Melvin Calvin (1974) - Carcinogenesis: Chemical, Physical and Biological

Thank you Professor Fuchs, Ladies and Gentlemen, the title of the discussion as it was given in the program is "Carcinogenesis: Chemical, Physical and Biological". The concern for this subject is one of very broad character. Yesterday you heard a call for the scientific community to be concerned with matters of public interest. Well, this one is such a one. In our country, well, first of all we are all surrounded by what seemed to be a variety of agents in our environment, which may, and in fact in some cases we know, do have serious consequences for human health. These include many of the natural environmental agents such as ultraviolet radiation from the sun or ionising radiation either from outer space or from the earth surface or created by man. And of course a wide variety of chemicals. Some created by the needs of mankind, some existing in nature in ordinary food stuffs. Now, as Professor Fuchs said a moment ago, it seems a far cry from the work which he described on photosynthesis to the subject upon which I chose to talk today. In a sense it is, in another sense it isn't. After all the kinds of questions which we sought answers to when we undertook to determine or to try and find out how a green plant uses sunshine to manufacture food and material, involved the use of all sorts, of all branches, of all disciplines of science. Organic chemistry, physical chemistry, physics, biochemistry and biology. And later, as I have found in the last few years, even such matters as human behaviour and economics. This subject is a similar one in that sense, in that it involves all kinds of human knowledge. And the specific way in which I came to be involved in this is something that perhaps at least some of you will appreciate. About 4 years ago there came into my laboratory in Berkley a young man, an Italian who had had a personal, he's an organic chemist, and he had had a personal experience with the disease, a cancer. As a result of that he applied for and received a postdoctoral fellowship from one of the private agencies that exist all over the world, particularly dedicated to the problems of cancer. He also was much interested in working in our Berkley laboratory because some of his friends had been there before him and had told him a little bit about the place. So when he arrived his fellowship specified that he had to work on cancer. But we had nothing going in the laboratory on this subject specifically. And so we had a conference, Ercole and I sat down, he came into my office, we discussed what could be done that would fulfil the requirement of his fellowship and my interests. And after some discussion we agreed that the photochemistry of some carcinogenic agents in the environment would do this. And that is how in detail, specific detail we became involved in the problem. That was the beginning of it. And you see that's the nature of our lives, moving from thing to thing, from adjustment to adjustment. And expanding, always expanding our interests by virtue of the flux of young people which goes through our laboratory. It is the thing which I hopefully believe is so, that keeps us alive in that particular group of workers. Well now, without following that line, without trying to give you the details of what Ercole did and how it expanded into what I'm going to discuss today, I'll point out what he did as we go along. Now, why is this subject relevant, as I said earlier there are carcinogens, various kinds of them, physical, chemical and biological surrounding us all the time. The chemicals which we add to our food, which we use as drugs and with which we are in contact every day. Either in our clothing or in our furniture or in our houses. Contained materials some of which might be and in fact are known to induce the appearance of tumours in man. The only way in which this kind of relationship is established is by an epidemiological study, we don't do experiments with men usually. And it's interesting to remind you that the earliest known such connection was discovered by a British physician almost 200 years ago in the case of the chimney sweeps who cleaned out the chimneys of British homes. You know, each year they collect a lot of soot from the coal that they were burning and these chimney sweeps would have to go through those chimneys and sweep them out. It turned out that there was a particular kind of cancer, cancer of the scrotum which was very prevalent amongst these people. And eventually that cancer was traced to a chemical contained in the soot which collected in the chimneys. And this is the one in fact or one of them with which I will spend most of my time. There are many other such materials now that we know about. That occur in our food or in our environments. The other end of the story, in other words not only do we have a wide variety of carcinogens, that is chemicals, radiation and biological materials. The most recent of which has, and you've heard about it here before, are the viruses. But the consequences of their action, the way in which the carcinogenesis is expressed varies a great deal depending upon that part of the body in which the cancer appears. It looks very different from one to another. So we have a wide variety of agents, very different in character. And we have what looks like a wide variety of consequences also very different in overt appearance. However it is my belief and it is going to be the thrust of everything I say this morning, that this wide variety of agents act through a single kind of mechanism. Not one mechanism but a single kind of mechanism. And that the wide variety of expressions of the consequences, of the biological consequences are all of the same general sort. Involving a change in the genetic content of cells. And the expression of that change of genetic content may be in a variety of forms, but have one thing in common. And it is this commonality between the inducing agents on the one hand and the consequences on the other that I would like to bring into one story if I can. Now, as an example, yesterday at lunch I was reminded of a story or a bit of advice which I frequently find myself induced to give to some students. And what I am going to do today and I'm going to say today is really the embodiment of that advice. Very often a student will arrive or work in the laboratory and spend his entire time gathering data without really trying to integrate it. Saying that well, he doesn't have all of the information and he's going to wait until he has collected it all before he begins to think about it. Now, this isn't really the way science grows. It is true that without data science can't exist or can't continue, can't develop. But it isn't really the way in which a new generation of thought is created. At least not in my experience. And I have to tell them a little story and I do it in this way. I say to them it is not, in order to be creative in science one must, occasionally, not always, in fact very seldom, get the right answer. But occasionally you must get the right answer about how nature is working when you have only half of the data in your hand. And half of what you have is wrong and you don't know which half is wrong. And then you get the right answer, you are doing something creative. And that's what I'm going to do today. I haven't got all the data, some of what I have is wrong but I don't know which parts of it are wrong, but I'm going to try and put it together. And eventually there will emerge from this construction certain kinds of questions which one can put to the, experimental questions which one can put to the test. And as we put them to the test we will modify our concepts to fit. So that the new concept changed by the new information grows eventually into a correct one. Well, now let us go on with the nature of chemical carcinogenesis as we understand it today. Of course it might change but today there is a basic unity, at least there appears to be a basic unity in the nature, in the chemical nature of the substances which are known to be carcinogenic. Produce cancer either in man or in experimental animals or more recently in even simpler systems such as cultures of living cells in a bottle, in a flask from various sorts of animals. And still simpler systems in which we test the chemicals on certain relatively purified enzyme systems which are molecules themselves. And so we have a range of test systems from the whole animal on the one hand, well mankind on the one hand, to animals, to tissue cultures, to molecules. And we do all of them. When we look at the collection of molecules which we know to be carcinogenic in one system or another, we see that there is some commonality in their construction. And the first slide is simply a catalogue of such chemicals. All of them have one thing in common. They all produce electrophilic bits. This carbonium ion, this carbonium ion when the carbon to oxygen bond is broken. The negative charge remains on the oxygen, the positive on the carbon and this carbonium ion then is an electrophilic agent seeking a high density of electrons. And this is true of all of these first four that I have put on the slide machine here. All of them are alkylating agents, electrophilic reagents giving a positive carbon atom. Even without any enzyme interference. And the kinds of electron dense, molecules with which they react are listed over here in this column. And for those molecules which are common in cells, the electrophile, I should say the nucleophiles are mostly in the nucleic acid basis either in DNA or in RNA or in proteins. There may be others as well, these are the principle ones that seem to be involved in the change in the genetic composition of the cell. There are a number of other molecules listed in the lower half which by themselves are not electrophiles, at least not from their first look. However after they are changed enzymatically this one by oxidation of this NH bond to an NOH bond which then can be esterified with acetate or sulphate and this now drops off as a negative ion leaving behind a positive nitrogen ion, which in turn can be and is a powerful electrophile. Just as these carbonium ions are. The same sort of system occurs, the same sort of change occurs on this carcinogen, which used to be used as a food colouring many, many years go, it's no longer so used. It was found to be a carcinogen of the liver. And the mechanism of its transformation from this yellow die into a carcinogen is probably very much the same as this one here. By an oxidation of the nitrogen to the NOH and then eventually getting into a nitronium ion so that it can attack the cellular nucleophiles. The same thing can be said of these nitrogen compounds. Now, down here there is a very simple symbol, PAH meaning polycyclic aromatic hydrocarbons. And these require enzyme activation and when they are so activated they also appear to be nucleophiles. And it is this group of compounds about which I will speak mostly in terms of the chemical consequences. That group of compounds, the particular example of which is shown in the next slide. All are produced always when any combustion of any organic material occurs. For example when you burn tobacco in a cigarette. Some micrograms of benzopyrene, the one on the left, is produced. When you burn gasoline in the internal combustion engine some milligrams of benzopyrene are produced and come out the back end of the exhaust pipe. When you burn coal in a power plant or in a heating system in a home, a good bit of this polycyclic aromatic hydrocarbon is part of the combustion products. And so that particular group of compounds finds its way into our environment in many different ways. Even when you burn wood or I should say agricultural refuse as a result of the harvesting or the pruning of trees. This also is one of the products that comes out in the smoke. And so it is a common environmental component. It is perhaps most effective when it is inhaled into the lungs as a result of smoking a cigarette because then it gets right to the sensitive tissues. And so the very few micrograms from each cigarette are deposited right in the proper place if you like. Well now, the basic notion about how this material which is a relatively inert, it seems to be a relatively inert chemical, these polycyclic aromatic hydrocarbons. How can they become, how can they be made to fit into the notion of electrophilic activity which we mentioned a moment ago. In the last decade a great deal of work has been done implicating an enzyme system which is present in all living cells to some extent, but is induced to a higher level in cells, in most cells, particularly in liver when they are exposed to such materials as this. Not only this one but other materials of the same kind will do the similar thing. These are called, for obvious reasons, the aerial hydrocarbon hydroxylases. A group of mixed function oxidases, that is enzymes which will use molecular oxygen to add one of the oxygen atoms to the aromatic hydrocarbon. And use two hydrogen atoms from a reduced coenzyme to take care of the other oxygen atom. This is what is meant by mixed function oxidase. They are present in most cells and tissues but they are raised to a higher level when such cells and tissues are exposed to these aromatic hydrocarbons. Well now, the next slide shows a way in which that happens. Aromatic hydrocarbon hydroxylase and molecular oxygen and I didn't put on here the reduced pyridine nucleotide which takes the other oxygen atom. And it was proposed that one of these oxygen atoms is used to hook on to the aromatic hydrocarbon in the number three and four position making this epoxide. Now, that's a very unstable compound which with a little bit of acid opens to give a carbonium ion at one of these positions, either that one or that one, which then will react to give a hydroxyl and the remaining carbonium ion will then react with the nucleophile giving the carbon to carbon bond which I mentioned at the beginning. Thus this is proposed as an obligatory intermediate to make this compound into an electrophile which can then be carcinogenic if this reaction occurs. A side reaction which destroys this is simple hydrolysis of this epoxide linkage to give a diol. There are many lines of evidence which indicate that this hydroxylase is indeed involved in making this compound into a carcinogen if one blocks this enzyme in some way. Either by a chemical agent which blocks it or by a mutation which prevents it from being made. This material then does not become carcinogenic in such cells. So the participation of the hydroxylase seems to be well established. However the isolation of such a product has never been achieved. And so we don't really know whether this is indeed the way in which the hydroxylase produces its effect. And it was at this point that the student whose story I told you earlier on, entered the picture. He undertook to examine the reactions of these aromatic hydrocarbons with components of nucleic acids. And the one he chose was N-Methylcytosine. The next slide shows what he found. Instead of finding the hydroxylated compound on the three or four position, he found that the reaction took place on the number six position, I should say on the four or five position. The reaction took place not here but on the number six position to give this product. Now this is a photochemical induced coupling. However the same reaction can be induced with the aryl hydrocarbon hydroxylase and oxygen. Exactly the same reaction in which one gets this kind of a coupling, rather than on the sixths