(Small) Molecules of Life

by David Siegel

An Economic View on Human Biochemistry
“The human body’s chemical value is just about a couple of bucks.” - a frequently read line and a great understatement. While it is indeed true that the value of the chemical elements found in a human body, mainly oxygen, carbon, hydrogen, nitrogen, calcium and phosphorus in their pure form is not more than a couple of dollars or euros, this is not what we are actually made of. Our bodies are rather incredibly rich agglomerations of biomolecules, made from those elements, ranging from simple compounds like water to huge biopolymers like DNA or collagen, the major structural protein in our skin, hair, muscles or tendons. In this chemical treasure trove the pure elements are barely represented - neither by mass nor by number.

Biomolecules, as well as their mixtures and structures (think of organs, eggs, bone-marrow or blood) fulfil key functions in human biology and thus gain their worth. A fact which needs to be acknowledged when attempting the calculation of a body’s “chemical value”. It is obvious that such calculations are sketchy as human body parts are usually not sold freely - at least not on legal marketplaces. Still, the magazine Wired attempted an estimate in its February 2011 issue [1] and arrived at several million US dollars for the components of a human body, sold individually.

The difference between the two prices, “a couple of bucks” and several million dollars, one for the plain elements, the other for molecules and structures thereof, is a (sketchy) measure of the value of chemical information inherent to our bodies’ biomolecules, which is, again, a measure for the incredible degree of optimization achieved by evolutionary processes. In his 1977 Lindau lecture, German Nobel Laureate Manfred Eigen gave the audience a straightforward yet impressive introduction on the power of evolution with respect to the generation of such (useful) biochemical information:

Manfred Eigen on the Evolution of Biological Information (in German)
(00:01:53 - 00:04:48)

Structuring the Biochemical Treasure Trove
The molecular information generated in several billion years of evolution is vast. Even today, no one would dare to claim to understand all the chemistry going on in a human body – even keeping track of the tens of thousands of molecules we do know about proves difficult enough. Still, there are ways of classifying our biomolecules which can make life a lot easier.

First off, there are the biopolymers, chain-like molecules built from recurring, well-defined links. Our DNA is a biopolymer built from a set of four nucleobases. Similarly, our proteins are biopolymers built from 21 amino acids. Biopolymers are characterized by an easily comprehensible, linear construction principle, which – at the same time – allows for a theoretically limitless number of molecules. The only restricting factor is the achievable chain length. Hence, DNA and most proteins are what biochemists consider “large” molecules.

Next to the large biopolymers, there are non-polymeric molecules most of which qualify as “small”. By convention, this means that their atomic mass is below 900 Dalton, the mass of 900 hydrogen atoms, 56 oxygen atoms or 50 water molecules. In our bodies, small molecules take over a variety of functions – nutrients like carbohydrates and lipids partake in metabolism and thus act as a source of energy and chemical building blocks required for growth and development. Neurotransmitters, hormones and pheromones are involved in signal transduction. And vitamins and cofactors support enzymes in conducting essential biochemical reactions, to name only the most prominent examples.

Small molecules may enter the human body via inhalation, absorption through the skin and most importantly: via food. Once taken up, they are subject to a variety of metabolic processes. Small molecule nutrients are broken down to gain energy and chemical building blocks or converted to other compounds, which can be stored or transported more efficiently. Potentially toxic substances are equally degraded or chemically modified to facilitate excretion. And, most compounds are, to a lower extent, subject to random chemical reactions, which are unintended by the body’s biochemical machinery. Taken together, these processes account for the huge number of small molecules found in our bodies. Today, we know of more than 40.000 such compounds [2]. Reasons enough to put DNA, RNA and the proteins on the side and dive into the world of our (small) molecules of life.

Dealing with Macronutrients: Central Carbon and Energy Metabolism
Next to the proteins, small molecule macronutrients like carbohydrates and lipids are essential for our survival. As opposed to micronutrients, they are required in rather large quantities and can be considered raw materials required both as “fuels” and for the generation of chemical building blocks. Our body is equipped with a highly optimized biochemical machinery, allowing for an incredibly efficient utilization of such macronutrients. Humans metabolize as much as 93 to 95 % of the macronutrients contained in a typical mixed meal [5].

In the world of macronutrients, everything revolves around carbon. To obtain energy, our body converts energy-rich, carbon-based macronutrients to energy-poor, stable molecules, most of all carbon dioxide. Details on the chemical journey of carbon, from macronutrient to carbon dioxide and the associated Nobel Prizes, can be found in the Mediatheque’s Topic Cluster on Carbon. Notably, these so-called oxidation processes do not occur in a single step but proceed through biochemical pathways like glycolysis or the citric acid cycle, involving a wide range of intermediate compounds. Taken together, these small molecules are referred to as central carbon metabolites or energy metabolites. They are found in practically every cell.

However, our bodies do not stop at just degrading macronutrients. To a certain degree, they also interconvert them. One of these interconversion processes leads to an effect dreaded by many: weight gain, i.e. the accumulation of fatty acid triglycerides in fat cells. Fat pads are in essence reservoirs of small molecules used for energy storage. In this context, it is a common misconception that the build-up of fat can be avoided by a fat-free diet. Our bodies possess the ability to biosynthesize fats from very small building blocks, containing only two carbon atoms. The body can source these building blocks from carbohydrates and proteins and thus produce fat de novo. At the 1966 Lindau meeting, 1964 Nobel Laureate Feodor Lynen, who had been honoured together with Konrad Bloch for his contributions to the elucidation of cholesterol and fatty acid metabolism, explained to the audience why humans are largely independent of dietary fat:

Feodor Lynen (1966) - Build-Up of Fatty Acids in the Cell (German presentation)

Meine Damen und Herren, unter den drei Nährstoffen Kohlenhydrate, Eiweiß und Fett ist Fett kalorisch am hochwertigsten. Wie Sie vielleicht wissen, werden während der Verbrennung von Kohlenhydrat oder Eiweiß im Organismus 4,5 kcal/g Nahrungsstoff geliefert, während bei der Verbrennung von 1 Gramm Fett die doppelte Menge, Und wenn deshalb die Hausfrau sich eine Nahrungsreserve in Zeiten der Not schaffen will und mit Platz sparen muss, so kann man ihr nur raten, sich einen Vorrat von Fett anzulegen. Das war den Menschen übrigens seit urdenklichen Zeiten bekannt, schon lange, bevor es die Kalorientabellen unserer Tage gab. Aber noch viel, viel früher, noch lange, bevor im Laufe der Evolution die ersten Menschen, menschlichen Wesen auf dem Erdball erschienen sind, ist diese Tatsache bereits in den lebenden Organismen selbst ausgenützt worden. Die Samen vieler Pflanzen enthalten große Mengen Fett als Reservematerial, und im Tierreich bis hinauf zum Menschen steht Fett unter den Reservestoffen an der ersten Stelle. Das wissen wir alle aus eigener Erfahrung, weil ja jedes Zuviel an Nahrung in Form der Fettpolster in unserem Körper - vielfach nicht gerade erwünscht - abgelagert wird. Dabei spielt es keine Rolle, ob das Zuviel an Nahrung selbst Fett war oder ob es aus Kohlenhydraten oder Eiweiß bestand, weil der Organismus in der Lage ist, Fett aus anderen Nahrungsstoffen, zum Beispiel aus Kohlenhydraten, selbst aufzubauen. Die Herkunft des Fettes aus Kohlenhydraten, wie schon von Justus von Liebig für die Pflanzenfresser behauptet, ist auf folgendem Wege experimentell einwandfrei bewiesen worden. Und zwar wurden in diesen Versuchen möglichst fettarme Tiere - man hat Schweine eingesetzt - unter möglichster Einschränkung der Fett- und Eiweißzufuhr mit überschüssigen Kohlenhydratmengen gemästet, hier ist Reis verfüttert worden. Und ergab dann das angelagerte Fett, das heiß die Differenz der Fettmengen eines vor und eines nach der Messung geschlachteten Tieres einen größeren Wert als aus dem sämtlichen zugeführten Fett und dem abgebauten Eiweiß sich ergeben konnte, so war die Fettbindung aus Kohlenhydraten erwiesen. Versuche dieser Art sind zahlreich angestellt worden und sie ergaben, dass der tierische Organismus von der Fettzufuhr mit der Nahrung nahezu unabhängig ist. Ich muss hier eine gewisse Einschränkung anbringen, weil bestimmte Bestandteile der Fette, die in besonders hoher Konzentration in pflanzlichen Ölen, wie Sonnenblumenöl oder Rapsöl vorkommen aber auch im Schweineschmalz und in der Butter anzutreffen sind, im Körper nicht gebildet werden können, der mengenmäßige Bedarf an diesen sogenannten essenziellen oder unentbehrlichen Fettsäuren ist aber verhältnismäßig gering und in etwa dem Bedarf an Vitaminen vergleichbar. Wenn man aber schon von Fettsäuren spricht, dann ist es an der Zeit etwas über die Beziehungen zwischen Fettsäuren und Fetten zu erfahren. Chemisch gesehen sind Fette Glycerinester der Fettsäuren. Und da im Glycerin - das Sie hier sehen - 3 OH-Gruppen, oder wie der Chemiker sagt, alkoholische Gruppen, vorhanden sind, können 3 Moleküle Fettsäure mit einem Molekül Glycerin verbunden sein. Und diese 3 Moleküle können entweder chemisch gleich oder verschieden sein, was eine große Mannigfaltigkeit der Fette bedingt. Die verschiedenen Fettsäuren haben im Grunde den gleichen chemischen Bauplan, der dann hier oben wiedergegeben ist. Sie bestehen meist aus einer geradkettigen, unverzweigten Kohlenwasserstoffkette, diesem Teil hier, wie der Name schon sagt, ist dieser Teil nur aus Kohlenstoff und Wasserstoff, C und H, aufgebaut, und dieser Teil trägt am Ende eine Carboxylgruppe COOH. Diese Carboxylgruppe ist hier schematisch, diese Zickzack-Linie soll einfach diesen Kohlenwasserstoffteil wiedergeben, hier finden wir diese Carboxylgruppe, und diese Carboxylgruppe ist in den Fetten mit dem Glycerin verästet, sodass hier unten als das Fett selbst, die Formel des Fetts selbst wiedergegeben ist. Die einzelnen Fettsäuren unterscheiden sich einmal in der Länge der Kohlenstoffkette, das sehen Sie hier, hier ist eine Reihe von solchen Fettsäuren aufgetragen, Sie sehen, dass die Kohlenstoffkette verschieden lang ist, am einen Ende COOH, am anderen Ende steht diese CH3-Gruppe, also das ist ein Unterschied zwischen den verschiedenen Fettsäuren. Und zwar sind die meisten natürlich vorkommenden Fettsäuren aus 16 oder 18 Kohlenstoffatomen aufgebaut, wie Palmitin- oder Stearinsäure. Ein zweiter Unterschied ist durch Zahl und Lage von Doppelbindungen im Kohlenwasserstoffteil gegeben. Viele Fettsäuren, wie Palmitin- oder Stearinsäure, enthalten überhaupt keine Doppelbindungen, man nennt sie deshalb gesättigte Fettsäuren. Andere hingegen, wie die Ölsäure, die Linol- und die Linolensäure, die hier unten stehen, Öl-, Linol- und Linolensäuren gehören zu den essenziellen Fettsäuren, denen allen wie der Stearinsäure eine Kette aus 18 Kohlenstoffatome eigen ist, Sie sehen, die Kettenlänge ist die gleiche, aber diese Säuren enthalten nun eine bzw. zwei, drei Doppelbindungen im Molekül, man nennt sie deshalb ungesättigte Fettsäuren. Und im Zuge der biologischen Fettsynthese werden Glycerin und Fettsäuren auf getrennten Wegen gebildet und dann miteinander unter Bildung der Fette vereinigt. Herrschen im gebildeten Fettmolekül gesättigte Fettsäuren vor, also solche ohne Doppelbindung, wie etwa im Rindertalg, dann ist das Fett bei Zimmertemperatur fest. Steigt dagegen der Gehalt an ungesättigten Fettsäuren an, an Ölsäure, Linol- oder Linolensäure, dann sinkt der Schmelzpunkt, sodass schließlich in den pflanzlichen Ölen das Fett bei Zimmertemperatur flüssig ist. Die Bildung des Glycerins aus Kohlenhydraten ist seit langem chemisch aufgeklärt. Man hat zuerst nachgewiesen, dass es als Nebenprodukt bei der Vergärung von Zucker entsteht und dann die einzelnen Stufen dieses Prozesses in chemischer Hinsicht aufgeklärt. Die Einblicknahme in die Biosynthese der Fettsäuren, des zweiten Bestandteils der Fette, hat sehr viel länger auf sich warten lassen. Man hat zwar frühzeitig erkannt, dass die langen Kohlenstoffketten durch Aneinanderreihung kleiner Bausteine aufgebaut werden, aber wie das im Einzelnen vor sich geht, hat man erst in jüngster Zeit erfahren. Von vornherein kamen alle möglichen Vorstufen in Betracht, organische Moleküle, die aus drei, zwei, vier oder sechs miteinander verbundenen Kohlenstoffatomen bestehen, dass eigentlich nur Vorstufen mit zwei Kohlenstoffatomen in Betracht kommen, hat dann sehr nachdrücklich der physiologische Chemiker Franz Knoop bereits um die Jahrhundertwende betont. Ihm war aufgefallen, dass im tierischen Fett fast nur Fettsäuren mit gerader Anzahl von Kohlenstoffatomen vorkommen und besonders in der Milch die Reihe der Säuren von vier Kohlenstoffatomen, wie hier oben steht, bis zu der Säure mit 18 Kohlenstoffatomen lückenlos vorhanden ist. Um ihre experimentelle Sicherung erfuhr diese Vorstellung jedoch erst mit der Einführung der Isotopen Markierungstechnik in die Biochemie, die auf die Pioniertat Georg von Hevesys zurückgeht, den wir leider in diesem Jahr nicht unter uns sehen. Die Anwendung dieser Isotopen Markierungstechnik auf das Problem der Fettsäuresynthese, fast gleichzeitig von Rudolf Schönheimer in New York und von Robert Sonderhoff in München erreicht, führt zu der Erkenntnis, dass der Baustein der Fettsäuren, die zwei Kohlenstoffatome enthaltende einfachste Carbonsäure, Essigsäure ist, die Sie hier oben sehen. Damit war das Verbindungsglied zwischen Kohlenhydraten und Fettsäuren aufgefunden, denn es war bekannt, dass Essigsäure bei der biologischen Oxidation der Kohlenhydrate auftreten kann, bevor die vollständige Verbrennung zu Kohlendioxid und Wasser im Zitronensäurezyklus einsetzt. In den Versuchen von Schönheimer und Sonderhoff diente als Etikett zur Markierung der Essigsäure, das schwere Wasserstoffisotop Deuterium. In späteren Versuchen, über die Konrad Bloch 1945 berichtete, wurde eine doppelt markierte Essigsäure verwendet, eine, die sowohl in der COOH-Gruppe wie auch in der Methylgruppe markiert war und damit nachgewiesen, dass erwartungsgemäß beide Kohlenstoffatome der Essigsäure beim Aufbau der Fettsäuren eingebaut werden. Mit diesen Untersuchungen wurde ein wichtiger Fortschritt erzielt, die chemischen Details der Umwandlung von Essigsäure in die Fettsäuren blieben aber noch ungeklärt. Zu diesem Zeitpunkt hatte man nämlich bereits erkannt, dass die freie Essigsäure für biosynthetische Prozesse, wie zum Beispiel die Fettsäuresynthese, durch chemische Umwandlung in ein Derivat, das als aktivierte Essigsäure bezeichnet wurde, chemisch vorbereitet werden muss. Es ist nämlich allgemein so, dass in den chemischen Aufbauvorgängen, und darunter fallen nicht nur die Bildung der Fettsäuren aus Essigsäure, sondern auch die Bildung der Eiweißkörper aus den Bausteinen Aminosäuren oder die Bildung der Polysaccharide, Stärke und Zellulose aus Traubenzucker und viele andere Synthesen, dass bei diesen Aufbauvorgängen Kohlenstoffverbindungen von komplizierterer Struktur aus einfachen Bausteinen zusammengesetzt werden. Also so wie man ein Haus baut aus Ziegeln, so werden auch in der Zelle aus einfachen Bausteinen die komplexen organischen Moleküle synthetisiert. Mit diesem Aufbau aus einfachen Bausteinen ist ein energetisches Problem eng verbunden, weil sich die Bausteine im Verband der komplexen Moleküle auf einem höheren Energieniveau befinden als im freien Zustand. Daraus folgt unmittelbar, dass ein Arbeitsaufwand bei biosynthetischen Reaktionen erforderlich ist. Die lebende Zelle nützt deshalb bei ihren Biosynthesen die Tatsache aus, dass kein Energieaufwand erforderlich ist, wenn der Baustein nicht frei, sondern schon in gebundener Form vorliegt und gewissermaßen als Gruppe von einer Verbindung auf eine andere übertragen wird. Ein solcher Vorgang, den man als Gruppenübertragung bezeichnet hat, verläuft freiwillig. Und bei vielen biosynthetischen Prozessen muss deshalb chemische Energie in vorbereitenden Reaktionen zugeführt werden, wo sie dazu dient, den freien Baustein an ein Vehikel, vielfach ein Coenzym, zu binden und damit zu aktivieren. Und diese energetischen Verhältnisse werden durch das hier gezeigte Energieschema erläutert - hier ist die Energie der Gruppe aufgetragen, und sehen Sie hier, der freie Baustein, null Energie, nur wenn er gebunden wird, hat er eine gewisse Bindungsenergie. Und um nun in diesen gebundenen Baustein - da ist eine Übertragung von einer zur anderen Verbindung möglich - aber um einen freien Baustein in die gebundene Form umzuwandeln, muss Energie zugeführt werden. Hier unten ist eine kleine Auswahl von derartig aktivierten Verbindungen aufgeführt, die bei der Synthese der Polysaccharide, Nukleinsäure oder Proteine beteiligt sind - wir wollen hier an dieser Stelle nicht weiter darauf eingehen. Diese energieverbrauchende Aktivierung des freien Bausteins wird in der Zelle generell durch die Spaltung von Adenosintriphosphat, abgekürzt ATP, erreicht, das dabei gespalten wird. Dieses ATP, dessen Formel Sie im nächsten Bild sehen können, das den meisten von Ihnen ja bekannt ist, dieses ATP ist der generelle Energieträger der Zelle, also die Münze der Zelle, mit der Energiebedarf gedeckt wird, und dieses ATP entsteht bei den Vorgängen der Energielieferung durch Atmung und Gärung aus ADP, dem Adenosindiphosphat und Phosphorsäure. Im ATP sind drei Phosphatgruppen miteinander verbunden, und wenn nun umgekehrt das ATP gespalten wird, dann wird die Energie frei, und die kann für chemische Reaktionen, zum Beispiel biosynthetische Reaktionen, verwendet werden. Die aktivierte Essigsäure des Zellstoffwechsels ist eine chemische Verbindung aus Essigsäure mit dem sogenannten Coenzym A, die Formel sehen Sie hier - bitte erschrecken Sie nicht. An diesem Coenzym, dessen Formel wir im Einzelnen nicht diskutieren wollen, das Coenzym ist von Fritz Lipmann entdeckt worden, in diesem Coenzym ist der Gehalt an Pantothensäure - dieser Abschnitt des Moleküls - bemerkenswert. Die Pantothensäure gehört nämlich zu den Vitaminen, das heißt zu einer Klasse höchst wirksamer Substanzen, die in der Nahrung enthalten sein müssen, weil sie vom menschlichen und tierischen Organismus nicht selbst erzeugt werden können. Fehlen sie in der Nahrung, so stellen sich schwere Krankheitszustände ein, die zum Tod führen können und als Vitaminmangelkrankheiten oder Avitaminosen bezeichnet werden. Unzureichende Zufuhr von Pantothensäure mit der Nahrung führt zu einer Reihe von Symptomen und zu Störungen des Wachstums, Defekten des Nervensystems und krankhaften Erscheinungen im Magen-Darm-Trakt. Am auffälligsten sind Hautveränderungen und eine schwere Schädigung der Nebennieren, Krankheitssymptome, die als die äußeren Zeichen einer tiefgreifenden Störung des Essigsäurestoffwechsels anzusehen und auf das Fehlen von Coenzym A dieser Verbindung zurückzuführen sind. Bei Pantothensäuremangel fehlt ja dem Organismus ein wesentliches Glied zum Aufbau des Coenzyms, das heißt, wenn dieser Teil fehlt, dann kann die Verbindung im Körper nicht synthetisiert werden. Für die chemische Funktion des Coenzyms im Stoffwechsel ist das in Form einer Sulfhydryl- oder SH-Gruppe vorliegende Schwefelatom - das Sie hier sehen, dieses S - von wesentlich größerer Bedeutung. An diesem Schwefelatom können nämlich organische Carbonsäuren, wie Essigsäure oder ihre höheren Homologen, in aktivierter, das heißt zu chemischen Umsetzungen befähigter Form gebunden werden. Die Fixierung der Essigsäure an das Coenzym A kann in Übereinstimmung mit unserem Energieschema von vorhin in verschiedener Weise erfolgen. Einmal kann es gebildet werden durch Übertragung eines Acetylrestes aus einem geeigneten Acetyl-Donator, was sich durch dieses Schema wiedergeben lässt. Die Acetylgruppe vom Donator geht auf den Schwefel, das ist dieses Acetyl-Coenzym A, wir wollen diese Abkürzung SCoA, das ist also das Coenzym A-Molekül, und dabei unter Bildung des acetylfreien Donator-Moleküls. Bei der Verwertung der Kohlenhydrate, wie Stärke oder Rohrzucker, hat die Oxidation von Brenztraubensäure als Acetyl-Donator-Reaktion die größte Bedeutung. Die Kohlenhydrate werden in der ersten Phase dieses vielstufigen Abbaus über eine Reihe phosphorylierter Zwischenprodukte in die Brenztraubensäure übergeführt, dessen Formel Sie hier oben sehen, wir brauchen uns aber die Formel gar nicht merken. Und diese wird dann in Gegenwart von Coenzym A dehydriert, wobei die aktivierte Essigsäure Acetyl-Coenzym A-CO2 entsteht, der Wasserstoff, der dabei verfügbar wird, wird von Otto Warburgs Wasserstoff übertragenden Coferment Diphosphor-Pyridinnucleotid aufgenommen. Wie aus der Bilanzgleichung dieses Oxidationsvorganges ersichtlich ist, der hier wiedergegeben ist, wird dabei die in der Brenztraubensäure vorgebildete Acetylgruppe, das ist dieser Teil, CH3CO, aus der Bindung an Kohlensäure, COOH, übertragen auf das Schwefelatom des Coenzym A. Ein zweiter Weg zur Bildung des Acetyl-Coenzym A geht von freier Essigsäure aus, und er ist in den einleitend besprochenen Versuchen beteiligt gewesen, in denen der Aufbau von Fettsäuren aus Essigsäure mithilfe isotop markierter Essigsäure nachgewiesen wurde. Wir wollen uns auch diesen Prozess etwas genauer ansehen, weil wir an diesem Beispiel erfahren können, wie die Zelle einen freien Baustein aktiviert unter Verwertung der chemischen Energie des ATP. Zudem spielt dieser Vorgang in der Ernährung der Wiederkäuer, wie Rind, Schaf oder Ziege, eine ungemein wichtige Rolle. In ihren Pansen liefern bakterielle Prozesse aus der zellulosereichen Nahrung große Mengen Essigsäure, die ins Blut übertreten und dann in den verschiedenen Geweben nach Fixierung an Coenzym A verwertet werden können. Wir wollen uns außerdem daran erinnern, dass die chemischen Prozesse in den Lebewesen durch spezifische Katalysatoren von Eiweißnatur durch die sogenannten Enzyme oder Fermente ermöglicht werden. Durch ihre nur in Spuren benötigte Gegenwart beseitigen sie Reaktionswiderstände und bringen damit reaktionsträge Verbindungen zu einer in messbarer Geschwindigkeit verlaufenden chemischen Umsetzung. Um nun in die chemischen Details der Stoffwechselvorgänge einzudringen, macht die biochemische Forschung von der experimentellen Möglichkeit Gebrauch, die enzymatischen Katalysatoren von der lebenden Zelle abzutrennen, sodass man dann mithilfe isolierter Enzyme den vitalen Vorgang im Reagenzglas nachahmen kann. Und mithilfe des isolierten Enzyms für die Aktivierung der Essigsäure fand man, dass die an die Spaltung des ATP zu Adenosinmonophosphat AMP und Pyrophosphat geknüpfte Vereinigung von Essigsäure - hier haben wir die Essigsäure mit dem Coenzym A zu Acetyl-Coenzym A - dass dieser Prozess in einem 2-Stufen-Mechanismus verläuft, der hier oben wiedergegeben ist. Und zwar entsteht dabei ein Acetyl-AMP als Zwischenprodukt. Und dieses Acetyl-AMP entsteht im ersten Schritt durch Übertragung des im ATP gebunden vorliegenden AMP auf die freie Essigsäure. Damit wird aber die Essigsäure nun gebunden an das AMP, sodass ihrer Übertragung von Acetyl-AMP auf Coenzym A kein energetisches Hindernis im Wege steht. Der ganze Prozess ist an sich reversibel, wie dieser Doppelpfeil ausdrücken soll. Wenn nun aber in allen Zellen und Geweben ein sehr aktives Ferment vorkommt, das anorganisches Pyrophosphat, abgekürzt PP, unter Hydrolyse zu zwei Moleküle Orthophosphat aus dem Gleichgewicht entfernt, kann in vivo die Reaktion von rechts nach links niemals zum Zuge kommen. Ein zweistufiger Reaktionsmechanismus dieser Art, der, wie wir heute wissen, vielen Aktivierungsreaktionen im Stoffwechsel, darunter auch der Bildung der aktivierten Aminosäuren, der aktivierten Nukleotide und des aktivierten Zuckers zugrunde liegt, ist in biologischer Hinsicht höchst sinnvoll, weil der Organismus ja in Hinblick auf die von ihm vorzunehmenden chemischen Synthesen bestrebt sein muss, die Bausteine in gebundener und damit reaktionsfähiger Form zu behalten. Also die Essigsäure muss am Coenzym A gebunden sein, das will und das erreicht er durch diese Art von Reaktionsmechanismus. Mit dem Nachweis der Thioesterbindung in der aktivierten Essigsäure durch mein Laboratorium im Jahre 1950 war das Fundament gelegt für die Aufklärung der biologischen Fettsäuresynthese. Es hat aber dann doch noch acht Jahre gedauert, bis man erkannte, dass der Zelle die Thioesterbindung allein für den Vollzug dieser Synthese nicht genügt und sie zusätzliche Energie investiert. Diese wichtige Erkenntnis wurde von Sahlih Wakil in Madison, USA, beim Studium der zellfreien Fettsäuresynthese gewonnen. Wakil konnte aus Tauben- und Hühnerlebern zwei Enzymfraktionen isolieren, deren Zusammenwirken zur Synthese der Palmitinsäure aus Acetyl-Coenzym A führt, wenn das Reaktionsgemisch aus einem biologischen Wasserstoffspender in Form von Warburgs reduzierten Triphosphorpyridinnucleotid auch noch das ATP als Energiequelle enthielt, und was am meisten überraschte, wenn Kohlensäure zugegen war. Weiterhin wurde festgestellt, dass in einer der beiden Enzymfraktionen das Vitamin Biotin fest gebunden ist und offenbar an der Fettsäuresynthese beteiligt sein muss, denn bei der Reinigung des betreffenden Enzyms nahmen Biotingehalt und Enzymaktivität im gleichen Verhältnis zu und außerdem ließ sich das Enzym durch Avidin aus rohem Hühnereiweiß hemmen. Bei diesem Stoff Avidin handelt es sich um einen Eiweißkörper, der beim Studium einer Krankheit entdeckt wurde, die bei einseitiger Ernährung von Ratten mit rohem Eiklar auftritt und sich in einer schweren Dermatitis mit Schuppung der Haut, Lähmungen der Hinterbeine, Haarverlust um die Augen und einer verringerten Resistenz gegenüber Infektionen äußert. Dieses Krankheitsbild ist das einer Biotin-Avitaminose, die dadurch zustande kommt, dass sich dieser Eiweißkörper Avidin stöchiometrisch mit dem Biotin aus der Nahrung oder aus der Darmflora stammend, zu einem Komplex verbindet, der im Magen-Darm-Trakt weder spaltbar noch resorbierbar ist. Glücklicherweise sind gekochte Eier in dieser Hinsicht ungefährlich, weil der Eiweißstoff Avidin als Protein beim Kochen koaguliert und dabei die Kapazität zur Komplexbildung mit Biotin einbüßt. Die Beteiligung des Biotins an der Fettsäuresynthese hängt mit dem bereits erwähnten Bedarf von ATP und Kohlensäure zusammen. In Untersuchungen, an denen außer Wakils Arbeitskreise auch mein Laboratorium beteiligt war, ließ sich nachweisen, dass die biotinhaltige Enzymfraktion aus der Leber eine Acteyl-CoA-Carboxylase darstellt,ein Enzym, das Acetyl-CoA, dessen Formel Sie hier sehen, mit Kohlensäure HCO3 vereinigt unter Bildung von Malonyl-Coenzym A, also einem carboxylierten Acetyl-Coenzym A. Dieser Prozess lässt sich wiederum in das vorhin besprochene Energieschema einordnen. Die Vereinigung von Acetyl-CoA und Kohlensäure erfordert chemische Energie, die durch die Spaltung von ATP in ADP und Orthophosphat aufgebracht wird. Das Biotin stellt die Wirkungsgruppe des Enzyms dar. Es ist fest mit dem Eiweiß verbunden in Form eines Biotin-Enzyms, und das Biotin-Enzym wird im ersten Teilschritt der Enzymkette mit Kohlensäure, mit CO2 beladen unter Bildung eines CO2-Biotin-Enzyms. Das CO2-Biotin-Enzym überträgt dann im zweiten Reaktionsschritt die CO2-Gruppe auf das Acetyl-Coenzym A unter Bildung von Malonyl-Coenzym A. In chemischer Hinsicht besteht die Aufgabe des Biotins, dessen Formel Sie hier sehen - bitte halten Sie sich nicht daran auf, eine ist etwas kompliziert gebaut - was ich Ihnen zeigen möchte, ist, dass in chemischer Hinsicht die Aufgabe des Biotins einfach darin besteht, die reaktionsträge Kohlensäure durch Bindung an dieses Stickstoffatom hier in eine reaktionsfähige aktivierte Form überzuführen, mit deren Hilfe dann das Acetyl-Coenzym A carboxyliert werden kann. Mit der Aufklärung der katalytischen Wirkung des Biotins, die in München gelang, wurde auch verständlich, warum Avidin die Fettsäuresynthese verhindert. Das Avidin verbindet sich nämlich mit diesem Biotin des Enzyms zu einem stabilen Komplex und blockiert damit die Beladung des Biotins mit Kohlensäure. Dass das Biotin irgendwie an der Biosynthese der Fettsäuren beteiligt sein muss, war übrigens schon längere Zeit bekannt. So hatte zum Beispiel Boas bereits 1927 darauf hingewiesen, dass bei der sogenannten egg-white injury, der vorhin erwähnten Biotinmangelkrankheit nach Verfütterung von Eiklar, die Fettdepots des Organismus vollständig verschwinden. Auch das ist jetzt ohne weiteres verständlich. Beim Fehlen von Biotin kann der tierische Organismus keine vollständige Acetyl-CoA-Carboxylase mehr synthetisieren, damit fällt die Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA aus und folglich auch der Aufbau der Fettsäuren. Auch hier trifft es somit zu, dass die Symptome des Vitaminmangels nur das erste und äußerlich erkennbare Merkmal einer tiefgreifenden Störung des Zellstoffwechsels sind. Die zweite Enzymfraktion, die aus den Leberextrakten isoliert wurde, ist für die Umwandlung von Malonyl-CoA in Palmitinsäure verantwortlich. Hier ist also die erste Reaktion, die Bildung von Malonyl-CoA, hier kommt diese zweite Reaktion, die Umwandlung von Malonyl-Coenzym A in Palmitinsäure. Und für diesen Prozess werden noch dieses TPNH, das ist das reduzierte Triphosphor-Pyridinnucleotid, als Reduktionsmittel und - interessanterweise - kleine Mengen Acetyl-Coenzym A benötigt. Bei Untersuchungen hat sich herausgestellt, dass die beiden Kohlenstoffatome des Acetyl-Coenzym A am Methylende der Fettsäuren wiedergefunden werden und somit der Aufbau der Kohlenstoffketten durch sukzessiven Anbau von zwei Kohlenstoffeinheiten aus Malonyl-Coenzym A an dieses Acetyl-Coenzym A zustande kommt. Die zugrunde liegende chemische Reaktionskette konnte in meinem Arbeitskreis beim Studium eines entsprechenden aus Hefezellen isolierten Enzymsystems entwirrt werden. Das Hefeenzym, das wir als Fettsäuresynthetase bezeichnet haben, unterscheidet sich etwas vom tierischen Enzym, weil es als Syntheseprodukt nicht freie Palmitinsäure, sondern die Verbindung der Palmitinsäure mit Coenzym A, des Palmityl-Coenzym A entsteht. Nun, diese gereinigte Synthetase erwies sich als ein Multienzymkomplex, der aus sieben Enzymen, die hier in der Figur durch diese Kugeln symbolisiert sein sollen, aus diesen Kugeln besteht und der nichts anderes darstellt als die Fabrikationsstätte für die Fettsäuren. Wichtig ist, dass in diesem Multienzymkomplex zwei verschiedene SH-Gruppen vorhanden sind. Eine hier, dieses SH und eine zweite hier, zweites SH. Und an diesen SH-Gruppen sind die Zwischenprodukte der Synthese kovalent gebunden. Wir unterscheiden diese beiden SH-Gruppen durch die Bezeichnung zentrale und periphere SH-Gruppe und deuten diesen Unterschied, in dem im nächsten Bild gezeigten Reaktionsschema durch Fett- und Magerdruck. Und hier werden viele von Ihnen erschrecken, ich will es aber für diejenigen, die chemische Formeln lesen können, doch ganz kurz erklären, wie die Synthese vonstatten geht und daher im folgenden Bild noch einmal das Prinzip kurz auseinandersetzen. Die Synthese wird eingeleitet mit einer Startreaktion, indem die Acetylgruppe aus Acetyl-Coenzym A auf die periphere Sulfhydrylgruppe des Enzymkomplexes übertragen wird, es entsteht ein Acetyl-Enzym. Dieses Acetyl-Enzym übernimmt nun ein Malonsäurerest vom Malonyl-Coenzym A und der zentralen Sulfhydrylgruppe, ich sagte ja, zentrale ist Fettdruck. Es entsteht im ersten Schritt ein Acetyl-Malonyl-Enzym. Hier attackiert nun die an der peripheren schwefelgebundenen Acetylgruppe den Malonsäurerest und es entsteht unter Abspaltung von CO2 Acetacetyl-Enzym. Dieses Acetacetyl-Enzym wird nun durch Reduktion, Wasserabspaltung, umgewandelt in Butyryl-Enzym, wobei als Zwischenprodukte Betahydroxylbutyryl-Enzym und Crotonyl-Enzym entstehen. Was wichtig ist, die Umwandlung der Ketosäure, CO hier, in die gesättigte Säure vollzieht sich an Säureresten, die alle an die zentrale Sulfhydrylgruppe des Multienzymkomplexes gebunden sind. Und erst auf der Stufe der gesättigten Säure tritt nun ein Wechsel des Säurerestes von der zentralen Sulfhydrylgruppe auf die periphere Sulfhydrylgruppe ein in dieser Reaktion. Damit wird aber die zentrale Sulfhydrylgruppe frei, und sie kann nun in dieser Reaktion einen neuen Malonsäurerest übernehmen. Es entsteht jetzt aus einem Butyrylmalonyl-Enzym, das nun in selben Reaktionen eintritt, wie ich das vorhin diskutiert habe, und zwar wird bei jeder Wiederholung dieses Prozesses die Kohlenstoffkette um zwei Kohlenstoffatome verlängert. Sie sehen, wir sind hier ausgegangen von einer Säure CH3CH2 n mal CO S usw., hier unten entsteht CH3CH2 n+1 mal CO S, also es sind zwei Kohlenstoffatome mehr, und das wird solange wiederholt, bis schließlich Fettsäuren mit Kohlenstoffketten von 16 bis 18 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind. Und dann tritt die Abschlussreaktion ein, die hier unten gezeigt ist, nämlich die Rückübertragung des Fettsäurerestes von der zentralen Sulfhydrylgruppe auf das Coenzym A unter Regeneration des freien Enzyms, das nun in der Startreaktion von neuem mit Essigsäure beladen werden kann. Hier ist abgekürzt noch einmal das Wesentliche wiedergegeben, wir fangen also an mit einer Acetyl-CoA-Verbindung mit zwei Kohlenstoffatomen, das Malonyl- CoA überträgt den Malonsäurerest auf das Enzym, jetzt kommt die Kondensation unter Abspaltung von CO2, wir kommen zur Verbindung mit vier Kohlenstoffatomen, die noch die CO-Gruppe trägt, Reduktion führt nun zu einer Verbindung - Sie sehen, das ist einfach um zwei Kohlenstoffatome länger - wenn das nun in dieselbe Reaktion eintritt, wird eine Verbindung mit sechs Kohlenstoffatomen gebildet, Sie sehen also, wie sukzessive durch Anheften von zwei Kohlenstoffatomen die Ketten immer länger werden bis schließlich Ketten mit 16 und 18 Kohlenstoffatomen entstanden sind. Auf dieser Folge von Reaktionsschritten beruht unsere Vorstellung vom strukturellen Aufbau des Multienzymkomplexes. Wie wir annehmen, sind in seiner strukturellen Einheit die sieben Enzyme kreisförmig um diese zentrale Sulfhydrylgruppe angeordnet, und zwar derart, dass die an diese Sulfhydrylgruppe, an dieser SH-Gruppe gebundenen Zwischenprodukte nacheinander mit den aktiven Zentren der beteiligten Enzyme in Kontakt treten können. Der chemische Mechanismus der Fettsäuresynthese und Struktur des Enzymsystems, von uns aus zahllosen Experimenten am reinen Hefeenzym erschlossen, sind in den letzten Jahren durch Untersuchungen von Vagelos und Wakil am Enzymsystem der Bakterien bestätigt und ergänzt worden. Der Enzymkomplex aus Bakterium Coli, dem Darmbakterium, besitzt nicht die Stabilität desjenigen der Hefezellen oder der tierischen Gewebe. Bei der Fraktionierung zerfällt er in die einzelnen Komponenten, weshalb sich diese mit den Methoden der Proteinfraktionierung voneinander trennen lassen. Bei diesen Untersuchungen hat sich in Bestätigung unserer Vermutung herausgestellt, dass diese zentrale SH-Gruppe einem separaten Strukturelement, das hier so als Zigarre aus dem Komplex herausschaut, gebunden ist, das ein Protein darstellt und anscheinend selbst keine enzymatische Aktivität zu besitzen scheint. Vagelos nannte dieses Protein, dessen Molekulargewicht im Falle des Enzymsystems aus Bacterium coli etwa 10.000 beträgt, Acyl-Carrier-Protein, das heißt also Säurerest tragendes Protein. Bei der Fraktionierung tierischer Gewebsextrakte oder Hefeextraktes mit Milben die Enzymaktivität bewahrenden Methoden, bleiben die betreffenden Multienzymkomplexe intakt, in der Hefe, in tierischen Zellen sind diese Enzyme zu diesem Komplex durch Bindungskräfte zusammengehalten, sodass er intakt bleibt. Diese isolierten Multienzymkomplexe wandern im elektrischen Falt und auch in der Ultrazentrifuge einheitlich, und im Falle der Hefesynthetase ist ein Molekulargewicht von etwas 2,3 Millionen bestimmt worden. Und das Ordnungsgefüge dieses Multienzymkomplexes ist auch im Elektronenmikroskop sichtbar. Da ist eine Aufnahme des gereinigten Enzyms aus Hefe mit der Phosphorwolframsäuretechnik gewonnen was dazu führt, dass die Eiweißstrukturen als helle Gebilde auf einem dunklen Hintergrund erscheinen. Das sind also diese Fabrikationsstätten für die Fettsäuren, Sie sehen, dass diese Teilchen eine ganz diskrete Struktur besitzen, Sie sehen hier, da sind so einzelne Kugeln, das sind wahrscheinlich die einzelnen Enzyme, die hier zu dieser Übereinheit zusammengefasst sind. Die Teilchen selbst haben in der Größenordnung von 260 Angström Durchmesser oder Länge und 210 Angström Durchmesser. Leider können wir vorerst die elektronenmikroskopisch sichtbare Struktur noch nicht in bekannte Strukturschemata einordnen, aber Dr. Hofschneider vom Max-Planck-Institut für Biochemie, dem ich auch an dieser Stelle für seine wertvolle Hilfe danken möchte, ist auf dem Weg, dieses Ziel zu erreichen. In Zusammenhang mit chemischen Befunden ist ein Aufbau der Struktur aus drei ineinandergeschachtelten Ringen, so in dieser hier gezeigten Art, möglich, was mit der auch durch andere Befunde gestützten Annahme vereinbar wäre, dass in den Teilchen vom Molekulargewicht 2,3 Millionen drei komplette Enzymsätze für die Fettsäuresynthese vorliegen. Die chemische Identifizierung der beiden SH-Gruppen erbrachte sehr interessante Resultate. Die periphere SH-Gruppe liegt als Bestandteil der Aminosäure Cystein vor und wahrscheinlich gebunden in der Enzymkomponente für die Kondensation. Der Träger der zentralen SH-Gruppe hingegen erwies sich nach Untersuchungen amerikanischer Laboratorien, Wakil und Vagelos, am Bakterienenzym, und nach unseren Studien am Hefeenzym als ein alter Bekannter, nämlich als phosphoryliertes Pantethein, die Verbindung aus Pantothensäure und diesem Rest Cysteamin mit Phosphorsäure verbunden, also dieser Teil von hier bis hier. Alter Bekannter deshalb, weil wir ja diesen Bestandteil bereits als Komponente des Coenzym A kennengelernt haben. In der Fettsäuresynthetase ist dieses phosphorylierte Pantethein gebunden an einen Serinrest im Proteinverband. Und interessant an dieser Bindungsart ist, dass auf diese Weise die zentrale SH-Gruppe einen langen flexiblen Arm gewinnt, der ihre Rotation erleichtert und die mit ihr fest verbundenen Carbonsäuren in engem Kontakt mit den aktiven Zentren der verschiedenen Enzyme zu bringen vermag, obwohl diese im Multienzymkomplex räumlich stark fixiert sein dürften. Und in dieser Figur sollen die Kreise hier die aktiven Zentren einiger der hier beteiligten Enzyme schematisch wiedergeben, also hier das Enzym für den Malonyltransfer zum Beispiel, und dieser Arm kann sich um diese Bindungen drehen, der schwingt also hier, da wird die Malonsäure auf die SH-Gruppe geladen, dann wandert sie hier, dann tritt die Kondensation ein, hier ist also dieser Cysteinrest, der die periphere Sulfhydrylgruppe trägt und dann geht's weiter zur ersten Reduktion. Das soll also schematisch wiedergeben, wie am Arm diese Zwischenprodukte an den verschiedenen Enzymen vorbeigereicht werden können. Die wichtige Frage, warum der Fettsäureaufbau im Multienzymkomplex gerade auf der Stufe von Palmitin- und Stearinsäure, jedoch nicht vorher oder nachher abbricht, ist noch ein Rätsel. Es kann sein, dass hierbei der Spezifitätsbereich eines der beteiligten Enzyme eine maßgebliche Rolle spielt. Es wäre aber auch möglich, dass die spezifische Architektur des Multienzymkomplexes die Information zum Abbruch des Syntheseprozesses auf der Stufe der Säuren mit 16 bzw. 18 Kohlenstoffatomen in sich trägt. Der Ablauf einer aus vielen Schritten bestehenden Synthesekette in einem Multienzymkomplex bringt in reaktionskinetischer Hinsicht wesentliche Vorteile, weil die Diffusionswege für die Zwischenprodukte als Folge der festen Bindung an den Komplex auf ein Minimum beschränkt sind. Und hinzu kommt noch, was in physiologischer Hinsicht von allergrößter Bedeutung sein dürfte, dass Störungen des Syntheseprozesses durch fremde Enzyme, wie etwa durch die Enzyme des Fettsäureabbaus, unterbunden sind. Fettsäureaufbau und Fettsäureabbau sind in der Zelle räumlich geschieden, und damit gewinnt die Zelle die Möglichkeit, beide Prozesse getrennt voneinander ablaufen zu lassen, und was noch wichtiger ist, auch unabhängig voneinander zu regulieren. Wenn ich nun zum Abschluss auf die biologische Regulation der Fettsäuresynthese zu sprechen komme, so muss ich noch einmal zur Acetyl-CoA-Carboxylase zurückkehren, unter deren Wirkung, wie wir erfahren haben, Malonyl-CoA aus Acetyl-CoA entsteht, und zwar auf Kosten der Spaltung von ATP. Der Aufbau der Fettsäuren wird also in bester Übereinstimmung mit dem allgemeingültigen Grundplan des Synthesegeschehens, das ich hier einleitend geschildert habe, in der Zelle durch die Spaltung von ATP angetrieben. ATP ermöglicht die Fixierung der Kohlensäure im Acetyl-CoA, die dann beim Einbau des 2-Kohlenstoffbausteins in die Fettsäure wieder ausgestoßen wird. Für die biologische Steuerung der Fettsäuresynthese ist die Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase des ersten Enzyms entscheidend, und zwar deshalb, weil es das limitierende Enzym darstellt. Die Fettsäuresynthetase, der Multienzymkomplex, das zweite Enzym, ist in den tierischen Geweben in großem Überschuss vorhanden, man sagt deshalb, Acetyl-CoA-Carboxylase ist der Schrittmacher, weil durch ihre Aktivität die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion bestimmt ist. Und das hat zur Folge, dass sich jede Aktivitätsänderung der Carboxylase auf die Geschwindigkeit der Fettsäuresynthese auswirken muss. Diese Acetyl-CoA-Carboxylase hat nun eine Besonderheit. Wie man gefunden hat, benötigt das Enzym den Metabolit Zitronensäure als aktivierenden Effektor, als Aktivator. Und das äußert sich darin, dass das Protein in Abwesenheit von Zitronensäure praktisch wirkungslos ist und erst in Gegenwart dieses Effektors Zitronensäure die Fähigkeit zur Carboxylierung des Acetyl-Coenzym A gewinnt. Um den halbmaximalen Aktivierungseffekt zu erreichen, muss die Zitronensäurekonzentration etwa Molar Tausendstel sein. Dieses Phänomen fällt unter die sogenannten allosterischen Effekte, Effekte, die nach den Untersuchungen der letzten Jahre bei der Regelung sehr vieler Stoffwechselprozesse maßgeblich beteiligt sind. Solche Effekte lassen sich damit erklären, dass die betreffenden Enzyme zwei verschiedene Bindungsstellen besitzen, eine für das Substrat und eine für den regulierenden Effektor. Durch die Bindung des Effektors an das Enzym wird die Form des Proteins, das heißt die Faltung der Polypeptidkette dergestalt verändert, dass aus einem katalytisch inaktiven Protein ein katalytisch aktives wird. Die Vorgänge sehr vereinfachend, lässt sich diese Formänderung in dem hier gezeigten Bild schematisch wiedergeben. Wenn wir uns vorstellen, das ist das Substrat, hat diese Form, dann sehen Sie, dass in diesem Gebilde, in dem Protein dieser Form dieses Substrat hier nicht hereinpasst an die Substratstelle. Wenn aber nun der Effektor hier mit dieser Effektorbindungsstelle in Wechselwirkung tritt, dann wird die Form des Proteins so geändert, dass nun - wie hier unten gezeigt wird - das Substrat in das Enzym hereinpasst und am Enzym umgesetzt werden kann. Das ist ein ganz rohes, einfaches Bild für die Prozesse dieser allosterischen Effektoren. Und tatsächlich geht die Änderung am Protein der Acetyl-CoA-Carboxylase sehr viel weiter und führt zu einer Aggregation des Proteins. Messungen in der Ultrazentrifuge lieferten als Sedimentationskonstante des unbehandelten Enzyms Werte zwischen 19 und 23 Svedberg-Einheiten, als Sedimentationskonstante des durch Zitronensäure aktivierten Enzyms jedoch Werte zwischen 40 und 50 Svedberg-Einheiten. Im Hinblick auf eine mögliche biologische Steuerung der Fettsäuresynthese reicht die Citrat-Aktivierung allein allerdings noch nicht aus. Die in den Geweben unter verschiedenen Bedingungen gemessenen Änderungen im Citratspiegel sind nämlich relativ zu gering, um in Anbetracht der nicht sonderlich hohen Affinität der Acetyl-CoA-Carboxylase zur Zitronensäure ins Gewicht zu fallen. Hier kamen wir erst weiter, als Dr. Bortz in meinem Laboratorium in den Coenzym A-Derivaten langkettiger Fettsäuren, also Fettsäure-Coenzym A-Verbindungen höchst wirksame Antagonisten der Zitronensäure entdecken konnte, die schon in minimalen Konzentrationen die Aktivierung des Enzyms durch Zitronensäure beseitigen. In systematischen Untersuchungen konnte Dr. Numa dann nachweisen, dass diese Fettsäure-CoA-Verbindungen, wie etwa Palmityl- oder Stearyl-CoA, die wir vorhin als Syntheseprodukte der Fettsäuresynthetase kennen gelernt haben, mit Citrat um die Effektorbindungsstelle konkurrieren, und auf diese Weise die zur Enzymaktivität führende Konformationsänderung, Formänderung des Proteins, verhindern. Und diese Vorstellung ließ sich durch kinetische Messungen einwandfrei beweisen und auch durch Beobachtungen der Sedimentation des Enzyms in der Ultrazentrifuge. Im nächsten Bild ist ein derartiger Sedimentationsversuch wiedergegeben. Hier oben ist das Enzym ohne Zusatz von Citrat. Die Position in diesem Diagramm, wie das gewonnen worden ist, darauf will ich im Einzelnen nicht eingehen, das braucht man auch nicht, die Position in diesem Diagramm gibt an, je weiter sich etwas nach dieser Richtung verschiebt, umso größer ist das Molekül, also ohne Citratmolekül diese Größe, kleine Größe. Wenn man nun Citrat zusetzt - wie vorhin gesagt - dann tritt Aggregation ein, das Enzym sedimentiert stärker, es verschiebt sich nach rechts. Wenn man nun in Gegenwart von Citrat auch noch Palmityl-Coenzym A zusetzt, dann wird die Aktivierung des Enzyms unterbunden durch Citrat und gleichzeitig auch die Aggregation, denn Sie sehen, in diesem Fall läuft das Protein wieder an der selben Stelle wie in Abwesenheit von Citrat. Bei Bestimmungen der Hemmwirkung homologer Fettsäure-Coenzym A-Derivate ergab sich, dass die Affinität dieser Verbindungen zum Enzym mit zunehmender Kettenlänge des Fettsäurerests ansteigt und zur Erzielung des gleichen Hemmungsgrads, zum Beispiel von Stearyl-Coenzym A, der Verbindung mit 18 Kohlenstoffatomen, hundertmal weniger erforderlich ist als von Decanoyl-CoA , der Verbindung mit nur 10 Kohlenstoffatomen. Aus diesen Befunden ließ sich die Vorstellung ableiten, dass auch der Kontrolle der Fettsäure-Synthese im tierischen Organismus ein negativer Rückkoppelungsmechanismus durch Endprodukthemmung zugrunde liegt, wie sie vom Studium vieler anderer Reaktionsketten des Zellstoffwechsels her bekannt ist. Und das Prinzip dieser Rückkopplungshemmung ist hier wiedergegeben, es ist ganz schematisch wiedergegeben, dass eine Substanz F, also ein Zwischenprodukt des Stoffwechsels, auf verschiedenen Wegen aus anderen Verbindungen entstehen kann über die Zwischenprodukte C, D, E bzw. Zwischenprodukte DI BI, und dass dann dieses Zwischenprodukt nun in eine Reihe von Reaktionsketten eintreten kann, G, H usw. bis N, dem Endprodukt der Synthesekette oder auch in andere Reaktionen H1, G2, H2 usw. Die Endprodukthemmung kommt dadurch zustande, dass das Endprodukt der Synthesekette, also der Stoff N, das Enzym, welches die Umwandlung von F in G bewirkt, spezifisch hemmt. Und das hat zur Folge, dass dann, wenn das Endprodukt sich anhäuft, der Weg unterbunden wird, diese Synthesekette unterbunden wird, die zur Synthese dieses Produktes N führt, also eine Rückkoppelungshemmung durch das Endprodukt. Das nächste Bild gibt das Schema der Lipogenese wieder, wir sehen hier unser Acetyl-Coenzym A, das - wie wir erfahren haben - aus Kohlenhydrat entsteht. Dieses Acetyl-Coenzym A wird durch Carboxylierung in Malonyl-CoA umgewandelt, daraus entstehen dann die Fettsäure-CoA-Verbindungen, die dann in Fett, Phospholipide und Sphingolipide komplexe Verbindungen eingebaut wird. Und wie Sie aus diesem Schema sehen, sind die Fettsäure-CoA-Verbindungen die letzten Glieder in der Synthesekette, bevor Einbau in die komplexen Lipide erfolgt. Steigt daher die Konzentration dieser Fettsäure-CoA-Verbindungen in den Geweben an, so ist dies das Zeichen dafür, dass der Bedarf für den Aufbau der komplexen Lipide gedeckt ist, und es wäre unnötige Verschwendung, würde weiteres Acetyl-CoA auf den Weg dieser Biosynthese geleitet. Und das wird nun dadurch verhindert, dass die langkettigen Fettsäure-CoA-Verbindungen die Acetyl-CoA-Carboxylase hemmen, also gerade das Enzym, welches diese Umwandlung bewirkt, gerade also dieses Enzym, welches den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt dieser Synthesekette katalysiert und unter dessen Wirkung der Weg zur Fettsäuresynthese von den anderen Umwandlungen des Acetyl-Coenzym A, zum Beispiel der Verbrennung im Zitronensäurezyklus oder der Bildung des Cholesterins, der Terpene der Sterine abzweigt. Nun, die eben entwickelte Vorstellung von der regelnden Wirkung der Fettsäure-CoA-Verbindungen hängt nicht in der Luft, sondern hat eine experimentelle Basis. Es ist nämlich seit langem bekannt, dass unter Bedingungen wie Hunger, Diabetes oder Fettfütterung, unter denen die Fettsäuresynthese im tierischen Organismus erheblich vermindert ist, der Blutspiegel an freien Fettsäuren und somit der Zustrom freier Fettsäuren in die Organe, wie etwa die Leber, beträchtlich ansteigt. Das heißt, wenn der Spiegel an Fettsäuren erhöht ist, dann werden in den Organen nach Zustrom diese Fettsäure-CoA-Verbindungen gebildet, der Spiegel an diesen Fettsäure-CoA-Verbindungen steigt an, bei Diabetes und Hunger ist dieser Anstieg der Fettsäuren die Folge einer Mobilisation der Fettdepots im Körper. Und wie quantitative Bestimmungen in mehreren Laboratorien ergeben haben, ist unter all den aufgezählten Bedingungen der Gehalt der Leber an langkettigen Fettsäure-CoA-Verbindungen stark erhöht. Da ist hier diese Tabelle, Sie sehen, also in normalen Versuchen bei Ratten, Wieland fand 15 Millimikromol pro Gramm Frischgewicht, also die Zahl 15, Werte von uns im normalen Tier auch etwa 15. Wenn man aber das Tier hungern lässt, dann steigt dieser Wert an Fettsäure-CoA-Verbindungen bereits auf das Vierfache an. Hier sind Versuche von Engländern, die haben einen höheren Normalspiegel gefunden, was auf Unterschiede in der Bestimmungsmethode zurückzuführen ist, aber auch hier wieder: nach Hunger Verdoppelung, nach Fettfütterung fast nahezu Verdreifachung, und im akut dekompensierten Diabetes, also in der Zuckerkrankheit auch etwa 100, also Verdoppelung. Und zuletzt - hier unten - Versuche von Wieland in München, normal deckt sich mit unseren Befunden, auch hier wieder akut dekompensierter Diabetes, es waren Ratten, die sind mit Alloxan Diabetes gemacht worden, da hat man eine Zeitlang Insulin gegeben, Insulin abgesetzt, dann steigt der Fettsäure-CoA-Spiegel an, wenn man aber die Ratten mit Insulin behandelt, damit den Diabetes verhindert, sehen Sie, hat man normale Werte. Also in all diesen Situationen, in denen die Fettsäuresynthese verhindert ist, da steigt der Spiegel an Acyl-CoA-Verbindungen an, und damit wäre unsere Vorstellung von der Regulation der Fettsäuresynthese bestätigt. Sie werden mich nun vielleicht fragen, was sind die praktischen Konsequenzen, der mit diesen Untersuchungen gewonnenen Einblicknahmen in den chemischen Mechanismus der Fettsäuresynthese und ihrer Regelung.

Feodor Lynen on Fatty Acid Biosynthesis (in German)
(00:00:15 - 00:04:11)

Macronutrients vs. Micronutrients
Towards the end, Lynen mentions that certain fatty acids cannot be biosynthesized and hence need to be taken up with the diet in quantities comparable to those applicable to vitamins. These two fatty acids, α-linolenic acid and linoleic acid, belong to the group of micronutrients. Micronutrients are essential, but not required for energy generation. They rather support vital metabolic reactions, either directly, as enzyme cofactors, or indirectly, as building blocks for other biomolecules.

Minerals, trace elements (e.g. iodine) and vitamins complement the spectrum of micronutrients. In the realm of the Nobel Prizes, vitamins in particular play an outstanding role. No other group of small molecules has motivated more Nobel Prizes. This may be explained by considering that the concept of micronutrients in general and vitamins in particular was not well established until the first half of the 20th century. The story of vitamin discovery hence coincides with the story of the Nobel Prize, which was first awarded in 1901. Whereas (with few exceptions) the major macronutrients were isolated before Nobel Prizes were awarded, vitamin researchers just were in the right spot at the right time.


Vitamins

Discovery and Nobel Prizes
All 13 vitamins we know of today (A, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, D, E, K) were discovered in a period of about three decades, from 1913 to 1941. With the Nobel Prizes being awarded since 1901, the chances of receiving an award for vitamin research could not have been better and, in fact, as many as eight Nobel Laureates owe their Prizes directly to work on the discovery, isolation or structural characterization of novel vitamins [3]. Several additional Prizes were given for work involving vitamins in part.

However, it was only in 1929 when the Karolinska Institutet decided to honour vitamin researchers. After all, the concept of micronutrients and vitamins was still new, even the term “vitamin” had only been coined in 1912 (based on the false assumption that all vitamins feature an amine group, vitamin was short for “vital amines”). And by no means were vitamin pills available over the counter like they are today.

Still, once the importance of vitamins became apparent, a true wave of vitamin Nobel Prizes ensued. It began with the 1929 Prize in Physiology or Medicine, which went to Frederick Hopkins and Christiaan Eijkman for their work towards the discovery of the vitamins A and B1, respectively. These two vitamins were the first discovered and the first connected to a Nobel Prize. Interestingly, neither Eijkman nor Hopkins had isolated the pure vitamins or determined their structure. They merely pointed out that certain foods (milk in the case of vitamin A and brown rice in the case of vitamin B1) have the potential to cure certain conditions arising from an unbalanced diet. Others later identified the actual compounds responsible.

In 1937, both, the Prize in Physiology or Medicine and the Prize in Chemistry went to vitamin research. And both Prizes were motivated essentially by one compound: ascorbic acid or vitamin C. Albert von Szent-Györgyi Nagyrápolt was rewarded in Physiology or Medicine for its isolation, whereas Walter Haworth received one of the Chemistry Prizes for synthesizing the vitamin (in 1934). Haworth’s co-recipient, Paul Karrer, was acknowledged for his work on the vitamins A, E and the B vitamins.

