Drug Targets

by Joachim Pietzsch


A Delayed Revelation

Most drugs have been known before their targets. Their development either built on traditional knowledge or they were discovered through specific observations at the bench or the bedside, often by chance or serendipity, while their mode of action initially remained obscure. Take acetylsalicylic acid for example.[1] Its chemical basis, salicylic acid, is contained in willow barks, which already were described as a source of medicines to treat fever and pain in Egyptian papyri more than 3000 years ago. In his “account of the success of the bark of the willow in the cure of agues”, the English chaplain Edward Stone revived this ancient knowledge in 1763. During the 19th century, salicylate medicines were quite popular in Europe despite of their adverse side effects. In 1897, the German chemist Felix Hoffmann succeeded in synthesizing a more tolerable derivative, acetylsalicylic acid. It was launched by Bayer two years later under the brand name aspirin and became one of the world’s best-selling drugs. The reason for its analgesic, antipyretic and anti-inflammatory effects was not revealed before 1971, however, when John Vane, the discoverer of prostacyclin, elegantly demonstrated that aspirin targets the enzyme cyclooxygenase (COX) and thereby inhibits the production of pro-inflammatory prostaglandins. This insight enabled the discovery of selective COX-2 inhibitors 20 years later. Together with Sune Bergström and Bengt Samuelsson, Vane shared the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1982 “for their discoveries concerning prostaglandins and related biologically active substances.” Some ten years before, together with the Brazilian pharmacologist Sérgio Ferreira, Vane had also discovered a new principle for the treatment of cardiovascular diseases and paved the way for the development of ACE inhibitors. Interestingly, the Karolinska Institute did not mention this achievement.


Four Nobel Prizes for Drug Innovation

While drug research arguably “has contributed more to the progress of medicine during the past century than any other scientific factor”,[2] only four Nobel Prizes in Physiology or Medicine have been explicitly awarded for advances in drug innovation in the 20th century: 1939 to Gerhard Domagk "for the discovery of the antibacterial effects of prontosil"; 1945 to Sir Alexander Fleming, Ernst Boris Chain and Sir Howard Walter Florey "for the discovery of penicillin and its curative effect in various infectious diseases"; 1952 to Selman A. Waksman "for his discovery of streptomycin, the first antibiotic effective against tuberculosis"; and 1988 to Sir James W. Black, Gertrude B. Elion and George H. Hitchings "for their discoveries of important principles for drug treatment". One could consider to include three other Nobel Prizes. Emil von Behring’s serum therapy, however, for which he was awarded with the first Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1901, was a vaccination. Paul Ehrlich did in fact discover the first modern chemotherapeutic agent, salvarsan to treat syphilis - but he did so in the year after he shared the Nobel Prize with Ilya Mechnikov „in recognition of their work on immunity“ in 1908. And the discovery of insulin, which earned Frederick Banting and John Macleod the Nobel Prize in 1923, surely was a fundamental therapeutic breakthrough. Yet insulin is not a drug but a hormone.


Countless Contributions of Basic Research

In contrast, an almost countless number of Nobel Prizes in all three scientific disciplines has been awarded for inventions and discoveries of methods, structures and pathways that facilitated the identification of drug targets and the search for new drugs. The number of targets of current drugs is debated and estimated to lie between 218[3] and 483[4]. Their most prevalent biochemical classes are receptors and enzymes. Ion channels, transport proteins, nucleic acids and the ribosome offer additional targets. Growth factors, cell surface antigens, immunoglobulins and cytokines can be targeted by monoclonal antibodies. It would exceed the scope of this topic cluster to introduce all those Prizes in detail, so let us just have a selective and superficial look on them.


The Impact of Imaging

The most important methods for determining the structures of drug targets are X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. The development of the first originates in Röntgen’s discovery of X-rays (Nobel Prize in Physics 1901), is inaugurated by the discoveries of Max von Laue and William and Lawrence Bragg (Nobel Prize in Physics 1914 and 1915), advanced by techniques for the crystallization of enzymes, other proteins and viruses by James Sumner, John Northrop and Wendell Stanley (Nobel Prize in Chemistry 1946), and culminates in the structural elucidation of the first macromolecules by Dorothy Hodgkin (Nobel Prize in Chemistry 1964) and the first complex proteins by John Kendrew and Max Perutz (Nobel Prize in Chemistry 1962). Subsequently, Nobel Prizes related to X-ray crystallography were awarded both for methodological refinements (e.g. Nobel Prize in Chemistry 1985 to Herbert Hauptman and Jerome Karle) and the determination of numerous specific structures (from the Nobel Prize in Chemistry 1988 to Johann Deisenhofer, Robert Huber and Hartmut Michel “for the determination of the three-dimensional structure of a photosynthetic reaction centre" to the Nobel Prize in Chemistry 2012 to Robert Lefkowitz and Brian Kobilka „for studies of G-protein-coupled receptors). The development of nuclear magnetic resonance originates in the discoveries of Otto Stern and Isidor Rabi (Nobel Prize in Physics 1943 and 1944, respectively), and leads via the achievements of Felix Bloch and Edward Purcell (Nobel Prize in Physics 1952) and Richard Ernst (Nobel Prize in Chemistry 1991) to a Nobel Prize in Chemistry 2002 to Kurt Wüthrich „for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution" and the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 2003 to Paul Lauterbur and Sir Peter Mansfield „for their discoveries concerning magnetic resonance imaging".

The Power of Gene Technology

Without the invention of genetic engineering in 1973, drug researchers would not have been able to produce protein targets in sufficient amounts for high-throughput-screening and other preclinical assays nor would they be able to validate targets in knockout models. The importance of this tool is mainly reflected in the Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978 to Werner Arber, Daniel Nathans and Hamilton Smith "for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics", and in the Nobel Prize in Chemistry 1980 to Paul Berg "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA" and to Walter Gilbert and Frederick Sanger "for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids". In Physiology or Medicine alone, 17 Nobel Prizes (1933, 1946, 1958, 1959, 1962, 1965, 1968, 1975, 1978, 1983, 1993, 1995, 2002, 2006, 2007, 2009, 2012) are associated with the preparation and further progress of gene technology, ranging from „discoveries concerning the role played by the chromosome in heredity“ (Thomas Morgan 1933) to “the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent" (Sir John B. Gurdon and Shinya Yamanaka 2012), among them the Nobel Prize to Crick, Watson and Wilkins for unraveling the double helix structure of DNA (1962). Oswald Avery who had - against the prevailing view of his peers - identified DNA as the carrier of genetic information in 1943 did never receive a Nobel Prize, nor has the deciphering of the human genome in the year 2000 been awarded so far.


Pathways, Methods, Mechanisms

From the citric acid cyle to protein trafficking and vesicular traffic, from neurotransmission to immunology, from cellular signaling mechanisms to growth factors and oncogenes, from the patch-clamp-technique to the polymerase chain reaction: A plethora of discoveries and inventions that were rewarded with Nobel Prizes have spurred on drug discovery and target identification. To name but a few: The elucidation of the biosynthesis of cholesterol and the subsequent discovery of the LDL-receptor laid the ground for the development of HMG-CoA-inhibitors (statins), the world’s best-selling class of drugs (Nobel Prizes in Physiology or Medicine 1964 and 1985). The discovery that nitric oxide is identical with the endothelial derived relaxing factor and acts as an endogenous signaling molecule opened new horizons for the treatment of cardiovascular diseases – and, serendipitously, helped to develop drugs to treat erectile dysfunction (NP in Physiology or Medicine 1998). The discovery that reversible protein phosphorylation is a biological regulatory mechanism of outstanding importance (NP in Physiology or Medicine 1992) made kinase inhibition a fruitful field for drug development. Solving the structure of antibodies, understanding the creation of their diversity, and producing monoclonal antibodies were decisive steps on the way to today’s “biologicals” for the treatment of cancer and other diseases (NPs in Physiology or Medicine 1972, 1984 and 1987). The majority of currently available drug targets are G-protein coupled receptors (GPCRs). The Nobel Prizes in Physiology or Medicine 1971 (to Earl Sutherland who discovered the second messenger cAMP), 1994 (to Alfred Gilman and Martin Rodbell who discovered G-proteins and explained their role in signal transduction) and 2012 (to Robert Lefkovitz and Brian Kobilka who solved the structure of GPCRs) underline that significance.


Lindau Lectures on Drugs and their Targets 1951 - 2013

The development of drug discovery and the quest for novel targets is beautifully mirrored in lectures of many laureates in Lindau. Gerhard Domagk had discovered the first antibiotic chemotherapy, the sulpha drug prontosil, in 1932. From 1951 to 1963, the year before he died, he attended every Lindau Nobel Laureate Meeting. In the following lecture from 1960, he emphasizes the importance of this discovery by recalling how helpless medical doctors had been only three decades ago when confronted with bacterial infectious diseases: “We had to leave it to chance whether a patient succumbed to the disease or survived it.”


Gerhard Domagk on the impact of the first antibiotic chemotherapy
(00:07:15 - 00:09:42)

 

Selman Waksman who, shortly after the launch of penicillin, had discovered the first antibiotic remedy against the “white plague”, tuberculosis, in the 1940s, expressed himself even more enthusiastic about the impact of antibiotics. “This period, the last three decades, is known and will remain known as the golden age of antibiotics”, he said in his talk about “Successes and failures in search for antibiotics” in Lindau in 1969. “Some call it the atomic age, some the communications age, I prefer to call it the antibiotic age, because in no period of human history such blessings have been conferred upon mankind“. The development of resistance, however, had already become an issue and was discussed in Lindau both by Domagk and Waksman. Tuberculosis at least, he said, „is presently under complete control“. Bacterial infections obviously can be contained, but will this ever be possible for viral infections?


Selman Waksman (1969) - Successes and Failures in Search for Antibiotics

Mr President, Count Bernadotte, ladies and gentlemen. I am extremely happy to be here this morning and to tell you something about this fantastic new development known as the antibiotics. This period, covering the last 3 decades, is known, will remain known in the history of medical science and medical application as the golden age of chemotherapy. Many people refer to it as the atomic age, the communications age; I prefer, and fortunately many of my colleagues prefer, to call it the antibiotic age. Because at no period previously in the history of the human race have been such blessings conferred upon mankind as during the last 3 decades. It all began about 1939/1940, when almost simultaneously there were announced 3 new substances isolated from bacteria, one of which was discussed a few minutes ago by our eminent college under the name gramicidin S. Actually, it was known as tyrothricin of which one of the components was gramicidin. A second one was penicillin, which, although named and discovered 10 years before, was actually proven to be effective in 1939/1940 at Oxford University. And finally actinomycin, isolated from this group of actinomycetes in my laboratory. It was known before that various groups of microorganisms are capable of producing substances. And I want you to remember that the word antibiotic has been introduced only in 1941, also nearly 3 decades ago. It was known under a variety of names, mostly as microbial toxins – actually as far back as 1895, a precursor or a substance similar to penicillin was isolated from a green mould. Numerous other observers, including Professor Gratia in Belgium, observed prior to Fleming the ability of certain fungi to produce chemical substances, which have a growth-inhibiting or even a destructive effect upon various microorganisms, including numerous pathogenic forms. Bacteria products have also been isolated prior to tyrothricin. Professor Ernst Pringsheim, working not far from here, demonstrated that certain bacteria, especially spore-forming aerobic bacteria of the Bacillus mycoides-type, not very distant from Bacillus brevis, are capable of producing substances that have an inhibiting effect upon various bacteria. And even actinomycetes were shown capable of inhibiting the growth of various bacteria. But again, I begin this period only in 1939/1940, because we might call it the beginning of the antibiotic era because of those 3 discoveries. Purification, actually the substances were purified and their effect was tested on animals and in humans and found to be extremely important. Now my own, as the Chairman so ably presented: I began to work as a soil microbiologist. As you know microbes are concerned with the causation of disease. Microbes used in industry are primarily effective in pure culture. In the soil, however, as well as in sewage or on compost, manures, they are living in mixed populations. In other words, there are millions upon millions of different kinds of microbes living side by side in these natural substrates. And it was only logical to ask the question, how not only would these microbes ruin the soil, not only how they affect plant growth and soil transformations, but especially how do they affect one another? And in my own case, to my greatest surprise, I found that some of them have a greatly stimulating affect upon other microbes, while others have a greatly injurious affect upon other microbes. So much so that actually in January 1937 I published a comprehensive review which I called 'Associated and antagonistic interrelationships among microbes'. And it is very simple to prove that. As Professor Fleming said time and again, if he had worked in a clean laboratory perhaps he would never have observed a mould contaminating a plate, and producing a substance which he called penicillin. In my own case, as many soil microbiologists do, they dilute the soil sample to a very high dilution, 1 to a million, whereby isolated colonies appear on the plate. But occasionally either I made a mistake or the assistant whom I asked to carry out the analysis made a mistake, and instead of using a million dilution of soil, we used a thousand or 10,000 dilution. And to my great surprise, while the plate was covered with numerous colonies, some colonies existed at very sharp destructive affect - in other words inhibiting affect rather - upon others. And therefore the question was first of all, how do they do it? Why do they do it? And what use can we make of this particular observation? And further, another phenomenon must be emphasised here. Since my very early work on soil microbes in 1915, I concentrated primarily upon one group that is known as the actinomycetes. These are the so-called ray fungi. The microbiologists refer to them as fungi as the very name indicates. While the bacteriologists call them higher bacteria. Really to clear up that point: at the present time they are classified among the bacteria, but as a very special group of higher bacteria. And while it was known that they occur in large numbers in the soil, they were all given one generic name: actinomyces. Actually, all the names to this group of organisms were given right here in Germany. Professor Ferdinand Cohn at Bratislava University called them in 1872 streptothrix; and Professor Harz in Berlin called it in 1879 actinomyces. These 2 names are very important from the point of view of the naming, of the nomenclature of these antibiotics. It is therefore quite understandable why I should have concentrated upon the antibiotics of this group of organisms, and it is fortunate that I did so, because while the bacteria have contributed a large number of antibiotics, only 2 or 3 of them have found practical application. I need only mention tyrothricin, bacitracin and polymyxin. There are 1 or 2 others that I used occasionally. The fungi, who originally made such a tremendous impression because of the discovery of their ability to produce penicillin, have also contributed for practical use only 4 or 5 compounds, such as griseofulvin, such as cephalosporin and 1 or 2 others. But it is the actinomycetes that have contributed the greatest number of antibiotics, and the greatest number of which have found practical application. While at the beginning of the period that I am speaking of there were hardly any antibiotics used for practical purposes – I mean if a person financially inclined would have enumerated what we call now antibiotics, the sales throughout the world would not have amounted to more than a few hundred dollars; while at the present time we can actually calculate it in terms of billions of dollars of production a year throughout the world. And among these antibiotics the actinomycetes: probably more than a thousand compounds of preparations have been isolated since 1939 from this group of organisms. And practically 80, between 50 and 80 depending upon the particular use, are now used for practical control of infectious diseases of man, animals and plants. Some of them have found other applications which I will not dwell upon this morning, such as preservation of food stuffs, such as feeding of certain animals and so on. The important thing is to remember that first of all these antibiotics are now produced in such a scale that nobody would have ever dreamt of. I just want to remind you that again it was in this country that Paul Ehrlich isolated Salvarsan – not very long ago as history goes, but as far as the chemotherapy a long time ago. And Ehrlich himself prophesied that it will not take very long before chemical compounds will be found, that will do for bacterial infections what Salvarsan did for syphilis. But it took a quarter of a century before Domagk, again in this country, demonstrated the capacity of these sulpha drugs to inhibit bacterial growth - not only in the test tube but also in the living animal. Again, it seemed that only chemical industry will contribute these lifesaving drugs, but to the greatest astonishment, primarily of the chemical profession came to antibiotics. And the story is told that when - and I hope you will forgive me: I do not have any particular inclination to draw reflection upon any particular group, but the story must be told here that when the German soldiers in the African corps, in North Africa found among the dead American soldiers packages of penicillin, and they were told that these chemical substances were isolated from mould cultures, they said this is another American bluff. But fortunately this bluff turned out a great saving of the human race. As I said, I began early observations since my early work on the actinomycetes, beginning in 1915. But it was in 1939 that I began to concentrate upon the actual isolation of these chemical compounds from various cultures of actinomycetes. And the first culture that we isolated in 1940, in a pure crystalline state, we called actinomycin. And this substance alone is worth a great story - an extensive discussion for which I have no time. Later, if I do, I will mention it again. But actinomycin proved to be so extremely toxic that it would kill the animals which were treated with it as quickly as it would kill the bacteria that were infecting the animal. And therefore, after a certain amount of experimentation, we came to the conclusion that from a chemotherapeutic point of view it offers no promise whatsoever, and we put it aside. Now remember the word 'actinomycin' was derived from Harz’s first word 'actinomyces' that he attached to this group of organisms. Then 2 years later, between 1940 and ’42, penicillin became a reality. It’s important to remember the historical dates. And therefore I saw that the important substances that we are trying to isolate should have an activity which is not possessed by penicillin. And since penicillin was primarily active against gram-positive bacteria and certain gram-negative cocci, we concentrated, in my laboratory, upon the isolation of substances that would be active against gram-negative bacteria. And within 2 years we isolated streptothricin. Now first, the name, as you will recognise, was derived from Ferdinand Cohn’s first name streptothrix; and it was logical that we should use for our second antibiotic the second name given to a member of the group of these organisms. But streptothricin - and I must assure you that streptothricin was the precursor of streptomycin. If it had not been for the isolation 6 months later of streptomycin, streptothricin would have been a therapeutic drug at the present time. Streptothricin had all the desirable properties of a therapeutic agent: it was water-soluble; it was active; it was heat-stable; it was active on a wide range of bacteria, both among gram-positive and among gram-negative bacteria. We could save various experimental animals infected with a variety of pathogenic bacteria, but unfortunately the animals that we saved by the use of streptothricin began to die off a week or 2 later. In other words it possessed not as strong a toxicity as actinomycin, but it possessed a delayed toxicity which certainly had to be taken into immediate consideration. And streptothricin, in spite of its great desirability – we knew already at that time that it does not represent an isolated type of compound, but the various actinomyces had the capacity to produce all types of compounds similar, and some of them which might be better than streptothricin. All our methods were developed in the study of streptothricin. And within 6 months we isolated streptomycin which, although it possessed very similar properties to streptothricin, still had much less toxicity than streptothricin and therefore became much more desirable. And merely to distract you for a minute: you may have heard of the expression or the word 'screening programmes'. There have been 2 approaches in the study of these antibiotics. On the one hand the cursory observation, similar to the one of Fleming and Gratia and others, who observed a culture of a mould or a bacterium that had a destructive affect upon our growth, inhibiting affect upon other microorganisms. On the other hand there was - and this was the system that I followed and perhaps even helped to develop – the systematic search for chemical substances produced by different microorganisms that have the capacity of inhibiting the growth of others, which we called antibiotics. And now this screening programme, namely the testing of numerous organisms - systematically, of course. Because we did not have to actually isolate them, we developed techniques that gave us, in a preliminary fashion, what organisms are desirable and which ones are not desirable. But this system was immediately followed in thousands of laboratories throughout the world, and of particular importance the industrial laboratories which I will mention in a minute. You might say that ontogeny repeats phylogeny. And namely in most of these screening programmes, the first substance that had been usually isolated in various laboratories – not my laboratory, that was in the United States or in Great Britain or in the Soviet Union – was actinomycin; and the second one was streptothricin. And the third one might have been streptomycin or might have been something else. As a matter of fact, actinomycin at the present time... perhaps a word about actinomycin: As I said, because it has a tremendous importance at the present time, actinomycin which has a tremendous activity upon numerous bacteria, but it also possesses a very high toxicity. But we observed: because within 2 or 3 years after we found many antibiotics active upon bacteria, immediately the idea occurred, how about viruses? And we started to apply the screening programme to viruses. And we failed miserably, as I will explain in a few minutes later why. But the only type of compound that we found had some definite activity was a form of actinomycin; we called that form, our actinomycin, actinomycin A. Within 5 or 6 years an industrial laboratory in our own state of New Jersey, Hoffmann La Roche, isolated another form of actinomycin that they called B. But again: there was no excitement; there was no hope; there was nothing to follow. Until 6 years later, right here again in Germany, our old friend Domagk whom we miss here today – although I had the great pleasure of being with him at this meeting 6 years ago – Domagk and his colleagues isolated a new form of actinomycin, which they called actinomycin C. And upon superficial, I am sorry to say, study, they claimed or they believed that it possesses a great effectiveness upon a certain form of cancer, known as Hodgkin’s disease. And they published quite a group of papers, that actinomycin C is active upon Hodgkin’s disease. I received those papers early in 1953 at the time of the Microbiological Congress in Rome. I happened to be the chairman of a session on actinomyces, and in my presidential address I said that the story of these antibiotics has not come to an end, that there are tremendous potentialities, and that was the effectiveness upon cancer. And I illustrated that with the work of the Domagk group. And to my great misfortune there was a reporter in the audience who understood only one word of what I said and that word was 'cancer'. And since I received the Nobel Prize a year earlier, it came out at a large announcement in the front pages of all the newspapers of the world: Nobel Prize winner announces a cure for cancer - and I can assure you that I had hell to pay. I would receive telegrams; I can just cite to you from one of the Kings of Africa who said he is prepared to come with his daughter who suffers from Hodgkin’s disease, that I should treat her, and I can have every Arab horse that has ever found a practical use - and stories of that nature. But the most interesting thing was when I came home. Within a day I received a telephone call from a very wealthy American industrialist. And he said, what do I hear, that you discovered a cure for Hodgkin’s disease? I said, oh that’s a lot of nonsense. First of all I didn’t discover it. They’re a group there and bias indicate that claim to have that effect. And if you wanted, go and contact with them. No, no, no he said, I want you. What do you say about it? I said, we don’t know, we have to study it further. And he said, do you need any money to enlarge your activities? I said, I could use some (laughter); even a Nobel Prize winner does not have all the money at his disposal for research. And he said, and I mentioned quite a substantial sum, he said very well, next week you shall get the cheque. And I got it next week. And we immediately initiated a programme in search for - by that time we knew that there are numerous forms of actinomycin; as a matter of fact one of the most brilliant chemists in this country, Professor Brockmann at Göttingen, actually separated these actinomycin into dozens and dozens of different forms for which he used every letter of the Greek alphabet and every number of both the Arab and the Roman numerals. Then we initiated that programme. What we were looking for was for a form of actinomycin that might be less toxic than our original form A. And secondly, particularly because of Brockmann's difficulties in separating the actinomycin, which is a mixture of different chemical identities, a single form. And within a year we succeeded in isolating such a compound; and logically we called it actinomycin D. And by a sheer stroke of luck it was found that this actinomycin D actually has an effect upon certain forms of cancer, but unfortunately not the very common ones, such as Wilms cancer or kidney cancer in children; such as a certain form of throat cancer known as rhabdosarcoma. But much more important than that, actinomycin, and especially the D form, has become in recent years one of the greatest biochemical tools that have been introduced into the laboratory in recent years. It actually - if I may say so in spite of any molecular so-called biologists that may be in this room – it helped to solve the riddle, the genetic code of the DNA/RNA transformation; and it is being used at the present time in numerous laboratories in such studies. Now, as I said, to come back to streptomycin. Streptomycin was not necessarily an ideal drug. As the chairman said, it has eliminated numerous infectious diseases. Practically every infectious disease afflicting the human race - I am speaking of the infectious disease, incidentally exclusive of the viruses, to which I will come in a minute - can be controlled in a more or less definite fashion; and notably with tuberculosis streptomycin played such an important role. So much so - perhaps a story or 2 here might be in place. When I dedicated the first streptomycin plant built in India, outside of Bombay, I had the good fortune of addressing a large audience, side by side with Mister Nehru – at that time the premier, the great premier of India. And Mister Nehru said to me, why will you bring us such drugs? We have too many people. You bring us drugs to save many upon whose deaths we counted to keep our population under control. I said to him, Mister Nehru, that is your problem. My problem is to help save the lives that are already in this world. And, of course, he had nothing further to add; and I am sure that they will solve it sociologically rather than prevent the progress of medicine. Streptomycin had certain limitations: on the one hand it possessed a certain limited toxicity on hearing ototoxicity, and under motion, the motion control by the nervous system, rather the 8th nerve effect; and the second limitation was that since, in the case of tuberculosis particularly, it had to be used for a long time in order to control the disease, it gave every opportunity to the mycobacterium tuberculosis to develop resistance. And many people felt so unhappy about these 2 phenomena, that they thought that before very long tuberculosis will come back again to where it was before. Fortunately, and I said that time and again, streptomycin was the first drug that was shown to be effective against tuberculosis – not only against the organism in the test tube but also against infection in the animal and in humans. Certainly it could not be the last one, and it certainly could not be the best one. And fortunately before very long, Professor Lehmann from Gothenburg in Sweden demonstrated, established that a certain chemical synthetic compound, para-aminosalicylic acid, taken by mouth - streptomycin had to be injected - by mouth will have a destructive effect upon tuberculosis. And by combining streptomycin with PAS, para-aminosalicylic acid, not only were you able to reduce the toxicity of streptomycin or the amount that was required; but by distributing the dose at lesser frequency, you were able to reduce greatly the toxic effect. And more fortunate - and here comes another story: In 1952 - within 2 weeks, perhaps a week after I received the Nobel Prize in Sweden – I had to fulfil another engagement which was around the world, on the other side, and that was in Tokyo. Since I undertook 6 months earlier to deliver a series of important addresses in that country, and the Nobel Prize ceremonies finished on the 10th of December - as you well remember. On the 13th of December I had to deliver my general address, and on the 14th I had a plane that took us directly to Tokyo. It took 52 hours in one plane. It brought us there to fulfil our earlier engagement. I was invited by the Emperor of Japan to come and pay him a visit. He was very gracious. He asked me a series of questions, and one of the questions - it’s very important historically here. He said, when the war broke out, we had in Japan every year 300 deaths from tuberculosis, annually 300 deaths from tuberculosis, in 1940/41. Last year, which was 1952, and I was speaking to him at the end of January ’52 – I mean the end of December ’52 or early in January, I believe it was early in January ’53; we stayed in Japan about a month. And he said, last year, which was ‘51/’52, the deaths from tuberculosis fell to 90 out of 300 that we used to have before. And we'd like to ascribe that reduction to the use of streptomycin. But the question, he said, I want to ask you, what fate do these 90 have? Do they have any hope of surviving? And I said to him, you must remember that Streptomycin was the first drug and, as I said a minute ago, you can hardly think that it will be the only one. Others will forthcome which might even replace it and certainly may combine with it. And as I was talking with him, isoniazid, the third great important anti-tuberculosis drug, was being discovered in the United States and elsewhere. And I was very happy to read another 10 years later that the mortality in Japan from tuberculosis went down to less than 30 a year. So that at the present time, as the chairman said, tuberculosis is practically under complete control. I need not go into this subject further. But before I leave, I want to discuss, because I am asked very frequently, how about virus diseases? How about cancer diseases? Can antibiotics or do antibiotics offer any hope for their control? And you must remember that we are dealing in the case of these 2 groups of diseases in a totally different fashion from infectious diseases caused by microbial systems. In the case of, let us say, typhoid or pneumonia or tuberculosis, we deal with a microbe that grows, that metabolises, that multiplies. In the case of viruses they do not grow, they do not metabolise, they do not multiply per se - I said multiple, I mean: divide. In other words they are nothing but chemical agents that stimulate the cell to produce substances like them. And therefore any... the time does not permit me to discuss the mode of action of these antibiotics. Because that is extremely important to know: how do they act upon these sensitive bacteria? Some affect the growth; others affect their metabolism; still others affect their multiplication in one form or another. Since the viruses do not have these properties, the antibiotics will automatically not act upon viruses. And I can assure you that as soon as we recognise the importance of streptomycin, as soon as we receive the first funds to enlarge upon our work – we built a special building for the study of viruses, of which I knew very little. But we obtained the help of virologists and other experts in the field, and we immediately attacked the problem. And I can assure you that on my part it was the greatest waste of time and money, because we accomplished practically nothing. And the same is true for virus research, I mean for anti-viral, the search for anti-viral agents throughout the world. Although at the present time there are known compounds that may affect viruses in tissue culture and in the test tube, but not in the human or animal body. Fortunately for cancer phenomena or neoplastic diseases, the situation is not as bad. Because in the case of neoplastic diseases, where we have certain cells get out of control and begin to multiply independent of the control of the human or animal body, we can affect the rate of growth of these cells. And therefore substances have been found and at the present moment quite a few of them – as I said beginning with actinomycin and ending with a number of compounds that have been isolated primarily in Japan, sacromycin. I suppose one of you who has recently read or heard about this compound Rifampicin, or the derivative of rifamycin, a typical antibiotic, that there might be certain chemical derivatives of some antibiotics. And incidentally I hardly mentioned the fact that in the case of antibiotics, numerous attempts have been made to modify them chemically, possibly in the hope to change their activity. As you know no doubt, that penicillin has made tremendous progress in this direction only in very recent years. Where they have found the so-called semi-synthetic penicillins. The natural penicillin, that means the penicillin produced by the microbe, can be split by an enzyme and then rebuilt by adding other chemical compounds. And these semi-synthetic penicillins prove to enlarge greatly the effectiveness of the penicillin group of compounds. Unfortunately, in the case of streptomycin that proved to be impossible. Although originally a compound called dihydrostreptomycin was prepared from streptomycin synthetically, that compound proved to have no more desirable properties than streptomycin itself. On the other hand, there are numerous other antibiotics that have been isolated after streptomycin – notably the chloramphenicol first of all and then the tetracyclins, and then numerous others, as I have mentioned, rifamycin and so on - which lend themselves to chemical modifications. There are dozens of tetracyclines at the present time, both in the laboratory and in practical use. And in the case of chloramphenicol we have the active and the inactive form; so much so that that is practically the only antibiotic now that is produced synthetically. So while it is still an antibiotic, because originally it was isolated from a culture of a microbe, at the present time it is largely produced synthetically. Therefore our hope is great. And the first compound that uncovers the potentialities of some of these microbial products that we call antibiotics, perhaps their names will be different, and prove to be effective against viruses or against neoplasms, the whole field will open up tremendously. Now, I’ve been asked time and again, where do the antibiotics stand at the present moment? If I had the time to examine to you the progress of these compounds and their practical use, I would draw you a chart with several levelling-off periods; and unfortunately one of the levelling-off periods came from a compound, isolated again in this country, and that was thalidomide. The discovery of thalidomide and its use everywhere, especially in the United States, rendered a terrific blow to the further search for new antibiotics. I need not dwell upon that in detail; I am sure that most of you are familiar with that. And at the present time, in the United States particularly, because of the toxic effects of certain antibiotics, especially Chloramphenicol again, in certain orders, there is the government or the Food and Drug Administration of the Health Service in the United States has become extremely demanding upon the chemical industry or antibiotic industry for the practical evaluation before introducing them or allowing their introduction into practical use. Just one illustration: for example when streptomycin was discovered and when its potentialities against gram-negative bacteria was demonstrated, the logical question was in the case of mixed infections, why not use penicillin and streptomycin? And as a result of that there have been introduced numerous combinations, only the first of which I think was called combiotic - that means a combination of antibiotics. And it has been used since probably ’44, ’45 until this year. But now even this old combination is being questioned by the government agencies. Because they say, the best use of this combination is in the case of certain mixed infections of the ... (inaudible 42.16) tract, endocarditis particularly. But in the case of endocarditis you have to use a large dose of penicillin. And if you use combiotic you are thereby introducing a large quantity of streptomycin, which is more than necessary and which actually may prove to be toxic to the body. And therefore: why not use individual antibiotics and then combine them in different concentrations as they are required? But, unfortunately, the doctor, the practitioner does not have a very extensive laboratory at his disposal that could answer his questions. I have a culture and you find out for me how much penicillin, how much streptomycin, how many other drugs I’ve got to use. Sometimes he has to act immediately. And therefore this combination of antibiotics are lifesaving to him; and I am sure they saved many lives. And therefore the question is, what is going to happen now? And the result is that in very recent years only very few new antibiotics. And therefore the question, have we reached the end of antibiotic development or have we isolated enough compounds to take care of all our needs? Well, only time will tell. Thank you. Applause.