position or on the one and the three. One, three or six and not on the four and five. And that was his contribution then to this business. Well now, we have thus examined the chemical behaviour of a number or carcinogens, this one in particular but as yet we have no clue as to what the biological consequences of such an event might be. Why, if this happens, even if it happens, why should that produce the biological consequences that we know it produces, namely cancer. Now, here I have to leave chemical carcinogenesis, I'll say one more word about it. But we're going to leave chemical carcinogenesis for a moment and examine what we know about biological carcinogenesis. And then after I describe to you what I think is the nature of biological carcinogenesis we will see if we can't put the two things together and make a single unitary concept of the whole thing. Before we leave this chemical reaction let us see if we can imagine what the molecular consequences at least of such a change would be. Now I'm going to, I don't have pictures of it and I don't have a model, it's much too big to carry from Berkley to Lindau. So I'm going to ask you to imagine this thing. Most of you have heard of the structure, of what the structure of the genetic material of living things is, the nucleic acids, either the DNA or the RNA, most all mammalian, well all animals have DNA as their principle storage material for the genetic information. And that this DNA is primarily first constructed as a sequence of basis of which that N-Methylcytosine is one or that cytosine is one instead of the methyl group. There's a ribose sugar there. And it is a long string of such basis of which there are four different kinds, the cytosine is only one of them and there are three others. But they all have similar kinds of electron dense materials in them. They wind up in the double helical structure which you've all heard about. In which the basis are stacked like playing cards one on top of the other, 3 1/2 angstroms, roughly 3 1/2 angstroms apart. Now, if this aromatic hydrocarbon were to slip in between some of these basis and form that kind of a covalent carbon to carbon bond as it is described here. This is a carbon atom and that's a carbon atom. If this were to happen in the double helix, the normal helical structure would be distorted. In fact one could not maintain it if that reaction occurs. And the normal helical structure would be distorted so that at least one of the linear molecules would be looped out, it could not fit in the double helix. It would have to be looped out as a sort of a loop outside of the double helix. At least that, perhaps more. That is a molecular consequence of such a reaction. And at the end of this conversation I will try to deduce or introduce that again and go from that to the biological consequences of such an event. But before I can do that we have to examine what we know or what we think we know about the way in which a virus can induce cancer. Can change the character of cells to make them into malignant cells. Now, most of the work we have done in Berkley, at least in my laboratory that is, has been not with whole animals although we've done some of that and I will show you in the very last slide some of that. But mostly it has been done either with enzymes, isolated enzymes and more recently with cells of animals growing in the test tube, in a tissue culture. And we've examined the behaviour of those cells under various influences, under viral influence, under chemical influence and under both. In order for you to get some idea of how this is done I want to show you a picture of a tissue culture of mouse cells which have been infected with a virus and wherever the virus particles have been introduced into the cells and have transformed them by whatever mechanism - and we'll come to that in a moment - those cells which are transformed show as little piles of cells. And the next slide shows that tissue culture in which a few of the cells had been transformed. On the left we have only a very weak magnification, only a tenfold magnification and the dividing line is right here. This background is a background of normal cells, cells which have not been infected with virus and which grow to confluence and then stop growing. That is when they touch each other, when all the cells are touching each other they signal each other. They send signals to each other in such a way that the growth of the cell stops. However those cells which had been infected and transformed by the virus, the sarcoma virus, no longer are subject to that control mechanism. And even though they come to confluence, to touching each other, they keep on growing. And pile up on top of each other. And these little piles are called foci. And there are visible in this picture, one large focus and another smaller one and still two more smaller ones. There are I think four foci here, one large one and three small ones in which the piles of cells are visible even to the naked eye, one hardly needs a microscope. This is the same picture blown up 40 times instead of ten times, this focus plus that one. You can see, there it is. And each one of these little bright spots is a rounded up cancer cell piling up on top of some more. And here you see the big focus which is that one. And then at the edge of the smaller one here. This kind of system is one which has been widely used in the last decade to explore chemical, viral and radiation carcinogenesis. Rather than using whole animals. One of the reasons for this is one can grow a million cells on a dish only three centimetres in diameter. If one had to grow, do similar statistics with a million animals, even mice, you can imagine what kind of a housing problem that would be. Well, this has facilitated the work enormously. And it is this kind of tissue culture work which is dominant in our laboratory at the moment, it's really the next stage, most of our early work, some of you may remember, was done with single cells of plants, algae. And we kept looking for single cell cultures, we've got them now. And we can grow them both on plates and in deep cultures and this is the way we go about it. Now, what is the nature of the process of the change? Or what do we believe the nature of the change is which has transformed a normal cell into a malignant cell which keeps growing, which is not regulated. The next slide is a diagrammatic representation of that process of transformation. If we can lower it just a little bit, the top number one here represents, this is a DNA containing virus, this is a monkey virus, Simian virus 40. Which contains DNA and is represented here by this oval with the three black dots containing the DNA of the virus. When the virus infect in the cell here, is represented by the larger circle where the X is, representing the DNA of the cell. The chromosome material of the cell. The virus when it infects the cell, the virus injects or allows the DNA of the virus to enter the cytoplasm of the cell. Now, normally, normally, it's hardly normal but an infected cell may reproduce the DNA of the virus in the cytoplasm and eventually that cell membrane will rupture and more virus particles will be liberated. That's the normal course of events of a viral infection. However on a statistical basis a few cases will occur in which the viral DNA may be inserted into the cellular DNA in some way. And we're going to come back to how that happens. If that happens and this is the beginning of that process. Here is the end of it, if that happens, then the cellular nucleus contains not only cellular DNA but may contain all or some part of the viral DNA. And when it divides and grows it now has new information in it, some of it obtained from the virus, here's a pair of them. If that information, if that DNA of the virus has instructions for the manufacture of certain kinds of proteins which will change the membrane of the cell, so that when it comes in contact with another one, the message to stop growing is somehow blocked, it doesn't happen then the cell will continue to grow and we will speak of the cell as having been transformed. This will make itself evident in other ways as well. New proteins will have been, will be made by this cell which are coded for by the viral DNA. And we will see it in the membrane proteins of the cell. In the new antigens which the cell contains. As well as in terms of the nature of the growth mechanism of the cell. Both of these things have been shown. And the fact that the cell contains viral DNA has also been demonstrated by hybridisation experiments in which you measure the way in which the cellular DNA after transformation interacts with virus DNA. And you find that there is a homology between them. There is a certain amount of the viral DNA which has indeed been incorporated into the nuclear DNA as well. Well now, this is how we conceive the mechanism of transformation by a DNA containing virus, it's a monkey virus. But the fact is that the first slide I showed you, not the first one but the one ahead of this in which I showed you the transformation of mouse cells, my sarcoma virus, is not that kind of virus at all. Mouse sarcoma virus, Moloney sarcoma virus is not the DNA containing virus. It's a virus whose genetic information is RNA, not DNA. And the question then is if this is the nature of the transformation process, how can an RNA containing virus, a virus whose genetic information is entirely RNA, how can that achieve this result. Well, this was known six or eight years ago or thereabouts and Temin, a Wisconsin biochemist suggested that in order for this to happen there must be in the virus, or induced by it, an enzyme which could copy the RNA sequence into DNA. Now you should realise that this was at the time almost heresy because the gospel said that you could only go from DNA to RNA and then to protein, that you couldn't go the other way. And here was a young man suggesting that you could go the other way, in fact that you had to go the other way. Well, it took about five years before that enzyme was actually demonstrated in the mouse sarcoma virus and other oncogenic, as cancer producing RNA viruses. And thus the idea of the integration of viral information, genetic information into the chromosomes of the cell as the act of transformation from normal to cancer cell could be maintained. If such an enzyme copied the RNA virus into DNA. And the next slide shows that schematically. The copying of RNA virus, the normal behaviour of the cell, here's the DNA of the cell is copied by DNA dependent RNA polymerase to RNA which then makes proteins and a new cell and this is as shown on both sides, both to protein new cell and to replicate the DNA of the normal cell. However if we infect the cell with a viral RNA of an oncogenic virus and if it carries with it this RNA dependent DNA polymerase, RNA instructed DNA polymerase, that's what RDP is supposed to stand for, RNA dependent DNA polymerase, we can copy this piece of RNA of the virus into a piece of DNA which now represents the information. The genetic information of the virus in DNA. And then if there's a lot of it present it stands a chance of being inserted into the ordinary synthetic sequence of the cell replicating its own DNA and we could get a piece of this, some part of it at least added into the nuclear DNA of the cell. And we have then a transformed cell. If we have cellular DNA plus viral DNA, we thus get a transformed cell. Now, if this is the case, then if we were to find a chemical which could inhibit that particular enzyme, that particular enzyme. We should not only be able to inhibit the replication of the virus which has to go through this step through DNA and then back again into RNA. That's the normal replication, there's a line missing from here to there to indicate viral replication. We should not only be able to inhibit the replication of the virus, but because we prevent this copy from being made, we also inhibit the transformation. Well about the time that virus and its enzyme was discovered, I should say the enzyme was discovered. It was also found that a class of drugs which had been used to inhibit RNA polymerase in bacteria and was a very useful drug in controlling a variety of bacterial diseases, particularly tuberculosis, that one of its derivatives did indeed have specific inhibitory capacities for that enzyme. Now the next slide shows the picture of that drug and some of the derivatives which we have made. And all it is therefore is for you to get an idea of what they are. I'm not going to use them in any detail or discuss their synthesis. This is the nucleus of rifampicin, a class of antibiotics. And on this position are hooked these various side chains. The R group represents this entire rifampicin nucleus and these are a few of the several hundred of rifampicin derivatives that have been synthesised in the search for anti TB drugs. The one which has turned out to be the most useful for tuberculosis, for inhibiting the RNA polymerase of bacteria is this one. But it turns out that this one will not inhibit the RDP, the RNA dependent DNA polymerase or reverse transcriptase as it is called. The one which does that is the one below it, this one. This one does indeed inhibit that RNA dependent DNA polymerase. And in addition to this some of these others have been made and of these I'm going to speak only of this one which is a very potent inhibitor, even more potent inhibitor of RNA dependent DNA polymerase than is that one. And these are the two drugs, this one called DMB which I will speak of later and this one, well I call it, with a chain open here with two 8's, I call it R82. So later on you will see that. Those two are the only two I will speak about again. Well now, the first thing we did was to use the drugs that we had available, and the one we had available was that one, and I call it DMB, to see if it would inhibit, prevent the cancer producing virus from transforming or making a cancer. And the next slide shows the result of that experiment. Here we have, we're counting now the number of foci, that is the number of cancers which the virus produces. Without any drug we will produce 140 foci for 100,000 cells. With three micrograms of the drug in the medium we have reduced the number of foci to 90. With six we have reduced it still more, with nine we have reduced it still more. Thus the basic idea that the chemical which inhibits that particular enzyme can prevent that virus from transforming the cells is confirmed. But something else is in this slide which caused us some concern. Well, not only concern but excitement. These two columns, XC plaques, are simply devices for counting the number of virus particles that are liberated from the cells. And here you can see that in both of these experiments the drug has not reduced the number of virus particles at all. If anything, it's increased them a little bit. And so there is something wrong with the theory. Now, we don't like to throw it all away so we only threw part of it away or really we added something to it. We suggested that this same drug, these two that I mentioned earlier, too, they would inhibit the reverse transcriptase which is required for copying the viral RNA into DNA. But also there are other enzymes involved later on in the integration of that piece of DNA into the cell. And we make the suggestion which is illustrated in the next slide, that not only does the drug inhibit this enzyme but it may inhibit one or more of these which are required to insert that piece of DNA into the cellular DNA. In fact we can use a small enough amount of drug so that this stuff