Ascorbic acid, the lack of which caused the famous scurvy amongst sailors, was long sought after. It had been known for quite a while that foodstuffs like lemon juice can prevent scurvy. However, that a single small molecule compound was responsible for this effect could only be established in the 1930s. In his 1969 Lindau lecture, the Hungarian Szent-Györgyi described how he “accidentally” isolated vitamin C while wondering about why certain fruits turn brown when damaged, while others do not:

Albert von Szent-Györgyi (1969) - Molecules, Electrons and Biology (German Presentation)

Count Bernadotte, Colleagues ... (inaudible), thank you. Ladies and Gentleman, As you know, biological thinking today is permeated by the influence of the molecular theory. And according to this theory, the living system is composed of closed particles with closed electron shells, molecules. And heat agitation causes these molecules to oscillate and collide on occasion. I have never really been able to believe that this is the sole source of the wonderful intricacy and adaptability and fittingness of living nature, and here in Lindau I asked myself whether our situation is not analogous to a man observing the meeting of Nobel Prize laureates in Lindau from a height of 10,000 meters. If this person were asked: "What are Nobel Prize laureates?", he would say: Sometimes they collide, then they part again, and that's all there is to it". I have never really been able to believe this, and I would say that the main outcome of my long years of research of more than 50 years is a profound respect and admiration for the marvellous complexity of living nature. That these molecules are not really as isolated and not really as closed as the molecular theory would have us believe, the first indication was discovered by Weiss in England in 1942. He found that if a strong oxidising agent and a strong reduction agent are combined they form a complex. And this complex then develops a dipole moment, meaning that the molecule has a positive and a negative charge. And straight away he understood rightly that this could only happen through an electron transferring from the one molecule, from the reductant to the oxidiser. For as we know, oxidising agents have a strong desire to accept electrons and reduction agents are keen to release electrons or hydrogen atoms. So, this all adds up well. He interpreted the whole sequence – may I have the first slide – correctly at first glance, that the electron, with the one molecule releasing an electron which becomes the donor, right? The other accepts it, thereby becoming the acceptor, and these are then given the abbreviations D or A. So as Weiss accurately reports, in the first stage they form a complex, a stable configuration held by normal forces. Then an electron is transferred within the complex. An electron passes to the acceptor. As you know, all molecules are composed of electrons which always come in pairs. There are always the two together. They come in pairs, which means that an electron spins off from its pair and transfers to the acceptor, which then becomes negatively charged. No one has ever seen this happen – it's something we can't see. All we have is a good dipole measurement from measuring the dipole moment which is awfully difficult and very complicated, but we still can't see anything. If, however, the conditions are very favourable – extremely favourable – including the relative energy, the pair may break apart and become two independent particles, an acceptor with a negative charge and a donor with a positive charge, which is what we now call a free radical. So then we have a free radical. And this, which is something we can already prove, may emit a sign or a signal in an electron spin resonance machine. The electron spin, by which I mean the machine itself, has 1,000 buttons and fills a whole room, and as you know, one of the laws is the smaller particle the larger the machine needed for proof. So the electron spin resonance spectroscope can detect when an electron has separated from its pair and is sitting there by itself. So, what's the best way of imagining this - can I have the next slide. Here - as you know, the electrons in molecules or atoms form a sort of cloud and the cloud has a certain localisation called an orbital, and these orbitals have different energy levels. This slide shows occupied orbitals, there are, of course, occupied and empty orbitals. At this point, you will say that it's not empty at all. What we have here is a physical reality, but there is nothing sitting on it, sort of like an empty chair. So here are the occupied orbitals, the ones with the thick line, and those are the thin ones, which serves to indicate what is an oxidising agent and what a reduction agent. This means that an electron is in a very high orbital, at a very high level, with a strong propensity to transfer. If the acceptor, meaning the oxidising agent, has an empty chair, namely at a low level, the electron can go and sit on it. This then generates the energy and the two charges, the positive charge This is then the ground state, with no excitation. Only the previous carrier energised. This is the transition to the ground state or, to put it another way, strong charge transfer. Another type of charge transfer was subsequently discovered and researched in detail, in particular molecules with spin-up electrons. Could I have the next slide please? Naturally, an electron could never spin to a higher level by itself. It lacks the energy to do this. If, however, it happens that an electron is energised by a photon, by light energy, this energy can send it to a higher level, which is then charge transfer in an excited state, isn't it. Life's most important chemical reaction is of this kind, as exemplified by the excitation of the chlorophyll molecule in plants. The electron is excited by light and transferred to a higher level. So, what usually happens is that the electron naturally falls back again, the cloud is distributed between the two molecules, and the electron falls back. But life has learnt to grab hold of the electron here with a metal atom, with an iron atom, and then it has a little energy, and this is the energy which sustains you, which sustains us all, from this energy supplied by the photon. So, to summarise, the next slide please. So, there are two electron transfers, where an electron jumps to a higher level and where it falls back, which is the ground state. Now a question for the biologists: What can biology make of this? Nothing whatsoever, for the simple reason that there is no light in our bodies. Consequently, when we talk about animal physiology, there is no light in the body And there is no strong oxidising agent in the body either, as we would not be able to tolerate it. They would kill us, the strong oxidisers. Which is why there are none. As a result, there would be no chance of a charge transfer. Charge transfer could, however, be extremely significant. Indeed, if there were to be just one, even in this middle ground, where the electrons, where the substances are neither powerful oxidisers nor strong reducers. If they could display just one charge transfer. Because our whole body is constructed on substances, which are not strong oxidising agents. So my main question to put to the experts is now: whether, in this middle ground, which forms the basis for the whole body, a charge transfer would be possible. But now comes the difficult part: How could you prove this? In this region, indeed, waiting for an electron, for the whole electron cloud to transfer to another molecule would be an impossible option. It would merely spread, the electron cloud. That which we observe in electrons, like a cloud. The cloud would merely distribute itself between the two molecules, the donor and the acceptor, and in this state of dissipation, getting an electron spin resonance spectrum and an indication in this machine is not yet possible. So is there a way forward? Yes, there is, with a small trick. Small tricks are indispensable in science, because if one needs especially favourable conditions for a whole electron to transfer, yes - the attempt should then be made to create such favourable conditions, and then to observe whether the electron wants to pass over with the substances that are actually present in our bodies. After all, we have all sorts of substances inside us, proteins and amino acids and, taking all this, and having created particularly favourable conditions by introducing a strong acceptor in a particularly good solvent – there are special properties which one anticipates – and we then put the whole lot in the electron spin resonance machine and what we get is a wonderful signal. Anyone who has worked with an electron spin resonance machine knows how marvellous this signal is. There are intervals which we can use to calculate everything. This is a wonderful signal. And we found that hydrogen atoms and oxygen atom can donate electrons. So, this is really astonishing. As you know, electrons are always bound in most compounds. However, hydrogen and oxygen as well as sulphur and similar atoms have electrons, two electrons, always pairs of electrons that are not bound, chemically bound. These are called a lone pair of electrons, the French always say, "cherchez la femme", so in French this would be " unmarried electrons", "électrons célibataires". So, one of these unmarried electrons can transfer perfectly easily. Both from hydrogen, especially, and from oxygen. As well as sulphur. What we get is a completely new idea about life. And about living organisms. Also about the relation between molecules, and about everything that these delicate reactions could signify. So, we have a kind of cloud, an electron cloud, which disperses across two atoms. This is a spectacularly delicate connection where anything and everything could happen with the electrons. This includes the completely unexpected. And up until now, we have always believed that carbon is present, with its four valances and large molecules, which is correct. However, oxygen and hydrogen are only present to create acid and alkaline valances and possibly hydrogen compounds and so on, otherwise they don't have a purpose. But now we come to a new idea. Perhaps this is completely wrong. And perhaps this is the essence or one of the intrinsic factors of life, these electron clouds. And each hydrogen atom and oxygen atom, along with carbon and sulphur atoms, are wonderful donors with their unmarried electrons. Yes, but such a donor only makes sense if there is an acceptor. When a girl runs around finds no one to take her in, she makes no progress. Yes, acceptors are also needed. So, what are acceptors? No atom can be an acceptor. There is, however, a compound, the C-O bond, or every double bond, every double bond is a good acceptor. Oxygen is not alone in not being an acceptor. Carbon is not an acceptor but the electron clouds, present as an occupied electron cloud always in a double bond An empty one, which is also a good acceptor. But this makes the whole thing really exciting. And this is why: - Can I have the next slide please. This is a peptide bond. As you know, Thyrell discovered, or this was known already, that all proteins are made up of a huge number of amino acids, and two amino acids join with a peptide bond. There are therefore innumerable peptide bonds. Almost only one less, as many bonds as there are amino acids in one molecule. So, here is a peptide bond and there you can see what is so exciting, that's an acceptor, this double bond, a strong acceptor group, and here is a strong donor group. So, each bond has a donor, which means the possibility of a really large number of these change transfers This gives us a completely new possibility, doesn't it, for it is then possible that these clouds, here we say a peptide chain – next slide please. These are peptide chains here, which I have simply labelled as peptide chains. And when this oxygen generates a charge transfer with the next peptide chain, and this in turn with the one after, then the whole protein molecule or two molecules touching one another here join to make up an electron cloud. And this gives rise to quite different ideas about the real significance of a protein. Indeed, this leads to infinitely new things, I mean that it is only a fanciful notion at the moment, but a beautiful fanciful notion. So, those would be the possibilities, and each such charge transfer is a bond, evolving into a very large number of bonds, with weak bonds appearing, between protein chains or various molecules. So far, so good, but how to prove it? Proving it is not possible, unfortunately that doesn’t work. Simply because these transfers, meaning the cloud, do not sit on an atom but are dispersed, and therefore do not emit an electron spin signal. So what we can do right now is to investigate simple proteins and ask: Therefore, assuming we have the picture right, there must be very many weak bonds in the peptide chains and between the molecules, a veritable multitude. And a system where the components are held together by weak bonds, many weak bonds, has properties that are quite different from a system with few strong bonds. May I have the next slide please. Here I have roughly outlined the whole thing. Two molecule surfaces bound together by a strong bond, and here two molecule surfaces bound together by many very weak bonds. So what is the difference between the two? This is quite a delicate matter. To separate the two molecules I need enough energy to break the bond, let's say around 15 calories. Indeed, if I have a few weak bonds here, say 15 of them, I need the equivalent of the same energy as before if I want to proceed in this direction. But not if I come from the side. If I start at the side, here for instance, then I only need to break one bond at the moment if I start here. This is only one calorie. Then we move to the next bond, the second calorie, and then the third, so with a minimal amount of energy, namely only one calorie, I can break up the whole thing. And this has very interesting characteristics. If I break one bond, the next will be predisposed to break. It is too weak to hold the whole thing. It breaks as well, and the whole process is self-perpetuating. And this also works in reverse: if I create a bond, the next will form more easily. As you can see, the whole thing can continue to move along. It makes up a system, an "all-or-nothing" system, where either everything happens or nothing at all. We see systems of this kind in everyday life, don't we. Take a zipper, something you are familiar with, right? The zipper on a pair of men's trousers, such a zipper. A zipper is such an "all or nothing", you know it can only be unzipped from one end if you want to open it. And the it is zipped upwards. Closed from the other if you want to reverse the process. And, sometimes to our chagrin, it parts way in the middle, which opens the whole thing up and causes great inconvenience. There are various kinds of all-or-nothing stories, which can have the same effect. And what’s more - the characteristics that emerge can be completely weird. If I have two particles which have this weak energy on the surface binding them, they can rotate freely around each other without using energy. Because on the one side I then break the bonds and, on the other, I create bonds. This activity therefore costs me nothing. They can move around without any energy. They behave, in other words, like a liquid. At the same time, however, they are always held together at one point, which means they behave like solid matter. This is really strange, they are both solid matter and liquid, in one state and in the other. And living tissue has these properties. Wonderful. Take the tissue which is most easily accessible, skin, here is my skin, and this is the point: it is neither solid In my view, very robust, my skin would do any boot proud. At the same time, however, it is fluid, I can pull on it. And then it returns to its original state, to put it another way, it is fluid in its movement. This is the way it is, and then we progress to something very important, if I cut myself, these are cells which have remained undisturbed for 75 years and they are bound together in a solid configuration, all very firm in one respect. But when I cut myself, the picture then changes completely. The cells that were formerly strongly bonded together part ways, seep in a fluid movement into the wound and disperse. And in order to disperse a cell must be fluid, because otherwise it would not be able to make this transformation. So, all of a sudden, the whole thing takes on liquid form. And with anything to do with wounds, we need to be careful, very fluid, not to be touched. And as soon as the whole thing has sealed up, it fills out and a scar forms which is even more durable than before. As you see, there are these huge changes, these "all or nothings", these all-or-nothing changes, either into the one or the other state, either a fluid, active state or firm, static state. Consequently, we need to place a new demand on the system. Namely, if this is so, in this scenario, that there are ruptures in the wound, suddenly all these bonds are ruptured and it liquefies. Consequently, these bonds must be of a kind that can be easily and suddenly split. I cannot, for each bond, something special So the bond is that way. Electron charge transfers behave in a similar way. Because if I introduce strong donors, meaning electrons, into the system, the electrons will ... let's say, here is a donor and an acceptor which form a bond, the new acceptors which I introduce will compete with these donors and have a splitting effect. So by changing the electron voltage, therefore to speak, I can cause the whole thing to break up. Or to change if I introduce an acceptor to bind all these free electrons or strong, extremely active electrons, as the chemists would be sure to say, about the low ionisation potential, then the activity needs to cease, which then achieves a stable state. So this all makes sense. And then I look around to see if nature actually applies this principle. This acceptor-donor principle in its manipulations, and I have always been interested in plant oxidisation systems, and the first system which I worked on was the polyphenol oxidase system in plants. Yes, I need to add something. If a living system is able to induce a stable state through an electron acceptor which is introduced, I can use an electron acceptor to do the same, to eliminate all active electrons. Let's take an acceptor, and the acceptor I introduce must be a lot stronger than the acceptor lasts, otherwise it won't be able to compete. So how can one – I know only one acceptor and that is the CO bond, in actual fact a double bond, although there is also CC bond as well as NN – increase the activity of this bond? The answer is that I can't. So what can be done? How about taking two. That's simple. Then it will be twice as strong, won't it? So, if we take two, and if this does not suffice, I can take two COs, which means I can then count another double bond, a jointly conjugated electron system, which then becomes extremely strong. So, what is the strongest acceptor for regulation? Next slide please. The strongest acceptor would then be this one. In other words, a simple aromatic ring, and which is then immensely strong. It's the strongest, so strong a regulation that it kills everything. Killing is also a regulation where irreversible activity to CO is done. This is what we're doing now in Vietnam. This is the strongest bond. The next strongest bond would be where one takes the two CO apart a little, and then a little more in levels, to go a little into the side chains and then the next would the aliphatic bond where only 2 CO bonds are joined. I mentioned a while ago that I was very interested in plant systems and naturally, first of all the completely obvious, by which I mean plants that change colour when they are exposed to a specific influence. For instance, if you drop an apple it will have a brown patch the next day. And the colour has changed. Next slide please. It will not have escaped your notice that this is a banana, an Austrian one to be precise, because it is black and yellow. Thank you. So, this is an Austrian black-yellow banana, which has gone black because I have been maltreating it a little, because I dunked half of it in chloroform for a moment, and the next day it had gone Austrian. So what exactly did I do? As a young boy I – yes, it's very striking, isn't it? So, as a young boy I was very interested in this and discovered – what was partly, but not fully, known – what was actually going on here. Can I have the next please, that's the same again. There is a substance in the plant, some kind of a substance, the two hydroxyl groups, so that's the donor, a harmless affair, that promotes activity. And next to it is an enzyme, which takes two or one election from it, changing it all into a very strong oxidation agent. Now I would ask you to turn your attention to two great principles. One of the principles is what does nature do when it, it changes something, doesn’t it? Nature always kills two birds with one stone. It takes a system which exists in a living plant in a harmless form. Then, when something goes wrong, when the plant is compromised, the system and the enzyme attack the substance, accepting the two electrons and making an oxidisation agent, my electron acceptor. The second principle, which is very important and interesting, is that nature will defend itself if it suffers damage, that the damage not only creates damage but, at the same time, catalyses a system which rectifies the damage or protects us against it. You all know this from real life, if you go swimming, and if on that day the sun is shining brightly, then the sun's rays will damage your skin a little, which will then turn red, won't it? And then there is a system which also contains a phenol and an enzyme, which are both delicately kept apart, a separation which can be very easily destroyed. Sunshine is damaging to them and adversely affects the separation, the things come together. The culture oxidises. Phenol creates a pigment, and the pigment defends you against the sun. This is a fundamental principle of nature. Very, very ingenious. This is all around us, if you cut yourself and bleed, the cut activates a system, an enzyme system again, which creates fibrin to stop the blood which then ceases to flow. As I said before, you will frequently come across this system. A wonderful system. Our Creator, if we have one, must have had a lot of fun with it. Take the example of a plant that gets bacteria – it thinks now I will have an excellent Bavarian breakfast, and it begins to eat, at the same time activating the system that kills it. It has fallen into a trap. Nature has set a trap for the bacteria, which protects at the same time. So, this is the story of plants, known as polyphenol oxidase. The essence is naturally contained in the undamaged plant where the enzyme needs to be separate from the substrate and this separation must be very fine so that the most minute, the tiniest pathogen can be destroyed. Enzyme and substrate join forces and trigger the whole process. Once I had found out a little about what happens to these bananas, I ... half the plants are plants which changes colour. The other half doesn't change at all, such as lemons or oranges. You can chuck them on the floor, they won't go black. So, why not? This is something I worked on for many years without any success in solving the problem. My endeavours and my time were not entirely wasted as my work led me to the chance discovery that these systems contain a strong reducing agent. Naturally, as a good boy, I isolated this, finding what you know today as ascorbic acid. Ascorbic acid is a strong reductant which can always maintain phenols in a reduced state. Precisely, in recent times I have turned my attention to this system again and discovered that these plants have this kind of system. It is very similar to this. However, when two acids are set apart, the result is not black, solid or liquid – it remains colourless. There can be no bond with proteins. Consequently, this is simply what we have: these things are present in the plant and held in a reduced state by the ascorbic acid. If the plant is damaged, the ascorbic acid is oxidised away. It disappears and is no longer active. These substances then autooxidise to become dizinon, to paradizinon, and it kills the bacteria. So the same story again. It now becomes quite clear. The animal system, however, would not be able to function in this scenario. Plants are much more robust. The animal system is very unstable and extremely sensitive. It would not be able to work with this kind of conjugated double-bond system. These are frightfully strong acceptors which will only tolerate aliphatic dicarbonyl, two COs. The simplest aliphatic compound – next slide please – is the simplest dicarbonyl with a methyl, which is a glyoxal derivative. If one now wants to combine two COs, the question that needs to be asked is what type of CO do I want to attract, there are two different types. There is the ketone CO, which is simple CO, C here and C there, which has excellent thermodynamic properties. In chemical terms, however, it is very lazy and inert. The other type is where C is replaced by hydrogen, which is then an aldehyde. Aldehyde is in thermodynamic terms not as good. It is, however, highly reactive. The ideal would therefore be an aldo-ketone. Naturally, a ketone-aldehyde where one CO is like this and the other like that. And the simplest ketone-aldehyde is the one where a simple methyl group is attached, which would be methylglyoxal. This makes it all very exciting. So what's so hot about such a silly molecule? What is so exciting is that all living cells, all of them that we so far know of, are composed of an extremely active enzymatic system that converts methylglyoxal into lactic acid. Next slide please. Here I don't want to go into detail – there is methylglyoxal , and no - here is methylglyoxal which has two enzymes and a glutathione. All of them together react, and what we get in the end is lactic acid. The active ketone-aldehyde is gone, converted into tame lactic acid that can't do any damage. All living cells – thank you, that was sufficient – all living cells have extremely active methylglyoxal. And this is what is so wonderful, you see. In the first half of the century, our greatest biochemists, Neuberg and Dakin and Racker and Hopkins, were looking into this, and then slowly interest waned as no methylglyoxal was found. But there has to been something like methylglyoxal, as the enzyme, nature itself, it has no time for luxuries. An active enzyme is not just there for beauty's sake, there has to be something else There has to be a substrate, and this substrate must have an absolutely fundamental purpose. This substrate has to be a ketone-aldehyde, which makes it a good acceptor. This, in turn, has to do with a function connected with ketone-aldehyde and with the acceptor properties of ketone aldehyde. Yes, of course, given all the time I have spent studying plants it is natural that this was a growth inhibitor, right? The real issue at stake is this: All living tissue has a great propensity to multiply. The more active the system is, the more life there is, the more activity, and life wants to multiply, doesn't it? This is evident in the population explosion, life wants to multiply, multiply, multiply. As long as bacteria and lower-state things have nourishment, they will multiply rapidly. But this will not do in a multiple-cell organism. It all needs to be held in check in the interest of the whole. How is this living tissue restrained? Then the penny drops: perhaps this is a type of ketone-aldehyde. And perhaps it was difficult to find because not very much of it is needed. We have all ketone-aldehydes which can be tolerated, structured, chemical, and have found that in the minutest, one-thousandth molar concentration, all growth is kept in check, but they don't cause any harm. They are not at all poisonous in this concentration. They don't do a thing. Simply nothing, which means that nothing can multiply. Consequently, we arrive at a theory that our tissue is kept as it is precisely through ketone-aldehyde, which is present only in the minute quantity necessary and possible, which makes it impossible or very difficult to discover. Particularly, because ketone-aldehyde is highly reactive and binds easily with sulphur. As a result, ketone-aldehyde was only discovered in tissue in the very recent days. Now I want to go one step further by saying: Assuming that everything I have said is true and that in life, tissue is kept in equilibrium by a ketone-aldehyde, and assuming this is a highly active enzyme which serves to separate a frightfully delicate system from this kind of substrate and the wall separating the two was not properly structured, and the enzyme were to constantly eat away at the substrate? The cell would then start to multiply in a disordered fashion. And if a cell does this, it is called cancer, and this is what cancer is. At the present point in time, I believe that cancer is a state where enzyme and substrate are not precisely separated from one another, that the enzyme eats up the substrate in a senseless fashion, and the cell starts to multiply. Naturally, you then say: Well, if this is true, the cancerous cell must produce lactic acid because methylglyoxal always turns into lactic acid. And if we go one step further, we would say that it can only be the cancerous cell that produces aerobic lactic acid. This is precisely what Warburg discovered. Warburg found that it is only the cancer cell which produces lactic acid, aerobic. Naturally, his explanation of the production of lactic acid is different and I regret that he is not here, as he would be very angry with me. But because he isn't here, I can go on talking about it. I have looked at all of it, the literature, the proof that it comes from metabolism and not from methylglyoxal. It all proves nothing - it's too weak. I can't and don't want to continue talking about it without Warburg being present. So, let's go back to what I mentioned before about cancer. This is a theory, but nonetheless a good theory, a very good theory. A theory doesn't need to be true. There is only one condition: Please say whatever you want, but smile a little at the same time. So, I mention the theory with a little smile. It is a good theory because it is the first theory about cancer which is a bit physiological. It really is physiological and quite, quite simple. And secondly, there are many ideas about how to stop cancer, to prevent it from growing and make it go away. We are working on this very intensively now. I have this knowledge about cancer, which is in the process of evolving. I have revealed it because I wanted to show that these very abstract issues about electron clouds which we talk so much about, and that seem so pointless in biochemistry, may not only be deeply significant, but may also help us in solving humanity's most dreadful problems, at the beside of the those are ill. Thank you.

Graf Bernadotte, Kollege... (inaudible), ich danke Ihnen. Damen und Herren, wie Sie alle wissen, steht das biologische Denken heute ganz unter dem Einfluss der molekularen Theorie. Und diese Theorie besagt, dass das lebende System gebaut ist aus abgeschlossenen Einheiten mit einer abgeschlossenen Elektronenschale, Moleküle. Und diese Moleküle, die werden da durch die Wärmeagitation herumgestoßen und manchmal treffen sie sich. Ich habe nie wirklich glauben können, dass diese wunderbare Feinheit und Adaptabilität und Zupassung der lebenden Natur dadurch allein zustande kommen könnte und ich habe mich hier in Lindau gefragt, ob wir nicht in derselben Lage sind wie ein Mann, der die Sitzung der Nobelpreisträger in Lindau von einer Höhe von 10.000 Metern beobachten würde. Und wenn man den Menschen, den Mann, fragen würde: Und manchmal auch zusammenstoßen, dann wieder auseinandergehen, und das sei alles“. Das habe ich nie wirklich glauben können und ich würde sagen, das Hauptergebnis meiner langen Forschertätigkeit von über 50 Jahren ist eine tiefe Bewunderung für diese herrliche Feinheit der lebenden Natur. Dass diese Moleküle wirklich nicht so isoliert sind und nicht so abgeschlossen, wie uns das die molekulare Theorie will glauben lassen, den ersten Hinweis hat Weiss in England gefunden, in 1942. Der fand, dass wenn er ein starkes Oxidationsmittel und ein starkes Reduktionsmittel zusammenbringt, die machen einen Komplex. Und dieser Komplex entwickelt dann einen Dipol-Moment. Dipol-Moment heißt, dass das Molekül ein positives und ein negatives Ende hat. Und er hat gleich richtig gesehen, dass das nur dadurch zustande kommen kann, dass ein Elektron von dem einen Molekül vom Reduktionsmittel auf das Oxidationsmittel übergeht. Denn wir wissen doch, dass Oxidationsmittel die Sachen sind, die sehr gerne Elektronen aufnehmen und Reduktionsmittel sind die Sachen, die sehr gerne Elektronen oder Wasserstoffatome wieder abgeben. Also, das stimmt sehr gut. Da hat er gleich die ganze Folge - darf ich das erste Lichtbild haben – gleich richtig eingesehen, nicht wahr, also das Elektron, das eine Molekül gibt ein Elektron ab, das ist ein Donor,nicht wahr. Dann, das andere nimmt es an, das ist dann ein Akzeptor und das wird dann kurz D oder A genannt. Also wie das Weiss dann richtig gesehen hat, im ersten Schritt machen sie einen Komplex, der durch gewöhnliche Kräfte da aufrechterhalten wird. Dann, in dem Komplex, geht ein Elektron über. Ein Elektron geht auf den Akzeptor über. Wie Sie wissen, in allen Molekülen sitzen die Elektronen immer paarweise. Da sind immer zwei zusammen. Die sind paarweise, also ein Elektron reißt sich da von seinem Paar los und geht auf den Akzeptor über, der dann negativ geladen wird. Das hat eigentlich gar kein - das sieht man nicht. Nur durch die Dipolmomentmessungen, die furchtbar schwierig und sehr umständlich sind, eine gute Dipolmessung, da sieht man noch gar nichts. Aber wenn die Umstände sehr günstig sind, absolut günstig, dann kann es geschehen - und die Energieverhältnisse auch -, dass sich die zwei Sachen losreißen und dann dann sind es zwei selbständige Teilchen, ein Akzeptor mit einer negativen Ladung und ein Donor mit einer positiven Ladung und das ist, was man jetzt ein freies Radikal heißt. Das ist dann ein freies Radikal. Und das gibt, das kann man schon nachweisen, das kann ein Zeichen geben oder ein Signal geben in der Elektronspin-, ich weiß nicht wie das heißt, Elektronspinresonanzmaschine, nicht wahr. Die Elektronspin, also die Maschine, das ist so eine Maschine mit 1.000 Knöpfen und die füllt ein ganzes Zimmer, und Sie wissen, dass eines der Gesetze ist, dass je kleiner ein Teilchen ist, desto größere Maschinen man braucht, nicht wahr, um die nachzuweisen. Also das Elektronspinresonanzspektroskop, das gibt ein Zeichen, wenn sich ein Elektron von seinem Paar losgerissen hat und da alleine sitzt. Also, wie kann man sich das dann richtig vorstellen -darf ich das nächste Lichtbild haben. Hier - Sie wissen, dass die Elektronen da in jedem Molekül oder Atom so eine Wolke bilden und die Wolke hat so eine gewisse Lokalisation, die man Orbital nennt, und diese Orbitals die haben verschiedene Energieniveaus. Und auf diesem Lichtbild sind die besetzten Orbitals, natürlich, es gibt besetzte und leere Orbitals. Sie sagen dasist gar nichts leeres, das ist da, das ist eine physische Wirklichkeit, aber da sitzt nichts dran, so wie ein leerer Stuhl. Also das sind die besetzten, mit der dicken Linie, das sind die dünnen, also wenn das ein Oxidationsmittel ist, wenn das ein Reduktionsmittel ist, das heißt, dass es ein Elektron auf einem sehr hohen Orbital ist, auf einem sehr hohen Niveau und es sehr leicht abgibt, und wenn der Akzeptor, also das Oxidationsmittel einen leeren Stuhl hat, also auf einem niedrigen Niveau, dann kann das Elektron da hinübergehen, das liefert dann die Energie und die zwei Ladungen, positive Ladung -das bleibt positiv, das negativ - die auseinander, wenn diese Energie da ausreicht. Das ist dann der Grundzustand, da ist keine Erregung dabei, nur der Aufträger ist erregt, der Vorträger ist nur erregt, das ist der Übergang in den Grundzustand oder man so sagt auch starke Elektronenübertragung. Nachher hat man dann eine andere Art von Elektronenübertragung entdeckt und vielfach untersucht, besonders Mölleken, wo das Elektron raufgeht - darfich das nächste Bild. Natürlich könnte das Elektron nie tun, auf ein höheres Niveau allein zu gehen. Da gibt es keine Energie dazu. Es kann aber geschehen, dass ein Elektron durch ein Photon, durch eine Lichtenergie erregt wird, damit kann diese Energie sie dann hinüberstoßen auf das höhere Niveau, das ist dann Elektronenübertragung im erregten Zustand, nicht wahr. Die wichtigste chemische Reaktion des Lebens ist so eine Reaktion. Das ist die Erregung des Chlorophyllmoleküls in den Pflanzen, das Elektron wird durch das Licht erregt und auf ein höheres Niveau gebracht, nicht wahr. Also, was gewöhnlich geschieht, natürlich fällt das Elektron gleich wieder zurück, die Wolke verteilt sich auf die zwei Moleküle und das Elektron fällt zurück, aber das Leben hat gelernt, das Elektron hier zu packen mit einem Metallatom, mit einem Eisenatom und dann hat es ein bisschen Energie und das ist die Energie, wovon Sie alle leben, wovon wir alle leben, von dieser Energie, die dieses Photon da hineingebracht hat. Also, um zusammenzufassen, bitte das nächste Lichtbild. Also, da gibt es zwei Elektronenübertragungen, wo das Elektron hinübergeht und wie das Elektron hinuntergeht, das ist im Grundzustand. Jetzt ist die Frage für den Biologen: Was kann man damit jetzt in der Biologie machen? Gar nichts. Weil, aus dem einfachen Grunde, es gibt kein Licht in unserem Körper. Also, wenn man von tierischer Physiologie spricht, es gibt kein Licht im Körper – nur im Auge vielleicht - also das taugt nichts. Und es gibt keine starken Oxidationsmittel im Körper, die könnten wir nicht vertragen. Die würden uns töten, starke Oxidationsmittel. Also, die gibt es nicht. Da könnte man nicht mit charge transfer – wie das in Englisch heißt, Elektronenübertragung –beginnen. Die Elektronenübertragung könnte eine große Bedeutung haben. Wirklich, wenn es da auch einen, auch in dem Mittelgebiet, wo die Elektronen, wo die Substanzen keine großen Oxidationsmittel sind und keine starken Reduktionsmittel sind. Wenn die auch eine Elektronenübertragung zeigen könnten. Denn unser ganzer Körper ist auf solchen Substanzen aufgebaut, die nicht starke Oxidationsmittel sind. Also mein Haupt-Fachfrage war jetzt: Ob da in diesem Mittelgebiet, wovon der ganze Körper aufgebaut ist, es da auch eine Elektronenübertragung geben könnte. Aber ja, die Frage, die Schwierigkeit kommt jetzt: Wie könnte man die nachweisen? In diesem Gebiet, ja, könnte man nicht warten, dass ein Elektron, dass die Elektronenwolke ganz übergeht auf ein anderes Molekül. Die würde sich nur verteilen, die Elektronenwolke. Das was wir betrachten in Elektronen wie eine Wolke. Die Wolke würde sich nur verteilen über die zwei Moleküle, demDonor und dem Akzeptor, und in diesem verteilten Zustand bekommt man noch kein Elektronspinresonanzspektrum, oder kein Zeichen in dieser Maschine. Also, wie könnte man da irgendwie weiterkommen? Ja, man kann weiterkommen, mit einem kleinen Trick. Es kommt immer auf kleine Tricks in der Wissenschaft an, denn wenn man ganz besondere günstige Zustände nötig hat, um ein ganzes Elektron zu überbringen, ja – dann soll man versuchen, ganz besonders günstige Zustände zu machen und dann sehen, ob ein Elektron da übergehen will, mit Substanzen, die wirklich in unserem Körper vorkommen. Also, da haben wir doch alle möglichen Substanzen, Eiweiße und Aminosäuren und alles genommen und da den Umstand besonders günstig gemacht, dadurch, dass wir einen starken Akzeptor hineinsetzten in einem besonders guten Lösungsmittel - es gibt besondere Eigenschaften, die man abwartet – und dann haben wir die Sache in die Elektronspinresonanzmaschine hineingesteckt und da bekommen wir ein wunderbares Signal. Wer von Ihnen mit der Elektrospinresonanzmaschine gearbeitet hat, weiß, wie wunderbar dieses Signal ist. Da gibt es Abstände, aus denen man alle Sachen berechnen kann. Das ist ein wunderbares Signal. Und wir haben gefunden, dass jedes Stickstoffatom und jedes Sauerstoffatom kann Elektronen abgeben. Also, das ist sehr überraschend eigentlich. Sie wissen wohl, dass die Elektronen immer da in den meisten Verbindungen immer gebunden sind. Aber Stickstoff- und Sauerstoff- und auch Schwefel- und so Atome haben Elektronen, zwei Elektronen, immer Elektronenpaare, die nicht gebunden werden, chemisch gebunden sind. Das heißt „lone pair of electrons“, die Franzosen sagen immer „cherchez la femme“, also auf Französisch heißt das „die unverheirateten Elektronen“, „électrons célibataires“. Also, von diesen unverheirateten Elektronen kann eines furchtbar leicht übergehen. Sowohl von Stickstoff, besonders, und auch von Sauerstoff. Und auch Schwefel. Das bringt einen zu einer ganz neuen Idee über das Leben. Und über die lebende Materie. Und das Verhältnis von Molekülen und was das alles, diese feinen Reaktionen bedeuten könnten. Da gibt es dann so eine Wolke, Elektronenwolke, die sich da verteilt über zwei Atome. Das ist eine wunderbare feine Verbindung, wo mit den Elektronen alles Mögliche passieren kann. Das sind ganz unerwartete Sachen. Und bis jetzt haben wir immer gedacht, dass Kohlenstoff da ist mit seinen vier Valenzen und großen Molekülen, das ist richtig. Aber Sauerstoff und Stickstoff sind nur da, um Säure und basische Valenzen zu schaffen und vielleicht Wasserstoffverbindungen und so, aber sonst haben sie nichts zu machen. Aber jetzt, das führt zu einer neuen Idee. Vielleicht war das ganz falsch. Und vielleicht ist das Wesen oder einer der wesentlichen Faktoren der Leben diese Elektronenwolken. Und jedes Wasserstoffatom und jedes Sauerstoffatom und Kohle- und Schwefelatom ist so ein wunderbarer Donor mit seinen unverheirateten Elektronen. Ja aber, so ein Donor hat nur einen Sinn, wenn es auch einen Akzeptor gibt. Wenn so ein Mädel herumläuft und niemand findet, der sie wieder aufnimmt, dann kommt sie nicht weiter. Ja, da müssen auch Akzeptoren sein. Also was sind Akzeptoren? Es gibt kein Atom, das ein Akzeptor sein kann. Es gibt aber eine Verbindung, das ist die C-O-Bindung, oder jede Doppelbindung, jede Doppelbindung ist ein guter Akzeptor. Nicht nur Sauerstoff ist kein Akzeptor. Kohle ist kein Akzeptor, aber die Elektronenwolken, da ist eine besetzte Elektronenwolke in einer doppelten Bindung immer - so eine Paarelektronenwolke – und eine leere, ein antibonding Paarelektron-Orbital, wenn ich das ganz wissenschaftlich aussprechen soll. Eine leere, und auch das ist ein guter Akzeptor. Aber das macht die Sache furchtbar aufregend. Aus dem folgenden Grunde: Die, wie Sie wissen, Thyrell hat ihn, oder sie wussten schon früher, dass alle Proteine aus einer großen Anzahl von Aminosäuren aufgebaut sind und zwei Aminosäuren verbinden sich mit einer Peptidbindung. Also es gibt da zahllose Peptidbindungen. Beinahe eins weniger nur, so viele Bindungen, wie es Aminosäuren in einem Molekül gibt. Also da ist so eine Peptidbindung und da sehen Sie die aufregende Sache, da ist ein Akzeptor, diese Doppelbindung, eine starke Akzeptorgruppe und hier ist eine starke Donorgruppe. Also in jeder Verbindung sitzt da ein Donor, also ist da die Möglichkeit gegeben, dass da wirklich eine große Anzahl von diesen charge transfer – diese Elektronenübertragungsbindungen da - zustande kommt. Das ist eine schwache chemische Bindung von ungefähr 1 Kalorie. Also das gibt eine ganz neue Möglichkeit, nicht wahr, denn das ist möglich, dass sich diese Wolken dann, da sagen wir eine Peptid-Kette –bitte das nächste. Das sind Peptidketten hier, da habe ich einfach Peptidketten aufgeschrieben. Und wenn dieser Sauerstoff eine Elektronenübertragung mit der nächsten Peptidkette macht, und diese mit dem nächsten, dann wird das ganze Eiweißmolekül oder zwei Moleküle, die sich hier berühren, nicht, zu einer Elektronenwolke verbunden. Und das macht ganz verschiedene Ideen, was ein Protein eigentlich bedeuten könnte. Denn das kann dann endlos durchgehen, ich meine, das ist natürlich nur Phantasie im Augenblick, aber eine schöne Phantasie. Also, das wären dann die Möglichkeiten und eine solche, jede Übertragung ist eine Bindung und da würde dann eine sehr große Anzahl Bindungen, schwacher Bindungen zustande kommen, zwischen Eiweißketten oder verschiedenen Molekülen. Also – ja, es ist richtig, aber wie kann man das beweisen? Man kann das nicht beweisen, leider geht das nicht. Weil eben diese Übertragungen, das ist die Wolke, sitzt nicht auf einem Atom sondern sie verteilt sich und dann gibt sie kein Elektronspinsignal. Also was wir tun können im Augenblick, dass wir einfach Proteine untersuchen und fragen: Also, wenn das Bild richtig ist, dann muss es da sehr viele schwache Verbindungen geben in den Peptidketten und zwischen den Molekülen, sehr große. Und ein System, wo die Teilchen mit schwachen Bindungen, vielen schwachen Bindungen zusammengehalten werden, hat ganz andere Eigenschaften als ein System mit wenigen starken Bindungen. Darf ich das nächste Lichtbild haben. Hier habe ich sehr schematisch die Geschichte schematisiert. Zwei Moleküloberflächen, die mit einer starken Bindung verbunden sind und hier sind zwei Moleküloberflächen, die mit vielen, sehr schwachen Verbindungen gebunden sind. Ja, also was sind die Unterschiede zwischen den beiden? Diese Sache wird sehr spröde sein. Und um die zwei Moleküle zu teilen, muss ich dieselbe Energie aufwenden, die nötig ist, um diese Bindung zu brechen, also sagen wir rund 15 Kalorien. Ja, wenn ich hier ein paar schwache Bindungen habe, sagen wir 15 schwache Bindungen, brauche ich wieder dieselbe Energie wie vorher, wenn ich in dieser Richtung ziehe. Aber nicht, wenn ich von der Seite ziehe. Wenn ich an der Seite beginne, wie hier, sagen wir hier, in der Seite, dann muss ich, wenn ich da beginne, muss ich nur eine Bindung brechen zur Zeit. Das ist nur eine Kalorie. Und dann kommt die nächste Bindung, die zweite Kalorie und dann die Dritte, also mit einer furchtbar schwachen Kraft von einer Kalorie kann ich das ganze Ding trennen. Und das hat ganz interessante Eigenschaften. Wenn ich da einen Bond breche, dann prädisponiert der nächste zum Brechen. Das ist zu schwach, um die Sache zu halten. Dann bricht der und so läuft die Sache ganz hinüber, ganz von selbst. Und auch zurück kann sie, wenn ich eine Bindung mache, die nächste entsteht leichter. Also, die ganze Sache kann so ganz entlang laufen. Es macht ein System, was man ein „Alles-oder-nichts-System“, „All-or-Nothing“, Alles-oder-nichts-System – entweder geschieht alles oder gar nichts. Sie kennen solche Systeme aus dem Leben, nicht wahr. Sehr bekannt, das Zip, Sie wissen was Zip ist, nicht wahr? An der Herrenhose Zip, so ein Zip. Zip ist so ein„All-or-Nothing“, Sie wissen, dass man Zip nur von einer Seite öffnen kann. Und dann geht es auf, nicht wahr. Oder von der anderen Seite schließen, dann geht es wieder zu. Und manchmal passiert es, dass es in der Mitte auseinandergeht und das wird verflucht, nicht wahr, dann geht die ganze Sache auf. Und macht einem furchtbare Unannehmlichkeiten. Es gibt verschiedene solcher All-or-Nothing-Geschichten, die dasselbe erreichen können. Und außerdem - ganz verrückte Eigenschaften kommen da raus. Wenn ich zwei Teilchen habe, die an der Oberfläche diese schwachen Kräfte haben, die es verbinden. Die können frei gegeneinander rotieren, ohne Energie aufzuwenden. Denn an der einen Seite breche ich die Verbindungen, an der anderen Seite schaffe ich die Verbindungen. Also es kostet mich gar nichts. Die können ohne Energie sich da herumbewegen. Sie verhalten sich also wie eine Flüssigkeit. Aber zur gleichen Zeit, immer werden sie an einem Punkt zusammengehalten. Also verhalten sie sich wie feste Stoffe. Also ist es ganz verrückt, sie sind feste Stoffe und zugleich sind sie Flüssigkeiten, in einer Beziehung und in einer anderen. Und das lebende Gewebe hat diese Eigenschaften. Wunderbar. Also das Gewebe, das am einfachsten zugänglich ist, die Haut, also hier ist meine Haut, und das ist die Sache: sie ist weder fest – sie ist in einer Beziehung sehr fest, das ist eigentlich die Aufgabe meiner Haut, meinen Körper zusammenzuhalten, und mich zu beschützen, eigentlich, gegen alle möglichen Sachen. Also ich finde, sehr fest, meine Haut würde jedem gute Stiefel machen. Aber zur gleichen Zeit ist sie flüssig, nicht, ich kann sie herausziehen. Und dann geht sie wieder zurück, nicht wahr, da fließt sie zurück sozusagen. Also das ist so, und dann noch etwas sehr wichtiges, wenn ich mich schneide, also diese Zellen waren also für 75 Jahre in Ruhe und sie sind sehr fest zusammengehalten da, nicht wahr, darum ist das sehr fest in einer Weise. Aber wenn ich mich schneide, sagen wir, dann verändert sich das ganze Bild. Die Zellen, die früher stark zusammengehalten waren, machen sich los und die kriechen mit einer flüssigen Bewegung einer Flüssigkeit in die Wunde und verteilen sich. Und zum verteilen muss eine Zelle auch flüssig sein, sonst könnte sie nicht diese Umordnung machen. Also auf einmal wird die Sache flüssig. Und diese ganze Wundgeschichte, da muss man aufpassen, ist sehr flüssig, nicht anrühren. Und dann, sobald die Sache gefüllt ist, dann füllt sich alles aus und dann bekommt man eine Narbe, die noch viel härter ist als früher. Also, da gibt es diese großen Veränderungen, diese All-or-Nothing, diese Alles-oder-nichts-Veränderungen, entweder in diesem oder in dem anderen Zustand. Also flüssiger aktiver Zustand oder der feste Ruhezustand. Ja, aber da müssen wir dann eine neue Forderung an das System stellen. Nämlich, wenn das so ist, nicht wahr, dass in dieser Regulation, dass da Spalten sind in dieser Wunde, werden dann plötzlich alle diese Verbindungen gespalten, es wird flüssig. Also diese Verbindungen müssen so sein, dass sie gespalten werden können, plötzlich. Ich kann nicht für jede Verbindung etwas Spezielles- durch eine Veränderung in einem Parameter, in einem Faktor muss alles auseinanderfliegen, nicht wahr. Also die Verbindung ist so. Und diese Elektronenübertragungsverbindungen sind dieser Art. Denn wenn ich das System starke Donoren also Elektronen einführe, die Elektronen werden mit den, sagen wir, da ist ein Donor und ein Akzeptor, die da verbunden sind, werden neue Akzeptoren, die ich da einführe, die werden mit diesen Donoren in Konkurrenz treten und die Sache spalten, das wird dann gespalten. Also mit der Veränderung der Elektronenspannung, sozusagen, kann ich die ganze Sache auseinanderfliegen lassen. Oder verändern, wenn ich dann einen Akzeptor hineinsetze, der alle diese freien Elektronen oder starken, stark aktiven Elektronen, so würden Chemiker sicherlich sagen, vom niedrigen Ionisationspotential, da binde, dann muss die ganze Sache aufhören zu arbeiten, kommt es in den Ruhezustand, nicht wahr. Also das entspricht sehr gut. Und dann habe ich mich danach umgesehen, ob die Natur dieses Prinzip wirklich verwendet. Dieses Akzeptor-Donor-Prinzip in seinen Manipulationen, und ich habe mich schon immer sehr auch für pflanzliche Oxidationssysteme interessiert, und das erste System über das ich gearbeitet habe, war das pflanzliche Phenoloxidase-System. Ja, eins muss ich noch hinzufügen. Wenn ein lebendes System diese ganzen Sachen mit einem Elektron-Akzeptor, den man da hineinsetzt, zur Ruhe bringen kann, mit einem Elektron-Akzeptor kann ich die Sache zur Ruhe bringen, nehme alle die aktiven Elektronen weg. Mit einem Akzeptor, da muss dieser zugesetzte Akzeptor viel stärker sein wie der Akzeptor dauert, sonst kann er nicht konkurrieren. Also wie kann man - und ich kenne nur einen Akzeptor, und das ist die CO-Verbindung, oder eigentlich Doppelbindung, weil ich ja auch, es gibt auch CC-Verbindungen und NN und so, wie kann ich die Aktivität dieser Bindung erhöhen? Ich kann die nicht erhöhen. Aber was kann man da machen? Man nimmt zwei. Das ist einfach. Dann wird es zweimal so stark, nicht wahr? Also man nimmt dann zwei und wenn das nicht genügt, dann nehme ich zwei solche COs und dann zähle ich noch eine zweite Doppelbindung, das ist doch so ein gemeinschaftliches konjugiertes Elektronensystem, dann wird es furchtbar stark. Also was ist der stärkste Akzeptor für Regulation? Darf ich das nächste Bild haben. Der stärkste Akzeptor wäre dann dieser da. Zwei CO nebeneinander und nicht nur das, sondern ein System, ein ganzes System von Doppelbindungen. Das heißt, ein aromatischer Ring einfach und das ist dann furchtbar stark. Das ist das stärkste, so ein starke Regulation, dass es alles tötet, nicht wahr. Töten ist auch eine Regulation, wo man auf CO irreversible Aktivität zurückbringt. Das machen wir jetzt in Vietnam. Das ist die stärkste Verbindung. Die nächste starke Verbindung wäre, wo man die zwei CO auseinandernimmt ein bisschen, und das kann man noch ein bisschen abstufen, noch bisschen Seitengruppen hineinzugehen, und dann, die nächste wäre die aliphatische Verbindung, wo man einfach, nicht zyklisch, einfach nur 2 CO-Verbindungen nebeneinandersetzt. Ich sagte eben, ich habe mich sehr an Pflanzensystemen interessiert und zuerst natürlich, was mir gleichsam ins Auge fällt, über Pflanzen, die die Farbe verändern, wenn man Ihnen etwas antut. Also wenn Sie Ihren Apfel fallen lassen, am nächsten Tag haben sie einen braunen Fleck dran. Nicht wahr, da hat sich die Farbe verändert. Und darf ich das nächste Bild. Vielleicht erkennen Sie, das ist eine Banane, und zwar eine österreichische Banane. Weil, sie ist schwarz-gelb. Dankeschön. Das ist eine österreichische schwarz-gelbe Banane, die schwarz geworden ist, weil ich sie ein bisschen sekkiert habe. Ich habe sie halb in Chloroform getaucht für einen Augenblick, und am nächsten Tag wird sie österreichisch. Was habe ich da getan? Da als Jüngling habe ich mich - das ist sehr auffällig, nicht wahr? Also als Jüngling habe ich mich damit beschäftigt und da habe ich gefunden, dass - zum Teil war es bekannt, aber nicht ganz - was da eigentlich los ist. Darf ich das nächste Lichtbild bitte, das ist wieder das gleiche. Da gibt’s in der Pflanze eine Substanz, irgendeine Substanz, die zwei Hydroxygruppen, nicht wahr, das ist ein Donor, eine harmlose Sache, die Aktivität befördert. Und daneben hat es ein Enzym, was zwei Elektronen davon, oder ein Elektron davon abholt, und dann wird das verändert in ein furchtbar starkes Oxidationsmittel. Jetzt möchte Sie bitten, zwei große Prinzipien zu beobachten. Das eine Prinzip ist, dass -was macht die Natur, wenn sie was - sie, sie verändert etwas, nicht wahr? Die Natur tötet immer mehrere Vögel mit demselben Stein. Sie nimmt ein System, das in der lebenden Pflanze da ist in einer harmlosen Form. Und dann, wenn etwas schiefgeht, wenn die Pflanze beleidigt wird, dann geht das System, dann geht das Enzym auf die Substanz los, nimmt die zwei Elektronen ab und macht daraus ein Oxidationsmittel, mein Elektronenakzeptor. Das zweite Prinzip ist, was sehr wichtig und interessant ist, dass die Natur sich dadurch verteidigt, dass sie, wenn sie einen Schaden erleidet, dass der Schaden nicht nur Schaden macht, sondern gleich ein System aktiviert, das den Schaden wieder gut macht oder uns dagegen verteidigt, nicht wahr. Sie kennen das alle vom Leben, wenn Sie ins Schwimmbad gehen, heute ist schöner Sonnenschein, dann beschädigt der Sonnenschein Ihre Haut ein bisschen, die wird rot, nicht wahr? Und da gibt es ein System, wo es wieder so ein Phenol gibt, und ein Enzym, und diese sind getrennt durch eine sehr feine Trennung, die sehr leicht vernichtet wird. Der Sonnenschein schädigt sie und das beschädigt die Trennung, die Sachen kommen zusammen. Das Ferment oxidiert. Das Phenol macht ein Pigment, das Pigment verteidigt Sie gegen die Sonne. Das ist ein grundlegendes Prinzip der Natur. Sehr, sehr geistreich. Das finden Sie überall, wenn Sie sich schneiden und sie bluten, der Schnitt aktiviert ein System, wieder so ein Enzymsystem, das dann Fibrin macht, dies stoppt dann das Blut und dann blutet es nicht mehr, nicht wahr? Also, immer finden Sie dieses System wieder. Ein wunderbares System. Unser Schöpfer, wenn es einen gibt, muss sehr viel Spaß damit gehabt haben. Denn wenn, sagen wir so eine Pflanze und ein Bakterium kommt, jetzt werde ich ein gutes bayerisches Frühstück haben, und dann beginnt sie da zu fressen und aktiviert zugleich das System, das sie tötet. Sie ist in eine Falle gefallen, ja. Die Natur hat eine Falle für das Bakterium vorbereitet, die zugleich beschützt, nicht wahr. Also das war die Geschichte der Pflanzen, die sogenannte Polyphenoloxydase. Und das Wesentliche ist natürlich in der Pflanze, die nicht beschädigt ist, sie muss das Enzym vom Substrat getrennt sehen und die Trennung muss sehr fein sein, sodass durch die kleinste, der kleinste Schädling wird hier zerstört, Enzym und Substrat kommen zusammen und dann geht die Sache los. Nachdem ich das so ein bisschen wusste, wie das geht, bei diesen Bananen und so, habe ich mich - die Hälfte der Pflanzen sind Pflanzen, die die Farbe verändern. Die andere Hälfte der Pflanzen macht keine, wie Zitronen oder Orangen. Die können sie niederschmeißen, die werden nicht schwarz. Also, was gibt es da? Ich hab da viele Jahre darüber gearbeitet und die Sache nicht lösen können. Meine Mühe und Zeit waren nicht ganz vergeudet, denn bei dieser Arbeit habe ich zufällig gefunden, dass diese Systeme ein starkes Reduktionsmittel enthalten. Natürlich, als braver Jüngling habe ich das isoliert, die Sache, und die kennen Sie heute als Ascorbinsäure, nicht wahr. Das ist die Ascorbinsäure, ein starkes Reduktionsmittel, das Phenole immer im reduzierten Zustand erhalten kann. Genau, in letzter Zeit habe ich mich wieder diesem System zugewendet und habe gefunden, dass diese Pflanzen so ein System haben. Es ist sehr ähnlich wie dieses. Aber wenn die zwei Sauerstoffe auseinander sind, dann macht es keine schwarze Sache oder schwarze Soße, sondern es bleibt farblos. Es kann keine Verbindung mit Proteinen geben, nicht wahr. Also die Sache ist einfach die, in der Pflanze, da sind die Sachen da und die Sache wird in reduziertem Zustand gehalten durch die Ascorbinsäure. Wenn Sie die Pflanze beschädigen, dann wird die Ascorbinsäure wegoxidiert. Die verschwindet, dann macht sie nichts mehr, dann autooxidieren diese Substanzen zum Dizinon zum Paradizinon und die tötet die Bakterien. Also die gleiche Geschichte. Das ist so ziemlich klar, jetzt. Aber das tierische System das könnte nicht mit diesen Sachen arbeiten. Die Pflanzen, die sind viel fester. Das tierische System ist sehr labil und furchtbar heikel. Das könnte nicht mit solchen konjugierten Doublebond-Systemen arbeiten. Es sind furchtbar, zu starke Akzeptoren. Die können nur mit aliphatischem Dicarbonyl, zwei CO. Das einfachste aliphatische Zeug wäre - darf ich das nächste Bild – das ist das einfachste Dicarbonyl mit einem Methyl da, das ist ein Glyoxalderivat. Wenn man da jetzt zwei COs aneinanderlegen will, dann fragt man sich, was für ein CO will ich fangen, es gibt zweierlei Arten. Es gibt das ketonische CO, das ist einfach CO,und dann C hier und C hier, das ist Keton, das ist sehr gut thermodynamisch. Aber chemisch ist es furchtbar faul, es will nichts machen. Das andere ist das, wo anstelle von C ein Wasserstoff ist, das ist dann ein Aldehyd. Aldehyd ist thermodynamisch nicht so gut, aber es ist sehr reaktiv. Also das Ideal wäre ein Aldo-Keton. Natürlich ein Keton-Aldehyd, wo ein CO so ist, das andere so. Und das einfachste Keton-Aldehyd ist die Sache, wo eine einfache, so eine Methylgruppe dranhängt, ja das wäre Methylglyoxal. Das macht die Sache furchtbar aufregend. Na, was ist das Aufregende in so einem blöden Molekül? Das Aufregende ist, dass alle lebenden Zellen, alle, soweit man sie kennt, enthalten ein furchtbar aktives enzymatisches System, das das Methylglyoxal in Milchsäure und nein - hier ist Methylglyoxal, und das hat zwei Enzyme und ein Glutathion, und das zusammen macht was, und am Ende kommt Milchsäure heraus und das aktive Keton-Aldehyd ist verschwunden und wird die zahme Milchsäure, die dann nichts mehr antut. Und alle lebenden Zellen - dankeschön, das war genug - alle lebenden Zellen enthalten ein furchtbar aktives Methylglyoxal. Und das ist so wunderbar, sehen Sie, in der ersten Hälfte des Jahrhunderts haben die größten Biochemiker sich damit beschäftigt, Neuberg und Dakin und Racker und Hopkins, die besten unserer Biochemiker und dann langsam ist das Interesse verschwunden, weil man kein Methylglyoxal gefunden hat. Aber da muss so etwas da sein wie Methylglyoxal, denn das Enzym, die Natur kennt keinen Luxus, die hält kein aktives Enzym nur für die Schönheit, da muss etwas - so ein Enzym ohne Substrat wäre Unsinn, das hat keine Bedeutung. Da muss ein Substrat, und das Substrat muss etwas furchtbar grundlegendes zu tun haben. Und das Substrat muss ein Keton-Aldehyd sein, also ein guter Akzeptor. Also hat das etwas mit einer Funktion zu tun, die mit Keton-Aldehyden, mit der Akzeptoreigenschaft des Keton-Aldehyds verbunden ist. Ja, natürlich, also nach all dem Studium was ich an Pflanzen gemacht habe,ist es natürlich, dass das Wachstum dadurch hintan gehalten wird, nicht wahr. Nämlich die Frage ist, die Sache ist die: Alles lebende Gewebe hat die große Neigung, sich zu vermehren. Je mehr das System aktiv ist, je mehr Leben, je mehr Aktivität, desto mehr Leben ist da, und das Leben will sich vermehren, nicht wahr? Das sehen Sie ja an der Population-Explosion, das Leben will sich vermehren, vermehren, vermehren. Und bei Bakterien und niedrigen Sachen, die vermehren sich nur so schnell, wie es was zum Fressen gibt. Aber im mehrzelligen Organismus darf das nicht sein. Da muss jeder sich stillhalten im Interesse des Ganzen. Wie wird dieses lebende Gewebe stillgehalten? Und da kommt man zur Idee: Vielleicht ist das so ein Keton-Aldehyd. Und das hat man nie finden können, weil man vielleicht davon sehr wenig braucht. Wir haben dann alle Keton-Aldehyde, die möglich sind, aufgebaut, chemisch, und finden, dass in der kleinsten, in einer tausendstel Molar-Konzentration wird jedes Wachstum dann gehalten und die machen gar nichts. Die sind gar nicht giftig in dieser Konzentration, die machen gar nichts. Nur nichts, also gar nichts kann sich vermehren. Also kommt man zur Theorie, dass vielleicht unser Gewebe da nur gehalten wird, eben durch Keton-Aldehyde, aber so eine kleine Menge Keton-Aldehyd, die nötig ist und die sein kann, kann nie oder sehr schwer zur Entdeckung finden. Besonders, weil das Ketone-Aldehyd sehr reaktiv ist und sich mit Schwefel sehr leicht verbindet und so, also das ist so, nur in den allerletzten Tagen hat man ein Keton-Aldehyd in den Geweben entdeckt. Jetzt will ich nur noch einen Schritt weitergehen und sagen: Ja, wenn das alles wahr ist, was ich sage und da im Leben, dass wirklich das Gewebe in Ruhe gehalten wird durch ein Keton-Aldehyd, und da ist ein furchtbar aktives Enzym,wodurch ein schrecklich labiles System getrennt wird von so einem Substrat. Was würde geschehen, wenn aus irgendeinem Grunde Unordnung in diese Zelle käme und diese Wand zwischen den beiden nicht richtig aufgebaut wird und das Enzym das Substrat immer aufessen würde? Dann würde sich diese Zelle in sinnloser Weise vermehren. Und wenn sich eine Zelle in sinnloser Weise vermehrt, dann nennen sie es Cancer, das ist Cancer. Und ich denke, jetzt im Augenblick, dass Cancer eigentlich das ist, dass das Enzym und Substrat nicht ganz genau auseinandergehalten werden können, das Enzym frisst das Substrat auf, alles in sinnloser Weise, die Zelle vermehrt sich. Natürlich, dann sagen Sie: Ja, wenn das wahr ist, dann muss die Krebszelle immer Milchsäure produzieren, weil immer das Methylglyoxal in Milchsäure geht. Und wenn die noch weitergehen, sagen wir, es darf nur die Krebszelle sein, die aerob Milchsäure produziert. Ja, das was Warburg entdeckt hat. Das hat Warburg entdeckt, dass es nur die Krebszelle ist, die Milchsäure produziert, aerob. Natürlich, er erklärt es anders, die Milchsäureproduktion, und ich bedaure, dass er nicht hier ist, denn er wäre mir furchtbar böse. So, weil er nicht da ist, kann ich nicht weiter darüber sprechen. Aber ich habe alles durchgesehen, Literatur, die Beweise, dass das wirklich vom Stoffwechsel, nicht vom Methylglyoxal kommt, die beweisen gar nichts, die sind zu schwach. Ich kann und will nicht weiter darüber sprechen, weil Warburg nicht da ist. Also, ich habe diese letzte Sache mit dem Cancer eben erwähnt. Also das sind jetzt Theorien, aber es ist eine gute Theorie, wirklich eine gute Theorie. Eine Theorie braucht gar nicht wahr sein, man hat nur die Bedingung: Bitte sprechen Sie was sie wollen, aber immer bisschen lächeln dazu. Also, ich sage die Theorie mit ein bisschen Lächeln. Aber es ist eine gute Theorie, weil es ist die erste Cancer-Theorie, die ein bisschen physiologisch ist. Die ist wirklich physiologisch und ganz furchtbar einfach. Und zweitens gibt es viele Ideen, wie man Cancer einfach halten könnte, dass er nicht weiter wächst und dann wieder weggeht. Darüber arbeiten wir jetzt sehr stark. Ich habe also diese Sachkunde über Krebs, sie ist noch im Werden, aber ich habe die eben enthüllt, weil ich zeigen wollte, dass diese ganz abstrakten Fragen von Elektronenwolken, wovon wir soviel sprechen, und das so sinnlos scheint in der Biochemie, dass sie nicht nur eine sehr tiefe Bedeutung haben können, sondern dass sie uns helfen können, die furchtbarsten Probleme der Menschheit zu lösen, am Krankenbett. Ich danke Ihnen.

Albert von Szent-Györgyi on Curiosity Driven Discovery (in German)
(00:30:32 - 00:37:08)

The next Nobel Prize for vitamin research followed promptly in 1938, with the German organic chemist Richard Kuhn being distinguished for his work on the structure and synthesis of the vitamins B2 and B6. Kuhn later dedicated his 1952 Lindau lecture to the one foodstuff which was at the core of the discovery of the first vitamins: milk. Since most mammals live of nothing but milk during the first part of their life, a healthy mother’s milk must contain all macronutrients and micronutrients required for growth and development. This includes all vitamins, as Kuhn points out:

Richard Kuhn (1952) - The vitamins of milk (German presentation)

Normally, all mammals, for a short or longer length of time after birth, feed exclusively on their mother’s milk. Evidently, breast milk contains everything that is essential for the newborn to thrive. When, in 1909, Wilhelm Stepp in Strassburg and then Frederick Gowland Hopkins in England tried to raise young mice and young rats on a diet consisting of highly purified protein, fat, carbohydrate and mineral salts, they found it did not work. The animals died. By contrast, the animals developed well when milk was added to this diet. That is more or less what you might expect. But the experiments also led to an unexpected observation, namely that even “astonishingly small amounts of milk”, as Hopkins put it, were sufficient to supply the animals with what he himself called accessory nutrients, but which soon became known as vitamins. Milk can serve as an example to describe and explain nearly everything we have since learned about these vital substances: The distinction between fat-soluble vitamins, which separate into the cream during centrifugation, and water-soluble vitamins, which remain in the whey; methods of biological and chemical determination; enrichment and purification techniques, structural elucidation, and finally the synthesis of vitamins, their efficacy in treating deficiency disorders and the protection they offer against these and many others. Two vitamins in milk can be directly perceived, as they are pigments: Firstly, carotene, which separates out into the cream and is responsible for the yellow colour of butter; secondly, lactoflavin, which is water-soluble and gives whey its greenish-yellow colour. It is not my intention here to enumerate all the vitamins so far identified in milk individually or to discuss, with the help of long tables of figures, the differences in milk from various species, differences in vitamin content depending on diet, seasonal fluctuations or technical dairy problems. I wish to attempt, by drawing on just a few scientific findings arising from problems with milk, to show how they have gained relevance to other questions in chemistry and medicine. Two examples are particularly close to my heart, carotene, lactoflavin and a still uncharacterised factor found in human breast milk. Carotene was crystallised as early as 1831 by Wackenroder, not from butter but from carrots. However, it was not until 1928 that Hans von Euler in Stockholm showed it to be an essential raw substance, constituting the crucial factor in the fat-soluble phase in the pioneering experiments by Stepp and Hopkins. In an experiment with Edgar Lederer it was then discovered in 1931 that carotene can be separated into two clearly defined components. They are known as alpha and beta carotene. Together with Hans Brockmann, gamma carotene was later added. The method used for separating carotene into its constituent part is called chromatographic absorption analysis. And the extraordinary power of this method is reflected in the fact that it separated three isomeric carbohydrates, all of which have the same molecular formula: C40H56. The principle of chromatography was described by Schönbein in 1861 and in another form by the Russian botanist Zwet in 1906, but it had only been used occasionally as a qualitative tool for analytical observations. The separation of carotene into its constituents showed that the method is suitable for preparing organic compounds in their pure state. Since then, there has grown an almost bewildering array of applications for this tool. From my own institute, in particular Alfred Winterstein, Hans Brockmann and then Theodor Wieland made important methodological contributions. The technique has also been used on fluorescing compounds, on colourless compounds, on liquids and on gases. It has also found use in inorganic chemistry, for example, the separation of rare earth elements, a problem to which many outstanding chemists had devoted decades of their lives, which can now often be accomplished relatively easily by chromatography. And the same applies to the separation of uranium. And the principle of the method was specifically refined during World War II in England by Consden and Martin in the form of paper chromatographic analysis, which now appears to be irreplaceable for many problems in chemistry as well as biology and medicine. The question has occasionally been asked how such a simple and versatile method could be ignored for so long. Specifically, why Richard Willstädter, in his investigations of chlorophyll, did not use Zwet’s method, who had already described the separation of green pigment from leaf extracts into two components. Let me answer this question as follows. Willstädter was familiar with Zwet’s experiments, and he carried out the separation of chlorophyll into its A and B components according to Zwet’s description. And yet he rejected the method. The reason is that during the absorption of chlorophyll on silicic acid, on calcium carbonate, on aluminium oxide and on other adsorbants that Zwet had recommended, chlorophyll A and chlorophyll B undergo changes of a chemical nature that Zwet had not noticed, but which Willstädter did. During adsorption, the chlorophylls lost the property of turning brown after the addition of alkali. They lost what is known as the brown phase, and, for this reason, Willstädter believed that the method was unsuitable for isolating natural pigments. Among the numerous adsorbants Zwet recommended was, however, sucrose, on which, as Winterstein later showed, both chlorophylls remain intact. But sucrose, of all the substances, appears to have been ignored in the investigation by Willstädter’s laboratory. Of all the vitamins that occur in milk, probably only one was first actually isolated in its pure form from milk, namely lactoflavin. It occurs in nature, partly in a free state, dialyzable, and fluoresces yellowish-green, partly bound to proteins in an undialyzable and nonfluorescent form known as flavoproteins. Studies carried out jointly with Paul György and Theodor Wagner-Jauregg showed that lactoflavin has the same vitamin activity whether it is bound to protein or not, the amount of lactoflavin required to achieve one growth unit in young rats, that is, a weight gain of 40 grams in 30 days, is 10 grams lactoflavin. For lactoflavin later synthesised with Friedrich Weygand, the exact same activity was found. At the time, Otto Warburg had already showed that a yellow ferment occurs in yeast which acts within a system that oxidises glucose-6-phosphoric acid ester to gluconic acid-6-phosphoric acid ester, so that the activity of the ferment can be tracked by observing the oxygen consumption. By exposing his still crude ferment solution to light, Warburg obtained a chloroform-soluble fragment and the same fragment is obtained when the vitamin we isolated by crystallisation from milk is exposed to light. This observation led to the concept that vitamins are building blocks of ferments. Subsequently, this concept has been proved more precisely and in greater detail. The concept of a vitamin as a building block of a ferment explained for the first time why vitamins are active in such “astonishingly small amounts”. Because ferments, as catalysts, even in small quantities, are able to convert a large number of organic substrates in cells, and if a vitamin is a building block of such a ferment, it too, in small amounts, would result in high substance conversion rates. Theorell had found that Warburg’s yellow ferment could be split by the action of dilute acids into a colourless protein component and a phosphoric acid ester of lactoflavin. Together with Friedrich Weygand and Hermann Rudy, a complex multi-step process was used to obtain lactoflavin-5-phosphoric acid in a fully synthetic form, and it was possible to combine this synthetic lactoflavin-5-phosphoric acid ester with the protein component to obtain a fully catalytically active yellow ferment. Other flavins that do not occur in nature but can be synthesised have similarly been converted to synthetic yellow ferments by combining them with protein. The importance of the phosphoric acid residue for linking the vitamin to the specific protein body was illustrated in these experiments. The next picture shows you that the vitamin itself, the lactoflavin, has a certain affinity for the protein body. But this affinity is much smaller than that of lactoflavin-5-phosphoric acid ester. Here time is plotted, here oxygen consumption in cubic millimetres^2 in the enzymatic reaction. whereas 30 and 150 grams of lactoflavin bound only to protein, which dissociates much more strongly, is needed to even approach similar reaction speeds. The concept of a vitamin as the building block of a ferment was also recognised two years later by Karl Lohmann of the Meyerhof Institute in Heidelberg for vitamin B1, the antineuritic vitamin, in the form of chlorophosphoric acid ester, which forms a building block of carboxylase, an enzyme that plays a key role in splitting carbon dioxide from alpha-ketocarbonic acid. Vitamin B6 was also shown to have a similar relationship to ferments that split CO2 from amino acids. The generalisation of this concept became so widely accepted that as soon as a new vitamin was discovered, the question was asked in which ferment it acts as a building block. But this concept has not been proved in detail for the entire group of fat-soluble vitamins. It is questionable whether it will prove generally valid for this area. Although we know from George Wald’s elegant experiments that, for example, a cys-aldehyde of vitamin A forms visual purple in our retinas after combining with a specific protein body. But we also know that this function is definitely not the only one vitamin A has in the body. Lactoflavin is a vitamin not only in higher animals and for humans, it is also vital for many microorganisms, a growth factor, for example, of many lactic acid bacteria, whose activity is manifested when milk turns sour. This formation of lactic acid from carbohydrate also plays a key role in our muscles whenever work is performed. And the mechanism of lactic acid production was the object of a long series of admirable experiments by Otto Meyerhof. If I dedicate a few words to Meyerhof’s work here, I do so to convey the words this great physiologist said to me shortly before his death. I also do so to pave the way for an understanding of a specific lactic-acid-forming organism that we will now focus on. According to a long-standing principle formulated by Adolf von Baeyers, when oxygen combines with organic compounds, it tends to go where there is already oxygen. In the case of fructose with its 6 C atoms, we might therefore expect the C1 atom, which is at the highest oxidation state, namely the aldehydic state, to be the one to form CO2 during alcoholic fermentation or a carboxyl group of lactic acid during lactic-acid fermentation. But according to experiments by Otto Meyerhof, that is not the case. Consider the 6 C atoms of fructose here on the left, the first C atom of which is an aldehyde group, while each further C atom carries an alcoholic hydroxyl group. In a nutshell, Otto Meyerhof’s experiments showed that during lactic acid formation this first C atom is reduced to a methyl group of a lactic acid molecule and that the carboxyl group of both moles of lactic acid come from the third and fourth C atoms of fructose. The accuracy of Meyerhof’s concept can be easily proved today with the help of radioactive indicators. Mr. von Hevesy explained the principle to you this morning. The result was a resounding confirmation of Otto Meyerhof’s views. In this case it is possible to start with a non-radioactive pentose and to add the first C atom in radioactive form. In this way you obtain a fructose in which only the C1 atom is radioactive. On the other hand, if, for example, you grow sugar beets in an atmosphere of radioactive CO2, you obtain a sucrose from which you can extract fructose and glucose in which nearly all the radioactivity is located on the third and fourth C atoms. Thus, if we use glucose in which only the C1 atom is radioactive, we will find practically the entire activity in the one methyl group of lactic acid. In the case of alcoholic fermentation, the relationships are such that these two methyl groups from two molecules correspond to ethyl alcohol, and these two are released in the form of CO2. But last autumn a paper by Gonzales in Texas appeared which Mr. Meyerhof discussed with me in detail. The experiment was superbly conducted. It showed that another microorganism, Lactobacillus mesenteroides, breaks down fructose in such a way that 50% lactic-acid fermentation occurs, namely one mole of lactic acid is formed, as here, but instead of a second molecule of lactic acid, one mole of CO2 and one mole of ethyl alcohol are produced. And it was found that even when only the C1 atom in the fructose was radioactive, the entire radioactivity was found in the CO2. That is entirely at odds with Meyerhof’s scheme. It would have been understandable if the ethyl alcohol here had arisen from the first and second C atoms and the CO2 from the third. But that is definitely not the case. Meyerhof therefore concluded that his scheme is probably generally valid for so-called homofermentative lactic-acid producers, that is, for those microorganisms that form two moles of lactic acid from one mole of sugar. And that the fundamentally different mechanism used by heterofermentative microorganisms to break down carbohydrates, of which I’ve listed three, requires further research. Here, the breakdown scheme described has been clearly proved. For III and IV it has not been proved, an example of aldehyde, which produces, in addition to one mole of lactic acid, one mole of acetaldehyde and one CO2. The table shows another microorganism, Lactobacillus bifidus, which is also heterofermentative. It produces one mole of lactic acid and one mole of acetic acid. Lactobacillus bifidus was first isolated by Tissier in Paris in 1899 from the faeces of a breast-fed infant. Science is greatly indebted to the Heidelberg pediatrician Moro for his research. It is a highly sensitive microorganism. Its name is meant to express its shape, as it is branched, or bifurcated, at the ends, hence bifidus. It is Gram-positive, taking on Gram stain readily. The faeces of a breast-fed infant contains almost only Lactobacillus bifidus. When an infant is fed cow’s milk, the quantity of Lactobacillus bifidus rapidly declines; when human milk is given again, their number rebounds. It is an anaerobe, meaning that it has a poor tolerance of oxygen and this has created numerous problems with regard to its isolation. According to Hotchkiss, it stains bright red. This staining is achieved by first exposing the microorganism to a solution of sodium periodate, which splits carbohydrates into aldehyde groups. In the second step it is exposed to fuchsin-sulfuric acid, which makes the aldehyde groups visible by staining them red. Under the microscope, Lactobacillus bifidus cultures look like alphabet soup with nothing but capital Y's floating in it. But this structure can be altered, as I mentioned, quite easily, not only under the influence of oxygen, and the changes are not only expressed morphologically. Rather, it has been shown that along with many other changes, a characteristic physiological property can also change suddenly. Instead of optically active lactic acid, only racemic lactic acid is produced. Just three years ago researchers in the United States succeeded in establishing a clone of Lactobacillus bifidus for growing cultures, in which all the cells are derived from one and the same parent cell. Subsequently, Paul György isolated a mutant Lactobacillus bifidus strain from the faeces of a breast-fed infant. This strain had the property of growing only if human milk was added to the nutrient medium or solution. When cow’s milk was added, the mutant strain did not develop. This mutant has long been referred to by its laboratory name, 212A. It was later registered under the name Lactobacillus bifidus var. Penn. Penn is short for the University of Pennsylvania in Philadelphia, where the strain was first isolated. The next picture shows some known differences between the composition of human milk and cow’s milk. Most notably, human milk contains only half as much protein as cow’s milk, so that to prepare infant formulas, cow’s milk is often diluted by around 50% so that it contains the same protein content. And then sugar is added to bring it up to 6.6%. And in dozens of variants, you can also add other vitamins, mineral salts and so forth. For Lactobacillus bifidus there appears to be some hitherto unknown essential difference in the chemical composition of human milk and cow’s milk. And although it was not initially clear what impact the nutrient requirement of such a mutant has on an infant’s overall intestinal flora, I believe that Paul György’s discovery has enriched and invigorated an important chapter in pediatrics by raising new questions. In any case, it led to a test, by means of which it became possible to chemically track down an active substance in human milk. And the test is carried out as follows: The gas atmosphere is a mixture containing 90% nitrogen and 10% CO2. These bifidus strains are CO2-dependent. In addition, some hydrogen is added to the atmosphere and then a glowing platinum mesh burns off the remaining oxygen, so that growth takes place under strictly anaerobic conditions. The next picture shows the first half of the synthetic nutrient solution that György developed together with Dr Rose. A litre of this semisynthetic nutrient solution contains Also a number of amino acids, which are listed here. But the nutrient medium has so far never been fully synthesised. You still have to add a casein hydrolysate, and not an insignificant amount of it, in order to carry out the following determinations. The next picture shows more mineral salts and vitamins required for this test: potassium phosphate in relatively large quantity, iron, manganese and the vitamins shown here. All of this is sterilised, and only then is one gram of ascorbic acid added to one litre. Now everything is ready for the test. To determine the activity, the total acid, that is the sum of lactic acid and acetic acid produced by the growing bifidus cells, is potentiometrically titrated. Here you see a comparison of acid production in 40 hours at 37° after the addition of human milk and cow’s milk. Here it states how many tenths of a cubic centimetre of normal acid are produced. This word could also have been written with two g’s. You can see that in the case of human milk just 0.023 cubic centimetres is enough to produce 2.2 cubic centimetres of acid, whereas with cow’s milk one cubic centimetre, fifty times more, is needed to produce the same quantity of acid. Based on these figures, we would say that cow’s milk has only a fiftieth of the activity of human milk. In total, under the conditions used, approximately 18 tenths of a cubic centimetre of normal acid is produced from the lactose present, so that half that quantity, half the maximum possible lactic acid, or 9 tenths of a cubic centimetre, has been defined as one unit of activity. In other words, one bifidus unit is the quantity of bifidus-active substance needed to produce 9 tenths of a cubic centimetre of normal acid. The next picture compares the activity of milk from various animal species. You can see the activity is very low in all strict herbivores. One unit for such and such cubic centimetres of milk, the smaller the number, the greater the activity, and the last column shows the relative activities, taking 0.06 cubic centimetres for average human milk as equivalent to 100. You can see that guinea pig milk is practically inactive, cow’s milk, sheep’s milk and goat’s milk have very little activity, just 2 to 3% the activity of human milk. Pig’s milk is somewhat more active, and the most active of all the animals listed here is rat’s milk and rat’s colostrum, which is the very first milk the animal secretes after giving birth, and is not only more active, but around twice as active as average human milk. The most active we know is human colostrum, the first milk of a woman. There is also a value for cow’s colostrum. The case is as follows. At the time of birth, cow’s milk also has considerable activity. But it falls from this value of 40 to around 2 to 3% in the space of just two to three days. The activity of human colostrum declines much more slowly to reach, over the course of many, many weeks and months, a relatively constant level of 0.06 cubic centimetres of human milk per unit. We have also studied women who have breast-fed for a whole year or longer. And we found that during such long lactation, the activity continues to decline to 0.08, 0.12 cubic centimetres. But what I also want to mention is that precisely in those women who have breast-fed for so long, a bifidus activity of 0.02 cubic centimetres per unit was still found six to ten weeks postpartum, a value that is otherwise found only in human colostrum. Besides milk and colostrum, human sperm is also highly bifidus-active. Sperm from a bull or bulls’ testicles is completely inactive. The next picture shows examples of the distribution of the bifidus-active substance in the human body. At the top is again human colostrum at 0.01 to 0.2 cubic centimetres, with a mean of 0.015. Then milk with 0.02 to 0.15, or 0.06 on average. Meconium, the intestinal content of a newborn infant, in a 10% suspension is also highly active. Sperm 0.07 cubic centimetres on average. Gastric juice, saliva, urine, I’ll have something special to say about them later. Tears too. If you want to compare this figure with those for milk, you have to take into account the fact that milk contains approximately 12% dry substance, compared to only 0.5% organic substance in human tear fluid on average. Calculated on the basis of dry substance … [stops here]

Richard Kuhn on the Role of Milk in Vitamin Research (in German)
(00:00:12 - 00:02:58)

Another five years later, Henrik Dam and Edward Doisy shared the 1943 Prize in Physiology or Medicine, being rewarded for the discovery and structural elucidation of vitamin K.