Sehr geehrter Herr Präsident, Graf Bernadotte, meine Damen und Herren, ich freue mich sehr, an diesem Vormittag hier zu sein und Ihnen etwas über diese phantastische neue Entwicklung erzählen zu können, die Antibiotika. Diese letzten 3 Jahrzehnte werden als das goldene Zeitalter der Chemotherapie in die Geschichte der Medizinwissenschaft und der medizinischen Praxis eingehen. Viele Menschen bezeichnen es als Atomzeitalter oder als Kommunikationszeitalter. Ich – und glücklicherweise auch viele meiner Kollegen – nenne es bevorzugt das antibiotische Zeitalter. Zu keiner anderen Zeit in der Geschichte der Menschheit haben wir eine so segensreiche Entwicklung erlebt wie in den vergangenen 3 Jahrzehnten. Begonnen hat alles rund 1939/1940, als fast gleichzeitig 3 neue Wirkstoffe angekündigt wurden, die aus Bakterien isoliert wurden. Einer wurde vor wenigen Minuten von unserem berühmten Kollegen vorgestellt unter der Bezeichnung Gramicidin S. Eigentlich war er unter der Bezeichnung Tyrothricin bekannt, von dem ein Bestandteil Gramicidin war. Ein zweiter war das Penicillin, das zwar bereits vor 10 Jahren entdeckt und benannt wurde, aber dessen Wirksamkeit 1939/1940 an der Oxford University nachgewiesen werden konnte. Und dann noch Actinomycin, das aus der Gruppe der Actinomyceten in meinem Labor isoliert werden konnte. Vorher wusste man bereits, dass verschiedene Gruppen von Mikroorganismen Substanzen erzeugen können. Und ich möchte Sie daran erinnern, dass das Wort Antibiotika erst 1941, also vor rund 3 Jahrzehnten eingeführt wurde. Sie waren unter verschiedenen Namen bekannt, meistens als mikrobielle Toxine. Tatsächlich wurde bereits 1895 ein Vorgänger oder eine penicillin-ähnliche Substanz aus einem Grünschimmel isoliert. Viele weitere Beobachter, darunter Professor Gratia in Belgien, hatten bereits vor Fleming beobachtet, dass bestimmte Pilze über die Fähigkeit verfügen, chemische Substanzen mit einer wachstumshemmenden oder sogar zerstörenden Wirkung auf zahlreiche Mikroorganismen, einschließlich zahlreiche pathogene Formen, zu erzeugen. Auch vor Tyrothricin wurden bereits Bakterienprodukte isoliert. Der hier in der Nähe tätige Professor Ernst Pringsheim hat die Fähigkeit bestimmter Bakterien – insbesondere Sporen bildende, aerobe Bakterien des Typs Bacillus mycoides, die nicht allzu weit vom Bacillus brevis entfernt sind – zur Erzeugung von Substanzen nachgewiesen, die einen hemmenden Effekt auf verschiedene Bakterien haben. Und selbst Actinomyceten waren nachweislich in der Lage, das Wachstum verschiedener Bakterien zu hemmen. Aber wie ich bereits sagte, setze ich den Beginn dieser Periode erst 1939/1940 an, weil man das aufgrund dieser 3 Entdeckungen als den Beginn des Antibiotika-Zeitalters bezeichnen könnte. Tatsächlich wurden die Substanzen gereinigt, ihre Auswirkungen auf Tiere und Menschen getestet und als extrem bedeutsam eingestuft. Nun zu mir: Wie der Vorsitzende so treffend sagte, begann ich meine Tätigkeit als Bodenmikrobiologe. Mikroben gelten bekanntlich als Verursacher von Krankheiten. In der Industrie sind Mikroben besonders in Reinkultur sehr wirksam. Im Boden jedoch sowie im Abwasser oder im Kompost und Dung leben sie in Mischpopulationen. Mit anderen Worten: Es gibt zig Millionen von Mikroben unterschiedlicher Art, die in diesen natürlichen Substraten nebeneinander leben. So war es nur logisch, dass daraus die Frage erwuchs, wie diese Mikroben nicht nur den Boden ruinieren, sondern sich auch auf Pflanzenwachstum und Bodenumwandlung auswirken, aber insbesondere auch, welchen Einfluss sie aufeinander haben. Zu meiner größten Überraschung stellte ich fest, dass einige der Mikroben enorm stimulierend auf andere wirken, während andere sehr schädliche Auswirkungen auf andere Mikroben haben. Deshalb veröffentlichte ich im Januar 1937 eine umfassende Untersuchung mit dem Titel Das lässt sich ziemlich einfach nachweisen. Wie Professor Fleming immer wieder sagte: Wenn er in einem sauberen Labor gearbeitet hätte, hätte er vielleicht niemals einen Schimmelpilz beobachtet, der eine Platte kontaminiert und eine Substanz produziert, die er dann Penicillin nannte. Viele Bodenmikrobiologen verdünnen die Bodenprobe auf eine sehr starke Verdünnung, nämlich 1 zu 1.000.000, wodurch isolierte Kolonien auf der Platte erscheinen. Aber gelegentlich machte entweder ich einen Fehler oder der Assistent, den ich um die Durchführung der Analyse gebeten hatte, und statt eine Millionstel Bodenverdünnung zu verwenden, verwendeten wir eine Tausendstel oder Zehntausendstel Verdünnung. Und zu meiner großen Überraschung – die Platte war mit zahlreichen Kolonien besetzt – existierten einige Kolonien mit einem sehr stark destruktiven Effekt, mit anderen Worten einem hemmenden Effekt, auf andere. Und deshalb stellte sich zuallererst die Frage, wie sie das machen. Warum machen sie das? Und welchen Nutzen können wir aus dieser speziellen Beobachtung ziehen? Und außerdem muss hier auch ein weiteres Phänomen hervorgehoben werden. Seit meiner ganz frühen Arbeit über Bodenmikroben 1915 hatte ich mich in erster Linie auf eine Gruppe konzentriert, die als Actinomyceten bekannt sind. Das sind so genannte Strahlenpilze. Die Mikrobiologen bezeichnen sie als Pilze, wie der Name schon sagt, während sie für die Bakteriologen höhere Bakterien sind. Um diesen Punkt gleich zu klären: Derzeitig werden sie als Bakterien klassifiziert, aber als eine sehr spezielle Gruppe höherer Bakterien. Und da man wusste, dass sie in großen Mengen im Boden vorkommen, erhielten sie alle einen Namen als Oberbegriff: Actinomyceten. In der Tat wurden die Namen für diese Gruppe von Organismen alle hier in Deutschland vergeben. Professor Ferdinand Cohn von der Bratislava Universität nannte sie 1872 Streptothrix. Und Professor Harz in Berlin nannte sie 1879 Actinomyceten. Und diese beiden Namen sind aus der Perspektive der Nomenklatur dieser Antibiotika sehr wichtig. Es war deshalb verständlich, dass ich mich auf die Antibiotika dieser Gruppe von Organismen konzentrierte. Glücklicherweise, denn die Bakterien haben zwar eine große Zahl von Antibiotika beigesteuert, aber nur 2 oder 3 davon fanden eine praktische Anwendung. Ich brauche nur Tyrothricin, Bacitracin und Polymycin zu erwähnen. Es gibt aber noch 1 oder 2 weitere, die ich gelegentlich verwende. Die Pilze, die ursprünglich aufgrund der Entdeckung ihrer Fähigkeit zur Penicillin-Herstellung so enorm beeindruckten, haben auch 4 oder 5 Präparate für den Einsatz in der Praxis beigesteuert, etwa Griseofulvin, Cephalosporin und 1 oder 2 weitere. Aber die Actinomyceten haben die meisten Antibiotika beigesteuert und die meisten derer, die praktisch angewendet werden. Zu Beginn des Zeitraums, über den ich spreche, wurden Antibiotika kaum für praktische Zwecke eingesetzt. Wenn eine finanziell ehrgeizige Person auf das gesetzt hätte, was wir heute Antibiotika nennen, hätten ihr die weltweiten Umsätze nicht mehr als einige 100 Dollar eingebracht. Heute können wir das Produktionsvolumen weltweit tatsächlich auf mehrere Milliarden Dollar pro Jahr beziffern. Unter diesen Antibiotika sind die Actinomyceten. Seit 1939 wurden wahrscheinlich mehr als 1000 Verbindungen aus dieser Gruppe von Organismen isoliert. Und heute werden zwischen 50 und 80, abhängig von der speziellen Nutzung, zur praktischen Bekämpfung von Infektionskrankheiten bei Menschen, Tieren und Pflanzen eingesetzt. Einige werden auch in anderen Bereichen eingesetzt, auf die ich heute Vormittag nicht eingehen werde, beispielsweise in der Konservierung von Nahrungsmitteln, in Tierfuttermitteln usw. All diese Antibiotika werden in einer Größenordnung produziert, von der niemand je geträumt hätte. Ich möchte Sie auch daran erinnern, dass Paul Ehrlich, ebenfalls hier in diesem Land, Salvarsan isoliert hat – geschichtlich betrachtet noch gar nicht so lange her, aber in Bezug auf die Chemotherapie vor langer Zeit. Und Ehrlich selbst prophezeite, dass es nicht sehr lange dauern würde, bis chemische Verbindungen gefunden würden, die das für bakterielle Infektionen leisten können, was Salvarsan für Syphilis leisten konnte. Es dauerte aber ein Vierteljahrhundert, bis Domagk, wiederum in diesem Land, nachwies, dass diese antimikrobiellen Substanzen bakterielles Wachstum hemmen können – und zwar nicht nur im Reagenzglas, sondern auch in lebenden Tieren. Es schien, als würde nur die chemische Industrie zu diesen lebensrettenden Arzneimitteln beitragen. Aber zum größten Erstaunen, vor allem des chemischen Berufstandes, kamen die Antibiotika ins Spiel. Man erzählt sich - ich hoffe Sie verzeihen mir das, denn ich bin nicht im Geringsten geneigt, eine spezielle Gruppe anzusprechen, aber diese Geschichte muss hier erzählt werden. Als die deutschen Soldaten in den Afrikakorps in Nordafrika bei den toten Soldaten Penicillinpackungen fanden und ihnen erzählt wurde, dass diese chemischen Substanzen aus Schimmelkulturen isoliert wurden, hielten sie das für einen weiteren amerikanischen Bluff. Aber glücklicherweise stellte sich dieser Bluff als großer Segen für die Menschheit heraus. Wie ich bereits erwähnte, begann ich mich ab 1915 in meiner frühen Arbeit mit Actinomyceten zu beschäftigen. Aber erst 1939 konzentrierte ich mich auf die tatsächliche Isolierung dieser chemischen Verbindungen aus verschiedenen Actinomycetenkulturen. Die erste Kultur, die wir 1940 in einem rein kristallinen Zustand isolierten, nannten wir Actinomycin. Und diese Substanz allein ist eine großartige Geschichte wert – aber für eine umfassende Erläuterung habe ich keine Zeit. Falls genug Zeit ist, kann ich vielleicht später darauf noch eingehen. Actinomycin stellte sich aber als so extrem toxisch heraus, dass es die damit behandelten Tiere genauso schnell töten würde wie die Bakterien, die das Tier infiziert hatten. Deshalb kamen wir nach mehreren Experimenten zu dem Schluss, dass es aus chemotherapeutischer Sicht keinerlei Aussichten hatte und legten es deshalb zur Seite. Erinnern wir uns daran, dass das Wort „Actinomycin“ vom ersten Wort „Actinomyceten“ abgeleitet wurde, das Harz dieser Organismusgruppe zugeordnet hatte. Man rufe sich die historischen Daten ins Gedächtnis. Ich erkannte damals, dass die wichtigen Substanzen, die wir zu isolieren versuchten, über eine Aktivität verfügen müssten, die bei Penicillin nicht gegeben war. Da Penicillin in erster Linie gegen gram-positive Bakterien und bestimmte gram-negative Kokken wirkte, konzentrierten wir uns in meinem Labor auf die Isolierung der Substanzen, die gegen gram-negative Bakterien aktiv sein würden. Innerhalb von 2 Jahren konnten wir Streptothricin isolieren. Wie Sie bemerkt haben werden, wurde der Name von der ersten Bezeichnung von Ferdinand Cohn, nämlich Streptothrix, abgeleitet. Logischerweise verwandten wir für unser zweites Antibiotikum den zweiten Namen, der einem Mitglied der Gruppe dieser Organismen gegeben worden war. Aber Streptothricin - Streptothricin war der Vorgänger von Streptomycin. Wäre nicht 6 Monate später Streptomycin isoliert worden wäre, wäre Streptothricin heute ein Therapeutikum. Streptothricin verfügte über alle wünschenswerten Eigenschaften eines therapeutischen Wirkstoffes: Es war wasserlöslich; es war aktiv; es war hitzebeständig. Es war aktiv bei einem breiten Spektrum von Bakterien, sowohl gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien. Im Experiment konnten wir verschiedene Tiere retten, die mit einer Vielzahl von pathogenen Bakterien infiziert waren. Aber leider starben die Tiere, die wir durch den Einsatz von Streptomycin gerettet hatten, eine oder zwei Wochen später doch. Mit anderen Worten: Die Toxizität der Substanz war nicht genauso stark wie bei Actinomycin, aber es gab eine verzögerte Toxizität, die sofort berücksichtigt werden musste. Und auch, wenn wir uns das gewünscht hatten, wussten wir zu diesem Zeitpunkt bereits, dass Streptomycin keinen isolierten Typ der Verbindung repräsentierte, sondern dass die verschiedenen Actinomyceten gleichermaßen in der Lage waren, Verbindungstypen zu produzieren und dass einige davon möglicherweise besser sein würden als Streptotricin. Unsere gesamten Methoden haben wir im Zuge der Untersuchung von Streptothricin entwickelt. Innerhalb von 6 Monaten isolierten wir Streptomycin, das zwar sehr ähnliche Eigenschaften wie Streptothricin aufwies, das aber nicht so toxisch war wie Streptothricin und deshalb wesentlich erstrebenswerter schien. Übrigens: Vielleicht haben Sie schon den Ausdruck oder das Wort „Screeningprogramme“ gehört. Bei der Erforschung dieser Antibiotika gab es zwei Ansätze. Einerseits die oberflächliche Beobachtung, ähnlich der von Fleming und Gratia sowie anderen, die eine Schimmelkultur oder ein Bakterium beobachteten, das einen zerstörenden Einfluss auf unser Wachstum hat und andere Mikroorganismen hemmt. Andererseits gab es – und das war das System, das ich verfolgte und zu dessen Entwicklung ich vielleicht auch beigetragen habe – die systematische Suche nach chemischen Substanzen, die durch verschiedene Mikroorganismen produziert werden und das Wachstum anderer Mikroorganismen hemmen können. Und die nannten wir Antibiotika. Dieses Screeningprogramm bestand hauptsächlich aus der systematischen Untersuchung unterschiedlicher Organismen. Wir mussten sie nicht isolieren. Wir entwickelten Techniken, die uns eine vorläufige Einordnung gaben, welche Organismen wünschenswert sind und welche nicht. Dieses System wurde direkt von Tausenden Labors weltweit aufgegriffen und war insbesondere für die industriellen Labors von Bedeutung, auf die ich gleich eingehen werde. Man kann sagen, dass Ontogenie Phylogenie wiederholt. Und in den meisten dieser Screeningprogramme war die erste Substanz, die üblicherweise in verschiedenen Labors Und die zweite war Streptotricin. Und die dritte war vielleicht Streptomycin oder etwas anderes. Eigentlich ist Actinomycin heute - vielleicht kurz ein Wort zu Actinomycin, weil es gegenwärtig eine enorme Bedeutung hat, wie ich bereits sagte. Actinomycin ist hinsichtlich zahlreicher Bakterien enorm aktiv, aber auch sehr toxisch. stand gleich die Frage im Raum, was mit den Viren ist. Und wir begannen damit, das Screeningprogramm auch auf Viren anzuwenden. Wir scheiterten kläglich und gleich werde ich den Grund dafür nennen. Die einzige Art von Verbindung, die nach unserer Feststellung eine eindeutige Aktivität zeigte, war eine Form von Actinomycin. Wir nannten diese Form Actinomycin A. Aber innerhalb von 5, 6 Jahren isolierte ein Industrielabor in unserem eigenen Bundesstaat New Jersey, nämlich Hoffmann La Roche, eine weitere Form des Actinomycins, das mit B bezeichnet wurde. Aber auch hier galt: keine Begeisterung, keine Hoffnung - es war keine Spur, die man weiter verfolgte. ihm bei dem Treffen hier vor 6 Jahren zu begegnen –, gelang es also Domagk und seinen Kollegen, eine neue Form des Actinomycins zu isolieren, die sie als Actinomycin C bezeichneten. Und nach oberflächlicher Untersuchung, wie ich leider sagen muss, behaupteten oder glaubten sie, dass es hoch wirksam gegen eine bestimmte Krebsform, den Morbus Hodgkin, ist. Sie veröffentlichten zahlreiche Aufsätze über die aktive Wirkung von Actinomycin C auf Morbus Hodgkin. Diese Artikel erreichten mich Anfang 1953 in der Zeit, als der Mikrobiologiekongress in Rom stattfand. Ich war damals Vorsitzender einer Beratungsrunde zum Thema Actinomyceten. Und ich sagte in meiner Rede als Vorsitzender, dass die Geschichte dieser Antibiotika noch nicht zu Ende sei und enorme Möglichkeiten bestünden, die sich auf die Wirksamkeit gegen Krebs bezögen. Und ich verdeutlichte das an der Arbeit der Gruppe um Domagk. Und zu meinem großen Unglück saß ein Journalist im Publikum, der nur ein Wort von dem, was ich gesagt hatte, verstanden hatte. Und das war das Wort „Krebs“. Und da ich ein Jahr zuvor den Nobelpreis bekommen hatte, folgten große Schlagzeilen auf allen Zeitungstitelseiten der Welt: Glauben Sie mir, dass ich dafür sehr büßen musste. (Lachen) Ich erhielt jede Menge Telegramme. Ich kann nur eines zitieren, das von einem der afrikanischen Könige einging. Er kündigte an, mit seiner Tochter anreisen zu wollen, die an Morbus Hodgkin litt. Ich sollte sie behandeln. Und er versprach mir, ich könnte dafür jedes Araberpferd haben, das jemals praktischen Nutzen gefunden hat – und zahlreiche weitere Geschichten dieser Art. Aber das wirklich Interessanteste passierte, als ich nach Hause zurückkam. Innerhalb eines Tages erhielt ich den Anruf eines sehr vermögenden amerikanischen Industriellen. Er sagte: „Ich habe gehört, Sie haben ein Heilmittel gegen Morbus Hodgkin gefunden?“ Ich antwortete: „Das ist eine Menge Unsinn. Erstens habe ich das nicht gefunden. Es gibt eine Gruppe, die Anzeichen für eine Wirksamkeit sieht. Wenn Sie wollen, setzen Sie sich mit denen in Verbindung.“ Ich antwortete, dass wir noch nicht wüssten; wir müssten das weiter erforschen. Und er fragte mich, ob wir Geld benötigen, um unsere Aktivitäten auszuweiten. Ich sagte, dass ich immer Geld gebrauchen könnte. (Lachen) Selbst ein Nobelpreisträger hat nicht alles Geld für seine Forschung zur Verfügung. Ich habe eine ziemlich hohe Summe genannt und er sagte, dass ich in der nächsten Woche den Scheck dafür erhalten werde. Und ich habe ihn tatsächlich in der nächsten Woche bekommen. Wir starteten sofort ein Programm, um weiter zu forschen. Denn wir wussten zum damaligen Zeitpunkt, dass es zahlreiche Formen von Actinomycin gab. Tatsächlich trennte einer der brillantesten Chemiker dieses Landes, Professor Brockmann in Göttingen, diese Actinomycine in viele Dutzend unterschiedliche Formen, die er nach den Buchstaben des griechischen Alphabets benannte und für die er alle arabischen und römischen Zahlen verwendete. Dann initiierten wir dieses Programm. Wir suchten nach einer Form der Wirkung von Actinomycin, die weniger toxisch wäre als unsere ursprüngliche Form A. Und weil Brockmann Schwierigkeiten bei der Trennung von Actinomycin hatte, das eine Mischung aus unterschiedlichen chemischen Identitäten darstellt, suchten wir eine einzelne Form. Und innerhalb eines Jahres gelang es uns, eine solche Verbindung zu isolieren. Wir nannten sie logischerweise Actinomycin D. Es war ein echter Glücksfall, als wir feststellten, dass dieses Actinomycin D tatsächlich eine Wirkung auf bestimmte Krebsformen zeigte. Das betraf aber leider nicht die sehr verbreiteten Krebserkrankungen, sondern Wilms-Krebs oder Nierenkrebs bei Kindern oder eine bestimmte Form des Kehlkopfkrebses, die als Rhabdosarkom bekannt ist. Aber wesentlich wichtiger ist, dass Actinomycin, insbesondere die D-Form, zu einem der großartigsten biochemischen Werkzeuge geworden ist, das in den letzten Jahren Einzug in die Labors gefunden hat. Tatsächlich – wenn ich das trotz der Anwesenheit einiger so genannter Molekularbiologen in diesem Raum sagen darf – trug es dazu bei, das Rätsel, den genetischen Code der DNA/RNA-Transformation zu lösen. Und heute wird es in zahlreichen Labors bei solchen Studien verwendet. Um wieder auf Streptomycin zurückzukommen: Streptomycin war nicht unbedingt ein ideales Arzneimittel. Wie der Vorsitzende bereits erläuterte, hat es zahlreiche Infektionskrankheiten ausgerottet. Praktisch jede Infektionskrankheit, die die Menschheit bedroht – ich spreche von Infektionskrankheiten außer viralen Infektionen, auf die ich später noch zu sprechen komme – kann mehr oder weniger definitiv bekämpft werden. Und vor allem bei Tuberkulose spielte Streptomycin eine wichtige Rolle. Und zwar in einem Ausmaß – vielleicht kann ich hier noch 1 oder 2 Geschichten erzählen. Als ich das erste Streptomycin-Werk, das in Indien errichtet wurde, außerhalb von Bombay einweihte, hatte ich an der Seite des damaligen Premierminister Nehru – dem großartigen Premierminister von Indien – das Glück, ein großes Publikum ansprechen zu können. Und Premierminister Nehru fragte mich: "Warum bringen Sie uns solche Arzneimittel? Hier leben viel zu viele Menschen. Sie bringen uns Arzneimittel, um all die vielen Menschen zu retten, deren Tod wir in Kauf genommen haben, um unsere Bevölkerungszahl unter Kontrolle zu halten." Und ich sagte zu ihm: "Premierminister Nehru, das ist Ihr Problem. Meine Aufgabe ist es, die Leben zu retten, die bereits in der Welt sind." Und natürlich konnte er darauf nichts mehr erwidern. Ich bin sicher, dass man das Problem dort soziologisch lösen wird, statt den Fortschritt der Medizin zu verhindern. Streptomycin hatte gewisse Grenzen: Einerseits wirkte es in begrenztem Maße toxisch auf das Hörvermögen (Ototoxizität) und auf die Bewegungskontrolle durch das Nervensystem oder vielmehr den achten Nerv. Eine weitere Einschränkung war die Tatsache, dass es bei der Tuberkulose über sehr lange Zeiträume eingenommen werden musste, um die Krankheit zu bekämpfen. Damit gab man dem Tuberkulosebakterium die Möglichkeit zur Resistenzentwicklung. Und viele Menschen waren so unglücklich mit diesen beiden Phänomenen, dass sie davon überzeugt waren, die Tuberkulose würde innerhalb kurzer Zeit wieder das sein, was sie zuvor gewesen war. Glücklicherweise – und ich habe das immer wieder gesagt – war Streptomycin das erste Arzneimittel, das sich als wirksam gegen Tuberkulose erwies. Nicht nur gegen den Organismus im Reagenzglas, sondern auch gegen die Infektion bei Tieren und Menschen. Natürlich konnte es noch nicht das letzte und auch nicht das beste Mittel sein. Glücklicherweise wies dann Professor Lehmann aus Göteborg in Schweden binnen kurzer Zeit nach, dass eine bestimmte chemische synthetische Verbindung, nämlich Paraaminosalicylsäure, oral verabreicht, während Streptomycin injiziert werden musste, eine zerstörende Wirkung auf Tuberkulose hat. Durch Kombination von Streptomycin mit PAS, Paraaminosalicylsäure, konnte nicht nur die Toxizität von Streptomycin oder die erforderliche Menge reduziert werden. Durch eine in der Häufigkeit reduzierte Dosisverteilung war man in der Lage, den toxischen Effekt enorm zu reduzieren. Und es gab noch ein weiteres Glück: 1952, ungefähr 2 Wochen, vielleicht auch nur 1 Woche, nachdem ich den Nobelpreis in Schweden erhalten hatte, hatte ich einen weiteren Auftritt zu absolvieren, der auf der anderen Seite der Erde stattfand, in Tokio. Ich hatte mich 6 Monate zuvor dazu verpflichtet, eine Reihe von Vorträgen in diesem Land zu halten. Die Feiern anlässlich der Nobelpreisverleihung endeten am 10. Dezember, und am 13. Dezember musste ich meinen Hauptvortrag halten. Am 14. bestieg ich dann ein Flugzeug, das uns in einem 52-stündigen Flug direkt nach Tokio brachte. Mit dieser Reise erfüllten wir unsere früher gemachte Zusage. Der Kaiser von Japan lud mich zu einem Besuch zu sich ein; er war sehr freundlich. Er stellte mir einige Fragen und eine der Fragen - das ist historisch hier sehr bedeutsam: Er sagte, dass bei Kriegsausbruch in Japan jedes Jahr 300 Tuberkulosetote zu beklagen waren, jährlich 300 Tote wegen Tuberkulose 1940/41. wir waren ungefähr einen Monat in Japan. Wir schreiben diese Reduzierung dem Einsatz von Streptomycin zu. Aber ich möchte Sie fragen, welches Schicksal diese 90 erwartet; haben sie eine Hoffnung zu überleben?" Und ich sagte zu ihm, man müsse bedenken, dass Streptomycin das erste Arzneimittel war und, wie ich bereits eben sagte, kaum davon auszugehen ist, dass es das einzige bleiben wird. Andere werden folgen, die es vielleicht sogar ersetzen werden und die man sicherlich auch damit kombinieren kann. Und während ich mit ihm sprach, wurde Isoniazid, das dritte großartige und wichtige Antituberkulosemittel, in den USA und an anderen Orten entdeckt. Und ich war sehr glücklich, als ich 10 Jahre später las, dass die Tuberkulosesterblichkeitsrate in Japan auf weniger als 30 pro Jahr gesunken war. Damit ist die Tuberkulose heute, wie der Vorsitzende bereits sagte, praktisch vollständig bekämpft. Darauf muss ich hier nicht näher eingehen. Aber bevor ich zum Schluss komme, muss ich hier noch etwas erläutern, auf das ich sehr häufig angesprochen werde. Nämlich die Frage nach Viruserkrankungen. Was ist mit Krebserkrankungen? Bieten Antibiotika eine Hoffnung für deren Bekämpfung? Sie müssen wissen, dass wir es in dem Fall dieser beiden Krankheitsgruppen mit einem völlig anderen Muster zu tun haben als bei den Infektionskrankheiten, die durch mikrobielle Systeme verursacht werden. Bei Typhus, Lungenentzündung oder Tuberkulose haben wir es mit einer Mikrobe zu tun, die wächst, die metabolisiert, die sich vervielfältigt. Viren wachsen nicht, metabolisieren nicht, vervielfältigen sich nicht per se – ich sagte „vervielfältigen“, meinte aber „teilen“. Anders gesagt: Sie sind nichts anderes als chemische Wirkstoffe, die die Zelle stimulieren, Substanzen wie sie selbst zu produzieren. Ich kann jetzt hier die Wirkungsweise dieser Antibiotika nicht erläutern, weil dazu die Zeit nicht reicht. Es ist extrem wichtig zu wissen, wie sie auf diese empfindlichen Bakterien einwirken. Einige haben Einfluss auf das Wachstum, andere auf den Stoffwechsel. Wieder andere auf die Vermehrung in der ein oder anderen Form. Da die Viren nicht über diese Eigenschaften verfügen, wirken die Antibiotika auch nicht auf Viren. Und ich versichere Ihnen, dass wir, sobald wir die Bedeutung von Streptomycin erkannt und die ersten Mittel erhalten hatten, um unsere Arbeit ausbauen zu können, für die Untersuchung von Viren, über die wir nur sehr wenig wussten, ein spezielles Gebäude gebaut wurde. Aber wir holten uns Unterstützung von Virologen und anderen Experten und nahmen das Problem direkt in Angriff. Und ich kann Ihnen versichern, dass das die größte Zeit- und Geldverschwendung in meinem Leben war, weil wir praktisch nichts erreicht haben. Und das gleiche gilt für die Virusforschung, ich meine die Suche nach antiviralen Wirkstoffen weltweit. Derzeit sind Wirkstoffe bekannt, die möglicherweise Effekte auf Viren in Gewebekulturen und im Reagenzglas haben, aber nicht in Menschen oder Tieren. Glücklicherweise ist die Situation für Krebsphänomene oder neoplastische Erkrankungen nicht so schlecht. Bei neoplastischen Erkrankungen, bei denen bestimmte Zellen außer Kontrolle geraten und sich unabhängig von der Kontrolle des menschlichen oder tierischen Körpers vermehren, können wir auf die Wachstumsgeschwindigkeit dieser Zellen einwirken. Und dafür wurden Substanzen gefunden, gegenwärtig sogar einige. Das beginnt mit Actinomycin und endet mit verschiedenen Verbindungen, die in erster Linie in Japan isoliert werden konnten, Sacromycin. Ich nehme an, dass sicherlich der ein oder andere von Ihnen von dieser Substanz Rifamipicin gehört hat einem Derivat von Rifamycin, einem typischen Antibiotikum, dass also möglicherweise chemische Derivate zur Verfügung stehen werden. Und übrigens bin ich so gut wie gar nicht auf die Tatsache eingegangen, dass bei den Antibiotika zahlreiche Versuche unternommen wurden, sie chemisch zu modifizieren, und zwar in der Hoffnung, ihre Aktivität zu verändern. Wie Sie wissen, sind mit Penicillin zweifelsohne allein in den letzten Jahren enorme Fortschritte in dieser Richtung gelungen. So wurden beispielsweise die so genannten semisynthetischen Penicilline gefunden. Das natürliche Penicillin, also das von der Mikrobe produzierte Penicillin, kann durch ein Enzym aufgespalten und dann durch Zugabe anderer chemischer Verbindungen neu zusammengebaut werden. Und diese semisynthetischen Penicilline verstärken nachweislich die Wirksamkeit der Penicillin-Gruppe enorm. Leider stellte sich dies im Fall von Streptomycin als unmöglich heraus. Obwohl ursprünglich eine Verbindung mit der Bezeichnung Dihydrostreptomycin aus Streptomycin synthetisch hergestellt werden konnte, bot diese Verbindung keine zusätzlichen wünschenswerten Eigenschaften, die Streptomycin selbst nicht zu bieten hätte. Andererseits wurden nach Streptomycin zahlreiche weitere Antibiotika isoliert – allen voran Chloramphenicol und dann die Tetracycline und zahlreiche weitere, die ich bereits erwähnte, Rifamycin usw., die sich für chemische Änderungen eignen. Sowohl im Labor als auch in der praktischen Anwendung gibt es heute Dutzende Tetracycline. Im Fall von Chloramphenicol gibt es die aktive und die inaktive Form. Das ist praktisch heute das einzige Antibiotikum, das synthetisch hergestellt wird. Es ist zwar ein Antibiotikum, weil es ursprünglich aus einer Mikrobenkultur isoliert wurde, wird aber heute größtenteils synthetisch hergestellt, deshalb haben wir große Hoffnungen. Und die erste Verbindung, die das Potenzial einiger dieser mikrobiellen Produkte, die wir Antibiotika nennen – vielleicht werden sie einmal anders bezeichnet – gegen Viren oder Neoplasmen aufdecken, wird das gesamte Gebiet enorm bereichern. Immer wieder werde ich gefragt, wo die Antibiotika heute stehen? Wenn ich die Zeit hätte, Ihnen den Fortschritt dieser Verbindungen und ihres praktischen Einsatzes zu demonstrieren, würde ich eine Grafik mit mehreren, stagnierenden Perioden präsentieren. Leider hatte eine dieser Stagnationsperioden mit einer Verbindung zu tun, die ebenfalls in diesem Land isoliert wurde: mit Thalidomid. Die Entdeckung von Thalidomid und sein Einsatz überall, insbesondere in den USA, bedeutete für die weitere Suche nach neuen Antibiotika einen enormen Rückschlag. Ich brauche darauf nicht detailliert einzugehen, denn ich bin sicher, dass die meisten von Ihnen wissen, worum es geht. Aufgrund der toxischen Wirkung bestimmter Antibiotika, insbesondere wieder einmal Chloramphenicol, stellen die Regierung und die Food and Drug Administration der Gesundheitsbehörden in den USA in ihren Sicherheitsauflagen äußerst hohe Anforderungen an die chemische Industrie oder die Antibiotikaindustrie, was die praktische Evaluation vor der Zulassung für den Einsatz in der Praxis betrifft. Nur ein Beispiel: Als Streptomycin entdeckt wurde und seine Möglichkeiten gegen gram-negative Bakterien nachgewiesen worden waren, folgte beispielsweise die logische Frage, was im Falle von Mischinfektionen passiert. Warum kann man Penicillin und Streptomycin nicht gemeinsam verwenden? Infolgedessen wurden zahlreiche Kombinationspräparate eingeführt. Nur das erste wurde als Kombiotikum bezeichnet – das bezeichnet eine Kombination aus Antibiotika. Und das wird wahrscheinlich seit 1944 oder 1945 bis heute eingesetzt. Aber jetzt ist selbst diese alte Kombination von den staatlichen Behörden in Frage gestellt worden. Man sagt, dass diese Kombination am besten bei bestimmten Mischinfektionen eingesetzt werden kann, insbesondere bei Endokarditis. Aber im Falle der Endokarditis muss man eine große Dosis Penicillin verabreichen. Wenn man ein Kombiotikum einsetzt, verabreicht man damit eine große Menge Streptomycin, die nicht nötig ist und für den Körper tatsächlich toxisch sein kann. Und deshalb stellt sich die Frage: Warum nimmt man nicht einzelne Antibiotika und kombiniert sie in unterschiedlichen Konzentrationen je nach Bedarf? Leider steht dem Arzt aber kein umfassendes Labor zur Verfügung, das diese Fragen beantworten könnte: Hier habe ich eine Kultur. Bitte finden Sie für mich heraus, wie viel Penicillin, wie viel Streptomycin, wie viele andere Arzneimittel ich nehmen muss. Manchmal muss er direkt handeln. Und deshalb sind diese Antibiotikakombinationen für ihn lebensrettend. Und ich bin davon überzeugt, dass sie bereits viele Leben gerettet haben. Die Frage ist also, wie es jetzt weitergeht. In den letzten Jahren wurden nur sehr wenig neue Antibiotika entwickelt. Deshalb stellt sich die Frage, ob wir das Ende der Antibiotika-Entwicklung erreicht haben oder ob wir genügend Verbindungen isoliert haben, um unseren gesamten Bedarf abzudecken. Die Antwort kennt nur die Zeit. Vielen Dank.