will not be inhibited. And we will make more virus but one of these other enzymes. And I've listed three here, is more sensitive to the drug than is this one. And at low enough levels this will operate but one of these, one or more of these will not. And thus we can separate the integration phenomenon, that is the transformation from the virus replication step. And that is what I think has happened. Now, if that's the case, then we have to find out which of these enzymes is involved in the integration, they seem all to be. And there may be others which I haven't listed here, which I don't know about, so I have to look, I have to find them. And then this has another consequence which we can test. This says, this idea suggests that if we were to activate these enzymes, if we could find a way of activating this group of enzymes here especially highly in the presence of a large amount of this stuff, we should enhance greatly the rate at which this stuff is integrated into the cellular chromosome and at which transformation occurs. Now, this is a synergism experiment. This is an experiment in which we use something to activate that excision repair system on the left here. And at the same time we will have present a large amount of viral misinformation if you like. And if that situation is true we should enhance the rate at which that misinformation is integrated into the cellular chromosome. Now, that can be done and this is now where we come to the marriage between chemical carcinogenesis and biological carcinogenesis. It turns out that one of the things that the chemicals do, as I mentioned at the beginning is to deform the cellular DNA. Loop it out, react with it and change its normal shape into an abnormal shape. Now, apparently when that happens, enzymes for cutting out the mistake that loop out are induced and the whole, these enzymes are called the excision repair system, cutting out and repairing. So if we put the chemical in which does the reaction which I described earlier and if we have at that time present a large amount of viral DNA, which is carcinogenic, the probability of inserting it is greater, should be greater, should be greater, it's a test. And I found in the literature a number of such tests. We are doing them ourselves with the hydrocarbon. And I found in the literature a number of such tests with other chemical carcinogens. And I'm going to show you one of them because it does show exactly that effect. This is some work of Stitch, a Canadian biochemist who reported it a couple of years ago. And the next slide shows his result. In which he uses a chemical carcinogen and a viral carcinogen together. The viral carcinogen in this case is an adenoma virus, adenoma virus 7. It's a DNA virus. And if he puts the adenoma virus on at the same time he puts on the chemical treatment, in this case the chemical is 4-nitroquinoline and oxide which is a very potent liver carcinogen. And this is a Syrian hamster cell tissue culture. If he puts the SA 7 on, that is the adenoma virus on alone he gets 17 foci. This is the control experiment. The virus alone introduces 17 foci per two million cells, you see here it is per two million cells, If however he puts on the chemical and then within an hour and a half he puts on the virus, you see that instead of 17 transformations he got over 400 transformations. I should tell you that the chemical alone in this particular hamster cell system produces no transformations. The chemical alone will not do it. But here the virus alone does 17, the chemical alone zero, the chemical with the virus 400 or more. A very potent synergism. A confirmation at least of the concept I gave you on the previous picture. That the chemical triggers the introduction of the misinformation which must be there at the time the triggering occurs. There is another statement here, the whole excision repair system which is induced by the nitroquinoline and oxide is over in about eight to ten hours. So 24 hours later it doesn't work. The whole excision repair system has stopped and then adding the adenoma virus doesn't do any, there is no synergism at all. In fact it seems to be suppressed a little bit. This is the sort of confirmation that the chemicals are triggering the introduction of already present strips of misinformation. And those strips could be derived from a variety of sources. In this case that piece of information is derived from the adenoma virus. But it could come from other sources. It could be in extra nuclear DNA which might be in the cell. It could be in inactive DNA in the cell which is then moved around into another part of the chromosome by this whole system. All of these are different possible processes by which an inactive piece of DNA is made to express itself in the cell. And the chemical doesn't create the information, it integrates it. It triggers the integration and this may be the unitary process of the chemical, of the ultraviolet radiation and of the viral or other plasmid information. The way in which they work together. The chemical alone could not on this theory produce the transformation without the presence of some other source of misinformation. And that the integration phenomenon with all the enzymes involved that are involved, play a role. Well now, if that's the case we want to see if those other enzymes, those ligases particularly, the ones that hook together the loose ends of the DNA, play a role in the continuing reproduction of transformed cells. And it turns out that much to our surprise they seem to do so, although the interpretation of this result that I'm going to give you now is very, very questionable. We began to explore other, the second drug that I mentioned, the one that has two C8 groups attached to the hydrazine. It seemed to be a very special drug, had all sorts of properties for penetrating cell membranes that we liked. And we went on, it had very good enzyme inhibiting properties. And so that was the drug of choice. And in order to use it we had to test its toxicity on cells, before you can use it for any experiment. You have to see is the drug itself toxic to the cells. And the next experiment is the result that we found when we studied the toxicity of the R82. Can you focus that a little better, it looks blurred to me, that's much better, thank you. I'm now speaking of another drug of that same class. Instead of that 16 membered ring, which I showed you on the whole catalogue of drugs, I have opened the ring, it's very much the same but it has, instead of having a big 16 membered ring, it has a tail of two 8's. And that's why it's called, has this name. And now on normal cells, we are counting cells and we're determining what happens to normal cells when we add this drug to the medium in which they are growing. And look at this picture on the left, this is the number of days in which the cells are growing. We inoculate roughly 100,000 cells and then we wait and we count them. And the zero here means no drug at all and you see that in three days there is over one million cells and in four days there are about two million cells. The same thing happens when we put three gammas of this drug in it, this R82. So the three gammas of the drug, three micrograms, three millions of a gram of the drug don't do anything, doesn't do anything to the cells. Even five micrograms of the drug per millilitre doesn't do anything to the cells. We have to go up to ten before we begin to see any effect on the normal cells. And by the time we get to 15 or 20 we are really killing off the cells. So the drug is toxic at high enough levels but at low levels it isn't. Now when we look at T-cells, these are transformed cells, cells which have been transformed by the sarcoma virus. These are cells which are in effect cancer cells. And here again is no drug, counting the transformed cells, which grow even a little better when there is no drug than the normal cells, they grow a little faster as they should. But even as little as three micrograms of the drug suppress the growth of the transformed cells. Five micrograms suppress the growth of the transformed cells and ten of course stop it entirely. And if you now take a section here at the second day and count the number of normal and transformed cells at the second day, 48 hours, as a function of how much drug is present. You see that the normal cells resist three, five and even ten micrograms, one has to go to 15 before one suppresses the growth of the normal cells. But the transformed cells are suppressed even at the lowest level. Now, that was a surprise to us because the transformed cells, the cancer cells are in general much more vigorous than the normal cells. And here is a case in which the thing seems to be reversed. Now let me show you just quickly the last three slides in which you see what happens to the cells themselves. That was just a count and the next slide shows some pictures of the cells themselves and you can see what happens to them. This one is the normal cell without drug. This is the normal cells with drug. Here are the transformed cells. You see the difference between transformed cells and normal cells. Normal cells are elongated with their nuclei in them and growing in stringy close packed. The transformed cells are rounded up and pile up one on top of the other. The transformed cells however in the presence of the drug have disappeared. You see there are very few left. Normal cells grow normally even in the presence of five milligrams of drug. I guess this is five or six milligrams of drug. And here the transformed cells have sort of disappeared. At least they haven't grown. Looks as though they've died. Now we've done another experiment of the same sort. We've taken a tissue culture and the next slide shows it. We've taken a tissue culture and we have infected it with Rous sarcoma virus. And this is normal cells in the periphery and this is one of the foci that you saw on the very first slide of tissue culture. And the two white arrows are intended to mark the boundaries of the focus. Here is another one just like it, two of them. This one we have simply put fresh medium on and let it grow for 82 hours. And it grows enormously. It grows into a great big focus. In fact it grows into a very large, such a large one that the centre no longer gets nutrient and is necrotic, the cells are dying in the centre but they keep growing around the outside. This is a sort of a model of a solid tumour if you like. Here is an identical one here but after the focus has been formed, we have added the drug to it. And 82 hours later you see the focus has not grown at all. If anything it seems to be fading away. So as a model of the treatment of a tumour after it appears, by this drug, this tissue culture seems to be a positive experiment. And finally looking at the cells themselves we have taken a mixture of the cells. Half of them normal and half transformed. Next slide, half normal and half transformed in the top of the slide. And you see the transformed cells are the rounded up ones and the normal ones are the long ones. You see the transformed ones and the normal ones. This is the beginning of the experiment. We add the drug and let it go for two days and it looks as though there are very few transform cells left, one, two, three, a few of them. Most of the cells are normal. We don't know whether that normality, normal appearance of the tissue culture is due to the overgrowth of the normal cells over the transformed or whether it is due to the toxicity of the drug on the transformed cells simply eliminating them. And that's a very fundamental difference. In other words does the drug reverse the transformation or does it simply kill the transformed cells. It looks as though it simply kills them but we don't know for a fact that that is the case. And that's about where the experiments are. Now as a final picture let me tell you that we have gone a little further than tissue cultures. This is chicken cells in tissue culture and you have to keep that in mind, it's a long way from a human being, very long way. But we have gone one step further, we have used not this drug but the first one, DMB drug on rats which have been induced to have mammary tumours by a chemical, a condensed ring system hydrocarbon. I'm now returning to where this talk began. If this is all, if all the ideas hang together. These chemicals should not only prevent the transformation but conceivably could have a therapeutic effect even after the transformation has become visible. That wasn't the case, that idea wasn't extent when this last experiment was done. We used a strain of animals which has in it the necessarily genetic information so that when the animal is given one injection of a condensed ring hydrocarbon, dimethyl benzanthracene or trimethyl benzanthracene, let's say dimethyl benzanthracene. It's a condensed ring hydrocarbon which is in all these combustion smokes. All the animals developed mammary tumours. They have the genetic composition to do it. And the next slide, this is the last slide, shows, look at the upper part only. Here is the control experiment, N equal 17, that is 17 animals got an injection of dimethyl benzanthracene and they were all dead at eight weeks, zero survived. Percent unaffected zero, none unaffected, all dead in fact. It's a very potent titration. You know it's a hard titration to do because it takes such a long time. And of course it's a hard titration to do with very much statistical validity because it takes a lot of animals. I mean 17 animals is not a very great number. Of course if we had a million it would be better, but we don't. I mean we don't have a barn for a million rats. So we have to do it in this way. Well now if we give, we have here 12 animals which got dimethyl benzanthracene. You see they all die after eight weeks. These 12 got ten milligrams of the drug every seven days. And the course of the disease was at least altered, it was slowed down. Eventually they all died. If however we give ten milligrams every four days, in other words more drug, the course of the disease is altered still further and some of them even survive. The significance of a whole animal experiment of this kind is very difficult to be sure of. You know it's bad enough, may I have the lights please, it's all done now the slides, it's bad enough to try and interpret an experiment with tissue cultures, with whole cells. We want to keep pushing it back to the enzyme and to the substrate as far as we can get. So I've shown you experiments at all three levels, enzyme inhibition, cell inhibition and animal inhibition. The least certain of these is the whole animal work. Next in confidence is the tissue culture or cell work. And finally the one that is most, we have most confidence in is the enzyme inhibition. But for that one we have only the one enzyme, the reverse transcriptase. The only one we know. We know that there are three or four others involved in the transformation and we are just now in the process of trying to find out which ones they are, fish them out and do the experiments on the isolated enzymes. And we'll know then what is going on. We will have to find out also in detail what the chemical change is which induces the formation of those enzymes. We only have an indication of that. And that's where we are today. Perhaps if some of you students up there three years from now won't be here I'm afraid, I don't know where you'll be, you'll be someplace else. But if things go one tenth as well as, if one tenth of the guesses I have made today are correct there will be something to tell you about another time. Thank you very much. Applause.