The Special Case of Vitamin B12
Vitamin B12 takes a special role amongst the vitamins. It is the only vitamin that contains a metal atom (cobalt), as part of its structure. With a weight of 1580 Dalton it is the heaviest of the vitamins. It is the last vitamin to be structurally characterized. And it was linked to a Nobel Prize before it was even known to exist.
This Prize was given in 1934 to George Whipple, George Minot and William Murphy “for their discoveries concerning liver therapy in cases of anaemia". The scientists had shown, that certain fatal types of anaemia, a disease caused by the lack of red blood cells, could be treated by having patients eat liver. Thousands of lives could be saved by this method. However, when the Prize was awarded, the reasons for this success were unclear and only in 1948 the actual active agent, vitamin B12, could be isolated in crystalline form.

It then took another seven years before the British biochemist Dorothy Hodgkin was able to determine the correct structure of the crystalline compound by using the emerging technique of
x-ray diffraction crystallography
. Hodgkin was awarded the 1964 Chemistry Nobel Prize, inter alia for this achievement. It was the last Nobel Prize linked to the discovery, structural elucidation or synthesis of a vitamin so far.

Vitamins: A Story with an Open End
But of course, the story of vitamins does not end here. In the years following their discovery, researchers began to work towards an understanding of the biochemical role of the individual compounds. It was found, for example, that vitamin A is contained it the retina and directly involved in the visual process. This insight led to the 1967 Nobel Prize in Physiology or Medicine, which was given to Ragnar Granit, Haldan Hartline and George Wald "for their discoveries concerning the primary physiological and chemical visual processes in the eye".

Besides such fundamental work, numerous studies were concerned with determining the potential of vitamins in preventing or curing mental and physical diseases. Unfortunately, not all of these studies were conclusive and by no means is our knowledge on the biochemical functions or health effects of vitamins complete. It is thus not surprising that the wellknown recommended daily allowance (RDA) or dietary reference intake (DRI) are, in part, subject to heavy discussion.

Linus Pauling and Vitamin C
One of the most prominent critics of these RDA values was double Nobel Laureate Linus Pauling. Pauling claimed that vitamin C megadoses (around 10 gram per day, or 12500 % of the current EU-RDA) would be suited to treat cancer and support health in general. He himself took at least 10 gram of vitamin C per day for more than 20 years. In his 1981 Lindau lecture, Pauling explained how he conceived his 10 g/day recommendation:

Linus Pauling (1981) - Vitamin C in the Prevention and Treatment of Cancer

I am going to speak about vitamin C and cancer. I hadn't planned to work on cancer, work that I began, in fact, 10 years ago, nor to work on vitamin C or other vitamins as I began around 16 years ago. Instead I got into these fields by accident, or through some concatenation of circumstances that just left me, led me into these fields. I started to work on haemoglobin after having worked on simpler molecules for 14 years in 1936, and then the next year I began some work, together with my students of course, in the field of immunology. Then in 1945, I had an idea that sickle-cell anaemia might be a disease of a molecule, rather than a disease of a cell. Dr. Harvey Itano, a young physician, came to study with me and he and I began to check up on this idea. In 1949, together with two other students, Singer and Wells, we published a paper; "Sickle-Cell Anaemia, a Molecular Disease". After being with me 8 years, Dr. Itano was ordered as an officer of the public health service to move to Bethesda. And I decided that I should give up work on the hereditary haemolytic anaemias. It didn't seem to me very sensible of me to be competing with such an able and vigorous young investigator as Dr. Itano. So I thought, why shouldn't I look at other diseases to see whether or not they are molecular diseases? And they might as well be important diseases, because nobody else was working in the field, except by that time there were a good number of haematologists studying the haemoglobin anaemias. I thought, well, I might work on cancer. Or I might work on mental disease. And I rejected cancer for two reasons; one, it seemed to me that it was just too complicated a field for me to be involved in. And second, many people, many investigators were carrying on studies in the field of cancer, whereas in 1954 very few people were working on mental disease. It was of mental disease, our study is on schizophrenia and mental retardation that got me into vitamins. After about 10 years of work in this field I ran across some papers, publications, by doctors Hoffer and Osmond in Canada, Saskatoon, Saskatchewan, Canada. They made a report that really astonished me. They said that they were giving large doses of nicotinic acid or nicotinamide to schizophrenic patients. I knew, of course, that a little bit of nicotinic acid or nicotinamide must be ingested day after day, 5 milligrams, perhaps a little pinch, to keep a person from dying of pellagra. So I knew that these substances, the pellagra-preventing factor, are very powerful substances. And yet these substances are so lacking in toxicity that Hoffer and Osmond were giving a thousand or ten thousand times this physiologically effective amount, or pharmacologically effective therapeutic amount, to schizophrenic patients. Nobody knows just how toxic they are, people have taken 100 grams a day, or even more, without any serious side effects. I thought, how astonishing that there are substances of this sort that have physiological activity over a tremendous range of concentration, 1,000 fold or 10,000 fold range of concentration. In fact I found that Milner had been giving large doses of vitamin C in a double-blind experiment to schizophrenic patients and he reported that several grams, perhaps the thousand times the amount that will prevent scurvy in most people, several grams of ascorbic acid is also effective, more effective than a placebo, for these schizophrenic patients. The idea, that such substances exist, which are effective in one way or another over a tremendous range of concentrations, caused me to decide that this field of medicine deserved a name. I invented the word 'orthomolecular' to describe it. The right molecules are the molecules that are normally present in the human body, and the right amounts are they amounts that put people in the best of health. Well, I was interested in infectious diseases in relation to vitamin C originally, but in 1971 Charles Huggins asked me to speak at the dedication of his new cancer research laboratory. I thought, I must say something about cancer. So I remembered that I had read a book published in 1966 by Ewan Cameron, a surgeon in a hospital in Scotland who had been a general surgeon who had however all of his life as a surgeon been interested in cancer. He formulated a general argument in this book, "Hyaluronidase and Cancer". His argument was this - he said "the body has protective mechanisms, the immune system for example. If we could potentiate these, the natural protective mechanisms, they might provide additional protection against cancer". As Professor de Duve pointed out, we have, in many patients, most patients with cancer, circulating cells, but not all of them develop metastases. Those, whose immune systems are functioning well, have a smaller chance of developing metastatic cancer than those whose immune systems are not functioning well. Well, I thought, we know one thing about vitamin C, it is required for the synthesis of collagen. If then, persons with cancer were to be given larger amounts of vitamin C, they would be stimulated to produce more collagen fibrils in the intercellular cement that holds the cells in normal tissues together. These tissues might become strengthened in this way to such an extent that, as Cameron pointed out, without mention of vitamin C, to such an extent that they could resist infiltration by the growing malignant tumour. Dr. Cameron saw a newspaper account of my talk and wrote asking how much vitamin C to give. I replied he should give the patients 10 grams a day, 10,000 milligrams, 200 times the usually recommended amount. He began, cautiously, with one patient in Vale of Leven Hospital, Loch Lomond side, Scotland, and was astonished by the response of that patient, to such an extent that he gave 10 grams of vitamin C a day to a second terminal cancer patient, an untreatable patient receiving no treatment other than the vitamin C and narcotics to control pain. And then a third and fourth and more and more patients as he became more and more convinced of the value of this substance for patients with cancer. I, me, have started out now with the first slide. Well, I think, and perhaps this is the message that I should emphasise, I think that the people in the field of nutrition, the scientists in the field of nutrition, which up to 15 years ago seemed to me to be a terribly boring subject, have been off on the wrong track. They have said that a vitamin is needed, it's an organic compound needed in small amount to prevent death by a corresponding deficiency disease. And they have striven, very vigorously, over a period of 40 or 50 years, to find out just how much each of these substances is needed to keep people from dying. I believe that the problem that should be attacked is that of finding the intake that would put people in the best of health, not just the amount that will keep them from dying. The nutritionists refer to their recommend dietary allowances, RDA, by saying that these are the amounts that will prevent most people from developing the corresponding deficiency disease. Most people in ordinary good health. What they should say is that, it will prevent most people who are in what is ordinary poor health from dying from the corresponding deficiency disease. To be in what ought to be ordinary good health, they need to be ingesting the optimum amounts, the proper amounts, of these valuable substances. Next slide. There's an interesting difference between vitamin C and the other vitamins. The other vitamins, thiamine, pyridoxine, riboflavin, vitamin A and so on, are required by essentially all animal species. Vitamin C is not required by most animal species, 99% or more of animal species synthesize ascorbate, they do not rely on the dietary sources of the substance. If I ask, why do these animals continue to synthesize vitamin C even though they may be getting large amounts by ordinary standards in their diet, several grams a day for an animal the size of a man, the answer surely is that they continue to synthesize ascorbate because the amounts they get in their diet are not enough to put them in the best of health, not enough to put them in the fittest condition in the environments in which we live. Next slide. Man is one of the few unfortunate species of animals who are in rather poor health generally because of not having as much ascorbate as corresponds to the best of health. When I looked at 150 raw natural plant foods, taking the amounts that would give 2,500 kilocalories of energy, I found that for thiamine and other vitamins there was perhaps 3 times or 5 times as much of the vitamin as is now recommended, as you get in modern diet on the average, but 50 times as much vitamin C as is recommended. And I thought, this is an indication that larger amounts of vitamin C are needed because animals are getting these larger amounts but continue to make ascorbate. Next slide. The next slide please. Another interesting fact is that the committee that recommends the diet, the food for monkeys, experimental monkeys, recommends 70 times as much vitamin C. Monkeys also require exogenous vitamin C, they are primates and all of the primates require this vitamin. I think that this is understandable, monkeys are very valuable, experimental monkeys, if you've spent months carrying out studies with them and then suddenly your monkeys die, it's a real tragedy, so that a great effort has been made to find out how much vitamin C will put the monkeys in the best of health. No one has gone to the effort to carry out corresponding studies for human beings. Next slide. Well, I mentioned that these most species of animals synthesize ascorbate. The amount they synthesize depends on the size of the animal; small animals produce a small amount, large ones a large amount. Proportional to body weight, not to surface area, 2/3s however of the body weight, but to body weight. And the amount produced by different animal species is between 40 and 400 times the usual recommended intake for human beings. Averages 10 grams per day, per 70 kilogram body weight, that's why I wrote to Ewan Cameron, to say that 10 grams a day is the amount that he should try. I might say that the pharmacologists sometimes say that 50 milligrams a day of vitamin C per day is a physiological intake and that 10 grams a day is a pharmacological intake, that the vitamin is being used as a drug. I would say that 10 grams a day is the proper physiological intake and 100 grams a day might be called the pharmacological intake. And people have taken that amount, people have received 125, 150 grams of sodium ascorbate a day by intravenous infusion to control serious diseases, without any side effects, and have taken similar amounts by mouth. Next slide. So, this is the conclusion that I have reached. I have already stated it. Next slide please. Well, vitamin C is required for synthesizing collagen and I think it might well strengthen the normal tissues. Next slide. The reason that it is required is that collagen is formed from procollagen by hydroxylation of prolyl and seryl residues and there are other hydroxylation reactions, this one and other similar reactions do not take place except with use of vitamin C. Next slide. Well, collagen, the value of increased intake of vitamin C, under several circumstances, has been known for a long time, and surgeons for over 40 years have been recommended in the better surgical text books to give all surgical patients 1 gram or 2 or 3 grams of vitamin C per day in order to facilitate wound healing, healing of broken bones, of burns, to take care of peptic ulcers, periodontal disease, physicians have known, and dentists too, have known about this, they don't all practice it, but it's been known. Next slide. Here is a reference to Ewan Cameron, my associate for 10 years now in this work, and to his book "Hyaluronidase and Cancer". Next slide. And I argued then, in 1971, stated on this slide, that the increased synthesis of collagen might strengthen normal tissues to a significant extent. Next slide. Since then, a large amount of information has been gathered about the relation between intake of vitamin C and various aspects of the immune protective mechanisms. Vallance, Fagan, Yonemoto, others have shown that antibodies, IgG and IgM are produced in larger amounts with the increased intake of ascorbate. Fagan showed that a component of complement involving collagen-like sequences of amino acids, as shown by Prof. Porter, is produced in larger amounts, the blastogenesis of lymphocytes occurs at a greater rate, the activation of cytotoxic macrophages has been shown to be increased and interferon production is reported to be greater with a greater intake of vitamin C. I might mention that there's been a tremendous amount of interest in interferon for the treatment of cancer. One important point here is that to treat a patient with interferon costs about a thousand times as much as to treat him with ascorbic acid. Dr. Cameron says to people who ask about interferon, take ascorbic acid and synthesize your own interferon. Next slide please. This is the only study on vitamin C that has been carried out in the National Cancer Institute of the United States, Yonemoto, Chretien and Fehniger gave vitamin C, 5 grams a day for three days, to volunteers. The rate of blastogenesis of lymphocytes under antigenic stimulation doubled with this intake. When 10 grams a day for three days was given the rate tripled, and when 18 grams a day for three days was given the rate quadrupled. It's known that a high rate of blastogenesis of lymphocytes in the cancer patient is correlated with a better prognosis, longer survival, than a lower rate of blastogenesis. Next slide. Ascorbate seems to have a significant prophylactic value. Here I have listed seven studies relating to vitamin C and cancer, studies in which when a number of environmental or nutritional factors were correlated with the morbidity from cancer, vitamin C turned out to have the highest correlation coefficient, negative of course, to be the factor that seemed to be most strongly related to morbidity from cancer. Next slide. An interesting study was carried out by Dr. DeCosse and his associates. DeCosse is now the head of surgery in the Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre in New York City. He found that 3 grams a day of vitamin C given to patients with familial polyposis caused the polyps to disappear in half of the patients. I've suggested that he give 10 grams a day in a new trial, which is underway, but he is sticking with 3 grams a day because of his worry about toxic side effects of large doses. Well, there just aren't any toxic side effects of large doses of vitamin C, talk about kidney stones has essentially no basis whatever, no cases in the medical literature. Damage to the liver doesn't occur, although it's sometimes mentioned without references. Next slide please. Bruce in Toronto has used the Ames-method of testing for mutagens to study faecal material, the contents of the lower intestinal tract and there are many mutagens that show up, and they, of course, when tested by, with much difficulty, various mutagens for carcinogenic activity have usually been found, When vitamin C is given by mouth to patients, the number of mutagens in the faecal material is much less. This is presumably a mechanism for preventing cancer of the lower gastrointestinal tract. I find, when I take 10 grams a day, which is the amount that I do take, that half of the vitamin C, Presumably then providing protection against this tract and in particular, of course, preventing the formation of nitrosamines, which are a cause of gastric cancer and other cancers, but also destroying other mutagens in the materials in the gastrointestinal tract. Of this 30%, 1.5 grams is eliminated in the urine, and provides protection of the urinary tract on the way out, and the other 3 1/2 grams works throughout the human body. Next slide. Here are some clinical tests, all have been carried out that have been reported as yet, I made a mistake when I wrote the copy for this slide, Cameron's last study involved 300 terminal cancer patients treated with ascorbate, compared with 2,000 matched controls in the same hospital. With these studies, a hundred against a thousand matched controls, there was essential random distribution of patients between Dr. Cameron on the one hand and the other surgeons and physicians in the same hospital on the other. Over a period of time when Cameron was giving the patients with terminal cancer, untreatable cancer, vitamin C, and the other surgeons and the physicians were not, so that we had a sort of randomized allocation of students of patients to the two groups. Morishita and Morata are associates of our institute in California, Morata has worked there two summers and their work is carried out in a hospital in Japan. Next slide. The first thing that Dr. Cameron and his collaborators, the surgeons working with him, noticed was that the patients feel better when they receive ascorbate. Cancer patients usually are pretty miserable, don't feel well, they have poor appetites and don't eat well. These patients lost their cachexia, they began to feel lively, feel well, have good appetites and then there were other responses that were noted. And later on, of course, it was found, next slide, it was found that they survived longer than the controls. This slide shows survival times of the hundred patients with untreatable cancer who received ascorbate, and the thousand matched controls. Ten matched to each of the ascorbate-treated patients who had also reached the untreatable stage when no therapy was administered to them except morphine or diamorphine to control pain. After the date of untreatability, the controls lived on the average 54 days, and the ascorbate treated patients lived on the average about a year, much longer. Of the controls only three in a thousand, 3/10 of 1%, survived over 400 days, 4/10 of 1% over a year after untreatability, whereas around 16% of the ascorbate-treated patients, who continued to survive. And these patients continued to survive for a long time, as much now as 8 years after having been considered to be terminal with an expected survival time of only a couple of months. Next slide. These are results of similar observations made in Fukuoka Torikai Hospital in Japan, Fukuoka Japan. Again, there's a low ascorbate group, receiving less than 5 grams of vitamin C per day, in Cameron's patients in Scotland the low ascorbate group received very little, perhaps 50 milligrams a day, and the high ascorbate group receiving more than 5 grams a day, an average of about 15 grams a day. The curves, the survival curves are essentially the same as for the study in Scotland. These graphs represent a breakdown of that comparison of a hundred, the first hundred ascorbate-treated patients in Scotland, and a thousand matched controls. Here we have seventeen patients with cancer of the colon who had reached the untreatable stage, compared with a 170 matched controls. The controls died off pretty rapidly, the ascorbate-treated patients lived on, a number of them here, With cancer of the stomach, bronchus and breast, the situation is rather similar. Next slide. Cancer of the kidney, rectum, bladder, ovary, there doesn't seem to be much difference in the response of patients with different kinds of primary cancer to ascorbate. There are some statistically significant differences, but it's a difference between living a year longer on the average and living 7 months longer. In general, I would say these patients, who have reached the untreatable stage and in Scotland, the untreatable stage for adult patients with solid tumours, gastrointestinal tumours and so on, do not receive chemotherapy so that these patients in general had not been treated with chemotherapy. In general, I would say that the evidence indicates that to give them ascorbic acid leads to greater survival time as well as better well-being during the period of survival, than treatment with chemotherapy does, the standard sorts of chemotherapy that are used now. Next slide. Another trial carried out was by Creagan, Mertel and others in the Mayo Clinic. The difference between that trial and the trials in Scotland and Japan is that 88% of the patients, We argued, Dr. Cameron and I, before the Mayo clinic trial was begun, that they should not use patients who had had their immune systems badly damaged by courses of chemotherapy, because of our feeling that vitamin C works largely by stimulating production of, by stimulating the immune system. Next slide. Well, our conclusions, with the possible, and I just quote from our book, the last sentences in our book concern vitamin C, in the management of all cancer patients from as early in the illness as possible. Next slide. We believe that this simple method, measure would improve the overall results of cancer treatment quite dramatically, not only by making the patients more resistant to their illness, but also by protecting them against some of the serious and occasionally fatal complications of the cancer treatment itself. We are quite convinced that in the not too distant future, supplemental ascorbate will have an established place in all cancer treatment regimes". Next slide. Now the advantages, it is an orthomolecular substance, every human being has vitamin C in his body, so long as he continues to live, has very low toxicity, no serious side effects, makes a patient feel much better, very low cost, it's compatible with most or all other methods of treatment, the exception being chemotherapy. Of course, I think that chemotherapy should be used with childhood cancer, leukaemia, Hodgkin's disease, possibly together with vitamin C, but my own feeling is that vitamin C for adults with solid tumours is probably preferable to chemotherapy. Well, I can end up by saying that in the United States, the medical profession, as an organized group, has not accepted these ideas. Individual physicians, I would judge have, because we get hundreds of letters and telephone calls from individual physicians who have developed cancer asking for more information. Thank you. Applause.

Ich werde über Vitamin C und Krebs sprechen. Ich hatte nicht die Absicht, über Krebs zu arbeiten, eine Arbeit, die ich übrigens vor 10 Jahren begann. Ebenso wenig über Vitamin C oder andere Vitamine, was ich vor etwa 16 Jahren begann. Stattdessen kam ich zufällig in diese Forschungsgebiete, oder durch die Verkettung einiger Umstände, die mich in diese Felder geführt haben. Und im nächsten Jahr begann ich dann einige Arbeiten, natürlich zusammen mit meinen Studenten, auf dem Gebiet der Immunologie. Im Jahre 1940 hatte ich dann eine Idee, und zwar dass die Sichelzellenanämie die Krankheit eines Moleküls statt die Krankheit einer Zelle war. Dr. Harvey Itano, ein junger Arzt, kam zum Studium zu mir, und ich begann diese Idee zu überprüfen. Jahre 1949 publizierte ich zusammen mit zwei anderen Studenten, Singer and Wells, einen Aufsatz: Nachdem er acht Jahre bei mir gewesen war, wurde Dr. Itano als Beamter des öffentlichen Gesundheitsdienstes bestellt und er musste nach Bethesda umsiedeln. Und ich entschied, dass ich die Arbeit an den erblichen haemolytischen Anaemien aufgeben sollte. Erschien mir nicht sehr vernünftig, mit einem so fähigen und dynamischen jungen Forscher wie Dr. Itano not zu konkurrieren. So dachte ich mir: Warum sollte ich mir nicht andere Krankheiten ansehen und untersuchen, ob es sich bei Ihnen um molekulare Erkrankung handelt oder nicht? Und warum sollte es sich dabei nicht um wichtige Erkrankungen handeln, weil niemand sonst auf diesem Feld arbeitete, mit der einen Ausnahme, dass zum damaligen Zeitpunkt eine größere Zahl von Hämatologen die Hämoglobinanämien studierte. Ich dachte mir, dass sich über Krebs arbeiten könnte. Oder über seelische Erkrankungen. Ich verwarf das Thema Krebs aus zwei Gründen: einerseits schien es mir einfach ein zu kompliziertes Feld zu sein, um mich darin einzuarbeiten. Und zweitens führten viele Leute, viele Forscher Untersuchungen über Krebs durch, während 1954 nur sehr wenige Leute über seelische Erkrankungen arbeiteten. Es war die Arbeit über seelische Erkrankungen, meine Untersuchung über Schizophrenie und geistige Entwicklungsstörungen, über die ich zu den Vitaminen kam. Nach etwa zehn Jahren Arbeit auf diesem Gebiet stieß ich auf zwei Aufsätze, Veröffentlichungen der Ärzte Dr. Hoffer und Osmond in Kanada, in Saskatoon in Saskatchewan. Sie berichteten etwas, was mich wirklich erstaunte. Sie sagten, dass sie schizophrenen Patienten große Dosen von Nikotinsäure oder Nikotinamid verabreichten. Ich wusste natürlich, dass man täglich ein wenig Nikotinsäure oder Nikotinamid verabreichen muss, Milligramm, um zu verhindern, dass jemand an Pellagra stirbt. Ich wusste also dass diese Substanzen, der Pellagra vorbeugende Faktor, sehr wirksame Substanzen sind. Eine Dosis von täglich 5 Milligramm verhindert, dass jemand an dieser Krankheit stirbt. Und dennoch sind diese Substanzen so wenig giftig, dass Hoffer und Osmond das Tausendfache oder Zehntausendfache dieser physiologisch wirksamen Menge, oder pharmakologisch effektiven therapeutischen Dosis, schizophrenen Patienten gaben. Niemand weiß, wie giftig diese Substanzen sind. Einzelne Leute haben 100 Gramm am Tag zu sich genommen, oder sogar noch mehr, ohne irgendwelche ernsten Nebenwirkungen. Ich dachte mir, wie erstaunlich es ist, dass es Substanzen dieser Art gibt, die eine physiologische Aktivität über einen äußerst breiten Konzentrationsbereich haben, vom Tausendfachen bis zum Zehntausendfachen der Konzentration. Tatsächlich fand ich heraus, dass Milner schizophrenen Patienten große Dosen von Vitamin C in einem Doppelblindversuch gegeben hatte, und er berichtete, dass mehrere Gramm, vielleicht das Tausendfache der Menge, die bei den meisten Menschen Zuckerbrot verhindert, dass mehrere Gramm Ascorbinsäure bei diesen schizophrenen Patienten ebenfalls wirksam sind, wirksamer als ein Placebo. Die Vorstellung, dass solche Substanzen existieren, die auf die eine oder andere Weise über einen riesigen Konzentrationsbereich wirksam sind, führte mich zu dem Entschluss, dass dieses Gebiet der Medizin einen Namen verdient. Zu seiner Beschreibung erfand ich das Wort "orthomolekular". Die richtigen Moleküle sind die Moleküle, die normalerweise im menschlichen Körper vorhanden sind, und die richtigen Mengen sind diejenigen Mengen, bei denen Menschen sich optimaler Gesundheit erfreuen. Nun, ursprünglich interessierte ich mich für die Beziehung zwischen Vitamin C und Infektionskrankheiten, doch 1971 bat mich Charlie Huggins anlässlich der Einweihung dieses neuen Krebsforschungslabors zu sprechen. Ich dachte mir, dass ich etwas über Krebs sagen müsste. Ich erinnerte mich also, dass ich ein 1966 von Ewan Cameron veröffentlichtes Buch gelesen hatte. Ewan Cameron war Chirurg in einem Krankenhaus in Schottland, der zwar in der allgemeinen Chirurgie arbeitete, sein Leben lang jedoch als Chirurg an Krebs interessiert gewesen war. In seinem Buch "Hyaluronidase und Krebs" stellte er eine allgemeine These auf. Seine These lautete folgendermaßen. Er sagte, dass "der Körper über Schutzmechanismen verfügt, zum Beispiel das Immunsystem. Wenn es uns möglich wäre, dies zu verstärken, die natürlichen Schutzmechanismen, dann könnte dies einen zusätzlichen Schutz gegen Krebs bewirken". Wie Professor de Duve gesagt hat, kommen bei vielen Patienten, bei den meisten Patienten mit Krebs, wandernde Zellen vor, doch nicht alle von ihnen führen zur Entwicklung von Metastasen. Bei denjenigen Patienten, deren Immunsysteme gut funktionieren, besteht eine geringere Wahrscheinlichkeit, dass sich Metastasen entwickeln, als bei den Patienten, deren Immunsysteme nicht gut arbeiten. Nun, ich dachte mir: Eines wissen wir über Vitamin C. Es wird zur Synthese von Kolagen benötigt. Wenn daher Personen mit Krebs Vitamin C in großen Mengen gegeben würde, dann würde ihr Körper dazu stimuliert, im interzellulären Zement, der die Zellen in normalen Geweben zusammenhält, mehr Kollagenfibrillen zu produzieren. Diese Gewebe könnten auf diese Weise so sehr gestärkt werden, dass sie – wie Cameron ohne Hinweis auf Vitamin C meinte – der Infiltration durch den wachsenden bösartigen Tumor widerstehen konnten. Dr. Cameron sah einen Zeitungsartikel über mein Vortrag und schrieb mir mit der Frage, wie viel Vitamin C ich verabreichte. Ich antwortete ihm, er solle den Patienten täglich 10 Gramm geben, 10.000 Milligramm, das Zweihundertfache der normalerweise empfohlenen Menge. Er begann, vorsichtig, mit einem Patienten in der Vale of Leven Klinik, am Loch Lomond in Schottland, und war über die Reaktion des Patienten erstaunt; so sehr, dass er einem anderen totkranken Krebspatienten 10 Milligram Vitamin C am Tag gab. Dieser unbehandelbare Patient bekam keine andere Therapie als das Vitamin C und Narkotika zur Schmerzbekämpfung. Und dann einen dritten und vierten und mehr und mehr Patienten, als er vom Wert dieser Substanz für Patienten mit Krebs immer überzeugter war. Ich habe nun das erste Dia angezeigt. Nun, ich denke – und vielleicht ist dies die Botschaft, die ich hervorheben sollte – ich denke, dass die Leute auf dem Gebiet der Ernährungslehre, die Wissenschaftler auf diesem Gebiet, das mir bis vor 15 Jahren ein furchtbar langweiliges Fach zu sein schien, den falschen Weg eingeschlagen haben. Sie haben gesagt, dass ein Vitamin erforderlich ist, dass eine organische Verbindung in kleinen Mengen benötigt wird, um dem Tod durch eine entsprechende Mangelerkrankung vorzubeugen. Und Sie haben sich über einen Zeitraum von 40 oder 50 Jahren sehr angestrengt darum bemüht herauszufinden, genau wie viel dieser Substanzen benötigt wird, um zu verhindern, das Menschen sterben. Ich bin der Meinung, dass das Problem, das man angreifen sollte, darin besteht herauszufinden, welche Dosis die optimale Gesundheit des Menschen unterstützt, nicht nur festzustellen, welche Menge verhindert, dass er stirbt. Die Ernährungswissenschaftler beziehen sich auf ihre empfohlene Tagesdosis (RDA), in dem Sie sagen, dass es sich hierbei jeweils um die Menge handelt, die bei den meisten Menschen verhindert, dass sich bei ihnen die entsprechende Mangelerkrankung entwickelt. Bei den meisten Menschen mit normaler Gesundheit. Was Sie sagen sollten, ist: dass sie bei den meisten Menschen, die sich bei gewöhnlich schlechter Gesundheit befinden, verhindert, an der entsprechenden Mangelkrankheit zu sterben. Um sich bei normaler guter Gesundheit zu befinden, müssen sie die optimale Menge zu sich nehmen, die angemessene Menge dieser wertvollen Substanzen. Nächstes Dia. Es gibt einen interessanten Unterschied zwischen Vitamin C und anderen Vitamin. Die anderen Vitamine, Thiamin, Pyridoxin, Riboflavin, Vitamin A und so weiter, werden im Prinzip von allen Tierarten benötigt. Die Tiere der meisten Arten benötigen kein Vitamin C. Sie sind nicht auf die Quellen dieses Stoffs in der Ernährung angewiesen. Wenn ich frage, warum diese Tiere weiterhin Vitamin C synthetisieren, obwohl sie nach herkömmlichen Standards möglicherweise große Mengen in ihrer Nahrung erhalten, mehrere Gramm am Tag für ein Tier von der Größe des Menschen, so lautet die Antwort sicherlich, dass sie weiterhin Ascorbinsäure synthetisieren, weil die Mengen, die sie in ihrer Nahrung erhalten, nicht ausreichen, um ihre optimale Gesundheit zu garantieren, um in den Umgebungen, in denen wir leben, ihren kräftigsten Zustand sicherzustellen. Nächstes Dia. Der Mensch ist eine der wenigen unglücklichen Tierarten, deren Gesundheit im Allgemeinen eher schlecht ist, da er nicht über so viel Ascorbinsäure verfügt, wie es seinem optimalen Gesundheitszustand entsprechen würde. Als ich 150 naturbelassene pflanzliche Nahrungsmittel untersuchte, und davon die Mengen nahm, die einem am Tag 2500 kcal Energie geben würden, stellte ich fest, dass sie für Thiamin und andere Vitamine etwa das 3- bis 5-fache der empfohlenen Menge enthielten Ich wertete dies als einen Hinweis darauf, dass größere Mengen von Vitamin C benötigt werden, da Tiere diese größeren Mengen des Vitamins erhalten und trotzdem weiterhin Ascorbinsäure synthetisieren. Nächstes Dia. Das nächste Dia bitte. Eine weitere interessante Tatsache ist, dass der Ausschuss, der die Nahrung für Affen, in Experimenten verwendete Affen, empfiehlt, 70 mal so viel Vitamin C empfiehlt. Auch Affen benötigen exogenes Vitamin C. Es sind Primaten, und alle Primaten benötigen dieses Vitamin. Das 70-fache der für Menschen empfohlenen Menge. Ich denke dies ist verständlich. Affen sind sehr wertvoll, in Experimenten verwendete Affen. Wenn man Monate damit zugebracht hat, Untersuchungen mit Ihnen durchzuführen, und sie dann plötzlich sterben, ist es eine wirkliche Tragödie. Daher hat man sich sehr bemüht festzustellen, wie viel Vitamin C die Affen für Ihre optimale Gesundheit benötigten. Die Mühe, entsprechende Studien für den Menschen durchzuführen, hat sich noch niemand gemacht. Nächstes Dia. Nun, ich erwähnte, dass die meisten Tierarten Ascorbinsäure synthetisieren. Die von ihnen synthetisierte Menge hängt von der Größe des Tieres ab. Kleine Tiere produzieren eine kleine Menge, große Tiere eine größere; proportional zum Körpergewicht, nicht zur Körperoberfläche, jedoch zu 2/3 des Körpergewichts. Und die von Tieren synthetisierte Menge entspricht etwa dem 40- bis 400-fachen der für den Menschen normalerweise empfohlenen Dosis. Das ergibt im Durchschnitt 10 Gramm pro Tag je 70 Kilogramm Körpergewicht. Das ist der Grund, warum ich Ewan Cameron schrieb, dass er eine Dosis von 10 Gramm pro Tag ausprobieren sollte. Ich sollte vielleicht erwähnen, dass Pharmakologen manchmal behaupten, was der Einnahme des Vitamins als Medikament entspricht. Ich würde sagen, dass 10 Gramm am Tag der korrekten physiologischen Menge entsprechen und 100 Gramm pro Tag als pharmakologische Menge bezeichnet werden könnte. Einzelne Personen haben diese Menge zu sich genommen, sie haben täglich 125, 150 Gramm Natriumascorbat in Form intravenöser Infusionen zur Kontrolle schwerer Erkrankungen verabreicht bekommen, ohne irgendwelche Nebenwirkungen zu haben, und haben ähnliche Mengen auch oral eingenommen. Nächstes Dia. Dies ist nun die Schlussfolgerung, zu der ich gelangt bin. Ich habe sie bereits formuliert. Das nächste Dia bitte. Nun, Vitamin C wird zur Synthese von Kollagen benötigt, und ich halte es für sehr gut möglich, dass es die normalen Gewebe stärkt. Nächstes Dia. Der Grund dafür, dass es benötigt wird, ist der, dass Kollagen aus Prokollagen durch die Hydroxylierung von Prolyl- und Serylresten gebildet wird, und es gibt andere Hydroxylierungsreaktionen, diese und andere ähnliche Reaktionen, die nur unter Einsatz von Vitamin C stattfinden. Nächstes Dia. Nun, Kollagen, der Wert einer erhöhten Aufnahme von Vitamin C, bei verschiedenen Bedingungen, ist seit langer Zeit bekannt. Seit mehr als 40 Jahren haben Chirurgen in den besseren Chirurgielehrbüchern empfohlen, allen Patienten 1 oder 2 oder 3 Gramm Vitamin C am Tag zu verabreichen, um die Wundheilung zu unterstützen, die Heilung von gebrochenen Knochen oder Verbrennungen, sowie zur Behandlung von Magengeschwüren, Paradontose. Ärzten und Zahnärzten ist dies bekannt. Sie halten sich nicht alle daran, aber sie verfügen über dieses Wissen. Nächstes Dia. Hier ist ein Hinweis auf Ewan Cameron, der zehn Jahre mit mir diese Arbeiten durchgeführt hat, und auf sein Buch "Hyaluronidase und Krebs". Nächstes Dia. Und stellte dann 1971 die These auf, die auf diesem Dia dargestellt ist, dass die verstärkte Synthese von Kollagen die normalen Gewebe in erheblichem Maße stärken könnte. Nächstes Dia. Seither hat man eine große Menge von Daten über die Beziehung zwischen der Einnahme von Vitamin C und verschiedene Aspekte der Immunschutzmechanismen gesammelt. Vallance, Fagan, Yonemoto und andere haben gezeigt, dass Antikörper, IgG und IgM mit der erhöhten Einnahme von Ascorbat in größeren Mengen produziert werden. Fagan zeigte, dass bei einer verstärkten Einnahme von Vitamin C eine Komponente eines komplementären Elements in einer Kollagen-ähnlichen Sequenz von Aminosäuren, wie von Prof. Porter gezeigt wurde, in großen Mengen produziert wird und dass die Blastogenese der Lymphozyten mit einer größeren Rate erfolgt. Man hat [auch] gezeigt, dass die Aktivierung der zytotoxischen Makrophagen intensiviert ist, und berichtet, dass die Interferonproduktion erhöht ist. Ich sollte erwähnen, dass Interferon für die Behandlung von Krebs ein äußerst großes Interesse gefunden hat. Ein wichtiger Punkt in diesem Zusammenhang ist, dass die Behandlung eines Patienten mit Interferon etwa 1000 mal so teuer ist wie seine Behandlung mit Ascorbinsäure. Dr. Cameron sagt Leuten, die nach Interferon fragen: Das nächste Dia bitte. Dies ist die einzige Studie über Vitamin C, die im Nationalen Krebsinstitut der USA durchgeführt wurde. Yonemoto, Chretien und Fehniger gaben Freiwilligen 5 Gramm Vitamin C täglich. Bei dieser eingenommenen Menge verdoppelte sich die Rate der Blastogenesis der Lymphozyten bei Stimulation durch Antigene. Wurden drei Tage lang 10 Gramm verabreicht, verdreifachte sich die Rate, und wenn für drei Tage 18 Gramm gegeben wurden, vervierfachte sich die Rate. Man weiß, dass eine hohe Rate der Blastogenesis der Lymphozyten bei Krebspatienten mit einer besseren Prognose, längerer Überlebenszeit korreliert ist, als eine geringere Rate der Blastogenesis. Nächstes Dia. Ascorbat scheint einen signifikanten prophylaktischen Wert zu haben. Hier habe ich 7 Untersuchungen zu Vitamin C und Krebs aufgelistet, Untersuchungen, bei denen – wenn eine Reihe von Umwelt- oder Ernährungsfaktoren mit der Morbidität aufgrund von Krebs in Beziehung gesetzt wurden – Vitamin C sich als der Faktor mit dem größten Korrelationskoeffizienten erwies, natürlich einem negativen, als derjenige Faktor, der mit der Morbidität aufgrund von Krebs am stärksten korreliert war. Nächstes Dia. Eine interessante Untersuchung wurde von Dr. DeCosse und seinen Mitarbeitern durchgeführt. DeCosse ist jetzt der Direktor der chirurgischen Abteilung des Memorial Sloan-Kettering Krebszentrums in New York City. Er stellte fest, dass 3 Gramm Vitamin C am Tag, wenn man es Patienten mit familiärer Polyposis gab, dazu führte, dass die Polypen bei der Hälfte der Patienten verschwanden. Ich schlug vor, er sollte in einer neuen Versuchsreihe, die zurzeit durchgeführt wird, 10 Gramm täglich verabreichen, doch er bleibt bei 3 Gramm pro Tag, da er besorgt ist, dass sich bei größeren Dosen giftige Nebeneffekte ergeben könnten. Nun ja, es gibt einfach keine giftigen Nebeneffekte großer Dosen von Vitamin C. Der Rede von Nierensteinen fehlt im Wesentlichen jegliche Basis, sie kann in der medizinischen Literatur durch keine Fälle belegt werden. Leberschäden treten nicht auf, obwohl dies manchmal ohne Angabe von Referenzen erwähnt wird. Das nächste Dia bitte. Bruce in Toronto hat die Ames-Methode der Suche nach Mutagenen zur Untersuchung von Fäkalmaterial verwendet, des Inhalts des unteren Verdauungstraktes. Dabei hat man zahlreiche Mutagene finden können. Sie sind natürlich, wenn Sie – mit großer Schwierigkeit – auf karzinogene Aktivität untersucht wurden, zu 90 % ebenfalls krebserregend. Wenn Vitamin C Patienten oral verabreicht wird, ist die Anzahl der Mutagene im Fäkalienmaterial wesentlich geringer. Dies ist wahrscheinlich ein Mechanismus zur Verhinderung von Krebs im unteren Teil des Gastrointestinaltrakts. Ich habe festgestellt, wenn ich 10 Gramm täglich zu mir nehme, was der von mir eingenommenen Menge entspricht, dass die Hälfte des Vitamin C, 5 Milligramm, im Inhalt des Gastrointestinaltraktes verbleiben. Vermutlich bieten sie dann Schutz insbesondere für diesen Trakt und verhindern natürlich die Bildung von Nitrosaminen, bei denen es sich um eine Ursache von Magenkrebs und anderen Krebsarten handelt, die jedoch auch anderen Mutagene in den Materialien des Gastrointestinaltraktes zerstören. Davon werden 30 %, 1,5 Gramm mit dem Urin ausgeschieden und bieten so Schutz für den Harnweg auf ihrem Weg aus dem Körper, und die anderen 3,5 Gramm wirken im gesamten Körper. Nächstes Dia. Hier sind einige klinische Tests. Alle, über die bisher berichtet wurde, sind durchgeführt worden. Mir ist ein Fehler unterlaufen, als ich den Text für dieses Dia schrieb. Camerons letzte Studie umfasste 300 Krebspatienten im Endstadium, die mit Ascorbat behandelt wurden, verglichen mit 2000 korrelierten Kontrollpatienten im selben Krankenhaus. Bei diesen Studien, 100 im Vergleich mit 1000 korrelierten Kontrollpatienten, gab es im Wesentlichen eine Zufallsverteilung der Patienten zwischen Dr. Cameron einerseits und den anderen Chirurgen und Ärzten im selben Krankenhaus auf der anderen. Für einen bestimmten Zeitraum, als Cameron den Patienten mit Krebs im Endstadium, unbehandelbarem Krebs, Vitamin C gab, und die anderen Chirurgen, die anderen Ärzte dies nicht taten, hatten wir eine Art zufälliger Zuordnung der Studenten der Patienten der beiden Gruppen. Morishita und Morata sind Mitarbeiter an unserem Institut in Kalifornien. Morata hat dort zwei Sommer lang gearbeitet. Ihre Arbeit wird in einem Krankenhaus in Japan durchgeführt. Nächstes Dia. Als erstes fiel Dr. Cameron und seinen Mitarbeiter, den mit ihm zusammenarbeitenden Chirurgen, auf, dass sich die Patienten besser fühlen, wenn sie Ascorbat erhalten. Krebs-Patienten geht es normalerweise ziemlich schlecht. Sie fühlen sich unwohl, haben kaum Appetit und essen wenig. Die Patienten verloren ihre Abmagerung, begannen sich lebendig zu fühlen, hatten einen guten Appetit, und dann konnte man auch noch andere Reaktionen bemerken. Und später wurde dann natürlich festgestellt, nächstes Dia, dass sie länger überlebten als die Kontrollpatienten. Dieses Dia zeigt Überlebensraten von 100 Patienten mit unheilbarem Krebs, die Ascorbat enthielten, und 1000 entsprechenden Kontrollpatienten. Auf jeden mit Ascorbat behandelten Patienten kamen zehn Patienten, deren Krebs ebenfalls in das unheilbare Stadium eingetreten war, in dem außer der Schmerzbehandlung mit Morphium oder Diamorphin keine weitere Therapie mehr durchgeführt wird. Nach dem Datum, ab dem als unheilbar galten, lebten die Kontrollpatienten durchschnittlich von 54 Tage, und die mit Ascorbat behandelten Patienten lebten im Durchschnitt noch ein ganzes Jahr, also wesentlich länger. Von den Kontrollpatienten erlebten nur drei von 1000, also 0,3 %, mehr als 400 Tage, im Gegensatz zu etwa 16 % der mit Ascorbat behandelten Patienten, die noch länger überlebten. Und diese Patienten überlebten für lange Zeit, bis zu 8 Jahre, nachdem man sie als Krebspatienten im Endstadium mit einer Lebenserwartung von nur noch wenigen Monaten angesehen hatte. Nächstes Dia. Dies sind Ergebnisse ähnlicher Beobachtungen, die im Torikai- Krankenhaus in Japan, in Fukuoka, gesammelt wurden. Auch hier gibt es wieder eine Gruppe von Patienten, die nur wenig Ascorbat erhielten, weniger als 5 Gramm Vitamin C am Tag. Von Camerons Patienten in Schottland erhielt die Gruppe mit der geringen Ascorbat-Einnahme eine sehr geringe Dosis, vielleicht 50 Milligramm am Tag. Die Patientengruppe mit der hohen Dosis erhielt mehr als 5 Gramm am Tag, im Durchschnitt etwa 15 Gramm. Die Kurve, die Überlebenskurven, sind im Wesentlichen die gleichen wie in der Studie in Schottland. Diese Diagramme zeigen eine Analyse des Vergleichs von 100, der ersten 100 mit Ascorbat behandelten Patienten in Schottland, und von 1000 entsprechenden Kontrollpatienten. Hier haben wir 17 Patienten mit Dickdarmkrebs im unheilbaren Stadium, verglichen mit 170 entsprechenden Kontrollpatienten. Die Kontrollpatienten starben bereits nach ziemlich kurzer Zeit. Die mit Ascorbat behandelten Patienten lebten länger, einige von ihnen hier, ein Drittel von ihnen oder mehr, über ein Jahr. Einer von ihnen lebte noch im Jahr 1978, mit Magen-, Bronchial- und Brustkrebs, die Situation ist sehr ähnlich. Nächstes Dia. Krebs der Nieren, des Enddarms, der Blasen oder der Eierstöcke: Es scheint keinen großen Unterschied in der Reaktion der Patienten mit verschiedenen Primärtumoren auf Ascorbat zu geben. Es gibt einige statistisch signifikante Unterschiede, doch es ist ein Unterschied zwischen einem durchschnittlichen Überlebenszeitraum von einem Jahr oder von sieben Monaten. Im Allgemeinen würde ich sagen, dass diese Patienten, die das unheilbare Stadium erreicht haben, erwachsene Patienten im unheilbaren Stadium mit festen Tumoren, Tumoren des Magen-Darm-Traktes usw., keine Chemotherapie erhalten, so dass diese Patienten im allgemeinen nicht mit Chemotherapie behandelt worden waren. Im Allgemeinen würde ich sagen, dass die Ergebnisse darauf hinweisen, dass die Gabe von Ascorbinsäure einen längeren Überlebenszeitraum zur Folge hat und ein größeres Wohlbefinden während dieses Zeitraums, als die Behandlung mit Chemotherapie, mit den standardmäßigen Chemotherapien, die man heute einsetzt. Nächstes Dia. Eine weitere Versuchsreihe wurde von Creagan, Mertel und anderen an der Mayo-Klinik durchgeführt. Der Unterschied zwischen dieser Versuchsreihe und den Versuchsreihen in Schottland und Japan bestand darin, dass im Versuch an der Mayo-Klinik 88 % der Patienten, 123 Patienten, Chemotherapie erhalten hatten, im Vale of Leven Hospital hingegen nur 4 %. Dr. Cameron und ich behaupteten, bevor die Versuchsreihe an der Mayo-Klinik begonnen wurde, dass man keine Patienten verwenden sollte, deren Immunsystem durch eine chemotherapeutische Behandlung schwer geschädigt worden war, denn wir vermuteten, dass die Wirkungsweise von Vitamin C zum großen Teil darin besteht, dass es das Immunsystem anregt. Nächstes Dia. Nun ja, unsere Schlussfolgerungen... Ich zitiere einfach aus unserem Buch, die letzten Sätze unseres Buch handeln von Vitamin C: empfehlen wir dringend die Verwendung von zusätzlichem Ascorbat bei der Behandlung sämtlicher Krebspatienten ab dem frühest möglichen Stadium. Wir glauben, dass diese einfache Methode, diese Maßnahme, die Gesamtergebnisse der Krebsbehandlung ziemlich dramatisch verbessern werden. Nicht nur dadurch, dass sie die Patienten gegen ihre Krankheit resistenter machen würde, sondern auch dadurch, indem sie sie gegen einige der schwersten und gelegentlich tödlich ausgehenden Komplikationen der Krebsbehandlung selbst (nächstes...) schützen könnte. Wir sind ziemlich davon überzeugt, dass die ergänzende Behandlung mit Ascorbat in nicht allzu ferner Zukunft einen festen Platz in sämtlichen Maßnahmen der Krebsbehandlung haben wird." Nächstes Dia. Nun, die Vorteile: Es handelt sich um eine orthomolekulare Substanz, jeder Mensch hat Vitamin C in seinem Körper, solange er weiterlebt. Es hat eine sehr geringe Toxizität, keine ernsten Nebeneffekte, es erhöht deutlich das Gesamtbefinden der Patienten, ist sehr preisgünstig, und kann mit den meisten oder allen anderen Behandlungsmethoden, mit Ausnahme der Chemotherapie, kombiniert werden. Natürlich bin ich der Meinung, dass Chemotherapie bei der Behandlung von Krebs im Kindesalter, von Leukämie, der Hodgekin-Krankheit, eingesetzt werden sollte, möglicherweise in Verbindung mit Vitamin C. Doch meine eigene Überzeugung ist, dass bei Patienten mit festen Tumoren die Behandlung mit Vitamin C der Behandlung durch Chemotherapie wahrscheinlich vorzuziehen ist. Nun, ich kann meinen Vortrag damit beenden, indem ich feststelle, dass die Ärzte in den Vereinigten Staaten, als organisierte Körperschaft, diese Ideen nicht akzeptiert hat. Einzelne Ärzte, so glaube ich sagen zu können, haben sie akzeptiert, denn ich erhalte Hunderte von Briefen und Anrufen von einzelnen Ärzten, die an Krebs erkrankt sind und mich um weitere Informationen bitten. Ich danke Ihnen.

Linus Pauling on His Justification of Vitamin C Megadoses
(00:09:45 - 00:15:18)

To date (2013), it has not been proven that vitamin C megadoses are suited as a cancer therapy and the studies Pauling describes in his talk have been shown to contain systematic flaws. The Linus Pauling Institute at the Oregon State University, founded in 1973 by Pauling and colleagues, now distances itself from the claim that vitamin C is effective in cancer therapy and recommends a rather low daily intake of 400 milligram (or 500 % of the current EU-RDA) based on the “currently available epidemiological, biochemical, and clinical evidence” [4].

Signalling: Neurotransmitters, Hormones and the Sense of Smell
Leaving behind nutrition and metabolism, we arrive at another important biochemical domain of small molecules: the transduction of signals. Just as metabolic processes, chemical signalling is a pillar of life. It perpetually occurs on almost all scales – inside individual cells or in-between different cells of the same organism, between an individual organism and the environment, but also between organisms, be they of the same or different species.

Hundreds of messenger molecules, belonging to all kinds of compound classes are known to act in our bodies. However, whenever a signal has to be transmitted very rapidly or over a very long distance, the odds are that a small molecule is involved. This is due to several reasons: small molecules can be made and processed much faster than proteins, they can, in part, migrate through cell walls and, in the case of smells or pheromones, be distributed via air.

Neurotransmission
A classic example of rapid chemical signalling is neurotransmission. Today we know, that signal transduction between neurons is achieved by small molecule neurotransmitters such as glutamate, GABA, glycine, dopamine or serotonin. However, for a long time the crucial role of these small molecules was not realized and neurotransmission was assumed to be merely electrical in nature. Only in 1920, the pharmacologist Otto Loewi, then at the University of Graz in Austria, showed with a famous experiment that a chemical substance must be involved. Loewi himself described this experiment as follows [6]:

“The hearts of two frogs were isolated, the first with its nerves, the second without. Both hearts were attached to Straub canulas filled with a little Ringer solution. The vagus nerve of the first heart was stimulated for a few minutes. Then the Ringer solution that had been in the first heart during the stimulation of the vagus was transferred to the second heart. It slowed and its beats diminished just as if its vagus had been stimulated. Similarly, when the accelerator nerve was stimulated and the Ringer from this period transferred, the second heart speeded up and its beats increased. These results unequivocally proved that the nerves do not influence the heart directly but liberate from their terminals specific chemical substances which, in their turn, cause the well-known modifications of the function of the heart characteristic of the stimulation of its nerves.”

Together with the Brit Henry Dale, Loewi then went on to discover the first neurotransmitter, acetylcholine. Both scientists shared the 1936 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Loewi also showed that after neurotransmission acetylcholine is broken down to two other small molecules, acetate and choline, by an enzyme called acetylcholine esterase. This is one of the fastest enzymatic reactions known. A single molecule of acetylcholine esterase, which is considered to be an “evolutionary perfect” enzyme [7], can hydrolyse around 16.000 molecules of acetylcholine per second [8]. Proteins cannot be made or degraded at similar rates.

Loewi was a pioneer of neuroscience and many others followed in his footsteps. At the 2011 Lindau Nobel Laureate Meeting, 1991 Nobel Laureate Erwin Neher, who had received a shared Prize for his work on ion channels, summarized the history and current knowledge on neurotransmission:

Erwin Neher (2011) - Signals and Signalling Mechanisms in the Central Nervous System

I think it is a challenge to keep up after these fantastic lectures this morning but I'll try anyway. My topic is signals and signalling mechanisms in the central nervous system and since I understand that this is a pretty diverse audience let me try to give a short introduction into the historical background regarding our knowledge on what happens in our brain. And of course this knowledge about bio-electricity, about signalling the brain starts with Luigi Galvani and Alessandro Volta in Italy. Luigi Galvani who showed that there is electricity in our bodies that frog muscles can be made to twitch when the nerve is stimulated by electric shock. About one hundred years later we got a very good impression on the structure of our brain when Ramon y Cajal showed that our brain is made up of these very delicate structures which we call neurons. And today we know that our brain is a network of about 1012 such neurons which are extensively connected with each other. Each nerve cell receiving input from up to about ten thousand neurons. Ramon y Cajal also developed ideas on the signal flow in the nervous system. When you look at his beautiful drawings you discover these little arrows everywhere. They show what his ideas about the signal flow was and one must say he had very good intuition. He was mostly right. Of course he didn't know what these signals were. But about at the same time Julius Bernstein showed what he called the "negative Schwankung" an electrical signal associated with nerve activity, which he was able to measure with this very difficult apparatus. And he also formulated his membrane theory which said the neurons are surrounded by a membrane and it's actually the voltage across this membrane which is responsible for signal and which changes in the way of this "negative Schwankung" when there is nerve activity. Now, 1952 Hodgkin and Huxley provided our understanding of the action potential of the nerve impulse by showing that actually when you depolarise a nerve something happens. When you cross a threshold the membrane suddenly becomes permanent with sodium ions. So even the electrochemical radiance across biological membranes and sodium rushes in and makes the inside more positive. But this is only a very short duration, soon after the membrane becomes permeable to potassium, potassium ions leaves the cell and this makes it again negative. Okay, so this more or less formed our understanding of what the brain is about. Each cell receives all its inputs mainly on its dendrites and adds up integrates its signals and once the threshold in a given cell has been surpassed the action potential is generated which then travels along the axon and signals to other cells. Now, the other part of course of the picture is what happens when such an electrical signal arrives, that's a nerve ending and signals to the receiving cell. This phenomenon synaptic transmission was first studied in detail at the neuromuscular junction. A special type of synapse when the nerve interacts with the muscle and gives its signal for the muscle to contract. There is a typical synapse at this neuromuscular junction. This is where Sir Bernhard Katz and colleagues studied this process of synaptic transmission in the 50s and 60s. What you see here is one of the basic discoveries which they made when they studied the signal in the muscle which is elicited by a nerve action potential. This is shown down here what happens is when the nerve impulse arrives there is a deflection. A positive signal which is the so-called synaptic signal generated by synaptic current, which then elicits an action potential a nerve impulse very much like the nerve impulse. Now what Bernhard Kutz did he looked at this at the baseline, he turned up the gain of his amplifier and observed something very strange namely that when you look at this baseline in high resolution you see all these little blips. So many researchers might dismiss this signal because it may be just some interference. But he decided to study it and what he found was when he reduced extra-cellular calcium concentration this nerve evoked signal became smaller and smaller and eventually at very low calcium concentration there was basically nothing left and the nerve impulse either did not illicit any signal or else elicited a signal of this kind which by itself happens spontaneously now and then. And this information of course when it was combined with the electro-microscopic evidence at the time that in the nerve terminals there are these little structures, these little granules called synaptic vesicles. This combined led to our current understanding of what synaptic transmission is, namely that a nerve impulse causes the influx of calcium ions. This was an underlying observation was that the strength of the signal is so critically dependent on extra calcium concentration. So this is calcium entering the nerve terminal as a consequence of the action potential, the calcium makes vesicles fuse with the plasma membrane and the vesicles are filled with neurotransmitter which diffuses to the postsynaptic membrane. The neurotransmitter opens channels in the postsynaptic membrane and so this again causes an electrical signal in the postsynaptic membrane. So we have this relatively complex process and electrical signal being translated into a chemical signal and back again to an electrical signal. Okay, so there is one very special feature of this kind of signal transmission which is very different in the brain as compared to a computer. In the computer the signal elicited by one transistor in the receiving circuit is always the same. But in neuroscience you observe basically everywhere you look that the synaptic strength which is the signal produced by a pre-synaptic action potential in the postsynaptic cell. So the synaptic strength changes in a youth dependent member. And neuroscientists are convinced that it is this plasticity, the constant reorganisation of the neuronal network which is at the basis of many of the very complex information processing tasks in the central nervous system. This plasticity occurs on many times scales, there are phenomena of long-term plasticities, so-called long-term depression and I think there is general agreement that this is the basis of learning and memory. But there is also short-term plasticity on the timescale of milliseconds to seconds which mediates basic signalling tasks like filtering adaptation and other things like gain control. So when we study the nervous system today we can principally take two approaches. Either the top-down approach starting from the higher functions and try to understand by lesion, by imaging how these functions are being generated by the element of the brain. Or else we can take the bottom-up approach which starts at the building blocks of molecules and tries to understand phenomena like nerve impulse synaptic transmission and so on. So my laboratory and my interest have guided me on the bottom up pathway. Already during my thesis - this is an illustration taken from my own thesis - recording from a giant neuron of a snail. When I started this research and lined up with Bert Sakmann to tackle some of the problems it was of course known from Hodgkin and Huxley that the action potential is a consequence of the permeability changes in nerve membrane but it was not known at this time what the underlying mechanisms are. Now around that time there was another field of research, which was work on artificial membrane. On so-called bimolecular lipid membranes. These were invented by Mueller and Rudin, two American researchers and more or less mimicked the biological membranes. What they found is that these artificial membranes just consisting of lipids were pretty good insulators but when you added tiny amounts of certain substances like the antibiotic gramicidin suddenly you saw, by recording currents across this membrane after applying a voltage, that there was this jumps in current recording. And all the evidence pointed that these gramicidin molecules formed pores in the membranes, so-called ion channels, which would then lead to a conductance. Obviously here these pores would form and decay and the up and down would be the opening and closing of these ion channels. And of course the proposal was that similar ion channels also would be operative in a biological membranes but the proof that was lacking. In fact there were competing hypothesis about carrier mechanism, about phase transitions in the membranes which might produce phenomenal like action potential. But Bert Sakmann and myself set out to prove this channel concept by showing that actually you can record such discontinuous jumps in current on the biological membrane. So just to give you an idea about the order of magnitude the channels of artificial membranes had an amplitude of about one pico-amp. You see here these arrow which should represent currents on a logarithmic scale, I need not go through all of this but just point out that typically the smallest biological currents that could be recorded at the time were on the order of a nano-amp, which is typically the current which is elicited in a muscle when one single quantum of transmitter, one vesicle fuses with the plasma membrane. But the problem was that all these methods for recording currents had an intrinsic noise of about a tenth or two-tenths of an nano-amp and we wanted to record this currents which were hundredfold smaller. So we had to come up with a new idea. The new idea is now known as the so-called Patch Clamp Technique. We used pipettes, measuring pipettes and did not punch through the membrane, as was usual at that time, but tried to place them touchingly on the surface to isolate little patches of membrane and the idea was that if you were lucky there would be a channel we could record the current flowing through this channel through an amplifier. We used a neuromuscular junction and were looking for this ion channels which are activated by the neuromuscular transmitter, which is acetylcholin, and indeed after a little bit of frustration, two or three years, we got recordings of this type. Very clear step-like changes in current elicited by acetylcholin which was added to the recording pipette. A few years later we happened to run across an improvement in the sense that the quality of this recording is very much dependent on the quality of the contact between the recording electrode and the membrane. And we happened to improve this contact about a hundredfold reaching so-called gigaseal conditions which means that the resistance between the inside of the pipette and the outside is in the order of gigaohms and this actually allowed us to record this current in very high precision. Around the same time the molecular biology had advanced, biochemists had been able to isolate membrane proteins, so-called acetylcholine receptors which could be shown to underlie these step like changes in current namely pentameric proteins which had binding sites for acetylcholine. And when this acetylcholine, the neuromuscular transmitter, binds to these molecules they undergo a conformational change, open the pathway through the channel and creating a current. I think that Bert Sakmann in his lecture on Wednesday or Thursday will show a few examples in terms of movies of what you can observe on the oscilloscope when you do this experiment. So let me just point out we were interested in nerve excitability in neuromuscular transmission. We just wanted to show that there are channels and wanted to study these channels. What we did not consider and which came as a surprise to us and actually which made our invention of this technique much more relevant is that channels not only are represented in so-called electrical excitable tissue but fulfil a huge array of different tasks in the whole range of other cells. Basically every cell type we looked at and which we started to look at when we had this method at hand tuned out to contain a specific types of channel which do fulfil all these jobs mainly at the interface between the biochemistry and chemistry and electrical signalling. Particularly in the sensory organs where channels are the real elemental transfusing the end signal from the surround to the central nervous system. What also turned out which we were not aware of is that these channels are prime targets for pharmaca. Just one example here a slide given to me by Harald Reuter an investigation on cardiomyocytes, heart cells, which express a particular type of calcium channel which lets calcium enter the cell to produce the heart contraction. When activated by voltage and under controlled conditions if you have a patch with just a single one of these channels you see upon depolarization this flickering open and close. If you do the same under the influence of a so-called calcium antagonist, a molecule which had been known and had been used as a pharmacon to fight hypertension, these channels are much less willing to open. Their opening is suppressed and therefore there is less calcium influx, less contraction of the heart and particularly also less tone on the blood vessels cells. Okay, another surprise was that defects in ion channels cause a number of hereditary diseases. Some of these are quite common but of course the majority of these diseases which have been characterised in between some fifty to a hundred diseases are quite rare diseases. But still they offer the possibility to learn a lot about human biology. To learn a lot about how very defined changes in a functional molecule in the end turn out to lead to pathological changes. And by now it's clear that about a thousand of the, I think we should say now twenty-thousand genes code for ion channels and transport mechanisms. Okay, so much about ion channels let me guide you one more step on the bottomup approach namely concentrate on synaptic transmission, which is my current field of research. And let me just show once more this summary slide on the basic way how this functions. But let me point out that of course in the end things are much more complex than originally thought. If we look today what biochemists, molecular biologists know about the synapse there about a huge number of molecules engaged in both the pre-synaptic compartment and the post-synaptic compartment. To do this job of synaptic transmission, I mean even though the mechanism is quite complex, neurotransmitter release post-synaptic sensitivity, one could do with just a few of these molecules to make such a complex thing. But in fact we are dealing with about fifteen-hundred interacting proteins here and probably the reason why it is such a complex thing is because of synaptic plasticity. Because of course we not only have to understand how the process takes place but also the nature has to have the means to regulate this synaptic connectivity on all these different time scales in a very complicated way. Okay, so we have been interested in some of the mechanisms of short-term plasticity, the very short forms of changes in synaptic transmission. And our preparation during the last few years has been the so-called Calyx of Held synapse in the auditory pathway second relay station of auditory information. This was already described by Hans Held in 1893, it was re-discovered for electro-physiology by Ian Forsythe who showed that these pre-synaptic terminals are so big that you can use our techniques with the patch pipettes to study in detail the pre-synaptic processes. And Gerard Borst together with Bert Sakmann has shown then that indeed you can do a simultaneously dual whole cell recording which means that you can simultaneously look, record currents and voltage both pre- and post-synaptic, that you can by taking excess with the recording pipette to the inter-cell milieu you can control the ions inside the cell. And you can load the terminals with fluorescent indicators and with so-called caged compounds. This will be one thing which I will come back in a second. So when you record from this synapse you see a large so-called excitatory post-synaptic current, a surge of invert-current as a consequence of the transmitter which has been liberated by the nerve. So this invert-current would use an action potential if it were not voltage clamped, if not our apparatus would hold the potential and the post-synaptic site constant. And the understanding of how this works goes again back to Sir Bernhard Katz who proposed that the release, the signal is proportional to two quantities namely to what's called the number of units available, the number of vesicles ready to be exocytosed when an action potential arrives, times the probability that a given vesicle actually fuses during action potential. Now this was extended by an Australian scientists Vere-Jones in 1966 who said this number of units available is proportional to the number of sites from which such vesicles can be released, times a probability that these sites are occupied. So you have the release to be proportional to the number of sites, times probability these are occupied, times the probability that a vesicle is released. Now, what we can observe on the Calyx of Held are the two most prominent forms of so-called short-term synaptic plasticity namely short-term depression, short-term facilitation. This you can see here when you give a sequence of stimuli at rapid succession you see if you do this here at two millimol calcium which is more or less normal condition that the response depresses, becomes smaller and smaller. Whereas if you do this at a small extracellular calcium concentration the first response is very small, it's different scale here, but subsequent responses are larger. So this is phenomenon of facilitation. Katz's concept gives a simple explanation to this, namely if you take the response proportional to these two kinds of probabilities, of course when you start here the first response releases a large fraction of the units available. So for the second response, the probability of occupancy of a given site is smaller and after a few responses you have more or less exhausted all your store of vesicles and you are left with a very small response. If however, you have a very small first response so the release probability here under these conditions is very small. You hardly change the probability of occupancy during this train and what you then see is that underlying this depression is actually an increase in the release probability for a given vesicle. This is the basis of facilitation. And here in our preparation these two processes superimpose on each other. Other synapses are made up in the sense that you see either only this or that actually also under normal conditions you see the facilitation in cases where release probability of the first pulse is very small. And each type of synapse in different regions of the brain has its own personality in this respect. Now, let me spend two more minutes I hope to just go into another very basic question, which is relevant for synaptic transmission and that is the calcium dependence. Katz already showed that the influx of calcium is the real trigger for the release but up to relatively recently nobody really knew how high this calcium concentration has to rise in order to trigger this event. And how long the duration of such signals and what its properties are. The reason is that of course the concentration of calcium at a given site depends strongly on the neighbourhood relationships. On how far away the calcium source is from the channels which mediate the calcium influx. Since it matters on a length scale of 10µM ~ 100µM culture imaging which is a method available to look at special distribution of calcium signals is not capable of answering this question. So in order to get an idea on how sensitive this release apparatus to calcium is we resorted to so-called caged calcium measurements. We filled the terminal with a compound called calcium compound which is a chelator like EGTA binding calcium but being photo-labile and giving a UV flash we can split this compound. We can liberate calcium and if we make sure that this compound was distributed evenly and also the light is evenly distributed we can elevate calcium uniformly in the cell and having also a calcium indicator dye, a substance which measures calcium concentration, we can then watch these responses to calcium increases, step-like calcium increases to various levels. And we see that if we increase calcium to about 2 micromolar from a pre-calcium level of only one-tenth of the micromolar we see a very, very small response. If we increase calcium to about 6 micromolar we see a response of about the same magnitude as an action potential induced response. So the cause answer is that the release apparatus response to calcium concentrations in the range of 10 micromolar. Of course this is a very course thing and we have to do biophysical modelling in order to get precise answers. But what I showed you establishes that this un-caging allows us to characterise the sensitivity and the speed of response of the release apparatus that from this knowledge we can then by biophysical modelling infer that actually when this calcium increase is only very short-lived we have to have an increase in the region of the vesicles to about 20um. We also can postulate that this increase has to be extremely short-lived because after having characterised the kinetics we know that any longer increase in calcium would lead to much more sluggish and long-lived responses. And further biophysical modelling then shows that actually you need a very tight spatial coordination between the calcium influx and the release sites. So without being able to go into details let me just summarise, we get the speed of the synaptic response by proximity. This provides a need for a very precise ultrastructural organisation of the synapse and this is also one of the reasons why you have these very many specialised molecules in the nerve terminal. So I shouldn't close without mentioning that of course this is the work of the laboratory and the main contributors to what I summarised here are Ralf Schneggenburger a previous post-lab who is now a professor at the EPFL in Lausanne. And Takeshi Sakaba who used to be a post-doc now he has his own group from Japan and from September he will be a professor in Kyoto. Thank you very much.