Selman Waksman’s skepticism about antiviral research
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A Rational Road to Success

What appeared to be “the greatest waste of time and money” to Waksman, was a road to success for George Hitchings and Gertrude Elion. Right from the start of their 40-year-long collaboration, which was crowned by a Nobel Prize in 1988, they built their research on strategy rather than on serendipity. Their hypothesis was that it should be possible to selectively inhibit the synthesis of nucleic acids of bacteria, cancer cells and viruses without impeding the growth of normal cells. So they began to develop antagonists of nucleic acid bases – in times when the details of purine and pyrimidine synthesis had not yet been worked out. The results of this rational “antimetabolite approach” include inter alia the first treatment for leukemia, 6-mercaptopurine, the first immuno-suppressive agent, azathioprine, and the antiviral drug aciclovir for the treatment of herpes simplex, herpex zoster and varicella zoster infections. When Gertrude Elion came to Lindau in 1996, she thoroughly explained why the three compounds aciclovir, ganciclovir and azidothymidine act selectively on certain viruses. The latter was the first reverse transcriptase inhibitor for the treatment of AIDS. 


Gertrude Elion on the first drug to treat HIV/AIDS
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With “a feeling of optimism that we can do something for AIDS patients that is more than we’ve been able to do in the past”, Elion concludes her talk and mentions the triple combination therapy. In the week after her Lindau lecture it was introduced in Vancouver and indeed proved to be the decisive turning point in the treatment of HIV infections. 

Elion’s and Hitching’s co-recipient of the Nobel Prize, Sir James Black, who never lectured in Lindau, had pursued a different drug discovery strategy. He identified subtypes of certain receptors and developed drugs to inhibit them by molecular modeling. In 1964, he developed the first beta-blocker, propranolol, and eight years later he characterized the H2-subtype of histamine receptors, and subsequently developed the first H2-receptorantagonist – an effective medicinal treatment for patients with peptic ulcer who so far mostly had to undergo surgical treatment. The Japanese biochemist Akira Endo on the other hand never has been rewarded with a Nobel Prize nor did he receive any royalty for his breakthrough discovery that enabled the development of statins, which have generated cumulative sales of almost half a trillion dollars as of today. Statins inhibit excessive cholesterol synthesis and therefore are suited to treat certain cardiovascular diseases. They target the enzyme hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, which catalyzes a key step in the biosynthesis of cholesterol. Konrad Bloch and Feodor Lynen, the two scientists who had earned the Nobel Prize in Physiology or Medicine 1964 for elucidating the complex biosynthesis of cholesterol, were frequent guests in Lindau. As a Nobel Laureate, Bloch had focused his research more and more on the role of lipids in the composition and function of cellular membranes, as his 1972 lecture shows:


Konrad Bloch (1972) - Control Aspects of Lipid Biosynthesis

Professor Weißschädel, ladies and gentlemen. The preceding speakers have spoken to you on broad subjects of society, physiology and medicine, and in clear and comprehensible terms, in a language understandable to all of you. I am going to depart from this pattern and give a report on a rather technical, highly specialised subject. And for this reason I will have to speak in the language of chemistry and biochemistry. I therefore expect some problems of communication. Unfortunately, this particular language problem cannot yet be handled by simultaneous translation. When I spoke here 3 years ago, I commented, and perhaps lamented, the fact that lipids played a relatively minor role in the concepts and dogmas of modern biology, and molecular biology in particular. At that time, and still today, the nucleic acids and proteins occupy the centre of the stage, and deservedly so, because these macromolecules have taught us so much about heredity and the processes of information transfer. Yet in the few years that have passed, a rather significant change has taken place. Largely because it has been recognised that we cannot understand or describe cellular activities without an intimate knowledge of the structure and function of cell envelopes or the membranes which surround the cell content. And since lipids, along with protein, are essential membrane components, the structure and biosynthesis of lipids and the role which lipids play in modulating membrane properties have attracted wide attention. And it has been said that, perhaps with undue enthusiasm, that membranes may be to the 1970s and 1980s what nucleic acids were to the 1950s and the 1960s. Be that as it may, the field is an unusually active one and pervaded by the feeling that we are on the threshold of major breakthroughs, which may allow us not only to understand how membranes work but also how to synthesise membranes. And if you can synthesise functional membranes, we may well be on the way to synthesising cells themselves. With this rather sanguine introduction, let me turn more soberly to a statement of the lipid problem as it relates to membrane function. According to a currently very attractive membrane model - may I have the first slide please – proposed by Singer in modification of the older Danielli membrane structure, the lipid bilayer structure, into which proteins either penetrate partially or totally. We have then an arrangement of polar portions of the lipid molecule extending to the external cell fluid, and an arrangement of 2 layers of these phospholipid structures, in which the hydrocarbon chains, the fatty acid chains, interact with each other, both laterally and vertically. The one particular point I want to call attention to is that these hydrocarbon or hydrophobic chains are not given as straight linear arrangements; that they vary in length in this scheme; and also that the arrangement of these chains shows either closer or more remote relationships. And this is not an accident; this is deliberately done by the authors of this model. And this particular arrangement of the fatty acid chain will be part of my thesis. According to this type of model then, the lipid bilayer provides a liquid mobile matrix into which other molecules, notably the proteins, can float and move about. The emphasis here is on the liquid or fluid phase properties of the membrane, which apparently only the lipids can provide. We therefore shall have to enquire why lipids are uniquely suited to provide the properly liquid or fluid medium. May I have the next slide please? The phospholipids, and these are the ubiquitous and universal membrane lipids, have the distinctive structural features I alluded to earlier: a so-called polar head group containing glycerol phosphate and a nitrogenous base, and attached to them the long hydrocarbon chains. This polar, non-polar or antipathic character appears to be the secret of the phospholipid molecule. The polar head groups are exposed to the aqueous phase external to the membrane while the non-polar hydrocarbon chains make contact with each other, both within the molecule and between adjacent molecules, by additive van der Waals interactions. It is the strength of these interactions which determines the action between these hydrocarbon chains, which determines the fluidity or lack of fluidity of a particularly membrane. In turn it will be obvious that the strength of these interactions is a function of the number of carbon atoms in the chain and in the way in which these hydrocarbons are aligned, which in turn follows from the van der Waals radii between adjacent chains. Now in a closely packed arrangement, such as shown here, in a phospholipid containing 2 saturated fatty acids, the interactions lead to physical properties which seem to be unsuitable for membranes. And, indeed, one does not find in nature phospholipid molecules which contain 2 saturated fatty acid chains. On the contrary - the next slide please - the predominant pattern in most phospholipids is 1 saturated hydrocarbon chain, and another 1 in which the molecule is bent away, therefore lessening and weakening the interaction, the hydrophobic or non-polar interactions. The question then arises: How is this particular structure, consisting of regions in which there are close contacts and regions in which there is less contact, how this is achieved? Now, in the bacterial membrane, which we know in much greater detail than the eukaryotic membrane, one finds most commonly phospholipids containing pairs of saturated and unsaturated olefinic acids, either 16 carbon atoms long. And characteristically the cis-olefinic bond is present somewhere in the middle of the molecule, at the 9, 10 or 11 position. And the double bond, as I indicated, then introduces a kink in the hydrocarbon chain, weakening the non-polar interaction. And it is clear that the specific location of this disturbing feature, as it were, along the hydrocarbon chain is very important in determining whether the interactions will be strong or weak. And this may well be the reason why we find in nature, in natural phospholipid predominantly, if not exclusively, olefinic double bonds at a particular position along the hydrocarbon chain. There is not much evidence that nature has chosen this structural feature, a centrally located cis-olefinic bond, as a principle device to achieve the appropriate membrane fluidity. However, what apparently matters is not the chemistry of the olefinic bond - the next slide please – but simply some bulky or disturbing group in the same position along the hydrocarbon chain. Here we have the cis-olefin which was indicated in the previous model. This can be replaced, for example, by a cyclopropane group in certain bacterial systems, or one can artificially create the same disturbance in the alignment of hydrocarbon chains by introducing a bromine atom at the 9, 10 position, or by introducing an acetylated hydroxyl function. In some instances, in some bacilli, the same loosening of the membrane phospholipid is achieved by branching of the hydrocarbon chain, either at the end or at the penultimate position. So it is not cis-olefinic bond per se but some disturbing influence, some ... (inaudible) group then, which under certain conditions can replace the naturally occurring cis-olefin structure. One of the currently very interesting questions: how does a cell achieve the proper mixture of saturated and unsaturated fatty acids in a phospholipid molecule and thereby the appropriate physical properties for the membrane? One condition which allows one at least to vary the phospholipid composition of membranes in microorganisms is temperature, environmental temperature. It has long been known that, as a result of changes in environmental temperature, the degree of unsaturation of the fatty acids undergoes very drastic changes. And this response is clearly an adjustment of the cell to preserve membrane fluidity under adverse or abnormal conditions. And we may ask, by what regulatory mechanisms this adjustment is achieved? The next slide please. There are various a priori possible mechanisms for achieving the proper liquid, the nature of the membrane: One, by regulating the relative rates of the saturated and unsaturated acids. The other one would be the relative rates of activation of these saturated and unsaturated fatty acids, that is the conversion into the activated derivative, which are necessary for introducing the molecule into the phospholipid structure. Or rates of transport could be involved. And finally, the rate-determining step could be the selection of saturated or unsaturated fatty acids for introduction into the phospholipid molecule. Doctor Sinensky in my laboratory has addressed himself to this problem by studying control of phospholipid synthesis in Escherichia coli, and has obtained some rather unambiguous answer, that mechanism for the relative rates of eutrophication do determine the composition of the membrane lipids in this microorganism. Sinensky took advantage of the fact that E. coli cells will take up or incorporate from the external medium both saturated and unsaturated fatty acids, when these are provided. And under appropriate conditions the external medium is indeed the principle fatty acid source for the membrane phospholipids. By supplying the bacterial cell with tritium-labelled oleate and C14-palmitate during growth and measuring the ratio of the 2 isotopes in the membrane phospholipids, he showed that one of the steps in the utilisation of fatty acids of phospholipid synthesis is indeed temperature control. The next slide please. This panel here to the left shows the response in terms of the ratio of – if you can move this over a little bit, please, the slide, to the right. The ratio of palmitate to oleate incorporated into cellular phospholipids, as a function of temperature, shows a very marked, about 4- to 5-fold, rise between 20 and 30 degrees. Subsequently the inflection of this curve occurs which can be explained, but which I will not have time to explain here. The more important result is that the same phenomenon, the change in the relative proportion of these 2 types of fatty acids, can be reproduced in vitro with isolated membrane particles by providing them again with labelled palmitate oleate. Again one obtains a temperature- dependent change in the relative amounts of palmitate oleate, which are incorporated into the cellular phospholipids. Independent experiments show that it is the incubation temperature during assay, and not during growth, which determines the relative proportion of these 2 membrane constituents. The effect of temperature is therefore on enzyme activity and not on enzyme synthesis. Induction or derepression are not involved. The esterifying enzymes - the next slide please - what we are concerned with here, introducing fatty acid residues into the 1 and 2 position of the phospholipid precursor. And they can do so in various ways: they can either introduce these residues into the 1 position or the 2 position; they can introduce a subsequent step, an additional saturated or an additional unsaturated fatty acid, resulting in 4 different phospholipid species. And it will be the ratio of these phospholipid species which determines the overall phospholipid composition and the suitability of the membrane lipids under a particular environmental temperature. When the environmental temperature for growth of the microorganism is normal, one will find primarily this type of a species here, in which we have one saturated and one unsaturated molecule. As the growth temperature is lowered this more unsaturated species will increase and conversely, at higher temperature, we will have a relative increase in the proportion of the diunsaturated phospholipid. One final point on this subject which is worth mentioning is, that these variations in lipid compositions in E. coli are continuous with growth temperature rather than a step function. And it is therefore not surprising that the temperature effect is mediated in the enzymatic rather than the genetic level. The second major determinant of phospholipid structure and hence membrane fluidity, as I indicated already, is the length of the hydrocarbon chain. And this brings me to the topic I want to discuss in some detail. Fatty acid synthesis is that the build-up of the hydrocarbon chain has some very intriguing features, which it shares with very few other biosynthetic processes, polyisoprenoid biosynthesis being perhaps the only other comparable case. The next slide please. The process involves the sequential action of a set of 7 enzymes, which activate and condense the precursors. And after completion of each sequence or cycle of reactions the process is repeated 7 or 8 times, until a chain of 16 or 18 carbon atoms has been reached. Each of the enzymes has a remarkably broad specificity in that it can handle intermediates varying in length from 4 to 16 carbon atoms. Surprisingly the chain lengthening process comes to an abrupt or rather abrupt halt at the level of 16 or 18 carbon acid, as shown by some typical fatty acid patterns. The next slide please. Fatty acid synthetases for example from a bacterial... from corynebacterium, or a plant source which we have investigated, show this pattern in which one particular fatty acid predominates and in which one finds small amounts of fatty acid with longer or shorter chains. This was entirely expected. The only exception to this monomodal distribution pattern we have found in fatty acid synthesis by Mycobacterium phlei, which shows a bimodal fatty acid distribution pattern, which was entirely unexpected. And I will deal in some detail with this particular aspect. In order to explain the normal or more usual situation of chain length specificity in the build-up of the hydrocarbon chain and its stoppage, let us say at 16 carbon atoms, Lynen and his collaborators have advanced an elegant mechanism to rationalise chain termination. In terms of the change in the relative rates of 2 of the component enzymes, namely the condensation step by which the carbon chain is lengthened and the termination process in which the end product is discharged from the enzyme. As the hydrocarbon chain grows, and with it the hydrophobic character of the molecule, interactions between substrate or intermediate and enzyme protein favour the termination process at the expense of condensation. A mechanism of this type would not predict absolute fidelity, that is the termination in a single length fatty acid but rather a spectrum with 1 or 2 chain lengths predominating. And this is what we found, as I have said, with one exception so far. Now, before I describe the properties of this rather unusual fatty acid synthetase from Mycobacterium phlei, let me comment first briefly on some general properties of fatty acid synthetases. As I mentioned a moment ago, these biosynthetic pathways consist of enzyme systems that form long-chain fatty acids from acetyl-CoA and malonyl-CoA by the sequential action of at least 7 enzymes. In conformity with the principle of biochemical unity, to which we are so accustomed, the chemical mechanisms of the individual steps appear to be identical for all forms of life: animals, plants and microorganisms. On the other hand the fatty acid synthetase enzymes from different sources exhibit strikingly diverse molecular properties and patterns of organisation. The next slide please. The classical example of fatty acid synthetase system is the multi-enzyme complex from yeast, first described by Lynen, and the comparable fatty acid synthetases from animal tissues described by Wakil and Porter. And there is a second class of fatty acid synthetases which catalyses the same type of reactions but shows entirely different organisational patterns, namely those which are found in bacteria and in certain plant systems. The next slide please. What we like to call type-I fatty acid synthetases, as exemplified by Lynen’s yeast fatty acid synthetase, are highly organised multi-enzyme complexes varying in molecular weight from half a million to about 2 million, depending on the source. All animal tissues contain fatty acid synthetases of roughly the same molecular weight, half a million. And their specific activities are also roughly similar. I have listed here the fact that 2 bacterial sources also contain multi-enzyme complexes with molecular weights in the same range as those found in yeast. And finally, another example of fatty acid synthetase in a plant system in the ethylated form of the algae Euglena gracilis. The point I want to make here that all these enzyme systems then are highly organised structures, in which the individual components are part of the very tight complex in which one cannot study the individual enzymes. Or separate the individual enzymes from the complex which interact in such a way that activity of each individual component is dependent on the presence of others. You find then a remarkable range of molecular weights as well as specific activities, but with one possible exception: It appears that the subunit structure of this multi-enzyme complex is very similar. In all but one case so far one can dissociate these multi-enzyme complexes into subunits which have roughly a molecular weight of 200,000 and which are functionally totally inactive – either with respect to total fatty acid synthesis or catalysis of some of the partial reactions. The next slide shows by contrast fatty acid synthetases from bacterial and plant systems, in which the individual component, the 7 enzymes, can be isolated as separate entities, purified to a high degree; and which are further characterised by the requirement of a molecule known as ACP or acyl-carrier protein, which must be added externally to the system for activity. In contrast to the organised enzyme systems, which I mentioned briefly, in which this ACP or acyl-carrier protein molecule is built into this stable multi-enzyme complex. This rather striking and unparalleled duality of fatty acid synthetase properties, the highly organised and the unorganised systems, interested us for 2 principle reasons. First of all we were curious to know whether the occurrence of type I and type II enzymes – type I being the organised ones and type II the dissociated systems - has evolutionary or phylogenetic significance. And secondly, we hoped to find examples of fatty acid synthetases intermediate in properties between the types I and II. If such intermediate or transitional forms existed, then they might be manipulated to cause them to dissociate and reassociate, and therefore serve as models for studying or reproducing the assembly of individual enzymes into a multi-enzyme complex. We have so far failed in both of these objectives. But searching for a suitable enzyme source among the more advanced prokaryotic organisms, we have found in Mycobacterium phlei a fatty acid synthetase with properties and regulatory features that seem to us quite noteworthy. Now, as I indicated earlier, Mycobacterium phlei does contain a multi-enzyme complex and this was the first example of a type I fatty acid synthetase in a bacterial source. And this then, in fact, established the point that multi-enzyme complexes can occur in prokaryotic as well as in eukaryotic cells. We have since found multi-enzyme complexes of similar character also in corynebacterium species and in streptomyces. But in the absence of a more systematic survey and in view of the uncertain phylogenetic relationships in bacteria, we are reluctant to conclude that the appearance of fatty acid synthetases as multi-enzyme complexes, highly organised multi-enzyme complexes, has evolutionary significance or implications. Among the properties of the mycobacterial fatty acid synthetase the following are unusual and worthy of comment. The next slide please. The majority of the fatty acid synthetases which have been studied have what one might call physiological Km values for substrate concentration, that is for a concentration which one might expect to find in the cell. For acetyl-CoA this is in the range of 2 to 20 micromolar. By contrast, the system for Mycobacterium phlei has an abnormally high Km value for acetyl-CoA, about 800. And it is in fact impossible to saturate the system with this essential substrate, as we were able to demonstrate. There is also a fairly high Km value for malonyl-CoA in the system, but this is less striking. A second abnormality of the M. phlei system was the abnormally high Km value for the reductant TPNH, triphosphopyridine nucleotide. Again this is quite out of line with the TPNH Km values which one finds in other fatty acid synthetase systems. This particular property we have been able to explain by the fact that the 2 reductive steps in fatty acid syntheses in Mycobacterium phlei are supported by 2 pyridine nucleotides, namely TPNH and DPNH respectively, whereas in most other systems study TPNH can serve as a single electron donor for either of the 2 reductive steps. The next slide please. One operational problem in the purification of the fatty acid synthetase for Mycobacterial phlei was its sensitivity to varying ionic strengths. Perhaps for good reasons, Lynen has been so highly successful with the yeast fatty acids synthetase because it is an exceedingly stable molecule, which can be subjected to ionic strength varying from 0 to 1 molar, for example without change in activity or change in physical properties, as indicated here. By contrast, the enzyme system from rat liver when exposed to low ionic strength decays with a half time of about 2 hours. And the system for Mycobacterium phlei decays in low ionic strength to the half time of 4 to 5 minutes. And this has greatly limited the procedures which one can use for purification of the enzyme system. The next slide please. Now this slide illustrates again a point of comparative biochemistry, and perhaps the differences in the cellular environments in different forms of life. Here again we demonstrate the sensitivity of various fatty acid synthetases from various sources as a function of ionic strength. The yeast enzyme is not at all affected in an over 50-fold range of phosphate buffer concentration. The second enzyme from corynebacterium diphtheria: there is no activity whatsoever in 100 molar phosphate and it needs .5 molar phosphate for optimal activity. Similarly, the enzyme from Mycobacterium phlei: there is no activity in low ionic strength. Then it rises rather sharply over a 10-fold range of concentration and slightly drops off. Finally, a fatty acid synthetase from Euglena gracilis shows the opposite behaviour: it has optimal activity in very low ionic strength and is totally inhibited at .5 molar phosphate. To us this simply means that the environment in which these various enzyme systems operate in various cells are totally different. And since these processes are membrane associated it is clear that a membrane environment and membrane structure must vary greatly from one organism to the other. The next slide please. I already indicated the bimodal chain length pattern, which is produced by the mycobacterial fatty acid synthetase, giving 2 peaks, 1 at 18 carbon atoms and the other one at 24 carbon atoms, whether one initiates a chain with acetyl-CoA or with a longer fatty acid, longer chain fatty acid. Now this bimodality is very difficult to explain in terms of a single set of enzymes. We therefore have made an attempt to see whether we were dealing with more than one complex, but perhaps 2 tightly interacting complexes of independent systems. But so far no such evidence has been obtained. May I have the next slide please? Early in the purification of the fatty acid synthetase from M. phlei we found that at assay conditions which are normal for all known - or were normal at the time - for all known fatty acid synthetases, for example in 20-micromolar acetyl-CoA enzyme activity was barely detectable. It could be increased, however, by raising the acetyl-CoA concentration very substantially, as I already indicated further, or one could alternately activate the system by fortifying with a crude boiled extract of Mycobacterium phlei – the same source from which the fatty acid synthetase was isolated. And a combination of the 2 gave optimum results. This simply shows a response of a crude boiled extract of fatty acid synthetase activity from this organism in response to a crude extract measured either in terms of its sugar or protein content. At the early stages we were not sure with what type of a molecule we were dealing. Other logical heat-stable factors which were tested, such as acyl carrier protein or perhaps BSA, bovine serum albumen, had no effect; they are not able to activate the system. You see then that you do get activity, very substantial stimulation of this system, by this heat-stable extract. The next slide please. On purification of this heat-stable material it turned out that it contained 2 active factors, which stimulated synthetase activity in this organism. One was simply flavin nucleotide, and the other one was a complex family of carbohydrates, unexpectedly, which could be further separated into 2 classes of medium molecular weight polysaccharides, the compositions of which are shown in the next slide. The next slide please. Before I show you the chemical composition of these polysaccharides I want to indicate here how one can activate this M. phlei system: Either by increasing the substrate concentration of acetyl-CoA without adding any of the factors. Then, when FMN is added, one obtains a significant but not very striking increase in activity. And then, by adding FMN plus what we call stimulating factor, we got then activity, maximal activity, at very low or physiological substrate concentrations. The next slide please. These polysaccharides, which were separated by various procedures of column chromatography, belong to 2 principle classes: One in which the main sugar is a tri-O-methylmannose component and which was independently isolated by Ballou at the University of California. And the second class of polysaccharides - and their molecular weights range from 2 to 4,000 – consists of roughly equal amounts of glucose and 6-O-methylglucose. And in addition, as Ballou has shown, this type of polysaccharide which he refers to as lipopolysaccharide contains acyl chains esterified to some of the free hydroxyl groups. The next slide please. These are due to Ballou’s publication showing a general structure for one of the polysaccharides, which he referred to as MGLP because of its content of methyl glucose, and which contains a certain proportion of methyl groups or hydrophobic groups, and this may be significant, at the 6th position of the sugar; and, as indicated here, contains varying amounts of short chain fatty acids esterified to hydroxyl groups. Next slide shows the second mannose-based structure, containing primarily 3-O-methylmannose residues. And here again there are structural proposals by Ballou which are based on the fact that this type of molecule does not seem to contain a reducing end. And the circular structures are interesting, because in line of some of the interactions which I will describe shortly. Of course, we were mainly interested in finding out what is the role of this unexpected activity of these polysaccharides in stimulating fatty acid synthetase. Very grossly speaking - the next slide please - the effect of these polysaccharides is to lower the Michaelis constant for acetyl-CoA for one of the substrates. And from this data here, which shows the usual line with a work plot, one can calculate that the Km under certain conditions for acetyl-CoA is lowered approximately 50-fold in the presence of these polysaccharides to allow the system to operate under physiological conditions. Yet this is simply another description of a phenomenon rather than a molecular explanation. And we therefore attempted to identify and localise the specific enzyme component in which these polysaccharides may play their role. However, in testing every one of the component enzymes, or partial activities, we were unable to demonstrate effect on an isolated single enzymatic reaction by the polysaccharides. At this point we turned our attention again to the curious and previously mentioned bimodal chain-length pattern, one of the unique features of the M. phlei system, which does not fit into the general patterns of enzyme specificities. On examining whether the fatty acid spectrum was in any way altered by the stimulatory polysaccharides, we did find - the next slide please - we did find that the addition of either the methylmannose- or methylglucose-containing polysaccharides had a very marked effect on the chain-length distribution pattern. The addition of these materials roughly doubled the relative proportion of the shorter chain acid at the expense of the longer chain acid. The pattern was still bimodal but the relative proportion of these 2 families, if you wish, of fatty acids was changed by the addition of the polysaccharides. If we assume that termination of the synthetase process involves a transfer of the enzyme-bound fatty acyl chain, then a stimulation of this enzyme by polysaccharide might account for the increased release of fatty acids in this molecular weight range or chain-length range on addition of polysaccharides. We have so far only preliminary indications that the polysaccharides may act at the level of the palmitoyl transacylase. But in the course of these studies we have observed independently some interesting phenomena which may be relevant to the function of the polysaccharides. The next slide please. which transfer acetyl and malonyl residues from its combinations to coenzyme A to the enzyme complex. And we found that these 2 initiating enzymes are exceedingly sensitive to one of the end products of fatty acid synthetase, namely palmitoyl-CoA. You see here the effects of increasing concentrations of palmitoyl-CoA on the activity of acetyl and malonyl transacylase - the malonyl transacylase being the more sensitive of the 2. At roughly 5 micromolar palmitoyl-CoA, one obtains complete inhibition of this enzyme by one of the end products of the synthetase reaction. Well if one now assays these 2 transacylases in the presence of one of the 2 types of polysaccharides, which I have mentioned, you find that these polysaccharides restore activity to normal at least up to a certain palmitoyl-CoA concentration; that is they counteract the inhibitory effects of palmitoyl-CoA, whether palmitoyl-CoA acts as a feedback inhibitor or not. So a specific and possibly physiologically significant effect of these polysaccharides then is to allow the systems to operate in the presence of a cumulating end product. The same is true - the next slide please - for the overall process of fatty acid synthetase. The normal or controlled system of fatty acid synthesis is over 90% inhibited in the presence of palmitoyl-CoA. Yet on addition of the polysaccharides activity and very small amounts of polysaccharides, activity is restored to normal. Whereas one of the widely used agents to neutralise the inhibitory effects of palmitoyl-CoA, namely bovine serum albumen, has only a very marginal effect, even at very high concentrations. And the same phenomenon, that is inhibition by palmitoyl-CoA and relief of the inhibition by polysaccharide, is true for all fatty acid synthetases which we have tested. And of course 2 questions are raised by these experiments: first, by what mechanism do the polysaccharides protect; and secondly are these effects trivial or do they have regulatory significance? The next slide fairly convincingly answers the first of these 2 issues. When one chromatographs one of these polysaccharides on a bio-gel column, one finds a very distinctive allusion pattern. Whereas similar chromatography of palmitoyl-CoA shows a rather broad allusion pattern, smeared out as it were, and not being alluded in a single sharp peak. If one chromatographs the polysaccharide, or one of the polysaccharides in the presence of palmitoyl-CoA, the 2 emerge from the column in a single sharp peak, suggesting a very strong interaction. The same can be demonstrated if one adds to a column from which palmitoyl-CoA is gradually emerging the polysaccharide then all of a sudden the rest of the palmitoyl-CoA will be discharged from the column, suggesting that these 2 types of molecules are capable of interacting and forming some kind of a complex or sequestered form. Undoubtedly it is the hydrophobic character of the methoxy groups on some of these polysaccharides which may play a role in these interactions. And we have evidence that by removal of these methoxy groups one can negate the binding ability of polysaccharide for palmitoyl-CoA. All workers in the general lipid field had observed that whenever an enzyme is inhibited by palmitoyl-CoA, bovine serum albumen provides some protection or relieves inhibition; simply because of its binding capacity for fatty acids, which is well known and which may be one of the functions of serum albumen in the transport of lipids. However, in the M. phlei system the action of the polysaccharide seems to be more specific. The polysaccharides completely overcome palmitoyl-CoA inhibition under conditions where serum albumen is only marginally effective. Secondly, some the polysaccharide effects cannot at all be duplicated by serum albumen, for example the stimulation of the palmitoyl-CoA transacylase. If we rule out a trivial non-specific effect, what is then the mode of action of these polysaccharides in enhancing fatty acid synthesis in M. phlei? As I mentioned before, these materials markedly enhance the overall activity of the synthetase system in the absence of any added palmitoyl-CoA, and they have similar though much smaller effects on the fatty acid synthetases from other bacterial sources and from yeast. The capacity of the polysaccharides to bind and to interact with palmitoyl-CoA, which is shown in this slide, then raises the possibility that this interaction occurs not only with externally added palmitoyl-CoA, but also with palmitoyl-CoA end product, enzymatically generated by the system itself. If some of the early steps - the next slide please - in the elongation process, namely the initial transacylation reaction which we have seen to be very sensitive to palmitoyl-CoA, unusually sensitive to this end product and subject to feedback inhibition, this system would very soon come to a halt, unless the end product is somehow sequestered or removed in some non-inhibitory form. Our experiment can certainly be interpreted in such a way that the system which generates palmitoyl-CoA and therefore generates its own inhibitor in a typical negative feedback loop, can be operated, can be under a positive control loop by removal of the feedback inhibitor by converting it into an innocuous complexed form. So we may then have both a positive and negative control mechanism for fatty acid synthetase, at least in this special instance. I might add here that the mode of control of fatty acid synthetase in multi-enzyme complex is not at all settled and it may differ from one organism to another. For animal tissue there is strong evidence that the control occurs at a step which precedes the elongation process, namely at the level of the acetyl-CoA-carboxylase which generates malonyl-CoA from acetyl-CoA. That is a reaction which is not associated with a multi-enzyme complex. But there is no evidence for this type of control so far in any other system, including yeast or microbes. Finally I wish to comment on another aspect of the complex control devices that operate in the M. phlei fatty acid synthetase system. As we have seen the chain length pattern of the synthetase produced does not show a single peak, but 2 peaks. And this, of course, has aroused our interest, and we have tried to obtain some insight into the mechanisms which are responsible for this bimodal pattern. I pointed out already that the M. phlei synthetase can be initiated not only with acetyl-CoA, but one can feed also palmitoyl-CoA into the system. However - the next slide please - if one initiates a system with a normal substrate acetyl-CoA – we have seen that this system must be stimulated or supported by factors which we identified as polysaccharides. And these polysaccharides, obtained from crude extracts, are fully capable of replacing the crude boiled factor. Now if one tries to initiate the fatty acid synthetase with palmitoyl-CoA to build it up to 24 carbon atoms, one finds no activity in the absence of any additions. The crude boiled extracts stimulates approximately 100-fold, but in this instance, in contrast to the acetyl-CoA initiation, the polysaccharides will not replace, will not stimulate or allow the system to operate. So clearly it appeared that these crude extracts contained other factors, in addition to the polysaccharides, which were needed for the second phase, if you wish, of this elongation process. The next slide simply tells you that we have been able to separate from these polysaccharides a material which turned out to be a protein, which was essential for the elongation process. And this protein, which we call protein B or elongating factor, has not yet been obtained in pure form; it turns out to be very difficult to purify, although it is heat-stable. But all we know it is a low molecular weight protein with a molecular weight of less than 10,000, and is not identical for example with acyl carrier protein or any other known protein entities. And again we are faced with the problem of finding out, what is the function of this protein – beyond the statement that it is needed in order to allow the elongation process to continue. The next slide shows that this protein, which incidentally is needed in microgram quantities, is effective only with the longer-chain acyl-CoA derivatives; that is it is an elongation factor rather than a factor which is needed for the total fatty acid synthesise starting from acetyl-CoA. The effect becomes significant with 10 carbon atoms and then shows roughly similar activities for medium- and longer-chain fatty acids. The next slide please. In trying to localise the effect of this protein on the elongation pattern, we have had some partial success in showing that the target for this protein appears to be the condensing enzyme that is the enzyme which catalyses the elongation of the carbon chain by 2 carbon atoms. And if you study this condensation process by reversing it and measuring CO2 fixation, you find that this protein has no effect on condensing enzyme and the acyl component is short of a short chain. But if you go up now to C10, C14 and C16, you see very substantial stimulation of the chain lengthening process, as measured by the condensing enzyme by the protein elongation factor. Since we are dealing with a multi-enzyme complex - and we cannot isolate the condensing enzyme from the multi enzyme complex we do not know how many individual reactions are involved in this overall transformation. And therefore - next slide please - we formulate the function of this protein at some stage beyond palmitoyl enzyme. Once the C16 stage has been reached, a new protein enters the picture, which allows the system to carry out the elongation process further and therefore ultimately gives rise to a bimodal chain-length distribution pattern. This appears to be a non-catalytic protein. It may be a regulatory or specifier protein, which may either activate an existing enzyme or change the specificity of a condensing enzyme proper - this remains for further study. I would like to conclude my remarks by posing the question, whether the exceedingly complex mechanism, the mechanism I have described, has a bearing on fatty acid biosynthesis in general; or whether it is confined to mycobacteria with their notoriously complex carbohydrate and lipid chemistry and metabolism. It seems highly probable that the Mycobacterium phlei synthetase serves multiple purposes, providing fatty acids not only for the membrane lipids but also for the lipid components of the mycobacterial cell wall. The next slide please. The phospholipids, the membrane phospholipids in mycobacteria as another bacteria contain fatty acids with 16 or 18 carbons in normal chain length. However, the cell wall of mycobacteria contains very complex lipid structures known as mycolic acids or cord factors, among which C24 acids are major constituents. Therefore, if the bacterial cell operates with a single fatty acid synthetase, it must have some regulatory device which allows it to direct the flow of fatty acids of various chain length, either into the synthetase of phospholipids in the membrane or into the complex lipids and glycolipids of the mycobacteria cell wall. One would therefore expect some very special devices for the control of fatty acid synthetase in this organism. Thank you. Applause.