Vielen Dank, Professor Fuchs. Meine Damen und Herren, der Titel der Diskussion, wie er im Programm angekündigt wurde, lautete "Karzinogenese: chemische, physikalische und biologische Aspekte". Dieses Thema findet ein sehr breit gefächertes Interesse. Gestern hörten Sie den Appell, dass sich die Gemeinschaft der Wissenschaftler mit Angelegenheiten von öffentlichem Interesse beschäftigen sollte. Nun, hierbei handelt es sich um eine solche Sache. In unserem Land..... Nun, wir alle sind zunächst einmal in unserer Umwelt von einer Vielzahl von Stoffen umgeben, von denen einige möglicherweise - bzw. in manchen Fällen definitiv - ernsthafte Konsequenzen für die menschliche Gesundheit haben, wie zum Beispiel die ultraviolette Strahlung der Sonne oder die ionisierende Strahlung, die aus dem Weltraum stammt, von der Erdoberfläche oder vom Menschen selbst produziert wurde. Und selbstverständlich von einer großen Vielzahl von chemischen Verbindungen, wobei einige von ihnen von den Bedürfnissen des Menschen geschaffen wurden, andere hingegen in der Natur in alltäglichen Lebensmitteln vorhanden sind. Nun, wie Professor Fuchs soeben gesagt hat: Es besteht ein großer Unterschied zwischen den Arbeiten zur Photosynthese, die er beschrieben hat, und dem Thema, das ich für meinen heutigen Vortrag ausgewählt habe. In gewisser Hinsicht trifft das zu, in anderer jedoch auch nicht. Schließlich spielten bei den Fragen, die wir zu beantworten versuchten, als wir zu erklären versuchten, wie grüne Pflanzen das Sonnenlicht verwenden, um Nahrungs- und andere Stoffe zu synthetisieren, höchst unterschiedliche Fächer aus allen Zweigen der Wissenschaft eine Rolle. Organische Chemie, physikalische Chemie, Physik, Biochemie und Biologie. Und später, wie ich in den letzten Jahren erfahren habe, sogar solche Dinge wie menschliches Verhalten und die Wirtschaft. Dieses Thema ist insofern ähnlich, als es alle möglichen Wissensgebiete umfasst. Der spezielle Weg, auf dem ich es damit zu tun bekam, wird zumindest für einige von Ihnen von Interesse sein. Vor etwa vier Jahren kam ein junger Mann, ein Italiener, in mein Büro in Berkeley, ein organischer Chemiker, der von dieser Krankheit, von Krebs, persönlich betroffen war. Aus diesem Grund hatte er sich bei einer der privaten Organisationen, die sich besonders den Problemen widmen, die mit Krebs in Zusammenhang stehen, und die es überall auf der Welt gibt, erfolgreich um ein Postdoc-Stipendium beworben. Außerdem wollte er unbedingt in unserem Labor in Berkeley arbeiten, weil einige seiner Freunde vor ihm dort gewesen waren und ihm einiges darüber erzählt hatten. Als er ankam, legte sein Stipendium fest, dass er über Krebs forschen sollte. Doch in unserem Labor gab es kein Projekt, das mit diesem speziellen Thema zu tun gehabt hätte. Also hielten wir eine Konferenz ab. Ercole kam in mein Büro und wir besprachen, was wir tun könnten, um die Auflagen seines Stipendiums zu genügen und dabei meine Interessen zu berücksichtigen. Nachdem wir eine Weile diskutiert hatten, waren wir uns einig, dass die Erforschung der Photochemie einiger karzinogener Stoffe der Umwelt ein geeignetes Thema sei. Auf diese besondere Weise bekam ich es mit diesem Problem zu tun. Das war der Anfang. Und Sie sehen, dass dies das Wesen unseres Lebens ist: Wir bewegen uns von einer Sache zur nächsten, von einer zu einer anderen Ausrichtung. Und wir erweitern unsere Interessen, erweitern sie ständig, und zwar mit dem Strom junger Leute, der durch unser Labor fließt. Es ist dasjenige - ich hoffe, dass dies zutrifft -, was uns in dieser besonderen Arbeitsgruppe am Leben erhält. Nun, statt diese Sache jetzt weiterzuverfolgen und ohne zu versuchen Ihnen in allen Einzelheiten zu erklären, was Ercole unternahm und wie dies sich zu dem erweiterte, was ich heute erörtern werde, werde ich im Laufe meines Vortrags auf seine Arbeiten hinweisen. Warum also ist dieses Thema relevant? Wie ich bereits sagte, gibt es krebserregende Faktoren, verschiedene Arten von ihnen, physikalische, chemische und biologische, die uns ständig umgeben: die chemischen Stoffe, die wir unseren Nahrungsmitteln hinzufügen, die wir als Medikamente verwenden und mit denen wir täglich in Berührung kommen, entweder in unserer Kleidung oder in unseren Möbeln oder in unseren Häusern. Sie enthalten Stoffe, von denen einige karzinogen sein könnten bzw. von den wir wissen, dass sie beim Menschen zur Entstehung von Tumoren führen können. Die einzige Methode, mit der sich diese Art von Zusammenhang feststellen lässt, ist eine epidemiologische Untersuchung. Normalerweise werden mit Menschen keine Versuche angestellt. Und es ist interessant sich daran zu erinnern, dass einer der ersten derartigen Zusammenhänge vor fast 200 Jahren von einem englischen Arzt entdeckt wurde, und zwar bei Schornsteinfegern, die die Schornsteine von Wohnhäusern in England säuberten. Sie wissen, dass sie jährlich große Mengen Ruß sammelten, von der Kohle, die man zum Heizen verwendete, und dass sie durch diese Schornsteine krochen und sie ausfegten. Es zeigte sich, dass es eine bestimmte Krebsform gab, einen Krebs des Skrotums, der bei diesen Leuten besonders häufig auftrat. Und schließlich konnte man diesen Krebs mit einem chemischen Stoff in Verbindung bringen, der in dem aus den Schornsteinen zusammengetragenen Ruß enthalten war. Dies ist derjenige Stoff, oder einer von ihnen, mit dem ich mich heute am längsten beschäftigen werde. Es gibt zahlreiche andere solche Stoffe, die uns heute bekannt sind, die in unserer Nahrung und in unserer Umwelt vorkommen. Das andere Ende der Geschichte: Es gibt nicht nur eine große Vielzahl von Karzinogenen, d.h. chemische Stoffe, Strahlung und biologische Materialien. Das zuletzt entdeckte - Sie haben davon an dieser Stelle bereits gehört - sind die Viren. Sondern die Folgen ihrer Wirksamkeit, die Art und Weise, wie es zur Entstehung von Krebs kommt, hängt sehr stark vom Teil des Körpers ab, an dem der Krebs auftritt. Das sieht von Fall zu Fall sehr verschieden aus. Wir haben es also mit einer großen Vielfalt von Faktoren zu tun, und zwar von sehr unterschiedlicher Art. Und wir haben es mit einer großen Vielfalt von Folgen zu tun, deren Erscheinungsbild ebenfalls sehr unterschiedlich ausfällt. Ich bin jedoch davon überzeugt, und es ist das Hauptziel von allem, was ich heute morgen sagen werde, dass diese breite Palette von Faktoren durch eine einzige Art von Mechanismus wirksam ist; nicht durch einen einzigen Mechanismus, sondern durch eine einzige Art von Mechanismus; und dass die große Vielfalt der Ausdrucksformen der Folgen, der biologischen Folgen, alle von der gleichen, allgemeinen Art sind. Sie führen zu einer Änderung im genetischen Inhalt der Zelle. Die Manifestation dieser Änderung des genetischen Inhalts kann auf unterschiedliche Weise erfolgen, wird aber etwas gemeinsam haben. Es ist diese Gemeinsamkeit zwischen dem auslösenden Faktor auf der einen Seite und den Konsequenzen auf der anderen, die ich nach Möglichkeit in meine Darstellung einbringen möchte. Ein Beispiel: Beim Mittagessen wurde ich an eine Geschichte erinnert, oder an einen Ratschlag, den ich häufig Grund habe, an manche Studenten weiterzugeben. Und bei dem, was ich heute tun und was ich sagen werde, handelt es sich tatsächlich um die Verwirklichung dieses Ratschlags. Sehr häufig kommt ein Student ins Labor und arbeitet dort und verbringt seine ganze Zeit damit, Daten zu sammeln, ohne zu versuchen sie zu systematisieren. Er sagt dann, er habe noch nicht alle Informationen gesammelt und er werde warten, bis er sie zusammengetragen hat, bevor er damit beginnt, darüber nachzudenken. Nun, dies ist nicht der Weg, auf dem die Wissenschaft vorankommt. Es ist zwar wahr, dass die Wissenschaft ohne Daten nicht existieren oder fortgesetzt wird, sich nicht entwickeln kann. Doch dies ist nicht die Vorgehensweise, durch die ein neues theoretisches Kapitel aufgeschlagen wird; zumindest nicht nach meiner Erfahrung. Und ich muss Ihnen eine kleine Geschichte erzählen, und ich tue es auf folgende Weise. Ich sage ihnen, dass dies nicht der richtige Weg ist. Um in der Wissenschaft kreativ zu sein, muss man gelegentlich, nicht immer - tatsächlich nur sehr selten - die richtige Antwort finden. Hin und wieder muss man allerdings die richtige Antwort auf die Frage finden, wie die Natur funktioniert, wenn man nur die Hälfte der Daten in Händen hält, und wenn die Hälfte davon falsch ist und man nicht weiß, welche Hälfte die falsche ist. Und dann findet man die richtige Antwort, gelingt einem etwas Kreatives. Und das ist es, was ich heute tun werde. Ich verfüge nicht über alle Daten, einige von ihnen sind falsch, aber ich weiß nicht, welche das sind. Doch werde ich versuchen, sie zu systematisieren. Und schließlich werden sich aus dieser Konstruktion bestimmte Arten von Fragen ergeben, experimentelle Fragen, die man einem Test unterziehen kann. Und wenn wir sie durch Experimente zu beantworten versuchen, modifizieren wir unsere Begriffe, um sie daran anzupassen, sodass der neue, durch die neuen Informationen geänderte Begriff schließlich zu einem wahren Begriff heranwächst. Fahren wir nun fort mit dem Wesen der chemischen Karzinogenese, wie wir sie heute verstehen. Diese Theorie kann sich natürlich ändern, aber heute gehen wir davon aus, dass es eine grundlegende Einheit in der Natur, in der Natur der Substanzen gibt, von denen wir wissen, dass sie karzinogen sind, dass sie beim Menschen oder bei Tieren im Labor oder in letzter Zeit bei noch einfacheren Systemen, wie etwa Kulturen lebender Zellen von verschiedenen Tierarten in einer Flasche, einem Glaskolben, zu Krebs führen. Sogar in noch einfacheren Systemen, in denen wir die chemischen Stoffe mit bestimmten, relativ rein vorliegenden Enzymen testen, bei denen es sich um Moleküle handelt. Und somit haben wir einen ganzen Bereich von Testsystemen, vom ganzen Tier auf der einen Seite, bzw. vom Menschen auf der einen Seite, bis zu Gewebekulturen, Molekülen auf der anderen, und wir verwenden sie alle. Und dies gilt für alle dieser vier ersten Systeme, die ich hier auf dem Dia-Projektor zeige. Sie alle sind alkylierende Wirkstoffe, elektrophile Reagenzien, die ein positives Kohlenstoffatom abgeben. Sogar ohne jedes Zutun eines Enzyms. Und die Art der Elektronendichte, die Moleküle, mit denen sie reagieren, sind hier in dieser Spalte aufgelistet. Diejenigen Moleküle, die in Zellen häufig vorkommen, die elektrophilen, ich sollte sagen: die nukleophilen, befinden sich größtenteils in der Nukleinsäurebasis entweder der DNA oder in der RNA oder in Proteinen. Es mag noch andere geben. Dies sind die wichtigsten, die an der Änderung in der genetischen Zusammensetzung der Zelle scheinbar beteiligt sind. In der unteren Hälfte sind eine Reihe von Molekülen aufgelistet, die an sich nicht elektrophil sind, zumindest nicht auf den ersten Blick. Sie sind es jedoch, nachdem sie durch Enzymreaktionen geändert wurden, dieses durch Oxydation seiner NH-Bindung zu einer NOH-Bindung, die dann mit Azetat oder Sulphat verestert werden kann, und nachdem dies dann als negatives Ion abfällt, das ein positives Stickstoffion zurücklässt, das wiederum sehr elektrophil sein kann und es in diesem Fall auch ist. Ebenso, wie es diese Ionen des Kohlenstoffs sind. Dasselbe geschieht, dieselbe Art von Änderung geschieht bei diesem Karzinogen, das früher als Lebensmittelfarbstoff verwendet wurde, vor vielen, vielen Jahren; heute nicht mehr. Man stellte fest, dass es Leberkrebs verursacht. Und seine Umwandlung von diesem gelben Farbstoff zu einem Karzinogen erfolgt wahrscheinlich sehr ähnlich wie diese hier: durch eine Oxydation des Stickstoffs zu NOH, welches dann schließlich zu einem