Nach diesen fantastischen Vorträgen heute Morgen wird das eine Herausforderung hier mitzuhalten, aber ich werde es dennoch versuchen. Mein Thema sind Signale und Signalgebungsmechanismen im zentralen Nervensystem. Da ich weiß, dass es sich hier um ein recht bunt gemischtes Publikum handelt, möchte ich Ihnen eine kurze Einführung in die Historie unserer Erkenntnisse über die Vorgänge im Gehirn geben. Natürlich beginnt dieses Wissen von der Bioelektrizität, der Signalgebung im Gehirn mit Luigi Galvani und Alessandro Volta in Italien. Luigi Galvani, der zeigte, dass es Elektrizität in unserem Körper gibt, dass man Froschmuskeln zucken lassen kann, wenn man den Nerv mittels Elektroschock stimuliert. Etwa 100 Jahre später bekamen wir eine sehr gute Vorstellung von der Struktur unseres Gehirns, als Ramon y Cajal zeigte, dass unser Gehirn aus diesen äußerst feinen Strukturen, den sogenannten Neuronen besteht. Heute wissen wir, dass unser Gehirn ein Netzwerk aus etwa 1012 solcher Neuronen ist, die flächendeckend miteinander vernetzt sind. Jede Nervenzelle erhält dabei Informationen von bis zu etwa zehntausenden anderen Neuronen. Ramon y Cajal entwickelte auch Ideen bezüglich des Signalflusses im Nervensystem. Wenn Sie sich seine wunderbaren Zeichnungen anschauen, entdecken Sie überall diese kleinen Pfeile. Sie stellen seine Vorstellungen vom Signalfluss dar, und man muss sagen, er hatte eine sehr gute Intuition und lag meistens richtig. Natürlich wusste er nicht, was diese Signale waren. Doch etwa zur selben Zeit stellte Julius Bernstein die von ihm so bezeichnete "negative Schwankung" dar, ein mit der Aktivität eines Nervs assoziiertes elektrisches Signal, das er mit dieser hochkomplizierten Vorrichtung messen konnte. Er formulierte auch seine Membrantheorie, die besagt, dass die Neuronen von einer Membran umgeben sind und es eigentlich die Spannung an dieser Membran ist, die für das Signal verantwortlich ist und sich bei Aktivität des Nervs im Sinne dieser "negativen Schwankung" ändert. dass bei Depolarisierung eines Nervs tatsächlich etwas geschieht. Überschreitet man eine Schwelle, wird die Membran infolge der elektrochemischen Strahlung in biologischen Membranen plötzlich für Natriumionen durchlässig; Natrium strömt ein und verstärkt die positive Ladung im Inneren. Dies ist jedoch nur von sehr kurzer Dauer; kurz danach wird die Membran wieder für Kalium durchlässig, d.h. Kaliumionen treten aus der Zelle aus, wodurch diese wieder negativ wird. Dies bildete also mehr oder weniger unser Verständnis von der Funktionsweise unseres Gehirns. Jede Zelle empfängt ihre Informationen hauptsächlich über die Dendriten und integriert (addiert) dabei die Signale; sobald die Schwelle in einer Zelle überschritten ist, wird das Aktionspotential erzeugt, das dann am Axon entlang wandert und das Signal an andere Zellen sendet. Auf der anderen Seite ist natürlich die Frage, was geschieht, wenn ein solches elektrisches Signal auf ein Nervenende trifft und der Empfängerzelle Informationen übermittelt. Dieses Phänomen - die synaptische Übertragung - wurde erstmals an der neuromuskulären Endplatte näher untersucht, einer speziellen Synapse, an der der Nerv mit dem Muskel in Wechselwirkung tritt und dem Muskel das Signal zur Kontraktion gibt. Die neuromuskuläre Platte ist eine typische Synapse; an ihr untersuchten Sir Bernhard Katz und Kollegen den Prozess der synaptischen Übertragung in den 50er und 60er Jahren. Hier sehen Sie eine der grundlegenden Entdeckungen, die sie bei der Untersuchung des von einem Nervenaktionspotential ausgelösten Signals im Muskel machten. Das ist hier unten dargestellt. Bei Ankunft des Nervenimpulses kommt es zu einer Auslenkung, einem von dem synaptischen Strom erzeugten positiven Signal, dem sogenannten synaptischen Signal, das dann ein dem Nervenimpuls sehr ähnliches Aktionspotential auslöst. Bernhard Kutz schaute sich die Basislinie an, drehte seinen Verstärker auf und beobachtete etwas sehr Seltsames, nämlich dass an der Basislinie bei hoher Auflösung diese kleinen Ausschläge sichtbar werden. Viele Forscher ignorierten dieses Signal, da es einfach eine Interferenz sein konnte. Er aber entschied sich, das Phänomen zu untersuchen, und stellte fest, dass dieses vom Nerv evozierte Signal bei Reduktion der extrazellulären Kalziumkonzentration immer kleiner wurde und schließlich bei sehr niedriger Kalziumkonzentration praktisch nicht mehr vorhanden war. Der Nervenimpuls sendete entweder gar kein Signal oder ein ab und an spontan entstehendes Signal aus. In Kombination mit den damaligen elektromikroskopischen Belegen, dass in den Nervenenden diese kleinen Strukturen, diese Körnchen, die sogenannten synaptischen Vesikel zu finden sind, führten diese Informationen zu unserem heutigen Verständnis der synaptischen Übertragung, dass nämlich ein Nervenimpuls das Einströmen von Kalziumionen auslöst. Die zugrundeliegende Beobachtung war, dass die Signalstärke entscheidend von der extrazellulären Kalziumkonzentration abhängt. Hier strömt Kalzium infolge des Aktionspotentials am Nervenende ein und bewirkt, dass die Vesikel mit der Plasmamembran verschmelzen und mit einem Neurotransmitter gefüllt werden, der durch die postsynaptische Membran diffundiert. Der Neurotransmitter öffnet Kanäle in der postsynaptischen Membran, was wiederum ein elektrisches Signal in der postsynaptischen Membran erzeugt. Wir haben also diesen relativ komplexen Prozess, bei dem ein elektrisches Signal in ein chemisches Signal und wieder zurück in ein elektrisches Signal verwandelt wird. Im Vergleich zum Computer gibt es jedoch im Gehirn eine ganz spezielle Besonderheit bei dieser Art von Signalübertragung. Im Computer ist das durch einen Transistor im Empfängerschaltkreis ausgelöste Signal stets dasselbe. In der Neurowissenschaft beobachtet man jedoch praktisch überall, dass die synaptische Stärke, also das von einem präsynaptischen Aktionspotential in der postsynaptischen Zelle erzeugte Signal... Der Laserpointer macht mir hier schlapp, vielleicht könnte ich einen neuen haben? Die Synapsenstärke ändert sich je nach Verwendungszweck. Neurowissenschaftler sind davon überzeugt, dass diese Plastizität, die kontinuierliche Umorganisation des neuronalen Netzwerks einem Großteil der äußerst komplexen Aufgaben der Informationsverarbeitung im zentralen Nervensystem zugrundeliegt. Diese Plastizität tritt in unterschiedlichen Zeitmaßstäben auf. Es gibt Phänomene der Langzeitplastizität, die sogenannte Langzeitpotenzierung/-depression, und ich denke, es herrscht allgemeine Übereinstimmung darüber, dass dies die Grundlage von Lernen und Gedächtnis ist. Es existiert aber auch eine Kurzzeitplastizität in einem Zeitraum von Millisekunden bis Sekunden, die grundlegende Signalgebungsaufgaben wie adaptive Filterung und Verstärkungsregelung vermittelt. Bei der Untersuchung des Nervensystems lassen sich heute im Prinzip zwei Ansätze verfolgen. Entweder der Ansatz von oben nach unten, also ausgehend von den höheren Funktionen, wo man versucht, anhand der Läsionen und mittels Bildgebung zu verstehen, wie diese Funktionen von den Elementen des Gehirns erzeugt werden, oder der Ansatz von unten nach oben, wo man bei den Molekülbausteinen beginnt und Phänomene wie die synaptische Übertragung von Nervenimpulsen usw. zu verstehen versucht. Mein Labor und mein Interesse haben mich auf den von unten nach oben verlaufenden Weg geführt. Bereits während meiner Doktorarbeit - das ist eine Abbildung daraus, die Ableitung eines Riesenneurons einer Schnecke - als ich mit meiner Forschung begann und mich mit Bert Sakmann zusammentat, um einige der Probleme anzugehen, war uns natürlich von Hodgkin und Huxley bekannt, dass das Aktionspotential Folge der Permeabilitätsveränderungen in der Nervenmembran ist. Die zugrundeliegenden Mechanismen waren damals jedoch noch nicht bekannt. Etwa zu dieser Zeit existierte ein anderes Forschungsgebiet, nämlich die Arbeit an künstlichen Membranen, sogenannten bimolekularen Lipidmembranen. Sie wurden von Mueller und Rudin, zwei amerikanischen Wissenschaftlern erfunden und ahmten mehr oder weniger die biologischen Membranen nach. Die Forscher stellten fest, dass diese künstlichen, nur aus Lipiden bestehenden Membranen zwar relativ gute Nichtleiter waren, bei Zugabe winziger Mengen bestimmter Substanzen wie dem Antibiotikum Gramicidin jedoch bei Aufzeichnung der Ströme an der Membran nach Anlegen einer Spannung Sprünge in der Ableitung auftraten. Alles deutete darauf hin, dass diese Gramicidin-Moleküle Poren in den Membranen bildeten, sogenannte Ionenkanäle, die dann die Leitfähigkeit bewirkten. Offensichtlich entstehen diese Poren und bilden sich wieder zurück, und das Auf und Ab entspricht dem Öffnen und Schließen dieser Ionenkanäle. Natürlich nahm man an, dass ähnliche Ionenkanäle auch in biologischen Membranen funktionieren, doch der Beweis fehlte. De facto existierten konkurrierende Hypothesen zu Trägermechanismen und Phasenübergängen in den Membranen, die Phänomene wie das Aktionspotential hervorrufen könnten. Doch Bert Sakmann und ich machten uns daran, dieses Konzept der Kanäle zu beweisen, indem wir zeigten, dass sich solche diskontinuierlichen Sprünge in der Stromkurve der biologischen Membran tatsächlich ableiten lassen. Damit Sie einen Eindruck von der Größenordnung der Kanäle künstlicher Membranen erhalten: Sie beträgt etwa 1 Picoampere. Sie sehen hier diese Pfeile, die Ströme auf einer logarithmischen Skala darstellen sollen. Ich will das nicht alles durchgehen, möchte aber darauf hinweisen, dass typischerweise die kleinsten biologischen Ströme, die man damals ableiten konnte, in der Größenordnung von 1 Nanoampere lagen, also typischerweise dem Strom entsprachen, der in einem Muskel ausgelöst wird, wenn ein Transmitterquantum, ein Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt. Das Problem war jedoch, dass bei all diesen Methoden zur Ableitung von Strömen ein intrinsisches Rauschen von 1/10 oder 2/10 eines Nanoampere auftrat, wir aber diese hundertfach kleineren Ströme ableiten wollten. Wir mussten also mit einer neuen Idee aufwarten - heute wird sie als Patch-Clamp-Technik bezeichnet. Wir benutzten Messpipetten, stachen aber damit nicht durch die Membran hindurch, wie es damals üblich war, sondern versuchen sie im Kontakt mit der Oberfläche zu platzieren, um kleine Stellen der Membran zu isolieren. Die Idee war, dass wir im Falle des Vorhandenseins eines Kanals den durch diesen Kanal fließenden Strom mittels eines Verstärkers aufzeichnen könnten. Wir verwendeten eine neuromuskuläre Endplatte und suchten nach diesen Ionenkanälen, die durch den neuromuskulären Transmitter Acetylcholin aktiviert werden. Und tatsächlich, nach zwei oder drei frustrierenden Jahren, gelang uns diese Ableitung: Ganz deutliche, stufenweise Veränderungen des Stroms, die durch das der Messpipette zugesetzte Acetylcholin hervorgerufen wurden. Einige Jahre später stießen wir zufällig auf eine Verbesserung in dem Sinne, dass die Qualität dieser Ableitung sehr stark von der Qualität des Kontaktes zwischen der Messelektrode und der Membran abhängt. Wir verbesserten diesen Kontakt um etwa das Hundertfache und erreichten auf diese Weise sogenannte Gigaseal-Bedingungen; dabei liegt der Widerstand zwischen der Innen- und Außenseite der Pipette in der Größenordnung von Gigaohm. Dies erlaubte uns die Messung dieses Stroms mit sehr großer Präzision. Etwa um dieselbe Zeit gab es Fortschritte in der Molekularbiologie; die Biochemiker konnten Membranproteine, sogenannte Acetylcholin-Rezeptoren isolieren, und es konnte gezeigt werden, dass diese Rezeptoren, nämlich Pentamerproteine, die über Bindungsstellen für Acetylcholin verfügen, diesen stufenweisen Veränderungen des Stroms zugrundeliegen. Bindet das Acetylcholin, der neuromuskuläre Transmitter, an diese Moleküle, kommt es zu einer Konformationsänderung, der Weg durch den Kanal öffnet sich und es wird ein Strom erzeugt. Ich denke, dass Bert Sakmann Ihnen in seinem Vortrag am Mittwoch oder Donnerstag einige Filmbeispiele dafür zeigen wird, was sich bei diesem Experiment auf dem Oszilloskop beobachten lässt. Wir waren also an der Erregbarkeit von Nerven bei der neuromuskulären Übertragung interessiert. Wir wollten einfach zeigen, dass es Kanäle gibt, und diese Kanäle untersuchen. Was wir nicht bedacht hatten und für uns daher überraschend kam und unsere Erfindung dieser Technik erheblich relevanter machte, war, dass Kanäle nicht nur in elektrisch erregbarem Gewebe vorliegen, sondern auch eine unglaubliche Vielzahl unterschiedlicher Aufgaben in allen anderen Zellen erfüllen. Es stellte sich heraus, dass praktisch jeder Zelltyp, den wir uns anschauten, als uns dieses Verfahren zur Verfügung stand, spezielle Kanäle enthielt, die all diese Aufgaben hauptsächlich an der Schnittstelle zwischen Biochemie, Chemie und elektrischer Signalgebung erfüllten, insbesondere in den Sinnesorganen, in denen Kanäle am Ende die eigentlichen Überträger des Signals von der Umgebung auf das zentrale Nervensystem sind. Es stellte sich zudem heraus - und dessen waren wir uns ebenfalls nicht bewusst - dass diese Kanäle das vorrangige Ziel von Medikamenten sind. Nur ein Beispiel: Hier sehen Sie eine Folie, die mir Harald Reuter gegeben hat, über die Untersuchung von Kardiomyozyten, also Herzzellen, die eine bestimmte Art von Kalziumkanal exprimieren, der Kalzium in die Zelle strömen lässt, um die Kontraktion des Herzens zu induzieren. Hat man eine Stelle mit nur einem dieser Kanäle und aktiviert man diesen mittels Spannung unter kontrollierten Bedingungen, sieht man, dass er bei Depolarisierung auf und zu geht. Macht man dasselbe unter dem Einfluss eines sogenannten Kalziumantagonisten, eines Moleküls, das damals bereits bekannt war und als Medikament gegen Bluthochdruck eingesetzt wurde, öffnen sich diese Kanäle weit weniger bereitwillig. Das Öffnen wird unterdrückt, so dass weniger Kalzium einströmt, das Herz weniger stark kontrahiert und insbesondere der Tonus der Blutgefäßzellen niedriger ist. Eine weitere Überraschung war, dass Defekte in den Ionenkanälen zu einer Reihe von Erbkrankheiten führen. Einige davon sind recht häufig, doch der Großteil dieser etwa fünfzig bis hundert Erkrankungen tritt natürlich eher selten auf. Dennoch eröffnen sie die Möglichkeit, etwas über die menschliche Biologie zu erfahren, darüber wie genau definierte Veränderungen in einem funktionellen Molekül am Ende zu pathologischen Veränderungen führen. Heute ist klar, dass etwa 1000 der, ich denke wir können sagen 20.000 Gene Ionenkanäle und Transportmechanismen codieren. Gut, so viel zu den Ionenkanälen. Begeben wir uns in unserem Ansatz von unten nach oben auf die nächste Stufe und konzentrieren wir uns auf die synaptische Übertragung, mein aktuelles Forschungsgebiet. Ich zeige Ihnen noch einmal diese Folie, die einen Überblick über die grundlegende Funktionsweise gibt. Ich möchte allerdings betonen, dass die Dinge am Ende wesentlich komplexer sind als man ursprünglich dachte. Wenn wir uns heute anschauen, was Biochemiker und Molekularbiologen über die Synapse wissen, dann existiert eine unglaubliche Anzahl von Molekülen, die sowohl im präsynaptischen als auch im postsynaptischen Kompartiment an der synaptischen Übertragung beteiligt sind. Selbst wenn der Mechanismus relativ komplex ist - Neurotransmitter-Freisetzung, postsynaptische Sensibilität - käme man für einen solch komplexen Vorgang mit einigen wenigen dieser Moleküle aus. De facto haben wir es hier aber mit etwa 1500 interagierenden Proteinen zu tun. Der Grund für diese Komplexität ist wahrscheinlich die synaptische Plastizität, denn wir müssen natürlich nicht nur verstehen, wie der Prozess stattfindet, sondern die Natur muss auch über die Mittel verfügen, diese synaptische Vernetzung innerhalb der unterschiedlichen Zeitrahmen auf äußerst komplizierte Weise zu regulieren. Wir sind also an einigen der Mechanismen der Kurzzeitplastizität interessiert, d.h. den kurzfristigen Veränderungen bei der synaptischen Übertragung. Während der letzten Jahre haben wir uns mit der sogenannten Heldschen Calyx, einer Synapse der Hörbahn beschäftigt, die die zweite Relaisstation akustischer Informationen darstellt. Sie wurde bereits 1893 von Hans Held beschrieben und von Ian Forsythe für die Elektrophysiologie wiederentdeckt; er zeigte, dass diese präsynaptischen Nervenenden so groß sind, dass man die präsynaptischen Prozesse mit unserer Technik der Patch-Pipette näher untersuchen kann. Gerard Borst und Bert Sakmann haben gezeigt, dass tatsächlich eine simultane, duale Ganzzellableitung, d.h. die gleichzeitige prä- und postsynaptische Aufzeichnung von Strömen und Spannungen möglich ist, man die Ionen im Inneren der Zelle steuern kann, indem man sich mit der Messpipette Zugang zum interzellulären Milieu verschafft, und sich die Nervenenden mit fluoreszierenden Indikatoren, sogenannten Käfigverbindungen bestücken lassen. Darauf komme ich in einer Sekunde noch zurück. Bei Ableitung von dieser Synapse zeigt sich als Folge des von dem Nerv freigesetzten Transmitters ein großer, sogenannter exzitatorischer postsynaptischer Strom, ein plötzlicher Anstieg des Einwärtsstromes. Ohne Voltage-Clamp, ohne unsere Vorrichtung, die das Potential und die postsynaptische Stelle konstant hält, würde dieser Einwärtsstrom ein Aktionspotential induzieren. Das Verständnis dieser Vorgänge geht ebenfalls auf Sir Bernhard Katz zurück, der postulierte, dass das Signal zu zwei Größen proportional ist, nämlich zur Anzahl der verfügbaren Einheiten und zur Anzahl der Vesikel, bei denen es bei Ankunft eines Aktionspotentials zur Exozytose kommt, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Vesikel tatsächlich während eines Aktionspotentials verschmilzt. Dies wurde von dem australischen Wissenschaftler Vere-Jones 1966 noch weiter gefasst; nach seiner Auffassung ist die Anzahl der verfügbaren Einheiten proportional zur Anzahl der Stellen, an denen solche Vesikel freigesetzt werden, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass diese Stellen belegt sind. Die Freisetzung muss also proportional sein zur Anzahl der Stellen, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass diese belegt sind, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass ein Vesikel freigesetzt wird. Nun, was wir an der Heldschen Calyx beobachten können, sind die beiden markantesten Formen der sogenannten synaptischen Kurzzeitplastizität, nämlich short-term depression (STD) und short-term facilitation (STF). Sendet man in rascher Folge eine Reihe von Reizen - bei zwei Millimol Kalzium, was mehr oder weniger normwertig ist - sieht man, dass die Reaktion abnimmt und immer kleiner wird. Tut man dagegen dasselbe mit einer kleinen extrazellulären Kalziumkonzentration, fällt die erste Reaktion zwar auch sehr gering aus - der Maßstab ist hier anders - die späteren Reaktionen sind dagegen größer. Das ist das Phänomen der STF. Katz' Konzept liefert hierfür eine einfache Erklärung: Nimmt man nämlich die Reaktion proportional zu diesen beiden Wahrscheinlichkeiten und fängt hier an, setzt die erste Reaktion einen großen Teil der verfügbaren Einheiten frei. Bei der zweiten Reaktion ist die Wahrscheinlichkeit der Belegung einer Stelle somit kleiner, und nach ein paar Reaktionen ist mehr oder weniger der gesamte Vorrat an Vesikeln aufgebraucht und die Reaktion ist nur noch sehr gering ausgeprägt. Fällt jedoch die erste Reaktion sehr gering aus, ist auch die Wahrscheinlichkeit einer Freisetzung unter diesen Bedingungen sehr gering. Die Belegungswahrscheinlichkeit ändert sich während dieser Abfolge kaum. Sie sehen, dass dieser Depression eigentlich eine Zunahme der Freisetzungswahrscheinlichkeit für ein bestimmtes Vesikel zugrundeliegt. Das ist die Basis der STF. Hier in unserem Beispiel überlagern sich diese beiden Prozesse. Andere Synapsen sind dergestalt aufgebaut, dass man entweder nur dies sieht oder - auch unter normalen Bedingungen - in Fällen, in denen die Freisetzungswahrscheinlichkeit des ersten Impulses sehr gering ist, die STF. In dieser Hinsicht hat jede Synapse in den verschiedenen Gehirnregionen ihre eigene Persönlichkeit. Ich möchte mich jetzt noch zwei Minuten mit einer anderen grundlegenden Frage beschäftigen, die für die synaptische Übertragung relevant ist, und zwar mit der Kalziumabhängigkeit. Katz hatte bereits gezeigt, dass der Kalziumeinstrom der eigentliche Auslöser für die Freisetzung ist, doch bis vor kurzem wusste niemand wirklich, wie hoch die Kalziumkonzentration sein muss, um diesen Vorgang auszulösen, und wie lange solche Signale dauern und welche Eigenschaften sie haben. Der Grund dafür ist, dass die Kalziumkonzentration an einer bestimmten Stelle natürlich stark von den Nachbarschaftsverhältnissen abhängt, wie weit z.B. die Kalziumquelle von den Kanälen, die den Kalziumeinstrom vermitteln, entfernt ist. Da es um eine Längenskala von 10-100 µm geht, lässt sich diese Frage mittels Kalziumbildgebung, einem Verfahren, mit dem sich die spezielle Verteilung von Kalziumsignalen untersuchen lässt, nicht beantworten. Um also eine Vorstellung davon zu erhalten, wie empfindlich dieser Freisetzungsmechanismus für Kalzium ist, griffen wir auf die sogenannte caged-Kalzium-Messung zurück. Wir füllten die Nervenenden mit einer caged-Kalzium-Verbindung, also einem Chelator wie EGTA, der Kalzium bindet, jedoch photolabil ist und einen UV-Blitz erzeugt. Wir können diese Verbindung spalten und Kalzium freisetzen. Wenn wir für eine gleichmäßige Verteilung der Verbindung und des Lichts sorgen, können wir die Kalziumkonzentration in der Zelle gleichmäßig erhöhen. Mit einem Kalziumindikatorfarbstoff, einer Substanz, die die Kalziumkonzentration misst, können wir die Reaktionen auf die schrittweise Kalziumerhöhung auf verschiedene Konzentrationen beobachten. Bei einer Kalziumerhöhung von einem Präkalziumspiegel von nur 1/10 Mikromolar auf etwa 2 Mikromolar sehen wir nur eine äußerst geringe Reaktion. Erhöhen wir Kalzium auf etwa 6 Mikromolar, besitzt die zu beobachtende Reaktion etwa dieselbe Größenordnung wie eine von einem Aktionspotential induzierte Reaktion. Die Antwort ist, dass die Reaktion des Freisetzungsmechanismus auf die Kalziumkonzentrationen etwa im Bereich von 10 Mikromolar liegt. Natürlich ist das nur eine grobe Schätzung und wir müssen biophysikalische Modelle erarbeiten, um genaue Antworten zu erhalten. Was ich Ihnen gezeigt habe, beweist jedoch, dass uns dieses sogenannte Uncaging erlaubt, die Sensibilität und Geschwindigkeit der Reaktion des Freisetzungsmechanismus zu charakterisieren. Von diesem Wissen können wir dann mit Hilfe biophysikalischer Modelle ableiten, dass es im Falle einer nur sehr kurzzeitigen Kalziumerhöhung zu einem Anstieg im Bereich der Vesikel auf etwa 20 µm kommt. Wir können auch postulieren, dass dieser Anstieg außerordentlich kurzzeitig sein muss, denn nach Erstellung des kinetischen Profils wissen wir, dass ein längerer Kalziumanstieg zu erheblich schleppenderen und längeren Reaktionen führen würde. Weitere biophysikalische Modellversuche zeigten, dass de facto eine sehr enge räumliche Koordination zwischen dem Kalziumeinstrom und den Freisetzungsstellen notwendig ist. Ich kann hier nicht weiter ins Detail gehen, möchte Ihnen aber noch eine Zusammenfassung geben. Die Geschwindigkeit der synaptischen Reaktion hängt von der Lage ab, daher ist eine sehr genaue ultrastrukturelle Organisation der Synapse notwendig. Das ist auch einer der Gründe, warum diese unzähligen spezialisierten Moleküle in den Nervenenden existieren. Ich möchte meinen Vortrag nicht schließen, ohne anzumerken, dass dies natürlich die Arbeit des Labors ist und zwei Leute wesentlich zu dem beigetragen haben, was ich Ihnen heute gezeigt habe, nämlich Ralf Schneggenburger, ein früherer Post-Doc im Labor, heute Professor an der EPFL in Lausanne, und Takeshi Sakaba, ebenfalls ein früherer Post-Doc, der jetzt eine eigene Arbeitsgruppe in Japan leitet und ab September Professor in Kyoto ist. Vielen Dank.

Erwin Neher on the History of Neurotransmission
(00:00:30 - 00:08:03)


Hormones and Related Messengers
Neurotransmission is a fast process and usually occurs at synapses linking two neurons. If cells require to communicate over longer distance, for example between different parts of the body, the may do so by means of a different group of signalling molecules, the hormones.

In his 2007 Lindau lecture, 1998 Nobel Laureate Ferid Murad familiarized the audience with intercellular, hormonal signalling. He had received the Prize together with Robert Furchgott and Louis Ignarro for the discovery of one of the smallest signalling molecules known: nitric oxide, a molecule consisting of only a nitrogen and an oxygen atom.

Ferid Murad (2007) - Nitric oxide as a messenger molecule and its role in drug development

So after this wonderful start of the meeting, we heard about the Big Bang, and I think the following talk also can be considered that it has been a Big Bang in biomedicine. That was the discovery of nitric oxide. It’s a great pleasure to ask Professor Ferid Murad from Houston, Texas to give his lecture to us here. He won the Nobel Prize in physiology and medicine in 1998. And it was listed for the discoveries concerning nitric oxide as a signalling molecule in the cardiovascular system. Professor Murad. This is my first visit to Lindau. It looks like a very exciting opportunity for the speakers as well as the students and I’m going to enjoy the week, I can assure you. Shortly after the Nobel Prize was announced, my office received numerous phone calls from the local schools in Houston, the high schools, the colleges, asking me to give lectures and meet students and I did that. But the requests really got to be enormous and I couldn’t keep up with it. So I went to the audiovisual television department in the Texas Medical Center and asked if they would help me put a video together. So this morning is going to be movies and films. This department is really an excellent department. They prepare tapes and videos for patients, how do they manage their ileostomy bags, how do they manage their renal shunts for dialysis and so forth. So we got together and put a dialogue together, we exchanged a lot of information back and forth and finally one Saturday morning they showed up at my home and we prepared this video and I think you’ll enjoy it. Now, it was prepared for teenagers but I’ve shown it to 4 year olds, 85 year olds and everybody seems to enjoy it because it’s science in lay language that all of you should understand. So let’s start with the video. Girl 1: Gosh, what’s with all the awards shows? TV: And the winner is... Congratulations. And now I ask you to step forward and receive your Nobel Prize. Girl 1: Nobel Prize? What is that? Girl 2: Beats me. Prof. Dr. Ferid Murad: What? You don’t know what the Nobel Prize is? We have to do something about that. Girl 1: Wow! Girl 2: What’s up with this? Boy: Hey, you’re just coming out of the TV! It’s like aliens. Prof. Dr. Ferid Murad: May I? Girl 1: Yeah sure, why not? So, what’s your story? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, my name is Ferid Murad. You can call me Fred. I’m a doctor and researcher and a scientist at the University Of Texas Medical School. And, oh, by the way I got the “Nobel Prize” in medicine in 1998. Girl 2: So, what is that “Nobel Prize” anyway? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, the Nobel Prize is one of the greatest awards you can get in the world. Boy: Aha... Prof. Dr. Ferid Murad: It’s recognition from other scientists. Girl 2: So? Prof. Dr. Ferid Murad: Hmm. Well, you get to be on TV all over the world. There’s a big party in Sweden. You even get to meet the King and Queen of Sweden. You get a gold medal. Then of course there is the money. Boy: Money? Girl 1: Party? Girl 2: Royalty? Prof. Dr. Ferid Murad: Yeah. Maybe it would be better if I showed you. May I? Girl 1: Mmm...sure. Prof. Dr. Ferid Murad: Thanks. Scientist on TV: Thanks, Fred. Welcome to my world of science and my laboratory. You know, the Nobel Prize wouldn’t even be around if it wasn’t for...dynamite. Anyway. Alfred Nobel, the Swedish inventor and businessman who invented the Nobel Prizes, was the guy who invented dynamite. Nitro-glycerine is the explosive chemical in dynamite. And even though it was very dangerous, Mr. Nobel figured out a way to contain nitro-glycerine so that it could be put to good use like to build stuff. You could say his discovery rocked the world. But nitro-glycerine has other uses. When Nobel started having heart problems, his doctor actually prescribed nitro-glycerine for his heart. But Nobel said: “No way.” So he blew it. Nobody knew why it worked. But it did. and he shared the 1998 Nobel Prize in Medicine with Dr. Robert Furchgott and Dr. Luis Ignarro for figuring it out. Boy: So you’re the dude that figured out why nitro-glycerine helps peoples’ hearts? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, yeah. Girl 2: So? Prof. Dr. Ferid Murad: So what? Girl 2: So why does it work? Prof. Dr. Ferid Murad: We were trying to answer the question to how nitro-glycerine works to help with chest pain. I did experiment, observed the results and collected data. Then I found out if what I thought was right or wrong. Anyway, what I did find was that nitro-glycerine releases nitric oxide and that nitric oxide does a lot of important stuff in the body. Girl 1: So, what is nitric oxide? And what exactly did you figure out that got you this “Nobel Prize”? Prof. Dr. Ferid Murad: Let me show you. Announcer on TV: It protects the heart. It stimulates the brain. It kills bacteria. And it’s a real gas. It’s nitric oxide. No one can say no to NO. Nitric oxide or NO is a simple molecule with two adapts, nitrogen and oxygen. And yes, it’s a colourless, odourless gas. A scientific sensation sweeps the globe. Nitric oxide is everywhere. It’s coming in toxic pollution depletes the ozone layer. It’s even found in car exhaust and cigarette smoke. But from super-menace to superhero. Nitric oxide is also found inside the human body and it helps send very important messages which are not from our sponsors. When blood flows through your blood vessels, the inner lining or endothelium releases nitric oxide. The nitric oxide signals your blood vessel to relax and widen. So what? This in turn lowers blood pressure, the force which the blood exerts on the vessel walls. If your blood vessels make enough nitric oxide, this signals your blood vessel to relax. Then your blood flows on through. No problem. But if blood doesn’t flow through, blood plugs forks. Then... (heart attack). And that’s not all! Scientist on TV: So relaxed blood vessels allow more blood to flow and nitric oxide can have an impact on all different parts of the body. For example, nitric oxide is already saving the lives of babies who are born too early by breathing in very small doses of this gas. It helps their lungs and improves their breathing. And that’s good! In nerve cells nitric oxide can stimulate the brain affecting things like behaviour. Oh behave, baby! As part of the body’s self-defence system nitric oxide defends against tumour cells and bacteria too. It’s amazing stuff. But nitric oxide is no laughing matter and not to be confused with nitrous oxide, better known as laughing gas. Ha-ha... somebody turn of that gas. Boy: So how do you think of all that anyway? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, over time I became very interested in how cells talk to each other. But most other scientists didn’t think that was very important. Scientist on TV: Dr. Murad figured out that when cells talk to each other, it’s like one cell sends an e-mail to another cell somewhere in the body. And the e-mail is the gas nitric oxide. The e-mail can break into another cell and take over how the cell works. It may contain a message like instructions for a blood vessel to relax. Or it may contain some other kind of instructions. For example, if the message is being sent to a cancer cell, the nitric oxide may kill the cancer and then self-destruct. Hasta la vista, baby. Nitric oxide in your body affects so many things. It’s like having a worldwide internet system inside your own body. Girl 1: So why did you go into science in the first place? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, it’s really a lot of fun to figure out how stuff like this works. And you don’t have to be brilliant to get ahead. You just have to have some goals and be prepared to work very hard. Scientist on TV: As a scientist you get to do something for the first time that nobody else has ever done. And that’s exciting! Sometimes your discovery opens the door to a whole new way of thinking and even more new discoveries. It is really cool! It’s kind of like the “Science Olympics” and the goal is the Nobel Prize. Teams of scientists from around the world compete with each other. It’s fun. Who’s going to finish first? Who’s going to win the prize? Prof. Dr. Ferid Murad: One of you could be a Nobel Prize winner someday. Who knows? Boy: Hey! I have some more questions. Girl 2: Yeah, me too. Girl 1: Well, I guess we have to find out more on our own. Girl 2: Maybe we could check the internet. Boy: Yeah, and look out for science and the Nobel Prize. Prof. Dr. Ferid Murad: They’re gone and they left some popcorn, didn’t they? Yum! I was very fortunate in that I was one of the first MD PhD students in the United States when the program began in Cleveland and I decided that that’s what I wanted to do somehow. I wasn’t sure how I made that decision. I was excited about chemistry and biology. I guess I was confused more than anything else. And said I’m going to try both and see which way to go and I got hooked and I’ve always straddled the fence the rest of my life. My mentors were Earl Sutherland and Ted Rall. They had just discovered cyclic AMP a year before I joined their laboratory. And what an exciting time this was for a young student. My assignment was to figure out how catecholamines, adrenalin regulates cyclic AMP production in tissues and whether it works through the beta adrenergic receptor or the alpha receptor. And that was a pretty straightforward and actually simple assignment. But to see this whole era of cell signalling and messengers evolve was a remarkably exciting time. To see all the hormones that work through these pathways and all the drugs that were evolving that I became hooked on second messenger systems and cell communication. Cell communication is really an old concept, probably first introduced by Pavlov more than 100 years ago. As you recall from your psychology classes Pavlov had a patient with a gunshot wound to his abdomen who developed a gastric fistula to the exterior. And whenever the patient would see or smell food, he would enhance his gastric secretions. Well, Pavlov was clever enough that he developed pouches and fistulas in dogs and showed them food and they too would enhance their gastric secretions. But he decided to condition these dogs by ringing a bell. And ultimately all he had to do was ring a bell and they would enhance their secretion without having to show them food. That told him that the brain was talking to the stomach, cells communicate with each other. Of course we know today that lots of cells and tissues in the body communicate with each other. And this is summarised for you in this cartoon, in this first slide. This represents three different populations of cells that are going to talk to each other. They can be any cells but I’m going to call cell 1 a neuronal cell. It can be a central neuron or a peripheral neuron. Cell 2 I will call an endothelial cell lining a blood vessel and cell 3 a smooth muscle cell in the wall of that blood vessel. Cell 1 wants to talk to cell 2 and also cell 3. And it does it by producing molecules that Earl Sutherland called first messengers. Today we call them hormones, we call them cytokines, we call them growth factors, we call them a variety of things, paracrine substances, autacoids etc. They come in different shapes and sizes and flavours. Some are small amino acids; some are large proteins like the cardiac troponins. The point is they’re released into the interstitial space in the blood stream and they home the body to find its target. It identifies its target cell by the presence in their membrane of a macromolecule that we call a receptor. Sometimes these receptors are inside of the cell, as with steroids and thyroid hormone, but most often they’re transmembrane proteins, integral membrane proteins in the membrane surface. These ligands or first messengers interact with their appropriate cells that only possess those receptors. That’s where the specificity of the reaction occurs. They fit together conformationally, like a key in a lock. And they then only perturb the cells that have the appropriate receptor. The ligand doesn’t necessarily have to enter inside of the cell to cause the cascade of biochemistry to result in some physiologic response. They can just interact with the receptor, it tweaks it and then all of a sudden, voila, there are lots of different intracellular second messengers that accumulate. The first such second messenger was cyclic AMP. What Sutherland and Rall discovered: This is how glucagon and epinephrine regulated glycogen degradation in the liver. We know today that lots of pathways utilise that messenger. We also know that there are other second messengers besides cyclic AMP: cyclic GMP, calcium, diacylglycerol, nitric oxide. And while there are hundreds and hundreds of first messengers, there are a modest number of intracellular second messengers. Perhaps no more than a dozen at present but there will be more, I’m sure, in the future. These second messengers accumulate and carry out the function within the cell that was brought by this first messenger to the cell surface. What is unique about nitric oxide as an intracellular second messenger is that it’s a gas. It’s a free radical with an unshared electron and a very simple molecule. And because it’s uncharged, the physiologic pH, like all the other messengers, it doesn’t go in and out of membranes... it goes in and out of membranes much more readily than the other messengers that often require energy or transporters to do that. So it not only regulates the biochemistry in the cell in which it’s made, nitric oxide, but it can come out and travel a couple of hundred Angstrom, microns, to regulate adjacent cells to produce other second messengers such as cyclic GMP. So it’s a very unique messenger molecule. It’s the only messenger I’m aware of that functions both intracellularly as well as extracellularly. It can be a paracrine substance, a local autacoid. It can also bind with other carriers, glutathione, thiols, albumen, other proteins and be transported a distance to be released again and function therefore as a hormone. No other messengers can do that. Nitric oxide is a very old molecule and I have a theory that it participated also in evolution. It was probably one of the first messenger molecules 3 billion years ago, as cells began to communicate with each other. But I won’t get into that story because time doesn’t permit. But today we know that it’s very important as a pollutant. And this is when it became popular about 50 or 60 years ago when it was apparent that all fossil fuels when combusted with oxygen produced a family of nitrogen oxides, NO, NO2, N2O3 etc. All of these nitrogen oxides will interact with ozone and deplete the ozone layer and are responsible for global warming along with the greenhouse gases. But I’m going to tell you that not only is the nitric oxide a pollutant but it’s the mechanism of action of some very important cardiovascular drugs and it’s a very important messenger molecule in the body. And this is just a partial list of the biology that it regulates. And the list is much, much longer than this. It includes muscle relaxation, platelet aggregation, penile erection, killing of parasites and microorganisms and the list goes on and on. We’ll come back to some of that shortly. In 1963, 7 years after the discovery or 6 years after the discovery of cyclic AMP, a couple of chemists discovered for the first time cyclic GMP, another cyclic nucleotide, a cousin of cyclic AMP. All you do is shift the amino group on the purine ring and you have a different structure. They administered inorganic P32 phosphate to rats, harvested the urine and found two major organic phosphates in urine, cyclic AMP, the other being cyclic GMP. That was the first demonstration of cyclic GMP as a natural product. That stimulated a few laboratories to become interested in cyclic GMP, to look for enzymes that made it, enzymes that hydrolysed it etc. And the story began to evolve in the late 1960s, early 1970s just as I was finishing my training and getting ready to join the faculty at the University of Virginia. We know today that there is a family of enzymes called guanylyl cyclases and there are at least seven or eight members of this family and we think there will be even more with splice variants that we’re now isolating. All of these enzymes convert GTP to cyclic GMP and pyrophosphate. The reaction is very analogous to add an OH cyclase that converts ATP to cyclic AMP and pyrophosphate. In fact the catalytic domains of all of the cyclases are homologous with the change of one or two amino acids, one enzyme can make the other nucleotide. The cyclic GMP can be inactivated by a family of phosphodiesterases; there are at least 10 or 11 members in this gene family. And they hydrolyse the phosphodiester bond to convert the cyclic nucleotide to the corresponding monophosphate, either 5’ GMP or 5’ AMP and it becomes inactive. As you will hear later in the week from Doctor Fischer, many of the intracellular second messengers, cyclic AMP, cyclic GMP, diacylglycerol, calcium etc., often activate a protein kinase that then phosphorylates a variety of protein substrates by transferring the gamma phosphate from ATP to a serine-threonine residue or perhaps a tyrosine residue. There are I’m told now as many as 500 or 600 protein kinases. So while the concept of cell communication is pretty simple, a ligand or hormone regulates the second messenger production which then regulates the protein kinase which phosphorylates a protein, the problem is the matrix gets pretty hairy when you consider all the cyclases, the diastasis, the protein kinases and the numerous proteins that can be phosphorylated. When these proteins are phosphorylated, as you’ll hear from Doctor Fischer, their conformation changes. If they’re structural proteins they can influence motility and other processes, contractility. If they’re enzymes they can be activated or inhibited. So as this story was beginning to unfold with cyclic GMP, I decided to desert cyclic AMP and switch my interest to cyclic GMP. As a new young faculty member in the early 1970’s the cyclic AMP field in my opinion was becoming rather crowded, large groups of people around the world. And I didn’t think that I could compete with all these huge laboratories and cyclic GMP was evolving and I said I’m going to go in this new direction. And I wanted to address two questions. We knew that a couple of hormones could increase cyclic GMP accumulation in a couple of tissues, acetylcholine in heart preparations, prostaglandins in vascular preparations. But we didn’t know the molecular coupling mechanism. If we understood ligand binding to the receptor and the coupling to the guanylyl cyclase to make cyclic GMP, we could presumably influence that coupling process with various chemicals and drugs to potentiate a hormone response or block it and maybe come up with some novel therapies for various endocrine diseases. That was quite rational. The second is, although cyclic GMP was a natural product, we had no idea what it did or what its function was. So we began our studies by looking at the enzyme in some detail that made cyclic GMP and the first big surprise was that there wasn’t just a single enzyme but a couple of enzymes. The enzyme activity was in soluble fractions as well as particulate fractions. The kinetic properties of this isoforms was different. I suspected there would be isoforms. I had thought to myself: If there are different compartments and isoforms of guanylyl cyclase, perhaps they’re regulated by different groups of hormones, wouldn’t that be a fun project to sort out. And a lot of that all turned out to be true intuition at the time. Well, to prove that we were dealing with isoforms was going to take a lot of work. We had to purify these soluble particulate activities, clone them, express them, restudy them. We did that, it took us 12 or 15 years of work to do all that. But initially I took a shortcut. I said the cooperativity of the particulate isoform, whereas the typical Michaelis-Menten kinetics of the soluble could be artifactual because these were crude preparations that possessed nucleotidases, phosphatases, phosphodiesterases. So we created a cocktail and added it to our incubations to inhibit all these competing pathways. We made a cocktail pyrophosphate, fluoride, azide, hydroxylamine, sodium nitrite, methylxanthines etc. And quite accidentally, as science often is the case, we found compounds that activated the enzyme. While our goal was to figure out hormonal regulation, we couldn’t do that because once we disrupted tissues, the hormone coupling was lost. Hormones no longer activated extracts of the enzyme. But the small molecules now would activate and maybe they could be our surrogates for understanding hormonal regulation. Much as fluoride was a valuable resource for understanding hormonal regulation of adenylate cyclase. The activators were azide, hydroxylamine and sodium nitrite. And to make a long story short, the effects of the azide were oxygen dependent, enhanced with thiols, had a time lag before the rate of the reaction became maximal. They were tissue specific because tissues possessed inhibitors and activators of the pathway. And we were convinced that these activators were precursors or prodrugs being converted to something else in our incubation. And it became quite a mystery story for several years to figure out what that activator was going to be. We put azide and hydroxylamine and nitrite on cell cultures in tissues. And indeed they would elevate cyclic GMP levels and would also activate the enzyme and extracts. So they would work in both systems. One of the tissues, again fortunately, that we were working with was tracheal smooth muscle. As a student I knew that cyclic AMP relaxed smooth muscle, vascular and airway smooth muscle. And I thought cyclic GMP might antagonise cyclic AMP. So we prepared a smooth muscle preparation that was relatively homogenous in order to do some biochemistry and compare it with a physiologer. We put azide on those smooth muscle preparations, the cyclic GMP levels went up, but the muscle didn’t contract, it relaxed. The opposite of what we expected. The dose response curves, the time courses, everything told us that azide was a smooth muscle relaxant, mediating its effects through cyclic GMP and that’s how it worked. And that was the first physiologic function of cyclic GMP. We said: If these drugs cause relaxation and elevate G, what do the other smooth muscle relaxants do? Nitro-glycerine, which had been around for 100 years, nitroprusside? A lot of popular drugs in the cardiovascular intensive care units. They decreased after load, lowered blood pressure in patients with infarction and so forth. We put them on our preparations, they relaxed as expected. The surprise was that they elevated cyclic GMP levels. So now we had a family of compounds that we called nitrovasodilators that were capable of activating guanine cyclase in cell free preparations and elevating cyclic GMP levels in various tissues. These compounds included hydroxylamine, azide, sodium nitrite, some hydrazines, nitro-glycerine, nitroprusside, nitrosoureas, nitrosamines and a long list of other compounds, all NO donors. They all have nitrogen. Some are converted spontaneously based on redox and pH incubations. Some are converted insomatically, azide requires catalase conversion. And we reasoned that the intermediate for all of these prodrugs or precursors had to be nitric oxide. And the reason we thought it was nitric oxide is because azide’s tissue specificity was in part influenced by the presence of haemoglobin and myoglobin in our tissue extracts. These were inhibitors. We knew from the literature that NO had a very high affinity for the heme prosthetic group of haemoglobin, myoglobin. So we reasoned that all of these prodrugs or precursors were converted to nitric oxide. When we generated nitric oxide in the fume hood chemically, sodium nitrite, ferrous sulphate, sulphuric acid, ventilated the gas into our incubations, every preparation was activated. What an exciting period that was. The first demonstration that a free radical could activate an enzyme. And I thought that would be interesting chemistry. Lots of folks were sceptical. They all thought of free radicals and the nitric oxides as pollutants and toxic materials and sure enough it activated. Some people argued: Murad, you’re inhibiting an inhibitor, you’re disinhibiting in your crude preparations. So we were obliged to purify the enzyme to homogeneity and when we did the concentration the nitric oxide required to activate kept becoming lower, lower, lower as we moved scavengers and sinks from our incubation. Transition metals, thiols, proteins and sucked it up, you know. Nanomolar concentrations of NO would activate the enzyme and the Vmax would increase 200- to 400-fold, as it would lower the Km for GTP. So we realised that we had figured out the mechanism of action of the nitrovasodilators, such as nitro-glycerine that had been used clinically for 100 years. As a pharmacologist, when you find an exogenous material that does something in a biological system, you should ask yourself: Is it mimicking a natural pathway that’s already there? And is it working through a similar mechanism? So I proposed in some review articles in the late ‘70s that perhaps the effects of various hormones to increase cyclic GMP levels were because they were increasing the production of nitric oxide from some endogenous precursor, perhaps by altering some redox pathway. We couldn’t prove that hypothesis because the technology was not there to measure nitric oxide in its oxidation products at animals or concentrations back in the 70’s. There were crude colorimetric assays. So to prove this took another seven or eight years of technology development before we and others were able to prove that it turned out to be the case. But we expected that nitric oxide was going to be an intracellular second messenger and that was heresy. And it was enough to show that it activates... a free radical activates an enzyme, now you're saying a free radical is a second messenger and it turned out to be true, we turned out to be right. And basically that’s the reason we went to Stockholm. Shortly after this Robert Furchgott, a vascular pharmacologist in New York, showed for the first time that a group of agents would relax vascular segments in the organ bath in the laboratory. Agents such as acetylcholine, histamine, bradykinin that were known to be hypotensive in man or animals had always failed to cause relaxation in the laboratory. He found, if he preserved the integrity of the endothelium in his blood vessel preparations, they would cause relaxation. And that was an exciting turn of events in 1980. I heard him present this work, he said that these substances caused the release of a factor from the endothelium which he called endothelium-derived relaxant factor, or EDRF, and had a half-life of only several seconds. I said: Bob, this is a reactive species, maybe a free radical, maybe it works in cyclic G, maybe it’s going to be related somehow to NO. Let’s figure this out. Well, we moved to Stanford, Bob went to New York, his wife developed breast cancer and that collaboration never took place. But a couple of years later we became impatient and moved on ourselves and showed that that hypothesis was in fact the case. This is a blood vessel precontracted with norepinephrine. And then after five or seven minutes we introduced an endothelial dependent vasodilator, acetylcholine, bradykinin, ATP ionophore, histamine etc. And if the endothelium is present, cyclic GMP levels increased within seconds, returned to basals and this is followed by relaxation in the muscle. But that only occurs if the endothelium is intact, if there’s no endothelium there’s no increase in cyclic G, no relaxation. So we knew by the early 1980s there were now two pathways converging on guanylyl cyclase to regulate cyclic GMP synthesis. The NO donors in the endothelial dependent vasodilator pathway. We spent a couple of years showing that this resulted in the activation of protein kinase G in vascular smooth muscle preparations. We then chased the phosphorylation of a variety of proteins with P32 incorporation. And to put all of the story together for you, it’s summarised on this slide. This cartoon represents a blood vessel with the endothelial lining on the left and the smooth muscle compartment on the right and in red are three categories of vasodilators that work by enhancing cyclic GMP production. The nitrovasodilators that are converted spontaneously based on pH oxygen tension etc. or the enzymatically converted, such as nitro-glycerine, to nitric oxide which activates the soluble guanylyl cyclase. Soluble guanylyl cyclase is a heterodimer with an alpha-beta-subunit and the beta-subunit has a heme prosthetic group at the histamine 105 position. The iron in that heme has to be ferrous, NO binds to the ferrous, changes the liganding of the heme to the beta-subunit which then talks to the catalytic domain down at the C-terminal, resulting in activation of the enzyme. The cyclic GMP activates a cyclic G dependent protein kinase. There are a couple of these, soluble and particulate that phosphorylate numerous proteins. These proteins regulate the concentration of cytosol calcium by altering distribution within the cell from stores or through channels in the membrane. And we know that the myosin light-chain kinase is a calcium calmodulin dependent enzyme. So when you decrease calcium, you decrease the kinase, myosin light-chain accumulates in the dephosphorylated state. If you take actin and myosin filaments, when you phosphorylate the myosin light-chain, they slide together for contraction. You dephosphorylate they slide apart and you get relaxation. Since this work it’s been shown that cyclic GMP also regulates the phosphatase activity perhaps. The endothelial dependent vasodilators do exactly the same thing; however, the receptors for these endothelial dependent vasodilators are only on the endothelial cells, not the smooth muscle cells. That’s why patients with arthrosclerosis and cardiovascular disease get direct acting NO donors, nitro-glycerine, nitroprusside etc. They don’t get endothelial dependent vasodilators because their endothelium is abnormal. And I’ll tell you more about that in a moment. But they produce EDRF, which we know is nitric oxide, to work through the same pathway. A third category are the atriopeptins. It was found some years ago by deBold that the granules and atria possess a peptide called atrial natriuretic factor and we found that that factor, atriopeptins and the family of these, activate the particulate isoforms of guanylyl cyclase and there are several of these. It turns out the particulate cyclases are receptor cyclases. For atriopeptins, guanylyl, e-coli enterotoxin etc. And by elevating cyclic G, they too will cause relaxation. Now, you can relax smooth muscle in other ways with agents that alter calcium, agents that increase cyclic AMP, phosphodiesterase inhibitors etc. These are the mechanisms in which you cause relaxation by enhancing cyclic GMP production. But you can start combining this information now to create novel combination therapies for various cardiovascular diseases and I’ll show you how to do that in a moment. There was some other very important observations along the way and I’m going to have to skip them. But it became apparent by the mid and late 1980s that there had to be a pathway that was making nitric oxide. People were finding nitride and nitrate in their condition media, people were finding arginine activation of the pathway. And it turns out indeed there’s a family of enzymes called nitric oxide synthases, very ubiquitous, found in most tissues. And there are 3 isoforms, initially called neuronal NOS, inducible NOS, endothelial NOS, the tissues which they were first purified and characterised. Because they’re so ubiquitous, I’ve suggested we call them NOS-1, 2 and 3 in the chronological order in which they were first characterised, purified, cloned. Very homologous, about 50% to 60% homology with each other. Some are soluble, some are particulates, lots of opportunity for post-translational modifications. Some are acylated with polmitate or myristate; many of them are phosphorylated by various kinases. A very complicated family. Normally this NOS-2 or inducible NOS is not found in tissues. You don’t see transcript or protein unless there’s been an inflammatory insult. So it’s become a biomarker of inflammation. You can enhance its production by anything that turns on the NF-kappaB pathway, endotoxin, pro-inflammatory cytokines, IO1, interfering gamma etc. And you make a lot of enzyme which is a high output production stage for nitric oxide that will participate in a lot of cytoxic and inflammatory processes. All of these enzymes catalyse this reaction. They oxidise the guanidino nitrogen of arginine. They oxidise the turtle guanidino nitrogen to an intermediate hydroxy arginine, further oxidised NO and citrulline. The enzymes are only active as homodimers. They have a heme prosthetic group. They require NADPH oxygen flavines, heme as a prosthetic group. Very complicated. If the bioptron is oxidised to the dihydro, it no longer makes NO but the enzyme now makes super-oxide, one of the worse things you can do in nitric oxide biology. So let me put this pathway together for you. We know now that various hormones and ligands will interact with their appropriate receptors to regulate various co-factors for the nitric oxide synthase pathways to convert arginine to nitric oxide and cytroline. This then activates soluble guanylyl cyclase to make cyclic GMP which activates a kinase and the cascade goes on to cause some processor event. We can influence this pathway in a variety of ways now with pharmacological tools. We have compounds that are receptor agonist and antagonist. We can modify the availability of the cofactors. We have compounds that are arginine analogues or guanidino analogues to block and inhibit the nitric oxide synthases. Some of these are in clinical trials for septic shock and inflammatory diseases. We can scavenge the NO not only with haemoglobin and monoglobin but also with various thiols that are also in clinical trials. There are compounds available that activate the cyclase without NO. We have a mutant enzyme that doesn’t require NO for gene therapy some day we think. You can also enhance the activation by NO or another gas, carbon monoxide, which is a weak activator in the presence of compounds, and there are inhibitors available as well. So we have tools now to begin to approach this system. But the system is a little bit more complicated than that, it always is. When you make nitric oxide, what it wants to do is activate guanylyl cyclase to make cyclic G, to inhibit platelet aggregation, to act as a neurotransmitter, to influence smooth muscle relaxation, all the beneficial sorts of things. However it can get oxidised to nitrite nitrate, it can form complexes with other transition metals. It will form complexes with various thiol groups and proteins. More than 100 proteins get nitrosated on the cysteine residues and one of the important pathways is the interaction of nitric oxide with superoxide anion. This reaction is almost diffusion limited. So whenever you’ve got either in contact with one another, that’s the reaction that will take place and it acts as a steal or a sink to pull it away from the cyclic G pathway. And you make peroxynitrite, which is even more toxic than nitric oxide or superoxide. Peroxynitrite will nitrate protein residues adjacent to the hydroxyl and tyrosines, perhaps sterically inhibiting or interfering with tyrosine kinase phosphorylation in some cases. So maybe the two systems are talking to each other. The tyrosine kinase pathway, the NO pathway, perhaps. There’s been very little evidence in vivo showing that, most of the evidence so far as been in vitro. There is an important disease called endothelial dysfunction. Many of us, certainly the older folks in this audience, have endothelial dysfunction, maybe not so many of the younger people yet. It occurs with hypertension, atherosclerosis, diabetes, tobacco use and perhaps obesity. In all of these disorders there’s oxidated stress, the formation of reactive oxygen species, hydrogen peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical and the tissue of blood vessels don’t make sufficient quantities of nitric oxide, for a variety of reasons and I’m not going to go through all the reasons. But the net outcome is your blood vessels don’t make enough NO. They tend to be vasoconstricted, you accelerate the atherosclerotic process. You diminish perfusion in diabetic ulcers and lesions. So it’s a vicious cycle, as you get more constricted more reactive oxygen species, less NO. It gets worse and worse. So you’ve got to interrupt it, you’ve got to treat the underlying disease and perhaps come along with some new approaches, perhaps arginine supplementation to make more NO, antioxidants to get rid of the reactive oxygen species. And there are a lot of clinical, a lot of annual studies to support that. There are some clinical studies. The clinical studies have been very controversial. Almost through here, another slide. The nitric oxide field is gone absolutely bananas. Our first paper on the biological effects was in 1977. Almost as many as cyclic AMP, more than G proteins and a lot of other things. It’s incredible. That is about 6,000 to 8,000 papers per year, in the last 5 to 10 year period. That’s 20 to 30 papers a day. There’s no one in the world to keep up with it. It’s very frustrating for all of us in the field. But it’s also very exciting to see this interest and enthusiasm. I’ve created a partial list for you, this slide and the next, to show you where this field is going to go I think in the next decade with regard to a novel drug development and how you can take these biochemical molecular targets that we and others have described and turn them around now in high throughput screens and other assays to find chemical leads to make new therapeutics. We know, as I said, that NO is participating as a neurotransmitter in the brain, in some regions of the brain, both centrally and peripherally. If you make a NOS-1 knockout mouse and induce a cerebral infarct, the size of the infarct is smaller. If you make a NOS-3 knockout mouse, induce an infarct, the infarct is bigger. If you do a double knockout, NOS-1 and NOS-3, the mouse is not very smart anymore, it can’t get through the water maze just to find the flow. So the participations of nitric oxide is transmitters in various regions, also with memory and we certainly haven’t figured all that out. We know it plays a role in fluid production and re-absorption, in the eye for glaucoma, retinal neuronal degeneration. We talked a lot about vasodilation; pulmonary hypertension was mentioned in the movie. It’s been exciting to see that develop. Premature babies maintained in in vivo circulation, they don’t need to profuse their lungs because they get their oxygen from the placenta from their mother. If they’re born prematurely, their blood vessels are constricted, their lungs are not developed, they need surfactant, you need to dilate those blood vessels and they shunt right to left, so they’re hypoxic babies. If you give them a little nitric oxide in the nasal catheter, they dilate the vessels, they don’t shunt quite as much, they become oxygenated. There’s been a marvellous improvement to eliminate the need for ECMO therapy, which is rather nasty. You all know about Viagra. It came out of this research, not us but we developed the concepts. We used to joke in the lab, we’ll fill condoms with vasodilators and NO donors and PD inhibitors, they work. Viagra is an inhibitor of the type 5 phosphodiesterase which is found predominantly in blood vessels, both in the corpus cavernosum as well as the systemic vessels. This is why patients who take Viagra and now take NO donors, nitro-glycerine, can get severe hypertension, arrhythmia, strokes etc. So one has to be careful, it’s not a street drug, it can get you in trouble. It participates in wound healing and angiogenesis, atherosclerosis. If you look at exhalation of NO in your breath, it’s a wonderful marker of the severity of asthma. The more inflammation in your lungs, the more induction of NOS-2, the more NO you make, the more NO in your breath, so the clinician can have you breathe into a bag or tube and if the NO is elevated, he knows that your asthma is out of control and he’ll readjust therapy. It’s been very useful. There are clinical studies for septic shock, platelet aggregation. We know that NO regulates genes, both up and down from micro array studies on cells. We’ve become very interested in stem cell biology, the last several years we know that nitric oxide and cyclic G influence embryonic human and mouse stem cell proliferation and differentiation. We think we can force cells into different lineages by playing games with NO and cyclic G. And there are other applications, this is only a partial list, we can’t do everything. Thank you very much.