Professor Weißschädel, sehr geehrte Damen und Herren, die vorherigen Redner haben ein breites Themenspektrum aus den Bereichen Gesellschaft, Physiologie und Medizin angesprochen – in einer für Sie alle deutlichen und verständlichen Sprache. Ich werde von diesem Muster abweichen und zu einem ziemlich fachspezifischen Thema reden. Deshalb muss ich in der Sprache der Chemie und Biochemie reden. Ich erwarte in diesem Zusammenhang einige Kommunikationsprobleme. Leider kann dieses spezielle Sprachproblem bisher nicht in Form einer Simultanübersetzung gelöst werden. Als ich hier vor 3 Jahren einen Vortrag hielt, kommentierte und bedauerte ich die Tatsache, dass Lipide eine relativ geringfügige Rolle in den Konzepten und Dogmen der modernen Biologie und insbesondere der Molekularbiologie spielen. Zum damaligen Zeitpunkt und auch heute noch stehen die Nukleinsäuren und Proteine im Mittelpunkt – und das verdientermaßen, weil diese Makromoleküle uns so viel über die Vererbung und die Prozesse der Informationsübertragung gelehrt haben. Allerdings hat in den letzten Jahren ein ziemlich bedeutsamer Wandel stattgefunden, der größtenteils mit der Erkenntnis zusammenhängt, dass wir zelluläre Aktivitäten ohne tiefgehende Kenntnisse von Struktur und Funktion der Membranzellhüllen, die den Zellinhalt umgeben, weder verstehen noch beschreiben können. Da Lipide neben Protein essentielle Membranbestandteile sind, haben die Struktur und die Biosynthese von Lipiden sowie die Rolle der Lipide in der Modulierung von Membraneigenschaften inzwischen große Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Es wurde bereits – möglicherweise mit übertriebenem Enthusiasmus – behauptet, Membranen seien für die 1970-er und 1980-er Jahre das, was Nukleinsäuren für die 1950-er und 1960-er Jahre waren. Das mag so sein. Das Forschungsfeld gestaltet sich ungewöhnlich aktiv und ist von dem Gefühl durchdrungen, dass wir an der Schwelle bahnbrechender Erfolge stehen, die es uns möglicherweise nicht nur erlauben zu verstehen, wie Membranen funktionieren, sondern auch, wie Membranen synthetisiert werden. Und wenn man Funktionsmembranen synthetisieren kann, sind wir möglicherweise auf gutem Wege zur Synthetisierung von Zellen. Nach dieser ziemlich optimistischen Einführung wende ich mich etwas nüchterner einer Aussage über das Lipidproblem zu, das mit der Membranfunktion zusammenhängt. Nach einem derzeit sehr beliebten Membranmodell – könnte ich bitte das erste Dia haben –, das Singer in Modifikation zum älteren Membranmodell von Danielli vorgeschlagen hat, eine Lipiddoppelschichtstruktur, in die Proteine entweder teilweise oder vollständig eindringen, gibt es eine Anordnung von polaren Teilen des Lipidmoleküls, die sich auf die externe Zellflüssigkeit erstrecken, und eine Anordnung von zwei Schichten dieser Phospholipidstrukturen, in denen die Kohlenwasserstoffketten, die Fettsäureketten, sowohl lateral als auch vertikal miteinander interagieren. Ich möchte auf einen bestimmten Aspekt aufmerksam machen, nämlich dass diese Kohlenwasserstoff- oder hydrophoben Ketten nicht geradlinig angeordnet sind, dass sie in ihrer Struktur unterschiedliche Längen aufweisen und dass die Anordnung dieser Ketten entweder nähere oder entferntere Beziehungen aufweist. Das ist kein Zufall, sondern wurde von den Autoren des Modells absichtlich so gewählt. Und diese spezielle Anordnung der Fettsäurekette ist Teil meiner These. Nach diesem Modell bietet die Lipiddoppelschicht eine flüssige, mobile Matrix, in die andere Moleküle, insbesondere die Proteine, einströmen und in der sie sich bewegen können. Die Betonung liegt hier auf den Membraneigenschaften in der fluiden oder festen Phase, die offensichtlich nur die Lipide liefern können. Wir müssen deshalb untersuchen, warum Lipide speziell geeignet sind, das richtige fluide oder feste Medium bereitzustellen. Das nächste Dia bitte. Die Phospholipide, und dies sind die ubiquitären und universellen Membranlipide, verfügen über die charakteristischen Strukturmerkmale, die ich bereits früher erwähnt habe: eine sogenannte polare Kopfgruppe, die Glycerolphosphat und eine stickstoffhaltige Basis enthält, und damit verbunden die langen Kohlenwasserstoffketten. Dieser polare, nichtpolare oder antipathische Charakter scheint das Geheimnis des Phospholipidmoleküls zu sein. Die polaren Kopfgruppen sind der wässrigen Phase außerhalb der Membran ausgesetzt, während die apolaren Kohlenwasserstoffketten sowohl innerhalb des Moleküls als auch zwischen benachbarten Molekülen durch zusätzliche Van-der-Waals-Interaktionen Kontakt zueinander aufnehmen Die Stärke dieser Interaktionen entscheidet über die Interaktion zwischen diesen Kohlenwasserstoffketten und somit über die Fluidität oder die fehlende Fluidität einer bestimmten Membran. Umgekehrt ist klar, dass die Stärke dieser Interaktionen eine Funktion der Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Kette und der Art und Weise ist, in der diese Kohlenwasserstoffe ausgerichtet sind, was sich wiederum aus dem Van-der-Waals-Radius zwischen benachbarten Ketten ergibt. In einer dicht gedrängten Anordnung, wie hier zu sehen, in einem Phospholipid mit 2 gesättigten Fettsäuren führen die Interaktionen zu physikalischen Eigenschaften, die für Membranen offensichtlich ungeeignet sind. Und tatsächlich findet man in der Natur keine Phospholipidmoleküle, die 2 gesättigte Fettsäureketten enthalten. Im Gegensatz dazu – das nächste Dia bitte – besteht das dominierende Muster in den meisten Phospholipiden aus einer gesättigten Kohlenwasserstoffkette und einer weiteren, in der das Molekül abgewinkelt ist, was die hydrophoben oder apolaren Interaktionen verringert und schwächt. Es stellt sich die Frage: Wie wird diese spezielle Struktur mit Regionen, in denen enge Kontakte bestehen, und Regionen, in denen weniger Kontakte bestehen, erreicht? In der Bakterienmembran, die wir wesentlich genauer kennen als die eukaryotische Membran, findet man am häufigsten Phospholipide, die Paare von gesättigten und ungesättigten olefinischen Säuren enthalten, jeweils 16 Kohlenstoffatome lang. Und charakteristischerweise liegt die cis-olefinische Verbindung irgendwo in der Mitte des Moleküls, an Position 9, 10 oder 11. Und wie ich gesagt habe, sorgt die Doppelbindung dann für einen Knick in der Kohlenwasserstoffkette, was die apolare Interaktion schwächt. Und es ist klar, dass die spezielle Stelle dieser sozusagen störenden Eigenschaft entlang der Kohlenwasserstoffkette eine wichtige Rolle für die Feststellung spielt, ob die Interaktionen stark oder schwach sein werden. Und das kann der Grund dafür sein, dass wir in der Natur, im natürlichen Phospholipid überwiegend, aber nicht ausschließlich olefinische Doppelbindungen an einer speziellen Stelle entlang der Kohlenwasserstoffkette finden. Es deutet nicht viel darauf hin, dass die Natur dieses Strukturmerkmal, eine zentral lokalisierte cis-olefinische Bindung als grundsätzliche Einrichtung gewählt hat, um die geeignete Membranfluidität zu erreichen. Worauf es jedoch offensichtlich ankommt, ist nicht die Chemie der olefinischen Bindung – das nächste Dia bitte –, sondern einfach eine massige oder störende Gruppe an derselben Stelle entlang der Kohlenwasserstoffkette. Hier haben wir das Cis-Olefin, das im vorherigen Modell gezeigt wurde. Es kann beispielsweise durch eine Cyclopropangruppe in bestimmten Bakteriensystemen ersetzt werden, oder man kann dieselbe Störung in der Ausrichtung der Kohlenwasserstoffketten durch Einbringung eines Bromatoms an Position 9, 10 oder durch Einführung einer acetylierten Hydroxyl-Funktion erreichen. In einigen Fällen, bei einigen Bazillen, wird die gleiche Lösung des Membranphospholipids durch Verzweigung der Kohlenwasserstoffkette am Ende oder an vorletzter Stelle erreicht. Es ist also nicht die cis-olefinische Bindung an sich, sondern ein störender Einfluss, eine massige Gruppe, die unter bestimmten Umständen die natürlich vorkommende Cis-Olefin-Struktur ersetzen kann. Eine der derzeit sehr interessanten Fragen lautet: Wie erreicht eine Zelle in einem Phospholipidmolekül die richtige Mischung aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren und dadurch die geeigneten physikalischen Eigenschaften für die Membran? Eine Bedingung, die zumindest eine Variation der Phospholipidzusammensetzung von Membranen in Mikroorganismen zulässt, ist die Temperatur, die Umgebungstemperatur. Seit langem weiß man, dass der Ungesättigkeitsgrad der Fettsäuren infolge veränderter Umgebungstemperaturen starken Veränderungen unterliegt. Und diese Reaktion ist eindeutig eine Anpassung der Zelle zur Erhaltung der Membranfluidität unter nachteiligen oder abnormalen Bedingungen. Und man kann sich die Frage stellen, durch welche regulierenden Mechanismen diese Anpassung erreicht wird. Das nächste Dia bitte. Es gibt mehrere a priori mögliche Mechanismen für das Erreichen der richtigen Flüssigkeit, der richtigen Materialität der Membranen: Einer besteht in der Regulierung der relativen Raten der gesättigten und ungesättigten Säuren. Der andere wären die relativen Aktivierungsraten dieser gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, also die Umwandlung in das aktivierte Derivat, die zur Einbringung des Moleküls in die Phospholipidstruktur erforderlich sind. Oder Verbreitungsgeschwindigkeiten könnten eine Rolle spielen. Und letztendlich könnte der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Auswahl gesättigter oder ungesättigter Fettsäuren zur Einbringung in das Phospholipidmolekül bestehen. Dr. Sinensky hat sich in meinem Labor mit diesem Problem beschäftigt und die Regulierung der Phospholipidsynthese in Escherichia coli untersucht und ist zu der ziemlich unmissverständlichen Antwort gelangt, dass der Mechanismus für die relativen Raten der Esterifizierung über die Zusammensetzung der Membranlipide in diesem Mikroorganismus entscheidet. Sinensky nutzte die Tatsache, dass E. coli-Zellen sowohl gesättigte als auch ungesättigte Fettsäuren aus dem externen Medium aufnehmen oder integrieren, wenn diese bereitgestellt werden. Und unter geeigneten Bedingungen ist das externe Medium in der Tat die grundlegende Fettsäurequelle für die Membranphospholipide. Durch Versorgung der Bakterienzelle mit Tritium-markiertem Oleat und C14-Palmitat während des Wachstums und Messung des Verhältnisses der beiden Isotope in den Membramphospholipiden wies er nach, dass einer der Schritte in der Verwertung der Fettsäuren der Phospholipidsynthese tatsächlich die Temperaturregelung ist. Nächstes Dia bitte. Dieses Feld hier links zeigt die Reaktion als das Verhältnis – können Sie das bitte etwas nach rechts schieben – das Verhältnis von Palmitat zu Oleat, integriert in zelluläre Phospholipide, als Funktion der Temperatur. Zu sehen ist ein sehr markanter Anstieg, um das 4- bis 5-fache zwischen 20 und 30 Grad. Danach gibt es einen Knick in dieser Kurve, der erklärbar ist, aber aus Zeitgründen kann ich hier nicht näher darauf eingehen. Das wichtigere Ergebnis ist, dass das gleiche Phänomen, die Veränderung im relativen Anteil dieser beiden Arten von Fettsäuren in vitro mit isolierten Membranpartikeln reproduziert werden kann, indem sie erneut mit markiertem Palmitat und Oleat versorgt werden. Wieder erreicht man eine temperaturabhängige Veränderung der relativen Mengen von Palmitat und Oleat, die in die zellulären Phospholipide integriert sind. Unabhängige Experimente zeigen, dass die Inkubationstemperatur während des Assays und nicht während des Wachstums über das relative Verhältnis dieser beiden Membranbestandteile entscheidet. Der Effekt der Temperatur wirkt also auf die Enzymaktivität und nicht auf die Enzymsynthese. Eine Induktion oder eine Derepression sind nicht beteiligt. Die Veresterungsenzyme – das nächste Dia bitte – mit denen wir hier zu tun haben, führen Fettsäurereste in Position 1 und 2 des Phospholipidvorgängers ein. Das kann auf verschiedene Weise geschehen: Entweder können Sie diese Reste in Position 1 oder in Position 2 einbringen. Sie können einen nachfolgenden Schritt, eine zusätzliche gesättigte oder eine zusätzlich ungesättigte Fettsäure einführen, was zu 4 verschiedenen Phospholipidarten führt. Das Verhältnis dieser Phospholipidarten entscheidet über die gesamte Phospholipidzusammensetzung und die Eignung der Membramlipide bei einer speziellen Umgebungstemperatur. Wenn die Umgebungstemperatur für das Wachstum des Mikroorganismus normal ist, findet man überwiegend diese Art mit einem gesättigten und einem ungesättigten Molekül vor. Ist die Wachstumstemperatur reduziert, nimmt diese stärker ungesättigte Art zu. Und umgekehrt sehen wir bei einer höheren Temperatur eine relative Zunahme des Verhältnises des 2-fach ungesättigten Phospholipids. Ein letzter erwähnenswerter Aspekt zu diesem Thema ist, dass diese Variationen bei den Lipidzusammensetzungen in E. coli kontinuierlich zur Wachstumstemperatur und nicht in Stufenform verlaufen. Deshalb überrascht es nicht, dass der Temperatureffekt auf enzymatischer statt auf genetischer Ebene vermittelt wird. Der zweite bestimmende Faktor der Phospholipidstruktur und damit der Membranfluidität, wie ich bereits sagte, ist die Länge der Kohlenwasserstoffkette. Und dies führt mich zu dem Thema, auf das ich näher eingehen möchte. Der Aufbau der Kohlenwasserstoffkette bei der Fettsäuresynthese weist einige sehr interessante Merkmale auf, die mit nur wenigen anderen biosynthetischen Prozessen vergleichbar sind. Die Polyisoprenoid-Biosynthese ist möglicherweise der einzige andere vergleichbare Fall. Das nächste Dia bitte. Der Prozess umfasst die sequentielle Aktion einer Reihe von 7 Enzymen, die die Vorgänger aktivieren und kondensieren. Nach Abschluss jeder Sequenz oder jedes Reaktionszyklus wird der Prozess 7- oder 8-mal wiederholt, bis eine Kette von 16 oder 18 Kohlenstoffatomen erreicht ist. Jedes der Enzyme verfügt über eine bemerkenswert breite Spezifität und kann Zwischenprodukte variierender Länge von 4 bis 16 Kohlenstoffatomen bewältigen. Überraschenderweise kommt der Kettenverlängerungsprozess bei 16- oder 18-Carbonsäure zu einem abrupten oder ziemlich abrupten Ende, wie einige typische Fettsäuremuster zeigen. Das nächste Dia bitte. Zum Beispiel Fettsäuresynthetasen von einem Bakterium, beispielsweise vom Corynebacterium oder einer Pflanzenquelle, die wir untersucht haben, weisen dieses Muster auf, bei dem eine spezielle Fettsäure vorherrscht und geringe Mengen Fettsäure mit längeren oder kürzeren Ketten zu finden sind. Dies war absolut zu erwarten. Die einzige Ausnahme von diesem monomodalen Verteilungsmuster haben wir in der Fettsäuresynthese vom Mycobacterium phlei gefunden, das völlig unerwarteterweise ein bimodales Fettverteilungsmuster zeigt. Und ich möchte näher auf diesen Aspekt eingehen. Um die normale oder üblichere Situation der Kettenlängenspezifität im Aufbau der Kohlenwasserstoffkette und ihre Unterbrechung, sagen wir bei 16 Kohlenstoffatomen, zu erklären, haben Lynen und seine Mitarbeiter einen eleganten Mechanismus weiterentwickelt, um den Kettenabbruch zu rationalisieren, und zwar durch die Änderung der relativen Geschwindigkeiten der beiden Komponentenenzyme, nämlich des Kondensationsschritts, durch den die Carbonkette verlängert wird, und des Abbruchprozesses, mit dem das Endprodukt vom Enzym abgesetzt wird. Wenn die Kohlenwasserstoffkette wächst und mit ihr der hydrophobe Charakter des Moleküls zunimmt, begünstigen die Interaktionen zwischen Substrat oder Zwischenprodukt und Enzymprotein den Beendigungsprozess auf Kosten der Kondensierung. Ein solcher Mechanismus würde nicht die absolute Genauigkeit voraussagen, also den Abbruch der Fettsäure in einer einzigen Länge, sondern stattdessen in einem Bereich mit 1 oder 2 dominierenden Kettenlängen. Wie ich bereits sagte, haben wir das vorgefunden – bisher mit 1 Ausnahme. Bevor ich die Eigenschaften dieser ziemlich ungewöhnlichen Fettsäuresynthetase vom Mycobacterium phlei beschreibe, möchte ich zunächst kurz auf einige grundsätzliche Eigenschaften der Fettsäuresynthetase eingehen. Wie eben gesagt, bestehen diese biosynthetischen Übertragungswege aus Enzymsystemen, die durch die sequentielle Aktion von mindestens 7 Enzymen langkettige Fettsäuren aus Acetyl-CoA und Malonyl-CoA bilden. Übereinstimmend mit dem Grundsatz der uns vertrauten biochemischen Einheitlichkeit scheinen die chemischen Mechanismen der einzelnen Schritte für alle Lebensformen identisch abzulaufen: für Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen. Andererseits zeigen Fettsäuresynthetaseenzyme unterschiedlicher Quellen auffallend unterschiedliche molekulare Eigenschaften und Organisationsmuster. Das nächste Dia bitte. Ein klassisches Beispiel für ein Fettsäuresynthetasesystem ist der Multienzymkomplex von Hefe, der erstmalig von Lynen beschrieben wurde, sowie die vergleichbaren Fettsäuresynthetasen von Tiergewebe, die Wakil und Porter beschrieben haben. Und es gibt eine zweite Kategorie von Fettsäuresynthetasen, die die gleiche Art von Reaktionen katalysiert, aber völlig andere Organisationsmuster ausbildet, nämlich solche, die in Bakterien und bestimmten Pflanzensystemen zu finden sind. Das nächste Dia bitte. Was wir gerne als Fettsäuresynthetasen des Typs I bezeichnen, wie durch die Hefefettsäuresynthetase von Lynen verdeutlicht, sind hochorganisierte Multienzymkomplexe, deren Molekulargewicht, abhängig von der Quelle, zwischen einer halben Million und über 2 Millionen schwankt. Alle Tiergewebe enthalten Fettsäuresynthetasen mit grob dem gleichen Molekulargewicht, nämlich eine halbe Million. Und ihre spezifischen Aktivitäten sind ebenfalls grob vergleichbar. Ich habe hier die Tatsache aufgeführt, dass 2 bakterielle Quellen ebenfalls Multienzymkomplexe mit Molekulargewichten enthalten, die den in Hefe vorgefundenen Bereichen entsprechen. Und schließlich gibt es ein weiteres Beispiel für die Fettsäuresynthetase eines Pflanzensystems in der ethylierten Form der Alge Euglena gracilis. Worauf ich hinaus will, ist, dass es sich bei all diesen Enzymsystemen um hochorganisierte Strukturen handelt, deren einzelne Bestandteile Teil des sehr dichten Komplexes sind, dessen einzelne Enzyme man nicht untersuchen kann oder dessen einzelnen Enzyme man nicht vom Komplex trennen kann, da sie so interagieren, dass die Aktivität jedes einzelnen Bestandteils von der Gegenwart anderer Bestandteile abhängig ist. Man findet ein bemerkenswertes Spektrum von Molekulargewichten sowie spezifischen Aktivitäten vor, jedoch mit einer möglichen Ausnahme: Die Untereinheitsstruktur dieses Multienzymkomplexes scheint sehr ähnlich zu sein. Bis auf einen Fall konnte man bisher diese Multienzymkomplexe in Untereinheiten trennen, die ein Molekulargewicht von ungefähr 200.000 aufweisen und funktionell völlig inaktiv sind – entweder hinsichtlich der gesamten Fettsäuresynthese oder der Katalyse einiger Teilreaktionen. Im Gegensatz dazu zeigt das nächste Dia Fettsäuresynthetasen von Bakterien- und Pflanzensystemen, bei denen die einzelnen Komponenten, die 7 Enzyme, als separate Einheiten isoliert und bis zu einem hohen Maß gereinigt werden können und des Weiteren durch den Bedarf eines Moleküls charakterisiert sind, das als ACP oder Acyl-Carrier-Protein bekannt ist und dem System für die Aktivität extern zugeführt werden muss. Demgegenüber stehen die organisierten Enzymsysteme, die ich kurz erwähnte, bei denen dieses ACP oder Acyl-Carrier-Proteinmolekül in diesen stabilen Multienzymkomplex integriert ist. Diese ziemlich auffällige und einmalige Dualität von Fettsäuresynthetaseeigenschaften, die hochorganisierten und die unorganisierten Systeme, interessierten uns grundsätzlich aus 2 Gründen. Erstens wollten wir wissen, ob das Auftreten von Enzymen des Typs I und des Typs II – Typ I sind die organisierten Systeme und Typ II die dissoziierten Systeme – von evolutionärer oder phylogenetischer Bedeutung ist. Zweitens hoffen wir, Beispiele von Fettsäuresynthetasen mit Eigenschaften zwischen Typ I und Typ II zu finden. Wenn solche Zwischen- oder Übergangsformen existieren, könnten sie manipuliert werden, um ihre Trennung und Neuverbindung zu veranlassen. Somit könnten sie als Modelle für die Untersuchung oder Reproduktion des Aufbaus einzelner Enzyme zu Multienzymkomplexen benutzt werden. Beides ist uns bisher nicht gelungen. Aber bei der Suche nach einer geeigneten Enzymquelle unter den komplexeren prokaryotischen Organismen haben wir im Mycobacterium phlei eine Fettsäuresynthetase mit Eigenschaften und Regulierungsmerkmalen gefunden, die uns bemerkenswert erscheinen. Wie ich bereits sagte, enthält das Mycobacterium phlei einen Multienzymkomplex. Das war das erste Beispiel für eine Typ-I-Fettsäuresynthetase in einer bakteriellen Quelle. Und damit wurde nachgewiesen, dass Multienzymkomplexe sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen vorkommen können. Wir haben seitdem Multienzymkomplexe ähnlicher Art auch in einer Corynebacterium-Art und in Streptomyces gefunden. Aber wegen fehlender systematischerer Untersuchungen und im Hinblick auf die unklaren phylogenetischen Beziehungen in Bakterien sind wir zurückhaltend mit der Schlussfolgerung, dass das Auftreten von Fettsäuresynthetasen als hochorganisierte Multienzymkomplexe eine evolutionäre Bedeutung hat. Unter den Eigenschaften der mykobakteriellen Fettsäuresynthetase sind die folgenden ungewöhnlich und bemerkenswert. Das nächste Dia bitte. Der Großteil der untersuchten Fettsäuresynthetasen hat, wie man es nennen könnte, physiologische Km-Werte für eine Substratkonzentration, also für eine Konzentration, die man in der Zelle erwarten kann. Bei Acytel-CoA liegt diese im Bereich von 2 bis 20 Mikromol. Im Gegensatz dazu weist das System des Mycobacterium phlei einen anormal hohen Km-Wert für Acetyl-CoA auf, nämlich rund 800. Wie wir nachweisen konnten, ist es tatsächlich unmöglich, das System mit diesem essentiellen Substrat zu sättigen. Der