Stickstoffion wird, sodass es die nukleophilen Moleküle der Zelle angreifen kann. Dasselbe gilt für diese Stickstoffverbindungen. Hier unten befindet sich ein sehr einfaches Symbol, PAH, das für polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe steht. Sie benötigen eine Enzymaktivierung und sind anschließend scheinbar auch nukleophil. Es ist diese Gruppe von Verbindungen, über deren chemische Konsequenzen ich hauptsächlich sprechen werde. Über diese Gruppe von Verbindungen, ein konkretes Beispiel hierfür ist auf dem nächsten Dia dargestellt. Alle von ihnen entstehen jedes Mal, wenn beliebige organische Stoffe verbrannt werden; so zum Beispiel, wenn man Tabak in einer Zigarette verbrennt. Dabei entstehen einige Mikrogramm Benzopyren, der Stoff auf der linken Seite. Wenn man Diesel in einem Motor verbrennt, entstehen einige Milligramm Benzopyren und gelangen durch den Auspuff in die Umwelt. Wenn man Öl in einem Kraftwerk oder in der Heizanlage eines Hauses verbrennt, besteht ein recht großer Teil der Verbrennungsendprodukte aus diesen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen. Diese bestimmte Gruppe von Verbindungen gelangt demnach auf vielen verschiedenen Wegen in unsere Umwelt; selbst wenn man Holz verbrennt, oder ich sollte besser sagen: landwirtschaftliche Abfälle, als Teil der Abholzung oder wenn man Bäume zurückschneidet. Auch bei ihrer Verbrennung ist es eine der im Rauch vorkommenden Verbindungen. Daher kommen sie in der Umwelt relativ häufig vor. Sie sind vielleicht am wirksamsten, wenn sie beim Rauchen von Zigaretten in die Lunge eingeatmet werden, da sie dann direkt mit den empfindlichen Geweben in Kontakt kommen. Die wenigen Mikrogramm jeder Zigarette werden also sozusagen direkt an der "richtigen" Stelle abgelagert. Nun ja, es stellt sich hier die Frage, wie dieser Stoff, der relativ reaktionsträge ist - sie scheinen ziemlich wenig reaktionsfreudig zu sein, diese polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe -, wie es dazu kommt, wie man ihn mit der Vorstellung elektrophiler Aktivität verbinden kann, die wir soeben erwähnt haben? In den letzten 10 Jahren wurde durch viele Arbeiten ein Enzymsystem damit in Verbindung gebracht, das in gewissem Umfang in allen lebenden Zellen vorkommt. Es tritt jedoch in Zellen, den meisten Zellen, besonders in der Leber, in höherer Konzentration auf, wenn sie derartigen Substanzen ausgesetzt sind. Nicht nur diese Verbindung, sondern andere Stoffe derselben Art haben eine ähnliche Wirkung. Diese werden, aus offensichtlichen Gründen, als in der Luft vorkommende Kohlenwasserstoff-Hydroxylasen bezeichnet. Hierbei handelt es sich um eine Gruppe von Oxydasen mit unterschiedlichen Funktionen, d.h. um Enzyme, die molekularen Sauerstoff verwenden, um aromatischen Kohlenwasserstoffen eines der Sauerstoffatome hinzuzufügen. Außerdem verwenden sie zwei Wasserstoffatome eines reduzierten Koenzyms, die sich mit dem anderen Sauerstoffatom verbinden. Dies ist mit der Beschreibung "Oxydase mit unterschiedlichen Funktionen" gemeint. Sie befinden sich in den meisten Zellen und Geweben, treten jedoch in einer höheren Konzentration auf, wenn solche Zellen und Gewebe diesen aromatischen Kohlenwasserstoffen ausgesetzt sind. Nun, auf dem nächsten Dia sehen Sie einen Weg, wie dies geschehen kann: aromatische Kohlenwasserstoff-Hydroxylase und molekularer Sauerstoff. Ich habe das reduzierte Pyridinnukleotid, welches das andere Sauerstoffatom aufnimmt, hier nicht mit angegeben. Man hat die Hypothese vorgeschlagen, dass eines dieser Sauerstoffatome dazu verwendet wird, in den Positionen drei und vier sich mit dem aromatischen Kohlenwasserstoff zu verbinden und auf diese Weise dieses Epoxid herzustellen. Dies ist eine sehr instabile Verbindung, die mit ein wenig Säure aufgebrochen werden kann, so dass sich in einer dieser Positionen ein Kohlenstoffion ergibt, entweder in dieser oder in jener. Dieses reagiert dann und ergibt ein Hydroxyl. Die restlichen Kohlenstoffionen reagieren dann mit den nukleophilen Molekülen, was zu der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verbindung führt, die ich anfangs erwähnt habe. Man hat dies als notwendigen Zwischenschritt vorgeschlagen, der erforderlich ist, diese Verbindung elektrophil werden zu lassen, die dann krebserregend sein kann, wenn es zu dieser Reaktion kommt. Eine Nebenreaktion, wodurch diese Verbindung zerstört wird, ist die einfache Hydrolyse dieser Epoxidverbindung, wodurch ein Diol entsteht. Es gibt zahlreiche verschiedene Hinweise, die den Schluss nahelegen, dass diese Hydrolyse tatsächlich daran beteiligt ist, diese Verbindung zu einem karzinogenen Stoff werden zu lassen, wenn man dieses Enzym auf irgend eine Weise blockiert. Dies kann entweder durch einen chemischen Wirkstoff geschehen, der es blockiert, oder durch eine Mutation, die verhindert, dass es synthetisiert wird. In derartigen Zellen wird dieses Material dann nicht karzinogen. Die Beteiligung der Hydroxylase scheint demnach relativ gut belegt. Es ist jedoch bislang noch nie gelungen, ein derartiges Produkt zu isolieren, und daher wissen wir nicht wirklich, ob es sich hierbei tatsächlich um den Reaktionsweg handelt, auf dem die Hydroxylase diese Wirkung herbeiführt. Dies war der Punkt, an dem der Student, dessen Geschichte ich ihnen vorhin erzählt habe, auf den Plan trat. Er untersuchte die Reaktionen dieser aromatischen Kohlenwasserstoffe mit Komponenten der Nukleinsäuren, und er entschied sich für N-Methylcytosin. Auf dem Dia ist dargestellt, was er herausfand. Statt die hydroxylierte Verbindung in der dritten oder vierten Position zu finden, stellte er fest, dass die Reaktion in der sechsten Position stattfand. Ich sollte sagen, in der vierten oder fünften Position. Die Reaktion fand nicht hier statt, sondern in der sechsten Position, um dieses Produkt zu ergeben. Nun, hierbei handelt es sich um eine fotochemisch induzierte Verbindung. Die gleiche Reaktion kann jedoch mit der in der Luft vorkommenden Kohlenwasserstoff-Hydroxylase und mit Sauerstoff induziert werden. Exakt die gleiche Reaktion, bei der man diese Art von Verbindung erhält, statt an der sechsten Position oder an der ersten und der dritten. An der ersten, dritten oder sechsten, nicht an der vierten oder fünften. Und darin bestand sein Beitrag zu dieser Sache. Nun, wir haben bislang das chemische Verhalten einer Reihe von Karzinogenen untersucht, besonders dieses Karzinogens. Bislang haben wir jedoch noch keinen Hinweis darauf, worin die biologischen Konsequenzen eines solchen Ereignisses bestehen könnten. Warum sollte, wenn dies geschieht, selbst wenn es geschieht, warum sollte dies die biologischen Konsequenzen haben, von denen wir wissen, dass es sie zur Folge hat, nämlich die Entstehung von Krebs? Nun, an dieser Stelle muss ich das Thema der chemischen Karzinogenese abbrechen. Ich werde nur noch eine Sache dazu erwähnen. Doch wir werden gleich das Thema der chemischen Karzinogenese hinter uns lassen und betrachten, was wir über die biologische Karzinogenese wissen. Nachdem ich Ihnen beschrieben habe, was ich für das Wesen der biologischen Karzinogenese halte, werden wir uns fragen, ob wir die beiden Aspekte zusammenführen und ein einziges, einheitliches Konzept aus dem Ganzen entwickeln können. Lassen Sie uns, bevor wir die chemische Reaktion hinter uns lassen, sehen, ob wir uns zumindest vorstellen können, welches die molekularen Konsequenzen einer solchen Veränderung sein würden. Nun, ich habe keine Bilder und kein Modell davon. Es ist viel zu groß, um es von Berkeley nach Lindau zu transportieren. Ich werde Sie daher bitten, sich die Sache vorzustellen. Die meisten von Ihnen haben von der Struktur gehört, davon, was die Struktur des genetischen Materials der Lebewesen ist, von den Nukleinsäuren, entweder von DNA oder RNA. Die meisten, alle Säugetiere, nun ja, alle Tiere haben DNA als das wichtigste Speichermaterial ihrer genetischen Information. Und sie werden davon gehört haben, dass die DNA in der Hauptsache aus einer Sequenz von Basen besteht, zu denen auch N-Methylcytosin gehört, oder dass Cytosin eine Base ist, statt der Methylgruppe. Dies hier ist ein Ribose-Zucker. Es ist eine lange Kette solcher Basen, von denen es vier Arten gibt. Cytosin ist nur eine von ihnen, es gibt noch drei weitere. Sie alle enthalten jedoch Materialien von ähnlicher Elektronendichte. Sie sind in der Struktur einer Doppelhelix angeordnet, von der Sie alle gehört haben werden. Die Basen sind darin wie Spielkarten übereinander angeordnet, in einem Abstand von etwa 3 1/2 ?ngström. Nun, wenn dieser aromatische Kohlenwasserstoff zwischen einige dieser Basen rutschen und diese Art von kovalenter Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung eingehen würde - dies ist ein Kohlenstoffatom und dies ist ein Kohlenstoffatom -, wenn dies in der Doppelhelix geschieht, würde die normale Helixstruktur zerstört. Wenn es zu dieser Reaktion kommt, könnte die Struktur nicht erhalten bleiben. Die normale Helixstruktur würde verzerrt, sodass mindestens eines der linearen Moleküle eine seitliche Schleife bilden würde. Es würde nicht in die Doppelhelix passen. Es würde sich als äußere Schleife neben der Helix befinden. Zumindest dies, vielleicht käme es zu noch größeren Verzerrungen. Dies ist die molekulare Konsequenz einer solchen Reaktion. Am Ende dieses Vortrags werde ich versuchen, dies erneut abzuleiten oder einzuführen und von hier zu den biologischen Folgen eines solchen Vorgangs weitergehen. Doch bevor ich dies tue, müssen wir untersuchen, was wir über den Weg, auf dem ein Virus Krebs auslösen kann, wissen oder zu wissen glauben; den Weg, auf dem es Zellen so ändern kann, dass sie zu bösartigen Zellen werden. Nun, die meisten Arbeiten, die ich in Berkeley durchgeführt habe, zumindest in meinem Labor, wurden nicht mit Versuchstieren durchgeführt - obwohl wir einige solcher Experimente gemacht haben; auf dem letzten Dia zeige ich Ihnen einiges darüber. Größtenteils wurden die Versuche entweder mit Enzymen durchgeführt, isolierten Enzymen, und in jüngster Zeit in Reagenzgläsern mit Tierzellkulturen, in Gewebekulturen. Wir haben das Verhalten dieser Zellen unter den verschiedensten Einflüssen untersucht, unter dem Einfluss von Viren, unter chemischen und unter beiden Einflüssen. Um Ihnen eine Vorstellung davon zu geben, wie dies gemacht wird, möchte ich Ihnen das Bild einer aus Mauszellen bestehenden Gewebekultur zeigen, die mit einem Virus infiziert wurde, wobei die Viruspartikel in die Zellen eingebracht wurden und sie - durch welchen Mechanismus auch immer - umgewandelt haben. Wir werden darauf gleich noch zu sprechen kommen. Diese transformierten Zellen zeigen sich als kleine Zellhaufen. Das nächste Dia zeigt eine Gewebekultur, in der einige Zellen umgewandelt worden sind. Auf der linken Seite haben wir nur eine sehr schwache Vergrößerung, nur eine zehnfache Vergrößerung, und die Trennungslinie verläuft genau hier. Dieser Hintergrund ist ein Hintergrund normaler Zellen, von Zellen, die nicht von einem Virus infiziert wurden und die aufeinander zu wachsen und dann ihr Wachstum einstellen. Das heißt: Wenn sie sich gegenseitig berühren, wenn sich alle Zellen berühren, senden sie sich ein Signal. Sie schicken sich gegenseitig Signale mit dem Resultat, dass das Wachstum der Zellen aufhört. Diejenigen Zellen, die durch das Virus, das Sarkomvirus, infiziert und verändert wurden, unterliegen nicht mehr diesem Kontrollmechanismus. Und obwohl sie zusammenwachsen und sich gegenseitig berühren, wachsen sie weiter. Auf diese Weise entstehen Zellhaufen, und diese kleinen Anhäufungen werden als Foci bezeichnet. Sie sind auf diesem Bild zu sehen: ein größerer Focus und ein anderer kleinerer