Nachdem dieses Treffen so wunderbar angefangen hat, haben wir etwas über den Urknall gehört, und ich denke, dass das Thema des folgenden Vortrags ebenfalls als ein Urknall in der Biomedizin angesehen werden kann. Das war die Entdeckung von Stickstoffmonoxid. Es ist mir eine große Freude, Professor Ferid Murad aus Houston, Texas zu bitten, uns hier seinen Vortrag zu halten. die Stickstoffmonoxid als ein Signalmolekül im Herz-Kreislauf-System spielt. Professor Murad. Dies ist mein erster Besuch in Lindau. Es sieht nach einer sehr spannenden Gelegenheit sowohl für die Redner als auch für die Studenten aus, und ich werde diese Woche genießen, das kann ich Ihnen versichern. Kurz nachdem der Nobelpreis bekannt gegeben worden war, erhielt mein Büro zahlreiche Anrufe von den örtlichen Schulen, den High Schools und Colleges in Houston. Man bat mich, Vorträge zu halten und mit den Schülern zusammenzutreffen, und das tat ich. Aber es kamen enorm viele Nachfragen, und ich konnte nicht mehr mit ihnen Schritt halten. Daher fragte ich in der audiovisuellen TV-Abteilung im Texas Medical Center, ob man mir dabei helfen könne, ein Video zusammenzustellen. Heute Morgen wird es also Filme geben. Diese Abteilung ist wirklich eine sehr aufregende Abteilung. Sie erstellen Videos und Tonbänder für Patienten: wie sie mit ihren Kolostomiebeuteln zurechtkommen, wie sie mit ihren Nieren-Shunts für die Dialyse umgehen sollten usw. Wir setzten uns also zusammen und entwarfen einen Dialog. Wir tauschten viele Informationen untereinander aus. Schließlich kamen sie an einem Samstagmorgen zu mir nach Hause und wir drehten dieses Video, und ich denke, es wird Ihnen gefallen. Das Video wurde für Teenager erstellt, aber ich habe es auch Fünfjährigen und 85-Jährigen gezeigt, und allen scheint es zu gefallen, denn es ist Wissenschaft in Laiensprache, die Sie alle verstehen sollten. Lassen Sie uns also mit dem Video anfangen. Meine Güte, was soll das denn mit diesen ganzen Preisverleihungen? Und der Preisträger ist ... Herzlichen Glückwunsch. Ich bitte Sie jetzt nach vorne zu kommen und Ihren Nobelpreis in Empfang zu nehmen. Nobelpreis? Was ist denn das? Da bin ich überfragt. Was? Ihr wisst nicht, was der Nobelpreis ist? Dagegen müssen wir etwas unternehmen. Wow! Was ist denn das? Hey, Sie kommen einfach aus dem Fernseher! Das ist ja wie Aliens. Gestatten? Ja klar, warum nicht? Also - was haben Sie uns zu berichten? Nun, mein Name ist Ferid Murad. Ihr könnt mich Fred nennen. Ich bin Arzt und Forscher und Wissenschaftler an der University of Texas Medical School. Ach, und übrigens, ich habe 1998 den "Nobelpreis" für Medizin bekommen. Ok, was ist denn nun dieser "Nobelpreis"? Der Nobelpreis ist eine der größten Auszeichnungen der Welt, die man bekommen kann. Aha ... Er bedeutet Anerkennung durch andere Wissenschaftler. Und? Hm. Tja, man ist auf der ganzen Welt im Fernsehen. In Schweden gibt es eine große Feier. Man trifft sogar den König und die Königin von Schweden. Man bekommt eine goldene Medaille. Und dann ist da natürlich noch das Geld. Geld? Party? König und Königin? Ja. Vielleicht ist es besser, wenn ich es euch zeige. Darf ich? Mm ... na klar! Danke. Danke, Fred. Willkommen in meiner Welt der Wissenschaft und in meinem Labor. Wissen Sie, den Nobelpreis gäbe es nicht, wenn da nicht ... Dynamit gewesen wäre. Wie auch immer. Alfred Nobel, der schwedische Erfinder und Geschäftsmann, der die Nobelpreise erfand, war derjenige, der das Dynamit erfand. Nitroglycerin ist die explosive Chemikalie in Dynamit. Und obwohl es sehr gefährlich war, fand Herr Nobel einen Weg, um das Nitroglycerin so einzulagern, dass es für sinnvolle Zwecke verwendet werden konnte, zum Beispiel um Dinge zu bauen. Man könnte sagen, dass seine Erfindung die Welt erschütterte. Nitroglycerin hat jedoch noch andere Anwendungsbereiche. Als Nobel anfing, an Herzbeschwerden zu leiden, verschrieb ihm sein Arzt tatsächlich Nitroglyzerin für sein Herz. Aber Nobel sagte: "Auf keinen Fall." Also war die Sache für ihn "geplatzt". nicht gut für das Herz sein konnte. Niemand wusste, warum es wirkte. Aber das tat es. und er teilte sich 1998 den Nobelpreis für Medizin mit Dr. Robert Furchgott und Dr. Luis Ignarro, weil er die Antwort auf diese Frage herausfand. Sie sind also der Typ, der herausfand, dass Nitroglyzerin gut für das Herz ist? Äh, ja. Und? Und was? Und warum wirkt es? Wir versuchten die Frage zu beantworten, auf welche Art und Weise Nitroglyzerin bei Brustschmerz hilft. Ich führte Experimente durch, betrachtete die Ergebnisse und sammelte Daten. Dann fand ich heraus, ob, was ich dachte, richtig oder falsch war. Jedenfalls fand ich heraus, das Nitroglyzerin Stickstoffmonoxid freisetzt und dass Stickstoffmonoxid eine Menge wichtiger Dinge im Körper erledigt. Was ist denn Stickstoffmonoxid? Und was genau haben Sie herausgefunden, das Ihnen diesen "Nobelpreis" einbrachte? Lasst es mich euch zeigen. Es schützt das Herz. Es stimuliert das Gehirn. Es tötet Bakterien. Und es ist ein echtes Gas. Es ist Stickstoffmonoxid. Niemand kann zu NO nein sagen. Stickstoffmonoxid oder NO ist ein einfaches Molekül mit zwei Atomen, Stickstoff und Sauerstoff. Und ja, es ist ein farb- und geruchloses Gas. Eine wissenschaftliche Sensation fegt über die Welt. Stickstoffmonoxid ist überall. Im Zuge der Umweltverschmutzung durch Umweltgifte trägt es zur Zerstörung der Ozonschicht bei. Man findet es sogar in Autoabgasen und Zigarettenrauch. Aber kommen wir von der Superbedrohung zum Superhelden. Man findet Stickstoffmonoxid auch im menschlichen Körper und es hilft dabei, wichtige Signale zu senden, die nicht von unserem Sponsor stammen. Wenn Blut durch Ihre Blutgefäße fließt, dann setzt deren Innenverkleidung oder Ihr Endothel Stickstoffmonoxid frei. Stickstoffmonoxid signalisiert Ihren Blutgefäßen, dass sie sich entspannen und erweitern sollen. Und dann? Das wiederum führt zu einer Senkung des Blutdrucks, der Kraft, die das Blut auf die Gefäßwände ausübt. Wenn Ihre Blutgefäße genug Stickstoffmonoxid bilden, signalisiert dies Ihren Blutgefäßen, dass sie sich entspannen sollen. Dann fließt Ihr Blut weiter hindurch. Kein Problem. Aber wenn das Blut nicht hindurchfließt, bilden sich Blutklumpen. Dann ... (Herzinfarkt). Und das ist nicht alles! Entspannte Blutgefäße lassen also mehr Blut hindurchfließen und Stickstoffmonoxid kann Auswirkungen auf alle möglichen Bereiche des Körpers haben. Beispielsweise rettet Stickstoffmonoxid schon das Leben von zu früh geborenen Babys, die sehr kleine Dosierungen dieses Gases einatmen. Es hilft ihren Lungen und verbessert ihre Atmung. Und das ist gut! Bei Nervenzellen kann Stickstoffmonoxid das Gehirn stimulieren und damit Dinge wie das Verhalten und Benehmen beeinflussen. Oh, benimm dich, Baby! Als Teil des Selbstverteidigungssystems des Körpers verteidigt Stickstoffmonoxid uns auch gegen Tumorzellen und Bakterien. Es ist ein erstaunliches Zeug. Aber Stickstoffmonoxid ist nicht zum Lachen und sollte nicht mit Distickstoffoxid, besser bekannt als Lachgas, verwechselt werden. Ha-ha ... kann jemand bitte dieses Gas abstellen? Wie kommen Sie überhaupt auf das alles? Nun, mit der Zeit begann ich mich sehr dafür zu interessieren, wie Zellen miteinander reden. Aber die meisten anderen Wissenschaftler hielten das nicht für sehr wichtig. Dr. Murad fand heraus, dass, wenn Zellen miteinander reden, dies so ähnlich ist, als wenn eine Zelle einer anderen Zelle irgendwo im Körper eine E-Mail schickt. Und diese E-Mail ist das Gas Stickstoffmonoxid. Die E-Mail kann in eine andere Zelle einbrechen und die Arbeitsweise dieser Zelle übernehmen. Sie kann eine Botschaft enthalten, zum Beispiel die Anweisung an ein Blutgefäß, dass es sich entspannen soll. Oder sie kann eine andere Art von Anweisungen enthalten. Wenn die Botschaft beispielsweise an eine Krebszelle geschickt wird, kann es sein, dass das Stickstoffmonoxid den Krebs tötet und dann sich selbst zerstört. Hasta la vista, Baby. Stickstoffmonoxid bewirkt so viele Dinge in Ihrem Körper. Es ist, als hätte man in seinem eigenen Körper ein weltweites Internetsystem. Warum sind Sie überhaupt in die Wissenschaft gegangen? Nun, es macht wirklich viel Spaß, herauszufinden, wie solche Dinge funktionieren. Und man muss nicht brillant sein, um voranzukommen. Man muss nur Ziele haben und sich darauf einstellen, sehr hart zu arbeiten. Als Wissenschaftler kann man etwas zum ersten Mal tun, das kein anderer jemals getan hat. Und das ist spannend! Manchmal öffnet Ihre Entdeckung die Tür zu einer ganz neuen Art und Weise des Denkens und zu noch mehr neuen Entdeckungen. Das ist wirklich cool! Es ist so etwas wie die "Wissenschaftsolympiade" und das Ziel ist der Nobelpreis. Wissenschaftlerteams aus aller Welt treten gegeneinander an. Es macht Spaß. Wer wird als erster fertig sein? Wer wird den Preis gewinnen? Einer von euch könnte eines Tages ein Nobelpreisgewinner sein. Wer weiß? Hey! Ich habe noch ein paar Fragen! Ja, ich auch. Tja, ich glaube, wir müssen auf eigene Faust mehr herausfinden. Vielleicht finden wir etwas im Internet. Ja, und halte Ausschau nach Wissenschaft und dem Nobelpreis. Sie sind weg und haben noch etwas Popcorn übrig gelassen, oder? Mjam! Für mich fügte es sich sehr glücklich, dass ich, als das Programm in Cleveland startete, einer der ersten medizinischen Doktoranden in den USA war, und ich entschied irgendwie, dass es das war, was ich tun wollte. Ich war mir nicht sicher, wie ich zu der Entscheidung kam. Ich war begeistert von Chemie und Biologie. Ich glaube, mehr als alles andere war ich verwirrt. Und ich sagte, ich werde beides versuchen und schauen, in welche Richtung ich gehen sollte, und ich wurde süchtig danach und sitze seither auf diesem Zaun [zwischen Chemie und Biologie]. Meine Mentoren waren Earl Sutherland und Ted Rall. Ein Jahr, bevor ich in ihr Labor kam, hatten sie gerade ein zyklisches AMP (Adenosinmonophosphat) entdeckt. Was war das für eine aufregende Zeit für einen jungen Studenten! Die mir zugewiesene Aufgabe bestand darin, herauszufinden, wie Katecholamine, Adrenalin, die Produktion von zyklischem AMP in den Geweben reguliert und ob dies über den Beta-Adrenorezeptor oder den Alpha-Rezeptor geschieht. Dies war eine ziemlich einfache und in der Tat leichte Aufgabe. Allerdings war es eine außergewöhnlich spannende Zeit, in der wir erlebten, wie sich dieser ganze Bereich der Zellsignale und Botenstoffe herausbildete. All diese Hormone, die über diese Signalwege wirken, und all diese Medikamente, die entwickelt wurden, zu betrachten - das war es, wonach ich süchtig wurde: sekundäre Botenstoff-Systeme und Zellkommunikation. Zellkommunikation ist eigentlich ein altes Konzept, das wahrscheinlich vor mehr als 100 Jahren zum ersten Mal von Pawlow bekannt gemacht wurde. Wie Sie aus Ihren Psychologie-Kursen wissen, hatte Pawlow einen Patienten mit einer Schussverletzung am Bauch, bei dem sich eine Magen-Fistel bis nach außen entwickelte. Wann immer der Patient Nahrung sah oder roch, verstärkte dies die Magensaftsekretion. Pawlow war nun so clever, dass er bei Hunden Hautsäcke und Fisteln heranzüchtete. Er zeigte den Hunden Futter und auch bei ihnen verstärkte sich die Magensaftsekretion. Aber er entschloss sich, diese Hunde zu konditionieren, indem er eine Glocke läutete. Letztendlich musste er nur eine Glocke läuten und bei den Hunden verstärkte sich die Sekretion, ohne dass er ihnen Futter zeigen musste. Dies sagte ihm, dass das Gehirn mit dem Magen sprach, dass Zellen miteinander kommunizieren. Natürlich wissen wir heute, dass viele Zellen und Gewebe im Körper miteinander kommunizieren. Das wird hier für Sie in diesem Cartoon, in diesem ersten Dia zusammengefasst. Dies stellt drei verschiedene Zellpopulationen dar, die miteinander sprechen werden. Sie können jede Art von Zellen sein, aber ich werde Zelle 1 eine Nervenzelle nennen. Sie kann ein zentrales oder ein peripheres Neuron sein. Zelle 2 werde ich eine Endothelzelle nennen, die ein Blutgefäß auskleidet, und Zelle 3 werde ich eine glatte Muskelzelle in der Wand jenes Blutgefäßes nennen. Zelle 1 möchte mit Zelle 2 und auch mit Zelle 3 sprechen. Und sie tut das, indem sie Moleküle produziert, die Earl Sutherland als primäre Botenstoffe bezeichnete. Heute bezeichnen wir sie als Hormone, wir bezeichnen sie als Zytokine, wir bezeichnen sie als Wachstumsfaktoren, wir bezeichnen sie als eine Vielzahl von Dingen, parakrine Substanzen, Autakoide usw. Sie kommen in verschiedenen Formen und Größen und Arten aromatischer Verbindungen vor. Einige sind kleine Aminosäuren, andere sind große Moleküle wie die Herztroponine. Wichtig ist für uns hier, dass sie in den interstitiellen Raum, in den Blutstrom ausgeschüttet werden und zielgerichtet durch den Körper wandern, um ihr Ziel zu finden. Sie finden ihre Zielzelle mithilfe eines Makromoleküls in ihrer Membran, das wir als einen Rezeptor bezeichnen. Manchmal befinden sich diese Rezeptoren im Inneren der Zelle, wie bei Steroiden und Schilddrüsenhormonen, aber in den meisten Fällen handelt es sich um Transmembran-Proteine, integrale Membranproteine auf der Oberfläche der Membran. Diese Liganden oder primären Botenstoffe interagieren mit ihren entsprechenden Zellen, die die einzigen mit diesen Rezeptoren sind. Das ist der Punkt, an dem sich die Spezifität der Reaktion ereignet. Sie passen konformativ zueinander, wie ein Schlüssel in ein Schloss. Und sie "stören" nur die Zellen, die über den entsprechenden Rezeptor verfügen. Der Ligand muss nicht unbedingt in das Innere der Zelle gelangen, um zu bewirken, dass die biochemische Kaskade in einer physiologischen Antwort resultiert. Sie können einfach mit dem Rezeptor interagieren, sie zwicken ihn ein bisschen und auf einmal, voilà, haben wir viele verschiedene intrazelluläre sekundäre Botenstoffe, die sich ansammeln. Der erste dieser sekundären Botenstoffe war zyklisches AMP. Sutherland und Rall entdeckten Folgendes: Auf diese Art und Weise regulierten Glukagon und Epinephrin den Abbau von Glykogen in der Leber. Wir wissen heute, dass viele Signalwege sich dieses Botenstoffs bedienen. Wir wissen auch, dass es neben zyklischem AMP noch andere sekundäre Botenstoffe gibt: zyklisches GMP (Guanosinmonophosphat), Kalzium, Diacylglycerin, Stickstoffmonoxid. Und während es Hunderte und Hunderte von primären Botenstoffen gibt, kennen wir nur eine bescheidene Anzahl von intrazellulären sekundären Botenstoffen. Heute sind es vielleicht nicht mehr als ein Dutzend, aber ich bin sicher, dass es in der Zukunft mehr sein wird. Diese sekundären Botenstoffe sammeln sich an und führen innerhalb der Zelle die Funktion aus, die von diesem primären Botenstoff zur Zelloberfläche gebracht worden war. Das Einzigartige an Stickstoffmonoxid als einem intrazellulären sekundären Botenstoff ist, dass es ein Gas ist. Es ist ein freies Radikal mit einem ungeteilten Elektron und ein sehr einfaches Molekül. Und da es ungeladen ist, der physiologische pH-Wert, wie alle anderen Botenstoffe, durchquert es die Membranen sehr viel schneller als die anderen Botenstoffe, die oft Energie oder ein Transportmittel benötigen, um das zu tun. Stickstoffmonoxid reguliert also nicht nur die Biochemie der Zelle, in der es produziert wurde, sondern es kann sie auch verlassen und ein paar hundert Ångström, Mikrometer, wandern, um angrenzende Zellen zu regulieren und zu veranlassen, dass sie andere sekundäre Botenstoffe wie zyklisches GMP produzieren. Es ist also ein ganz einzigartiges Botenstoff-Molekül. Meines Wissens ist es der einzige Botenstoff, der intrazellulär ebenso funktioniert wie extrazellulär. Es kann eine parakrine Substanz sein, ein lokales Autakoid. Es kann sich mit anderen Trägern verbinden, Glutathion, Thiole, Albumin, andere Proteine, und über eine Entfernung transportiert werden, um dort wieder freigesetzt zu werden und als Hormon zu wirken. Keine anderen Botenstoffe können das. Stickstoffmonoxid ist ein sehr altes Molekül, und ich habe eine Theorie, dass es auch an der Evolution beteiligt war. Wahrscheinlich war es eines der ersten Botenstoff-Moleküle vor drei Milliarden Jahren, als die Zellen begannen, miteinander zu kommunizieren. Allerdings werde ich diese Geschichte nicht vertiefen, da die Zeit dies nicht erlaubt. Heute wissen wir jedoch, dass es als Schadstoff von großer Bedeutung ist. Dadurch wurde es vor ungefähr 50 oder 60 Jahren bekannt, als offenkundig wurde, dass alle fossilen Brennstoffe bei der Verbrennung mit Sauerstoff eine Familie von Stickstoffoxiden produzierten, NO, NO2, N2O3 usw. Alle diese Stickstoffoxide interagieren mit Ozon und führen zum Abbau der Ozonschicht und sind zusammen mit den Treibhausgasen verantwortlich für die globale Erwärmung. Aber ich werde Ihnen sagen, dass Stickstoffmonoxid nicht nur ein Umweltschadstoff, sondern auch das Wirkprinzip einiger sehr wichtiger Herz-Kreislauf-Medikamente und ein Botenstoff-Molekül von großer Bedeutung im Körper ist. Und dies ist nur eine unvollständige Liste der Biologie, die es reguliert. Die Liste ist sehr, sehr viel länger als das. Sie beinhaltet Muskelentspannung, Blutplättchenaggregation, die Erektion des Penis, die Tötung von Parasiten und Mikroorganismen - und die Liste geht weiter und weiter. Auf einiges davon werden wir in Kürze zurückkommen. Im Jahr 1963, sieben oder sechs Jahre nach der Entdeckung des zyklischen AMP, entdeckten ein paar Chemiker zum ersten Mal zyklisches GMP, ein weiteres zyklisches Nukleotid und ein Cousin des zyklischen AMP. Man verschiebt einfach die Amino-Gruppe auf dem Purin-Ring und hat eine andere Struktur. Man verabreichte Ratten anorganisches P32-Phosphat und fand in ihrem Urin zwei wichtige organische Phosphate, zyklisches AMP und zyklisches GMP. Dies war der erste Nachweis von zyklischem GMP als ein natürliches Produkt. Das veranlasste einige Labore, sich für zyklisches GMP zu interessieren und nach Enzymen zu suchen, die es herstellten, Enzyme, die es hydrolysierten usw. Und die Geschichte entwickelte sich in den späten 1960er, frühen 1970er Jahren, als ich gerade meine Ausbildung beendete und mich darauf vorbereitete, mich der Fakultät an der University of Virginia anzuschließen. Wir wissen heute, dass es eine Familie von Enzymen gibt, die Guanylylzyklasen genannt werden. Es gibt mindestens sieben oder acht Mitglieder dieser Familie und wir glauben, dass es mit den Spleißvarianten, die wir zur Zeit isolieren, sogar noch mehr sein werden. Alle diese Enzyme wandeln GTP (Guanosintriphosphat) zu zyklischem GMP und Pyrophosphat um. Die Reaktion ist in hohem Maße analog, wenn man eine OH-Zyklase hinzufügt, die ATP (Adenosintriphosphat) zu zyklischem AMP und Pyrophosphat umwandelt. In der Tat sind die katalytischen Domänen aller Zyklasen homolog, mit der Veränderung von einer oder zwei Aminosäuren, ein Enzym kann das andere Nukleotid produzieren. Das zyklische GMP kann durch eine Familie von Phosphodiesterasen inaktiviert werden. Diese Gen-Familie umfasst mindestens zehn oder elf Mitglieder. Sie hydrolysieren die Phosphodiester-Bindung, um das zyklische Nukleotid in das entsprechende Monophosphat umzuwandeln, entweder 5'-GMP oder 5'-AMP, und es wird inaktiv. Wie Sie im Laufe der Woche von Dr. Fischer hören werden, aktivieren viele der intrazellulären sekundären Botenstoffe, zyklisches AMP, zyklisches GMP, Diacylglycerin, Kalzium usw., häufig eine Proteinkinase, die dann eine Reihe von Protein-Substraten phosphoryliert, indem sie das Gamma-Phosphat von ATP zu einem Serin-Threonin-Rest oder vielleicht einem Tyrosin-Rest überträgt. Man hat mir gesagt, dass wir nun nicht weniger als 500 oder 600 Proteinkinasen kennen. Das Konzept der Zellkommunikation ist ziemlich einfach: Ein Ligand oder Hormon reguliert die Produktion des sekundären Botenstoffs, der dann die Proteinkinase reguliert, die ein Protein phosphoryliert. Das Problem besteht nun darin, dass die Matrix ziemlich brenzlig vertrackt wird, wenn man alle Zyklasen, die Diastasen, die Proteinkinasen und die vielen Proteine berücksichtigt, die phosphoryliert werden können. Wenn diese Proteine phosphoryliert werden, dann verändert sich, wie Sie von Dr. Fischer hören werden, ihre Konformation. Wenn es sich um Strukturproteine handelt, können sie die Motilität und andere Prozesse, die Kontraktilität, beeinflussen. Wenn es sich um Enzyme handelt, werden sie aktiviert oder gehemmt. Als sich nun diese Geschichte mit dem zyklischen GMP entfaltete, beschloss ich, mich vom zyklischen AMP abzuwenden und mein Interesse auf das zyklische GMP zu verlagern. Für ein neues, junges Fakultätsmitglied war in den frühen 1970er Jahren meiner Ansicht nach das Forschungsgebiet des zyklischen AMP ziemlich überfüllt, mit großen Gruppen von Leuten überall auf der Welt. Ich dachte nicht, dass ich mit all diesen großen Laboren konkurrieren könnte, und da sich das Gebiet des zyklischen GMP herausbildete, sagte ich, dass ich in diese neue Richtung gehen würde. Ich wollte zwei Fragestellungen angehen. Wir wussten, dass ein paar Hormone die Anreicherung von zyklischem GMP in einigen Geweben steigern konnten - Acetylcholin bei Herzpräparaten, Prostaglandine bei Gefäßpräparaten -, aber wir kannten den molekularen Mechanismus der Kopplung nicht. Wenn wir die Bindung des Liganden an den Rezeptor und die Kopplung an die Guanylylzyklase, um zyklisches GMP zu produzieren, verstehen würden, könnten wir vermutlich diesen Kopplungsprozess mit verschiedenen Chemikalien und Medikamenten beeinflussen, um eine Hormonreaktion zu verstärken oder zu blockieren, und vielleicht sogar ein paar neue Therapien für verschiedene endokrinologische Erkrankungen zu entwickeln. Das war ziemlich vernünftig. Das zweite Problem bestand darin, dass wir, obwohl zyklisches GMP ein natürliches Produkt war, keine Ahnung hatten, was es tat oder worin seine Funktion bestand. Wir begannen also unsere Studien, indem wir das Enzym, das zyklisches GMP produziert, detailliert untersuchten. Die erste große Überraschung war, dass es sich nicht um ein einzelnes Enzym, sondern um ein paar Enzyme handelte. Die Enzymaktivität war in löslichen Fraktionen wie auch in partikulären Fraktionen vorhanden. Die kinetischen Eigenschaften dieser Isoforme waren unterschiedlich. Ich vermutete, dass es Isoforme geben würde. Ich hatte mir gedacht: Falls es verschiedene Abteilungen und Isoforme von Guanylylzyklasen gibt, werden sie vielleicht von verschiedenen Gruppen von Hormonen reguliert - wäre es nicht ein tolles Projekt, das zu klären und zu sortieren? Viel davon erwies sich als echte Intuition zu jener Zeit. Der Beweis, dass wir es mit Isoformen zu tun hatten, erforderte viel Arbeit. Wir mussten diese löslichen und partikulären Aktivitäten purifizieren, sie klonen, exprimieren und erneut untersuchen. Wir taten dies, und die Arbeit dauerte zwölf oder 15 Jahre. Aber zunächst nahm ich eine Abkürzung. Ich sagte: Die Kooperativität des partikulären Isoforms - im Gegensatz zur typischen Michaelis-Menten-Kinetik des löslichen Isoforms - konnte ein Artefakt sein, da es sich um krude Präparate handelte, die Nukleotidasen, Phosphatasen, Phosphodiesterasen enthielten. Wir erstellten also einen Cocktail und fügten ihn unseren Inkubationen hinzu, um alle diese konkurrierenden Pfade zu hemmen. Wir erstellten einen Cocktail aus Pyrophosphat, Fluor, Azid, Hydroxylamin, Natriumnitrit, Methylxanthine etc. und rein zufällig - wie es in der Wissenschaft häufig der Fall ist - fanden wir Verbindungen, die das Enzym aktivierten. Während es unser Ziel war, die Hormonregulation zu verstehen, konnte uns das nicht gelingen, denn sobald wir die Gewebe störten, ging die Hormonbindung verloren. Extrakte des Enzyms wurden durch Hormone nicht mehr aktiviert. Die kleinen Moleküle wurden jedoch aktiviert, und vielleicht konnten sie unser Ersatz für das Verständnis der hormonalen Steuerung sein. Ähnlich wie Fluor eine wertvolle Ressource für das Verständnis der hormonellen Regulation der Adenylatzyklase war. Die aktivierenden Verbindungen waren Azid, Hydroxylamin und Natriumnitrit. Und um eine lange Geschichte kurz zu fassen: die Wirkungen des Azids waren von Sauerstoff abhängig, wurden durch Thiole verstärkt und zeichneten sich durch eine lange Zeitverzögerung aus, bevor die Reaktionsrate ihr Maximum erreichte. Sie waren gewebespezifisch, denn Gewebe besaßen Inhibitoren und Aktivatoren des Stoffwechselweges. Und wir waren davon überzeugt, dass diese Aktivatoren Vorläufer von Pro-Pharmaka waren, die in unseren Inkubationen zu etwas anderem umgewandelt wurden, und es wurde mehrere Jahre lang zu einer ziemlich geheimnisvollen Geschichte, welcher Aktivator das sein würde. Wir fügten Azid und Hydroxylamin und Nitrit zu Zellkulturen in Geweben hinzu. Und tatsächlich führten sie zu einer Erhöhung der Konzentration von zyklischem GMP und sie aktivierten außerdem die Enzyme und Extrakte. Sie würden also in beiden Systemen funktionieren. Eines der Gewebe, mit denen wir - wiederum zufälligerweise - arbeiteten, war glatte Muskulatur der Luftröhre. Als Student lernte ich, dass zyklisches AMP die glatte Muskulatur entspannt, die glatte Muskulatur der Gefäße und Luftwege. Und ich dachte, dass zyklisches GMP vielleicht ein Gegenspieler von zyklischem AMP sein könnte. Wir fertigten also eine Zubereitung aus glatter Muskulatur an, die relativ homogen war, um einige biochemische Tests daran durchzuführen und einen Physiologen dafür zu konsultieren. Wir fügten diesen Zubereitungen aus glatter Muskulatur Azid hinzu, der Spiegel des zyklischen GMP stieg an, doch die Muskeln kontrahierten sich nicht, sie entspannten sich. Dies war das Gegenteil von dem, was zu erwarten war. Die Dosis-Reaktions-Kurven, die Zeitverläufe: alles sagte uns, dass Azid ein Entspannungsmittel glatter Muskulatur war, das seine Wirkung durch zyklisches GMP vermittelte, und so funktioniert es, und das war die erste physiologische Funktion von zyklischem GMP. Wir sagten: diese Mittel führen zu einer Entspannung und zur Erhöhung von G. Worin besteht die Wirkung der anderen Entspannungsmittel der glatten Muskulatur? Von Nitroglycerin, das man schon seit etwa 100 Jahren kannte, von Nitroprussid, einer Menge der Medikamente, die auf Intensivstationen für Erkrankungen der Herzkranzgefäße beliebt sind? Sie senkten den Gefäßwiderstand, senkten den Blutdruck von Infarktpatienten usw. Wir fügten sie unseren Zubereitungen hinzu, und sie führten erwartungsgemäß zu einer Entspannung der Muskulatur. Überraschend war, dass sie die Konzentration des zyklischen GMP ansteigen ließen. Wir verfügten nun also über eine Familie von Verbindungen, die wir als NO-Pharmaka (nitrovasodilators) bezeichneten und die in zellfreien Zubereitungen Guaninzyklase aktivieren und in verschiedenen Geweben die Konzentration von zyklischem GMP anheben konnten. Zu diesen Verbindungen gehörten Hydroxylamin, Azid, Natriumnitrit, einige Hydrazine, Nitroglycerin, Nitroprussid, Nitrosoharnstoffe, Nitrosamine sowie eine lange Liste anderer Verbindungen, die alle Donoren von Stickstoffmonoxid (NO) waren. Sie alle enthalten Stickstoff. Einige von ihnen wandelten sich spontan um, basierend auf Redox- und pH-Inkubationen. Einige von ihnen werden nicht im Körper umgewandelt, Azid erfordert eine Katalase-Konversion. Und wir überlegten uns, dass die Zwischenstufe aller dieser Pro-Pharmaka oder Vorstufen Stickstoffmonoxid sein musste. Der Grund, warum wir dachten, es sei Stickstoffmonoxid, war folgender: Weil die Gewebespezifität von Azid teilweise durch das Vorhandensein von Hämoglobin und Myoglobin in unseren Gewebeextrakten beeinflusst wurde. Dies waren Inhibitoren. Wir wussten aus der Literatur, dass NO eine hohe Affinität zur prosthetischen Hämgruppe von Hämoglobin, Myoglobin, hat. Also zogen wir den Schluss, dass alle diese Pro-Pharmaka oder Vorstufen in Stickstoffoxid umgewandelt wurden. Wenn wir durch chemische Reaktionen Stickstoffoxid im Laborabzug erzeugten, Natriumnitrit, Eisen(II)-Sulfat, Schwefelsäure, und das Gas in unsere Zubereitungen ventilierten, wurde jede von ihnen aktiviert. Was für eine spannende Zeit das war! Der erste Beweis dafür, dass ein freies Radikal ein Enzym aktivieren konnte. Und ich dachte, das würde eine sehr interessante Chemie sein. Viele Leute waren skeptisch. Sie alle hielten freie Radikale und Stickstoffoxide für schädliche Verbindungen und giftige Stoffe, doch es bestand kein Zweifel daran: Sie hatten eine aktivierenden Wirkung. Einige Leute hielten mir entgegen: Murad, du inhibierst einen Inhibitor. Du führst in deinen primitiven Zubereitungen eine Aufhebung der Inhibition durch. Also mussten wir die Enzyme bis zur Homogenität reinigen, und wenn wir die Konzentration vornahmen, wurde die Menge des zur Aktivierung benötigen Stickstoffmonoxids geringer und immer geringer, noch niedriger, als wir Stoffe aus unserer Inkubation entfernten, die NO absaugten und verschluckten. Übergangsmetalle, Thiole, Protein saugten NO auf, wissen Sie. Nanomolare Konzentrationen von NO führten zu einer Aktivierung des Enzyms, und der Vmax-Wert stieg um das 200- bis 400-fache an, wie sie auch den Km-Wert für GTP senkten. So erkannten wir, dass wir den Wirkungsmechanismus der NO-Pharmaka (nitrovasodilators) herausgefunden hatten, wie etwa von Nitroglycerin, das seit 100 Jahren klinisch verwendet wurde. Findet man als Pharmakologe ein exogenes Material, das in einem biologischen System etwas bewirkt, sollte man sich fragen: Imitiert es einen natürlichen Stoffwechselpfad, der bereits existiert, sowie: Arbeitet es durch einen ähnlichen Mechanismus? Daher schlug ich in einer Buchbesprechung in den späten siebziger Jahren vor, dass die Wirkung verschiedener Hormone, d. h. die Erhöhung der Konzentration des zyklischen GMP, vielleicht darauf zurückzuführen sei, dass sie die Produktion von Stickstoffmonoxid über irgend einen endogenen Vorläufer verstärkte, möglicherweise dadurch, dass sie einen Redox-Stoffwechselweg änderten. Wir konnten diese Hypothese nicht überprüfen, weil in den siebziger Jahren die Technologie noch nicht vorhanden war, um Stickstoffmonoxid in seinen Oxidationsprodukten oder bei Tieren oder Konzentrationen zu messen. Es gab primitive kalorimetrische Untersuchungen. Dies zu beweisen erforderte sieben oder acht Jahre technologischer Entwicklung, bevor wir selbst oder andere zeigen konnten, dass es sich so verhielt. Doch wir erwarteten, dass Stickstoffmonoxid ein sekundärer, intrazellulärer Messenger war, und das war Häresie. Und es genügte zu zeigen, dass es aktiviert ... Ein freies Radikal aktivierte ein Enzym. Nun sagte man, dass ein freies Radikal ein sekundärer Messenger war, und es erwies sich als wahr, es zeigte sich, dass wir Recht hatten. Und im Wesentlichen ist das der Grund, warum wir nach Stockholm kamen. Wenig später zeigte Robert Furchgott, ein Gefäßpharmakologe aus New York, erstmals, dass eine Gruppe von Wirkstoffen Gefäßsegmente in einem Organbad im Labor entspannte. Von Wirkstoffen wie zum Beispiel Acetylcholin, Histamin, Bradykinin war bekannt, dass sie beim Menschen oder in Tierversuchen den Blutdruck senkten. Im Labor hatten sie jedoch niemals eine Entspannung bewirkt. Er stellte fest, dass diese Stoffe, wenn er die Integrität des Endothels in seinen Blutgefäßversuchsanordnungen bewahrte, eine Entspannung verursachte. Und das war 1980 ein aufregendes neues Ereignis. Ich hörte ihm zu, als er seine Arbeiten vorstellte. Er sagte, dass diese Substanzen die Abgabe eines Faktors aus dem Endothel bewirkten, den er EDRF (endothelium-derived relaxant factor) nannte. Er hatte eine Halbwertszeit von nur ein paar Sekunden. Ich sagte: Bob, dies ist eine reaktive Spezies, vielleicht ein freies Radikal. Vielleicht funktioniert es bei zyklischem G, vielleicht stellte es sich als irgendwie mit NO verwandt heraus. Lass uns der Sache auf den Grund gehen. Nun ja, wir gingen nach Stanford, Bob zog nach New York. Seine Frau bekam Brustkrebs, und diese Zusammenarbeit kam nie zustande. Doch einige Jahre später wurde ich ungeduldig, und ich ging der Sache selbst nach und zeigte, dass diese Hypothese tatsächlich zutraf. Dies ist ein Blutgefäß, das zuvor mit Norepinephrin kontrahiert wurde. Und dann gaben wir nach fünf oder sieben Minuten eine vom Endothel abhängige, gefäßerweiternde Substanz hinzu: Acetylcholin, Bradykinin, ATP-Ionophor, Histamin etc. Und wenn das Endothel vorhanden war, stiegen die Werte für zyklisches GMP innerhalb von Sekunden an, gingen wieder auf die Basiswerte zurück, und anschließend entspannte sich der Muskel. Doch dies geschieht nur, wenn das Endothel intakt ist. Wenn kein Endothelium vorhanden ist, kommt es zu keinem Anstieg des zyklischen G, zu keiner Entspannung. Wir wussten also in den frühen 1980er Jahren, dass es zwei Stoffwechselpfade gibt, die in der Guanylylzyklase konvergieren, um die Synthese von zyklischem GMP zu steuern: die NO-Donoren im endothelabhängigen Stoffwechselpfad zur Gefäßerweiterung. Wir verbrachten einige Jahre damit zu zeigen, dass dies in Zubereitungen des glatten Muskels der Blutgefäße zur Aktivierung der Proteinkinase G führt. Anschließend untersuchten wir die Phosphorylierung einer Vielzahl von Proteinen mit Hilfe der Einfügung von P32. Um die verschiedenen Teile der Geschichte für Sie zusammenzufassen, sind sie auf dem folgenden Dia übersichtlich dargestellt. Dieser Cartoon stellt ein Blutgefäß dar, mit der Endothelauskleidung auf der linken Seite und dem Anteil des glatten Muskels auf der rechten Seite. In rot sind drei Kategorien von gefäßerweiternden Substanzen dargestellt, die eine Verstärkung der Produktion von zyklischem GMP bewirken: die NO-Pharmaka (nitrovasodilators), die aufgrund der pH-Sauerstoff-Spannung etc. spontan umgewandelt werden, wie etwa Nitroglycerin, bis zu Stickstoffmonoxid, das die lösbare Guanylylzyklase aktiviert. Die lösbare Guanylylzyklase ist ein Heterodimer mit einer Alpha-Beta-Untereinheit, und die Beta-Untereinheit verfügt über eine prosthetische Gruppe in der Histamine-105-Position. Das Eisen in diesem Häm muss zweiwertig sein, NO bindet sich an diesen doppelwertigen Liganden, ändert die Bindung des Häm an die Beta-Untereinheit, die dann mit der katalytischen Domäne unten am C-Terminal kommuniziert, was zu einer Aktivierung des Enzyms führt. Das zyklische GMP aktiviert eine zyklische, G-abhängige Proteinkinase. Es gibt zwei von diesen: eine lösbare und eine partikelförmige, die zahlreiche Proteine phosphorylieren. Diese Proteine regulieren die Konzentration von Kalzium im Zytosol, indem sie die Verteilung innerhalb der Zelle aus Vorräten oder durch Kanäle in der Membran ändern. Und wir wissen, dass die Myosin-leichte-Ketten-Kinase ein von Kalzium/Calmodulin abhängiges Enzym ist. Wenn man die Kalziummenge reduziert, verringert man die Kinase, Myosin-leichte-Ketten sammeln sich im dephosphorylierten Zustand an. Wenn man die Aktin- und Myosin-Filamente nimmt, wenn man Myosin-leichte-Ketten phosphoryliert, gleiten sie zur Kontraktion aneinander vorbei. Wenn man Myosin-leichte-Ketten dephosporyliert, kommt es zur Entspannung. Seit dieser Arbeit ist gezeigt worden, dass zyklisches GMP möglicherweise auch die Phosphatase-Aktivität reguliert. Die vom Endothel abhängigen, gefäßerweiternden Substanzen tun genau dasselbe. Die Rezeptoren für diese vom Endothel abhängigen, gefäßerweiternden Substanzen befinden sich jedoch nur auf den Endothelzellen, nicht auf den Zellen der glatten Muskulatur. Das ist der Grund dafür, warum Patienten mit Arteriosklerose und Erkrankungen der Herzkranzgefäße direkt wirkende NO-Donoren verabreicht werden: Nitroglyzerin, Nitroprussid etc. Sie erhalten keine vom Endothel abhängige, gefäßerweiternden Substanzen, weil ihr Endothel nicht normal ist. Ich werde Ihnen sogleich mehr darüber erzählen. Doch sie produzieren EDRF, von dem wir wissen, dass es sich dabei um Stickstoffmonoxid handelt, um über denselben Stoffwechselweg zu arbeiten. Eine dritte Gruppe sind die Atriopeptine. DeBold stellte vor einigen Jahren fest, dass die Granulate und Atria über ein als atrialen natriuretischen Faktor bezeichnetes Peptid verfügen, und wir haben herausgefunden dass dieser Faktor, die Atriopeptine und die Familie dieser Substanzen die partikelförmigen Isoformen der Guanylylzyklase aktivieren, und es gibt mehrere von diesen. Es hat sich herausgestellt, dass die partikelförmigen Zyklasen Rezeptorzyklasen sind, für Atriopeptine, Guanylyl, e-coli-Enterotoxin etc. Und durch die Erhöhung der Konzentration von zyklischem G führen auch Sie zu einer Entspannung. Nun, man kann glatte Muskulatur auch auf andere Weise entspannen: mit Wirkstoffen, die die Kalziumkonzentration ändern, die Konzentration von zyklischem AMP ändern, mit Phosphodiesterase-Inhibitoren etc. Dies sind die Mechanismen, bei denen man durch die Verstärkung der Produktion von zyklischem GMP eine Entspannung herbeiführt. Man kann nun jedoch darangehen, diese Informationen zu kombinieren, um für verschiedene Erkrankungen der Herzkranzgefäße neuartige Kombinationstherapien zu konzipieren, und ich werde Ihnen gleich zeigen, wie man das macht. Es gab noch einige andere sehr wichtige Beobachtungen während unserer Arbeit, aber ich werde sie übergehen müssen. Um die Mitte und gegen Ende der 1980er Jahre wurde jedoch deutlich, dass es einen Stoffwechselweg geben musste, der Stickstoffmonoxid produziert. Die Leute fanden Nitrid und Nitrat in ihren Medien, die Leute fanden die Argininaktivierung des Stoffwechselweges. Und es stellte sich heraus, dass es tatsächlich eine Familie von Enzymen gibt, die man als Stickstoffoxid-Synthasen bezeichnet, die fast allgegenwärtig und in den allermeisten Geweben zu finden sind. Und es gibt drei Isoformen, die ursprünglich als neuronale NOS, induzible NOS und endotheliale NOS bezeichnet wurden, nach den Geweben, aus denen sie zuerst in reiner Form gewonnen und dann beschrieben wurden. Da sie so weit verbreitet sind, habe ich vorgeschlagen, dass wir sie als NOS-1, -2 und -3 bezeichnen, gemäß der chronologischen Reihenfolge, in der sie zuerst beschrieben, in reiner Form gewonnen und dann geklont wurden. Sie sind sehr homolog. Die Homologie zwischen ihnen beträgt etwa 50-60 %. Einige von ihnen sind löslich, andere liegen partikelförmig vor. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten für post-translationale Modifikationen. Einige von ihnen werden mit Polmitat oder Myristat acyliert. Viele von ihnen werden durch verschiedene Kinasen phosphoryliert. Eine sehr komplizierte Familie. Normalerweise ist dieses NOS-2 oder induzibles NOS in Geweben nicht zu finden. Man sieht keine Transkription oder kein Protein, sofern keine Entzündung aufgetreten ist. So wurde es zu einem Biomarker für Entzündungen. Sie können ihre Produktion durch alles verstärken, das zu einer Aktivierung des NF-kappaB-Stoffwechselpfades führt: Endotoxin, proinflammatorische Zytokinen, IO1, Interferon Gama etc. Und sie erzeugen sehr viel Enzym, bei dem es sich um ein Produktionsstadium für Stickstoffmonoxid mit hohem Output handelt, das an vielen zelltoxischen und entzündlichen Prozessen beteiligt ist. Alle diese Enzyme katalysieren diese Reaktion: sie oxidieren den Guanidino-Stickstoff von Arginin. Sie oxidieren den Schildkröten-Guanidino-Stickstoff zu einem Hydroxy-Arginin-Zwischenprodukt, und oxidieren außerdem NO und Citrullin. Diese Enzyme sind nur als Homodimere aktiv. Sie verfügen über eine prosthetische Hämgruppe. Sie benötigen NADPH-Sauerstoff-Flavine, Häm als prosthetische Gruppe. Sehr kompliziert. Wenn das Bioptron zu Dihydro oxidiert wird, produziert es kein NO mehr, sondern das Enzym produziert jetzt Superoxid, eines der schlimmsten Dinge, die man in der Stickstoffoxid-Biologie tun kann. Lassen Sie mich also diesen Stoffwechselpfad für Sie zusammensetzen. Wir wissen jetzt, dass verschiedene Hormone und Liganden mit ihren entsprechenden Rezeptoren zusammenarbeiten werden, um unterschiedliche Co-Faktoren für die Stoffwechselpfade der Stickstoffoxid-Synthase zu regulieren, um Arginin in Stickstoffoxid und Cytrolin umzuwandeln. Dies aktiviert dann die lösliche Guanylylzyklase, um zyklisches GMP zu produzieren, das eine Kinase aktiviert, und die Kaskade läuft weiter, um irgendein Prozessorereignis zu verursachen. Mit Hilfe pharmakologischer Werkzeuge können wir diesen Stoffwechselweg auf vielfache Weise beeinflussen. Wir haben Verbindungen, bei denen es sich um Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten handelt. Wir können die Verfügbarkeit der Co-Faktoren ändern. Wir verfügen über Verbindungen, bei denen es sich um Arginin- oder Guanidino-Analoge handelt, um die Stickstoffoxid-Synthasen zu blockieren und zu hemmen. Mit einigen von ihnen werden klinische Versuche zur Behandlung von septischen Schocks und Entzündungskrankheiten durchgeführt. Wir können das NO nicht nur mit Hämoglobin und Myoglobin "aufsaugen", sondern auch mit verschiedenen Thiolen, die sich ebenfalls in klinischen Tests befinden. Es gibt Verbindungen, die die Zyklase ohne NO aktivieren. Wir glauben, dass wir eines Tages über ein mutiertes Enzym verfügen werden, das für die Gentherapie kein NO benötigt. Man kann die Aktivierung durch NO oder ein anderes Gas auch verstärken, z.B. durch Kohlenmonoxid, bei dem es sich um einen schwachen Aktivator in Gegenwart von Verbindungen handelt, und es gibt auch Inhibitoren. Wir verfügen also nun über Werkzeuge, um damit zu beginnen, auf dieses System genauer eingehen. Doch das System ist etwas komplizierter als das. So ist es immer. Wenn Sie Stickstoffmonoxid produzieren, will es Folgendes tun: die Guanylylzyklase aktivieren, um zur Verhinderung der Blutplättchenaggregation, zur Verwendung als Neurotransmitter, zur Beeinflussung der Entspannung der glatten Muskulatur zyklisches G herzustellen: für alle diese hilfreichen Dinge. Es kann jedoch auch zu Nitrit/Nitrat oxidiert werden, es kann Komplexe mit anderen Übergangsmetallen bilden. Es bildet mit verschiedenen Thiolgruppen und Proteinen Komplexe. Mehr als 100 Proteine werden an den Cysteinresten nitrosiert, und einer der wichtigen Stoffwechselpfade ist die Interaktion von Stickstoffmonoxid mit Superoxidanionen. Diese Reaktion ist fast diffusionsbegrenzt. Wann immer man also die eine Verbindung mit der anderen in Kontakt bringt, ist dies die Reaktion, die stattfinden wird, und sie "verschluckt" oder stiehlt das NO vom Stoffwechselpfad des zyklischen G. Und dies führt zur Entstehung von Peroxynitrit, das sogar noch giftiger ist als Stickstoffoxid oder Superoxid. Peroxynitrit nitriert Proteinreste, die an Hydroxyl und Tyrosine angrenzen, indem es die Phosporylierung der Tyrosinkinase möglicherweise räumlich hemmt oder in einigen Fällen störend darauf einwirkt. Möglicherweise kommunizieren die beiden Systeme also miteinander: der Stoffwechselweg der Tyrosinkinase und der von NO. Vielleicht. Es gibt sehr wenige in vivo Hinweise darauf, die meisten Hinweise waren bislang in vitro. Es gibt eine wichtige, als endotheliale Dysfunktion bezeichnete Krankheit. Viele von uns, mit Sicherheit die Älteren unter uns, haben eine endotheliale Dysfunktion, von den jungen Leuten möglicherweise noch nicht so viele. Sie tritt zusammen mit Bluthochdruck, Arterioskelerose, Diabetes, Tabakkonsum und möglicherweise auch mit Übergewicht auf. Bei allen diesen Krankheiten kommt es zu oxydiertem Stress, der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, Wasserstoffperoxid, Superoxidanionen, Hydroxylradikalen, und die Gewebe der Blutgefäße erzeugen keine ausreichenden Mengen von Nitritoxid, aus einer Vielzahl von Gründen; ich kann diese Gründe nicht alle durchgehen. Doch das Nettoergebnis ist, dass die Blutgefäße nicht genug NO produzieren können. Sie tendieren dazu, verengt zu sein, wodurch der atherosklerotische Prozess beschleunigt wird. Die Durchblutung wird durch diabetische Geschwüre und Verletzungen verringert. Es handelt sich demnach um einen Teufelskreis: Je mehr die Blutgefäße verengt sind, umso mehr reaktive Sauerstoffspezies entstehen, umso weniger NO. Es wird schlimmer und schlimmer. Man muss den Kreislauf also unterbrechen. Man muss die zugrundeliegende Krankheit behandeln und möglicherweise mit einige neuen Therapien darangehen, möglicherweise mit der Zuführung von zusätzlichem Arginin, um mehr NO zu produzieren; oder mit Antioxidantien, um die reaktiven Sauerstoffspezies zu beseitigen. Und es gibt viele klinische, viele Jahresstudien, die dies belegen. Es gibt einige klinische Untersuchungen. Die klinischen Untersuchungen waren sehr umstritten. Wir sind fast am Ende. Hier ist ein weiteres Dia. Das Forschungsgebiet um Stickstoffmonoxid ist völlig verrückt geworden. Unser erster Aufsatz über die biologischen Wirkungen erschien 1977. Fast ebenso viele wie zu zyklischem AMP, mehr als zu G-Proteinen und vielen anderen Themen. Es ist unglaublich. Das entspricht etwa 6000 bis 8000 Aufsätzen im Jahr, im Zeitraum der letzten 5 bis 10 Jahre. Das sind 20 bis 30 Aufsätze am Tag. Niemand auf der Welt kann darüber den Überblick behalten. Es ist für alle von uns in diesem Forschungsfeld sehr frustrierend. Es ist aber auch sehr spannend, dieses Interesse und diese Begeisterung zu sehen. Ich habe eine Teilliste für Sie zusammengestellt, dieses Dia und das nächste, um Ihnen zu zeigen, wohin sich dieses Feld meiner Meinung nach in den nächsten 10 Jahren bewegen wird, was die Entwicklung neuer Medikamente betrifft, und wie wir diese biochemischen, molekularen Zielobjekte, die wir und andere beschrieben haben, nehmen können, und sie nun in Prüfverfahren mit hohem Durchsatz und andern Untersuchungen verwenden können, um chemische Hinweise zur Herstellung neuer Heilmittel zu finden. Wir wissen, wie ich bereits sagte, dass NO als Neurotransmitter am Hirnstoffwechsel beteiligt ist, in manchen Bereichen des Gehirns, sowohl zentral, als auch an der Peripherie. Wenn Sie eine Maus mit NOS-1 versehen und einen zerebralen Infarkt herbeiführen, ist der Umfang des Infarktes kleiner. Wenn Sie eine Maus mit NOS-3 versehen und einen zerebralen Infarkt herbeiführen, so ist der Umfang des Infarktes größer. Wenn Sie eine Maus mit NOS-1 und ohne NOS-3 versehen , ist die Maus nicht mehr sehr clever. Sie kommt nicht mehr durch aus dem Wasserlabyrinth. Es gibt also die Beteiligung von Stickstoffmonoxid als Transmitter in verschiedenen Bereichen, auch im Gedächtnis, und wir haben all das keineswegs verstanden. Wir wissen, dass es, bei einem Glaukom, bei der Produktion und Aufnahme von Flüssigkeit im Auge eine Rolle spielt, bei der neuronalen Degeneration der Retina. Wir haben ausführlich über die Gefäßerweiterung gesprochen, Bluthochdruck in der Lunge wurde im Film angesprochen. Es war eine aufregende Sache, diese Entwicklung mitzuverfolgen. Ungeborene Babys, verbunden mit der mütterlichen in vivo-Zirkulation, müssen ihre Lungen nicht aufblähen, weil sie ihren Sauerstoff von der Plazenta der Mutter bekommen. Wenn sie zu früh geboren wurden, sind ihre Blutgefäße verengt, ihre Lungen sind nicht entwickelt, sie benötigen einen oberflächenaktiven Stoff. Man muss diese Blutgefäße erweitern, ihr Blut fließt von der rechten in die linke Herzkammer, die Babys leiden an Sauerstoffmangel (Hypoxie). Wenn man ihnen über einen Nasenkatheder ein wenig Stickstoffmonoxid gibt, erweitert dies die Gefäße, der Blutfluss von der rechten in die linke Herzkammer geht zurück, ihr Blut wird mit Sauerstoff angereichert. Es hat eine wunderbare Verbesserung gegeben, mit der sich das Erfordernis einer ECMO-Therapie, die höchst unangenehm ist, eliminieren ließ. Sie haben alle von Viagra gehört. Es ging aus dieser Forschung hervor, nicht aus unserer, aber wir entwickelten die Konzepte. Wir haben im Labor Witze darüber gemacht: dass wir Kondome mit gefäßerweiternden Substanzen füllen würden, und mit NO-Donoren und PD-Inhibitoren. Sie funktionieren. Viagra ist ein Inhibitor der Typ-5-Phosphodiesterase, die man hauptsächlich in Blutgefäßen findet, sowohl im corpus cavernosum, als auch in den systemischen Gefäßen. Dies ist der Grund dafür, warum Patienten, die Viagra nehmen und nun zusätzlich NO-Donoren, Nitroglyzerine, sehr hohen Blutdruck, Herzrhythmusstörungen, Schlaganfälle etc. bekommen können. Man muss also vorsichtig sein. Es ist kein Medikament, das aus nichtmedizinischen Gründen genommen werden sollte, es kann zu Komplikationen führen. Es ist an der Wundheilung und der Angiogenese beteiligt, an der Atherosklerose. Wenn Sie sich die Menge ausgeatmeten NOs ansehen, ist dies ein wunderbarer Marker für die Schwere von Asthma. Je mehr Entzündungen in Ihrer Lunge sind, umso mehr Induktion von NOS-2, umso mehr NO produzieren Sie, umso mehr NO gelangt in die von Ihnen ausgeatmete Luft. Der Arzt kann Sie daher in einen Beutel oder eine Röhre blasen lassen, und wenn der NO-Gehalt erhöht ist, weiß er, dass Ihr Asthma außer Kontrolle ist und er passt die Therapie daran an. Das ist sehr nützlich gewesen. Es gibt klinische Studien für septischen Schock, Blutplättchenaggregation. Wir wissen aus Mikroarray-Studien an Zellen, dass NO Gene reguliert, sowohl hoch- als auch herunterreguliert. Wir haben großes Interesse an der Stammzellenbiologie entwickelt. Seit den letzten paar Jahren wissen wir, dass Stickstoffmonoxid und zyklisches G die Vermehrung embryonaler Stammzellen beim Menschen und bei Mäusen beeinflusst. Wir glauben, dass wir Zellen auf unterschiedliche Entwicklungsbahnen zwingen können, indem wir mit NO und zyklischem G herumspielen. Und es gibt noch andere Anwendungen, dies ist nur eine Teilliste. Wir können nicht alles tun. Haben Sie vielen Dank.

Ferid Murad on the History of Intercellular Signalling
(00:13:34 - 00:17:23)

As for the vitamins, the discovery of hormones began not earlier than 1902, making hormone research “highly susceptible” to Nobel Prizes. However, while in that year, the Brits Wiliam Bayliss and Ernest Starling did discover secretin, the first hormone ever identified, and while the two scientists even coined the term “hormone” in 1905, they never received the Nobel Prize.

Secretin is not a small, but a “large” protein molecule. It is released from the small intestine upon the arrival of food from the stomach. The hormone then triggers the release of digestive juices by the pancreas, a classical example of between-organ signalling. And, importantly, a process not involving the brain, as previously assumed. Curiously, Ivan Pavlov, introduced as the father of chemical signalling by Ferid Murad above, received the unshared 1904 Nobel Prize in Physiology or Medicine for a theory of digestion, which still put the brain at the centre of the physiology of gastric secretion. The award was given, although Pavlov’s theory had been proven incorrect by Bayliss and Starling two years before. A controversial decision.

Another “large” protein hormone tied to a much discussed Nobel Prize is insulin. The story of its discovery, and a description of the controversy around the associated 1923 Nobel Prize in Physiology or Medicine, may be found on the website of the Nobel Foundation [10].

In 1939, the first Nobel Prize involving small molecule hormones was given to the German Adolf Butenandt. The chemist received half of the award for his work on sex hormones. And it was hard work indeed. Butenandt and his team had processed thousands of litres of urine, collected from pregnant women, in order to isolate a couple of milligrams of the sex hormone oestrone. Butenandt also isolated androsterone from men’s urine and progesterone from pig ovaries, determining the structure of the compounds. Jointly with his co-recipient, the Swiss-Croatian Leopold Ruzicka, he eventually established that several sex hormones may be synthetically derived from a common precursor, cholesterol, the first known steroid.