Km-Wert für Malonyl-CoA im System ist ebenfalls ziemlich hoch, aber weniger auffällig. Eine 2. Anomalität des M. phlei-Systems war der ungewöhnlich hohe Km-Wert für das Reduktionsmittel TPNH, Triphosphopyridin-Nukleotid. Auch das weicht ziemlich von den TPNH-Km-Werten ab, die man in anderen Fettsäuresynthetasesystemen findet. Diese spezielle Eigenschaft konnten wir mit der Tatsache erklären, dass die beiden reduktiven Schritte in Fettsäuresynthesen in Mycobacterium phlei durch zwei Pyridin-Nukleotide unterstützt werden, nämlich TPNH bzw. DPNH, während in vielen anderen untersuchten Systemen TPNH als einzelner Elektronendonor für einen der beiden reduktiven Schritte dienen kann. Das nächste Dia bitte. Ein operatives Problem bei der Reinigung der Fettsäuresynthetase für Mycobacterium phlei war die Anfälligkeit gegenüber schwankenden Ionenstärken. Vielleicht war Lynen mit den Hefefettsäuresynthetasen aus gutem Grund so erfolgreich, weil es sich dabei um ein außerordentlich stabiles Molekül handelt, das Ionenstärken zwischen 0 und 1 Mol unterliegen kann, ohne etwa seine Aktivität oder seine physikalischen Eigenschaften zu ändern, wie hier zu sehen. Im Gegensatz dazu zerfällt das Enzymsystem einer Rattenleber, wenn es einer geringen Ionenstärke ausgesetzt ist, mit einer Halbwertzeit von rund 2 Stunden. Und das System von Mycobacterium phlei zerfällt bei geringer Ionenstärke mit einer Halbwertzeit von 4 bis 5 Minuten. Das hat die Verfahren, die man zur Reinigung des Enzymsystems verwenden kann, enorm eingeschränkt. Das nächste Dia bitte. Dieses Dia verdeutlicht wiederum einen Aspekt der vergleichenden Biochemie und möglicherweise die Unterschiede in den zellulären Umgebungen verschiedener Lebensformen. Hier sehen wir wieder die Empfindlichkeit verschiedener Fettsäuresynthetasen aus unterschiedlichen Quellen als Funktion der Ionenstärke. Das Hefeenzym ist in einem über 50-fachen Bereich der Phosphatpufferkonzentration überhaupt nicht betroffen. Das zweite Enzym von Corynebacterium diphtheria zeigt absolut keine Aktivität beim 100 Mol Phosphat und benötigt für eine optimale Aktivität 0,5 Mol Phosphat. Ähnlich zeigt das Enzym des Mycobacterium phlei keine Aktivität bei geringer Ionenstärke. Dann steigt sie bei über einem Zehnfachen der Konzentration steil an und fällt wieder leicht ab. Und schließlich zeigt die Fettsäuresynthetase von Euglena gracilis das gegenteilige Verhalten: Sie erreicht ihre optimale Aktivität bei sehr geringer Ionenstärke und ist bei 0,5 Mol Phosphat völlig blockiert. Für uns bedeutet das einfach, dass das Umfeld dieser verschiedenen Enzymsysteme in verschiedenen Zellen völlig unterschiedlich ist. Und weil es sich bei diesen Prozessen um membranassoziierte Prozesse handelt, ist klar, dass sich Membranumgebung und Membranstruktur verschiedener Organismen enorm voneinander unterscheiden müssen. Das nächste Dia bitte. Ich erwähnte bereits das bimodale Kettenlängenmuster, das von der mykobakteriellen Fettsäuresynthetase produziert wird, mit 2 Peaks, einem bei 18 Kohlenstoffatomen und dem anderen bei 24 Kohlenstoffatomen, abhängig davon, ob man eine Kette mit Acetyl-CoA oder mit einer längerkettigen Fettsäure initiiert. Diese Bimodalität lässt sich nur sehr schwer mit einer einzigen Enzymreihe erklären. Wir haben deshalb versucht festzustellen, ob wir es mit mehr als einem Komplex zu tun haben, vielleicht mit 2 eng interagierenden Komplexen unabhängiger Systeme. Aber bisher konnte das nicht nachgewiesen werden. Bitte das nächste Dia. Bei der Reinigung der Fettsäuresynthetase von M. phlei fanden wir bereits früh heraus, dass unter Assay-Bedingungen, die damals für alle bekannten Fettsäuresynthetasen normal waren, beispielsweise in 20 Mikromol Acetyl-CoA, die Enzymaktivität kaum feststellbar war. Wie bereits gesagt, konnte sie jedoch durch Erhöhung der Acetyl-CoA-Konzentration sehr stark gesteigert werden. Als Alternative konnte man das System durch Anreicherung mit einem rohen/gekochten Extrakt von Mycobacterium phlei aktivieren – derselben Quelle, aus der die Fettsäuresynthetase isoliert wurde. Eine Kombination aus beiden ergab optimale Ergebnisse. Hier sieht man einfach eine Reaktion eines rohen/gekochten Extraktes einer Fettsäuresynthetaseaktivität von diesem Organismus als Reaktion auf einen Rohextrakt, entweder anhand seines Zucker- oder seines Proteingehalts gemessen. In den Frühphasen waren wir nicht sicher, mit welchem Molekültyp wir es zu tun haben. Andere logische hitzebeständige Faktoren, die wir ausprobierten, etwa Acyl-Carrier-Protein oder BSA, Rinderserumalbumin, zeigten keine Wirkung. Sie konnten das System nicht aktivieren. Sie sehen, dass durch diesen hitzebeständigen Extrakt eine erhebliche Stimulierung und Aktivierung dieses Systems erfolgt. Das nächste Dia bitte. Bei der Reinigung dieses hitzebeständigen Materials stellte sich heraus, dass es 2 aktive Faktoren enthält, die die Synthetaseaktivität in diesem Organismus stimulieren. Einer war einfach Flavinnukleotid und der andere unerwarteterweise eine komplexe Familie von Kohlenwasserstoffen, die weiter in 2 Kategorien von Polysacchariden mit mittlerem Molekulargewicht unterteilt werden konnten. Deren Zusammensetzungen sind im nächsten Dia zu sehen. Das nächste Dia bitte. Bevor ich Ihnen die chemische Zusammensetzung dieser Polysaccharide präsentiere, möchte ich aufzeigen, wie man dieses M. phlei-System aktivieren kann: entweder durch Erhöhung der Substratkonzentration von Acytel-CoA ohne Zugabe von Faktoren. Dann erhält man nach Zugabe von FMN eine signifikante, wenn auch nicht sehr markante Aktivitätssteigerung. Und durch Zugabe von FMN plus dem, was wir als stimulierenden Faktor bezeichnen, erhielten wir eine maximale Aktivität bei sehr geringen oder physiologischen Substratkonzentrationen. Das nächste Dia bitte. Diese Polysaccharide, die über verschiedene Verfahren der Säulenchromatographie getrennt wurden, gehören zu 2 Grundklassen: Eine, in der der Hauptzucker eine Tri-O-Methylmannose-Komponente ist, die von Ballou an der University of California unabhängig isoliert wurde. Und die zweite Klasse von Polysacchariden – ihre Molekulargewichte reichen von 2 bis 4.000 – besteht aus ungefähr gleichen Mengen von Glucose und 6-O-Methylglucose. Und wie Ballou nachgewiesen hat, enthält diese Polysaccharid-Art, die er als Lipopolysaccharid bezeichnet, zusätzlich Acyl-Ketten, die mit einigen der freien Hydroxylgruppen verestert sind. Das nächste Dia bitte. Diese stammen aus Ballous Veröffentlichung und zeigen eine grundsätzliche Struktur für eines der Polysaccharide, das er aufgrund seines Gehalts an Methylglucose als MGLP bezeichnete und das einen bestimmten Anteil Methylgruppen oder hydrophobische Gruppen enthält, und an Position 6 des Zuckers – und das könnte bedeutsam sein und ist hier zu sehen – schwankende Mengen kurzkettiger Fettsäuren enthält, die mit Hydroxylgruppen verestert sind. Das nächste Dia zeigt die zweite mannose-basierte Struktur, die überwiegend 3-O-Methylmannose-Reste enthält. Und hier sind wieder Strukturmodelle von Ballou zu sehen, die auf der Tatsache basieren, dass diese Molekülart kein reduzierendes Ende zu enthalten scheint. Die Rundstrukturen sind interessant, weil sie einigen der Interaktionen entsprechen, die ich kurz beschreiben will. Natürlich wollten wir hauptsächlich herausfinden, welche Rolle die unerwartete Aktivität dieser Polysaccharide bei der Stimulierung der Fettsäuresynthetase spielt. Sehr grob gesagt – das nächste Dia bitte – besteht die Wirkung dieser Polysaccharide darin, die Michaelis-Konstante für Acetyl-CoA für eines der Substrate zu verringern. Und aus diesen Daten hier, die die gewöhnliche Linie darstellen, kann man errechnen, dass der Km unter bestimmten Bedingungen für Acetyl-CoA bei Vorhandensein dieser Polysaccharide ca. 50-fach herabgesetzt ist, damit das System unter physiologischen Bedingungen funktionieren kann. Dies ist einfach eine weitere Beschreibung eines Phänomens statt einer molekularen Erklärung. Deshalb versuchten wir den speziellen Enzymbestandteil, in dem diese Polysaccharide ihre Rolle spielen könnten, zu identifizieren und zu lokalisieren. Bei der Untersuchung der einzelnen Enzymkomponenten oder von Teilaktivitäten ist es uns jedoch nicht gelungen, Auswirkungen der Polysaccharide auf eine isolierte enzymatische Reaktion nachzuweisen. An dieser Stelle richteten wir unsere Aufmerksamkeit erneut auf das merkwürdige und schon erwähnte bimodale Kettenlängenmuster, eines der einzigartigen Merkmale des M. phlei-Systems, das nicht zu den generellen Mustern von Enzymspezifitäten passt. Als wir untersuchten, ob das Fettsäurespektrum in irgendeiner Weise durch die stimulierenden Polysaccharide verändert wurde, stellten wir fest – das nächste Dia bitte -, dass die Zugabe von Methylmannose oder Methylglucose enthaltenden Polysacchariden einen sehr markanten Effekt auf das Muster der Kettenlängenverteilung hatte. Bei Zugabe dieser Materialien verdoppelte sich der relative Anteil der kürzerkettigen Säure zu Lasten der längerkettigen Säure. Das Muster war nach wie vor bimodal, aber der relative Anteil dieser beiden, wenn man so will, Familien von Fettsäuren veränderte sich durch Zugabe der Polysaccharide. Wenn wir annehmen, dass die Beendigung des Synthetaseprozesses mit einer Übertragung der enzymgebundenen Fettacylkette, könnte eine Stimulierung dieses Enzyms durch Polysaccharid zu der erhöhten Fettsäurefreisetzung in diesem Molekulargewichtsbereich oder Kettenlängenbereich bei Zugabe von Polysacchariden beitragen. Wir haben bisher nur vorläufige Hinweise darauf, dass die Polysaccharide auf der Ebene der Palmitoyl-Transacylase wirken könnten. Aber im Verlauf dieser Studien haben wir unabhängig voneinander mehrere interessante Phänomene beobachtet, die für die Funktion der Polysaccharide interessant sein könnten. Das nächste Dia bitte. die Acetyl- und Malonylreste aus ihren Kombinationen mit Koenzym A auf den Enzymkomplex übertragen. Und wir stellten fest, dass diese beiden initiierenden Enzyme übermäßig empfindlich auf eines der Endprodukte der Fettsäuresynthetase, nämlich Palmitoyl-CoA, reagieren. Sie sehen hier die Effekte zunehmender Palmitoyl-CoA-Konzentrationen auf die Aktivität von Acetyl und Malonyl-Transacylase – wobei die Malonyl-Transacylase die empfindlichere der beiden ist. Bei rund 5 Mikromol Palmitoyl-CoA ist eine vollständige Hemmung dieses Enzyms durch eines der Endprodukte der Synthetasereaktion erreicht. Wenn man jetzt diese beiden Transacylasen in Gegenwart einer der beiden von mir erwähnten Polysaccharidarten untersucht, stellt man fest, dass diese Polysaccharide ihre Aktivität auf normalem Niveau wieder herstellen, bis mindestens eine bestimmte Palmitoyl-CoA-Konzentration erreicht ist. Sie wirken also den hemmenden Effekten von Palmitoyl-CoA unabhängig davon entgegen, ob Palmitoyl-CoA als Reaktionshemmer agiert oder nicht. Ein spezieller und möglicherweise physiologisch signifikanter Effekt dieser Polysaccharide ist also, das Funktionieren der Systeme in Gegenwart eines sich aufbauenden Endprodukts zu ermöglichen. Das Gleiche gilt – das nächste Dia bitte – für den Gesamtprozess der Fettsäuresynthetase. Das normale oder geregelte System der Fettsäuresynthese wird in Gegenwart von Palmitoyl-CoA zu über 90% gehemmt. Bei Zugabe der Polysaccharidaktivität und sehr geringen Polysaccharidmengen wird die Aktivität jedoch wieder normalisiert. Dagegen hat einer der häufig zur Neutralisierung der hemmenden Effekte von Palmitoyl-CoA eingesetzten Wirkstoffe, nämlich Rinderserumalbumin, auch in sehr hohen Konzentrationen nur einen sehr marginalen Effekt. Dasselbe Phänomen, nämlich die Hemmung durch Palitoyl-CoA und die nachlassende Hemmung durch Polysaccharid, gilt für alle Fettsäuresynthetasen, die wir getestet haben. Diese Experimente werfen natürlich zwei Fragen auf: Das nächste Dia beantwortet die erste dieser beiden Fragen ziemlich überzeugend. Wenn man eines dieser Polysaccharide in einer Bio-Gel-Säure chromatographiert, erhält man ein sehr deutliches Hinweismuster, während eine vergleichbare Chromatographie von Palmitoyl-CoA ein Muster mit relativ breiter Absorption zeigt, das verwischt erscheint und keinen einzelnen scharfen Peak anzeigt. Wenn man das Polysaccharid oder eines der Polysaccharide in Gegenwart von Palmitoyl-CoA chromatographiert, kommen die beiden in einem einzigen scharfen Peak aus der Säule. Das lässt eine sehr starke Interaktion vermuten. Dasselbe ist nachweisbar, wenn man zu einer Säule, aus der allmählich Palmitoyl-CoA kommt, das Polysaccharid zugibt. Dann wird plötzlich der Rest des Palmitoyl-CoA aus der Säule abgegeben, was vermuten lässt, dass diese beiden Molekülarten interagieren können und eine Art Komplex oder sequestrierte Form bilden können. Zweifelsohne ist es der hydrophobe Effekt der Methoxy-Gruppen auf einige dieser Polysaccharide, der bei diesen Interaktionen eine Rolle spielen könnte. Und wir haben Hinweise darauf, dass man durch Eliminierung dieser Methoxy-Gruppen die Bindefähigkeit von Polysaccharid für Palmitoyl-CoA negieren kann. Alle auf dem allgemeinen Gebiet von Lipiden tätigen Forscher haben beobachtet, dass immer dann, wenn ein Enzym durch Palmitoyl-CoA gehemmt wird, Rinderserumalbumin Schutz bietet oder die Hemmung herabsetzt. Das hängt ganz einfach mit seiner Bindefähigkeit für Fettsäuren zusammen, die bekannt ist und eine der Funktionen von Serumalbumin im Lipidtransport sein kann. Im M. phlei-System scheint jedoch die Aktion des Polysaccharids spezieller zu sein. Unter Bedingungen, bei denen Serumalbumin nur marginal wirksam ist, überwinden die Polysaccharide die Palmitoyl-CoA-Hemmung komplett. Zudem können einige der Polysaccharideffekte nicht mit Serumalbumin wiederholt werden, beispielsweise die Stimulation der Palmitoyl-CoA-Transacylase. Wenn wir einen unbedeutenden, unspezifischen Effekt ausschließen: Welche Funktion übernehmen dann diese Polysaccharide in der Verbesserung der Fettsäurensynthese in M. phlei? Wie ich bereits sagte, verbessern diese Materialien in markanter Weise die Gesamtaktivität des Synthetasesystems bei Abwesenheit von zusätzlichem Palmitoyl-CoA. Sie zeigen ähnliche, wenn auch wesentlich geringere Effekte auf Fettsäuresynthetasen aus anderen bakteriellen Quellen und aus Hefe. Die Fähigkeit der Polysaccharide, sich an Palmitoyl-CoA zu binden und damit zu interagieren, wie auf diesem Dia zu sehen, bringt die Möglichkeit ins Spiel, dass diese Interaktion nicht nur mit von außen zugesetztem Palmitoyl-CoA funktioniert, sondern auch mit einem Palmitoyl-CoA-Endprodukt, das enzymatisch vom System selbst produziert wird. Wenn einige der ersten Schritte - bitte das nächste Dia - im Elongationsprozess, vor allem in der anfängliche Transacylierungsreaktion, die, wie wir gesehen haben, sehr empfindlich auf Palmitoyl-CoA reagiert, ungewöhnlich empfindlich auf dieses Endprodukt reagiert und einer Feedback-Inhibition unterliegt, würde dieses System bald zum Stillstand kommen, wenn das Endprodukt nicht in irgendeiner Form zu einer nicht-hemmenden Form sequestriert oder entfernt wird. Unser Experiment kann sicherlich so interpretiert werden, dass das System, das Palmitoyl-CoA und damit seinen eigenen Hemmer in einer typischen, negativen Feedbackschleife erzeugt, durch eine positive Regelungsschleife gesteuert werden könnte, indem der Feedback-Hemmer entfernt und in eine unschädliche komplexe Form verwandelt wird. Wir haben dann also, zumindest in diesem speziellen Fall, sowohl einen positiven als auch einen negativen Regulierungsmechanismus für die Fettsäuresynthetase. Ich möchte hier ergänzen, dass der Regulierungsmodus für die Fettsäuresynthetase im Multienzymkomplex überhaupt nicht feststeht und von einem zum anderen Organismus variieren kann. Bei tierischem Gewebe gibt es aussagekräftige Hinweise darauf, dass die Regulierung in einem Schritt erfolgt, der dem Elongationsprozess vorausgeht, nämlich auf der Ebene der Acetyl-CoA-Carboxylase, die Malonyl-CoA aus Acetyl-CoA produziert. Diese Reaktion ist nicht mit einem Multienzymkomplex verbunden. Aber bisher gibt es für eine derartige Regulierung keine Nachweise in einem anderen System, wie in Hefe oder Mikroben. Abschließend möchte ich auf einen weiteren Aspekt der komplexen Regulierungsmechanismen eingehen, die im M. phlei-Fettsäuren-Synthetasesystem wirksam sind. Wie wir gesehen haben, weist das Kettenlängenmuster der erzeugten Synthetase keinen einzelnen Peak, sondern 2 Peaks auf. Das hat natürlich unser Interesse geweckt und wir haben versucht, die Mechanismen zu verstehen, die für dieses bimodale Muster verantwortlich sind. Ich habe darauf hingewiesen, dass die M. phlei-Synthetase nicht nur mit Acetyl-CoA initiiert werden kann, sondern dass man auch Palmitoyl-CoA in das System eingeben kann. Wenn man jedoch – bitte das nächste Dia – ein System mit einem normalen Substrat Acetyl-CoA initiiert, muss man dieses System durch Faktoren stimulieren oder unterstützen, die wir als Polysaccharide identifiziert haben. Und diese Polysaccharide aus Rohextrakten können den rohen/gekochten Faktor in vollem Umfang ersetzen. Wenn man versucht, die Fettsäuresynthetase mit Palmitoyl-CoA zu initiieren, um sie auf 24 Kohlenstoffatome aufzubauen, stellt man keinerlei Aktivität fest, sofern keine Zusätze hinzukommen. Die rohen/gekochten Extrakte sorgen für eine Stimulierung um das rund 100-fache. Aber in diesem Fall ersetzen, stimulieren oder ermöglichen die Polysaccharide im Gegensatz zur Acetyl-CoA-Initiierung nicht die Systemfunktion. Deshalb war offensichtlich, dass diese Rohextrakte neben den Polysacchariden andere Faktoren enthielten, die für die zweite Phase dieses, wenn Sie so wollen, Elongationsprozesses benötigt werden. Das nächste Dia zeigt einfach, dass wir in der Lage waren, ein Material von diesen Polysacchariden zu trennen, das sich als ein für den Elongationsprozess wesentliches Protein herausstellte. Dieses Protein, das wir als Protein B oder den Elongationsfaktor bezeichnen, wurde bisher noch nicht in Reinform gewonnen. Obwohl es hitzebeständig ist, gestaltete sich die Reinigung ziemlich schwierig. Alles, was wir wissen, ist, dass es sich um ein Protein mit geringem Molekulargewicht handelt, nämlich mit einem Molekulargewicht unter 10.000, und dass es beispielsweise nicht mit dem Acyl-Carrier-Protein oder anderen bekannten Proteineinheiten identisch ist. Und erneut müssen wir herausfinden, welche Funktion dieses Protein hat – über die Aussage hinausgehend, dass es zur Fortsetzung des Elongationsprozesses benötigt wird. Das nächste Dia zeigt, dass dieses Protein, das übrigens in Mikrogrammmengen benötigt wird, nur mit den längerkettigen Acyl-CoA-Derivaten wirksam ist. Es geht also eher um einen Elongationsfaktor als um einen Faktor, der für die gesamte Fettsäuresynthese, angefangen bei Acetyl-CoA nötig ist. Der Effekt wird bei 10 Kohlenstoffatomen signifikant und zeigt dann ungefähr die gleichen Aktivitäten für mittel- und längerkettige Fettsäuren. Das nächste Dia bitte. In dem Versuch, die Auswirkungen dieses Proteins auf das Elongationsmuster zu lokalisieren, hatten wir einen Teilerfolg. Das Ziel dieses Proteins scheint das kondensierende Enzym zu sein, das Enzym also, das die Elongation der Kohlenstoffkette durch zwei Kohlenstoffatome katalysiert. Wenn man diesen Kondensierungsprozess durch Umkehr und Messung der Co2-Fixierung analysiert, stellt man fest, dass dieses Protein keine Wirkung auf das kondensierende Enzym hat und die Acyl-Komponente keine kurze Kette aufweist. Wenn man jetzt zu C10, C14 und C16 hinaufgeht, erkennt man eine sehr umfangreiche Stimulierung des Kettenlängungsprozesses, gemessen anhand des kondensierenden Enzyms durch den Protein-Elongationsfaktor. Da wir es mit einem Multienzymkomplex zu tun haben und wir das kondensierende Enzym nicht vom Multienzymkomplex isolieren können, wissen wir nicht, wie viele individuelle Reaktionen mit dieser Gesamttransformation verbunden sind. Und deshalb – bitte das nächste Dia – formulieren wir die Funktion dieses Proteins in einer Phase jenseits des Palmitoyl-Enzyms. Sobald die C16-Phase erreicht ist, tritt ein neues Protein ins Bild, das dem System die Fortsetzung des Elongationsprozesses ermöglicht und deshalb letztendlich ein bimodales Kettenlängenverteilungsmuster verursacht. Dies scheint ein nicht-katalytisches Protein zu sein. Es kann ein Regulationsprotein oder ein Spezifikationsprotein sein, das entweder ein bestehendes Enzym aktiviert oder die Spezifität eines kondensierenden Enzyms korrekt verändert – das muss weiter untersucht werden. Ich möchte meine Ausführungen mit der Frage beenden, ob der überaus komplexe Mechanismus, den ich beschrieben habe, einen grundsätzlichen Einfluss auf die Fettsäure-Biosynthese hat oder ob er auf die Mykobakterien mit ihrer notorisch komplexen Kohlenhydrat- und Lipidchemie und -stoffwechsel begrenzt ist. Es scheint sehr wahrscheinlich, dass die Mycobacterium phlei-Synthetase mehreren Zwecken dient und nicht nur Fettsäuren für die Membranlipide, sondern auch für die Lipidbestandteile der mykobakteriellen Zellenwand liefert. Nächstes Dia bitte. Die Phospholipide, die Membranphospholipide in Mykobakterien sowie in weiteren Bakterien enthalten Fettsäuren mit 16 oder 18 Kohlenstoffen in normaler Kettenlänge. Allerdings enthält die Zellwand von Mykobakterien sehr komplexe Lipidstrukturen, die als Mykolsäuren oder Kettenfaktoren bekannt sind, worunter die C24-Säuren die wichtigsten Bestandteile sind. Wenn also die Bakterienzelle mit einer einzelnen Fettsäuresynthetase arbeitet, muss es einen Regulierungsmechanismus geben, der die Lenkung des Stroms von Fettsäuren unterschiedlicher Kettenlänge entweder zur Synthetase von Phospholipiden in der Membran oder zu den komplexen Lipiden und Glycolipiden der mykobakteriellen Zellwand ermöglicht. Man darf also sehr spezielle Mechanismen zur Regelung der Fettsäuresynthetase in diesem Organismus erwarten. Danke.