und noch zwei weitere kleine. Ich glaube, hier sind vier Foci, ein großer und drei kleine, bei denen die Zellanhäufungen mit bloßem Auge sichtbar sind. Man braucht kaum ein Mikroskop, um sie zu sehen. Dies ist dasselbe Bild, nur 40- statt 10mal vergrößert: dieser Focus und jener. Sie können sie sehen, hier sind sie. Jeder dieser kleinen hellen Flecken ist eine umwucherte Krebszelle, die über andere Zellen hinwegwächst. Und hier sehen Sie den großen Focus, bei dem es sich um diesen hier handelt, und dann am Rand hier den kleineren. Diese Art von System war in den letzten 10 Jahren zur Untersuchung der Krebsentstehung durch chemische, virale und durch Strahlungsfaktoren weit verbreitet, mehr als die Arbeit mit Versuchstieren. Einer der Gründe hierfür ist, dass man eine Million Zellen in einer Schale von 3 Zentimetern Durchmesser kultivieren kann. Wenn man eine ähnliche Statistik mit einer Million Tieren durchführen wollte, selbst mit Mäusen, können Sie sich vorstellen, welche Unterbringungsprobleme sich dabei ergeben würden. Nun, hierdurch wurde diese Arbeit enorm erleichtert. Diese Art der Arbeit mit Gewebekulturen dominiert zur Zeit in unserem Labor. Es handelt sich dabei tatsächlich um das nächste Stadium. Der größte Teil unserer frühen Arbeiten - einige von Ihnen erinnern sich vielleicht daran - wurde mit einzelnen Pflanzenzellen durchgeführt, mit Algen. Wir suchten ständig weiter nach Einzelzellkulturen, und haben sie jetzt gefunden. Wir können Sie entweder auf Schalen oder in tiefen Kulturen züchten, und dies ist unsere Vorgehensweise. Worin besteht nun das Wesen der Veränderung, oder was halten wir für das Wesen der Veränderung, die eine normale Zelle in eine bösartige Zelle verwandelt, die ständig weiter wächst und nicht gesteuert werden kann? Das nächste Dia ist eine schematische Darstellung dieses Umwandlungsprozesses. Wenn wir es vielleicht ein wenig nach unten bewegen könnten. Die obere Nummer 1 hier stellt eine DNA dar, die einen Virus enthält. Dies ist das Affenvirus, Simian Virus 40, der DNA enthält und hier durch dieses Oval mit den drei schwarzen Punkten dargestellt ist, in dem sich die DNA des Virus befindet. Wenn das Virus die Zelle hier infiziert, wird dies durch einen größeren Kreis wiedergegeben, wo sich das X befindet, der die DNA der Zelle darstellt, das chromosomale Material der Zelle. Wenn das Virus die Zelle infiziert, injiziert das Virus bzw. die Zelle erlaubt der DNA des Virus in das Zytoplasma der Zelle einzudringen. Nun, normalerweise, normalerweise - es ist wohl kaum normal, aber eine infizierte Zelle kann die DNA des Virus innerhalb des Zytoplasmas replizieren, und schließlich zerreißt diese Zellmembran und weitere Viruspartikel werden freigesetzt. Das ist die normale Ereignisfolge bei einer Virusinfektion. Entsprechend einer statistischen Grundlage treten jedoch einige wenige Fälle auf, bei denen die DNA des Virus auf irgendeine Weise in die DNA der Zelle eingefügt wird. Wie das geschieht, werden wir uns später noch ansehen. Wenn es dazu kommt, ist es der Anfang dieses Prozesses. Hier ist sein Endpunkt. Wenn sich dies ereignet, dann enthält der Zellkern nicht nur seine eigenen DNA, sondern er kann auch die gesamte DNA des Virus oder einen Teil davon enthalten. Und wenn er sich teilt und wächst, enthält er dann neue Informationen, von denen er einige von dem Virus erhalten hat. Hier ist ein Paar von ihnen. Wenn diese Information, wenn diese DNA des Virus Anweisungen zur Herstellung bestimmter Proteine enthält, die die Membran der Zelle verändern, so dass, wenn sie mit anderen Zellen in Kontakt kommt, das Signal zur Unterbrechung des Wachstums irgendwie blockiert ist, wenn es nicht ankommt, dann setzt die Zelle ihr Wachstum fort und wir reden davon, dass die Zelle transformiert wurde. Dies manifestiert sich auch auf andere Weise. Von dieser Zelle werden neue Proteine hergestellt, die von der DNA des Virus kodiert werden. Und wir erkennen es an den Membranproteinen der Zelle, an den neuen Antigenen, die die Zelle enthält, und außerdem zeigt es sich an der Natur des Wachstumsmechanismus der Zelle. Diese beiden Veränderungen konnten belegt werden, und die Tatsache, dass die Zelle Viren-DNA enthält, konnte anhand von Hybridisierungsexperimenten ebenfalls gezeigt werden. Hierbei wird gemessen, wie die DNA der Zelle nach der Transformation mit der DNA des Virus interagiert. Man stellt fest, dass zwischen beiden eine Homologie besteht. Es gibt eine bestimmte Menge viraler DNA, die tatsächlich in die DNA des Zellkerns aufgenommen wurde. Nun, so stellen wir uns den Mechanismus der Transformation durch einen DNA enthaltenen Virus vor. Es ist ein Moloney-Virus. Tatsächlich ist es nun jedoch so, dass auf dem ersten Dia, das ich Ihnen gezeigt habe - nicht auf dem ersten, sondern auf demjenigen davor, auf dem ich Ihnen die Transformation von Mauszellen gezeigt hatte - dass mein Sarkomavirus keineswegs ein Virus dieser Art ist. Das Maus-Sarkomvirus ist kein DNA enthaltendes Virus. Es ist ein Virus, dessen genetische Informationen aus RNA, nicht aus DNA bestehen. Und die Frage lautet dann, wenn es sich hierbei um das Wesen des Umwandlungsprozesses handelt: Wie kann ein RNA enthaltender Virus, ein Virus, dessen genetische Information gänzlich aus RNA besteht, wie kann ein solches Virus dieses Ergebnis erzielen? Nun, man wusste dies schon ungefähr sechs oder sieben Jahre früher, und Temin, ein Biochemiker aus Wisconsin, stellte die Hypothese auf, dass es hierzu ein Enzym geben müsse, das sich in dem Virus befindet oder dessen Herstellung durch das Virus angeregt würde, welches die RNA-Sequenz in DNA übertragen könnte. Nun sollten Sie sich klarmachen, dass dies zum damaligen Zeitpunkt fast eine Häresie war, denn es galt als unbezweifelbarer Grundsatz, dass man nur von der DNA zur RNA gelangen kann und dann zu Proteinen, dass es in der Gegenrichtung nicht möglich war. Und hier war ein junger Mann, der vorschlug, dass dies möglich sei, ja sogar, dass man diesen Weg nehmen musste. Nun, es dauerte etwa fünf Jahre, bis man dieses Enzym im Sarkomvirus der Maus und anderen RNA-Viren als krebserregend nachweisen konnte. Und auf diese Weise konnte die Theorie der Integration von Virusinformation, genetischer Information in die Chromosomen der Zelle als der Vorgang der Umwandlung von normalen zu bösartigen Zellen erhärtet werden; wenn solch ein Enzym den RNA-Virus in die DNA kopierte. Auf dem nächsten Dia ist dies schematisch dargestellt: das Kopieren des RNA-Virus, das normale Verhalten der Zelle. Hier wird die DNA der Zelle von DNA-abhängiger RNA-Polymerase zu RNA kopiert, die dann Proteine und eine neue Zelle herstellt. Dies wird auf beiden Seiten angezeigt: sowohl die Proteinsynthese für die neue Zelle, als auch die Replikation der DNA der normalen Zelle. Infizieren wir die Zelle jedoch mit der viralen RNA eines onkogenen Virus und verfügt es über diese RNA-abhängige Polymerase, von RNA angewiesene DNA-Polymerase - dies ist die Bedeutung der Abkürzung RDP: RNA-abhängige (dependent) DNA-Polymerase -, dann kann dieses Stück der RNA des Virus in ein Stück der DNA kopiert werden, die jetzt diese Information enthält, die genetische Information des Virus in der DNA. Und wenn sehr viel davon vorhanden ist, besteht die Chance, dass sie in die normale synthetische Sequenz der Zelle, die ihre eigene DNA repliziert, eingefügt wird, und es ist möglich, dass ein Teil davon, zumindest ein Teil, der DNA im Zellkern hinzugefügt wird. Wir haben es dann mit einer transformierten Zelle zu tun. Wenn wir DNA der Zelle und virale DNA vor uns haben, haben wir eine umgewandelte Zelle vor uns. Wenn dies der Fall ist, sollten wir, falls es uns gelänge eine chemische Substanz zu finden, die dieses besondere Enzym hemmen könnte, nicht nur in der Lage sein, die Replikation dieses Virus, bei dem dieser Zwischenschritt über die DNA und dann wieder zurück zur RNA erfolgen muss, zu hemmen. Das ist die normale Replikation. Von hier nach dort fehlt eine Zeile, die die Replikation des Virus anzeigt. Wir sollten nicht nur die Replikation des Virus hemmen können, sondern indem wir verhindern, dass die Kopie hergestellt wird, hemmen wir auch die Transformation. Nun, etwa zu der Zeit, zu der dieses Virus und sein Enzym entdeckt wurden - ich sollte sagen, zu der dieses Enzym entdeckt wurde -, stellte man auch fest, dass eine Klasse von Medikamenten, die verwendet worden war, um die RNA-Polymerase in Bakterien zu hemmen und die ein sehr nützliches Medikament zur Kontrolle einer Vielzahl bakterieller Erkrankungen war, besonders der Tuberkulose, dass eines seiner Derivate tatsächlich bestimmte inhibitorische Eigenschaften in Bezug auf dieses Enzym hatte. Das Dia zeigt das Bild dieses Medikaments und einige der Derivate, die wir hergestellt haben. Es soll lediglich dazu dienen, Ihnen eine Vorstellung davon zu geben, um was es sich handelt. Auf ihre Einzelheiten eingehen und ihre Synthese erörtern, werde ich nicht. Dies ist der Kern von Rifampicin, einer Klasse von Antibiotika, und an dieser Stelle sind die verschiedenen Seitenketten damit verbunden. Die R-Gruppe stellt diesen ganzen Rifampicin-Kern dar, und dies sind einige der mehreren Hundert Rifampicin-Derivate, die bei der Suche nach Medikamenten gegen Tuberkulose synthetisiert worden sind. Das für die Behandlung von Tuberkulose, für die Hemmung der RNA-Polymerase von Bakterien, nützlichste Derivat ist dieses hier. Doch es hat sich gezeigt, dass es die RDP, die RNA-abhängige DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase, wie man sie nennt, nicht hemmt. Dasjenige, was dieses leistet, ist das darunter, dieses hier. Dieses Derivat hemmt tatsächlich die RNA-abhängige Polymerase. Und darüber hinaus wurden noch einige dieser anderen produziert, und von denen werde ich nur über dieses hier reden, bei dem es sich um einen hochwirksamen Inhibitor handelt, um einen noch effektiveren Hemmstoff der RNA-abhängigen Polymerase, als es dieser hier ist. Dies sind die beiden Medikamente, dieses wird als DMB bezeichnet. Ich werde später noch darauf eingehen. Und dieses hier, mit einer offenen Kette hier, mit zwei Achten. Ich nenne es R82. Sie werden es später noch sehen. Dies sind die beiden einzigen, über die ich später reden werde. Nun, das Erste, was wir taten, war, die Medikamente verwenden, die uns zur Verfügung standen. Und was uns zur Verfügung stand, war dieses. Ich nannte es DMB. Wir wollten sehen, ob es eine hemmende Wirkung hatte, ob es den krebserregenden Virus daran hindern würde, eine Zellumwandlung zu erreichen bzw. Krebs auszulösen. Auf dem nächsten Dia sehen Sie das Ergebnis dieses Experiments. Hier habe wir... wir zählen jetzt die Zahl der Foci. Dies entspricht der Zahl der Krebsentstehungen, die das Virus verursacht hat. Ohne irgendein Medikament erhalten wir 140 Foci pro 100.000 Zellen. Mit drei Mikrogramm des Medikaments im Medium haben wir die Zahl der Foci auf 90 gesenkt. Mit 6 Mikrogramm haben wir sie weiter gesenkt, mit 9 Mikrogramm noch weiter. Auf diese Weise wurde die grundsätzliche Idee, dass dieser chemische Stoff dieses besondere Enzym hemmen kann, bestätigt. Doch auf dem Dia können Sie noch etwas Weiteres sehen, das uns einige Sorgen bereitete. Nicht nur Sorgen bereitete, sondern für Aufregung sorgte. Diese beiden Säulen, XC-Plaques, sind nichts anderes als einfache Geräte zur Zählung der Anzahl der Viruspartikel, die aus den Zellen freigesetzt werden. Und hier können Sie sehen, dass das Medikament in diesen beiden Experimenten die Zahl der Viruspartikel in keinster Weise reduziert hat. Wenn überhaupt, ist ihre Zahl etwas angestiegen. Mit der Theorie stimmt also etwas nicht. Wir wollten sie nun nicht ganz über Bord werfen, weshalb wir