In 1950, three scientists received the Nobel Prize for Physiology or Medicine for a similar feat. Edward Kendall and Philip Hench, both from the USA, and the Swiss-Polish Tadeus Reichstein were rewarded for their work on the hormones of the adrenal cortex. It included the isolation and structural characterization of about 29 small molecules found in the adrenal cortex and some early studies on their biological effects. The best known of these compounds is cortisone, which was later shown by Hench to be an effective anti – rheumatic agent. Like the sex hormones, the hormones of the adrenal cortex belong to the chemical group of steroids. At the 1954 Lindau Nobel Laureate Meeting, Reichstein told the story of their discovery:

Tadeus Reichstein (1954) - The Most Important Hormones of the Adrenal Cortex (German presentation)

Ihre Hoheit, meine Damen und Herren, ich will versuchen, einen ganz kurzen Überblick zu geben über das, was man heute als die wichtigsten Hormone der Nebenniere ansehen kann. Die Bedeutung der Nebennieren für den menschlichen Organismus und für seine normale Funktion sind vom englischen Arzt, Addison, Thomas Addison, vor ungefähr 100 Jahren erkannt worden. Im nächsten Bild sehen Sie das Titelblatt seiner berühmten Monografie. Die ist also im Jahr 1855 erschienen. Und er beschreibt dort bereits in einer sehr eingehenden Weise die Folgen, die im menschlichen Organismus erkannt werden können, wenn diese kleinen Organe durch irgendwelche Einflüsse zerstört werden, meistens beruht das auf tuberkulöser Infektion oder durch Atrophie. Dieses Krankheitsbild ist von Armand Trousseau nach ihrem Entdecker dann als Addisonsche Krankheit bezeichnet worden. Sie hatte früher eine sehr schlechte Prognose. Mit der heute möglichen Substitutionstherapie kann sie aber relativ leicht unter Kontrolle gebracht werden. Es ist ein Jahr später schon bereits von Brown-Séquard durch Tierexperimente gezeigt worden, dass es etwas Ähnliches auch im Tier erzeugt werden kann durch vollständige Entfernung der Nebennieren. Immerhin wurden die Resultate von Brown-Séquard zu seiner Zeit - und wahrscheinlich mit Recht - stark angezweifelt wegen seiner ungenügenden Operationstechnik. Die Tatsache an sich ist aber nicht bestritten und hat sich später durchaus als richtig erwiesen. Ich zeige Ihnen hier einen Schnitt durch eine menschliche Nebenniere, wobei Sie ziemlich deutlich eine helle innere Zone erkennen können, die ziemlich klein ist, und eine große dunkle Zone. Die helle Zone wird als Mark bezeichnet und die dunkle als Rinde. In Wirklichkeit handelt es sich eigentlich um zwei verschiedene Organe, die bei einigen Tierspezies, bei einigen Fischen beispielsweise, auch als getrennte Organe vorliegen, örtlich getrennt, sodass man sie dort als Suprarenalorgan und Intrarenalorgan bezeichnen kann, während sie beim Menschen und bei fast allen Warmblütern örtlich zu einem Gebilde zusammengewachsen sind. Diese örtliche Nähe deutet auf eine funktionelle Nebenwirkung. Weitere Versuche zeigten dann, dass die lebenserhaltende Funktion ... Also wenn man experimentell Tieren die beiden Nebennieren entfernt, so sterben sie nach ungefähr 4 bis 5 Tagen, das ist bei den Spezies etwas verschieden. Und es stellen sich im Allgemeinen sehr viele Ausfallerscheinungen ein, fast kein Organ funktioniert normal. Diese Störung wird nicht erreicht, wenn man beide Nebennieren vollständig entfernt, also beide Markteile vollständig entfernt, aber ein genügendes Stück Rindengewebe zurücklässt, dann bleiben die experimentellen Tiere am Leben. Es ist dann um das Jahr 1933 herum gezeigt worden - von verschiedenen Forschern - hauptsächlich in Amerika, Rogoff und Stewart, dann Hartman und Brownell, Swingle und Pfiffner besonders -, dass es gelingt, aus Gewebe von Nebennieren Extrakte zu erhalten, die bei täglicher Injektion an nebennierenlosen Tieren diese am Leben zu erhalten vermögen und sie auch vor den sonst auftretenden Ausfallerscheinungen zu bewahren vermögen. Damit war zum ersten Mal bewiesen, dass diese Drüse tatsächlich ein Hormon oder ein Gemisch von Hormonen ausscheidet, welches für das normale Funktionieren für Lebensvorgänge notwendig ist. Es war gleichzeitig damit die Grundlage geschaffen für eine chemische Behandlung der Addisonschen Krankheit sowie für die chemische Erforschung dieser Extrakte, dieser zugehörigen Stoffe. Solche chemischen Untersuchungen sind hauptsächlich an drei verschiedenen Laboratorien ausgeführt worden: bei Kendall in Rochester, Minnesota, in der Mayo-Klinik, dann bei Oskar Wintersteiner, damals an der Columbia University in New York und beim Vortragenden und seinen Mitarbeitern in Zürich und dann in Basel. Das Ergebnis dieser Untersuchungen kann kurz wie folgt zusammengefasst werden: Es gelingt, aus solchen Extrakten Konzentrate zu erhalten durch physikalische und chemische Operationen, die in hoch konzentrierter Form noch alle biologische Aktivität enthalten, soweit man das feststellen kann. Und zweitens konnten aus solchen Konzentraten dann ungefähr in den Jahren 1933 bis [19]45, im Ganzen 29 kristallisierte Stoffe erhalten werden, die sich als Steroide erwiesen. Sie sehen im nächsten Bild eine Zusammenstellung dieser Stoffe, die isoliert wurden aus Nebennieren. Eine Anzahl von diesen Stoffen war bereits früher schon bekannt, sie konnten teilweise aus anderem biologischen Material isoliert werden, während eben die Mehrzahl neu war und charakteristisch für die Nebennieren ist. Von diesen vielen Stoffen zeigten nicht alle, sondern im Ganzen, wie sich dann später erwies, im Ganzen sieben verschiedene sogenannte Cortin-Aktivität in dem Sinne, dass sie nun nierenlose Tiere bei täglicher Injektion am Leben zu erhalten vermögen und auch die meisten Ausfallserscheinungen zu heilen vermögen. Ich habe den siebenten Stoff nicht hier auf der Tabelle. Er unterscheidet sich von den anderen dadurch, dass dieser Ring hydriert ist, eine alphaständige Hydroxylgruppe hier dransteht und eine Hydroxylgruppe am Ende, wie hier angegeben. Die genauere biologische Analyse ergab dann allerdings, dass zwischen der Wirkung dieser sieben Stoffe noch erhebliche qualitative und quantitative Unterschiede bestehen. Zur Erläuterung möchte ich die drei obersten Vertreter, also das heute ... Das römisch "I" wird als Cortexon bezeichnet, Corticosteron, und 17-Oxycorticosteron oder Hydrocortison. Ich will die herausgreifen, um die Sache zu vereinfachen: Die Wirkung, die biologische Wirkung dieser zwei Vertreter ist praktisch gleich, ebenso diese hier, wobei die obere Reihe jeweils etwas stärker wirkt und wahrscheinlich auch den natürlichen Hormonen eher entspricht. Wenn man das tut, so zeigt sich Folgendes: Hier sind diese drei Vertreter in sieben verschiedenen Testmethoden geprüft worden. Das ist der Lebenserhaltungstest an der Ratte, das wäre der Einfluss auf den Natriumstoffwechsel, Natriumretention am Hund, das wäre der Einfluss auf den (rechts) Stickstoffgehalt des Bluts, ebenfalls am Hund gemessen, und das wäre der Einfluss auf die Muskelermüdbarkeit bei kurzer Reizung. Man glaubt, dass alle diese vier Testmethoden grob genommen etwas messen, was mit dem Mineralstoffwechsel zusammenhängt, und es ist sehr leicht ersichtlich, dass in diesen vier Testmethoden das Cortexon, dieser erste Stoff, weitaus am stärksten wirkt, währenddem das Hydrocortison entweder gar nicht oder nur eine schwache Wirksamkeit zeigt. In den anderen drei Testmethoden, das ist hier der Ingles-Test, auch ein Muskeltest, aber bei einer sehr lang dauernden Reizung, dann die Wirkung auf die Deponierung von Leberglykogen und der Antiinsulintest, das sind Testmethoden, die auf den Kohlehydratstoffwechsel zunächst einmal einwirken oder wenigstens das messen. Dort zeigt Stoff Nr. 1 entweder gar keine oder eine sehr schwache Wirksamkeit, währenddem das Hydrocortison in allen drei Testmethoden weitaus am stärksten ist. Und überall ist das Corticosteron ungefähr in der Mitte. Das hat dazu geführt, dass man gesagt hat: Man kann grob zwei Gruppen von Corticoiden unterscheiden: die Mineralocorticoide, die sich verhalten wie das Cortexon, und wobei das Cortexon der damals am stärksten wirksame Vertreter ist, und die sogenannten Glucocorticoide, die die starke Wirkung auf den Kohlehydratwechsel aufweisen, und dort ist ein Hauptvertreter das Hydrocortison oder das Cortison. Es ist allerdings zu sagen, dass diese Bezeichnung eine grobe Annäherung darstellt, es ist besonders von Long von Ingle und anderen darauf hingewiesen worden, dass die Kohlehydratwirkung dieser Stoffe vielleicht gar nicht ihre primäre Funktion ist, sondern dass die Wirkung aus dem Proteinstoffwechsel im Vordergrund steht und dass das, was man nachher misst, die Wirkung auf den Kohlehydratstoffwechsel eben ein sekundärer Effekt ist. Aber diese Bezeichnungen werden aber heute gebraucht und ich will sie in diesem Sinne verwenden. Die Entdeckung, die so großes Aufsehen erregt hat von Hench, Kendall und Mitarbeitern, dass das Cortison und auch diese anderen Vertreter das Hydrocortison besonders, eine entzündungshemmende Wirkung aufweisen und speziell Wirkungen zeigen bei rheumatischen Erkrankungen sowie bei allergischen Zuständen, die ist bis jetzt nur für diesen Stoff, für das Oxycorticosteron, festgestellt worden und das entsprechende Cortison. Also diese zwei Stoffe wirken manchmal. Aber in eindeutig reproduzierbarer Weise ist diese, wenn man sagen kann, entzündungshemmende Wirkung nur über das Cortison und Oxycorticosteron eindeutig reproduzierbar. Ich kann in dem nächsten Bild noch das Bild von Hench zeigen. Die Verschiedenheit der Wirkung dieser Stoffe macht es verständlich, dass immer wieder gefragt wurde, was nun eigentlich das richtige Hormon der Nebenniere sei, ob es nun eins, oder zwei oder drei gebe. Die Beantwortung dieser Frage ist natürlich nicht möglich durch die Untersuchung von Drüsenextrakten. Eine Extraktion einer Drüse ist ein viel zu grober Vorgang, als dass man sich daraus ein Bild machen könnte, was nun wirklich unter normalen Bedingungen ans Blut abgegeben wird. Diese Beantwortung dieser Frage wurde auf zwei Wegen versucht: Zunächst einmal durch Beobachtung der Erfolge einer Substitutionstherapie, das ist ein Annäherungsweg. Und zweitens: durch die direkte Beobachtung und Untersuchung des Blutes. Bei den Beobachtungen über Substitutionstherapie, die kann man am Tier machen oder besser am Addison-Patienten klinisch. Im letzteren Fall stütze ich mich auf Angaben von Thorn in Boston. Er kam zum Resultat, dass es nicht möglich ist, mit einem Stoff allein die maximale Wirkung zu erzielen. Es war bekannt, dass man Addison-Patienten durch Gaben von Cortexol allein praktisch beliebig am Leben und auch im Allgemeinen bei recht guter Gesundheit erhalten kann. Dagegen wird der Zustand verbessert, merklich, manchmal sehr merklich, manchmal nur wenig, wenn sie gleichzeitig noch Cortison bekommen. Und umgekehrt kam mit dem Aufkommen des Cortisons eine Periode, wo man probiert hat, die Addison-Patienten mit Cortison allein zu behandeln. Und seiner Erfahrung nach können sie dann auch in leider häufiger Ausfallserscheinung, eben aufgrund der schwachen Mineralwirkung, zeigen, dass eine Kombination von ca. 2 mg Cortexon mit etwa 15 mg Cortison sich als beste Substitutionstherapie ergeben hat. Diese Versuche würden also darauf deuten, dass es nicht möglich war - wenigstens bis damals - mit einem einzigen Stoff die Funktion der Drüse vollständig oder vollkommen zu ersetzen, dass dazu also mindestens zwei, vielleicht auch drei Stoffe nötig sind. Einen genaueren Einblick oder eine genauere Beantwortung der eingangs gestellten Frage erlaubt natürlich die Untersuchung des Blutes. Es ist klar, dass man ohne irgendwelche Voraussetzungen ganz unmöglich eine Antwort auf die Frage geben kann, was nun die Nebenniere für Stoffe wirklich ans Blut abgibt. Nachdem nun durch die Untersuchung der Extrakte eine ganze Reihe von Corticoiden bekannt geworden war, ihre Eigenschaften bekannt waren, so war es naheliegend, anzunehmen, dass nun entweder einige diese Stoffe - die gleichen, die man aus der Drüse isoliert hat oder sehr ähnliche - auch unter normalen Bedingungen ans Blut abgegeben werden. Nun, unter solchen Voraussetzungen ist es dann mit den modernen Methoden der Papierchromatografie besonders möglich, nach geeigneter Anreicherung, einen solchen Nachweis zu führen. Versuche dieser Art sind zuerst in Amerika von Nelson, Reich, Samuels und Zaffaroni beschrieben worden, dann später von Pincus, Hechter und Mitarbeitern sowie von Bush aus England, der damals auch in Amerika war, auch von anderen. Um möglichst hohe Konzentrationen zu erreichen, das heißt, um einen Nachweis zu erleichtern, wurde venöses Blut der Nebennieren untersucht, und zwar mit Versuchstieren, die zuerst mit relativ großen Dosen mit adenotropem Hormon behandelt wurden, um die Produktion zu stimulieren. Aber mit verfeinerten Nachweismethoden ist es auch möglich, auch das Blut normaler Tiere und auch von Menschen, und zwar das periphere Blut, zu untersuchen. Die Ergebnisse haben dann gezeigt, dass von den bekannten Corticoiden im Blut, und zwar sowohl nach adenotropem Hormon wie auch im normalen peripheren Blut von den damals bekannten Corticoiden sicherlich zwei nachgewiesen werden können, und das ist Corticosteron und das 17-Oxycorticosteron, das Hydrocortison. Es sind auch andere Stoffe drin nachgewiesen worden, teilweise viele, aber nicht mit absoluter Sicherheit identifiziert. Die sind also auch mit Derivaten usw. identifiziert worden, dass man den Nachweis, ich würde sagen, als mindestens 99 Prozent sicher betrachten kann. Und aus Blut, das durch Stimulation mit ACTH gewonnen wurde, sind solche Stoffe auch in Kristallen präparativ isoliert worden, sodass an der Identität kein Zweifel herrschen kann. Der Nachweis erbrachte ferner die Tatsache, dass die Menge, die im Blut vorkommt, signifikant ist, sodass sie also für die glucocorticoide Wirkung der Drüse ganz sicher eine ausreichende Erklärung gibt. Anders stand es mit der Mineralwirkung. Man weiß, dass die Funktion der Drüse sehr stark auf den Mineralstoffwechsel wirkt, und es hat sich bei diesen Versuchen gezeigt, dass das einzige Corticoid, was damals bekannt war, das Cortexon, sicherlich unter diesen Bedingungen nicht in genügenden Mengen ans Blut abgegeben wird, eventuell überhaupt nicht ans Blut abgegeben wird, sodass es nicht für die starke Wirkung auf den Mineralstoffwechsel verantwortlich gemacht werden kann, unter normalen Bedingungen. Es hat die Wirkung, wenn man es zuführt, aber das ist dann eine künstliche Substanz. Nun, dieses Resultat stimmte auch mit viel älteren Beobachtungen von Kendall sowie von Wintersteiner und anderen überein, wonach es gelingt, aus Drüsenextrakten amorphe Konzentrate zu gewinnen, die auf den Mineralstoffwechsel viel stärker wirksam sind, sogar noch - also pro Gewichtseinheit - als Cortexon, was damals das weitaus stärkst wirksame war, sowie irgendwelche anderen Stoffe. Um eine Erklärung dafür zu suchen, gibt es zwei Möglichkeiten: Man kann annehmen, es gibt noch einen Unbekannten oder mehrere Unbekannte in solchen Extrakten, die noch nicht isoliert werden konnten, oder dass es sich um eine Art Synergismus handelt, wie das bei gewissen anderen Drüsenextrakten auch beobachtet wurde. Und die Streitfrage war bis vor Kurzem offen. Es ist dann im Jahre 1952 entschieden worden und zwar von Brady, Simpson und Tait in London, und zwar entschieden im Sinne der Einstoff-Hypothese, [dass man] sagen kann, zugunsten der Hypothese eines neuen Stoffes. Diese Forscher haben zunächst einen sehr empfindlichen Test ausgearbeitet, mit dem es gelingt, das Verhältnis der Natrium- zur Kaliumausscheidung im Urin zu messen; dieses Verhältnis wird durch ein solches Corticoid besonders stark beeinflusst, weil die Natriumretention erhöht wird und zur gleichen Zeit die Kaliumausscheidung. Dieser Test ist so empfindlich, dass es gelingt, mit einem einzigen Fleck, den man bei der üblichen Papierchromatografie bekommt, mehrere Versuche durchzuführen. Und sie konnten zeigen, dass damit - mit Papierchromatografie -, dass die hauptsächlichste Mineralaktivität an einen einzigen Fleck gebunden ist und sich somit wie ein reiner - chemisch reiner Stoff benimmt. Gute Konzentrate, die sie damals herstellten, waren bereits in diesem Test etwa 50 bis 80 Mal wirksamer als kristallisiertes Cortexon. Da wir zur Zeit, als Simpson und Bates diese Versuche ausführten, auch mit ähnlichen Versuchen beschäftigt waren, aber noch im präparativen Maßstab diesen damals noch unbekannten Stoff isolieren wollten, haben wir eine Arbeitsgemeinschaft mit den englischen Forschern geschlossen, der sich in Basel auch die Herren Dr. Wettstein und Neher beteiligten und erhielten Extrakte von der Organon in Holland, die sie uns für diesen Zweck extra bereitet haben. Und es gelang dann durch ein Verfahren, das man als Verteilungschromatografie bezeichnet, relativ leicht eigentlich dann, einen Stoff zu isolieren, in Kristall zu isolieren. Ich kann Ihnen die Kristalle zeigen. Der also wirklich rein kristallisiert war, also ausgezeichnet, und der sich in jeder Hinsicht mit dem von Simpson und Tait beschriebenen Material als identisch erwies. Sie fanden in ihrem Test eine Aktivität von 120 Mal so aktiv als Cortexon. Die Formel konnte dann ziemlich bald aufgeklärt werden, im nächsten Bild sehen Sie die Formel. Es ist ein Stoff, der isomer ist, mit Cortison, allerdings anders gebaut. Man könnte ihn als ein Aldehyd bezeichnen, der sich vom Corticosteron ableitet. Und wahrscheinlich liegt es so, dass ähnlich wie bei dem Zucker - es handelt sich ja auch um ein Gamma-Oxyaldehyd - hier in Lösung wenigstens ein Gleichgewicht zwischen einer Halb-Acetalform und einer offenkettigen Form, die rechts beschrieben ist, existiert. In kristallisiertem Zustand und auch in Lösung benimmt er sich so, als ob hauptsächlich die zyklische Form vorliegt. Die Ausbeuten an Kristallen schwankten zwischen etwa 40 bis 90 Gamma pro Kilo Drüse, der wahre Gehalt dürfte etwa 0,1 mg pro Kilo sein bei Rindernebennieren. Schweinenebennieren scheinen ziemlich viel mehr zu enthalten. Das sagt natürlich sehr wenig, weil die Drüse den Stoff nicht speichert. Wie groß die täglich Produktion ist, kann man nur sehr grob schätzen. Der gleiche Stoff ist übrigens unauffällig auch von Mason und Mattox und Mitarbeitern in Amerika erhalten worden - ebenfalls in Kristallen erhalten worden. dass mit der Isolierung dieses Stoffes sozusagen die wesentliche Menge der Mineralwirksamkeit von Extrakten weitgehend erfasst ist, dass also wahrscheinlich keine anderen - oder nicht sehr viel anderes - mehr drin sein können, was auch noch mit zu der Wirksamkeit beiträgt. Von großem Interesse ist natürlich auch der Umstand, dass es Bush und Mitarbeitern gelungen ist, zu zeigen, dass derselbe Stoff auch im Blut vorkommt, und zwar ebenfalls in Mengen, die wahrscheinlich für die Funktion der Drüse als signifikant zu bezeichnen sind. Dort ist die Identifizierung nicht mit 100 Prozent Sicherheit erfolgt, ich glaube aber nicht, dass irgendein wirklich berechtigter Zweifel daran noch existieren kann, dass auch dieser Stoff ins Blut abgegeben wird und demnach für die Funktion der Drüse sicherlich maßgebend verantwortlich ist. Im Harn wurde der Stoff auch verschiedentlich beobachtet und zwar soll er sich besonders reichlich bei Patienten mit Geweben vorfinden, so zum Beispiel bei Kindern mit Nephrosis. Aldosteron, wie er heute bezeichnet wird, zuerst wurde er als Electrocorticoid provisorisch bezeichnet, ist heute noch nicht synthetisch zugänglich, und die Isolierung aus der Drüse bereitet große Mühe, ist mit viel Zeitverlust verbunden und liefert zudem nur sehr kleine Mengen. Darum konnte das neue Corticoid bisher nur orientierend in Tierversuchen und klinisch geprüft werden. Immerhin konnten bereits die folgenden, recht aufschlussreichen Resultate erhalten werden: In Natrium-, Kalium- und Wasserausscheidungsversuchen am nebennierenlosen Ratten fanden de Stol und Mitarbeiter im Vergleich zu Cortexon also immer ..., das bisher stärkste Corticoid, eine etwa eine 25 Mal stärkere Natriumretention und etwa 5 Mal stärkere Kaliumausscheidung. Das stimmt ausnehmend gut, trotzdem es in ganz verschiedenen Methoden und verschiedenen Laboratorien durchgeführt wurde, mit dem Wert unter 20 für das Verhältnis von Kalium und Natrium. Oder wenn mal 5 x 25 nimmt, kommt ja 125. Im Lebenserhaltungstest am Hund war es ebenfalls etwa 25 bis 30 Mal stärker wirksam, als das Acetyl für Cortexon und etwas Ähnliches wurde von Mack und Mitarbeitern in Genf bei der klinischen Versuchen am Addison-Patienten gefunden, wobei zwei Patienten während einer - allerdings natürlich nur kurzen Zeit behandelt werden konnten. Er fand dabei nicht nur eine viel stärkere Wirksamkeit, sondern auch qualitative, sehr deutliche Unterschiede. Aldosteron zeigte neben der Wirkung auf den Mineralstoffwechsel auch eine ausgesprochene Kohlehydratwirkung und zudem verursacht es keine abnormale Wasserretention und erhöhte den arteriellen Blutdruck nicht über das physiologische Maß. Und dann etwas ganz Besonderes und Auffallendes war, dass es der einzige Stoff ist, der bei der Veränderung der pathologischen Pigmentierung beobachtet wurde. Der Einfluss soll so groß gewesen sein, dass zwei Patienten, die vorher eben diese Bronzefärbung immer hatten, die weder durch Cortison noch irgendwelche anderen Stoffe zu beeinflussen ist, plötzlich auf der Straße von ihren Bekannten angesprochen wurden, die haben gefragt, was mit ihnen los sei, sie sähen plötzlich wieder ganz weiß aus. Also das zeigt, dass dort irgendein anderer Mechanismus noch im Spiel ist, wobei man bis jetzt nicht genau weiß, wo der Angriffspunkt ist. Überraschenderweise und in Übereinstimmung mit den klinischen Versuchen zeigte das Aldosteron auch im Tierversuch eine deutliche Kohlehydratwirkung. Es ist aber nicht nur ein 100-prozentiges Mineralocorticoid, sondern es zeigt auch diese Kohlehydratwirkung. Und zwar war es im Leberglykogentest, also ein ganz spezifischer Kohlenhydrattest, da zeigt es ungefähr etwa 30 Prozent der Cortisonwirkung. Und es war ebenfalls wirksam im [inaudible, 00:29:58]-Test, das ist ein Test auf den Eosinophilenabfall. Nach diesen Befunden dürfte es kaum einem Zweifel unterliegen, dass im Aldosteron ein recht interessanter Stoff aufgefunden wurde, und dass die Produktion dieses Stoffes eine der maßgebenden Funktionen der Nebennierenrinde darstellt. Als wichtigste Hormone dieses Organs müssten deswegen heute bezeichnet werden: das Aldosteron, Corticosteron und 17-Oxycorticosteron, vielleicht nehmen wir noch Cortison. Absolut 100-prozentige Beweise, dass damit die Funktion der Drüse erschöpft ist, liegen nicht vor. Es sind auch Unterschiede zwischen verschiedenen Arten beobachtet worden. Aber ich glaube, dass bei weiteren Untersuchungen das Resultat nicht wesentlich geändert werden wird. Ich will Ihnen in den letzten zwei Bildern noch die Kristalle dieser zwei anderen Vertreter zeigen, das wäre das Corticosteron und im nächsten Bild das 17-Oxycorticosteron, das hier aus Chloroform kristallisiert gezeigt wird. Zum Schluss möchte ich noch erwähnen, dass das Aldosteron bisher noch nie bei rheumatischen Leiden oder Erscheinungen ausprobiert werden konnte - dazu ist gar nicht genug Material vorhanden bisher. Es liegen aber keinerlei Anhaltspunkte dafür vor, dass es bei solchen Konditionen irgendeinen therapeutischen Einfluss haben kann. Es wäre durchaus möglich, aber es gibt ..., es wäre auch durchaus das Umgekehrte möglich, dass es beispielsweise als Antagonist des Cortisons wirken könnte. Hingegen muss man bei allen Betrachtungen und Theorien über die normale und pathologische Funktion der Nebennierenrinde ... wird man, bis auf Weiteres, berücksichtigen müssen, dass dieses Organ hauptsächlich die genannten drei und auch auf der Tafel zu unterst aufgeschriebenen Stoffe, nämlich Aldosteron, Corticosteron und 17-Oxycorticosteron produziert. Ich danke Ihnen für Ihre Aufmerksamkeit.

Tadeus Reichstein on the Hormones of the Adrenal Cortex (in German)
(00:00:15 - 00:07:29)

It may be added that, in 1934, Reichstein also developed a technical procedure for the large-scale production of vitamin C. The so-called Reichstein process relies on the use of the synthetic power of bacteria and has dominated industrial vitamin C production for decades. It is still used today in modified form [9].

Back in the world of hormones, the next Nobel Prize was awarded in 1971 to Earl Sutherland "for his discoveries concerning the mechanisms of the action of hormones". Sutherland had elucidated the concept of first and second messengers (introduced by Ferid Murad above) and discovered the important (small) second messenger molecule cyclic AMP. Unfortunately, Sutherland never came to Lindau. Six years after his distinction, Roger Guillemin and Andrew V. Schally shared one of the 1977 Nobel Prizes in Physiology of Medicine "for their discoveries concerning the peptide hormone production of the brain". They had investigated how the brain controls certain hormone producing glands, like the thyroid, and found that it uses yet another set of “large” protein hormones to do so.

The next Nobel Prize for small molecule signalling came in 1982 and was awarded jointly to Sune Bergström, Bengt Samuelsson and John Vane "for their discoveries concerning prostaglandins and related biologically active substances". Prostaglandins are locally acting messenger molecules affecting only those cells in the vicinity of the signalling cell (hence, they formally do not belong to the class of hormones). They exert an extremely wide variety of strong physiological effects and act in practically every organ, tissue, and cell of our bodies [11]. Prostaglandins trigger the constriction and relaxation of muscle tissue, induce labour and play important roles in pain, fever and inflammation, to name only a few examples. Drugs suppressing prostaglandin biosynthesis, such as aspirin or ibuprofen, are commonly used as anti-inflammatory agents, while the prostaglandins themselves have found several clinical applications including the induction of childbirth or early abortions [11].

This brings us to the last Nobel Prize given for the discovery of a small signalling molecule so far. It was given to Robert Furchgott, Louis Ignarro and Murad, who had elucidated nitric oxide signalling. Murad, who introduced this subsection, told the story of nitric oxide later in his talk:

Ferid Murad (2007) - Nitric oxide as a messenger molecule and its role in drug development

So after this wonderful start of the meeting, we heard about the Big Bang, and I think the following talk also can be considered that it has been a Big Bang in biomedicine. That was the discovery of nitric oxide. It’s a great pleasure to ask Professor Ferid Murad from Houston, Texas to give his lecture to us here. He won the Nobel Prize in physiology and medicine in 1998. And it was listed for the discoveries concerning nitric oxide as a signalling molecule in the cardiovascular system. Professor Murad. This is my first visit to Lindau. It looks like a very exciting opportunity for the speakers as well as the students and I’m going to enjoy the week, I can assure you. Shortly after the Nobel Prize was announced, my office received numerous phone calls from the local schools in Houston, the high schools, the colleges, asking me to give lectures and meet students and I did that. But the requests really got to be enormous and I couldn’t keep up with it. So I went to the audiovisual television department in the Texas Medical Center and asked if they would help me put a video together. So this morning is going to be movies and films. This department is really an excellent department. They prepare tapes and videos for patients, how do they manage their ileostomy bags, how do they manage their renal shunts for dialysis and so forth. So we got together and put a dialogue together, we exchanged a lot of information back and forth and finally one Saturday morning they showed up at my home and we prepared this video and I think you’ll enjoy it. Now, it was prepared for teenagers but I’ve shown it to 4 year olds, 85 year olds and everybody seems to enjoy it because it’s science in lay language that all of you should understand. So let’s start with the video. Girl 1: Gosh, what’s with all the awards shows? TV: And the winner is... Congratulations. And now I ask you to step forward and receive your Nobel Prize. Girl 1: Nobel Prize? What is that? Girl 2: Beats me. Prof. Dr. Ferid Murad: What? You don’t know what the Nobel Prize is? We have to do something about that. Girl 1: Wow! Girl 2: What’s up with this? Boy: Hey, you’re just coming out of the TV! It’s like aliens. Prof. Dr. Ferid Murad: May I? Girl 1: Yeah sure, why not? So, what’s your story? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, my name is Ferid Murad. You can call me Fred. I’m a doctor and researcher and a scientist at the University Of Texas Medical School. And, oh, by the way I got the “Nobel Prize” in medicine in 1998. Girl 2: So, what is that “Nobel Prize” anyway? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, the Nobel Prize is one of the greatest awards you can get in the world. Boy: Aha... Prof. Dr. Ferid Murad: It’s recognition from other scientists. Girl 2: So? Prof. Dr. Ferid Murad: Hmm. Well, you get to be on TV all over the world. There’s a big party in Sweden. You even get to meet the King and Queen of Sweden. You get a gold medal. Then of course there is the money. Boy: Money? Girl 1: Party? Girl 2: Royalty? Prof. Dr. Ferid Murad: Yeah. Maybe it would be better if I showed you. May I? Girl 1: Mmm...sure. Prof. Dr. Ferid Murad: Thanks. Scientist on TV: Thanks, Fred. Welcome to my world of science and my laboratory. You know, the Nobel Prize wouldn’t even be around if it wasn’t for...dynamite. Anyway. Alfred Nobel, the Swedish inventor and businessman who invented the Nobel Prizes, was the guy who invented dynamite. Nitro-glycerine is the explosive chemical in dynamite. And even though it was very dangerous, Mr. Nobel figured out a way to contain nitro-glycerine so that it could be put to good use like to build stuff. You could say his discovery rocked the world. But nitro-glycerine has other uses. When Nobel started having heart problems, his doctor actually prescribed nitro-glycerine for his heart. But Nobel said: “No way.” So he blew it. Nobody knew why it worked. But it did. and he shared the 1998 Nobel Prize in Medicine with Dr. Robert Furchgott and Dr. Luis Ignarro for figuring it out. Boy: So you’re the dude that figured out why nitro-glycerine helps peoples’ hearts? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, yeah. Girl 2: So? Prof. Dr. Ferid Murad: So what? Girl 2: So why does it work? Prof. Dr. Ferid Murad: We were trying to answer the question to how nitro-glycerine works to help with chest pain. I did experiment, observed the results and collected data. Then I found out if what I thought was right or wrong. Anyway, what I did find was that nitro-glycerine releases nitric oxide and that nitric oxide does a lot of important stuff in the body. Girl 1: So, what is nitric oxide? And what exactly did you figure out that got you this “Nobel Prize”? Prof. Dr. Ferid Murad: Let me show you. Announcer on TV: It protects the heart. It stimulates the brain. It kills bacteria. And it’s a real gas. It’s nitric oxide. No one can say no to NO. Nitric oxide or NO is a simple molecule with two adapts, nitrogen and oxygen. And yes, it’s a colourless, odourless gas. A scientific sensation sweeps the globe. Nitric oxide is everywhere. It’s coming in toxic pollution depletes the ozone layer. It’s even found in car exhaust and cigarette smoke. But from super-menace to superhero. Nitric oxide is also found inside the human body and it helps send very important messages which are not from our sponsors. When blood flows through your blood vessels, the inner lining or endothelium releases nitric oxide. The nitric oxide signals your blood vessel to relax and widen. So what? This in turn lowers blood pressure, the force which the blood exerts on the vessel walls. If your blood vessels make enough nitric oxide, this signals your blood vessel to relax. Then your blood flows on through. No problem. But if blood doesn’t flow through, blood plugs forks. Then... (heart attack). And that’s not all! Scientist on TV: So relaxed blood vessels allow more blood to flow and nitric oxide can have an impact on all different parts of the body. For example, nitric oxide is already saving the lives of babies who are born too early by breathing in very small doses of this gas. It helps their lungs and improves their breathing. And that’s good! In nerve cells nitric oxide can stimulate the brain affecting things like behaviour. Oh behave, baby! As part of the body’s self-defence system nitric oxide defends against tumour cells and bacteria too. It’s amazing stuff. But nitric oxide is no laughing matter and not to be confused with nitrous oxide, better known as laughing gas. Ha-ha... somebody turn of that gas. Boy: So how do you think of all that anyway? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, over time I became very interested in how cells talk to each other. But most other scientists didn’t think that was very important. Scientist on TV: Dr. Murad figured out that when cells talk to each other, it’s like one cell sends an e-mail to another cell somewhere in the body. And the e-mail is the gas nitric oxide. The e-mail can break into another cell and take over how the cell works. It may contain a message like instructions for a blood vessel to relax. Or it may contain some other kind of instructions. For example, if the message is being sent to a cancer cell, the nitric oxide may kill the cancer and then self-destruct. Hasta la vista, baby. Nitric oxide in your body affects so many things. It’s like having a worldwide internet system inside your own body. Girl 1: So why did you go into science in the first place? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, it’s really a lot of fun to figure out how stuff like this works. And you don’t have to be brilliant to get ahead. You just have to have some goals and be prepared to work very hard. Scientist on TV: As a scientist you get to do something for the first time that nobody else has ever done. And that’s exciting! Sometimes your discovery opens the door to a whole new way of thinking and even more new discoveries. It is really cool! It’s kind of like the “Science Olympics” and the goal is the Nobel Prize. Teams of scientists from around the world compete with each other. It’s fun. Who’s going to finish first? Who’s going to win the prize? Prof. Dr. Ferid Murad: One of you could be a Nobel Prize winner someday. Who knows? Boy: Hey! I have some more questions. Girl 2: Yeah, me too. Girl 1: Well, I guess we have to find out more on our own. Girl 2: Maybe we could check the internet. Boy: Yeah, and look out for science and the Nobel Prize. Prof. Dr. Ferid Murad: They’re gone and they left some popcorn, didn’t they? Yum! I was very fortunate in that I was one of the first MD PhD students in the United States when the program began in Cleveland and I decided that that’s what I wanted to do somehow. I wasn’t sure how I made that decision. I was excited about chemistry and biology. I guess I was confused more than anything else. And said I’m going to try both and see which way to go and I got hooked and I’ve always straddled the fence the rest of my life. My mentors were Earl Sutherland and Ted Rall. They had just discovered cyclic AMP a year before I joined their laboratory. And what an exciting time this was for a young student. My assignment was to figure out how catecholamines, adrenalin regulates cyclic AMP production in tissues and whether it works through the beta adrenergic receptor or the alpha receptor. And that was a pretty straightforward and actually simple assignment. But to see this whole era of cell signalling and messengers evolve was a remarkably exciting time. To see all the hormones that work through these pathways and all the drugs that were evolving that I became hooked on second messenger systems and cell communication. Cell communication is really an old concept, probably first introduced by Pavlov more than 100 years ago. As you recall from your psychology classes Pavlov had a patient with a gunshot wound to his abdomen who developed a gastric fistula to the exterior. And whenever the patient would see or smell food, he would enhance his gastric secretions. Well, Pavlov was clever enough that he developed pouches and fistulas in dogs and showed them food and they too would enhance their gastric secretions. But he decided to condition these dogs by ringing a bell. And ultimately all he had to do was ring a bell and they would enhance their secretion without having to show them food. That told him that the brain was talking to the stomach, cells communicate with each other. Of course we know today that lots of cells and tissues in the body communicate with each other. And this is summarised for you in this cartoon, in this first slide. This represents three different populations of cells that are going to talk to each other. They can be any cells but I’m going to call cell 1 a neuronal cell. It can be a central neuron or a peripheral neuron. Cell 2 I will call an endothelial cell lining a blood vessel and cell 3 a smooth muscle cell in the wall of that blood vessel. Cell 1 wants to talk to cell 2 and also cell 3. And it does it by producing molecules that Earl Sutherland called first messengers. Today we call them hormones, we call them cytokines, we call them growth factors, we call them a variety of things, paracrine substances, autacoids etc. They come in different shapes and sizes and flavours. Some are small amino acids; some are large proteins like the cardiac troponins. The point is they’re released into the interstitial space in the blood stream and they home the body to find its target. It identifies its target cell by the presence in their membrane of a macromolecule that we call a receptor. Sometimes these receptors are inside of the cell, as with steroids and thyroid hormone, but most often they’re transmembrane proteins, integral membrane proteins in the membrane surface. These ligands or first messengers interact with their appropriate cells that only possess those receptors. That’s where the specificity of the reaction occurs. They fit together conformationally, like a key in a lock. And they then only perturb the cells that have the appropriate receptor. The ligand doesn’t necessarily have to enter inside of the cell to cause the cascade of biochemistry to result in some physiologic response. They can just interact with the receptor, it tweaks it and then all of a sudden, voila, there are lots of different intracellular second messengers that accumulate. The first such second messenger was cyclic AMP. What Sutherland and Rall discovered: This is how glucagon and epinephrine regulated glycogen degradation in the liver. We know today that lots of pathways utilise that messenger. We also know that there are other second messengers besides cyclic AMP: cyclic GMP, calcium, diacylglycerol, nitric oxide. And while there are hundreds and hundreds of first messengers, there are a modest number of intracellular second messengers. Perhaps no more than a dozen at present but there will be more, I’m sure, in the future. These second messengers accumulate and carry out the function within the cell that was brought by this first messenger to the cell surface. What is unique about nitric oxide as an intracellular second messenger is that it’s a gas. It’s a free radical with an unshared electron and a very simple molecule. And because it’s uncharged, the physiologic pH, like all the other messengers, it doesn’t go in and out of membranes... it goes in and out of membranes much more readily than the other messengers that often require energy or transporters to do that. So it not only regulates the biochemistry in the cell in which it’s made, nitric oxide, but it can come out and travel a couple of hundred Angstrom, microns, to regulate adjacent cells to produce other second messengers such as cyclic GMP. So it’s a very unique messenger molecule. It’s the only messenger I’m aware of that functions both intracellularly as well as extracellularly. It can be a paracrine substance, a local autacoid. It can also bind with other carriers, glutathione, thiols, albumen, other proteins and be transported a distance to be released again and function therefore as a hormone. No other messengers can do that. Nitric oxide is a very old molecule and I have a theory that it participated also in evolution. It was probably one of the first messenger molecules 3 billion years ago, as cells began to communicate with each other. But I won’t get into that story because time doesn’t permit. But today we know that it’s very important as a pollutant. And this is when it became popular about 50 or 60 years ago when it was apparent that all fossil fuels when combusted with oxygen produced a family of nitrogen oxides, NO, NO2, N2O3 etc. All of these nitrogen oxides will interact with ozone and deplete the ozone layer and are responsible for global warming along with the greenhouse gases. But I’m going to tell you that not only is the nitric oxide a pollutant but it’s the mechanism of action of some very important cardiovascular drugs and it’s a very important messenger molecule in the body. And this is just a partial list of the biology that it regulates. And the list is much, much longer than this. It includes muscle relaxation, platelet aggregation, penile erection, killing of parasites and microorganisms and the list goes on and on. We’ll come back to some of that shortly. In 1963, 7 years after the discovery or 6 years after the discovery of cyclic AMP, a couple of chemists discovered for the first time cyclic GMP, another cyclic nucleotide, a cousin of cyclic AMP. All you do is shift the amino group on the purine ring and you have a different structure. They administered inorganic P32 phosphate to rats, harvested the urine and found two major organic phosphates in urine, cyclic AMP, the other being cyclic GMP. That was the first demonstration of cyclic GMP as a natural product. That stimulated a few laboratories to become interested in cyclic GMP, to look for enzymes that made it, enzymes that hydrolysed it etc. And the story began to evolve in the late 1960s, early 1970s just as I was finishing my training and getting ready to join the faculty at the University of Virginia. We know today that there is a family of enzymes called guanylyl cyclases and there are at least seven or eight members of this family and we think there will be even more with splice variants that we’re now isolating. All of these enzymes convert GTP to cyclic GMP and pyrophosphate. The reaction is very analogous to add an OH cyclase that converts ATP to cyclic AMP and pyrophosphate. In fact the catalytic domains of all of the cyclases are homologous with the change of one or two amino acids, one enzyme can make the other nucleotide. The cyclic GMP can be inactivated by a family of phosphodiesterases; there are at least 10 or 11 members in this gene family. And they hydrolyse the phosphodiester bond to convert the cyclic nucleotide to the corresponding monophosphate, either 5’ GMP or 5’ AMP and it becomes inactive. As you will hear later in the week from Doctor Fischer, many of the intracellular second messengers, cyclic AMP, cyclic GMP, diacylglycerol, calcium etc., often activate a protein kinase that then phosphorylates a variety of protein substrates by transferring the gamma phosphate from ATP to a serine-threonine residue or perhaps a tyrosine residue. There are I’m told now as many as 500 or 600 protein kinases. So while the concept of cell communication is pretty simple, a ligand or hormone regulates the second messenger production which then regulates the protein kinase which phosphorylates a protein, the problem is the matrix gets pretty hairy when you consider all the cyclases, the diastasis, the protein kinases and the numerous proteins that can be phosphorylated. When these proteins are phosphorylated, as you’ll hear from Doctor Fischer, their conformation changes. If they’re structural proteins they can influence motility and other processes, contractility. If they’re enzymes they can be activated or inhibited. So as this story was beginning to unfold with cyclic GMP, I decided to desert cyclic AMP and switch my interest to cyclic GMP. As a new young faculty member in the early 1970’s the cyclic AMP field in my opinion was becoming rather crowded, large groups of people around the world. And I didn’t think that I could compete with all these huge laboratories and cyclic GMP was evolving and I said I’m going to go in this new direction. And I wanted to address two questions. We knew that a couple of hormones could increase cyclic GMP accumulation in a couple of tissues, acetylcholine in heart preparations, prostaglandins in vascular preparations. But we didn’t know the molecular coupling mechanism. If we understood ligand binding to the receptor and the coupling to the guanylyl cyclase to make cyclic GMP, we could presumably influence that coupling process with various chemicals and drugs to potentiate a hormone response or block it and maybe come up with some novel therapies for various endocrine diseases. That was quite rational. The second is, although cyclic GMP was a natural product, we had no idea what it did or what its function was. So we began our studies by looking at the enzyme in some detail that made cyclic GMP and the first big surprise was that there wasn’t just a single enzyme but a couple of enzymes. The enzyme activity was in soluble fractions as well as particulate fractions. The kinetic properties of this isoforms was different. I suspected there would be isoforms. I had thought to myself: If there are different compartments and isoforms of guanylyl cyclase, perhaps they’re regulated by different groups of hormones, wouldn’t that be a fun project to sort out. And a lot of that all turned out to be true intuition at the time. Well, to prove that we were dealing with isoforms was going to take a lot of work. We had to purify these soluble particulate activities, clone them, express them, restudy them. We did that, it took us 12 or 15 years of work to do all that. But initially I took a shortcut. I said the cooperativity of the particulate isoform, whereas the typical Michaelis-Menten kinetics of the soluble could be artifactual because these were crude preparations that possessed nucleotidases, phosphatases, phosphodiesterases. So we created a cocktail and added it to our incubations to inhibit all these competing pathways. We made a cocktail pyrophosphate, fluoride, azide, hydroxylamine, sodium nitrite, methylxanthines etc. And quite accidentally, as science often is the case, we found compounds that activated the enzyme. While our goal was to figure out hormonal regulation, we couldn’t do that because once we disrupted tissues, the hormone coupling was lost. Hormones no longer activated extracts of the enzyme. But the small molecules now would activate and maybe they could be our surrogates for understanding hormonal regulation. Much as fluoride was a valuable resource for understanding hormonal regulation of adenylate cyclase. The activators were azide, hydroxylamine and sodium nitrite. And to make a long story short, the effects of the azide were oxygen dependent, enhanced with thiols, had a time lag before the rate of the reaction became maximal. They were tissue specific because tissues possessed inhibitors and activators of the pathway. And we were convinced that these activators were precursors or prodrugs being converted to something else in our incubation. And it became quite a mystery story for several years to figure out what that activator was going to be. We put azide and hydroxylamine and nitrite on cell cultures in tissues. And indeed they would elevate cyclic GMP levels and would also activate the enzyme and extracts. So they would work in both systems. One of the tissues, again fortunately, that we were working with was tracheal smooth muscle. As a student I knew that cyclic AMP relaxed smooth muscle, vascular and airway smooth muscle. And I thought cyclic GMP might antagonise cyclic AMP. So we prepared a smooth muscle preparation that was relatively homogenous in order to do some biochemistry and compare it with a physiologer. We put azide on those smooth muscle preparations, the cyclic GMP levels went up, but the muscle didn’t contract, it relaxed. The opposite of what we expected. The dose response curves, the time courses, everything told us that azide was a smooth muscle relaxant, mediating its effects through cyclic GMP and that’s how it worked. And that was the first physiologic function of cyclic GMP. We said: If these drugs cause relaxation and elevate G, what do the other smooth muscle relaxants do? Nitro-glycerine, which had been around for 100 years, nitroprusside? A lot of popular drugs in the cardiovascular intensive care units. They decreased after load, lowered blood pressure in patients with infarction and so forth. We put them on our preparations, they relaxed as expected. The surprise was that they elevated cyclic GMP levels. So now we had a family of compounds that we called nitrovasodilators that were capable of activating guanine cyclase in cell free preparations and elevating cyclic GMP levels in various tissues. These compounds included hydroxylamine, azide, sodium nitrite, some hydrazines, nitro-glycerine, nitroprusside, nitrosoureas, nitrosamines and a long list of other compounds, all NO donors. They all have nitrogen. Some are converted spontaneously based on redox and pH incubations. Some are converted insomatically, azide requires catalase conversion. And we reasoned that the intermediate for all of these prodrugs or precursors had to be nitric oxide. And the reason we thought it was nitric oxide is because azide’s tissue specificity was in part influenced by the presence of haemoglobin and myoglobin in our tissue extracts. These were inhibitors. We knew from the literature that NO had a very high affinity for the heme prosthetic group of haemoglobin, myoglobin. So we reasoned that all of these prodrugs or precursors were converted to nitric oxide. When we generated nitric oxide in the fume hood chemically, sodium nitrite, ferrous sulphate, sulphuric acid, ventilated the gas into our incubations, every preparation was activated. What an exciting period that was. The first demonstration that a free radical could activate an enzyme. And I thought that would be interesting chemistry. Lots of folks were sceptical. They all thought of free radicals and the nitric oxides as pollutants and toxic materials and sure enough it activated. Some people argued: Murad, you’re inhibiting an inhibitor, you’re disinhibiting in your crude preparations. So we were obliged to purify the enzyme to homogeneity and when we did the concentration the nitric oxide required to activate kept becoming lower, lower, lower as we moved scavengers and sinks from our incubation. Transition metals, thiols, proteins and sucked it up, you know. Nanomolar concentrations of NO would activate the enzyme and the Vmax would increase 200- to 400-fold, as it would lower the Km for GTP. So we realised that we had figured out the mechanism of action of the nitrovasodilators, such as nitro-glycerine that had been used clinically for 100 years. As a pharmacologist, when you find an exogenous material that does something in a biological system, you should ask yourself: Is it mimicking a natural pathway that’s already there? And is it working through a similar mechanism? So I proposed in some review articles in the late ‘70s that perhaps the effects of various hormones to increase cyclic GMP levels were because they were increasing the production of nitric oxide from some endogenous precursor, perhaps by altering some redox pathway. We couldn’t prove that hypothesis because the technology was not there to measure nitric oxide in its oxidation products at animals or concentrations back in the 70’s. There were crude colorimetric assays. So to prove this took another seven or eight years of technology development before we and others were able to prove that it turned out to be the case. But we expected that nitric oxide was going to be an intracellular second messenger and that was heresy. And it was enough to show that it activates... a free radical activates an enzyme, now you're saying a free radical is a second messenger and it turned out to be true, we turned out to be right. And basically that’s the reason we went to Stockholm. Shortly after this Robert Furchgott, a vascular pharmacologist in New York, showed for the first time that a group of agents would relax vascular segments in the organ bath in the laboratory. Agents such as acetylcholine, histamine, bradykinin that were known to be hypotensive in man or animals had always failed to cause relaxation in the laboratory. He found, if he preserved the integrity of the endothelium in his blood vessel preparations, they would cause relaxation. And that was an exciting turn of events in 1980. I heard him present this work, he said that these substances caused the release of a factor from the endothelium which he called endothelium-derived relaxant factor, or EDRF, and had a half-life of only several seconds. I said: Bob, this is a reactive species, maybe a free radical, maybe it works in cyclic G, maybe it’s going to be related somehow to NO. Let’s figure this out. Well, we moved to Stanford, Bob went to New York, his wife developed breast cancer and that collaboration never took place. But a couple of years later we became impatient and moved on ourselves and showed that that hypothesis was in fact the case. This is a blood vessel precontracted with norepinephrine. And then after five or seven minutes we introduced an endothelial dependent vasodilator, acetylcholine, bradykinin, ATP ionophore, histamine etc. And if the endothelium is present, cyclic GMP levels increased within seconds, returned to basals and this is followed by relaxation in the muscle. But that only occurs if the endothelium is intact, if there’s no endothelium there’s no increase in cyclic G, no relaxation. So we knew by the early 1980s there were now two pathways converging on guanylyl cyclase to regulate cyclic GMP synthesis. The NO donors in the endothelial dependent vasodilator pathway. We spent a couple of years showing that this resulted in the activation of protein kinase G in vascular smooth muscle preparations. We then chased the phosphorylation of a variety of proteins with P32 incorporation. And to put all of the story together for you, it’s summarised on this slide. This cartoon represents a blood vessel with the endothelial lining on the left and the smooth muscle compartment on the right and in red are three categories of vasodilators that work by enhancing cyclic GMP production. The nitrovasodilators that are converted spontaneously based on pH oxygen tension etc. or the enzymatically converted, such as nitro-glycerine, to nitric oxide which activates the soluble guanylyl cyclase. Soluble guanylyl cyclase is a heterodimer with an alpha-beta-subunit and the beta-subunit has a heme prosthetic group at the histamine 105 position. The iron in that heme has to be ferrous, NO binds to the ferrous, changes the liganding of the heme to the beta-subunit which then talks to the catalytic domain down at the C-terminal, resulting in activation of the enzyme. The cyclic GMP activates a cyclic G dependent protein kinase. There are a couple of these, soluble and particulate that phosphorylate numerous proteins. These proteins regulate the concentration of cytosol calcium by altering distribution within the cell from stores or through channels in the membrane. And we know that the myosin light-chain kinase is a calcium calmodulin dependent enzyme. So when you decrease calcium, you decrease the kinase, myosin light-chain accumulates in the dephosphorylated state. If you take actin and myosin filaments, when you phosphorylate the myosin light-chain, they slide together for contraction. You dephosphorylate they slide apart and you get relaxation. Since this work it’s been shown that cyclic GMP also regulates the phosphatase activity perhaps. The endothelial dependent vasodilators do exactly the same thing; however, the receptors for these endothelial dependent vasodilators are only on the endothelial cells, not the smooth muscle cells. That’s why patients with arthrosclerosis and cardiovascular disease get direct acting NO donors, nitro-glycerine, nitroprusside etc. They don’t get endothelial dependent vasodilators because their endothelium is abnormal. And I’ll tell you more about that in a moment. But they produce EDRF, which we know is nitric oxide, to work through the same pathway. A third category are the atriopeptins. It was found some years ago by deBold that the granules and atria possess a peptide called atrial natriuretic factor and we found that that factor, atriopeptins and the family of these, activate the particulate isoforms of guanylyl cyclase and there are several of these. It turns out the particulate cyclases are receptor cyclases. For atriopeptins, guanylyl, e-coli enterotoxin etc. And by elevating cyclic G, they too will cause relaxation. Now, you can relax smooth muscle in other ways with agents that alter calcium, agents that increase cyclic AMP, phosphodiesterase inhibitors etc. These are the mechanisms in which you cause relaxation by enhancing cyclic GMP production. But you can start combining this information now to create novel combination therapies for various cardiovascular diseases and I’ll show you how to do that in a moment. There was some other very important observations along the way and I’m going to have to skip them. But it became apparent by the mid and late 1980s that there had to be a pathway that was making nitric oxide. People were finding nitride and nitrate in their condition media, people were finding arginine activation of the pathway. And it turns out indeed there’s a family of enzymes called nitric oxide synthases, very ubiquitous, found in most tissues. And there are 3 isoforms, initially called neuronal NOS, inducible NOS, endothelial NOS, the tissues which they were first purified and characterised. Because they’re so ubiquitous, I’ve suggested we call them NOS-1, 2 and 3 in the chronological order in which they were first characterised, purified, cloned. Very homologous, about 50% to 60% homology with each other. Some are soluble, some are particulates, lots of opportunity for post-translational modifications. Some are acylated with polmitate or myristate; many of them are phosphorylated by various kinases. A very complicated family. Normally this NOS-2 or inducible NOS is not found in tissues. You don’t see transcript or protein unless there’s been an inflammatory insult. So it’s become a biomarker of inflammation. You can enhance its production by anything that turns on the NF-kappaB pathway, endotoxin, pro-inflammatory cytokines, IO1, interfering gamma etc. And you make a lot of enzyme which is a high output production stage for nitric oxide that will participate in a lot of cytoxic and inflammatory processes. All of these enzymes catalyse this reaction. They oxidise the guanidino nitrogen of arginine. They oxidise the turtle guanidino nitrogen to an intermediate hydroxy arginine, further oxidised NO and citrulline. The enzymes are only active as homodimers. They have a heme prosthetic group. They require NADPH oxygen flavines, heme as a prosthetic group. Very complicated. If the bioptron is oxidised to the dihydro, it no longer makes NO but the enzyme now makes super-oxide, one of the worse things you can do in nitric oxide biology. So let me put this pathway together for you. We know now that various hormones and ligands will interact with their appropriate receptors to regulate various co-factors for the nitric oxide synthase pathways to convert arginine to nitric oxide and cytroline. This then activates soluble guanylyl cyclase to make cyclic GMP which activates a kinase and the cascade goes on to cause some processor event. We can influence this pathway in a variety of ways now with pharmacological tools. We have compounds that are receptor agonist and antagonist. We can modify the availability of the cofactors. We have compounds that are arginine analogues or guanidino analogues to block and inhibit the nitric oxide synthases. Some of these are in clinical trials for septic shock and inflammatory diseases. We can scavenge the NO not only with haemoglobin and monoglobin but also with various thiols that are also in clinical trials. There are compounds available that activate the cyclase without NO. We have a mutant enzyme that doesn’t require NO for gene therapy some day we think. You can also enhance the activation by NO or another gas, carbon monoxide, which is a weak activator in the presence of compounds, and there are inhibitors available as well. So we have tools now to begin to approach this system. But the system is a little bit more complicated than that, it always is. When you make nitric oxide, what it wants to do is activate guanylyl cyclase to make cyclic G, to inhibit platelet aggregation, to act as a neurotransmitter, to influence smooth muscle relaxation, all the beneficial sorts of things. However it can get oxidised to nitrite nitrate, it can form complexes with other transition metals. It will form complexes with various thiol groups and proteins. More than 100 proteins get nitrosated on the cysteine residues and one of the important pathways is the interaction of nitric oxide with superoxide anion. This reaction is almost diffusion limited. So whenever you’ve got either in contact with one another, that’s the reaction that will take place and it acts as a steal or a sink to pull it away from the cyclic G pathway. And you make peroxynitrite, which is even more toxic than nitric oxide or superoxide. Peroxynitrite will nitrate protein residues adjacent to the hydroxyl and tyrosines, perhaps sterically inhibiting or interfering with tyrosine kinase phosphorylation in some cases. So maybe the two systems are talking to each other. The tyrosine kinase pathway, the NO pathway, perhaps. There’s been very little evidence in vivo showing that, most of the evidence so far as been in vitro. There is an important disease called endothelial dysfunction. Many of us, certainly the older folks in this audience, have endothelial dysfunction, maybe not so many of the younger people yet. It occurs with hypertension, atherosclerosis, diabetes, tobacco use and perhaps obesity. In all of these disorders there’s oxidated stress, the formation of reactive oxygen species, hydrogen peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical and the tissue of blood vessels don’t make sufficient quantities of nitric oxide, for a variety of reasons and I’m not going to go through all the reasons. But the net outcome is your blood vessels don’t make enough NO. They tend to be vasoconstricted, you accelerate the atherosclerotic process. You diminish perfusion in diabetic ulcers and lesions. So it’s a vicious cycle, as you get more constricted more reactive oxygen species, less NO. It gets worse and worse. So you’ve got to interrupt it, you’ve got to treat the underlying disease and perhaps come along with some new approaches, perhaps arginine supplementation to make more NO, antioxidants to get rid of the reactive oxygen species. And there are a lot of clinical, a lot of annual studies to support that. There are some clinical studies. The clinical studies have been very controversial. Almost through here, another slide. The nitric oxide field is gone absolutely bananas. Our first paper on the biological effects was in 1977. Almost as many as cyclic AMP, more than G proteins and a lot of other things. It’s incredible. That is about 6,000 to 8,000 papers per year, in the last 5 to 10 year period. That’s 20 to 30 papers a day. There’s no one in the world to keep up with it. It’s very frustrating for all of us in the field. But it’s also very exciting to see this interest and enthusiasm. I’ve created a partial list for you, this slide and the next, to show you where this field is going to go I think in the next decade with regard to a novel drug development and how you can take these biochemical molecular targets that we and others have described and turn them around now in high throughput screens and other assays to find chemical leads to make new therapeutics. We know, as I said, that NO is participating as a neurotransmitter in the brain, in some regions of the brain, both centrally and peripherally. If you make a NOS-1 knockout mouse and induce a cerebral infarct, the size of the infarct is smaller. If you make a NOS-3 knockout mouse, induce an infarct, the infarct is bigger. If you do a double knockout, NOS-1 and NOS-3, the mouse is not very smart anymore, it can’t get through the water maze just to find the flow. So the participations of nitric oxide is transmitters in various regions, also with memory and we certainly haven’t figured all that out. We know it plays a role in fluid production and re-absorption, in the eye for glaucoma, retinal neuronal degeneration. We talked a lot about vasodilation; pulmonary hypertension was mentioned in the movie. It’s been exciting to see that develop. Premature babies maintained in in vivo circulation, they don’t need to profuse their lungs because they get their oxygen from the placenta from their mother. If they’re born prematurely, their blood vessels are constricted, their lungs are not developed, they need surfactant, you need to dilate those blood vessels and they shunt right to left, so they’re hypoxic babies. If you give them a little nitric oxide in the nasal catheter, they dilate the vessels, they don’t shunt quite as much, they become oxygenated. There’s been a marvellous improvement to eliminate the need for ECMO therapy, which is rather nasty. You all know about Viagra. It came out of this research, not us but we developed the concepts. We used to joke in the lab, we’ll fill condoms with vasodilators and NO donors and PD inhibitors, they work. Viagra is an inhibitor of the type 5 phosphodiesterase which is found predominantly in blood vessels, both in the corpus cavernosum as well as the systemic vessels. This is why patients who take Viagra and now take NO donors, nitro-glycerine, can get severe hypertension, arrhythmia, strokes etc. So one has to be careful, it’s not a street drug, it can get you in trouble. It participates in wound healing and angiogenesis, atherosclerosis. If you look at exhalation of NO in your breath, it’s a wonderful marker of the severity of asthma. The more inflammation in your lungs, the more induction of NOS-2, the more NO you make, the more NO in your breath, so the clinician can have you breathe into a bag or tube and if the NO is elevated, he knows that your asthma is out of control and he’ll readjust therapy. It’s been very useful. There are clinical studies for septic shock, platelet aggregation. We know that NO regulates genes, both up and down from micro array studies on cells. We’ve become very interested in stem cell biology, the last several years we know that nitric oxide and cyclic G influence embryonic human and mouse stem cell proliferation and differentiation. We think we can force cells into different lineages by playing games with NO and cyclic G. And there are other applications, this is only a partial list, we can’t do everything. Thank you very much.