Konrad Bloch on the growing importance of lipid research
(00:01:02 - 00:02:45)

 

Membranes, Channels and Receptors

Bloch’s interest was shared by Salvador Luria who was awarded with the Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969 together with Delbrück and Hershey for their achievements in genetics but had discovered cellular membranes as an “unplowed field” he wanted to dig in already at the end of the 1950s. When he came to Lindau in 1981, he gave an interesting overview on different types of transmembrane channels:


Salvador Luria (1981) - Membranes and Transmembrane Channels

Ladies and Gentlemen, students and colleagues. It’s very pleasant to be a scientist speaking in a theatre because they give you the flowers before the performance, whereas an actress has to wait until after the performance. Probably the idea is that if they waited until after the performance we wouldn’t deserve the flowers. I think it’s going to be a difficult task. We followed 2 beautiful talks. A little bit like 2 marvellous symphonies which are so beautiful that one forgets that they continue, that the last movement continues 15 or 20 minutes longer than one expected. But I hope I still have enough of the time allotted to me for my own talk. But if the boat is to leave and I continue to talk and the boat is leaving, please feel free to leave and go for the promenade on the 'Bodensee'. Another apology I must make is that I cannot or I do not wish, like many of my colleagues, to talk about the fruit of their meditations and discoveries of many years. Because I feel that as long as I can talk about something that I am actually doing now and which I do not yet understand very well, I keep young. And this is one of the problems that one has in life is to keep as young as possible, or at least to forget that one is getting old. If I wanted to give to this lecture a very impressive title, I would say I want to talk about the molecular biology of transmembrane channels. But it’s really much less impressive than that. The question is that, as most of you know, biological membranes are rather strange things. On the one hand they have a stupid framework consisting of phospholipid molecules which are very impermeable to almost everything except water. And which are really relatively indifferent. Only the specialists really concern themselves about the internal changes with temperature or with other conditions. But in order for substances to go into cell or from one part of the cell into another, if the portions, if the parts of the cells are subdivided by membrane, there has to be some mechanism. And these mechanisms are channels. And these channels are proteins or group of proteins about which the task or people, the very few people fortunately still in the world - nothing like DNA or recombinant DNA. But there are still and already a substantial number of people beginning to understand that there is such a thing as interest in the way things go in and out of membrane. Of course neurophysiologists being the first ones who had to worry about these problems. But what one would like to know about these channels is, of course, first of all the specificity of the conductance for various substances. The rates at which various substances go through and what determines those rates. The dependence of the conductance for various substances on external stimuli, either chemical or electrical. And finally how they are formed and organised within the membrane. And to make clear about the various types of channels that we have, I would like to show you in the first slide a few types of membranes. This being the cytoplasmic membrane, let’s say of something, possibly of a bacterium or of a cell or of nerve fibres. Some are intelligent channels, for example the ones that regulate the transport of substances across the membrane. Either purely because of differences in the concentrations of specific substances, or because of actual coupling with energy from ATP or in other ways, as we’ll see later. Then we have not only the intelligent but the neurotic channels, that is those which are gated by the electrical potential. That is the membrane potential as it determines the permeability of channels for sodium or for potassium and so on. Then we have somewhat less intelligent channels which do not discriminate very much. And an example of that are the gap junctions that form between cells, for example in the very early embryo of most animals. And which can be formed, open or closed, either functionally or also developmentally, so that cells at a certain point stop being tightly coupled by gap junctions. And then finally we have another class which I would call the most stupid ones, but not quite stupid enough for my own taste. And an example of that are the so-called porins or matrix proteins or the outer membrane of bacteria. Bacteria of course like mitochondria have 2 membranes, an inner cytoplasmic membrane with all of the intelligent things. And an outer membrane which, not having any energy available, has to provide holes or channels through which substances up to about the molecular weight of 1,000 can go through and reach the active region. Now all of these membranes, all of this type of membranes on this slide have one unpleasant feature. In the course of the growth or the formation of the cell, the proteins of these channels have to go and insert themselves into the membranes. And therefore in general the biochemist who has tried to work with them finds that they are more or less distasteful, because they generally are poorly soluble in water. And when it comes to things which are poorly soluble in water biochemists prefers to turn the other way and look into the swimming pool. Now for example in the first class we can put the acetylcholine receptor – which is practically the only receptor for a neurotransmitter that has been purified and isolated in a satisfactory way. And that took approximately I’d say 10 to 15 years. In the case of the outer membrane pore of bacteria the matrix protein has been purified in a couple of laboratories after 5 or 6 years of work. So when many years ago I became interested in the idea of how things may go through membrane and so on, I thought, in fact in became interested because I became interested in a class of proteins which are really very remarkable. They are called colicins of the E group or the E1 group. And these colicins are antibiotics that attach themselves to certain bacteria and kill them. And as I will show you in this very brief talk, they kill them by doing exactly what a biochemist would like to do: by inserting themselves in the phospholipid bilayer of the cytoplasmic membrane. And they are creating a hole whose conductance is non-specific, relatively non-specific, and allows substances to pass, which have molecular weights up to about 800 or 900. And so what I am going to do now is to tell you a little bit the history of the battle that myself and my students have carried out against these proteins for a number of years. The next slide shows the effect of some of the proteins of this group. If you mix bacteria with sufficient amount of one of these proteins, you'll find that a whole series of physiological effects occur: The synthesis of protein RNA, the next should be DNA, and glycogens are arrested. Active transports, most of them, are actually blocked. Bacterial motility is blocked. And ATP levels decrease. And the remarkable point that I would like you to keep in mind is that all of these events are the results of a single molecule of colicin, attaching itself to a single bacterium. The kinetics is strictly first order. And as we know now, one molecule is sufficient to produce these effects. And we thought about strange possibilities of how to explain this several years ago, although now we have an explanation which is extremely simple and somewhat less interesting. Now whenever you see that one molecule of a protein interacting with a bacterium can do all of these things, you immediately think that it must act at the level of the energy metabolism. Because that’s the one place where all of these phenomena are going to be bound. Now the next slide shows a very simple way. A scheme of the energy metabolism of a bacterium like Escherichia coli growing with glucose as the only or main carbon source. And of course out of glucose can get phosphate or pyruvate, which is used in bacteria to bring in more glucose and mostly used to produce ATP. ATP is used for all of the syntheses. On the other hand we have electron transport with all of its intermediates. And the electron transport as well as the ATP with the mediation of a calcium magnesium activated ATPase. Both serve to generate what used to be called energised stratum membrane, and which we now call the proton motive force which has been shown now directly to energise bacterial motility and the active transport of a variety of substances. I hope everybody in this audience will forgive me when I say 'energise directly', because I do not want to enter into the question of whether the proton motive force is used directly at the level of certain proteins to transport substances. Or there might be some intermediates which Peter Mitchell would like not to hear about. And I agree with him. Now given this complexity it was quite clear that in some way the colicin had to affect somewhere this general complex. Either at the level of the ATP itself, therefore reducing this. Or at the level of the proton motive force itself. Or at the coupling of the proton motive force with these functions. And we solved this problem by making a second slide. The next slide. I give you about 10 seconds time to see how it differs from the other. (laughter) This is a mutant of course. I have to have bacterial mutants, otherwise I would not be true to my past. And this is a mutant that is blocked in the ITPase, which is the only ATPase functional in the bacterial cell. In such a mutant the proton motive force can be generated only by electron transport, and not from ATP. And therefore the effects of colicin on this mutant should reveal whether we are damaging here or here. And the next slide shows what happens when colicin acts on the ATPase-defective strain of E. coli. And here it turns out of course that respiration continues, which is fortunate, otherwise the experiments could not be done. But the synthesis of micro molecules, RNA, DNA and proteins and glycogen continue. And the ATP levels increase so that - what is happening here? We have created bacteria which are still able to make protein, to make RNA and DNA. They have a higher level of ATP now because the ATP is not wasted in charging the proton motive force, this squiggle. But the motility is still abolished and the accumulation of potassium, rubidium, galactosides, amino acids is still abolished. But now we notice that pre-accumulated substances come out of the cell. So we conclude that the effect of the colicin on the energy metabolism must be on the site of the proton motive force. And that probably some leakage from the cells is being generated by the single molecule protein. Now the next slide simply tells you a little bit more graphically what the proton motive force must be. It can be generated from ATP through the ATPase or from electron transport. It activates motility in the bacterial cells. It activates active transport. And it is involved in chemotaxis, but that’s not to be discussed here. Now what is the proton motive force? Since I had to learn it a few years ago from reading Mitchell and now students fortunately can study it in text books which are beginning to incorporate something about Mitchell’s theory. The next slide. I put something very elementary. The proton motive force is simply an energy charge across the membrane which consists of 2 components: a membrane potential and a difference in pH, that is immense potential for protons. And the 2 together amount to a force, to a potential of 200 millivolts. Now all of these, according to Mitchell’s theory, are generated because the respiratory chain or ATP through the ATPase, separately and more or less independently, can expel protons from the cell, creating a proton gradient. And the proton gradient across the membrane generates these 2 elements. And it's a membrane potential which is of course in existence already in the cell. But it is added on to the membrane potential. And in addition there is a gradience of protons which tends therefore to bring protons back into the cells. And it generates 100 millivolt energy charge at pH6 and that of course is dependent on the external pH. Now the question was at this point, can one measure this? Can one find out how one molecule of colicin affects this proton motive force? If it is true, our hypothesis, that this is where it affects it. And the next slide shows how methods developed in any number of laboratories but not in our own, although we used them passively, is that you can measure separately the delta side, that is the membrane potential in a bacterial cell, in which we cannot introduce a microelectrode because the smallest microelectrode is bigger than the biggest cell of E. coli. Therefore we had to do it chemically. It can be done by taking lipophilic cations, radioactively labelled, and then find that these cations are going to partition themselves in and out of the cells depending on the membrane potential. Because of course they can pass through the lipid bilayer. And if the membrane potential is high or negative inside, then they will accumulate here. And they come out when the membrane potential goes down. As far as measuring the pH inside the bacterium, we cannot put a pH-electrode - they don't make them this small. But we can use a radioactive weak acid for which the cell doesn't either transport or a metabolism. And we use for example for E. coli butyric acid, which has been used by many other people. And butyric acid will partition itself according to the difference in pH. The higher the pH here, the lower the concentration of hydrogen ion. Therefore less of the substance will be in this form inside, because in order to come through it has to be protonated. So these are just the tricks that we learned from the membrane physical chemists. And applying these tricks - the next slide - shows that when you add one of these lipophilic cations to a bacterial cell, it accumulates very rapidly. You add the colicin and it goes out. And the membrane potential decreases from about 110 millivolt to less than 10 millivolt in a matter of minutes. So it’s clear that one result, one consequence of the colicin molecule, is to abolish the membrane potential. The next slide is a little bit more puzzling, but we know the answer. This is actually printed directly from the computer. And the computer has been sort of unkind enough not to leave out the set of points that don’t fit the curve. But you have to live with the computer and you have to be honest. In fact, my secretary who was preparing the slides suggested that I have another side made without these 3 points, but I resisted the temptation. But anyway the curve is good enough to show that colicin added to the cell has practically no effect on the delta pH. But that other substances, which are known to be proton conductors, caused a decrease of the difference in concentration of ions. And this turns out to be a very simple reason. As I’ll tell you in a moment, before ending, is that the cells do in fact lose the membrane potential and they do in fact become also permeable to protons, so that protons do pass through. And the reason we don’t see it is because these cells, the rate of penetration of protons through the channels produced by the colicin is much slower than the rate of production and expulsion of protons through the electron transport system that the bacteria have. So that the bacteria are pumping out protons about 20 times faster than the protons can leak inside the cells. And so that the system is working nicely. Now at this point we have to ask the question. This is all very nice. We know that the colicin abolishes the membrane potential. But the question is what does it do. Does it act on the cytoplasmic membrane? Does it act on the outside? Does it disrupt something that we don’t know? Or something of that kind. At this point what we did, obviously, is we went to a simple system. And the simple system is to use liposomes. The next slide please. Liposomes, vesicles of phospholipid which are produced by a variety of ways, sonication, drying, sonication and so on. And they form vesicles that have a single bilayer of phospholipid around them. And these were produced using phospholipid directly from the cell, from the bacteria Escherichia coli, and in approximately the same proportions in which they are present in the cell, about phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol and cardiolipin in appropriate proportions. The interesting thing is the reason, why are they so uniform? The reason they are all so uniform is because my colleague Doctor Kayalar, who did this work with the liposomes, was asked at the meeting whether his liposomes were really all nice and uniform and large. And he didn’t have a slide. So when he came back he made many slides. And we chose the one that shows them all approximately like the same and all very large. If you looked at some other slides, you would find that there are some somewhat smaller. But these are approximately an average of about 600, 700 millimicron in diameter. And the smallest one was probably about 400. So they are really nice. There is a reason for telling you that. And the reason will come when I talk with the last slide. But anyway these are nice liposomes. If you make liposomes in a solution that contains one or more radioactive substances, and then you pass these liposomes through a column or you dialyse them through a medium, you can get rid of the external radioactive substance and you have liposome loaded with radioactive substances suspended in a medium without. So by measuring the radioactivity outside the liposome it’s very easy to see if anything comes out. It’s a little bit more complicated but we have done it to see if anything goes in. And the next slide now shows what happens if you take liposomes that have been made with radioactive rubidium and radioactive sucrose, both of them in the same solution, and you add the colicin. You see that rubidium comes out almost completely, because when you disrupt the liposome very little remains. I don't know how to point here, I'm not tall enough. Sucrose comes out at first more slowly and then even more slowly for quite a while. Now the exit is not simply disruption or a formation of a rapid channel. If there is a control you take the same kind of things but you add here valinomycin. Valinomycin makes an immediate channel for rubidium or for potassium, and they immediately equilibrate. Whereas if you add colicin K, you get again the same kind of slow exit. And what is most interesting, if we think in terms of the natural channels, is that for each substance we study we find that the channel produced by colicin has a specific rate of exit. Which means that this channel produced by a single molecule of colicin has a conductivity which is different for rubidium. It turns out that it’s about ½ if you measure it for sulphate ion. It’s similar for hydrogen ions, and similar to that for sulphate ion. About ¼ for sucrose and much shorter, much lower but still definite for substances like glucose-6-phosphate. And we can measure up to a polymer, a sugar polymer of approximately molecular weight of 750, and it comes out very slowly. Whereas inulin, a molecule of about 4,000 molecular weight, does not come out at all. And I may add that in the case of several other substances that we have studied, they seem to fall into, what I will say approximately, certain classes of conductances. Now the question is, is this really due to one molecule of colicin? Well, that was done - unfortunately I don't have a slide. But it was done in the case of rubidium by taking this initial part of this curve for various concentrations of rubidium and measuring very accurately. And Doctor Celik Kayalar, who is now at Berkeley, has found that the dependence of this initial slope on the concentration of colicin is exactly let’s say between 0.9 and 1.2. Definitely first order reaction. So a single molecule forms the channel. Now the question is, how does it form the channel? How does it go in? And here we have a puzzle which I think will be of interest to other people in membrane biology – if there are some present besides the neurophysiologists, who deal with much higher forms. Some time ago a group under Albert Einstein, Doctor Finkelstein and his co-workers, got some colicin K from us. And they placed it in a system in which you have an artificial membrane, one of the Montal-type, in which 2 monolayers of phospholipid are brought up against one another. And these are connected let’s say in 2 cuvettes into which you can put electrodes. And you can connect them through a voltage CRM system. And you can find out whether the channel, what is the conductance for sodium or potassium ions of the channels, if any. And whether the channel is open or closed immediately when you add the colicin or whether they require an electrical gating. The next slide which is the last shows these 2 systems. Here are the liposomes in water. And here is the type of artificial membrane produced by having 2 monolayers of phospholipid trapped in this little hole. And you have a system here which you can change the polarity and you have a voltage CRM that you can measure recurringly. Now the remarkable thing is that on this system they found that the conductors for potassium and sodium through this thing, produced by adding the colicin on one side or on the other, is definitely gated. That is in order for the sodium or potassium to start going through, you need to apply a potential difference of the order between 10 and 20 millivolt – about 20 millivolt you have open channels - and they close back and forth. So we said we have here the sodium channel, the potassium channel, marvellous. Except that when we went to do the same experiment with liposomes, it turns out that the channels produced by colicin are not gated at all. How do we know? Well any of you who are membranologist would know. All you have to do is to have different potassium concentration, add some valinomycin, and you change the membrane potential. And we changed the membrane potential between minus 100 inside to plus 100 inside in steps. And at each step the additional colicin made no difference at all. The additional colicin continued to make the same kind of channel conductances as it did at any of the other voltages. Now here we have a peculiar situation in membranology. This is not the first case. For example the outer membrane of the bacterial cell, the matrix protein, the channel, has been purified, as I said, by 2 laboratories. The laboratories of Nakae and Nikaido in Japan and in Berkeley find that when they put in artificial membranes that the channel's conductance is completely non-gated, independent of electrical potential. Whereas Schindler and Rosenbusch in Basel find that the same protein put in the same membrane, but in this form rather than in liposome, in this kind of set up, you find the gated situation. And this is also true for the outer membrane channel protein from mitochondria, although that has been done in a very partial way. So here we have a situation in which the simplest arrangement gives us a very simple answer. A more complicated arrangement gives an answer which in my opinion is probably completely wrong. And I mean, apart from the fact that in a more strictly professional audience I would say be careful before you use that kind of membrane. This reinforced my own conviction ever since I started doing experiments in the middle of the 1930s. If you can do something in a simple way without any instrument, do it that way. And you are likely to be more right than people who have big powerful apparatuses. Thank you very much. Applause.