einen Teil von ihr aufgaben bzw. ihr eigentlich etwas hinzufügten. Wir stellten die Vermutung auf, dass dieses selbe Medikament, diese beiden, die ich vorhin erwähnte, die reverse Transkriptase hemmen, die zum Kopieren der viralen RNA in DNA erforderlich ist. Bei der Integration dieses DNA-Stücks in die Zelle spielen zu einem späteren Zeitpunkt auch noch andere Enzyme eine Rolle. Und wir nahmen an, was auf dem nächsten Dia dargestellt ist, dass dieses Medikament nicht nur dieses Enzym hemmt, sondern auch ein oder mehrere von diesen, die benötigt werden, um dieses Stück DNA in die DNA der Zelle einzufügen. Tatsächlich können wir eine ziemlich kleine Menge des Medikaments verwenden, um zu verhindern, dass dieses Enzym gehemmt wird. Und wir produzieren mehr Virenpartikel, aber eines dieser anderen Enzyme. Ich habe hier drei aufgelistet. Dies reagiert empfindlicher auf das Medikament als dieses hier, und wenn die Konzentration niedrig genug ist, funktioniert dieses Enzym, doch eins von diesen, eins oder mehrere von diesen, funktioniert bzw. funktionieren nicht. Und auf diese Weise können wir das Phänomen der Integration, d.h. der Transformation, vom Schritt der Virusreplikation trennen. Das ist es, was, glaube ich, geschehen ist. Nun, wenn dies der Fall ist, dann müssen wir herausfinden, welche dieser Enzyme an der Integration beteiligt sind. Scheinbar sind es alle. Und es mag andere geben, die ich hier nicht aufgeführt habe, von denen ich nichts weiß. Ich muss also danach suchen und sie finden. Und dann hat dies eine andere Konsequenz, die wir testen können. Dies besagt, diese Idee legt die Vermutung nahe, dass wenn wir diese Enzyme aktivieren würden, wenn wir eine Methode finden würden, mit der wir diese Gruppe von Enzymen aktivieren könnten - hier besonders stark in Gegenwart einer großen Menge dieser Enzyme -, dass wir dann die Integrationsrate dieser genetischen Information in die Chromosomen der Zelle, durch die die Transformation geschieht, deutlich erhöhen könnten. Es handelt sich hierbei um ein synergistisches Experiment. Dies ist ein Experiment, in dem wir etwas verwenden, um dieses Exzisionsreparatursystem auf der linken Seite zu aktivieren. Und gleichzeitig haben wir eine große Menge viraler Fehlinformation vorliegen, wenn man so will. Wenn diese Situation zutrifft, sollten wir die Rate, mit der die Fehlinformation in die Chromosomen der Zelle integriert wird, erhöhen können. Nun, man kann dies tun, und an diesem Punkt kommen wir zur "Eheschließung" zwischen der chemischen und der biologischen Karzinogenese. Es zeigt sich, dass eines der Dinge, die die chemischen Substanzen bewirken - wie ich eingangs sagte - darin besteht, dass sie die zellulare DNA deformieren, zu einer externen Schleife führen, damit reagieren und ihre normale Form in eine anomale Form verwandeln. Wenn dies geschieht, werden Enzyme aktiviert, die die fehlerhaften Außenschleifen wegschneiden, und dieses Ganze, diese Enzyme werden als Exzisionsreparatursystem bezeichnet, das ausschneidet und repariert. Wenn wir nun den chemischen Stoff hinzufügen, der die Reaktion durchführt, die ich vorhin erläutert habe, und wenn wir gleichzeitig virale, karzinogene DNA in größerem Umfang vorliegen haben, ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie eingefügt wird, größer - sollte sie größer sein, sollte sie größer sein. Es ist ein Experiment. In der Literatur habe ich eine Reihe solcher Experimente gefunden. Wir führen sie mit Kohlenwasserstoff selbst durch, und ich fand in der Literatur eine Reihe solcher Tests mit anderen chemischen Karzinogenen. Ich werde Ihnen eines von ihnen zeigen, weil es diese Wirkung genau zeigt. Dies ist eine Arbeit von Stitch, von einem kanadischen Biochemiker, der vor ein paar Jahren darüber berichtet hat. Das nächste Dia zeigt sein Ergebnis. Er verwendet gleichzeitig ein chemisches und ein virales Karzinogen. Bei dem viralen Karzinogen handelt es sich in diesem Fall um ein Adenomvirus, um Adenomvirus 7. Es ist ein DNA-Virus. Und er verwendet das Adenomvirus gleichzeitig mit der chemischen Behandlung. In diesem Fall handelt es sich um die chemische Substanz 4-Nitroquinolin und um Oxyd, was ein hochwirksames Leberkarzinogen ist. Und dies ist eine Zellgewebekultur eines syrischen Hamsters. Wenn man das SA 7 hinzugibt, das heißt ausschließlich das Adenomvirus, erhält man 17 Foci. Dies ist das Kontrollexperiment. Das Virus allein führt zu 17 Foci pro 2 Millionen Zellen. Hier sehen Sie, dass es sich um 2 Millionen Zellen handelt, 17 Foci pro 2 Millionen Zellen. Wenn man jedoch die chemische Substanz hinzugibt und dann innerhalb von anderthalb Stunden das Virus, sehen Sie, dass er statt 17 Transformationen mehr als 400 Transformationen erhielt. Ich sollte Sie darauf hinweisen, dass in diesem speziellen Hamsterzellsystem die chemische Substanz zu keinen Transformationen führt. Die chemische Substanz allein hat nicht diese Wirkung. Doch hier führt das Virus allein zu 17, die chemische Substanz allein zu keinen und zusammen mit dem Virus zu 400 oder mehr Foci. Eine höchst wirksame Synergie. Dies ist zumindest eine Bestätigung des theoretischen Konzepts, das ich Ihnen auf dem vorigen Bild gegeben habe: dass die chemische Substanz die Einfügung der Fehlinformation herbeiführt, die zu dem Zeitpunkt, zu dem dieser Auslöser wirksam wird, vorhanden sein muss. Es gibt hier noch eine weitere Feststellung zu treffen: das gesamte Exzisionsreparatursystem, das durch Nitroquinolin und Oxyd angeregt wird, beendet seine Arbeit nach etwa 8-10 Stunden. und auch das Hinzufügen des Adenomvirus führt zu keiner Synergie mehr. Tatsächlich scheint es sogar ein wenig unterdrückt zu sein. Dies ist eine Art von Bestätigung dafür, dass die chemischen Stoffe die Einfügung von bereits vorhandenen Fehlinformationsstreifen auslösen. Und diese Streifen können aus einer Vielzahl verschiedener Quellen stammen. In diesem Fall stammt das Informationsstück aus dem Adenomvirus. Es hätte jedoch auch aus einer anderen Quelle stammen können. Es hätte sich dabei um ein zusätzliches Stück DNA im Zellkern handeln können. Es könnte sich um ein inaktives Stück DNA in der Zelle handeln, das dann durch dieses gesamte System in einen anderen Teil des Chromosoms verschoben werden könnte. All dies sind verschiedene mögliche Prozesse, durch die ein inaktives DNA-Stück zu seiner Expression in der Zelle gelangt. Und die chemische Substanz erstellt die Information nicht: sie integriert sie. Sie löst Integration aus, und hierbei kann es sich um den einheitlichen Prozess der chemischen Substanz handeln, der ultravioletten Strahlung und um die virale oder andere Plasmidinformationen; um die Art, wie sie zusammenarbeiten. Die chemische Substanz allein könnte nach dieser Theorie die Transformation ohne die Gegenwart einer anderen Quelle der Fehlinformation nicht bewirken. Und dass das Integrationsphänomen mit all den Enzymen, die dabei involviert sind, eine Rolle spielt. Nun, wenn dies der Fall ist, wollen wir sehen, ob diese anderen Enzyme, insbesondere diese Ligasen, die die losen Enden der DNA zusammenschließen, bei der fortgesetzten Reproduktion der transformierten Zelle eine Rolle spielen. Und es stellt sich heraus, dass sie dies - sehr zu unserer Überraschung - scheinbar tun, obwohl die Interpretation dieses Ergebnisses, das ich Ihnen jetzt geben werden, sehr, sehr fragwürdig ist. Wir haben damit begonnen, dies zu erforschen, das zweite Medikament, das ich erwähnte, dasjenige, bei dem mit dem Hydrazin zwei C8-Gruppen verbunden sind. Es scheint sich dabei um ein sehr spezielles Medikament zu handeln. Es verfügte über alle möglichen Eigenschaften zur Durchdringung der Zellmembran, die uns gefielen. Und wir setzten unsere Arbeit fort. Es verfügte über ausgezeichnete Enzymhemmungseigenschaften. Und somit war es das Medikament der Wahl. Um es verwenden zu können, mussten wir seine Toxizität für Zellen untersuchen, bevor wir es für irgendwelche Experimente einsetzen konnten. Man muss untersuchen, ob das Medikament selbst für die Zellen wichtig ist. Und das nächste Experiment ist das Ergebnis, das wir gefunden haben, als wir die Toxizität von R82 untersuchten. Können Sie das ein wenig schärfer stellen. Es erscheint mir verschwommen. Das ist viel besser. Vielen Dank. Ich spreche jetzt über ein anderes Medikament derselben Klasse. Statt des aus 16 Elementen bestehenden Rings, den ich Ihnen über den ganzen Katalog der Medikamente gezeigt habe, habe ich den Ring geöffnet. Es ist nach wie vor derselbe, doch er verfügt - statt über einen großen, 16-teiligen Ring, über einen Schwanz aus zwei Achten. Und darauf beruht sein Name. Und nun zu normalen Zellen. Wir zählen Zellen, und wir ermitteln, was mit normalen Zellen geschieht, wenn wir dem Medium, in dem sie wachsen, dieses Medikament hinzufügen. Schauen Sie sich dieses Bild auf der linken Seite an. Dies entspricht der Anzahl der Tage, über die die Zellen wachsen. Wir haben etwa 100.000 inokuliert, und dann warten wir und zählen sie. Die Null hier bedeutet, dass überhaupt kein Medikament verwendet wurde, und Sie sehen, dass es innerhalb von drei Tagen über 1 Million Zellen gibt, und in vier Tagen gibt es etwa 2 Millionen Zellen. Dasselbe geschieht, wenn wir dem Medium drei Mikrogramm dieses Medikaments hinzufügen, dieses R82. Die drei Mikrogramm dieses Medikaments, diese drei Millionstel eines Gramms des Medikaments, haben überhaupt keine Wirkung, sie lassen die Zellen unverändert. Selbst fünf Mikrogramm des Medikaments pro Milliliter wirkt sich auf die Zellen in keinster Weise aus. Wir müssen bis auf 10 Mikrogramm hochgehen, bis wir irgendeine Wirkung auf die normalen Zellen beobachten können. Und wenn wir bis zu 15 oder 20 Mikrogramm geben, töten wir die Zellen ab. Bei Konzentrationen, die hoch genug sind, ist das Medikament giftig, bei geringen jedoch nicht. Wenn wir uns nun T-Zellen ansehen, dies sind transformierte Zellen, Zellen, die durch das Sarkomvirus verändert wurden. Dies sind Zellen, bei denen es sich tatsächlich um Krebszellen handelt. Und auch hier wurde wieder kein Medikament verwendet. Wenn man die transformierten Zellen zählt, stellt man fest, dass sie sogar noch ein bisschen besser wachsen als die normalen Zellen, sie wachsen etwas schneller, als sie sollten. Doch selbst eine so geringe Konzentration wie 3 Mikrogramm des Medikaments unterdrückt das Wachstum der transformierten Zellen. Fünf Mikrogramm unterdrücken das Wachstum der transformierten Zellen und 10 Mikrogramm bringen es vollständig zum Erliegen. Wenn man nun hier am zweiten Tag einen Ausschnitt nimmt und die Zahl der normalen und transformierten Zellen am zweiten Tag zählt, nach 48 Stunden, als Funktion der vorhandenen Menge des Medikaments, sehen Sie, dass die normalen Zellen eine Resistenz gegen drei, fünf und sogar 10 Mikrogramm haben. Man muss bis auf 15 Mikrogramm hochgehen, um das Wachstum der normalen Zellen zu unterbrechen. Die transformierten Zellen werden sogar bereits bei der geringsten Konzentration unterdrückt. Nun, das war eine Überraschung für uns, denn die transformierten Zellen, die Krebszellen zeigen in der Regel ein wesentlich energischeres Wachstum als normale Zellen. Und hier liegt ein Fall vor, bei dem dies scheinbar umgekehrt ist. Lassen Sie mich Ihnen nun noch schnell die letzten drei Dias zeigen, auf denen Sie Bilder von den Zellen selbst sehen. Sie können sehen, was mit ihnen geschieht. Dies ist die normale Zelle ohne Medikament. Dies ist die normale Zelle mit Medikament. Hier sind die transformierten Zellen. Sie können sehen, welche Unterschiede zwischen transformierten und normalen Zellen bestehen. Normale Zellen sind gestreckt und haben ihre Kerne. Sie wachsen dichtgedrängt in fadenartiger Formation. Die