Nachdem dieses Treffen so wunderbar angefangen hat, haben wir etwas über den Urknall gehört, und ich denke, dass das Thema des folgenden Vortrags ebenfalls als ein Urknall in der Biomedizin angesehen werden kann. Das war die Entdeckung von Stickstoffmonoxid. Es ist mir eine große Freude, Professor Ferid Murad aus Houston, Texas zu bitten, uns hier seinen Vortrag zu halten. die Stickstoffmonoxid als ein Signalmolekül im Herz-Kreislauf-System spielt. Professor Murad. Dies ist mein erster Besuch in Lindau. Es sieht nach einer sehr spannenden Gelegenheit sowohl für die Redner als auch für die Studenten aus, und ich werde diese Woche genießen, das kann ich Ihnen versichern. Kurz nachdem der Nobelpreis bekannt gegeben worden war, erhielt mein Büro zahlreiche Anrufe von den örtlichen Schulen, den High Schools und Colleges in Houston. Man bat mich, Vorträge zu halten und mit den Schülern zusammenzutreffen, und das tat ich. Aber es kamen enorm viele Nachfragen, und ich konnte nicht mehr mit ihnen Schritt halten. Daher fragte ich in der audiovisuellen TV-Abteilung im Texas Medical Center, ob man mir dabei helfen könne, ein Video zusammenzustellen. Heute Morgen wird es also Filme geben. Diese Abteilung ist wirklich eine sehr aufregende Abteilung. Sie erstellen Videos und Tonbänder für Patienten: wie sie mit ihren Kolostomiebeuteln zurechtkommen, wie sie mit ihren Nieren-Shunts für die Dialyse umgehen sollten usw. Wir setzten uns also zusammen und entwarfen einen Dialog. Wir tauschten viele Informationen untereinander aus. Schließlich kamen sie an einem Samstagmorgen zu mir nach Hause und wir drehten dieses Video, und ich denke, es wird Ihnen gefallen. Das Video wurde für Teenager erstellt, aber ich habe es auch Fünfjährigen und 85-Jährigen gezeigt, und allen scheint es zu gefallen, denn es ist Wissenschaft in Laiensprache, die Sie alle verstehen sollten. Lassen Sie uns also mit dem Video anfangen. Meine Güte, was soll das denn mit diesen ganzen Preisverleihungen? Und der Preisträger ist ... Herzlichen Glückwunsch. Ich bitte Sie jetzt nach vorne zu kommen und Ihren Nobelpreis in Empfang zu nehmen. Nobelpreis? Was ist denn das? Da bin ich überfragt. Was? Ihr wisst nicht, was der Nobelpreis ist? Dagegen müssen wir etwas unternehmen. Wow! Was ist denn das? Hey, Sie kommen einfach aus dem Fernseher! Das ist ja wie Aliens. Gestatten? Ja klar, warum nicht? Also - was haben Sie uns zu berichten? Nun, mein Name ist Ferid Murad. Ihr könnt mich Fred nennen. Ich bin Arzt und Forscher und Wissenschaftler an der University of Texas Medical School. Ach, und übrigens, ich habe 1998 den "Nobelpreis" für Medizin bekommen. Ok, was ist denn nun dieser "Nobelpreis"? Der Nobelpreis ist eine der größten Auszeichnungen der Welt, die man bekommen kann. Aha ... Er bedeutet Anerkennung durch andere Wissenschaftler. Und? Hm. Tja, man ist auf der ganzen Welt im Fernsehen. In Schweden gibt es eine große Feier. Man trifft sogar den König und die Königin von Schweden. Man bekommt eine goldene Medaille. Und dann ist da natürlich noch das Geld. Geld? Party? König und Königin? Ja. Vielleicht ist es besser, wenn ich es euch zeige. Darf ich? Mm ... na klar! Danke. Danke, Fred. Willkommen in meiner Welt der Wissenschaft und in meinem Labor. Wissen Sie, den Nobelpreis gäbe es nicht, wenn da nicht ... Dynamit gewesen wäre. Wie auch immer. Alfred Nobel, der schwedische Erfinder und Geschäftsmann, der die Nobelpreise erfand, war derjenige, der das Dynamit erfand. Nitroglycerin ist die explosive Chemikalie in Dynamit. Und obwohl es sehr gefährlich war, fand Herr Nobel einen Weg, um das Nitroglycerin so einzulagern, dass es für sinnvolle Zwecke verwendet werden konnte, zum Beispiel um Dinge zu bauen. Man könnte sagen, dass seine Erfindung die Welt erschütterte. Nitroglycerin hat jedoch noch andere Anwendungsbereiche. Als Nobel anfing, an Herzbeschwerden zu leiden, verschrieb ihm sein Arzt tatsächlich Nitroglyzerin für sein Herz. Aber Nobel sagte: "Auf keinen Fall." Also war die Sache für ihn "geplatzt". nicht gut für das Herz sein konnte. Niemand wusste, warum es wirkte. Aber das tat es. und er teilte sich 1998 den Nobelpreis für Medizin mit Dr. Robert Furchgott und Dr. Luis Ignarro, weil er die Antwort auf diese Frage herausfand. Sie sind also der Typ, der herausfand, dass Nitroglyzerin gut für das Herz ist? Äh, ja. Und? Und was? Und warum wirkt es? Wir versuchten die Frage zu beantworten, auf welche Art und Weise Nitroglyzerin bei Brustschmerz hilft. Ich führte Experimente durch, betrachtete die Ergebnisse und sammelte Daten. Dann fand ich heraus, ob, was ich dachte, richtig oder falsch war. Jedenfalls fand ich heraus, das Nitroglyzerin Stickstoffmonoxid freisetzt und dass Stickstoffmonoxid eine Menge wichtiger Dinge im Körper erledigt. Was ist denn Stickstoffmonoxid? Und was genau haben Sie herausgefunden, das Ihnen diesen "Nobelpreis" einbrachte? Lasst es mich euch zeigen. Es schützt das Herz. Es stimuliert das Gehirn. Es tötet Bakterien. Und es ist ein echtes Gas. Es ist Stickstoffmonoxid. Niemand kann zu NO nein sagen. Stickstoffmonoxid oder NO ist ein einfaches Molekül mit zwei Atomen, Stickstoff und Sauerstoff. Und ja, es ist ein farb- und geruchloses Gas. Eine wissenschaftliche Sensation fegt über die Welt. Stickstoffmonoxid ist überall. Im Zuge der Umweltverschmutzung durch Umweltgifte trägt es zur Zerstörung der Ozonschicht bei. Man findet es sogar in Autoabgasen und Zigarettenrauch. Aber kommen wir von der Superbedrohung zum Superhelden. Man findet Stickstoffmonoxid auch im menschlichen Körper und es hilft dabei, wichtige Signale zu senden, die nicht von unserem Sponsor stammen. Wenn Blut durch Ihre Blutgefäße fließt, dann setzt deren Innenverkleidung oder Ihr Endothel Stickstoffmonoxid frei. Stickstoffmonoxid signalisiert Ihren Blutgefäßen, dass sie sich entspannen und erweitern sollen. Und dann? Das wiederum führt zu einer Senkung des Blutdrucks, der Kraft, die das Blut auf die Gefäßwände ausübt. Wenn Ihre Blutgefäße genug Stickstoffmonoxid bilden, signalisiert dies Ihren Blutgefäßen, dass sie sich entspannen sollen. Dann fließt Ihr Blut weiter hindurch. Kein Problem. Aber wenn das Blut nicht hindurchfließt, bilden sich Blutklumpen. Dann ... (Herzinfarkt). Und das ist nicht alles! Entspannte Blutgefäße lassen also mehr Blut hindurchfließen und Stickstoffmonoxid kann Auswirkungen auf alle möglichen Bereiche des Körpers haben. Beispielsweise rettet Stickstoffmonoxid schon das Leben von zu früh geborenen Babys, die sehr kleine Dosierungen dieses Gases einatmen. Es hilft ihren Lungen und verbessert ihre Atmung. Und das ist gut! Bei Nervenzellen kann Stickstoffmonoxid das Gehirn stimulieren und damit Dinge wie das Verhalten und Benehmen beeinflussen. Oh, benimm dich, Baby! Als Teil des Selbstverteidigungssystems des Körpers verteidigt Stickstoffmonoxid uns auch gegen Tumorzellen und Bakterien. Es ist ein erstaunliches Zeug. Aber Stickstoffmonoxid ist nicht zum Lachen und sollte nicht mit Distickstoffoxid, besser bekannt als Lachgas, verwechselt werden. Ha-ha ... kann jemand bitte dieses Gas abstellen? Wie kommen Sie überhaupt auf das alles? Nun, mit der Zeit begann ich mich sehr dafür zu interessieren, wie Zellen miteinander reden. Aber die meisten anderen Wissenschaftler hielten das nicht für sehr wichtig. Dr. Murad fand heraus, dass, wenn Zellen miteinander reden, dies so ähnlich ist, als wenn eine Zelle einer anderen Zelle irgendwo im Körper eine E-Mail schickt. Und diese E-Mail ist das Gas Stickstoffmonoxid. Die E-Mail kann in eine andere Zelle einbrechen und die Arbeitsweise dieser Zelle übernehmen. Sie kann eine Botschaft enthalten, zum Beispiel die Anweisung an ein Blutgefäß, dass es sich entspannen soll. Oder sie kann eine andere Art von Anweisungen enthalten. Wenn die Botschaft beispielsweise an eine Krebszelle geschickt wird, kann es sein, dass das Stickstoffmonoxid den Krebs tötet und dann sich selbst zerstört. Hasta la vista, Baby. Stickstoffmonoxid bewirkt so viele Dinge in Ihrem Körper. Es ist, als hätte man in seinem eigenen Körper ein weltweites Internetsystem. Warum sind Sie überhaupt in die Wissenschaft gegangen? Nun, es macht wirklich viel Spaß, herauszufinden, wie solche Dinge funktionieren. Und man muss nicht brillant sein, um voranzukommen. Man muss nur Ziele haben und sich darauf einstellen, sehr hart zu arbeiten. Als Wissenschaftler kann man etwas zum ersten Mal tun, das kein anderer jemals getan hat. Und das ist spannend! Manchmal öffnet Ihre Entdeckung die Tür zu einer ganz neuen Art und Weise des Denkens und zu noch mehr neuen Entdeckungen. Das ist wirklich cool! Es ist so etwas wie die "Wissenschaftsolympiade" und das Ziel ist der Nobelpreis. Wissenschaftlerteams aus aller Welt treten gegeneinander an. Es macht Spaß. Wer wird als erster fertig sein? Wer wird den Preis gewinnen? Einer von euch könnte eines Tages ein Nobelpreisgewinner sein. Wer weiß? Hey! Ich habe noch ein paar Fragen! Ja, ich auch. Tja, ich glaube, wir müssen auf eigene Faust mehr herausfinden. Vielleicht finden wir etwas im Internet. Ja, und halte Ausschau nach Wissenschaft und dem Nobelpreis. Sie sind weg und haben noch etwas Popcorn übrig gelassen, oder? Mjam! Für mich fügte es sich sehr glücklich, dass ich, als das Programm in Cleveland startete, einer der ersten medizinischen Doktoranden in den USA war, und ich entschied irgendwie, dass es das war, was ich tun wollte. Ich war mir nicht sicher, wie ich zu der Entscheidung kam. Ich war begeistert von Chemie und Biologie. Ich glaube, mehr als alles andere war ich verwirrt. Und ich sagte, ich werde beides versuchen und schauen, in welche Richtung ich gehen sollte, und ich wurde süchtig danach und sitze seither auf diesem Zaun [zwischen Chemie und Biologie]. Meine Mentoren waren Earl Sutherland und Ted Rall. Ein Jahr, bevor ich in ihr Labor kam, hatten sie gerade ein zyklisches AMP (Adenosinmonophosphat) entdeckt. Was war das für eine aufregende Zeit für einen jungen Studenten! Die mir zugewiesene Aufgabe bestand darin, herauszufinden, wie Katecholamine, Adrenalin, die Produktion von zyklischem AMP in den Geweben reguliert und ob dies über den Beta-Adrenorezeptor oder den Alpha-Rezeptor geschieht. Dies war eine ziemlich einfache und in der Tat leichte Aufgabe. Allerdings war es eine außergewöhnlich spannende Zeit, in der wir erlebten, wie sich dieser ganze Bereich der Zellsignale und Botenstoffe herausbildete. All diese Hormone, die über diese Signalwege wirken, und all diese Medikamente, die entwickelt wurden, zu betrachten - das war es, wonach ich süchtig wurde: sekundäre Botenstoff-Systeme und Zellkommunikation. Zellkommunikation ist eigentlich ein altes Konzept, das wahrscheinlich vor mehr als 100 Jahren zum ersten Mal von Pawlow bekannt gemacht wurde. Wie Sie aus Ihren Psychologie-Kursen wissen, hatte Pawlow einen Patienten mit einer Schussverletzung am Bauch, bei dem sich eine Magen-Fistel bis nach außen entwickelte. Wann immer der Patient Nahrung sah oder roch, verstärkte dies die Magensaftsekretion. Pawlow war nun so clever, dass er bei Hunden Hautsäcke und Fisteln heranzüchtete. Er zeigte den Hunden Futter und auch bei ihnen verstärkte sich die Magensaftsekretion. Aber er entschloss sich, diese Hunde zu konditionieren, indem er eine Glocke läutete. Letztendlich musste er nur eine Glocke läuten und bei den Hunden verstärkte sich die Sekretion, ohne dass er ihnen Futter zeigen musste. Dies sagte ihm, dass das Gehirn mit dem Magen sprach, dass Zellen miteinander kommunizieren. Natürlich wissen wir heute, dass viele Zellen und Gewebe im Körper miteinander kommunizieren. Das wird hier für Sie in diesem Cartoon, in diesem ersten Dia zusammengefasst. Dies stellt drei verschiedene Zellpopulationen dar, die miteinander sprechen werden. Sie können jede Art von Zellen sein, aber ich werde Zelle 1 eine Nervenzelle nennen. Sie kann ein zentrales oder ein peripheres Neuron sein. Zelle 2 werde ich eine Endothelzelle nennen, die ein Blutgefäß auskleidet, und Zelle 3 werde ich eine glatte Muskelzelle in der Wand jenes Blutgefäßes nennen. Zelle 1 möchte mit Zelle 2 und auch mit Zelle 3 sprechen. Und sie tut das, indem sie Moleküle produziert, die Earl Sutherland als primäre Botenstoffe bezeichnete. Heute bezeichnen wir sie als Hormone, wir bezeichnen sie als Zytokine, wir bezeichnen sie als Wachstumsfaktoren, wir bezeichnen sie als eine Vielzahl von Dingen, parakrine Substanzen, Autakoide usw. Sie kommen in verschiedenen Formen und Größen und Arten aromatischer Verbindungen vor. Einige sind kleine Aminosäuren, andere sind große Moleküle wie die Herztroponine. Wichtig ist für uns hier, dass sie in den interstitiellen Raum, in den Blutstrom ausgeschüttet werden und zielgerichtet durch den Körper wandern, um ihr Ziel zu finden. Sie finden ihre Zielzelle mithilfe eines Makromoleküls in ihrer Membran, das wir als einen Rezeptor bezeichnen. Manchmal befinden sich diese Rezeptoren im Inneren der Zelle, wie bei Steroiden und Schilddrüsenhormonen, aber in den meisten Fällen handelt es sich um Transmembran-Proteine, integrale Membranproteine auf der Oberfläche der Membran. Diese Liganden oder primären Botenstoffe interagieren mit ihren entsprechenden Zellen, die die einzigen mit diesen Rezeptoren sind. Das ist der Punkt, an dem sich die Spezifität der Reaktion ereignet. Sie passen konformativ zueinander, wie ein Schlüssel in ein Schloss. Und sie "stören" nur die Zellen, die über den entsprechenden Rezeptor verfügen. Der Ligand muss nicht unbedingt in das Innere der Zelle gelangen, um zu bewirken, dass die biochemische Kaskade in einer physiologischen Antwort resultiert. Sie können einfach mit dem Rezeptor interagieren, sie zwicken ihn ein bisschen und auf einmal, voilà, haben wir viele verschiedene intrazelluläre sekundäre Botenstoffe, die sich ansammeln. Der erste dieser sekundären Botenstoffe war zyklisches AMP. Sutherland und Rall entdeckten Folgendes: Auf diese Art und Weise regulierten Glukagon und Epinephrin den Abbau von Glykogen in der Leber. Wir wissen heute, dass viele Signalwege sich dieses Botenstoffs bedienen. Wir wissen auch, dass es neben zyklischem AMP noch andere sekundäre Botenstoffe gibt: zyklisches GMP (Guanosinmonophosphat), Kalzium, Diacylglycerin, Stickstoffmonoxid. Und während es Hunderte und Hunderte von primären Botenstoffen gibt, kennen wir nur eine bescheidene Anzahl von intrazellulären sekundären Botenstoffen. Heute sind es vielleicht nicht mehr als ein Dutzend, aber ich bin sicher, dass es in der Zukunft mehr sein wird. Diese sekundären Botenstoffe sammeln sich an und führen innerhalb der Zelle die Funktion aus, die von diesem primären Botenstoff zur Zelloberfläche gebracht worden war. Das Einzigartige an Stickstoffmonoxid als einem intrazellulären sekundären Botenstoff ist, dass es ein Gas ist. Es ist ein freies Radikal mit einem ungeteilten Elektron und ein sehr einfaches Molekül. Und da es ungeladen ist, der physiologische pH-Wert, wie alle anderen Botenstoffe, durchquert es die Membranen sehr viel schneller als die anderen Botenstoffe, die oft Energie oder ein Transportmittel benötigen, um das zu tun. Stickstoffmonoxid reguliert also nicht nur die Biochemie der Zelle, in der es produziert wurde, sondern es kann sie auch verlassen und ein paar hundert Ångström, Mikrometer, wandern, um angrenzende Zellen zu regulieren und zu veranlassen, dass sie andere sekundäre Botenstoffe wie zyklisches GMP produzieren. Es ist also ein ganz einzigartiges Botenstoff-Molekül. Meines Wissens ist es der einzige Botenstoff, der intrazellulär ebenso funktioniert wie extrazellulär. Es kann eine parakrine Substanz sein, ein lokales Autakoid. Es kann sich mit anderen Trägern verbinden, Glutathion, Thiole, Albumin, andere Proteine, und über eine Entfernung transportiert werden, um dort wieder freigesetzt zu werden und als Hormon zu wirken. Keine anderen Botenstoffe können das. Stickstoffmonoxid ist ein sehr altes Molekül, und ich habe eine Theorie, dass es auch an der Evolution beteiligt war. Wahrscheinlich war es eines der ersten Botenstoff-Moleküle vor drei Milliarden Jahren, als die Zellen begannen, miteinander zu kommunizieren. Allerdings werde ich diese Geschichte nicht vertiefen, da die Zeit dies nicht erlaubt. Heute wissen wir jedoch, dass es als Schadstoff von großer Bedeutung ist. Dadurch wurde es vor ungefähr 50 oder 60 Jahren bekannt, als offenkundig wurde, dass alle fossilen Brennstoffe bei der Verbrennung mit Sauerstoff eine Familie von Stickstoffoxiden produzierten, NO, NO2, N2O3 usw. Alle diese Stickstoffoxide interagieren mit Ozon und führen zum Abbau der Ozonschicht und sind zusammen mit den Treibhausgasen verantwortlich für die globale Erwärmung. Aber ich werde Ihnen sagen, dass Stickstoffmonoxid nicht nur ein Umweltschadstoff, sondern auch das Wirkprinzip einiger sehr wichtiger Herz-Kreislauf-Medikamente und ein Botenstoff-Molekül von großer Bedeutung im Körper ist. Und dies ist nur eine unvollständige Liste der Biologie, die es reguliert. Die Liste ist sehr, sehr viel länger als das. Sie beinhaltet Muskelentspannung, Blutplättchenaggregation, die Erektion des Penis, die Tötung von Parasiten und Mikroorganismen - und die Liste geht weiter und weiter. Auf einiges davon werden wir in Kürze zurückkommen. Im Jahr 1963, sieben oder sechs Jahre nach der Entdeckung des zyklischen AMP, entdeckten ein paar Chemiker zum ersten Mal zyklisches GMP, ein weiteres zyklisches Nukleotid und ein Cousin des zyklischen AMP. Man verschiebt einfach die Amino-Gruppe auf dem Purin-Ring und hat eine andere Struktur. Man verabreichte Ratten anorganisches P32-Phosphat und fand in ihrem Urin zwei wichtige organische Phosphate, zyklisches AMP und zyklisches GMP. Dies war der erste Nachweis von zyklischem GMP als ein natürliches Produkt. Das veranlasste einige Labore, sich für zyklisches GMP zu interessieren und nach Enzymen zu suchen, die es herstellten, Enzyme, die es hydrolysierten usw. Und die Geschichte entwickelte sich in den späten 1960er, frühen 1970er Jahren, als ich gerade meine Ausbildung beendete und mich darauf vorbereitete, mich der Fakultät an der University of Virginia anzuschließen. Wir wissen heute, dass es eine Familie von Enzymen gibt, die Guanylylzyklasen genannt werden. Es gibt mindestens sieben oder acht Mitglieder dieser Familie und wir glauben, dass es mit den Spleißvarianten, die wir zur Zeit isolieren, sogar noch mehr sein werden. Alle diese Enzyme wandeln GTP (Guanosintriphosphat) zu zyklischem GMP und Pyrophosphat um. Die Reaktion ist in hohem Maße analog, wenn man eine OH-Zyklase hinzufügt, die ATP (Adenosintriphosphat) zu zyklischem AMP und Pyrophosphat umwandelt. In der Tat sind die katalytischen Domänen aller Zyklasen homolog, mit der Veränderung von einer oder zwei Aminosäuren, ein Enzym kann das andere Nukleotid produzieren. Das zyklische GMP kann durch eine Familie von Phosphodiesterasen inaktiviert werden. Diese Gen-Familie umfasst mindestens zehn oder elf Mitglieder. Sie hydrolysieren die Phosphodiester-Bindung, um das zyklische Nukleotid in das entsprechende Monophosphat umzuwandeln, entweder 5'-GMP oder 5'-AMP, und es wird inaktiv. Wie Sie im Laufe der Woche von Dr. Fischer hören werden, aktivieren viele der intrazellulären sekundären Botenstoffe, zyklisches AMP, zyklisches GMP, Diacylglycerin, Kalzium usw., häufig eine Proteinkinase, die dann eine Reihe von Protein-Substraten phosphoryliert, indem sie das Gamma-Phosphat von ATP zu einem Serin-Threonin-Rest oder vielleicht einem Tyrosin-Rest überträgt. Man hat mir gesagt, dass wir nun nicht weniger als 500 oder 600 Proteinkinasen kennen. Das Konzept der Zellkommunikation ist ziemlich einfach: Ein Ligand oder Hormon reguliert die Produktion des sekundären Botenstoffs, der dann die Proteinkinase reguliert, die ein Protein phosphoryliert. Das Problem besteht nun darin, dass die Matrix ziemlich brenzlig vertrackt wird, wenn man alle Zyklasen, die Diastasen, die Proteinkinasen und die vielen Proteine berücksichtigt, die phosphoryliert werden können. Wenn diese Proteine phosphoryliert werden, dann verändert sich, wie Sie von Dr. Fischer hören werden, ihre Konformation. Wenn es sich um Strukturproteine handelt, können sie die Motilität und andere Prozesse, die Kontraktilität, beeinflussen. Wenn es sich um Enzyme handelt, werden sie aktiviert oder gehemmt. Als sich nun diese Geschichte mit dem zyklischen GMP entfaltete, beschloss ich, mich vom zyklischen AMP abzuwenden und mein Interesse auf das zyklische GMP zu verlagern. Für ein neues, junges Fakultätsmitglied war in den frühen 1970er Jahren meiner Ansicht nach das Forschungsgebiet des zyklischen AMP ziemlich überfüllt, mit großen Gruppen von Leuten überall auf der Welt. Ich dachte nicht, dass ich mit all diesen großen Laboren konkurrieren könnte, und da sich das Gebiet des zyklischen GMP herausbildete, sagte ich, dass ich in diese neue Richtung gehen würde. Ich wollte zwei Fragestellungen angehen. Wir wussten, dass ein paar Hormone die Anreicherung von zyklischem GMP in einigen Geweben steigern konnten - Acetylcholin bei Herzpräparaten, Prostaglandine bei Gefäßpräparaten -, aber wir kannten den molekularen Mechanismus der Kopplung nicht. Wenn wir die Bindung des Liganden an den Rezeptor und die Kopplung an die Guanylylzyklase, um zyklisches GMP zu produzieren, verstehen würden, könnten wir vermutlich diesen Kopplungsprozess mit verschiedenen Chemikalien und Medikamenten beeinflussen, um eine Hormonreaktion zu verstärken oder zu blockieren, und vielleicht sogar ein paar neue Therapien für verschiedene endokrinologische Erkrankungen zu entwickeln. Das war ziemlich vernünftig. Das zweite Problem bestand darin, dass wir, obwohl zyklisches GMP ein natürliches Produkt war, keine Ahnung hatten, was es tat oder worin seine Funktion bestand. Wir begannen also unsere Studien, indem wir das Enzym, das zyklisches GMP produziert, detailliert untersuchten. Die erste große Überraschung war, dass es sich nicht um ein einzelnes Enzym, sondern um ein paar Enzyme handelte. Die Enzymaktivität war in löslichen Fraktionen wie auch in partikulären Fraktionen vorhanden. Die kinetischen Eigenschaften dieser Isoforme waren unterschiedlich. Ich vermutete, dass es Isoforme geben würde. Ich hatte mir gedacht: Falls es verschiedene Abteilungen und Isoforme von Guanylylzyklasen gibt, werden sie vielleicht von verschiedenen Gruppen von Hormonen reguliert - wäre es nicht ein tolles Projekt, das zu klären und zu sortieren? Viel davon erwies sich als echte Intuition zu jener Zeit. Der Beweis, dass wir es mit Isoformen zu tun hatten, erforderte viel Arbeit. Wir mussten diese löslichen und partikulären Aktivitäten purifizieren, sie klonen, exprimieren und erneut untersuchen. Wir taten dies, und die Arbeit dauerte zwölf oder 15 Jahre. Aber zunächst nahm ich eine Abkürzung. Ich sagte: Die Kooperativität des partikulären Isoforms - im Gegensatz zur typischen Michaelis-Menten-Kinetik des löslichen Isoforms - konnte ein Artefakt sein, da es sich um krude Präparate handelte, die Nukleotidasen, Phosphatasen, Phosphodiesterasen enthielten. Wir erstellten also einen Cocktail und fügten ihn unseren Inkubationen hinzu, um alle diese konkurrierenden Pfade zu hemmen. Wir erstellten einen Cocktail aus Pyrophosphat, Fluor, Azid, Hydroxylamin, Natriumnitrit, Methylxanthine etc. und rein zufällig - wie es in der Wissenschaft häufig der Fall ist - fanden wir Verbindungen, die das Enzym aktivierten. Während es unser Ziel war, die Hormonregulation zu verstehen, konnte uns das nicht gelingen, denn sobald wir die Gewebe störten, ging die Hormonbindung verloren. Extrakte des Enzyms wurden durch Hormone nicht mehr aktiviert. Die kleinen Moleküle wurden jedoch aktiviert, und vielleicht konnten sie unser Ersatz für das Verständnis der hormonalen Steuerung sein. Ähnlich wie Fluor eine wertvolle Ressource für das Verständnis der hormonellen Regulation der Adenylatzyklase war. Die aktivierenden Verbindungen waren Azid, Hydroxylamin und Natriumnitrit. Und um eine lange Geschichte kurz zu fassen: die Wirkungen des Azids waren von Sauerstoff abhängig, wurden durch Thiole verstärkt und zeichneten sich durch eine lange Zeitverzögerung aus, bevor die Reaktionsrate ihr Maximum erreichte. Sie waren gewebespezifisch, denn Gewebe besaßen Inhibitoren und Aktivatoren des Stoffwechselweges. Und wir waren davon überzeugt, dass diese Aktivatoren Vorläufer von Pro-Pharmaka waren, die in unseren Inkubationen zu etwas anderem umgewandelt wurden, und es wurde mehrere Jahre lang zu einer ziemlich geheimnisvollen Geschichte, welcher Aktivator das sein würde. Wir fügten Azid und Hydroxylamin und Nitrit zu Zellkulturen in Geweben hinzu. Und tatsächlich führten sie zu einer Erhöhung der Konzentration von zyklischem GMP und sie aktivierten außerdem die Enzyme und Extrakte. Sie würden also in beiden Systemen funktionieren. Eines der Gewebe, mit denen wir - wiederum zufälligerweise - arbeiteten, war glatte Muskulatur der Luftröhre. Als Student lernte ich, dass zyklisches AMP die glatte Muskulatur entspannt, die glatte Muskulatur der Gefäße und Luftwege. Und ich dachte, dass zyklisches GMP vielleicht ein Gegenspieler von zyklischem AMP sein könnte. Wir fertigten also eine Zubereitung aus glatter Muskulatur an, die relativ homogen war, um einige biochemische Tests daran durchzuführen und einen Physiologen dafür zu konsultieren. Wir fügten diesen Zubereitungen aus glatter Muskulatur Azid hinzu, der Spiegel des zyklischen GMP stieg an, doch die Muskeln kontrahierten sich nicht, sie entspannten sich. Dies war das Gegenteil von dem, was zu erwarten war. Die Dosis-Reaktions-Kurven, die Zeitverläufe: alles sagte uns, dass Azid ein Entspannungsmittel glatter Muskulatur war, das seine Wirkung durch zyklisches GMP vermittelte, und so funktioniert es, und das war die erste physiologische Funktion von zyklischem GMP. Wir sagten: diese Mittel führen zu einer Entspannung und zur Erhöhung von G. Worin besteht die Wirkung der anderen Entspannungsmittel der glatten Muskulatur? Von Nitroglycerin, das man schon seit etwa 100 Jahren kannte, von Nitroprussid, einer Menge der Medikamente, die auf Intensivstationen für Erkrankungen der Herzkranzgefäße beliebt sind? Sie senkten den Gefäßwiderstand, senkten den Blutdruck von Infarktpatienten usw. Wir fügten sie unseren Zubereitungen hinzu, und sie führten erwartungsgemäß zu einer Entspannung der Muskulatur. Überraschend war, dass sie die Konzentration des zyklischen GMP ansteigen ließen. Wir verfügten nun also über eine Familie von Verbindungen, die wir als NO-Pharmaka (nitrovasodilators) bezeichneten und die in zellfreien Zubereitungen Guaninzyklase aktivieren und in verschiedenen Geweben die Konzentration von zyklischem GMP anheben konnten. Zu diesen Verbindungen gehörten Hydroxylamin, Azid, Natriumnitrit, einige Hydrazine, Nitroglycerin, Nitroprussid, Nitrosoharnstoffe, Nitrosamine sowie eine lange Liste anderer Verbindungen, die alle Donoren von Stickstoffmonoxid (NO) waren. Sie alle enthalten Stickstoff. Einige von ihnen wandelten sich spontan um, basierend auf Redox- und pH-Inkubationen. Einige von ihnen werden nicht im Körper umgewandelt, Azid erfordert eine Katalase-Konversion. Und wir überlegten uns, dass die Zwischenstufe aller dieser Pro-Pharmaka oder Vorstufen Stickstoffmonoxid sein musste. Der Grund, warum wir dachten, es sei Stickstoffmonoxid, war folgender: Weil die Gewebespezifität von Azid teilweise durch das Vorhandensein von Hämoglobin und Myoglobin in unseren Gewebeextrakten beeinflusst wurde. Dies waren Inhibitoren. Wir wussten aus der Literatur, dass NO eine hohe Affinität zur prosthetischen Hämgruppe von Hämoglobin, Myoglobin, hat. Also zogen wir den Schluss, dass alle diese Pro-Pharmaka oder Vorstufen in Stickstoffoxid umgewandelt wurden. Wenn wir durch chemische Reaktionen Stickstoffoxid im Laborabzug erzeugten, Natriumnitrit, Eisen(II)-Sulfat, Schwefelsäure, und das Gas in unsere Zubereitungen ventilierten, wurde jede von ihnen aktiviert. Was für eine spannende Zeit das war! Der erste Beweis dafür, dass ein freies Radikal ein Enzym aktivieren konnte. Und ich dachte, das würde eine sehr interessante Chemie sein. Viele Leute waren skeptisch. Sie alle hielten freie Radikale und Stickstoffoxide für schädliche Verbindungen und giftige Stoffe, doch es bestand kein Zweifel daran: Sie hatten eine aktivierenden Wirkung. Einige Leute hielten mir entgegen: Murad, du inhibierst einen Inhibitor. Du führst in deinen primitiven Zubereitungen eine Aufhebung der Inhibition durch. Also mussten wir die Enzyme bis zur Homogenität reinigen, und wenn wir die Konzentration vornahmen, wurde die Menge des zur Aktivierung benötigen Stickstoffmonoxids geringer und immer geringer, noch niedriger, als wir Stoffe aus unserer Inkubation entfernten, die NO absaugten und verschluckten. Übergangsmetalle, Thiole, Protein saugten NO auf, wissen Sie. Nanomolare Konzentrationen von NO führten zu einer Aktivierung des Enzyms, und der Vmax-Wert stieg um das 200- bis 400-fache an, wie sie auch den Km-Wert für GTP senkten. So erkannten wir, dass wir den Wirkungsmechanismus der NO-Pharmaka (nitrovasodilators) herausgefunden hatten, wie etwa von Nitroglycerin, das seit 100 Jahren klinisch verwendet wurde. Findet man als Pharmakologe ein exogenes Material, das in einem biologischen System etwas bewirkt, sollte man sich fragen: Imitiert es einen natürlichen Stoffwechselpfad, der bereits existiert, sowie: Arbeitet es durch einen ähnlichen Mechanismus? Daher schlug ich in einer Buchbesprechung in den späten siebziger Jahren vor, dass die Wirkung verschiedener Hormone, d. h. die Erhöhung der Konzentration des zyklischen GMP, vielleicht darauf zurückzuführen sei, dass sie die Produktion von Stickstoffmonoxid über irgend einen endogenen Vorläufer verstärkte, möglicherweise dadurch, dass sie einen Redox-Stoffwechselweg änderten. Wir konnten diese Hypothese nicht überprüfen, weil in den siebziger Jahren die Technologie noch nicht vorhanden war, um Stickstoffmonoxid in seinen Oxidationsprodukten oder bei Tieren oder Konzentrationen zu messen. Es gab primitive kalorimetrische Untersuchungen. Dies zu beweisen erforderte sieben oder acht Jahre technologischer Entwicklung, bevor wir selbst oder andere zeigen konnten, dass es sich so verhielt. Doch wir erwarteten, dass Stickstoffmonoxid ein sekundärer, intrazellulärer Messenger war, und das war Häresie. Und es genügte zu zeigen, dass es aktiviert ... Ein freies Radikal aktivierte ein Enzym. Nun sagte man, dass ein freies Radikal ein sekundärer Messenger war, und es erwies sich als wahr, es zeigte sich, dass wir Recht hatten. Und im Wesentlichen ist das der Grund, warum wir nach Stockholm kamen. Wenig später zeigte Robert Furchgott, ein Gefäßpharmakologe aus New York, erstmals, dass eine Gruppe von Wirkstoffen Gefäßsegmente in einem Organbad im Labor entspannte. Von Wirkstoffen wie zum Beispiel Acetylcholin, Histamin, Bradykinin war bekannt, dass sie beim Menschen oder in Tierversuchen den Blutdruck senkten. Im Labor hatten sie jedoch niemals eine Entspannung bewirkt. Er stellte fest, dass diese Stoffe, wenn er die Integrität des Endothels in seinen Blutgefäßversuchsanordnungen bewahrte, eine Entspannung verursachte. Und das war 1980 ein aufregendes neues Ereignis. Ich hörte ihm zu, als er seine Arbeiten vorstellte. Er sagte, dass diese Substanzen die Abgabe eines Faktors aus dem Endothel bewirkten, den er EDRF (endothelium-derived relaxant factor) nannte. Er hatte eine Halbwertszeit von nur ein paar Sekunden. Ich sagte: Bob, dies ist eine reaktive Spezies, vielleicht ein freies Radikal. Vielleicht funktioniert es bei zyklischem G, vielleicht stellte es sich als irgendwie mit NO verwandt heraus. Lass uns der Sache auf den Grund gehen. Nun ja, wir gingen nach Stanford, Bob zog nach New York. Seine Frau bekam Brustkrebs, und diese Zusammenarbeit kam nie zustande. Doch einige Jahre später wurde ich ungeduldig, und ich ging der Sache selbst nach und zeigte, dass diese Hypothese tatsächlich zutraf. Dies ist ein Blutgefäß, das zuvor mit Norepinephrin kontrahiert wurde. Und dann gaben wir nach fünf oder sieben Minuten eine vom Endothel abhängige, gefäßerweiternde Substanz hinzu: Acetylcholin, Bradykinin, ATP-Ionophor, Histamin etc. Und wenn das Endothel vorhanden war, stiegen die Werte für zyklisches GMP innerhalb von Sekunden an, gingen wieder auf die Basiswerte zurück, und anschließend entspannte sich der Muskel. Doch dies geschieht nur, wenn das Endothel intakt ist. Wenn kein Endothelium vorhanden ist, kommt es zu keinem Anstieg des zyklischen G, zu keiner Entspannung. Wir wussten also in den frühen 1980er Jahren, dass es zwei Stoffwechselpfade gibt, die in der Guanylylzyklase konvergieren, um die Synthese von zyklischem GMP zu steuern: die NO-Donoren im endothelabhängigen Stoffwechselpfad zur Gefäßerweiterung. Wir verbrachten einige Jahre damit zu zeigen, dass dies in Zubereitungen des glatten Muskels der Blutgefäße zur Aktivierung der Proteinkinase G führt. Anschließend untersuchten wir die Phosphorylierung einer Vielzahl von Proteinen mit Hilfe der Einfügung von P32. Um die verschiedenen Teile der Geschichte für Sie zusammenzufassen, sind sie auf dem folgenden Dia übersichtlich dargestellt. Dieser Cartoon stellt ein Blutgefäß dar, mit der Endothelauskleidung auf der linken Seite und dem Anteil des glatten Muskels auf der rechten Seite. In rot sind drei Kategorien von gefäßerweiternden Substanzen dargestellt, die eine Verstärkung der Produktion von zyklischem GMP bewirken: die NO-Pharmaka (nitrovasodilators), die aufgrund der pH-Sauerstoff-Spannung etc. spontan umgewandelt werden, wie etwa Nitroglycerin, bis zu Stickstoffmonoxid, das die lösbare Guanylylzyklase aktiviert. Die lösbare Guanylylzyklase ist ein Heterodimer mit einer Alpha-Beta-Untereinheit, und die Beta-Untereinheit verfügt über eine prosthetische Gruppe in der Histamine-105-Position. Das Eisen in diesem Häm muss zweiwertig sein, NO bindet sich an diesen doppelwertigen Liganden, ändert die Bindung des Häm an die Beta-Untereinheit, die dann mit der katalytischen Domäne unten am C-Terminal kommuniziert, was zu einer Aktivierung des Enzyms führt. Das zyklische GMP aktiviert eine zyklische, G-abhängige Proteinkinase. Es gibt zwei von diesen: eine lösbare und eine partikelförmige, die zahlreiche Proteine phosphorylieren. Diese Proteine regulieren die Konzentration von Kalzium im Zytosol, indem sie die Verteilung innerhalb der Zelle aus Vorräten oder durch Kanäle in der Membran ändern. Und wir wissen, dass die Myosin-leichte-Ketten-Kinase ein von Kalzium/Calmodulin abhängiges Enzym ist. Wenn man die Kalziummenge reduziert, verringert man die Kinase, Myosin-leichte-Ketten sammeln sich im dephosphorylierten Zustand an. Wenn man die Aktin- und Myosin-Filamente nimmt, wenn man Myosin-leichte-Ketten phosphoryliert, gleiten sie zur Kontraktion aneinander vorbei. Wenn man Myosin-leichte-Ketten dephosporyliert, kommt es zur Entspannung. Seit dieser Arbeit ist gezeigt worden, dass zyklisches GMP möglicherweise auch die Phosphatase-Aktivität reguliert. Die vom Endothel abhängigen, gefäßerweiternden Substanzen tun genau dasselbe. Die Rezeptoren für diese vom Endothel abhängigen, gefäßerweiternden Substanzen befinden sich jedoch nur auf den Endothelzellen, nicht auf den Zellen der glatten Muskulatur. Das ist der Grund dafür, warum Patienten mit Arteriosklerose und Erkrankungen der Herzkranzgefäße direkt wirkende NO-Donoren verabreicht werden: Nitroglyzerin, Nitroprussid etc. Sie erhalten keine vom Endothel abhängige, gefäßerweiternden Substanzen, weil ihr Endothel nicht normal ist. Ich werde Ihnen sogleich mehr darüber erzählen. Doch sie produzieren EDRF, von dem wir wissen, dass es sich dabei um Stickstoffmonoxid handelt, um über denselben Stoffwechselweg zu arbeiten. Eine dritte Gruppe sind die Atriopeptine. DeBold stellte vor einigen Jahren fest, dass die Granulate und Atria über ein als atrialen natriuretischen Faktor bezeichnetes Peptid verfügen, und wir haben herausgefunden dass dieser Faktor, die Atriopeptine und die Familie dieser Substanzen die partikelförmigen Isoformen der Guanylylzyklase aktivieren, und es gibt mehrere von diesen. Es hat sich herausgestellt, dass die partikelförmigen Zyklasen Rezeptorzyklasen sind, für Atriopeptine, Guanylyl, e-coli-Enterotoxin etc. Und durch die Erhöhung der Konzentration von zyklischem G führen auch Sie zu einer Entspannung. Nun, man kann glatte Muskulatur auch auf andere Weise entspannen: mit Wirkstoffen, die die Kalziumkonzentration ändern, die Konzentration von zyklischem AMP ändern, mit Phosphodiesterase-Inhibitoren etc. Dies sind die Mechanismen, bei denen man durch die Verstärkung der Produktion von zyklischem GMP eine Entspannung herbeiführt. Man kann nun jedoch darangehen, diese Informationen zu kombinieren, um für verschiedene Erkrankungen der Herzkranzgefäße neuartige Kombinationstherapien zu konzipieren, und ich werde Ihnen gleich zeigen, wie man das macht. Es gab noch einige andere sehr wichtige Beobachtungen während unserer Arbeit, aber ich werde sie übergehen müssen. Um die Mitte und gegen Ende der 1980er Jahre wurde jedoch deutlich, dass es einen Stoffwechselweg geben musste, der Stickstoffmonoxid produziert. Die Leute fanden Nitrid und Nitrat in ihren Medien, die Leute fanden die Argininaktivierung des Stoffwechselweges. Und es stellte sich heraus, dass es tatsächlich eine Familie von Enzymen gibt, die man als Stickstoffoxid-Synthasen bezeichnet, die fast allgegenwärtig und in den allermeisten Geweben zu finden sind. Und es gibt drei Isoformen, die ursprünglich als neuronale NOS, induzible NOS und endotheliale NOS bezeichnet wurden, nach den Geweben, aus denen sie zuerst in reiner Form gewonnen und dann beschrieben wurden. Da sie so weit verbreitet sind, habe ich vorgeschlagen, dass wir sie als NOS-1, -2 und -3 bezeichnen, gemäß der chronologischen Reihenfolge, in der sie zuerst beschrieben, in reiner Form gewonnen und dann geklont wurden. Sie sind sehr homolog. Die Homologie zwischen ihnen beträgt etwa 50-60 %. Einige von ihnen sind löslich, andere liegen partikelförmig vor. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten für post-translationale Modifikationen. Einige von ihnen werden mit Polmitat oder Myristat acyliert. Viele von ihnen werden durch verschiedene Kinasen phosphoryliert. Eine sehr komplizierte Familie. Normalerweise ist dieses NOS-2 oder induzibles NOS in Geweben nicht zu finden. Man sieht keine Transkription oder kein Protein, sofern keine Entzündung aufgetreten ist. So wurde es zu einem Biomarker für Entzündungen. Sie können ihre Produktion durch alles verstärken, das zu einer Aktivierung des NF-kappaB-Stoffwechselpfades führt: Endotoxin, proinflammatorische Zytokinen, IO1, Interferon Gama etc. Und sie erzeugen sehr viel Enzym, bei dem es sich um ein Produktionsstadium für Stickstoffmonoxid mit hohem Output handelt, das an vielen zelltoxischen und entzündlichen Prozessen beteiligt ist. Alle diese Enzyme katalysieren diese Reaktion: sie oxidieren den Guanidino-Stickstoff von Arginin. Sie oxidieren den Schildkröten-Guanidino-Stickstoff zu einem Hydroxy-Arginin-Zwischenprodukt, und oxidieren außerdem NO und Citrullin. Diese Enzyme sind nur als Homodimere aktiv. Sie verfügen über eine prosthetische Hämgruppe. Sie benötigen NADPH-Sauerstoff-Flavine, Häm als prosthetische Gruppe. Sehr kompliziert. Wenn das Bioptron zu Dihydro oxidiert wird, produziert es kein NO mehr, sondern das Enzym produziert jetzt Superoxid, eines der schlimmsten Dinge, die man in der Stickstoffoxid-Biologie tun kann. Lassen Sie mich also diesen Stoffwechselpfad für Sie zusammensetzen. Wir wissen jetzt, dass verschiedene Hormone und Liganden mit ihren entsprechenden Rezeptoren zusammenarbeiten werden, um unterschiedliche Co-Faktoren für die Stoffwechselpfade der Stickstoffoxid-Synthase zu regulieren, um Arginin in Stickstoffoxid und Cytrolin umzuwandeln. Dies aktiviert dann die lösliche Guanylylzyklase, um zyklisches GMP zu produzieren, das eine Kinase aktiviert, und die Kaskade läuft weiter, um irgendein Prozessorereignis zu verursachen. Mit Hilfe pharmakologischer Werkzeuge können wir diesen Stoffwechselweg auf vielfache Weise beeinflussen. Wir haben Verbindungen, bei denen es sich um Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten handelt. Wir können die Verfügbarkeit der Co-Faktoren ändern. Wir verfügen über Verbindungen, bei denen es sich um Arginin- oder Guanidino-Analoge handelt, um die Stickstoffoxid-Synthasen zu blockieren und zu hemmen. Mit einigen von ihnen werden klinische Versuche zur Behandlung von septischen Schocks und Entzündungskrankheiten durchgeführt. Wir können das NO nicht nur mit Hämoglobin und Myoglobin "aufsaugen", sondern auch mit verschiedenen Thiolen, die sich ebenfalls in klinischen Tests befinden. Es gibt Verbindungen, die die Zyklase ohne NO aktivieren. Wir glauben, dass wir eines Tages über ein mutiertes Enzym verfügen werden, das für die Gentherapie kein NO benötigt. Man kann die Aktivierung durch NO oder ein anderes Gas auch verstärken, z.B. durch Kohlenmonoxid, bei dem es sich um einen schwachen Aktivator in Gegenwart von Verbindungen handelt, und es gibt auch Inhibitoren. Wir verfügen also nun über Werkzeuge, um damit zu beginnen, auf dieses System genauer eingehen. Doch das System ist etwas komplizierter als das. So ist es immer. Wenn Sie Stickstoffmonoxid produzieren, will es Folgendes tun: die Guanylylzyklase aktivieren, um zur Verhinderung der Blutplättchenaggregation, zur Verwendung als Neurotransmitter, zur Beeinflussung der Entspannung der glatten Muskulatur zyklisches G herzustellen: für alle diese hilfreichen Dinge. Es kann jedoch auch zu Nitrit/Nitrat oxidiert werden, es kann Komplexe mit anderen Übergangsmetallen bilden. Es bildet mit verschiedenen Thiolgruppen und Proteinen Komplexe. Mehr als 100 Proteine werden an den Cysteinresten nitrosiert, und einer der wichtigen Stoffwechselpfade ist die Interaktion von Stickstoffmonoxid mit Superoxidanionen. Diese Reaktion ist fast diffusionsbegrenzt. Wann immer man also die eine Verbindung mit der anderen in Kontakt bringt, ist dies die Reaktion, die stattfinden wird, und sie "verschluckt" oder stiehlt das NO vom Stoffwechselpfad des zyklischen G. Und dies führt zur Entstehung von Peroxynitrit, das sogar noch giftiger ist als Stickstoffoxid oder Superoxid. Peroxynitrit nitriert Proteinreste, die an Hydroxyl und Tyrosine angrenzen, indem es die Phosporylierung der Tyrosinkinase möglicherweise räumlich hemmt oder in einigen Fällen störend darauf einwirkt. Möglicherweise kommunizieren die beiden Systeme also miteinander: der Stoffwechselweg der Tyrosinkinase und der von NO. Vielleicht. Es gibt sehr wenige in vivo Hinweise darauf, die meisten Hinweise waren bislang in vitro. Es gibt eine wichtige, als endotheliale Dysfunktion bezeichnete Krankheit. Viele von uns, mit Sicherheit die Älteren unter uns, haben eine endotheliale Dysfunktion, von den jungen Leuten möglicherweise noch nicht so viele. Sie tritt zusammen mit Bluthochdruck, Arterioskelerose, Diabetes, Tabakkonsum und möglicherweise auch mit Übergewicht auf. Bei allen diesen Krankheiten kommt es zu oxydiertem Stress, der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, Wasserstoffperoxid, Superoxidanionen, Hydroxylradikalen, und die Gewebe der Blutgefäße erzeugen keine ausreichenden Mengen von Nitritoxid, aus einer Vielzahl von Gründen; ich kann diese Gründe nicht alle durchgehen. Doch das Nettoergebnis ist, dass die Blutgefäße nicht genug NO produzieren können. Sie tendieren dazu, verengt zu sein, wodurch der atherosklerotische Prozess beschleunigt wird. Die Durchblutung wird durch diabetische Geschwüre und Verletzungen verringert. Es handelt sich demnach um einen Teufelskreis: Je mehr die Blutgefäße verengt sind, umso mehr reaktive Sauerstoffspezies entstehen, umso weniger NO. Es wird schlimmer und schlimmer. Man muss den Kreislauf also unterbrechen. Man muss die zugrundeliegende Krankheit behandeln und möglicherweise mit einige neuen Therapien darangehen, möglicherweise mit der Zuführung von zusätzlichem Arginin, um mehr NO zu produzieren; oder mit Antioxidantien, um die reaktiven Sauerstoffspezies zu beseitigen. Und es gibt viele klinische, viele Jahresstudien, die dies belegen. Es gibt einige klinische Untersuchungen. Die klinischen Untersuchungen waren sehr umstritten. Wir sind fast am Ende. Hier ist ein weiteres Dia. Das Forschungsgebiet um Stickstoffmonoxid ist völlig verrückt geworden. Unser erster Aufsatz über die biologischen Wirkungen erschien 1977. Fast ebenso viele wie zu zyklischem AMP, mehr als zu G-Proteinen und vielen anderen Themen. Es ist unglaublich. Das entspricht etwa 6000 bis 8000 Aufsätzen im Jahr, im Zeitraum der letzten 5 bis 10 Jahre. Das sind 20 bis 30 Aufsätze am Tag. Niemand auf der Welt kann darüber den Überblick behalten. Es ist für alle von uns in diesem Forschungsfeld sehr frustrierend. Es ist aber auch sehr spannend, dieses Interesse und diese Begeisterung zu sehen. Ich habe eine Teilliste für Sie zusammengestellt, dieses Dia und das nächste, um Ihnen zu zeigen, wohin sich dieses Feld meiner Meinung nach in den nächsten 10 Jahren bewegen wird, was die Entwicklung neuer Medikamente betrifft, und wie wir diese biochemischen, molekularen Zielobjekte, die wir und andere beschrieben haben, nehmen können, und sie nun in Prüfverfahren mit hohem Durchsatz und andern Untersuchungen verwenden können, um chemische Hinweise zur Herstellung neuer Heilmittel zu finden. Wir wissen, wie ich bereits sagte, dass NO als Neurotransmitter am Hirnstoffwechsel beteiligt ist, in manchen Bereichen des Gehirns, sowohl zentral, als auch an der Peripherie. Wenn Sie eine Maus mit NOS-1 versehen und einen zerebralen Infarkt herbeiführen, ist der Umfang des Infarktes kleiner. Wenn Sie eine Maus mit NOS-3 versehen und einen zerebralen Infarkt herbeiführen, so ist der Umfang des Infarktes größer. Wenn Sie eine Maus mit NOS-1 und ohne NOS-3 versehen , ist die Maus nicht mehr sehr clever. Sie kommt nicht mehr durch aus dem Wasserlabyrinth. Es gibt also die Beteiligung von Stickstoffmonoxid als Transmitter in verschiedenen Bereichen, auch im Gedächtnis, und wir haben all das keineswegs verstanden. Wir wissen, dass es, bei einem Glaukom, bei der Produktion und Aufnahme von Flüssigkeit im Auge eine Rolle spielt, bei der neuronalen Degeneration der Retina. Wir haben ausführlich über die Gefäßerweiterung gesprochen, Bluthochdruck in der Lunge wurde im Film angesprochen. Es war eine aufregende Sache, diese Entwicklung mitzuverfolgen. Ungeborene Babys, verbunden mit der mütterlichen in vivo-Zirkulation, müssen ihre Lungen nicht aufblähen, weil sie ihren Sauerstoff von der Plazenta der Mutter bekommen. Wenn sie zu früh geboren wurden, sind ihre Blutgefäße verengt, ihre Lungen sind nicht entwickelt, sie benötigen einen oberflächenaktiven Stoff. Man muss diese Blutgefäße erweitern, ihr Blut fließt von der rechten in die linke Herzkammer, die Babys leiden an Sauerstoffmangel (Hypoxie). Wenn man ihnen über einen Nasenkatheder ein wenig Stickstoffmonoxid gibt, erweitert dies die Gefäße, der Blutfluss von der rechten in die linke Herzkammer geht zurück, ihr Blut wird mit Sauerstoff angereichert. Es hat eine wunderbare Verbesserung gegeben, mit der sich das Erfordernis einer ECMO-Therapie, die höchst unangenehm ist, eliminieren ließ. Sie haben alle von Viagra gehört. Es ging aus dieser Forschung hervor, nicht aus unserer, aber wir entwickelten die Konzepte. Wir haben im Labor Witze darüber gemacht: dass wir Kondome mit gefäßerweiternden Substanzen füllen würden, und mit NO-Donoren und PD-Inhibitoren. Sie funktionieren. Viagra ist ein Inhibitor der Typ-5-Phosphodiesterase, die man hauptsächlich in Blutgefäßen findet, sowohl im corpus cavernosum, als auch in den systemischen Gefäßen. Dies ist der Grund dafür, warum Patienten, die Viagra nehmen und nun zusätzlich NO-Donoren, Nitroglyzerine, sehr hohen Blutdruck, Herzrhythmusstörungen, Schlaganfälle etc. bekommen können. Man muss also vorsichtig sein. Es ist kein Medikament, das aus nichtmedizinischen Gründen genommen werden sollte, es kann zu Komplikationen führen. Es ist an der Wundheilung und der Angiogenese beteiligt, an der Atherosklerose. Wenn Sie sich die Menge ausgeatmeten NOs ansehen, ist dies ein wunderbarer Marker für die Schwere von Asthma. Je mehr Entzündungen in Ihrer Lunge sind, umso mehr Induktion von NOS-2, umso mehr NO produzieren Sie, umso mehr NO gelangt in die von Ihnen ausgeatmete Luft. Der Arzt kann Sie daher in einen Beutel oder eine Röhre blasen lassen, und wenn der NO-Gehalt erhöht ist, weiß er, dass Ihr Asthma außer Kontrolle ist und er passt die Therapie daran an. Das ist sehr nützlich gewesen. Es gibt klinische Studien für septischen Schock, Blutplättchenaggregation. Wir wissen aus Mikroarray-Studien an Zellen, dass NO Gene reguliert, sowohl hoch- als auch herunterreguliert. Wir haben großes Interesse an der Stammzellenbiologie entwickelt. Seit den letzten paar Jahren wissen wir, dass Stickstoffmonoxid und zyklisches G die Vermehrung embryonaler Stammzellen beim Menschen und bei Mäusen beeinflusst. Wir glauben, dass wir Zellen auf unterschiedliche Entwicklungsbahnen zwingen können, indem wir mit NO und zyklischem G herumspielen. Und es gibt noch andere Anwendungen, dies ist nur eine Teilliste. Wir können nicht alles tun. Haben Sie vielen Dank.

Ferid Murad on Nitric Oxide Signalling
(00:27:50 - 00:30:58)


Signalling Beyond Body Borders
After all, chemical signalling does not end at the borders of our bodies. We routinely send and receive chemical signals to and from the environment. Amongst our five senses, the sense of smell and taste are charged with the reception and processing of such signals. Even though the human sense of smell does not belong to the best developed amongst mammals, its power is still impressive. Humans are able to recognize around 10.000 different odours [11]. These may convey a variety of signals – they may warn us of immediate dangers, such as fires, tell us about the quality of food or, as for the so-called social odours, inform us about sex, health, reproductive status or competitive ability of another human [12].

Curiously, the 10.000 odours we can perceive are composed from merely less than 1.000 different small molecule odorants. The number of odours can be so much higher than the number of odorants because odours are characteristic mixtures of several types of odorant molecules. The latter are typically “very small” with a mass of less than 300 Dalton. Molecules of this size are often volatile, an essential prerequisite for perception by the olfactory system.
The question, how exactly the sense of smell is able to differentiate so efficiently between so many odours has long puzzled scientists. Today we know, that the human olfactory system uses a limited range of odorant receptor types to characterize a given odour. Each of these receptors can, to varying degrees, be activated by several odorants. The odorants of a certain characteristic scent thus create a unique combinatorial pattern, which can be recognized and remembered by the brain. The two scientists who unravelled the workings of the olfactory system, Richard Axel and Linda Buck, were honoured with the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 2004. Amongst other things they could point out which receptors are activated by which small molecule odorants. They further showed that pheromones, chemical signals directly triggering social responses, are recognized by similar receptors as smells.

In the case of pheromones, the sensitivity of the involved receptors is truly stunning. The first one to point this out was 1939 Nobel Laureate Adolf Butenandt, introduced above as the discoverer of the sex hormones oestrone, androsterone and progesterone. After receiving the Nobel Prize, Butenandt attempted the first-ever isolation of a pheromone, bombykol. It took his lab 20 years to isolate 15 milligrams of bombykol from 500.000 female silk moths. One reason for the slow success was that the female silk moth requires merely tiny amounts of bombykol to attract males. In fact, a couple of molecules suffice to trigger a reaction. Even today, this stunning sensitivity is unmatched by any form of modern analytical instrumentation. At the 1960 Lindau meeting, shortly after the discovery of bombykol, Butenandt told the audience about his experiments with the first pheromone discovered:

Adolf  Butenandt (1960) - From the Biochemistry of the World of the Insects (German presentation)

Ladies and Gentlemen, At earlier conferences here in Lindau, as just mentioned, I spoke several times about problems in the field of insect biochemistry. My decision to choose the same topic to talk to you about today was prompted mainly by a desire to tell you about the progress and achievements that have been made in areas that, for the most part, could only be discussed in earlier lectures in terms of the problems they presented. Unfortunately, in addition to presenting new facts, I cannot avoid covering some ground that may already be familiar to some of you, for which I beg your indulgence. For those of you who have not yet come across these problems, please permit me a preliminary remark. Some of you may question the point of tackling such specific questions as those posed by the insect world. I’d like to counter that opinion with the following observation. You will all be aware that the science of biology has long since abandoned its descriptive efforts and now seeks, with the help of methods borrowed from physics and chemistry, to analyse fundamental life phenomena that apply universally to all organisms. In this way, it is doing its part in pursuing the aim of science to explore the nature of humankind itself and the living world around it. In so doing, it is free to choose its objects and, depending on the question being addressed and the method used, uses a wide range of different organisms in the animal, plant, and microbial realms. And you will also be aware that insects are very often used to solve fundamental biological problems. We should recall, for example, that the laws of classical genetics that apply to all life forms – including humans – were discovered for the most part in insects and that animal behaviour laws were investigated in insects to a large extent. And in particular, the principles discovered in social insects have delighted awestruck researchers over and over again. Also Biochemistry, which aims to analyse the chemical transformations associated with life processes, chooses its objects from among all the organisms on Earth. For over twenty years we at the Max Planck Institute for Biochemistry have been investigating a number of chemical life phenomena that have been made accessible by studying insects. And as so often we have found in pursuing this work that very specific questions that appear meaningful only for the insect world hold the key to explaining generally valid phenomena or yield findings that can be of practical importance to our own social lives. I would like to demonstrate this with the help of several examples. Let’s begin by considering the natural pigments that are characteristic of the insect kingdom. You all know that the numerous pigments that embellish the natural world and delight humans were a major focus of interest for many generations of chemists. Each period, with improvements in analytical methods, introduced new ways to isolate and identify the structure of natural pigments. So for a long time scientists believed that they were well acquainted with all the important and widespread pigments in the natural world, which often served as models for the technical synthesis of organic dyestuffs. Surprisingly, however, they had overlooked the red, brown, yellow and purple pigments of the insect world, including a previously unknown natural pigment type, which we discovered during our research in recent years and which, as we found, figures among the most widely distributed pigments in nature. First, let us see in pictures what these pigments are and where they occur. In the first picture we see a butterfly, the well-known small tortoiseshell, and this butterfly has just shed its pupal case and has secreted what entomologists call pupal secretion. Many butterflies secrete a cleansing liquid like this immediately after pupating. You can see in this case that the secretion, captured here on blotting paper, has a bright red hue. This is a pigment of the red type in the insect world, and the wing markings, insofar as they are red, yellow or brown, also fall into the group of pigments we will be talking about. Wing pigment of our type can also be seen in the next pictures. In the next picture we again see the wings of the small tortoiseshell. Here is the peacock butterfly, here the admiral. All examples of where yellow, red and brown wing pigments occur. In the next picture we see the silver-washed fritillary, such colours, as well as the pretty red markings of this large American moth Cecropia platysamia, belong here. On the epidermis of some insects or larvae are the natural pigments we’re talking about. In the next picture we see the caterpillar of the puss moth, characterised by the fact that it turns deep red immediately before pupating. The pigmentation is just starting here as depicted. Again this red pigment type. In the next picture you see the pretty colour pattern of a grasshopper larva Schistocerca, here we also have the individual pigment patterns, and finally, I would also like to show you the eye of the grasshopper. Many insect eyes are pigmented red, brown or a darker shade. Now, all these pigments that I’ve presented to you, I repeat, as red, brown or even darker shades of pupating secretion, wing pigments, epidermis pigments, and eye pigments in insects are chemically closely related. And based on their universal occurrence in all insect eyes, where they were first discovered, they have been given the collective name ommochrome eye pigments. The occurrence of these substances is not limited to insects. They are also found as eye and skin pigments in all arthropods, for example crabs, as well as in cephalopods and more rarely in other animal classes as well. There is a whole series of ommochromes as chemical entities. As a characteristic and widespread representative of these ommochromes, let us consider the structure of just one substance in the next picture, of so-called xanthommatin. This yellowish brown pigment, xanthommatin, was first obtained in pure crystallised form from the red pupating secretion of around 10,000 small tortoiseshells, which yielded just 100 mg of the pigment. Later, 19 mg was isolated from the eyes of 7,800 blowflies, marking the first time an insect eye pigment was obtained in pure form. Xanthommatin occurs in very many insect eyes. It is one of the pigments found in wings and skin. The structure of this substance was elucidated and definitively confirmed by synthesis. For those of you familiar with the language of chemical formulae, here is the formula of xanthommatin and you can see that it is what is known as a phenoxazone system, that is a tricyclic system with nitrogen, to which a quinoline ring is attached, and here there is also an oxoaminocarbonic acid side chain. This phenoxazone system is found in all ommochromes. We could say that ommochromes are phenoxazone pigments. Typical of xanthommatin and other ommochromes is a characteristic redox behaviour, which is shown here in the picture. This yellowish brown pigment stage is reduced by the addition of hydrogen, resulting in a bright red stage. Here is the structure of hydroxanthommatin with the two attached hydrogen atoms here and the subsequent rearrangement of the double bonds. The red hydroxanthommatin, with the release of hydrogen, is converted back to the yellowish brown product. And this redox behaviour is shown again in the next picture in colour, here the oxidised yellowish brown, here the reduced bright red colour, this behaviour is, firstly, characteristic of the group and, secondly, is unusual for biochemists and dye chemists, because here reduction is accompanied by a deepening of the colour, which is generally not the case. It is interesting, that nature uses both types, the oxidised and the reduced pigment. We know, for example, that the previously mentioned change from the brown colour of the puss moth to the bright red colour before pupation is due to such a reductive process. All ommochromes are phenoxazone pigments, as I said, we regard xanthommatin as the basic substance, which can be converted in various ways into other types of ommochromes. It is interesting to note that the red hydrated pigment stage is not very stable in the presence of oxygen, instead the oxidised pigment is the stable form. What does nature do when it wants to fix the red hydrated pigment stage? It does this by converting xanthommatin into two other pigments of the bright red type, which can be derived from hydrated xanthommatin, and which we have named rhodommatin and ommatin D. In the next picture I would like to suggest how the hydrated red stage is fixed. Here you see again the hydrated form of xanthommatin, but there is only one hydrogen atom here on the nitrogen, down there on the oxygen it is replaced by a residue R. This residue R can be either a sugar residue, in which case it forms a glucoside, or it can be a sulfa residue, a sulphuric acid ester, and whenever such a hydrogen atom is replaced by such groups – through sugar groups, through sulphuric acid – the reduced form cannot be converted as easily, namely only after removal of the residue, into the oxidised form, and in this way nature fixes the hydrated unstable pigments to produce bright red. They are therefore at the same time substances that show the formula types of other ommochromes. Thank you. And the following strikes us as being of general interest. The ommochromes were found to contain a new pigment system which, as I mentioned, had not previously been observed in nature, the phenoxazone system. This system has been known for over 40 years in the field of synthetic dyestuffs, but its much earlier invention by nature has never been copied. Among these phenoxazone-type synthetic dyes, some are used as photosensitisers on photographic plates. Are pigments of this type in the eyes of insects also involved in light absorption, in the visual process, instead of just acting, as assumed, as photoprotection pigments? This is a question for sensory physiologists. The ommochromes of insects were the first phenoxazone pigments to be discovered in nature. Soon after their discovery, other representatives of this pigment type were found in the natural world. Determining the structure of ommochromes provided the key for analysing the pigmentation system of the so-called actinomycins. Antibiotically active metabolic products of ray fungi and also proved to be the key to other representatives of this class in the fungus kingdom. You again see in the top picture the formula of xanthommatin as a class and how this basic substance is converted by substitution in the group of actinomycins, investigated by Brockmann, and in the lower picture you see types of fungal pigments investigated by Gripenberg. According to very recent observations, it is likely that xanthommatin is also a metabolic product of mammals and perhaps even humans. Whether it has any significance in this context is not known. Actinomycins are antibiotics. This means that they are among the modern weapons doctors use against infectious diseases, about which, in the presentation by Herr Domagk yesterday, we heard so many fascinating things. Because the actinomycins include drugs against malignant diseases of the lymphatic system, it is understandable that the ommochromes – initially merely objects of whimsical research – are increasingly attracting the attention of the pharmaceutical industry. The ommochromes however have gained the greatest theoretical importance as traits which are expressed only under the effect of specific genetic factors. That was the topic of my very first lecture in Lindau: “What do we know about the effects of genetic factors?” Entomologists have found that some insect species are unable to produce ommochromes. And genetic analysis of these ommochrome-free species has shown that they differ from ommochrome-containing wild species in that there is a change or mutation in individual genes in the genome. These genes must therefore control the synthesis of ommochromes. This discovery made it possible to analyse the effects of genes for the first time, that is to answer the question of how specific eye traits of an organism are determined by the presence of specific genetic factors located in the cell nucleus. In the next picture I would like to remind you of the classical experiment by Alfred Kühn, who pioneered this development. In this diagram we see the caterpillar and head of the flour moth Ephestia kuehniella, specifically the wild form characterised by dark ommochrome pigmentation. Here is an ommochrome-free mutant, the caterpillar’s skin is colourless, the eyes red, and there is no dark pigment, and these two variants differ only in a single genetic trait. If, as Kühn did, you implant tissue from the wild form into this penultimate instar of the colourless mutant ommochrome, which is otherwise absent, is synthesised in the host under the influence of this tissue, and the colourless insects are transformed into insects that are phenotypically indistinguishable from the wild forms. The implant must transfer a factor that restores the somehow defective process of ommochrome synthesis. The biochemical analysis of this experiment then led to the recognition of a chain of genetic effects, from which the following can be concluded: The ommochromes in our pigments are synthesised from the amino acid tryptophan, a normal product of protein metabolism, by way of stepwise catabolism via kynurenine and hydroxykynurenine. Each of these steps is catalysed by a characteristic enzyme. Those enzymes, however, are present only if certain genes are present in the pool of genetic factors. We therefore conclude the following: the synthesis of the enzymes that catalyse a given reaction step is dependent upon genes. Genes act via enzymes, when genes mutate, the associated enzymes are absent or altered, so that chemical reaction steps, in this case subprocesses of ommochrome synthesis, no longer occur. This experiment showed, for the first time, that genes act via enzymes. Enzymes are the first detectable products of genetic factors. Because enzymes are specific proteins, we also draw the important conclusion from the experimental results that the information required for the synthesis of specific proteins resides in the structure of genetic factors. In this way, a basic problem in biology was discovered and then made accessible by a subsequent experiment. The question as to how genetic factors in a cell convey information for the synthesis of specific proteins and thus for the production of all specific cellular structures is one of the most exciting problems in biochemistry today, the answer to which is probably in the offing. We have insects to thank for teaching us a law that has meanwhile been confirmed on a broad basis in many organisms and that now allows us to analyse control processes in nature that reside primarily in the genetic material. Unfortunately, we cannot continue this thread. We will now turn instead to another control problem in the field of developmental physiology. Most organisms develop from a single cell - the fertilised egg cell – and the question of how this development of the individual is controlled, how each phase of development is causally determined by the preceding phase, defines the complex of problems addressed by developmental physiology. Here, too, insects have taught us many fundamental principles. You will all be aware that the development of many insects proceeds via an interesting metamorphosis. From the egg of a fly or butterfly hatches the larva or caterpillar. As it grows, it passes through stages during which it moults its outer layer, or cuticle. In the process of pupal moulting, the mature larva changes into a pupa. The pupa undergoes further transformation, at the end of which the sexually mature form, the imago, develops. It emerges from the pupa in a process known as imago moulting. It has been found that this sequence of processes, larval moulting, pupal moulting, imago moulting, is triggered and controlled by three specifically acting hormones, and here we are confronted by the second problem, which I’ve already spoken about in Lindau in the past. At the time, it was believed that the three metamorphosis hormones interact according to this scheme, the first hormone, adenotropic hormone, is produced in neurosecretory cells of the brain, under whose effect the prothoracic gland produces a second hormone, prothoracic hormone. Its presence then causes the epidermis, the skin, to moult. The prothoracic hormone triggers moulting. The form of moulting is determined by the presence or absence of the third hormone, which is produced in the corpora allata. When this hormone is present, which is the case during the entire period of larval development, the insect undergoes larval moulting, if the corpora allata ceases to produce this hormone, known as juvenile hormone, pupal moulting occurs, and the same prothoracic hormone is ultimately still required for imago moulting. All three hormones at work here have meanwhile been isolated. And we are able to demonstrate their effects on suitable objects. We will limit our observations today to prothoracic hormone – the actual moulting or pupation hormone. It is the only one of the three to date to have been isolated in crystallised form. From one tonne of fresh silk worm pupae, 75 to 100 mg of the hormone can be obtained, which we have named ecdysone from ecdysis, or moulting. It is a bicyclic system without nitrogen with the formula C18H30O4. Unfortunately, we still do not know the structural details. We now hope to get help from x-ray structural analysis. Nevertheless, in recent years it has been possible, using the pure hormone, to study its physiological effects in detail and in this context I would like to discuss two examples. Here a ligature is being performed on a fly maggot which separates the head end from the rear end. The result of such an intervention, as shown in the next picture, is a partial pupation. Only the anterior end pupates; the posterior end remains a permanent larva. This pattern results because the metamorphosis hormone that induces pupation is produced in the head and cannot travel past the ligature to the abdominal section of the insect. If we inject pure ecdysone into the abdominal section of the permanent larva, it too subsequently undergoes pupation. Here you see how the hormone is injected into the small larva using a microinjection syringe. We inject 0.01 ml of a solution, equivalent to 0.01 grams, or 10^-8 grams of the hormone, to induce pupation. The result of such an injection is statistical in nature, as expected in biological experiments. Here are a number of abdominal sections injected with hormone and you can see that in addition to total pupations, partial pupations have also occurred, while some insects did not respond, as we would expect in a biological experiment. Many of you will recall that this effect forms the basis of the physiological test to detect and isolate ecdysone. The most elegant biological experiment on the effect of ecdysone was conducted by Carrol Williams, and in the next picture, from a paper by Carrol Williams, you can see what he did. Previously we saw the large moth Cecropia platysamia, a beautiful colourful silkmoth, a giant. And here at the top is the isolated abdomen of a pupa of this moth. We see how two pieces of organ are inserted using small needles, namely neurosecretory cells from the brain and prothoracic gland. So the two hormone-secreting glands, under the influence of the other implant, the prothoracic gland, produces prothoracic hormone. This hormone, as I said, also controls the final stage of imago development, and the abdomen of the pupa develops into the abdomen of the moth. The entire morphology changes, the colour changes and the isolated abdomen even lays eggs. It functions. Without the intervention, without a supply of hormone, it would have died. This experiment was repeated with pure crystallised ecdysone instead of the two organ implants. In the next picture we see this isolated abdomen, coloured yellowish brown, placed on a small agar plate, before imago development, before imago moulting. If we did nothing, this isolated abdomen would, of course, die within a short time. After injection of 6 micrograms of ecdysone, the entire developmental process occurs, this is a photo of the same setup. You see the change in the shape of the moth’s abdomen. You see the expression of the colours and the pattern. So the entire developmental process occurs under the influence of a tiny amount of pupating hormone. It would be difficult to demonstrate the causal effect and significance of a hormone in the course of a developmental step more convincingly. Hormones also act as regulators in the developmental stages of mammals, including humans, but nowhere can their effects be studied so easily and in such an isolated setting as here. So how does this hormone actually work? The activity of hormones is, for the most part, not known in detail. We are repeatedly struck by the astonishing fact that such tiny quantities of a substance can trigger such dramatic processes in the organism. I am delighted to tell you that Dr Karlsson, in cooperation with Beermann’s department at the Max Planck Institute for Biology in Tübingen, has recently made an observation with the help of ecdysone which I regard as groundbreaking. For the first time namely it has been shown that the function of gene loci in the nucleus is influenced by this hormone We thank Beermann for demonstrating that those parts of a chromosome in which active gene loci are located undergo a histological change. So-called puffs form, which we interpret biochemically as a loosening of the genetic substance and a transition to its actual function. Geneticists have always claimed that such puffs cannot occur simply from an internal mechanism of the chromosome but that the surrounding milieu must induce the gene loci to carry out specific functions that are required for further development. But it has never been possible to exert an unambiguous influence on puff formation experimentally. Only now has it been possible to demonstrate, using ecdysone and giant chromosomes of dipterans, in which these things can be observed so well, that minute amounts of hormone can induce puffing in highly specific gene loci, thus activating their function. Recalling everything I’ve said before, that in some way the production of specific proteins is initiated from these gene loci, we can imagine that such activation of individual gene loci initiates the production of specific enzymes. That is really just a start. And we also know how we must interpret this effect. And as I said, this is a groundbreaking achievement for which I have the greatest admiration. Ladies and Gentlemen, another example of the control of the development of individual organisms by an active substance is the honey bee, Apis mellifica, in which the expression of various sexual forms will serve as an introduction to the problem of assignment within a social colony. A robust beehive consists of about 50,000 to 80,000 worker bees, 2,000 to 3,000 male bees, the drones, and a single queen. In the next picture we see the morphological differentiation of these types, in the middle the queen, on the left the drones, on the right the workers, you will already be familiar with all this. The drone is nearly as big as the queen but darker. We know that the drones, the male bees, are produced through parthenogenesis. This means from unfertilised eggs. Whereas the queen and workers are produced from fertilised eggs. Whether a fertilised egg gives rise to a worker or a queen is determined solely by how the broods are fed. Here are the various forms of cells, which you are familiar with. A fertilised egg raised in the small cells produces a worker. A fertilised egg raised in a characteristic queen cell becomes a large queen. It has been observed that larvae hatched from the same eggs are fed differently in the various cells. Whereas the worker larvae are fed only a pinhead quantity of worker food, the larva in the large queen cell selected as the queen receives a copious amount of royal jelly, which is produced by glands in the head of nurse bees. In the next picture you see a cross-section through a bee, and here in the head are a number of glands. This one here is the gland that produces royal jelly. Despite much effort - let me reiterate – one gets the impression that whether an egg develops into a queen is determined by royal jelly, that is by the diet. If a bee larva is transferred just after it has hatched in a hive from a normal brood cell, in which it would have developed into a worker, to a queen cell, it is fed royal jelly and becomes a queen. But despite much effort, all attempts were in vain to transform a young larva into a queen outside the hive by feeding it royal jelly. And consequently, even today, many still contend that entirely unknown brood-care factors determine whether a larva becomes a queen. The situation has changed dramatically since Dr Hanser at our institute recently succeeded in identifying the conditions in which just-hatched presumptive worker larvae can be raised in an incubator, outside the hive, into completely normal queen bees solely by feeding them royal jelly, excluding all other brood-care factors. Dr Hanser’s experimental setup is shown in this picture. It is a small wooden board into which, as you can see, small artificial honeycombs are inserted. They consist of small glass vessels, like this one here shown in detail. And you can see here in the vessels the developing larvae floating. They are floating in royal jelly. If one manages to transfer young larvae, within the first two days of hatching, a period during which they are particularly sensitive, living and unharmed to the experimental cells, they will develop in an incubator at a normal hive temperature of 35° and fed with royal jelly, into queens. Larvae, at the end of the second day of life or later, subjected to the same conditions, always develop into workers. However, under the influence of royal jelly, they can develop into giant workers, which rarely occur in normal hives, if at all. The result of the experimental setup is shown here. You see on the left a normal queen from the hive. You see on the far right a normal worker from the hive. This is a queen raised by us in the laboratory, which developed from a small larva that would have produced a worker in the hive. And here is a so-called giant worker, which develops if you introduce the larva to the experimental setup too late, namely when the actual determination has already been made. The queen differs from the workers not only in size, but above all in the development of ovaries and the morphological shape of the mouth parts. Moreover, the queen lacks the tools on her posterior legs required to collect pollen, namely the brushes and baskets, in short: the queen not only differs from the workers in size and the development of ovaries, her entire morphology is different. That’s why it is important to recognize that a queen produced experimentally in an incubator shows all the features of a normal queen, she is even accepted as queen by a colony. In this picture, let me show you the differing morphology of the mouth parts. On the right by the worker with a long proboscis, on the left by the queen. And you can clearly see the morphological differentiation. Now we can therefore draw the following conclusion: It is clear that the decision about the biological fate of a larva is determined in the first 48 hours of its life and indeed solely by the food it is fed. Whether, as we would probably like to assume, royal jelly contains a determinant substance with specific activity or, also a possibility, whether the determination of a larva to develop into a worker is due to poor nutrition during the sensitive period remains uncertain. But the experimental foundation to answer this question has been laid, and we have begun experiments to fractionate royal jelly and test the individual fractions to see if they induce queen development in the incubator. We look forward to next season’s experiments with particular excitement. Ladies and Gentlemen, I would also like to conclude this problem of determination here. The time is already advanced, and in the final part of my lecture I would like to return to a problem that has already been broached here in earlier lectures. The problem regarding communication between insects through chemical substances. We call substances that are produced in an individual, from these transferred to others, and received by those individuals as communication signals pheromones. Pheromones are therefore chemical messengers conveyed from individual to individual. There are many of them and we can regard them as substances of social cohesion, because they are produced in greater numbers in social insects so that individuals can communicate with each other. Pheromones include species- and gender-specific scents produced by insects which are released by the male or female in order to attract a partner and advertise the presence of individuals of the same sex. We have worked with one such gender- and species-specific sexual attractant in the silkmoth. And last year, after 20 years of effort, we were successful for the first time in isolating such a pheromone, such a gender-specific sexual attractant, and determining its chemical structure. In many insects, finding a sexual partner is facilitated by such species-specific attractants. Detailed knowledge about their activity has been gained mainly from butterflies and moths, whose extraordinary olfactory performance was noted very early on. Insect lovers and entomologists have shown through numerous observations that the female of many butterfly and moth species are able to attract mates from afar. I would like to describe an elegant experiment from the recent literature which was carried out on Chinese silkmoths. Males of this moth species were marked individually and released from a moving train at various distances from the home location, at which a female of the species was kept in a gauze cage. From a distance of 4.1 kilometres, 40% of the released males, and from a distance of 11 kilometres 26% returned to the female. By means of a series of easily performed experiments it can be reliably shown that the female in special scent glands produces gender- and species-specific substances which can be extracted from the glands with lipoid solvents and are perceived by the males through sensory fronds on their antennae. We now know that perception of this scent prompts males to fly against the air current, against the direction of the wind, and thus get underway on their quest for a sexual mate. This behaviour explains why males are frequently attracted from large distances. They do not measure for instance the concentration of the molecules, but instead a scent molecule is interpreted to mean “fly off against the direction of the wind”, and we can easily see that in most cases the attractant must have been carried by the wind so that the male’s chances of finding the female are not bad. Many experiments have been carried out to isolate such scents in order to determine their chemical makeup. Usually insect pests such as the nun moth, grapevine moth and gypsy moth are used. And using extracts from the female scent glands of these species, researchers have tried to attract males in the outdoors. The number of males captured served as a measure of the potency of each extract. The knowledge thus gained about the nature of such sexual scents in 40 years of work was extraordinarily poor. In 1939 we undertook the biochemical identification, as I mentioned, of the sexual attractant of the silkmoth Bombyx mori. It had, until then, never been used in such experiments and yet it had the great advantage for the laboratory that it is a domesticated insect which can be easily bred and which is procured in large quantities in the silk industry. The moths no longer consume food, they can be kept in open trays because they do not fly, and in the presence of a female silkworm or under the influence of an extract from the abdominal glands of the female, the practically stationary males become highly excited, beating their wings rapidly and rotating in searching movements. And that forms the basis for the required chemical identification test. We have been, since 1939, in the summer and autumn months, conducting experiments with the aim of identifying this attractant biochemically. For opening up this interesting field, my coworkers and I are indebted to the suggestion and advice of Walter Schoeller, the former head of the main laboratory of Schering AG in Berlin, who, I believe, is also among our friends here today. The choice of the experimental object, this simple experimental object, was made on the advice of the entomologist Görnitz, who, after orientating experiments conducted jointly with Schotte at Schoeller’s Laboratory in Berlin, recognized the possibility of learning about the general character of the sexual attractant of lepidopterans by using the silkmoth as a laboratory model. Here you see a silkmoth and when sexually excited, the female extends two glands from the posteriormost abdominal segment, the lateral sacculi. They are pigmented yellow, and the attractant can be extracted from them with lipoid solvents. The males sit there very calmly after hatching. They can be identified by their large antennae. They maintain their idle state. For the attractant test they can be kept in open trays, where they sit calmly and are used as follows for the test. We first insert a clean glass rod into the glass vessel, position it in front of the males’ antennae and expect no change in the insects’ idle state. When we then dip the tip of the glass rod into an attractant, the insects begin to intensively whirr immediately. For us it is the clearest sign that the insect is still alive at all. These insects live for around eight days without eating, as I mentioned. When you believe that they are outwardly no longer alive, you can determine with this attractant whether they will attempt the very last movements of this kind. You can therefore gauge a reaction to the test in this way. You can define an attractant unit, for example, by saying that one attractant unit of 1 microgram means that the substance, when present in a concentration of 1 microgram per cubic centimetre, elicits this excited dancing in 50% of the experimental insects after we dip the tip of the glass rod, the magic wand, into the solution. We know from the first experiments in 1939 and 1940, which aimed to concentrate and chemically identify the attractant, that the attractant must be a lipoid-soluble, neutral and nonsaponifiable alcohol that is resistant to dilute acids and bases, but sensitive to oxidants. From 7,000 female butterflies we were able at the time to isolate 100 mg of a waxlike fraction that contained one attractant unit in 0.01 micrograms, i.e. 10^-2 micrograms. We believed at the time that we were already pretty close to the goal, but the following years showed that those products would have to be concentrated by several orders of magnitude to obtain the pure attractant. After we, on the basis of many years of gradually improving experimentation, again processed the extract from 500,000 glands the year before last, we finally achieved the goal of purification. As I said, just about 20 years after the work was commenced. We succeeded in obtaining pure attractant in the form of 12 mg from those 500,000 glands and 12 mg of a crystallised coloured ester, from which the colourless attractant itself can be generated. With this small quantity it was possible to carry out an analysis of the chemical structure. The formula of this first gender- and species-specific attractant is given here below. It is a hexadecadienol. That means that we have a straight chain of 16 carbon atoms. Hexadeca is the basic substance. At the end of this chain we have a primary alcohol group-ol, attached to carbon atom 16. We have two double bonds between carbon atoms 4 and 5 and between 6 and 7. Hence, a hexadecadienol. Our picture shows how the essential structural elements were found. The free alcohol was reduced to a known substance, cetyl alcohol, which was unambiguously identified. In this way we showed that a straight chain of 16 carbon atoms was present. The coloured ester was then oxidised using a micromethod specifically developed for this purpose. And all 16 carbon atoms were detected in the form of hydroxycapric acid, in the form of butyric acid and in the form of oxalic acid. Thus, the formula was unequivocally identified. Now, chemists know that the spatial arrangement around a double bond can always give rise to two isomers, resulting from the configuration of the atoms in space. We can have a cis or a trans configuration at the double bonds that carry substituents. This means that a compound with this formula exists in four isomeric forms. A cis can occur at both double bonds, and a trans can occur at both. A cis configuration here, a trans there, or a trans here, a cis there. Spectroscopic analyses have shown that one of the double bonds has a trans configuration, the other probably a cis configuration. Thus, the number of 4 possible isomers has been reduced to 2. In the past year we have attempted to prepare these 4 isomers of hexadecadienol synthetically and have been successful in doing so. These isomers are extraordinarily similar to each other, as you might expect. But the hope of reporting to you today about the physiological testing of the 4 isomers has not been realized, because we still have no silkmoths. This conference was scheduled about 14 days too early. We plan to test these 4 isomers. We are convinced that we have successfully synthesised the attractant itself, and which of the isomers is the actual attractant and how greatly the isomers differ quantitatively in their physiological effect is a question that we are keen to study in the coming weeks. Remarkable is the extremely potent physiological effect of the attractant. The solution used to test the efficacy limit contains, according to the definition of the attractant unit, 10^-10 micrograms per cubic centimetre. The tip of the glass rod, when wetted with the test solution, has around 10^-2 cubic centimetres of test solution adhering to it, corresponding to around 1,000 molecules on the tip. The magic wand carrying this small number of molecules causes 50 of 100 individual silkmoths to beat their wings. When you consider that the vapour pressure of hexadecadienols is not very high and that the vaporised molecules also have to cross the air space between the glass rod and the insects’ antennae, probably very few individual molecules actually reach the sensitive elements of the antennae. Biochemists are astonished by the relatively simple structure of a substance with such specific action, as this substance is perceived as an attractant only by male silkmoths, not by others. And this attractant contains no branches of carbon atoms, no asymmetric carbon atom. Evidently, part of its specificity lies in the configuration of the conjugated double-bond system. Studying the relationship between structure and activity in this example therefore has particularly interesting prospects. Of course, knowledge of the structure of the sexual attractant of the silkmoth is only of theoretical interest. We expect, however, from the outset that the specific sexual attractants of butterflies and moths all belong to the same substance class, so that the Bombyx attractant holds the key to unlocking the secrets of other sexual attractants. This could prove of practical importance in fighting those moths that are feared as plant pests. We know that the insecticides in use today, we will hear more about them tomorrow, are by no means toxic only to insects, they also harm other animal species and plants treated with insecticides can also be detrimental to humans. Unfortunately, along with insect pests, useful insects are also destroyed, and the lack of selectivity in today’s pesticides can lead to major disruptions in the biological equilibrium of the treated biotope. In addition, the use of insecticides leads to the development of resistant strains that are immune to the effects of the agent being used. The notion of using specific sexual attractants to combat insect pests is old and compelling. We could conceivably use a synthetically manufactured sexual attractant of an insect pest to attract only the males out of a district, capture these, and thus interrupt the propagation of the species. The development of resistance to the attractive scent of the coveted females is, I believe, nothing to fear. Ladies and Gentlemen, I’m happy to tell you that a first step in this direction has been made in the chemical field. A working group headed by Haller in Washington, using the methods we developed on the silkmoth, recently isolated the sexual attractant of the gypsy moth, prepared it in pure form, and analysed it. The gypsy moth ranks among those insects that cause untold damage. And here’s the gratifying news for us. What is the chemical nature of this substance? It also contains 16 carbon atoms in a straight chain. It is also a primary alcohol, like our substance. But it contains not two double bonds but just one, and in place of the other double bond, it contains an oxygen function, an acetylated hydroxyl group. The positions of the double bond and the acetoxy group are still unknown. But what is known shows that our idea was correct, that the silkmoth holds the key to the secrets of attractants of insect pests. With the attractant of the gypsy moth experiments conducted outdoors have been successful insofar as it is now possible, with the help of this substance, to determine in a biotope whether gypsy moths are present or not, which is important. And even that would represent a gain if our hope of mounting a real campaign with the attractant is not realized. Ladies and Gentlemen, I would like to stop here. and Thank you for your attention and that I hope I have been able to show you that old problems, which we talked about in the past, are still exciting, and that progress, though unfortunately slow, is being made.