Sehr geehrte Damen und Herren, Studenten und Kollegen. Es ist sehr angenehm, als Wissenschaftler in einem Theater zu sprechen, da man die Blumen vor der Vorstellung erhält, während die Schauspielerinnen bis nach der Aufführung warten müssen. Wahrscheinlich will man nicht bis nach der Rede warten, da wir womöglich keine Blumen verdienen würden. Ich glaube, meine Rede wird eine schwierige Aufgabe sein. Wir haben 2 schöne Reden gehört. Ein bisschen wie 2 herrliche Symphonien, die so schön sind, dass man darüber die Zeit vergisst und bei denen der letzte Satz 15 oder 20 Minuten länger als erwartet dauert. Ich hoffe jedoch, dass von der mir zugeteilten Zeit noch genug für meine eigene Rede übrig bleibt. Wenn jedoch das Boot abfährt und ich noch immer jede, dann zögern Sie nicht, einfach zu gehen, um an der Bodensee-Schifffahrt teilzunehmen. Ich muss mich auch dafür entschuldigen, dass ich im Gegensatz zu vielen Kollegen nicht über das Ergebnis der Überlegungen und Entdeckungen vieler Jahre sprechen werde. Solange ich über etwas spreche, womit ich mich derzeit beschäftige und was ich noch nicht besonders gut verstehe, fühle ich mich jung. Und das ist eben eines der Probleme im Leben, dass man so jung wie möglich bleiben will oder zumindest vergessen will, dass man älter wird. Wollte ich dieser Rede einen sehr beeindruckenden Titel geben, würde ich sagen, dass ich über die Molekularbiologie von Transmembrankanälen sprechen möchte. Es ist aber wirklich nicht so beeindruckend. Wie die meisten von Ihnen wissen, sind biologische Membranen recht seltsame Dinge. Sie verfügen über einen dämlichen Aufbau aus Phospholipidmolekülen, die für fast alles außer Wasser recht undurchlässig sind. Und die auch wirklich ziemlich gleichgültig sind. Nur die Spezialisten beschäftigen sich mit den internen Veränderungen mit der Temperatur oder anderen Bedingungen. Damit jedoch Substanzen in die Zelle oder von einem Teil der Zelle in einen anderen gelangen, wenn die Abschnitte, die Teile der Zellen durch Membranen unterteilt werden, muss es einen Mechanismus geben. Diese Mechanismen sind Kanäle. Und diese Kanäle sind Proteine oder Proteingruppen. Es gibt Personen, von denen viele glücklicherweise noch am Leben sind, nicht so wie bei der DNA oder rekombinanten DNA, also es gibt noch immer und bereits eine große Anzahl von Personen, die zu verstehen beginnen, dass es von Interesse ist, wie Dinge in und aus der Membran dringen. Natürlich mussten sich die Neurophysiologen als erste mit diesen Problemen beschäftigen. Was man vor allem über diese Kanäle wissen möchte, ist natürlich: an erster Stelle, die Spezifität der Leitfähigkeit für verschiedene Substanzen. die Geschwindigkeit, mit der verschiedene Substanzen durchgehen und wodurch diese Geschwindigkeiten bestimmt werden. die Abhängigkeit der Leitfähigkeit für bestimmte Substanzen von externen Reizen, entweder chemischer oder elektrischer Art. und schließlich, wie sie innerhalb der Membran geformt und organisiert werden. Um zu verdeutlichen, welche verschiedenen Kanalarten wir haben, möchte ich Ihnen als erstes Dia ein paar Membranarten zeigen. Das ist die Zytoplasmamembran von etwas, wahrscheinlich von einem Bakterium oder einer Zelle oder von Nervenfasern. Einige sind intelligente Kanäle, wie z. B. jene, die den Transport von Substanzen durch die Membran regeln. Entweder nur aufgrund von Unterschieden in der Konzentration spezifischer Substanzen, oder aufgrund einer tatsächlichen Kopplung mit Energie vom ATP oder auf andere Weise, wie wir später sehen werden. Zusätzlich zu den intelligenten Kanälen gibt es auch neurotische Kanäle, die durch das elektrische Potenzial gesteuert werden. Dies ist das Membranpotenzial, das die Durchlässigkeit der Kanäle für Natrium oder Kalium, etc. bestimmt. Dann haben wir noch etwas weniger intelligente Kanäle, die nicht viele Unterschiede machen. Ein Beispiel sind Gap Junctions, die sich zwischen Zellen bilden, zum Beispiel in den frühen Embryonen der meisten Tiere. Sie können gebildet, geöffnet und geschlossen werden, entweder nach Funktion oder Entwicklung, sodass Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt aufhören, eng durch Gap Junctions gekoppelt zu sein. Und schließlich haben wir noch eine andere Kategorie, die ich als die dümmste bezeichnen würde, ohne dass sie jedoch für meinen Geschmack dumm genug ist. Ein Beispiel hierfür sind die sog. Porine oder Matrixproteine oder die Außenmembran von Bakterien. Bakterien wie Mitochondrien haben natürlich 2 Membranen: eine zytoplasmische Innenmembran mit allen intelligenten Dingen und eine Außenmembran. Da dieser keine Energie zur Verfügung steht, muss sie Löcher und Kanäle bereitstellen, durch die Substanzen mit einem Molekulargewicht von 1,000 dringen und die aktive Region erreichen können. Alle diese Membranen, alle diese Membranarten auf dem Dia haben eine unliebsame Eigenschaft. Im Laufe des Wachstums oder der Bildung der Zelle, müssen die Proteine dieser Kanäle wandern und sich in die Membranen einfügen. Und deshalb findet sie der Biochemiker, der sich mit ihnen beschäftigen will, schrecklich, da sie meist schlecht wasserlöslich sind. Und wenn etwas schlecht wasserlöslich ist, wenden sich Biochemiker am liebsten ab und schauen in das Schwimmbecken. In die erste Gruppe können wir z. B den Acetylcholinrezeptor einordnen, der praktisch der einzige Rezeptor für einen Neurotransmitter ist, der auf zufriedenstellende Weise gereinigt und isoliert wurde. Und das hat ca. 10 bis 15 Jahre lang gedauert. Im Falle der Außenmembranpore von Bakterien wurde das Matrixprotein nach 5 oder 6 Jahren Arbeit in einigen Labors gereinigt. Als ich vor vielen Jahren begann, mich dafür zu interessieren, wie Dinge durch die Membran dringen, interessierte ich mich für eine Kategorie von Proteinen, die wirklich bemerkenswert sind. Sie werden Colicine der Gruppe E oder E1 genannt. Und diese Colicine sind Antibiotika, die sich an bestimmte Bakterien binden und diese töten. Und wie ich Ihnen in dieser kurzen Rede vorführen werde, töten sie sie, indem sie genau das tun, was die Biochemiker tun möchten: Sie schleusen sich selbst in die Phospholipid-Doppelschicht der zytoplasmischen Membran ein. Und sie erzeugen ein Loch, dessen Leitfähigkeit unspezifisch, relativ unspezifisch, ist, und es Substanzen mit Molekulargewichten bis zu 800 oder 900 möglich macht, durchzudringen. Jetzt werde ich Ihnen ein bisschen von dem Kampf erzählen, den meine Studenten und ich über mehrere Jahre gegen diese Proteine geführt haben. Das nächste Dia zeigt die Auswirkung einiger der Proteine dieser Gruppe. Wenn Sie Bakterien mit einer genügenden Menge eines dieser Proteine mischen, werden Sie feststellen, dass eine ganze Reihe von physiologischen Wirkungen auftritt: Die Synthese von Protein-RNA, die nächste sollte DNA sein, und Glykogenen wird gestoppt. Die meisten aktiven Transporte werden blockiert. Die bakterielle Motilität wird blockiert. Die ATP-Werte nehmen ab. Und das Bemerkenswerte, das Sie nicht vergessen sollen, ist der Umstand, dass all diese Ereignisse das Ergebnis eines einzigen Colicin-Moleküls sind, das sich an ein einziges Bakterium bindet. Die Kinetik ist streng erster Ordnung. Und wir wissen jetzt, dass ein Molekül ausreicht, um diese Wirkungen zu erzielen. Vor ein paar Jahren suchten wir nach seltsamen Möglichkeiten, um dies zu erklären, während wir jetzt eine extrem einfache und irgendwie weniger interessante Erklärung haben. Wenn Sie sehen, dass ein Proteinmolekül, das mit einem Bakterium interagiert, all diese Dinge tun kann, denken Sie sofort, dass es auf Ebene des Energiemetabolismus agieren muss. Denn das ist der Ort, an dem all diese Phänomene beheimatet sind. Das nächste Dia zeigt eine sehr einfache Art. Ein Schema des Energiemetabolismus eines Bakteriums wie Escherichia coli, das mit Glukose als einziger oder hauptsächlicher Kohlenstoffquelle wächst. Und natürlich kann aus Glukose Phosphat oder Pyruvat entstehen, was in Bakterien verwendet wird, mehr Glukose reinzubringen und vor allem um ATP zu produzieren. ATP wird für alle Synthesen verwendet. Auf der anderen Seite haben wir einen Elektronentransport mit all seinen Zwischenprodukten. Und den Elektronentransport sowie das ATP mit der Mediation einer Kalzium-Magnesium-ATPase. Beide dienen der Erzeugung dessen, was früher als energetisierte Schichtmembran und jetzt als Protonengradient bezeichnet wird, und von dem gezeigt wurde, dass er die bakterielle Motilität und den aktiven Transport einer Reihe von Substanzen direkt energetisiert. Ich hoffe, dass Sie mir alle im Publikum verzeihen, wenn ich „direkt energetisiert“ sage, da ich nicht auf die Frage eingehen will, ob der Protonengradient direkt auf dem Niveau bestimmter Proteine verwendet wird, um Substanzen zu transportieren. Es kann auch sein, dass es Zwischenprodukte gibt, von denen Peter Mitchell nichts hören möchte. Und ich stimme ihm zu. Bei dieser Komplexität war es klar, dass das Colicin auf irgendeine Weise diesen allgemeinen Komplex beeinträchtigen musste. Entweder auf dem ATP-Niveau selbst, und dieses deshalb reduzierend. Oder auf dem Niveau des Protonengradienten selbst. Oder an der Kopplung des Protonengradienten mit diesen Funktionen. Wir haben dieses Problem gelöst und ein zweites Dia gemacht. Das nächste Dia. Ich gebe Ihnen ca. 10 Sekunden Zeit, um den Unterschied zum anderen Dia zu erkennen. (Gelächter) Dies ist natürlich ein Mutant. Ich brauche bakterielle Mutanten, sonst wäre ich mir selber nicht treu. Und das ist ein Mutant, der in der ITPase blockiert wird, die die einzige ATPase ist, die in der Bakterienzelle funktionstüchtig ist. In einem solchen Mutanten kann der Protonengradient nur durch Elektronentransport und nicht aus ATP erzeugt werden. Deshalb sollten die Auswirkungen von Colicin auf diesen Mutanten zeigen, ob wir hier oder hier Schaden anrichten. Das nächste Dia zeigt, was passiert, wenn Colicin auf den Stamm von E. coli mit defekter ATPase einwirkt. Und hier stellt sich natürlich heraus, dass die Atmung fortfährt, was ein Glück ist, da sonst die Experimente nicht durchgeführt werden könnten. Aber die Synthese von Mikromolekülen, RNA, DNA und Proteinen und Glykogen besteht weiter. Und die ATP-Niveaus steigen weiter – was passiert hier? Wir haben Bakterien erzeugt, die noch immer Protein, RNA und DNA herstellen können. Sie haben nun ein höheres ATP-Niveau, da das ATP nicht vergeudet wird, den Protonengradienten zu laden. Aber die Motilität ist noch immer abgeschafft und die Anreicherung von Kalium, Rubidium, Galactosiden und Aminosäuren ist noch immer abgeschafft. Aber wir stellen jetzt fest, dass zuvor angereicherte Substanzen aus der Zelle dringen. Daraus schließen wir, dass die Auswirkung von Colicin auf den Energiemetabolismus an der Stelle des Protonengradienten erfolgen muss. Und dass wahrscheinlich durch das Einzelmolekül-Protein ein Austritt aus den Zellen erzeugt wird. Das nächste Dia zeigt Ihnen grafisch, wie der Protonengradient aussehen muss. Er kann durch das ATP über die ATPase oder durch Elektronentransport erzeugt werden. Er aktiviert die Motilität in den Bakterienzellen. Er aktiviert den aktiven Transport. Und er ist an der Chemotaxis beteiligt, worüber wir aber heute nicht sprechen werden. Was ist nun der Protonengradient? Ich musste es vor ein paar Jahren lernen, indem ich Mitchell las, und heute können es die Studenten glücklicherweise in Lehrbüchern nachlesen, die beginnen, die Theorie von Mitchell zu integrieren. Das nächste Dia. Ich verwendete etwas sehr Einfaches. Der Protonengradient ist einfach eine Energieladung über eine Membran hinweg, die aus 2 Komponenten besteht: einem Membranpotenzial und einer pH-Differenz, die ein enormes Potenzial für Protonen darstellt. Die 2 gemeinsam bilden eine Kraft, ein Potenzial von 200 Millivolt. All dies wird nach der Theorie von Mitchell erzeugt, weil die Atmungskette oder ATP durch die ATPase separat und mehr oder weniger selbständig Protonen aus der Zelle ausstoßen kann, und somit einen Protonengradienten erzeugt. Und der Protonengradient über die Membran hinweg erzeugt diese 2 Elemente. Es handelt sich um ein Membranpotenzial, das natürlich bereits in der Zelle existiert. Aber es wird zum Membranpotenzial hinzugefügt. Und zusätzlich gibt es einen Protonengradienten, was meist Protonen zurück in die Zellen bringt. Und es wird eine Energieladung von 100 Millivolt bei pH6 erzeugt, die natürlich vom äußeren pH abhängig ist. Die Frage an dieser Stelle war: Kann man das messen? Kann man herausfinden, wie ein Colicin-Molekül diesen Protonengradienten beeinflusst? Wenn unsere Hypothese stimmt, dass der Einfluss hier stattfindet. Und das nächste Dia zeigt, wie in mehreren Labors Methoden entwickelt wurden, aber nicht in unserem eigenen, obwohl wir sie passiv verwendeten. Mit diesen Methoden können separate Messungen der Delta-Seite, d. h. des Membranpotenzials in einer Bakterienzelle, gemacht werden, in die wir keine Mikroelektrode einführen können, da die kleinste Mikroelektrode größer ist als die größte Zelle von E. coli. Deshalb mussten wir chemisch vorgehen. Das ist möglich, indem man radioaktiv markierte, lipophile Kationen nimmt, und dann herausfindet, dass diese Kationen sich selbst in und außerhalb der Zellen teilen, je nach Membranpotenzial. Da sie natürlich die Lipid-Doppelschicht durchdringen können. Und wenn das Membranpotenzial innen hoch oder negativ ist, sammeln sie sich hier an. Und sie kommen heraus, wenn das Membranpotenzial sinkt. Was die Messung des pH im Inneren des Bakteriums anbelangt, können wir keine pH-Elektrode verwenden – so kleine gibt es nicht. Wir können jedoch eine radioaktive schwache Säure verwenden, für die die Zelle weder einen Transport noch einen Metabolismus ausführt. Und wir verwenden z. B. für E. coli Buttersäure, die von vielen anderen Personen auch verwendet wurde. Und die Buttersäure spaltet sich entsprechend der pH-Differenz. Je höher hier der pH ist, umso niedriger ist die Konzentration des Wasserstoffions. Deshalb wird es in dieser Form weniger von dieser Substanz im Inneren geben, da sie für die Überquerung protoniert werden muss. Das sind die Tricks, die wir von den Membran-Physikochemikern gelernt haben. Wenn wir diese Tricks anwenden, sehen wir am nächsten Dia, dass sich beim Hinzufügen eines dieser lipophilen Kationen zu einer Bakterienzelle dieses sehr schnell anreichert. Sie fügen das Colicin hinzu und es geht nach außen. Und das Membranpotenzial sinkt von ca. 110 Millivolt auf weniger als 10 Millivolt binnen weniger Minuten. Eine Auswirkung des Colicin-Moleküls ist also, dass das Membranpotenzial zerstört wird. Das nächste Dia ist etwas mehr erstaunlich, aber wir kennen die Antwort. Es handelt sich direkt um einen Computerausdruck. Und der Computer hat uns nicht den Gefallen getan, jene Punkte auszulassen, die nicht zur Kurve passen. Aber Sie müssen mit dem Computer leben und ehrlich sein. Meine Sekretärin, die die Dias vorbereitete, schlug vor, ein Dia ohne diese 3 Punkte zu machen, aber ich widerstand der Versuchung. Wie auch immer, die Kurve ist gut genug, um zu zeigen, dass das Hinzufügen von Colicin zu einer Zelle praktisch keine Auswirkung auf die pH-Differenz hat. Dass jedoch andere Substanzen, die als Protonenleiter bekannt sind, eine Reduzierung der Ionenkonzentrations-Differenz bewirkt haben. Und dies hat letztendlich einen sehr einfachen Grund. Wie ich Ihnen in Kürze abschließend mitteilen werde, verlieren die Zellen ihr Membranpotenzial und werden für Protonen durchlässig, sodass sie von Protonen durchdrungen werden. Der Grund, warum wir das nicht sehen, ist die Tatsache, dass bei diesen Zellen das Eindringen der Protonen durch die Kanäle, die durch das Colicin erzeugt wurden, viel langsamer ist als die Geschwindigkeit der Erzeugung und des Ausstoßes von Protonen durch das Elektronentransportsystem der Bakterien. So pumpen die Bakterien ca. 20-mal schneller Protonen heraus, als diese in die Zellen dringen können. Somit funktioniert das System prächtig. An dieser Stelle müssen wir eine Frage stellen. Es ist ja alles recht und gut. Wir wissen, dass das Colicin das Membranpotenzial abschafft. Die Frage ist jedoch, wie es das macht. Wirkt es auf die Zytoplasmamembran? Wirkt es auf das Äußere? Unterbricht es etwas, was wir nicht kennen? Oder macht es sonst etwas? An dieser Stelle wandten wir uns natürlich einem einfachen System zu. Und das bedeutet, dass wir Liposome verwendeten. Das nächste Dia, bitte. Liposome sind Phospholipid-Bläschen, die auf verschiedene Arten erzeugt werden: durch Beschallung, Trocknen, etc. Die geformten Bläschen sind von einer einzigen Doppelschicht aus Phospholipid umhüllt. Zur Erzeugung wird direkt das Phospholipid aus der Zelle, von der Bakterie Escherichia coli, verwendet, in ungefähr demselben Verhältnis, in dem sie in der Zelle vorhanden sind, also Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerol und Cardiolipin im richtigen Verhältnis. Interessant ist, warum sie so gleichmäßig sind. Der Grund ist folgender: Mein Kollege Dr. Kayalar, der diese Arbeit mit den Liposomen ausführte, wurde bei einem Treffen gefragt, ob seine Liposome wirklich alle so schön, gleichmäßig und groß seien. Und er hatte kein Dia. Als er zurückkam, machte er viele Dias. Und wir haben jenes ausgewählt, auf dem alle recht gleich und sehr groß aussehen. Auf anderen Dias sieht man einige kleinere Liposome. Diese haben jedoch durchschnittlich einen Durchmesser von 600, 700 Millimikron. Und das kleinste hatte wahrscheinlich einen Durchmesser von 400. Sie sind also wirklich schön. Es gibt einen Grund, warum ich Ihnen das erzähle. Und diesen Grund werden wir sehen, wenn ich das letzte Dia kommentiere. Wie auch immer, es handelt sich um schöne Liposome. Wenn Sie Liposome in einer Lösung machen, die eine oder mehrere radioaktive Substanzen enthält, und dann diese Liposome durch eine Säule leiten oder durch ein Medium dialysieren, können sie die externe, radioaktive Substanz loswerden und Sie verfügen über Liposom, das mit radioaktiven Substanzen geladen ist, in einem Medium ohne solche Substanzen. Durch das Messen der Radioaktivität außerhalb des Liposoms ist es einfach, zu sehen, ob etwas herausdringt. Es ist ein bisschen schwieriger, zu sehen, ob etwas hineindringt, aber wir haben es gemacht. Auf dem nächsten Dia sehen Sie, was passiert, wenn Sie Liposome nehmen, die mit radioaktivem Rubidium oder radioaktiver Saccharose gemacht wurden, beide in derselben Lösung, und Sie Colicin hinzufügen. Sie sehen, dass das Rubidium beinahe vollständig herauskommt, denn wenn Sie das Liposom zerstören, bleibt wenig übrig. Ich kann nicht hinzeigen, ich bin nicht groß genug. Saccharose kommt zunächst langsamer heraus und dann eine Weile lang sogar noch langsamer. Der Austritt ist nicht ein einfacher Bruch oder das Bilden eines schnellen Kanals. Wenn es eine Überwachung gibt, nehmen Sie dieselben Dinge, fügen hier jedoch Valinomycin hinzu. Valinomycin schafft einen sofortigen Kanal für Rubidium oder für Kalium, die sich sofort ausgleichen. Wenn Sie jedoch K-Colicin hinzufügen, erzielen Sie dieselbe Art des langsamen Austritts. Was äußerst interessant ist, wenn wir über die natürlichen Kanäle nachdenken, ist, dass wir für jede untersuchte Substanz herausfinden, dass der durch das Colicin erzeugte Kanal eine spezifische Austrittgeschwindigkeit hat. Das bedeutet, dass der Kanal, der durch ein einziges Colicin-Molekül erzeugt wird, eine andere Leitfähigkeit hat als für Rubidium. Es stellt sich heraus, dass sie ca. halb so groß ist, wenn Sie sie für Sulfationen messen. Sie ist ähnlich für Wasserstoffionen und ähnlich der Leitfähigkeit für Sulfationen. Ungefähr ¼ für Saccharose und viel kürzer, viel niedriger, aber immer noch eindeutig für Substanzen wie Glukose-6-phosphat. Und wir können bis zu einem Polymer messen, einem Zuckerpolymer mit einem Molekulargewicht von ca. 750, und es kommt sehr langsam heraus. Wohingegen Inulin, ein Molekül mit einem Molekulargewicht von 4000 überhaupt nicht herauskommt. Und ich kann hinzufügen, dass einige der Substanzen, die wir untersucht haben, anscheinend in bestimmte Kategorien der Leitfähigkeit fallen. Die Frage ist nun, ob dies wirklich durch ein Colicin-Molekül bewirkt wird. Leider habe ich hierzu kein Dia. Wir haben uns aber bei Rubidium diese Frage gestellt, indem wir diesen Anfangsteil der Kurve für verschiedene Rubidium-Konzentrationen genommen und sehr genau gemessen haben. Dr. Celik Kayalar, der sich nun in Berkeley befindet, hat herausgefunden, dass die Abhängigkeit dieser anfänglichen Steigung von der Colicin-Konzentration genau zwischen 0,9 und 1,2 beträgt. Mit Sicherheit eine Reaktion erster Ordnung. Ein einziges Molekül formt also den Kanal. Die Frage ist, wie es den Kanal formt. Wie kommt es hinein? Hier haben wir eine Problemstellung, die sicher andere Personen in der Membranbiologie interessieren wird. Vielleicht sind einige zugegen neben den Neurophysiologen, die sich mit viel höheren Formen beschäftigen. Vor einiger Zeit hat eine Gruppe unter Albert Einstein, Dr. Finkelstein und seinen Mitarbeitern von uns etwas K-Colicin bekommen. Sie haben es in ein System mit einer künstlichen Membran der Montal-Art gebracht, in der 2 Einzelschichten aus Phospholipid aufeinander stoßen. Sie werden in 2 Becken miteinander verbunden, in die Sie Elektroden geben können. Und Sie können sie über ein Spannungs-CRM-System verbinden. Sie können die Leitfähigkeit für die Natrium- oder Kaliumionen der Kanäle, falls vorhanden, herausfinden. Und ob der Kanal sofort geöffnet oder geschlossen wird, wenn Sie Colicin hinzufügen, oder ob eine elektrische Steuerung (Gating) erforderlich ist. Das nächste Dia, das das letzte ist, zeigt diese 2 Systeme. Die Liposome befinden sich hier in Wasser. Und hier wird die künstliche Membran dadurch erzeugt, indem 2 Einzelschichten aus Phospholipid in diesem kleinen Loch gefangen werden. Und Sie haben hier ein System, dessen Polarität Sie ändern können, und einen Spannungs-CRM, den sie wiederholt messen können. Bemerkenswert ist, dass bei diesem System herausgefunden wurde, dass die Leiter für Kalium und Natrium durch dieses Ding, das durch das Hinzufügen von Colicin auf der einen oder anderen Seite geschaffen wird, bestimmt gesteuert werden. Damit das Natrium oder Kalium beginnen, durchzudringen, müssen Sie eine Potenzialdifferenz von 10 bis 20 Millivolt anlegen. Bei ca. 20 Millivolt haben Sie offene Kanäle, die zu- und wieder aufgehen. Wir haben hier also den Natriumkanal und hier den Kaliumkanal, das ist wunderbar. Als wir jedoch dasselbe Experiment mit Liposomen durchführten, stellte sich heraus, dass die durch das Colicin erstellten Kanäle überhaupt nicht gesteuert waren. Wie wir das wissen? Nun, alle Membranbiologen unter Ihnen würden das wissen. Sie brauchen nur verschiedene Kaliumkonzentrationen, etwas Valinomycin hinzufügen und Sie ändern das Membranpotenzial. So haben wir nach und nach das Membranpotenzial von minus 100 innen auf plus 100 innen geändert. Bei jedem Schritt hat das zusätzliche Colicin überhaupt keine Rolle gespielt. Das zusätzliche Colicin erzeugte weiterhin dieselben Kanal-Leitfähigkeiten wie bei allen anderen Spannungen. Hier stehen wir vor einer eigenwilligen Situation der Membranbiologie. Das ist nicht zum ersten Mal so. Die Außenmembran der Bakterienzelle, das Matrixprotein, der Kanal, wurde z. B., wie ich sagte, von 2 Labors gereinigt. Die Labors von Nakae und Nikkaido in Japan und Berkeley haben herausgefunden, dass bei Verwendung von künstlichen Membranen die Leitfähigkeit des Kanals völlig ungesteuert ist, unabhängig vom elektrischen Potenzial. Schindler und Rosenbusch in Basel haben hingegen herausgefunden, das dasselbe Protein in derselben Membran, aber in dieser Form eher als in Liposom, in dieser Lage zu einer gesteuerten Situation führt. Und dies trifft auch auf das Protein des Kanals der Außenmembran von Mitochondrien zu, obwohl dies sehr ansatzweise gemacht wurde. Hier haben wir eine Situation, in der uns die einfachste Anordnung eine sehr einfache Antwort liefert. Eine kompliziertere Anordnung liefert uns eine Antwort, die meiner Meinung nach völlig falsch ist. Bei einem ausschließlichen Fachpublikum würde ich sagen: Seien Sie vorsichtig, bevor Sie so eine Membran verwenden. Meine eigene Überzeugung wurde gestärkt, seit ich in der Mitte der 1930er Jahre mit den Experimenten begonnen habe. Wenn Sie etwas auf einfache Weise ohne Instrument erledigen können, so tun Sie das. Sie haben mehr Chancen, richtig zu liegen, als Personen mit großen, leistungsstarken Apparaten. Vielen Dank. Applaus.

Salvador Luria’s typology of membrane channels
(00:02:06 - 00:07:09)

 

The acetylcholine receptor to which Luria refers in this lecture, was of great interest for Sir Bernard Katz, too. He was a pioneer in solving the mechanisms of neuronal signaling, who was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine 1970 jointly with Ulf von Euler and Julius Axelrod. Progress in synaptic cell physiology, he states in the following snippet from the lecture he gave in Lindau in 1978, has been mainly dependent on improvements in the methods of recording electrical signals:


Sir Bernard Katz on advances in electrophysiological recording
(00:08:53 - 00:11:03)


The direct observation of single ion channels, which Katz mentions here, facilitated both basic research and drug discovery greatly. It had been enabled just two years before by the invention of the patch-clamp-technique by Erwin Neher and Bert Sakman whom Katz praises as if he already wanted to recommend them for the Nobel Prize in Physiology or Medicine, which they received in 1991. 

Katz’ co-laureate Julius Axelrod (he had - without much recognition and no financial reward – discovered the painkiller paracetamol in his younger years) pointed out that acetylcholine receptors can be either ion channels or GPCRs in his Lindau lecture from 1993:


Julius Axelrod on acetylcholine receptors
(00:17:09 - 00:18:49)

 

The surprising and fundamental discovery that reversible protein phosphorylation by kinases is one of the most widely used regulatory and signaling mechanisms of intracellular communication, was made by Edmond Fischer and Edwin Krebs who shared the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1992, already in the mid-50s. Fischer has been a regular speaker in Lindau. “I love this meeting and I wouldn't miss it for the world”, he opens this lecture from 2011, in which he introduces the ubiquity of protein phosphorylation and the large number of diseases in which it is involved: 


Edmond Fischer (2011) - Protein Cross Talk in Cell Signaling

I’m delighted to be here, to have this opportunity to speak with students, I think it’s the 9th time that I have been coming to Lindau, and I love it and I wouldn’t miss it for the world. What I decided to do today is to give you a sort of a rapid historical account of the work we carried out with my lifelong friend and colleague Ed Krebs on glycogen phosphorylase studies that led us to find reversible protein phosphorylation. Now, Ed unfortunately died a year and a half ago, and therefore I decided to introduce a couple of very small video tapes of him speaking, while the two of us were speaking about discussing our early work. The reaction we found, you’ll see it, is really embarrassingly simple and nobody would have paid much attention to it if it didn’t turn out to be absolutely crucial for the regulation of cellular processes. On the other hand, it’s fair to say that when we came out with it, it came out as a very big surprise, because in those days one knew essentially nothing about cellular regulation, and to put this in the proper context, let me tell you how things were about 55 years ago, when we got started. To begin with terms like signalling or signal transduction would not have been understood, they would have been meaningless. Secondly, while endocrinology was already well established as a discipline, it remained purely at the phenomenological level, mostly intact animal level. A few hormones were known that carried messages from one organ to another and resulted in some kind of a physiological response, for instance insulin was known as a message that controlled carbohydrate metabolism, just like adrenalin was known as this kind of message. But the action of those hormones stopped at the cell membrane and what happened next was totally unknown, it was inconceivable that the hormone could act in a cell free system until Earl Sutherland and Ted Rall came up with a stunning discovery of cyclic AMP as you heard yesterday from Ferid Murad. As a second intracellular messenger for the action of adrenalin. Secondly, science was conducted in a totally different way than it is conducted today. In those days, in fact since the days of Claude Bernard, the French physiologist who first showed the glycogenic action of the pancreas, one observed a physiological phenomenon and then one tried to detect the factors, the enzymes, hormones, responsible for it, whereas today by and large it’s the other way around. First enzyme proteins are discovered and with the completion of I don’t know how many genome sequencing projects, So, to paraphrase Pirandello, we went from 6 functions in search of an enzyme to 100’s of enzymes and protein in search of a function. And finally, as I said, one knew essentially nothing about how cells were regulated, the prevailing idea was that enzymes were regulated by the rate at which they were synthesised and then degraded. And that held until the late ‘40s, maybe early ‘50s, when people realised that this could not be the case, that this wouldn’t work because those were far too slow processes, it was clear that cells had to have ways of modulating the activity of the enzyme once they had been produced and liberated inside the cell. They had to have the capability of responding to the environment, of satisfying the metabolic needs in response to whatever internal, external signal was applied on them. And this was the big problem that faced the biologists, the biochemists in those days, and that we decided to tackle with my friend Ed Krebs. We wanted to know how an important enzyme, called glycogen phosphorylase, was regulated, in fact very important, because the Coris in St. Louis and others had shown that it catalysed the rate limiting step of carbohydrate metabolism. That is the first step in the degradation of glycogen to yield blood glucose in the liver, mind you this is probably the most important function of the liver, and then ATP, as a result of carbohydrate energy metabolism everywhere, in every tissue. Phosphorylase was an attractive enzyme to work on because it was already well-known to be under complex hormonal regulation. In the resting state it is almost inactive and very little glycogen breaks down, but the moment you need to elevate blood glucose or ATP, for instance if you are hypoglycaemic or if you exercise, it becomes instantly activated by adrenalin. And adrenalin had been shown to be released under conditions that the physiologist Cannon in the 1920’s termed actions that would prepare an animal for fight or flight when subjected in emergency situations, as depicted here. When a person finds itself in front of this menace, a stress signal is sent to the brain and the brain immediately orders the adrenal to produce adrenalin, which is then distributed in all the body's tissues of the person. And you are all aware, I’m sure, what happens when you have a shot of adrenalin or an adrenalin rush. Heartbeat accelerated, in fact it beats like crazy, blood pressure goes up, respiration increases. But if you have to fight or run away, such as depicted here, the first thing you have to do is to produce ATP in a hurry. By contrast, if the stores of glucose and ATP are high, for instance after a big meal, then the activity of phosphorylase is inhibited by the release of insulin which was known in those days to bring about a deposition of glucose into glycogen, but by a mechanism which was totally unknown until Luis Leloir from Argentina came up with his, what we call the Leloir pathway, involving glycogen synthase. And then also a third hormone, glucagon. It was known as an impurity in insulin, forgotten for many years until Christian de Duve, whom you will hear in a little while, let’s say reactivated this hormone. So anyway it was clear that glucose homeostasis was regulated by the interplay, by the opposing action of those various hormones, and therefore it was clear that phosphorylase had to play a central role in those reactions. This is a picture of Luis Leloir taken in, I think in the mid ‘60s at a meeting in Mexico City, you can see the pyramid in the back, next to this very good looking young guy. Okay. Phosphorylase, the central enzyme, was discovered I the mid ‘30’s by Parnas in Poland and Carl and Gerty Cori, husband and wife team, and when discovered it was known to be totally inactive unless adenlyic acid, AMP, was added, and AMP was thought logically to serve the function of a coenzyme. And that stood until 1943, when a gal at Cori’s lab, Arda Green, crystallised phosphorylase, but in a new form. New because it was active without any need for AMP. The Coris called that form phosphorylase A and assumed very logically that in that form AMP was linked covalently to the protein, as what we call a prosthetic group. Further they assumed that this must be the native form of the enzyme in muscle, because if muscle extracts were left standing for a little while, it was rapidly converted to the old form which they now call phosphorylase B, the form that required AMP for activity. So an absolutely logical hypothesis. But if it were correct, AMP would have had to be produced in this reaction and they found none. Furthermore, using the most sensitive biological assays available at that time, they could find no adenine, ribose or AMP in the native enzyme. So the Coris knew that phosphorylase existed in two forms, but they had no idea in which way those two forms might differ and, really strange by today’s standard, they actually dropped the problem. Well, first I want to show you pictures of Carl and Gerty Cori when they got the Nobel prize in 1947, and then a picture I took of Carl while we were walking, that was in the ‘60s, in the vicinity of Seattle, at the foot of Mount Rainier. So this is where Ed and I came into the picture, we started working on this problem when we found ourselves in the same department of biochemistry at the University of Washington in 1953. Ed had been a postdoc with the Coris, so he assumed, like they did, like most people did, that AMP was a kind of coenzyme for phosphorylase, I had done my PhD at the University of Geneva with Kurt Meyer, we had worked on various amylolytic enzymes, and among these we had isolated phosphorylase from potatoes. And it was active without any need for AMP, and even though biochemistry was in its infancy in the ‘50s, one knew enough to know that coenzymes were conserve and it seemed very unlikely that it would serve as a coenzyme for muscle protein and not for a potato enzyme, even though admittedly potatoes are pretty dump when you compare them to muscles. So we decided, well, why don’t we take a crack at this problem, try to find out what is happening. And Ed had at first some hesitations: we might start working on phosphorylase, and at that time postdocs, when they left a lab or students when they left a lab, did not work on the problem that the mentor was going on in the lab. And then I got thinking about it and five years since I was in that laboratory, certainly it may not have been permissible if we worked together. Well, I can tell you we never found out either what AMP was, we never solved that problem, for that we had to wait 8 years for Jacques Monod, Jeffrey Wyman and Jean-Pierre Changeux at the Pasteur institute to come up with a remarkable allosteric model of enzyme regulation, but what we rapidly found out is actually the enzyme was regulated by a totally different kind of mechanism. So, okay, we decided to start working on that, we cleared a corner of a bench in the lab and we started working much more like two friends than like two colleagues in a department. And the first thing we had to do is to purify phosphorylase, using the classical procedure of Cori, it was pretty archaic. It consisted in taking some rabbit muscle, grinding it, extracting it in water, putting this mess in a cheese cloth, you squeezed it, and then filtering the very turbid solution extract that came out through a huge battery of filter paper. Gerty Cori always said you have to work very, very fast, otherwise active and native phosphorylase will be degraded to the inactive B form. So they had this huge, I don’t know 15, 20 filter papers, those were really the good old days of biochemistry, in fact here’s a picture of our lab. You see Ed Kreb standing here under the top hat. So we decided, you know, enough with that jazz, let’s go modern and replace the paper filtration by a centrifugation. It’s true that no good centrifuge existed at the time of the Cori but Sorvall had came up with a large quantity refrigerated centrifuge. So we centrifuge our extracts rather than filtered them, but as fast as we could work, as cleanly as we could work, we could never obtain active phosphorylase A, only the degraded B form. So in desperation we said, you know, we have to go back to Cori’s procedure, paper filtration and all. And to our enormous surprise, this is what we found, that the very first extract coming out of the muscle was not active phosphorylase, as we had expected, but inactive phosphorylase B. And yet when that extract was filtered through filter paper, it was converted to phosphorylase A. Now let me tell you, speaking of a deception, this would be to put it mildly, you know, as two young investigators we thought we’ll discover the very sophisticated mechanism of regulation, maybe a new cofactor, what not, paper filtration to activate an enzyme... the fact that in those days all filtered papers were contaminated by trace amounts of calcium ions and the extract went through sufficient number of filtration that it picked up enough calcium to bring about the conversion. If the papers were washed with dilute acid, no conversion took place. Finally we even took a bunch of paper, we ashed them in a furnace and rather than filtering, we just sprinkled the ashes: Bingo, conversion. And then, very rapidly after that, it was clear that calcium wasn’t act alone, but that ATP was also required. So that strongly suggested that we were dealing with a phosphorylation reaction, but we didn’t know what had become phosphorylated. In those days, you didn’t have any ATP 32, you had to synthesise the damn thing yourself, but we knew that Art Kornberg, a friend of us in St. Louis, had synthesised some ATP 32 that he needed for his biosynthesis of the beautiful work on biosynthesis of DNA. So we called Art on the phone, he immediately sent us some 8 gamma-label ATP 32, we could show it was incorporated into a protein fraction which we could isolate, and it turned out to be phosphorylase. So for the first time we could propose that the regulation of phosphorylase occurred like so, inactive phosphorylase, in the presence of calcium, magnesium and ATP, was become phosphorylated and activated by an enzyme which we called phosphorylase kinase, and therefore the reverse reaction had to be catalysed by a phosphorylase phosphathase, and bingo, we sent the manuscript to the JBC… and I think there were five or six people in the country who reviewed all of the papers that were submitted to the Journal of Biological Chemistry. And I do remember that when Ed and I sent in our first paper on phosphorylase, we were aware of the fact that Carl Cori was one of the five or six editors of the Journal of Biological Chemistry. And so, when we sent in our first paper on phosphorylase, we knew that he would see it and we had faith, which was justified that he would not take advantage of seeing that paper and he didn’t. He himself was very excited by our findings. Well, by today’s standard, this reaction I just gave you would be considered totally trivial, absolutely simple. But when we came up with it in the mid ‘50s, it came up as an enormous surprise because in those days people knew just about nothing about phosphoproteins, only two had been characterised: Casein from milk, ovavitellin from egg yolk, and their only function was for the feeding of the young, and they were thought to be devoid of any biological activity and totally dismissed as nonentities. But that reaction I showed you turned out to be a little bit more complicated, as soon as we began purifying the elements of the reaction, particularly when we began purifying phosphorylase kinase and adding that as a substrate. It was clear that with the purified system calcium could not act in that reaction. And yet it was totally needed when crude extracts were used - crude extracts, where you have a lot of phosphorylase B, a lot of phosphorylase kinase or with magnesium ATP - no conversion took place unless calcium was added. And the only possibility was that phosphorylase kinase, just like phosphorylase, also existed in an inactive and active form. And that perhaps calcium might be involved for that reaction, and that turned out to be correct. In the presence of calcium ions phosphorylase kinase become phosphorylated and activated, and then it can act on phosphorylase. So we had already the beginning of a cascade of one enzyme acting on another enzyme. Note that exactly at the same time Earl Sutherland and his group, Wally Wosilait, Ted Rall had arrived to the same conclusion. Working with liver rather than muscle phosphorylase, they had shown that when liver active phosphorylase was incubated with another liver fraction, some inorganic phosphate was being produced. But an epochal finding that grew from those studies were the discovery of cyclic AMP, as I told you. And Earl was a very good friend, and Ted Rall, we met at every federation meeting, and they didn’t know how cyclic acted, they knew that it increased the amount of active phosphorylase, so they immediately sent us a sample of cyclic AMP and we could show that it acted on the activation, either, we didn’t know, either by accelerating the rate of autophosphorylation or perhaps acting on yet another kinase, for which we wanted of a better term, we called it a kinase, kinase. And that hypothesis turned out to be correct by the isolation four years later of the cyclic AMP dependent protein kinase by Ed Krebs and Don Walsh. And since by that time Sutherland’s group had elucidated the production of cyclic AMP at the membrane, the entire cascade for the degradation of glycogen was established. We were very interested in the fact that calcium was involved in that reaction, because the physiologists knew for a very long time that calcium, released as a result of a nerve impulse, could trigger muscle contraction. Our finding with people in physiology, Glenn Kerrick, that exactly the same concentration of calcium that triggered contraction, would trigger glycolysis but activating the phoskinase, phosphorylase, glycolysis, bringing about the formation of ATP needed to maintain contraction showed how two different physiological processes could be regulated in concert. At that time we had no idea whether or not this phosphorylation reaction we had observed was restricted to maybe a couple of enzyme, of a carbohydrate metabolism. We wondered, for instance, are the enzymes responsible for the regulation of nitrogen metabolism? Are they maybe regulated by amidation, deamidation, the enzymes of fat metabolism, perhaps by acetylation, deacetylation? And our luck really was that, as you well know, phosphorylation is one of the most prevalent means of cellular regulation being involved in the control of carbohydrate metabolism, gene transcription, translation, immune response, differentiation, cell cycle, etc, so that incidentally now you could replace phosphorylation by ubiquitination, and you would have exactly the same picture, I can sell that picture to you if you want. And it’s involved in a number of hereditary, bacterial, viral diseases and things like that, just it’s involved, of course, in diabetes or Alzheimer, Parkinson, chronic myelogenous leukemia, bacterial diseases such as cholera and plague, viral diseases such as smallpox, and increasingly now involved in cancer. Just as an example, the enormous virulence of Yersinia pestis, the agent responsible for bubonic plague, the “black death”, that wiped out a good proportion of the human population in centuries past, is due to the fact that the bacterium injects in the host cell a tyrosine phosphortase that immediately brings a catastrophic set of tyrosine dephosphorylation that totally wipes out the immune defence of the cell. If you delete that enzyme from the bacterium, as done by Jack Dixon, it becomes harmless, non-pathogenic. Ed and I were often asked whether or not we realised at the beginning that we had stumbled on a very ubiquitous and therefore very fundamental reaction. Absolutely not, we thought it was a nice system, we thought it was an interesting one, we stayed with it, but we never could have guessed the enormous development that occurred. In fact, in those days everybody was thinking about allostery of Jacque Monod, or the induced fits of Danny Koshland, as just mentioned a moment ago by Tom Steitz. In fact, at meetings one wondered, is this system regulated by the allosteric system of Monod or the induced fit system of Danny Koshland. And Jacque Monod, who was really a very close friend of mine, never believed for one second that covalent regulation could play a major role in cell regulation. With his death, 35 years ago, and then that of Danny Koshland, showed on the left - that was a meeting in the ‘60s, on the right you have Hans Krebs, the guy responsible for the Krebs cycle and P. P. Cohen in the middle we really have experienced the end of an extraordinary era. Thank you very much.