transformierten Zellen sind abgerundet und stapeln sich übereinander auf. In Gegenwart des Medikaments sind die transformierten Zellen jedoch verschwunden. Wie Sie sehen, sind nur sehr wenige übrig geblieben. Normale Zellen wachsen selbst bei einer Konzentration von 5 Milligramm normal. Ich vermute, dass es sich hierbei um 5 oder 6 Milligramm handelt. Und hier sind die transformierten Zellen sozusagen verschwunden. Zumindest sind sie nicht gewachsen. Es sieht so aus, als wären sie abgestorben. Wir haben noch ein anderes Experiment derselben Art durchgeführt. Wir haben eine Gewebekultur genommen..... Sie ist auf dem nächsten Dia dargestellt. Wir haben eine Gewebekultur genommen und sie mit dem Rous-Sakomvirus infiziert. Und dies sind normale Zellen an der Peripherie. Dies ist einer der Foci, die Sie auf dem ersten Dia über Gewebekulturen gesehen haben. Die beiden weißen Pfeile sollen die Grenzen des Focus markieren. Hier ist ein weiterer, ebensolcher Focus, zwei von ihnen. Hier haben wir einfach ein neues Medium zugegeben und es 82 Stunden lang wachsen lassen. Es wächst enorm. Es wächst zu einem großen, dicken Fokus heran. Tatsächlich wächst es zu einem sehr großen Focus. Zu einem so großen, dass das Zentrum keine Nährstoffe mehr erhält und nekrotisch ist. Die Zellen sterben im Zentrum ab, aber wachsen auf der Außenseite weiter. Wenn Sie so wollen, ist dies eine Art Modell eines festen Tumors. Hier ist ein identisches, jedoch nachdem der Focus entfernt wurde. Wir haben das Medikament hinzugefügt. Und 83 Stunden später sehen Sie, dass der Foci nicht gewachsen ist. Wenn überhaupt, dann scheint er zurückzugehen. Als Modell der Behandlung eines Tumors mit diesem Medikament, nachdem er sichtbar geworden ist, scheint diese Gewebekultur ein positives Experiment zu sein. Schließlich kommen wir zur Betrachtung der Zellen selbst. Wir haben eine Mischung von Zellen genommen. Die Hälfte von ihnen ist normal und die Hälfte transformiert. Auf dem nächsten Dia sehen Sie am oberen Rand des Dias die Hälfte der normalen und die Hälfte der umgewandelten Zellen. Sie sehen, dass die transformierten Zellen die abgerundeten Zellen sind und die normalen Zellen die länger gestreckten. Sie sehen die transformierten und die normalen Zellen. Dies ist der Beginn des Experiments. Wir fügen das Medikament hinzu und lassen es zwei Tage wirksam sein, und es sieht so aus, als ob nur sehr wenige transformierte Zellen übrig sind, eins, zwei, drei, ein paar von ihnen. Die meisten Zellen sind normal. Wir wissen nicht, ob diese Normalität, dieses normale Aussehen der Gewebekultur auf dem übermäßigen Wachstum der normalen Zellen im Vergleich zu den umgewandelten Zellen beruht, oder auf der Toxizität des Medikaments für die transformierten Zellen, die dazu führt, dass sie einfach eliminiert werden. Das ist ein sehr fundamentaler Unterschied. Mit andern Worten: Kehrt das Medikament die Transformation um, oder bringt es einfach die transformierten Zellen zum Absterben? Es sieht so aus, als ob es sie zum Absterben bringt, doch wir wissen nicht mit Sicherheit, dass es so ist. Und das ist in etwa der aktuelle Stand der Experimente. Nun, lassen Sie mich Ihnen als Letztes auf einem Bild zeigen, dass wir mittlerweile über Zellkulturen hinausgekommen sind. Dies sind Hühnerzellen in einer Gewebekultur, und Sie müssen das im Hinterkopf behalten: Dies ist vom Menschen weit entfernt, sehr weit entfernt. Doch wir sind einen Schritt weitergegangen. Wir haben nicht dieses Medikament verwendet, sondern das erste, das Medikament DMB bei Ratten, bei denen man auf chemischem Wege mit einem Kohlenwasserstoff mit kondensiertem Ringsystem ein Mammakarzinom induziert hatte. Ich komme nun zu dem Thema zurück, mit dem ich diesen Vortrag begann, wenn dies alles ist, wenn die Ideen zusammenhängen. Diese chemischen Substanzen könnten nicht nur die Transformation verhindern, sondern es ist auch denkbar, dass sie selbst dann eine therapeutische Wirkung haben, wenn die Transformation sichtbar geworden ist. Dies war nicht der Fall, diese Idee war noch nicht vorhanden, als dieses letzte Experiment durchgeführt wurde. Wir verwendeten eine Tierreihe, die über die nötigen genetischen Informationen verfügt, sodass, wenn man einem Tier ein Injektion mit kondensierten Ring-Kohlenwasserstoffen gab, mit Di- oder Trimethylbenzanthracen; sagen wir Dimethylbenzanthracen (es ist ein kondensierter Ring-Kohlenwasserstoff, der im Rauch aller Verbrennungen vorkommt), dass sich dann stets ein Mammakarzinom entwickelte. Sie verfügten über die genetische Zusammensetzung dazu. Und das nächste Dia, dies ist das letzte Dia. Schauen Sie sich den oberen Teil hier an. Hier ist das Kontrollexperiment, N = 17, das heißt: 17 Tiere erhielten eine Injektion mit Dimethylbenzanthracen, und acht Wochen später waren alle tot, nicht eins überlebte. Prozent unbeeinflusst: 0, kein Tier war unbeeinflusst, jedes der Tiere verendete. Es ist eine höchst wirksame Titration. Wissen Sie, es ist eine nur sehr schwer zu erstellende Titration, weil sie so zeitaufwendig ist. Und natürlich ist es eine mit statistischer Gültigkeit schwer durchzuführende Titration, weil hierzu viele Tiere erforderlich sind. Ich will damit sagen, dass 17 keine große Zahl ist. Wenn wir über eine Million Tiere verfügten, wäre das besser, aber die haben wir nicht. Ich meine, wir haben keinen Stall für eine Million Ratten. Also mussten wir es auf diesem Weg durchführen. Nun ja, wenn wir... Wir haben hier 12 Tiere, die Dimethylbenzanthracen erhielten. Wie Sie sehen, verendeten sie alle nach 8 Wochen. Diese 12 erhielten 10 Milligramm des Medikaments alle sieben Tage. Und der Verlauf der Krankheit wurde zumindest verlangsamt. Schließlich erendeten jedoch alle Tiere. Wenn wir allerdings 10 Milligramm alle 4 Tage geben, mit anderen Worten: eine höhere Konzentration des Medikaments, ändert sich der Krankheitsverlauf weiter, und einige der Tiere überleben sogar. Der Aussagekraft einen Tierexperiments dieser Art kann man sich nur schwer sicher sein. Sie wissen, dass es schwierig genug ist - darf ich bitte wieder Licht haben, es gibt keine weiteren Dias - dass es schwierig genug ist, ein Experiment mit Gewebekulturen zu deuten, mit ganzen Zellen. Wir möchten die Experimente so weit wie möglich zum Enzym und Substrat vorantreiben. Ich habe Ihnen also Experimente auf allen drei Ebenen gezeigt: die Hemmung auf der Ebene des Enzyms, der Zelle und des Gesamtorganismus. Am ungewissesten sind die Arbeiten am Gesamtorganismus. Mehr Vertrauen kann man in die Experimente mit den Gewebekulturen setzen. Und den Experimenten auf der Ebene des Enzyms, der Enzymhemmung, lässt sich schließlich am meisten vertrauen. Doch für dieses Experiment haben wir nur das eine Enzym, die reverse Transkriptase. Das einzige, das wir kennen. Wir wissen, dass noch drei oder vier andere Enzyme an der Transformation beteiligt sind, und wir versuchen zur Zeit herauszufinden, um welche es sich hierbei handelt, sie "herauszufischen" und die Experimente an den isolierten Enzymen vorzunehmen. Und dann werden wir wissen, was geschieht. Wir müssen außerdem herausfinden, wie die chemische Veränderung, die zur Bildung dieser Enzyme Anlass gibt, im Einzelnen vor sich geht. Wir haben lediglich einen Hinweis darauf. Und dies ist der Punkt, an dem wir heute stehen. Vielleicht, wenn einige von Ihnen Studierenden dort oben in drei Jahren... Sie werden, fürchte ich, nicht hier sein, ich weiß nicht, wo sie sein werden, Sie werden irgendwo anders sein. Doch wenn sich die Dinge nur um ein Zehntel so gut weiterentwickeln, wenn ein Zehntel meiner heute geäußerten Vermutungen richtig sind, dann wird es Ihnen ein anderes Mal etwas zu erzählen geben. Ich danke Ihnen vielmals für Ihre Aufmerksamkeit.

Melvin Calvin (1974)

Carcinogenesis: Chemical, Physical and Biological

Melvin Calvin (1974)

Carcinogenesis: Chemical, Physical and Biological

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Melvin Calvin received the unshared 1961 Nobel Prize in Chemistry for the elucidation of the so-called Calvin Cycle. The Calvin Cycle, which is in fact a cyclic sequence of enzymatically catalysed biochemical reactions, is part of the machinery that allows plants to turn sunlight into food. It explains in detail how plants convert aerial carbon dioxide into biomass. A process which is essential for sustaining life as we know it. In the present lecture, however, Calvin discusses a rather different topic: the development of cancer. In the early 1970s, he had established a group to work on this issue at the University of California at Berkeley. Here, Calvin explains how this group came into life and discusses some research efforts on-going at the time.He starts off by pointing out the special role of chemicals in cancer development. Already around 1775, it had been observed that chimney sweeps, whose task it was to clear ash and soot from chimneys, showed significantly increased rates of scrotum skin carcinoma. This disease can nowadays be linked to carcinogenic compounds, the so-called polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), which are formed during combustion.At the time of Calvin’s talk, the involvement of PAHs in carcinogenesis was apparent, however, the precise mechanism was still speculative. It was believed that PAHs themselves were not carcinogenic, but were converted to carcinogenic epoxides only by enzymes of the body, the so-called aerial hydrocarbon hydroxylases. Still, as Calvin points out, the epoxides had never been detected in vivo and the biological consequences of their formation had not been identified. Calvin suggests that they might react with DNA, yielding a distortion of the helical DNA structure. He further discusses the proposition that such damage could have additional consequences if a viral infection occurred at the same time. The DNA repair mechanisms triggered by the body upon chemical-induced DNA damage could create a loophole for the insertion of viral DNA into the DNA of the host cell, according to Calvin. He concludes that viral and chemical factors might in fact “work together” towards carcinogenesis. Eventually, he presents the results of some early cancer-prevention experiments with drugs that block enzymes involved in the incorporation of viral DNA into host cell DNA. Calvin’s suggestions are based on quite a few assumptions, a fact which he was well aware of. During his talk, he thus adds a little disclaimer, stating that he has only half the data required to prove what he is proposing. However, according to Calvin, creativity in science is when you get the right answer despite not knowing everything you need to know. And, in fact, Calvin got most of his speculations right. Today we know that PAHs are converted to diol epoxides by the combined actions of cytochrome P and epoxide hydrolase enzymes. The diol epoxides may then react with cellular DNA. There is now also substantial evidence for a synergistic interaction of viral and chemical factors in carcinogenesis. A well-established example is the synergism between tobacco smoke (i.e. PAH intake) and human papilloma virus infection in the development of cervical cancer (cf. the Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008 to Harald zur Hausen). Also, the prevention of cancer with certain enzyme-blocking drugs, as suggested by Calvin, is being followed up on. Friends of red wine might be pleased to read that, amongst others, resveratrol, a compound found in red grapes, can inhibit cytochrome P enzymes and thus potentially reduce the risk for cancer due to PAH intake [1]. [1] T. Shimada, Y. Fujii-Kuriyama, Cancer Science 95 (2004) 1.

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