Meine Damen und Herren, auf früheren Tagungen hier in Lindau habe ich, es wurde eben schon gesagt, schon mehrfach über Probleme der Insektenbiochemie gesprochen. Wenn ich mich entschlossen habe, heute das gleiche Thema noch einmal zu wählen, so war der Wunsch maßgebend, Ihnen erzählen zu können über Fortschritte, über Erreichtes auf Arbeitsgebieten, die in früheren Vorträgen im Wesentlichen nur in ihrer Problematik dargestellt werden konnten. Dabei wird es leider nicht ausbleiben, dass ich manchen von Ihnen Altbekanntes neben Neuem erzählen muss, dafür bitte ich von Vornherein um Entschuldigung. Für diejenigen unter Ihnen, die dieser Problematik noch nicht begegnet sind, darf ich vielleicht eine Vorbemerkung machen. Es wird sich vielleicht der eine oder andere fragen, was es für einen Sinn hat, so spezielle Fragen anzugehen, wie sie die Insektenwelt uns stellen. Nun eine solche Meinung möchte ich vielleicht mit folgendem Hinweis entkräften. Sie wissen alle, dass die wissenschaftliche Biologie seit Langem das Stadium ihrer deskriptiven Bemühungen verließ und unter Anwendung der Methoden der Physik und Chemie Grundphänomene des Lebens zu analysieren versucht, die für alle Organismen gelten. Damit erfüllt sie zu ihrem Teil den Auftrag der Wissenschaft, das Wesen des Menschen selbst und der ihn umgebenden und auf ihn bezogenen Natur zu erkunden. Dabei ist sie frei in der Wahl ihrer Objekte und benutzt je nach Fragestellung und verwendeter Methodik die verschiedensten Organismen des Tier-, Pflanzen oder Mikrobenreiches. Und Sie wissen, dass Insekten sehr häufig zur Lösung biologischer Grundprobleme verwendet worden sind. Wir erinnern uns nur daran, dass die für alle Lebewesen - auch für den Menschen - geltenden Gesetze der sogenannten klassischen Vererbungsforschung zu einem ganz großen Teil an Insekten erkannt wurden, und dass auch Gesetze der tierischen Verhaltensweisen zu einem guten Teil an Insekten analysiert werden konnten. Und vor allem die an staatenbildenden Insekten aufgefundenen Prinzipien beglücken ja den ehrfürchtig beobachtenden Forscher immer wieder aufs Neue. Auch die Biochemie, deren Aufgabe es ist, alle mit dem Ablauf von Lebensprozessen verbundenen chemischen Umsetzungen zu analysieren, wählt ihre Objekte aus allen Organismen unserer Erde. Seit über 20 Jahren haben wir am Max-Planck-Institut für Biochemie eine Reihe von chemischen Phänomenen des Lebens studiert, zu denen uns eben die Insekten den Zugang öffneten. Und wie so oft hat es sich auch bei diesen Arbeiten gezeigt, dass sehr spezielle Fragestellungen, die zunächst nur für das Insekt bedeutungsvoll erscheinen, den Zugang zur Lösung allgemeingültiger Phänomene öffnen oder für unser eigenes Gemeinschaftsleben praktisch verwertbare Ergebnisse liefern können. Das möchte ich im Folgenden an einigen Beispielen zeigen. Beginnen möchte ich mit der Betrachtung typischer, für das Insektenreich charakteristischer Naturfarbstoffe. Sie wissen alle, dass die zahlreichen Farbstoffe, mit der die Natur sich schmückt und den Menschen erfreut, für viele Generationen von Chemikern bevorzugte Objekte ihres Interesses gewesen sind. Jede Zeit hat mit dem Fortschritt der analytischen Methodik neue Wege zur Reindarstellung und zur Konstitutionsermittlung von Naturfarbstoffen eröffnet. Und man durfte lange davon überzeugt sein, alle wichtigen und verbreiteten Naturfarbstoffe, die oft auch für die technische Synthese organischer Farbstoffe Modell standen, gut zu kennen. Überraschenderweise aber wurden dabei die Farben des Insektenreiches von rotem, braunem, gelbem und violettem Farbton übersehen, denen nach unseren Arbeiten der letzten Jahre ein bisher in der Natur noch unbekannt gewesener Bautypus zukommt und die, wie wir fanden, zu den am weitesten verbreiteten Naturfarbstoffen gehören. Sehen wir uns zunächst einmal in Bildern an, um was für Farbstoffe es sich handelt und wo wir sie finden. Sie sehen hier im ersten Bild einen Schmetterling, den bekannten Kleinen Fuchs und zwar hat dieser Schmetterling gerade die Puppenhülle verlassen und hat ausgespritzt das, was der Entomologe das Schlupfsekret nennt. Viele Schmetterlinge spritzen unmittelbar nach dem Schlüpfen ein solches Reinigungssekret aus. Sie sehen in diesem Fall, dass dieses Sekret hier auf Fließpapier aufgefangen, eine leuchtend rote Farbe zeigt. Das ist solch ein Farbstoff vom roten Typ im Insektenreich und auch die Flügelzeichen, soweit sie rot, gelb, braun ist, gehört in das Gebiet, was wir besprechen wollen. Flügelfarbstoff unseres Typs sehen Sie auch in den nächsten Bildern. Im nächsten Bild erkennen Sie hier wiederum die Flügel des Kleinen Fuchses. Hier ist das Tagpfauenauge, hier ist der Admiral. Beispiele dafür, wo sich solche gelbe, rote, braune Flügelfarbstoffe finden. Im nächsten Bild sehen Sie Kaisermantel, solche Farben und auch die schöne rote Zeichnung dieses großen amerikanischen Schmetterlings Cecropia platysamia gehört hierher. Auch die Epidermis mancher Insekten oder Larven enthält die Naturfarbstoffe, von denen wir sprechen. Im nächsten Bild sehen wir die Raupe des sogenannten Gabelschwanzes, dadurch gekennzeichnet, dass sie sich unmittelbar vor der Verpuppung intensiv rot verfärbt. Die beginnende Verfärbung ist gerade hier dargestellt. Wieder dieser rote Farbstofftyp. Im nächsten Bild sehen Sie die schöne Farbzeichnung einer Heuschreckenlarve Schistocerca auch hier haben wir die einzelnen Farbstoffmuster, und zum Schluss zeige ich Ihnen noch ebenfalls von der Heuschrecke das Auge der Insekten. Viele Insektenaugen sind rot, braun oder dunkler gefärbt. Nun alle diese Farbstoffe, die ich Ihnen, ich wiederhole, als rote, braune oder noch dunklere Töne von Schlupfsekreten, Flügelfarbstoffen, Epidermisfarbstoffen und Augenfarbstoffen von Insekten vorführte, sind chemisch eng verwandt. Und nach dem universellen Vorkommen in allen Augen der Insekten, wo sie zuerst entdeckt worden sind, haben sie die Gruppenbezeichnung ommochrome Augenfarbstoffe erhalten. Das Vorkommen dieser Stoffe ist nicht auf Insekten beschränkt. Sie finden sich bei allen Gliederfüßlern, zum Beispiel bei Krebsen, auch bei Tintenfischen als Augen- und Hautfarbstoffe und seltener auch in anderen Tierklassen. Es gibt eine ganze Reihe von Ommochromen als chemische Individuen. Als charakteristischen und weit verbreiteten Vertreter dieser Ommochrome wollen wir im nächsten Bild die Struktur nur eines Stoffes betrachten, des sogenannten Xanthommatins. Dieser gelb-braune Farbstoff Xanthommatin wurde zuerst aus dem roten Schlupfsekret von etwa 10.000 Faltern des Kleinen Fuchses in einer Ausbeute von 100 mg rein und kristallisiert gewonnen. Später konnten 19 mg aus den Augen von 7.800 Schmeißfliegen isoliert werden und damit war erstmalig ein Augenfarbstoff der Insekten in reiner Form gewonnen. Xanthommatin findet sich in sehr vielen Insektenaugen. Er findet sich unter den Flügelfarbstoffen und Hautfarbstoffen. Die Konstitution dieses Stoffes wurde aufgeklärt und durch die Synthese eindeutig gesichert. Für diejenigen unter Ihnen, die der chemischen Formelsprache mächtig sind, steht hier die Formel des Xanthommatins und man erkennt, dass es sich handelt um ein sogenanntes Phenoxazonsystem, das ist dieses dreikörnige System mit Stickstoff, dem ein Chinolinring angegliedert ist und hier ist eine Oxo-Aminocarbonsäure-Seitenkette noch vorhanden. Dieses Phenoxazonsystem finden wir in allen Ommochromen. Wir können sagen, Ommochrome sind Phenoxazon-Farbstoffe. Charakteristisch für Xanthommatin und andere Ommochrome ist das charakteristische Redoxverhalten, was auch hier im Bild wiedergegeben ist. Es heißt, diese gelb-braune Farbstufe kann durch Aufnahme von Wasserstoff reduziert werden und geht dann über in eine leuchtend rote Stufe. Hier ist die Konstitution des Hydroxanthommatins mit den beiden hier angelagerten Wasserstoffatomen und der daraus folgenden anderen Verteilung der Doppelbindungen. Das rote Hydroxanthommatin geht unter Abgabe von Wasserstoff wieder in das gelb-braune Produkt über. Und dieses Redoxverhalten im nächsten Bild auch nochmal farbig dargestellt, hier die oxidierte gelb-braune, hier die reduzierte leuchtend rote Farbe ist erstens charakteristisch für die Gruppe, zweitens für den Biochemiker seltsam oder für den Farbstoffchemiker, weil hier bei Reduktion eine Farbvertiefung stattfindet, was im Allgemeinen nicht der Fall ist. Es ist interessant, dass die Natur die beiden Typen oxidierten und reduzierten Farbstoff verwendet. Wir wissen zum Beispiel, dass der vorhin angedeutete Übergang der braunen Farbe der Gabelschwanzraupe in die leuchtend rote Farbe vor der Verpuppung auf einen solchen Reduktionsvorgang zurückzuführen ist. Alle Ommochrome sind Phenoxazonfarbstoffe, sagte ich, das Xanthommatin betrachten wir als Stofftypus, der [nicht] nun in mannigfacher Weise in die Vertreter anderer Ommochrome abgewandelt werden kann. Interessant ist, dass die rote hydrierte Farbstoffstufe in Gegenwart von Sauerstoff nicht sehr stabil ist, sondern der oxidierte Farbstoff ist der stabile. Was tut die Natur, wenn sie die rote hydrierte Farbstoffstufe fixieren will. Sie tut das durch Umwandlung des Xanthommatins in zwei andere Farbstoffe von leuchtend rotem Typ, die sich von dem hydrierten Xanthommatin ableiten lassen und die wir als Rhodommatin und Ommatin D bezeichnet haben. Im nächsten Bild möchte ich Ihnen andeuten, wie die Fixierung auf der hydrierten roten Stufe erfolgt. Sie erkennen hier wieder die hydrierte Form des Xanthommatins, nur ist ein Wasserstoffatom hier am Stickstoff, dort unten am Sauerstoff durch einen Rest R substituiert. Dieser Rest R kann sein entweder ein Zuckerrest, dann bildet sich ein Glucosid, der Rest R kann ein Sulfatrest sein, ein Schwefelsäureester sein, und immer wenn ein solches Wasserstoffatom substituiert ist durch solche Gruppen dann kann die reduzierte Form nicht so leicht, das heißt erst nach Abspaltung des Restes in die oxidierte Form übergehen und so fixiert die Natur die hydrierten instabilen Farbstoffe in leuchtendem Rot. Es sind damit zugleich Stoffe, die Formeltypen weiterer Ommochrome Ihnen gezeigt. Dankeschön. Und das Folgende erscheint uns von allgemeinem Interesse. In dem Ommochromen wurde ein neues, ich sagte es schon, bisher in der Natur nicht beobachtetes Farbstoffsystem, eben das Phenoxazonsystem aufgefunden. In der Technik synthetischer Farben ist dieses System schon seit über 40 Jahren bekannt, ohne dass man seine viel früher schon gemachte Erfindung durch die Natur ahnte. Unter diesen technischen Farbstoffen vom Phenoxazontyp gibt es Vertreter, die als sogenannte Photosensibilisatoren der fotografischen Platte verwendet werden. Sollten die Augenpigmente der Insekten von diesem Typ auch etwas mit der Lichtaufnahme, mit dem Sehvorgang zu tun haben und nicht nur, wie angenommen wird, als Lichtschutzpigmente dienen. Hier ist eine Frage an die Sinnesphysiologie gestellt. Die Ommochrome der Insekten waren die ersten in der Natur aufgefundenen Phenoxazon-Farbstoffe. Bald nach ihrer Entdeckung hat man weitere Vertreter dieses Farbstofftypus in der Natur gefunden. Die Konstitutionsermittlung der Ommochrome lieferte den Schlüssel für die Analyse des farbgebenden Systems der sogenannten Actinomycine. Antibiotisch wirksamer Stoffwechselprodukte von Strahlenpilzen und zugleich den Zugang zu anderen Vertretern dieser Klasse im Reich der Pilze. Sie sehen auf dem Bild oben noch einmal die Formel des Xanthommatins als Typus und sehen, wie diese Grundsubstanz abgewandelt wird durch Substitution in der Farbgruppe der Actinomycine, die von Brockmann untersucht worden sind, und unten sehen Sie Typen von Pilzfarbstoffen, wie sie Gripenberg analysiert hat. Nach ganz neuen Beobachtungen ist es sogar wahrscheinlich, dass das Xanthommatin auch zu den Stoffwechselprodukten des Säugers und vielleicht auch des Menschen gehört. Ob es hier irgendeine Bedeutung besitzt, weiß man nicht. Die Actinomycine sind Antibiotika. Das heißt, sie gehören zu den modernen Waffen des Arztes gegen Infektionskrankheiten, über die wir ja gestern in dem Vortrag von Herrn Domagk so viel Eindrucksvolles hörten. Da sich unter den Actinomycin Arzneimittel gegen bösartige Erkrankungen des Lymphsystems befinden, wird verständlich, dass die Ommochrome - zunächst nur Objekte des wissenschaftlich-spielenden Forschers - die steigende Aufmerksamkeit der pharmazeutischen Industrie gewinnen. Die theoretisch größte Bedeutung aber haben die Ommochrome gewonnen als Merkmale, die nur unter der Wirkung bestimmter Erbfaktoren ausgeprägt werden. Das war das Thema meines allerersten Vortrages in Lindau "Was wissen wir über die Wirkung von Erbfaktoren?". Die Entomologen haben gefunden, dass es Insektenrassen gibt, die keine Ommochrome bilden können. Und die genetische Analyse dieser ommochromfreien Rassen lehrt, dass sie sich von den ommochromhaltigen Wildrassen durch die Veränderung zur Mutation nur einzelner Gene des Erbgutes unterscheiden. Diese Gene müssen somit die Synthese der Ommochrome steuern. Diese Entdeckung ermöglichte erstmalig die Analyse der Genwirkung, das heißt die Beantwortung der gestellten Frage, wie werden bestimmte Außenmerkmale eines Organismus durch die Anwesenheit bestimmter, im Zellkern lokalisierter Erbfaktoren ausgeprägt. Ich darf Sie im nächsten Bild erinnern, an den klassischen Versuch von Alfred Kühn, der diese Entwicklung eingeleitet hat. Wir sehen in diesem Schema die Raupe und Kopf der Mehlmotte Ephestia kuehniella und zwar der Wildform ausgezeichnet durch dunkle Pigmentierung durch Ommochrome. Hier ist eine solche ommochromfreie Mutante, die Raupenhaut ist farblos, die Augen nur rot, der dunkle Farbstoff fehlt und diese beiden Rassen unterscheiden sich nur durch ein einziges Erbmerkmal. Wenn man nun nach Kühn in dieses vorletzte Raupenstadium der farblosen Mutante Gewebe aus der Wildform implantiert, so wird unter dem Einfluss des Gewebes die fehlende Ommochromsynthese nun im Wirt durchgeführt und entstehen aus den farblosen Tieren solche, die sich phänotypisch von den Wildformen nicht unterscheiden. Es muss also hier durch das Implantat die Bedingung übertragen sein, unter denen die irgendwie gestörte Ommochromsynthese ermöglicht wird. Die biochemische Analyse dieses Experimentes hat dann zur Aufstellung dieser Genwirkkette geführt, aus denen Folgendes hervorgeht: Die Ommochrome unserer Farbstoffe entstehen aus der Aminosäure Tryptophan, einem normalen Produkt des Eiweißstoffwechsels durch schrittweisen Abbau über Kynurenin und Hydroxykynurenin. Jeder dieser Schritte wird durch ein charakteristisches Ferment ermöglicht. Diese Fermente sind aber nur vorhanden, wenn bestimmte Gene im Erbfaktorenbestand vorliegen. So kommen wir zum folgenden Schluss: Die Fermente, die bei einem bestimmten Reaktionsschritt katalysieren, werden in Abhängigkeit von Genen gebildet. Gene wirken über Fermente, wenn Gene mutieren, werden die zugehörigen Fermente ausfallen oder verändert und infolge dessen werden chemische Reaktionsschritte hier Teilprozesse der Ommochromsynthese nicht mehr vollzogen. Durch diese Experimente ist gezeigt, und zwar erstmalig gezeigt, dass Gene über Fermente wirken. Die Fermente sind die ersten fassbaren Produkte der Erbfaktoren. Da Fermente spezifische Eiweißstoffe sind, entnehmen wir den Versuchsergebnissen zugleich die wichtige Erkenntnis, dass im Bau der Erbfaktoren die Information liegt für die Synthese spezifischer Eiweißstoffe. Damit wurde ein Grundproblem der Biologie aufgedeckt und im weiteren Experiment zugänglich gemacht. In der Frage, wie die Erbfaktoren einer Zelle die Information für die Synthese spezifischer Eiweißstoffe und damit für die Herstellung aller spezifischen Strukturen der Zelle übermitteln, liegt eines der aufregendsten Probleme der heutigen Biochemie, dessen Lösung aber wohl bevorstehen dürfte. Wir danken es den Insekten, uns ein Gesetz gelehrt zu haben, das inzwischen an vielen anderen Organismen auf breiter Basis bestätigt heute die Analyse der primären im Erbgut gelegenen Steuerungsvorgänge in der belebten Natur erlaubt. Leider können wir den hier gesponnenen Faden nicht weiter spinnen. Wir wenden uns einem anderen Steuerungsproblem aus dem Gebiet der Entwicklungsphysiologie zu. Die meisten Lebewesen entwickeln sich aus einer einzigen Zelle - der befruchteten Eizelle - und die Frage, wie diese Individualentwicklung gesteuert, wie jede Phase der Entwicklung kausal durch die vorhergehende Phase bestimmt wird, umschließt den Problemkreis der Entwicklungsphysiologie. Auch hierzu lehren uns die Insekten mancherlei Grundsätzliches. Ihnen allen ist bekannt, dass die Entwicklung vieler Insekten sich auf dem Wege einer interessanten Metamorphose vollzieht. Aus dem Ei einer Fliege oder eines Schmetterlings schlüpft die sogenannte Larve oder Raupe. Sie wächst heran unter wiederholten Häutungen, den sogenannten Larvenhäutungen. Die ausgewachsene Larve wandelt sich im Vorgang der Puppenhäutung, der sogenannten Verpuppung in eine Puppe um. In der Puppe vollzieht sich die Imaginalentwicklung, an deren Ende die geschlechtsreife Form, die Imago, steht. Sie entschlüpft der Puppe in der sogenannten Imaginalhäutung. Man hat festgestellt, dass diese Folge an Vorgängen Larvenhäutung, Puppenhäutung, Imaginalhäutung durch drei spezifisch wirkende Hormone ausgelöst und gesteuert werden und hier haben wir das zweite Problem vor uns, über das ich in Lindau früher schon einmal gesprochen habe. Damals ist ausgeführt worden, dass die drei Metamorphosehormone nach diesem Schema zusammenwirken in neurosekretorischen Zellen des Gehirns wird das erste Hormon, das adenotrope Hormon gebildet, unter dessen Wirkung produziert die Prothoraxdrüse ein zweites Hormon, das Prothorakalhormon. Seine Gegenwart veranlasst die Epidermis, die Haut, zu einer Häutung. Das Prothorakalhormon befiehlt eine Häutung. Die Form der Häutung wird bestimmt durch die Anwesenheit oder Abwesenheit des dritten Hormons, das in den Corpora allata gebildet wird. Wenn dieses Hormon zugegen ist, und das ist während der ganzen Larvenentwicklung der Fall, erfolgt die Häutung als Larvenhäutung, stellen die Corpora allata die Produktion dieses sogenannten Juvenilhormons auch ein, dann erfolgt eine Puppenhäutung und dasselbe Prothorakalhormon ist schließlich noch für die Imaginalhäutung nötig. Alle drei Hormone, die hier mitspielen, sind inzwischen in Substanz gefasst. Und man kann ihre Wirkung an geeigneten Objekten jederzeit demonstrieren. Wir beschränken unsere Betrachtung heute auf das Prothoraxhormon - das eigentliche Häutungs- oder Verpuppungshormon. Es ist bisher als einziges von den dreien in kristallisierter Form dargestellt worden. Aus einer Tonne frischer Seidenspinnerpuppen lassen sich etwa 75 bis 100 mg des Hormons gewinnen, das wir Ecdyson von Ecdysishäutung genannt haben. Es ist ein bizyklisches System ohne Stickstoff der Formel C18H30O4. Leider kennen wir die Einzelheiten des Baus auch heute immer noch nicht. Wir erhoffen jetzt eine wirksame Hilfe von der Röntgenstrukturanalyse. Aber es konnten in den letzten Jahren mit dem reinen Hormon die physiologischen Wirkungen im Einzelnen studiert werden und von diesen möchte ich Ihnen zwei Beispiele vorführen. Hier wird an einer Fliegenmade eine Ligatur durchgeführt, die das Kopfende vom Hinterende trennt. Das Ergebnis eines solchen Eingriffes ist, wie im nächsten Bild gezeigt, eine Teilverpuppung. Nur das Vorderende verpuppt sich, das Hinterende bleibt Dauerlarve. Dieses Bild erscheint, weil die Metamorphosehormone, die zur Verpuppung führen, im Kopf gebildet werden, und nicht durch die Ligatur in dem hinteren Teil des Tieres gelangen. Wenn man reines Ecdyson in den hinteren Teil in die Dauerlarve hineinspritzt, so vollzieht sie nachträglich noch die Verpuppung. Hier ist gezeigt, wie man mit einer Mikroinjektionsspritze hier in die kleine Larve injiziert und wir injizieren 0,01 ml einer Lösung und zwar eine Menge von 0,01 Gamma also 10^-8 g des Hormons, um eine Verpuppung zu erzielen. Das Ergebnis einer solchen Injektion fällt nach biologischen Versuchen in statistischer Weise aus. Hier sind eine Reihe solcher mit Hormon injizierter Hinterleiber gezeigt und Sie sehen, dass neben Totalverpuppungen, die sich hier vollzogen haben, auch Teilverpuppungen zu beobachten sind und dass auch einige Tiere nicht reagiert haben, wie wir es von einem biologischen Experiment erwarten. Viele von Ihnen werde sich erinnern, dass diese Wirkung Grundlage des physiologischen Testes zum Nachweis und zur Anreicherung des Ecdysons gewesen ist. Das schönste biologische Experiment über die Wirkung des Ecdysons hat Carrol Williams vollzogen und im nächsten Bild sehen Sie aus einer Arbeit von Carrol Williams, was er gemacht hat. Wir haben vorhin den großen Schmetterling, Cecropia platysamia, diesen wunderschönen bunten Spinner gesehen, ein Riesenschmetterling. Und hier oben ist abgebildet das isolierte Hinterstück einer Puppe dieses Schmetterlings. Es ist gezeigt, wie mit kleinen Kanülchen hier zwei Organstückchen hineingebracht werden nämlich neurosekretorische Zellen des Gehirns und Prothoraxdrüse. Also die beiden hormonspendenden Drüsen aus der Prothoraxdrüse wird unter der Wirkung des anderen Implantats das Prothoraxhormon gebildet. Unter der Wirkung dieses Hormons, das wie ich sagte, auch die letzte Phase der Imaginalentwicklung steuert, verwandelt sich nun das isolierte Hinterstück der Puppe in ein Hinterteil des Schmetterlings. Die ganze Form wird verändert, die Farbe wird verändert und das isolierte Hinterstück legt auch Eier ab. Es funktioniert. Es wäre ohne den Eingriff, ohne Zufuhr von Hormon zugrunde gegangen. Das ist nun mit reinem kristallisierten Ecdyson anstelle der zwei Organimplantate wiederholt worden. Im nächsten Bild zeige ich Ihnen dieses einfarbig gelbbraun gezeichnete isolierte Hinterstück auf einer kleinen Agarplatte aufgesetzte Hinterstück einer Puppe, also vor der Imaginalentwicklung, vor der Imaginalhäutung. Würden wir nichts tun, würde dieses isolierte Hinterstück natürlich in kurzer Zeit sterben. Durch Injektion von 6-Gamma Ecdyson ist auch hier die ganze Entwicklung vollzogen, das ist eine Aufnahme des gleichen Präparates. Sie sehen die Veränderung der Form im Sinne des Hinterleibs des Schmetterlings. Sie sehen die Ausprägung der Farben und des Musters. Es wird also hier die ganze Entwicklung unter der Wirkung einer ganz kleinen Menge des Verpuppungshormons nachgeholt. Man kann die kausale Wirkung und Bedeutung eines Hormons im Ablauf eines Entwicklungsschrittes kaum überzeugender dartun. Auch für die Entwicklungsstadien der Säuger und des Menschen wirken Hormone als Regulatoren, doch nirgends vermag man ihre Wirkung so leicht und isoliert zu demonstrieren und zu studieren wie hier. Wie greift nun eigentlich dieses Hormon an. Die Wirkung von Hormonen ist im Einzelnen zumeist noch unbekannt. Wir stehen immer wieder vor der überraschenden Tatsache, dass so winzige Mengen eines Stoffes so revolutionierende Prozesse im Organismus auszulösen vermögen. Ich freue mich, Ihnen sagen zu können, dass Dr. Karlsson in Zusammenarbeit mit dem Max-Planck-Institut für Biologie in Tübingen, Abteilung Beermann, kürzlich mithilfe des Ecdysons eine Beobachtung gemacht hat, die ich für einen ganz entscheidenden Fortschritt halte. Es ist nämlich erstmalig gezeigt worden an diesem Stoff, dass die Funktion der im Kern gelegenen Genorte durch das Hormon beeinflusst wird - in ganz charakteristischer Weise. Wir verdanken Beermann die Erkenntnis, dass jene Teile eines Chromosoms in dem gerade funktionierende Genloci sich befinden, histologisch sich verändern. Es bilden sich hier sogenannte Puffs - Aufblähungen, die wir biochemisch als Auflockerung der Erbsubstanz und Übergang in ihre eigentliche Funktion interpretieren. Die Genetiker haben immer gefordert, dass solche Puffs nicht nur aus einer inneren Gesetzmäßigkeit des Chromosoms entstehen können, sondern dass das umgebende Milieu das Chromosom, die Genloci auffordern müsste, bestimmte Funktionen zu erfüllen, die nun für die weitere Entwicklung nötig sind. Aber man hat niemals die Puffbildung experimentell eindeutig beeinflussen können. Es ist erst jetzt mit Ecdyson gelungen unter Benutzung der Riesenchromosomen der Dipteren an denen man diese Dinge hat so gut verfolgen kann und man hat zeigen können, dass durch geringste Hormonmengen ganz bestimmte Genloci zur Puffbildung, das heißt für uns zur Funktion geführt werden. Wenn wir nun uns an all das erinnern, was vorhin geschildert wurde, dass hier von diesen Genloci aus nun in irgendeiner Weise die Bildung spezifischer Eiweißstoffe eingeleitet wird, dann können wir uns vorstellen, dass durch solche Anforderungen an einzelnen Genloci der Prozess der Bildung spezifischer Enzyme beginnt. Das ist wirklich nur ein Beginn. Und wir wissen noch nicht, wie wir diese Wirkung zu deuten haben, aber ein Fortschritt, den, wie ich sagte, ich außerordentlich hoch veranschlage. Meine Damen und Herren, ein weiteres Beispiel für die Steuerung der Individualentwicklung durch Wirkstoffe liefert uns die Honigbiene Apis mellifica, bei der die Ausprägung verschiedener Geschlechtsformen in das Problem der Ordnung in einem Zellenstaat führt. Ein starker Bienenstock besteht aus etwa 50.000 bis 80.000 sogenannten Arbeiterinnen, und einer einzigen Königin. Im nächsten Bild zeige ich Ihnen die morphologische Differenzierung dieser Typen, in der Mitte die Königin, links die Drohne, rechts die Arbeiterin, das sind Ihnen bekannte Erscheinungen. Die Drohne ist fast so groß, die Königin dunkler als diese. Man weiß, dass die Drohnen, die männlichen Tiere, durch Partenogenese entstehen. Das heißt also aus unbefruchteten Eiern. Während Königin und Arbeiterinnen aus befruchteten Eiern entstehen. Die Entscheidung, ob aus einem befruchteten Ei eine Arbeiterin oder eine Königin wird, fällt allein durch die Brutpflege. Hier sind die Ihnen bekannten verschiedenen Formen der Zellen. Ein befruchtetes Ei, aufgezogen in den kleinen Zellen führt zur Arbeiterin. Ein befruchtetes Ei aufgezogen in den charakteristischen Weiselzellen führt zu der großen Königin. Man beobachtet, dass die den gleichen Eiern entschlüpfenden Larven unterschiedlich in den verschiedenen Zellen ernährt werden. Während die Arbeiterinnenmade nur mit einem stecknadelgroßen Quantum Arbeiterinnenfutter versorgt wird, erhält die als Königin ausersehene Larve in der großen Weiselzelle ein reiches Angebot an sogenanntem Weiselfuttersaft oder Gelee Royal, das in der Futtersaftdrüse der Ammenbienen bereitet wird. Im nächsten Bild sehen Sie einen schematischen Schnitt durch die Biene und hier im vorderen Teil liegen eine Reihe von Drüsen, die hier gezeichnete ist die Futtersaftdrüse, die das Gelee Royal produziert. Trotz vieler Mühe - ich möchte noch einmal wiederholen - man gewinnt den Eindruck, dass die Determination des Eies zu einer Königin durch dieses Weiselfutter erfolgt, also durch die Fütterungsart. Bringt man nämlich eine Bienenmade unmittelbar nach dem Schlüpfen im Stock aus einer normalen Brutzelle, in der sie sich zu einer Arbeiterin entwickelt hätte, in eine Weiselzelle, so wird sie dort mit Gelee Royal gefüttert und wird zur Königin. Aber trotz vieler Mühe hat man bisher vergeblich versucht, eine junge Larve außerhalb des Bienenstocks zu einer Königin heranwachsen zu lassen durch Fütterung mit Gelee Royal. Und es hat deshalb bis in unsere Tage hinein nicht an Stimmen gefehlt, die ganz unbekannten Faktoren der Brutpflege, die Determination der Larve zur Königin zusprechen wollten. Die Verhältnisse haben sich grundlegend gewandelt. Nachdem es Fräulein Dr. Hanser in unserem Institut kürzlich gelungen ist, die Bedingungen zu finden, unter denen man im Brutschrank aus dem Bienenstock unmittelbar nach dem Schlüpfen entnommene präsumtive Arbeiterinnenlarven allein durch Verfütterung von Weiselfutter, das heißt also unter Ausschaltung aller anderen Faktoren der Brutpflege aus ihnen völlig normale Königinnen zu züchten. Die Versuchsanordnung von Fräulein Dr. Hanser ist in diesem Bild gezeigt. Es ist ein kleines Holzbrett und Sie sehen, es sind darin gestellt die kleinen künstlichen Waben. Sie bestehen aus kleinen Glasgefäßen, wie hier eins besonders abgebildet ist. Und Sie erkennen vielleicht in diesen Gefäßen hier schwimmend die sich entwickelnden Larven. Sie schwimmen in Weiselfutter. Wenn es gelingt, junge Larven vor dem Ablauf ihrer ersten zwei Lebenstage in einer Zeit, in der sie besonders empfindlich sind, lebend und ungeschädigt in das Versuchsgefäß zu bringen, entwickeln sie sich im Brutschrank bei einer normalen Stocktemperatur von 35° beim Füttern mit Gelee Royal zu Königinnen. Larven, die am Ende des zweiten Lebenstages oder später den Bedingungen desselben Versuches unterworfen werden, entwickeln sich stets zu Arbeiterinnen. Allerdings können sie unter dem Einfluss des herrschaftlichen Futters zu Riesenarbeiterinnen heranwachsen, wie sie im normalen Bienenstock selten oder gar nicht vorkommen. Das Ergebnis der Versuchsanordnung sehen Sie hier. Sie sehen links eine normale Königin aus dem Stock. Sie sehen ganz rechts eine normale Arbeiterin aus dem Stock. Das ist eine von uns im Laboratorium gezüchtete Königin aus einer kleinen Larve, die im Stock eine Arbeiterin ergeben hätte. Und hier ist eine sogenannte Riesenarbeiterin, die also entsteht, wenn man die Larve zu spät in den Versuch nimmt, das heißt also, wenn die eigentliche Determination schon vollzogen ist. Die Königin unterscheidet sich von der Arbeiterin nicht nur in der Größe, sondern vor allem in der Entwicklung der Eierstöcke und außerdem an einer anderen morphologischen Gestaltung der Mundwerkzeuge. Es fehlen der Königin außerdem an den Hinterbeinen die zum Pollensammeln dienenden Werkzeuge, die Bürsten und Körbchen, kurz: Es ist nicht etwa so, dass eine Königin lediglich sich von der Arbeiterin in der Größe und in der Ausbildung der Eierstöcke unterscheidet, sondern die ganze morphologische Gestalt ist eine andere. Darum ist es wichtig zu sehen, dass die im Brutschrank experimentell erzeugten Königinnen sämtliche Merkmale einer normalen Königin zeigen, sie werden auch von einem Bienenvolk als Weisel angenommen. In einem Bild darf ich Ihnen die unterschiedliche morphologische Ausprägung der Mundwerkzeuge zeigen. Rechts bei der Arbeiterin mit dem langen Rüssel, links bei der Königin. Und Sie sehen hier ganz deutlich die verschiedene morphologische Differenzierung. Nun es ist damit folgendes Ergebnis zu verzeichnen: Es zeigt sich eindeutig, dass die Entscheidung über das biologische Schicksal einer Larve in den ersten 48 Stunden ihres Lebens erfolgt und zwar ausschließlich durch die Art der Fütterung. Ob, wie wir als wahrscheinlich annehmen möchten, im Gelee Royal ein determinierender Stoff spezifischer Wirkung vorkommt oder was auch möglich bleibt, die Determination der Larve zur Arbeiterin durch eine Mangelernährung während der sensiblen Periode erfolgt, ist offen. Aber nun ist die experimentelle Grundlage gelegt, um diese Frage zu entscheiden und wir haben mit Versuchen begonnen, Gelee Royal zu fraktionieren und nun einzelne Fraktionen in den Test der Königinnenentwicklung im Brutschrank zu prüfen. Wir erwarten die Versuche der nächsten Saison wiederum mit besonderer Spannung. Meine Damen und Herren, ich möchte hier dieses Problem der Determination auch abschließen. Die Zeit ist schon fortgeschritten und ich möchte im letzten Teil auch auf ein Problem zurückkommen, das in früheren Vorträgen hier schon einmal angeklungen ist. Auf das Problem der Verständigung der Insekten untereinander durch chemische Stoffe. Wir nennen Stoffe, die in einem Individuum gebildet werden, von diesem auf das andere übertragen und von diesem als Nachrichtenübermittlung empfunden werden Pheromone. Pheromone sind also Sendboten chemischer Stoffe von Individuum zu Individuum. Es gibt deren viele und wir können sie auch als Wirkstoffe der sozialen Korrelation bezeichnen, weil gerade in den staatenbildenden Insekten diese Pheromone in größerer Zahl gebildet werden, damit die Individuen sich verständigen. Zu den Pheromonen gehören die art- und geschlechtsspezifischen Duftstoffe der Insekten, die von Männchen oder Weibchen erzeugt werden, um den anderen Partner anzulocken oder von der Gegenwart des Geschlechtsgenossen zu verständigen. Wir haben uns mit einem solchen geschlechtsspezifischen und artspezifischen Sexuallockstoff beschäftigt, und zwar beim Seidenspinner. Und im letzten Jahr wurde der seit 20 Jahren angestrebte Erfolg erreicht, hier erstmalig ein solches Pheromon einen solchen geschlechtsspezifischen Sexuallockstoff zu isolieren und in der chemischen Konstitution aufzuklären. Bei vielen Insekten wird das sich Finden der Geschlechtspartner durch so artspezifische Lockdüfte ermöglicht. Nähere Kenntnisse über ihre Wirkung sind vornehmlich an Schmetterlingen gewonnen worden, deren außergewöhnliche Geruchsleistungen schon früh auffielen. Insektenliebhaber und Entomologen haben durch zahlreiche Beobachtungen gezeigt, dass die Weibchen vieler Schmetterlingsarten ihre Männchen aus weiter Entfernung anlocken. Ich möchte einen schönen Versuch aus der neueren Literatur erwähnen, der an chinesischen Seidenspinnern gemacht wurde. Männliche Falter dieses Schmetterlings wurden einzeln markiert und aus einem fahrenden Eisenbahnzug in verschiedene Entfernungen vom Ausgangsort freigelassen, an dem sich unter einer Gazeglocke ein Weibchen der Art verbarg. Aus 4,1 km Entfernung fanden noch 40 %, aus 11 km Entfernung noch 26 % der ausgesetzten Männchen zu ihrem Weibchen zurück. Durch eine Reihe leicht durchführbarer Experimente kann man sicher zeigen, dass die Weibchen in besonderen Duftdrüsen geschlechts- und artspezifische Stoffe produzieren, die man aus diesen Drüsen mit Lipoid-Lösungsmitteln extrahieren kann und die vom Männchen mithilfe von Sensillen auf ihren Fühlern wahrgenommen werden. Wir wissen heute, dass die Wahrnehmung dieses Duftes das Männchen veranlasst, gegen die Luftströmung, gegen die Windrichtung zu fliegen und sich so auf die Suche nach dem Geschlechtspartner zu begeben. Dieses Verhalten erklärt, warum die Männchen oft aus so weiter Entfernung angelockt werden. Sie zählen nicht etwa die Konzentration der Moleküle, sondern ein Duftmolekül bedeutet "Fliege auf gegen die Windrichtung" und wir können leicht erkennen, dass in den meisten Fällen ja dieser Lockstoff mit dem Wind gekommen sein muss und dass man deshalb die Wahrscheinlichkeit nicht gering schätzen muss, dass das Männchen nun das Weibchen findet. Es sind viele Ortsversuche angestellt worden solche Duftstoffe zu isolieren, um ihre chemische Konstitution kennenzulernen. Zumeist dienten dabei Schadinsekten, wie Nonne, Traubenwickler, Schwammspinner. Und mit den Extrakten aus den weiblichen Duftdrüsen dieser Arten versuchte man im Freiland deren Männchen anzulocken. Die Zahl der eingefangenen Männchen diente als Maß für die Wirksamkeit des jeweiligen Extraktes. Die Kenntnisse, die man auf diese Weise in 40-jähriger Erfahrung über die Natur solcher Sexualduftstoffe gesammelt hat, waren ganz außerordentlich gering. Wir begannen 1939 uns mit der biochemischen Kennzeichnung, wie ich schon sagte, des Sexuallockstoffes des Seidenspinners Bombyx mori zu beschäftigen. Er war bis dahin für diese Versuche nicht verwendet und hatte doch große Vorteile fürs Laboratorium, es handelt sich um ein Haustier, das man leicht züchten kann, das in der Seidenindustrie in größerer Menge zu beschaffen ist. Die Falter nehmen keine Nahrung mehr auf, man kann sie in offenen Schalen halten, weil sie nicht fliegen und die normalerweise fast unbeweglich verharrenden Männchen geraten in Gegenwart eines weiblichen Seidenspinners oder unter dem Einfluss eines Extraktes aus den Hinterleibspitzen des Weibchens in starke Erregung, die sich bis zum schnellen Flügelschlag und rotierend suchender Bewegung steigert. Und darin liegt die Grundlage für den zur chemischen Aufarbeitung benötigten Test. Wir haben seit 1939 jeweils in den Sommer- und Herbstmonaten Versuche zur biochemischen Kennzeichnung dieses Lockstoffes durchgeführt. Den Zugang zu diesem interessanten Arbeitsgebiet verdanken meine Mitarbeiter und ich dem Vorschlag und Rat von Walter Schoeller, dem damaligen Leiter des Hauptlaboratoriums der Schering AG in Berlin, der, wie ich glaube, zu unserer Freude auch heute unter uns weilt. Die Wahl des Versuchsobjektes dieses einfachen Versuchsobjektes erfolgt auf Anraten des Entomologen Görnitz, der nach orientierenden, gemeinsam mit Schotte im Schoellerschen Laboratorium in Berlin durchgeführten Versuchen die Möglichkeit erkannte, dem allgemeinen Charakter des Sexuallockstoffe der Lepidopteren unter Verwendung des Seidenspinners als Laboratoriumsbeispiel näher zu kommen. Sie sehen hier einen Seidenspinner und bei sexueller Erregung stülpt das Weibchen aus dem letzten Hinterleibssegment zwei Drüsen aus, die Sacculi laterales. Sie sind gelb gefärbt und man kann aus diesen Drüsen mit Lipoid-Lösungsmitteln den Lockstoff extrahieren. Die Männchen sitzen sehr ruhig nach dem Schlüpfen dort. Sie sind gekennzeichnet durch die großen Antennen. Sie behalten fast ihre Ruhelage. Zum Testversuch auf Lockstoff kann man sie in offenen Schalen halten, wo sie einzeln sitzen und in folgender Weise zum Test verwendet werden. Wir führen zunächst einen reinen Glasstab in das Glasgefäß hinein, bringen ihn vor die Antennen und verlangen, dass sich die ruhige Haltung des Tieres nicht ändert. Wenn wir nunmehr die Spitze dieses Glasstabes in einen Lockstoff enthaltenen Extrakt hineinstecken, dann findet sofort dieses intensive Schwirren statt. Es ist für uns das deutlichste Kennzeichen geworden, dass überhaupt noch Leben in dem Tier ist. Diese Tiere leben etwa acht Tage ohne Futteraufnahme, wie ich schon sagte. Wenn man glaubt äußerlich, sie seien nicht mehr am Leben, kann man mit diesem Lockstoff noch feststellen, ob sie die allerletzten Bewegungen dieser Art noch versuchen. Man kann also diese Reaktion zum Test ausbilden. Man kann eine Lockstoffeinheit definieren etwa in der Weise, dass man sagt, eine Lockstoffeinheit von 1 Gamma soll bedeuten, dass die Substanz in einer Konzentration von 1 Gamma pro Kubikzentimeter bei 50 % der Versuchstiere noch diesen Erregungstanz hervorruft, wenn wir in die Lösung die Spitze des Glasstabes - des Zauberstabes stecken. Aus ersten Versuchen des Jahres 39 und 40 über die Anreicherung chemischer Kennzeichnung des Lockstoffes war zu entnehmen, dass es sich um einen lipoidlöslichen neutralen und unverseifbaren Alkohol handeln müsse, der beständig ist gegen verdünnte Säuren und Alkali, aber empfindlich gegen Oxidationsmittel. Aus 7.000 weiblichen Schmetterlingen konnten damals 100 mg einer wachsartigen Fraktion gewonnen werden, welche die Lockstoffeinheit in 0,01 Gamma, also 10^-2 Gamma enthielt. Wir glaubten damals schon dem Ziel ziemlich nah zu sein, aber die folgenden Jahre haben gezeigt, dass jene Präparate noch um mehrere Zehnerpotenzen bis zum reinen Lockstoff anzureichern waren. Nachdem wir aufgrund der langjährigen und alljährlich verbesserten Erfahrung erneut den Extrakt aus 500.000 Drüsen im vorletzten Jahr aufarbeiten konnten, wurde das Ziel der Reindarstellung erreicht. Wie ich sagte, gerade 20 Jahre nach Beginn der Arbeiten. Es gelang, reinen Lockstoff in Gestalt von 12 mg aus diesen 500.000 Drüsen und 12 mg eines kristallisierten farbigen Esters darzustellen, aus dem dann der farblose Lockstoff selbst zu generieren ist. Mit der kleinen Menge konnte eine chemische Konstitutionsermittlung durchgeführt werden. Die Formel dieses ersten geschlechts- und artspezifischen Lockstoffes ist hier unten angegeben. Es ist ein Hexadecadien-ol. Das heißt, wir haben eine gerade Kette von 16 Kohlenstoffatomen. Hexadeca ist Grundsubstanz. Wir haben am Ende dieser Kette eine primäre Alkoholgruppe-ol an Kohlenstoffatom 16. Wir haben zwei Doppelbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen 4 und 5 und 6 und 7. Daher ein Hexadecadien-ol. Unser Bild zeigt, wie die wesentlichen Konstitutionselemente gefunden wurden. Der freie Alkohol wurde reduziert zum bekannten Cetylalkohol, der eindeutig identifiziert wurde. Damit war gezeigt, dass eine gerade Kette von 16 Kohlenstoffatomen vorhanden ist. Es ist dann ein farbiger Ester oxidiert worden nach einer Mikromethodik, die eigens zu diesem Zweck entwickelt wurde. Und es sind alle 16 Kohlenstoffatome gefasst in Gestalt der Hydroxycaprinsäure, in Gestalt der Buttersäure und in Gestalt der Oxalsäure. Damit war diese Formel eindeutig ermittelt. Nun weiß der Chemiker, dass in räumlicher Beziehung an einer solchen Doppelbindung immer zwei Isomere möglich sind, die sich nur durch die Lagerung der Atome im Raum ergeben. Wir können sogenannte Cis- und Translagerung an der Doppelbindung, der Substituenten an der Doppelbindung haben. Das bedeutet, eine Verbindung dieser Formel existiert in 4 Isomeren. An beiden Doppelbindungen kann Cis, an beiden kann Trans sein. An dieser Cis, an jener Trans oder an dieser Trans an jener Cis Konfiguration. Spektroskopische Untersuchungen zeigen, dass eine der Doppelbindungen eine Trans-, die andere wahrscheinlich eine Cis-Konfiguration hat. Darauf würde die Zahl der 4 Isomere auf 2 zurückgehen. Wir haben im letzten Jahr uns bemüht, diese 4 Isomere Hexadecadien-ole darzustellen und es ist auch gelungen synthetisch. Diese Isomeren sind einander außerordentlich ähnlich, wie man erwarten muss. Und die Hoffnung, meine Damen und Herren, Ihnen nun heute über die physiologische Testung der 4 Isomeren berichten zu können, hat sich nicht erfüllt, weil wir noch keine Seidenspinner haben. Diese Tagung ist etwa 14 Tage zu früh einberufen worden. Wir werden diese 4 Isomeren austesten. Wir sind überzeugt, dass die Synthese des Lockstoffs selbst gelungen ist, welche der Isomeren nun der eigentliche Lockstoff ist, und wie stark sich die verschiedenen Isomeren quantitativ in der physiologischen Wirkung unterscheiden werden, ist eine Frage, die wir mit Spannung in den nächsten Wochen studieren können. Bemerkenswert ist die extrem hohe physiologische Wirkung des Lockstoffes. In der Testlösung, mit der man nach der Definition der Lockstoffeinheit die Wirksamkeitsgrenze prüft, befinden sich 10^-10 Gamma in einem Kubikzentimeter. An der Glasstabspitze, die mit der die Testlösung benetzt wird, bleiben etwa 10^-2 Kubikzentimeter Lösung haften, das sind rund 1.000 Moleküle an der Glasstabspitze. Der mit dieser geringen Molekülzahl behaftete Zauberstab bringt 50 von 100 einzeln gehaltenen Seidenspinnermännchen zum Flügelschlag. Berücksichtigt man, dass der Dampfdruck des Hexadecadien-ole nicht hoch ist und die verdampfenden Moleküle ja den Luftraum zwischen Glasstab und Antenne zu überbrücken haben, so dürften nur einzelne oder sehr wenige Moleküle die sensiblen Elemente der Antenne erreichen. Den Biochemiker überrascht der relativ einfache Bau eines Stoffes mit so spezifischer Wirkung, denn dieser Stoff wird ja nur vom Seidenspinnermännchen, nicht von anderen als Lockstoff wahrgenommen. Und dieser Lockstoff enthält keine Verzweigung der Kohlenstoffatome, kein asymmetrisches Kohlenstoffatom. Offenbar liegt ein Teil der Spezifität in der Konfiguration des konjugierten Doppelbindungssystems. Das Studium der Beziehung zwischen Konstitution und Wirkung dürfte daher an diesem Beispiel besonders interessante Ausblicke bieten. Nun, die Kenntnis vom Bau des Sexuallockstoffes des Seidenspinners hat für sich natürlich nur theoretisches Interesse. Wir erwarteten jedoch von vornherein, dass die spezifischen Sexuallockstoffe der Schmetterlinge alle dem gleichen Stofftypus angehören, und uns somit im Bombyx-Lockstoff der Schlüssel zur Verfügung steht, der den Zugang zu den übrigen Sexuallockstoffen öffnen wird. Dem könnte ja möglicherweise praktische Bedeutung zukommen zur Bekämpfung jener Schmetterlinge, die als Pflanzenschädlinge gefürchtet sind. Bekanntlich sind die heute gebräuchlichen Insektizide, wir hören ja noch morgen von ihnen, keineswegs nur für Insekten wirksame Gifte, auch andere Tierarten werden geschädigt und auch für den Menschen können die mit Insektiziden behandelten Pflanzen gefährlich werden. Leider werden gemeinsam mit den Schadinsekten auch nützliche Insekten vernichtet und die mangelnde Selektivität der heute verwendeten Schädlingsbekämpfungsmittel kann zu starken Störungen des biologischen Gleichgewichtes in dem behandelten Biotop führen. Außerdem führt der Einsatz der Insektizide zur Entwicklung resistenter Stämme, die sich der Wirkung des verwendeten Mittels entziehen. Der Gedanke, spezifische Sexuallockstoffe zur Bekämpfung der Schadinsekten einzusetzen, ist alt und bestechend. Man könnte möglicherweise mit einem technisch herstellbaren Sexuallockstoff eines Schadinsektes ausschließlich dessen Männchen aus einem Distrikt herauslocken, diese fangen und damit die weitere Vermehrung der Art unterbrechen. Die Ausbildung einer Resistenz gegen den lockenden Duft der begehrten Weibchen ist, wie ich glaube, nicht zu befürchten. Meine Damen und Herren, ich freue mich, Ihnen sagen zu können, dass ein erster Schritt im chemischen Gebiet nach dieser Richtung inzwischen gemacht wurde. In einer Arbeitsgruppe unter Führung von Haller in Washington ist vor Kurzem unter Verwendung der von uns entwickelten Methodik, am Seidenspinner entwickelten Methodik, der Sexuallockstoff des Schwammspinners, der Gypsy Moths, isoliert und in reiner Form dargestellt und analysiert worden. Die Gypsy Moth gehört zu jenen Insekten, die ganz außerordentlichen Schaden anrichten. Und nun kommt das für uns Erfreuliche. Was ist dieser Stoff chemisch? Er enthält auch 16 Kohlenstoffatome in gerader Kette. Er ist auch ein primärer Alkohol wie unser Stoff. Aber er enthält nicht zwei Doppelbindungen, sondern eine und anstelle der anderen Doppelbindung eine Sauerstofffunktion, eine acetylierte Hydroxylgruppe. Die Lage der Doppelbindung und der Acetoxygruppe sind noch nicht bekannt. Aber das was bekannt ist, zeigt schon, dass unsere Idee richtig war, dass der Seidenspinner uns den Schlüssel liefern würde für die Lockstoffe von Schadinsekten. Mit dem Lockstoff der Gypsy Moth sind Versuche im Freiland gemacht worden, die insofern erfolgreich waren, weil man mithilfe dieses Stoffes in einem Biotop feststellen konnte, ob überhaupt Schwammspinner vorhanden sind oder nicht, was ja schon wesentlich ist. Und auch das wäre ein Gewinn, wenn sich die Hoffnung zerschlagen sollte, nun eine wirkliche Bekämpfungsaktion mit dem Lockstoff zu machen. Meine Damen und Herren, ich möchte hier abbrechen, ihnen für Ihre Aufmerksamkeit danken und ich hoffe, dass ich Ihnen zeigen konnte, dass alte Probleme, die wir früher hier diskutiert haben, immer wieder reizvoll sind und langsam leider vorangehen, aber doch vorangehen.

Adolf Butenandt on Pheromones and Bombykol (in German)
(00:47:03 - 01:03:36)

Conclusion
With the pheromones we conclude our excursion through the world of the small molecules of life. Clearly, the important examples of small molecules discussed here represent merely a glimpse on the vast world of biologically relevant small compounds. Some important groups of small molecules, which are not endogenous in humans, had to be by-passed for the sake of brevity. Those include toxins, medicines and drugs. Nobel Prizes related to such substances were, for example, given in 1945 and 1952 for the discovery of antibiotics penicillin and streptomycin, respectively.

Today, small molecules are rather easy to isolate and characterize, especially in contrast to proteins. In addition, sophisticated synthetic methods in many cases allow for their cost-efficient, large-scale synthesis. Beginning in the second half of the 20th century, Nobel Prizes given for the discovery of “new” small molecules have thus become rather scarce. Instead, the elucidation of entire biomolecular mechanisms, often involving a set of already known small molecules, has moved into focus. The 2004 Nobel Prize to Richard Axel and Linda Buck is a good example of that.

Still, it can be stated without doubt that we do not know all biologically relevant small molecules. The future might thus well hold some exciting surprises. And, coming back to the initial theme, small molecules do significantly contribute to the “chemical worth” of a body. As an average human, you make around 70 kilogram of adenosine triphosphate (ATP) per day [13]. If you would purify and sell only a tenth of that, it would instantly make you a millionaire.

Footnotes:
[1]http://www.wired.com/magazine/2011/01/ff_redmarkets/
[2]D.S. Wishart et al., Nucleic Acids Research 2013, 41(D1), D801-7.
[3]Carpenter, KJ, The Nobel Prize and the Discovery of Vitamins, http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/articles/carpenter/
[4]http://lpi.oregonstate.edu/infocenter/paulingrec.html
[5]F.X. Pisunyer, Critical Reviews in Food Science and Nutrition 33 (1993) 359.
[6]Loewi, O. (1960-1961) Perspect. Biol. Med. 4, 3-25
[7]D.M. Quinn, Chemical Reviews 87 (1987) 955.
[8]T.L. Rosenberry, Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular
Biology 43 (1975) 103.
[9]C. Bremus et al., Journal of Biotechnology 124 (2006) 196.
[10]http://www.nobelprize.org/educational/medicine/insulin/discovery-insulin.html
[11]http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2004/press.html
[12]P.A. Brennan et al., Philosophical Transactions of the Royal Society
B-Biological Sciences 361 (2006) 2061.
[13]S.E. DiCarlo and H.L. Collins, Advances in Physiology Education 25 (2001) 70.