Ich freue mich außerordentlich bei Ihnen zu sein und mit Studenten sprechen zu können. Ich glaube, ich bin jetzt zum neunten Mal in Lindau. Ich bin überaus gerne hier, und ich würde es um nichts in der Welt verpassen wollen. Was ich heute tun möchte, ist Folgendes: Ich möchte Ihnen einen kurzen historischen Abriss der Arbeit geben, die ich zusammen mit meinem lebenslangen Freund und Kollegen Ed Krebs zur Erforschung der Glykogenphoshorylase durchgeführt habe, in deren Verlauf wir die reversible Proteinphosphorylierung entdeckt haben. Ed ist leider von anderthalb Jahren gestorben, weshalb ich einige kurze Videoaufnahmen wiedergeben möchte, auf denen er spricht. Es handelt sich dabei um Teile eines Gesprächs, in dem wir unsere frühen Arbeiten diskutieren. Wie Sie sehen werden, ist die Reaktion, die wir gefunden haben, beschämend einfach, und niemand würde ihr viel Beachtung geschenkt haben, wenn sich nicht herausgestellt hätte, dass sie für die Regulierung der Abläufe in der Zelle absolut entscheidend ist. Andererseits muss man fairerweise sagen, dass es eine große Überraschung war, als wir das Ergebnis unserer Arbeit vorstellten, weil man damals noch fast nichts über die Regulierung der Abläufe in der Zelle wusste. Lassen Sie mich Ihnen, um dies in den richtigen Kontext zu stellen, erzählen, was vor etwa 55 Jahren, als wir unsere Arbeit begannen, der Stand der Dinge war. Erstens wären Begriffe Signalisierung oder Signaltransduktion nicht verstanden worden: Sie waren noch ohne Bedeutung. Und zweitens bewegte sich die Endokrinologie, obwohl sie sich bereits als Fachgebiet etabliert hatte, auf einer rein phänomenologischen Ebene. Sie beschäftigte sich größtenteils noch mit dem Gesamtorganismus. Man kannte einige Hormone, die Informationen von einem Organ auf ein anderes übertrugen und eine Art von physiologischer Reaktion hervorriefen. So wusste man beispielsweise, dass Insulin ein Botenstoff ist, der den Kohlenhydratstoffwechsel steuert, und dass Adrenalin ein gleichartiger Botenstoff ist. Die Wirkung dieser Hormone konnte man jedoch nur bis zur Zellwand verfolgen: Was danach geschah, war völlig unbekannt. Es war unvorstellbar, dass Hormone in einem zellfreien System wirken könnten, bis Earl Sutherland und Ted Rall, wie sie gestern von Ferid Murad erfahren haben, die umwerfende Entdeckung machten, dass zyklisches AMP als zweiter intrazellulären Botenstoff für die Wirkung von Adrenalin fungiert. Zweitens wurde die Wissenschaft damals auf völlig andere Art und Weise betrieben, als dies heute der Fall ist. Seit den Zeiten von Claude Bernhard, des französischen Physiologen, der als erster die glykogenische Funktion der Bauchspeicheldrüse bewies, beobachtete man ein physiologisches Phänomen und versuchte anschließend die Faktoren Heute ist es hingegen in der Regel umgekehrt: Zuerst werden Enzymproteine entdeckt, und bei – ich weiß nicht wie vielen – Projekten zur Sequenzierung des Genoms werden Hunderte von ihnen entdeckt. Anschließend versucht man dann, durch ihre Überexpression oder indem man sie eliminiert oder hinzufügt, ihre Funktion zu entschlüsseln. Um es in Worten auszudrücken, die denen von Pirandello ähnlich sind: Wir begannen damit, für sechs Funktionen ein Enzym zu suchen, und hatten schließlich Hunderte von Enzymen und Proteine, deren Funktion wir zu entdecken versuchten. Und wie ich bereits sagte, verstand man so gut wie nichts über die Zellregulierung. Nach der vorherrschenden Auffassung wurden die Enzyme durch die Rate reguliert, mit der sie synthetisiert wurden und dann wieder zerfielen. Diese Annahme hielt sich bis in die späten 1940er Jahre und vielleicht sogar bis in die frühen 1950er Jahre, als man erkannte, dass dies nicht der Fall sein konnte. Es konnte nicht so verhalten, weil diese Prozesse zu langsam abliefen. Es war klar, dass Zellen über Mechanismen verfügen mussten, die die Aktivität der Enzyme abwandeln, nachdem sie hergestellt und im Inneren der Zelle freigesetzt worden waren. Sie mussten über die Fähigkeit verfügen, auf die Umwelt sowie auf die Anforderungen des Stoffwechsels zu reagieren, die sich aufgrund eines beliebigen inneren oder äußeres Signal ergaben, das die Zellen erhielten. Dies war das große Problem, mit dem die Biologen, die Biochemiker dieser Zeit konfrontiert waren, und zu dessen Lösung ich mit meinem Freund Ed Krebs einen Beitrag leisten wollte. Wir wollten verstehen, wie ein wichtiges Enzym namens Glykogenphosphorylase reguliert wurde. Tatsächlich war es ein sehr wichtiges Enzym, denn Coris in St. Louis und andere hatten gezeigt, dass es ein Katalysator für diejenigen Schritte des Kohlenhydratstoffwechsels war, der seine Geschwindigkeit begrenzte. Dies ist der erste Schritt des in der Leber ablaufenden Abbaus von Glykogen zur Gewinnung von Blutzucker (wahrscheinlich ist es die wichtigste Funktion der Leber) und dann zur Gewinnung von ATP, als Ergebnis des Kohlenhydratenergiestoffwechsels in jedem Gewebe des Körpers. Das Enzym Phosphorylase war ein attraktives Forschungsobjekt, denn es war bereits wohlbekannt, dass es einer komplizierten hormonalen Steuerung unterlag. Im Ruhezustand ist es fast völlig inaktiv und nur sehr wenig Glykogen wird aufgespalten. Sobald man jedoch einen höheren Blutzucker- oder ATP-Spiegel benötigt, weil man unterzuckert ist oder sich körperlich anstrengt, wird es augenblicklich durch Adrenalin aktiviert. Und von Adrenalin wusste man, dass es in Situationen freigesetzt wird, die der Physiologe Cannon in den 1920er Jahren als solche beschrieben hatte, in denen sich ein Tier zum Kampf oder zur Flucht vorbereitet, wenn es sich in Notsituationen befindet, wie hier beschrieben wurde. Wenn Sich ein Mensch in einer bedrohlichen Situation befindet, wird ein Stresssignal an das Gehirn gesendet und das Gehirn befiehlt den Nebennieren sofort, Adrenalin herzustellen, das dann in allen Geweben des Körpers verteilt wird. Und Sie wissen sicherlich alle, was geschieht, wenn Sie einen Adrenalinstoß oder –schub erhalten: Die Herzfrequenz steigt, ja das Herz schlägt wie verrückt, der Blutdruck steigt, die Atmung wird intensiver. Wenn ein Organismus jedoch kämpfen oder fliehen muss, wie es hier beschrieben ist, muss zu allererst auf die Schnelle ATP produziert werden. Sind hingegen die Glukose- und ATP-Speicher voll, wie zum Beispiel nach einer üppigen Mahlzeit, dann ist die Aktivität der Phosphorylase durch die Freisetzung von Insulin gehemmt, von dem man damals wusste, dass es zur Ablagerung von Glukose in Form von Glykogen führt, allerdings durch einen Mechanismus, der völlig unbekannt war, bis Luis Leloir aus Argentinien seinen Mechanismus vorstellte, den wir den Leloir-Stoffwechselpfad nennen und an dem Glykogensynthase beteiligt ist. Und dann auch noch ein drittes Hormon: Glykagon. Man kannte es als eine Verunreinigung von Insulin, die viele Jahre lang vergessen wurde, bis Christian de Duve, von dem Sie wenig später noch mehr hören werden, das Hormon – sagen wir reaktiviert hatte. Jedenfalls war klar, dass das Glukosegleichgewicht durch das Zusammenspiel der antagonistischen Wirkung dieser verschiedenen Hormone reguliert wurde, und daher war klar, dass die Phosphorylase eine zentrale Rolle bei diesen Reaktionen spielen musste. Dies ist ein Foto von Luis Leloir: Ich glaube es wurde in der Mitte der 1960er Jahre in Mexiko City aufgenommen. Im Hintergrund sehen Sie die Pyramide, neben diesem gutaussehenden jungen Mann. Okay. Die Phosphorylase, das zentrale Enzym, wurde Mitte der 1930er Jahre von Parnas in Polen und von Carl und Gerty Cori gefunden, einem aus einem Ehepaar bestehenden Team. Als man es entdeckte, wusste man, dass es völlig inaktiv war, wenn man keine Adenylsäure, AMP, hinzufügte, und man nahm logischerweise an, dass es die Funktion eines Koenzyms habe. Diese Annahme hielt sich bis 1943, als eine junge Frau in Coris Labor, Arda Green, Phosphorylase kristallisierte, allerdings in einer neuen Form. Es handelte sich um eine neue Form, weil sie aktiv war, ohne dass es dazu AMP bedurfte. Die Coris nannten diese Form Phosphorylase A und zogen den sehr logischen Schluss, dass AMP in dieser Form kovalent an das Protein gebunden war, als sogenannte prosthetische Gruppe. Sie nahmen ferner an, es handele sich hierbei um die native Form des Enzyms in Muskelgewebe, denn wenn man Muskelextrakte eine Weile stehen ließ, wurde es schnell wieder in die alte Form umgewandelt, die sie jetzt als Phosphorylase B bezeichneten, die Form, die zur Aktivierung AMP benötigte. Es handelte sich also um eine absolut logische Hypothese. Doch wenn sie zutraf, würde AMP bei dieser Reaktion entstehen müssen, und sie fanden keins. Außerdem konnten Sie, unter Verwendung der damals empfindlichsten biologischen Analysemethoden, im nativen Enzym keine Adenin, keine Ribose und kein AMP finden. Die Coris wussten also, dass die Phosphorylase in zwei Formen existierte, doch sie hatten keinerlei Vorstellung davon, auf welche Weise sich diese beiden Formen voneinander unterschieden, und sie gingen – was wir uns nach heutigen Standards kaum vorstellen können – dem Problem nicht weiter nach. Nun, zunächst möchte ich Ihnen Fotos von Carl und Gerty Cori bei der Entgegennahme des Nobelpreises im Jahre 1947 zeigen, und dann ein Foto, das ich von Carl gemacht habe, als wir zusammen wanderten. Es entstand Mitte der 1960er Jahre, in der Nähe von Seattle am Fuß von Mount Rainier. An diesem Punkt kamen Ed und ich ins Bild. Wir begannen diesem Problem nachzugehen, als wir 1953 in der gleichen Abteilung für Biochemie an der Universität Washington arbeiteten. Ed hatte eine Postdoc-Stelle bei den Coris. Also nahm er wie sie – und die meisten anderen Leute – an, dass AMP eine Art Koenzym der Phosphorylase sei. Ich hatte meine Doktorarbeit an der Universität Genf bei Kurt Meyer geschrieben. Wir untersuchten verschiedene amylolytische Enzyme. Unter anderem war es uns gelungen, Phosphorylase aus Kartoffeln zu isolieren, und sie war aktiv, ohne hierzu AMP zu bedürfen. Und obwohl die Biochemie in den 1950er Jahren noch in ihren Kinderschuhen steckte, reichten die Erkenntnisse aus, um zu wissen, dass Koenzyme konservativ sind. Es war daher sehr unwahrscheinlich, dass AMP als Koenzym für Muskelprotein diente, jedoch nicht für eine Kartoffelenzym, obwohl Kartoffeln, verglichen mit Muskeln, zugegebenermaßen ziemlich dumm sind. Also trafen wir die Entscheidung, uns dem Problem zu verschreiben, festzustellen, wie die Dinge sich in Wahrheit verhielten. Ed war zunächst etwas zögerlich: Tatsache war, dass ich im Labor der Coris gearbeitet hatte, und hier – nur knapp 5 Jahre später – sollten wir anfangen, über Phosphorylase zu arbeiten. Damals war es nicht üblich, dass Postdocs oder Studenten, wenn sie ein Labor verließen, über das Problem ihres Mentors arbeiteten. Doch dann dachte ich darüber nach: Es war fünf Jahre her, seit ich das Labor verlassen hatte. Sicherlich wäre es nicht zulässig gewesen, wenn wir noch Seite an Seite gearbeitet hätten. Nun ja, ich kann Ihnen sagen, dass auch wir nicht herausfanden, was AMP ist. Dieses Problem haben wir nie gelöst. Dafür mussten wir noch 8 Jahre auf Jacques Monod, Jeffrey Wyman und Jean-Pierre Changeux am Pasteur-Institut warten, die das bemerkenswerte allosterische Modell der Enzymregulation entdeckten. Doch was wir sehr bald erkannten war, dass das Enzym tatsächlich durch einen völlig anderen Mechanismus reguliert wurde. Also okay, wir entschlossen uns, über dieses Problem zu arbeiten. Wir räumten eine Ecke auf einem Labortisch frei und begannen unsere Arbeit mehr wie zwei Freunde als zwei Kollegen in einer Forschungsabteilung. Das erste, was wir tun mussten, war Folgendes: Wir mussten Phosphorylase in einer reinen Form gewinnen, unter Verwendung des klassischen Verfahrens der Coris. Es war ziemlich archaisch. Es bestand darin, dass man etwas Muskelfleisch eines Kaninchens zerkleinerte, in Wasser extrahierte, diesen Matsch in ein Stofftuch wickelte, ausquetschte und dann dieses höchst „schmutzige“ Lösungsextrakt durch eine Batterie von Filterpapier reinigte. Gerty Cori sagte immer, dass man sehr, sehr schnell arbeiten müsse, da ansonsten die aktive und native Phosphorylase zur inaktiven B-Form zerfällt. Sie hatten diese riesigen Papierfilter – ich weiß nicht mehr genau wie viele: es mögen 15 oder 20 gewesen sein. Es war die gute alte Zeit der Biochemie. Hier ist ein Foto unseres Labors. Hier sehen Sie Ed Krebs mit seinem Zylinder. Wissen Sie, wir kamen dann zu dem Entschluss: genug mit diesem ganzen Theater. Lass’ uns zu moderneren Methoden greifen und die Papierfilter durch eine Zentrifuge ersetzen. Es stimmt, dass es zur Zeit der Coris noch keine gute Zentrifuge gab, doch Sorvall hatte eine gekühlte Zentrifuge für große Volumina entwickelt. Also zentrifugierten wir unsere Extrakte statt sie zu filtern. Doch so schnell und so sauber wir auch arbeiteten: Es gelang uns nie, aktive Phosphorylase A zu gewinnen, nur die degradierte B-Form. Verzweifelt sagten wir uns: Wir müssen wieder zum Verfahren der Coris zurückkehren, zur Papierfilterung und allem, was damit zusammenhing. Und zu unserer riesigen Überraschung fanden wir Folgendes heraus: Das erste Muskelextrakt enthielt keine aktive Phosphorylase, wie wir vermutet hatten, sondern inaktive Phosphorylase der B-Form. Und dennoch wurde sie, wenn das Extrakt durch das Papier gefiltert wurde, in Phosphorylase A umgewandelt. Ich will Ihnen sagen: Selbsttäuschung wäre untertrieben. Als zwei junge Forscher glaubten wir, wir würden den höchst komplizierten Mechanismus der Regulation entdecken, vielleicht einen neuen Kofaktor, was auch immer: Papierfilterung zur Aktivierung eines Enzyms... Doch bald zeigte sich, dass es nicht die Filterung war, die zur Aktivierung führte, sondern die Tatsache, dass damals alle Filterpapiere mit Spuren von Kalziumionen verunreinigt waren, und das Extrakt passierte genug Filter, dass es genug Kalzium aufnahm, um die Umwandlung herbeizuführen. Wenn die Filterpapiere mit verdünnter Säure gewaschen wurden, kam es zu keiner Umwandlung. Zum Schluss nahmen wir sogar einiges Filterpapier, verbrannten es in einem Ofen, und statt das Extrakt zu filtern, streuten wir einfach etwas Asche darauf. Und siehe: Es kam zu einer Umwandlung. Und es dauerte nicht lange, bis klar wurde, dass Kalzium nicht alleine wirksam war, sondern dass ATP ebenfalls erforderlich war. Dies deutete stark darauf hin, dass wir es mit einer Phosphorylierungsreaktion zu tun hatten, doch wir wussten nicht, das phosphoryliert worden war. Wir hatten damals noch kein ATP 32, sodass man das verdammte Zeug selbst synthetisieren musste. Doch wir wussten, dass Art Kornberg, ein Freund von uns in St. Louis, etwas ATP 32 synthetisiert hatte, das er für seine Biosynthese benötigte, für seine wunderbaren Arbeiten zur Biosynthese der DNA. Wir riefen also Art an, und er schickte uns sogleich etwas gamma-label ATP 32. Es gelang uns zu zeigen, dass es in einen Proteinanteil integriert wurde, den wir isolieren konnten, und er stellte sich als Phosphorylase heraus. Wir konnten daher erstmals vorschlagen, dass die Regulierung der Phosphorylase auf folgende Weise geschieht: Inaktive Phosphorylase wurde in Gegenwart von Kalzium, Magnesium und ATP phosphoryliert und durch ein Enzym aktiviert, das wir als Kinase der Phosphorylase-Kinase bezeichneten. Die Umkehrreaktion musste daher durch eine Phosphorylase-Phosphathase katalysiert werden. Es war ein Volltreffer, und wir schickten das Manuskript an das JBC (Journal of Biological Chemistry) Ich weiß, dass der Redaktionsrat des Journal of Biological Chemistry für unsere ersten Erfahrungen sehr klein war, und ich glaube, es gab fünf oder sechs Leute im Land, die alle Artikel begutachteten, die dem Journal of Biological Chemistry eingereicht wurden. Und ich erinnere mich daran, dass Ed und ich uns bewusst waren, als wir unseren ersten Aufsatz über Phosphorylase eingereicht hatten, dass Carl Cori einer der fünf oder sechs Gutachter des Journal of Biological Chemistry war. Und als wir also unseren ersten Aufsatz über Phosphorylase eingereicht hatten, wussten wir, dass er ihn lesen würde und wir vertrauten darauf – zu Recht, wie sich zeigen sollte –, dass er sich die Kenntnis unseres Aufsatzes nicht zunutze machen würde, und er tat es nicht. Er selbst fand unsere Entdeckung äußerst faszinierend. Nun, nach heutigen Maßstäben würde man die Reaktion, die ich Ihnen beschreiben habe, völlig trivial finde, absolut einfach. Doch als wir damit in der Mitte der 1950er Jahre hervortraten, war es eine riesige Überraschung, da man damals so gut wie nichts über Phosphoproteine wusste. Nur zwei hatte man beschrieben: Casein aus der Milch und Ovavitellin aus dem Eigelb, und ihre einzige Funktion war die eines Nährstoffs für Jungtiere. Man dachte nicht, dass sie irgendeine biologische Funktion haben und missachtete sie als belanglos. Doch sobald wir ihre Elemente in reiner Form gewannen, erwies sich diese Reaktion, die ich Ihnen gezeigt habe, als etwas komplizierter, besonders als wir begannen, reine Formen der Phosphorylase-Kinase zu gewinnen und sie als Substrat hinzuzufügen. Es war klar, dass in dem gereinigten System Kalzium an dieser Reaktion nicht beteiligt sein konnte. Und dennoch war es unerlässlich, wenn man noch ungereinigte Extrakte verwendete – ungereinigte Extrakte, in denen sehr viel Phosphorylase B, sehr viel Phosphorylase-Kinase mit oder ohne Magnesium ATP vorhanden war. Wenn man kein Kalzium hinzufügte, fand keine Unwandlung statt. Die einzig mögliche Antwort auf dieses Problem war, dass auch die Phosphorylase-Kinase, genauso wie die Phosphorylase, in einer inaktiven und einer aktiven Form existiert, und dass Kalzium möglicherweise an dieser Reaktion beteiligt war. Diese Hypothese erwies sich als zutreffend. In Gegenwart von Kalziumionen wurde Phosphorylase-Kinase phosphoryliert und aktiviert, und dann konnte sie auf die Phosphorylase einwirken. Somit hatten wir den Beginn einer Kettenreaktion eines Enzyms, das auf ein anderes einwirkt. Beachten Sie, dass genau zur gleichen Zeit Earl Sutherland und seine Arbeitsgruppe, Wally Wosilait, Ted Rall, zur selben Schlussfolgerung gelangt waren. Sie arbeiteten mit Phosphorylase aus der Leber statt aus Muskelgewebe. Sie konnten Folgendes zeigen: Wenn man aktive Leber-Phosphorylase mit einem anderen Leberextraktanteil inkubierte, entstanden einige anorganische Phosphate. Doch eine epochale Entdeckung, die aus diesen Studien hervorging, war die Entdeckung von zyklischem AMP, wie ich Ihnen bereits sagte. Und Earl war ein sehr guter Freund, ebenso Ted Rall. Wir begegneten uns auf jedem Treffen des Verbandes. Sie wussten nicht, wie das zyklische AMP reagierte. Sie wussten [nur], dass es die Menge der aktiven Phosphorylase vergrößerte. Sie schickten uns sogleich eine Probe des zyklischen AMP und wir konnten zeigen, dass es eine Rolle bei der Aktivierung spielte: entweder – wir wussten es nicht – indem es die Rate der Autophosphorylierung erhöhte, oder vielleicht indem es auf noch eine weitere Kinase einwirkte, die wir in Ermangelung eines besseren Namens als „Kinase-Kinase“ bezeichneten. Vier Jahre später erwies sich diese Hypothese durch die Isolierung der von zyklischem AMP abhängigen Proteinkinase durch Ed Krebs und Don Walsh als korrekt. Und da zum damaligen Zeitpunkt Sutherlands Arbeitsgruppe die Synthese von zyklischem AMP an der Zellmembran aufgeklärt hatte, war die gesamte Kettenreaktion zum Abbau von Glykogen erforscht. Es interessierte uns sehr, dass Kalzium an der Reaktion beteiligt war, denn die Physiologen wussten seit sehr langer Zeit, dass Kalzium, wenn es als Ergebnis eines Nervenimpulses freigesetzt wurde, eine Muskelkontraktion auslösen konnte. Unsere Entdeckung mit Leuten aus der Physiologie, Glenn Kerrick, dass genau dieselbe Konzentration von Kalzium, die zu einer Kontraktion führt, die Glykolyse auslöste, indem sie die Phosphokinase, die Phosphorylase und die Glykolysis aktivierte und auf diese Weise zur Bildung des ATP führte, das zur Aufrechterhaltung der Kontraktion benötigt wurde, zeigte, wie zwei verschiedene physiologische Prozesse gemeinsam reguliert werden konnten. Zum damaligen Zeitpunkt hatten wir keine Vorstellung davon, ob diese von uns beobachtete Phosphorylierungsreaktion vielleicht nur auf ein paar Enzyme eines Kohlenhydratstoffwechselprozesses beschränkt war. So fragten wir uns beispielsweise, ob die Enzyme für die Regulierung des Stickstoffstoffwechsels verantwortlich sind. Werden sie vielleicht durch Amidierung, Deamidierung, die Enzyme des Fettstoffwechsels, vielleicht durch Acetylierung oder Deacetylierung gesteuert? Und unser Glück bestand darin, dass – wie Sie genau wissen – die Phosphorylierung einer der häufigsten Mechanismen der Steuerung der Abläufe in der Zelle ist. Sie ist beteiligt an der Steuerung des Kohlenhydratstoffwechsels, der Gentranskription, der Gentranslation, der Immunreaktion, der Differenzierung, dem Zellzyklus etc., sodass man – nebenbei gesagt – statt von Phosphorylierung von Ubiquitinierung reden könnte. Und man würde genau das gleiche Bild erhalten. Wenn Sie möchten, kann ich Ihnen dieses Bild verkaufen. Außerdem ist die Phosphorylierung an einer Reihe von Erbkrankheiten sowie an bakteriellen und viralen Erkrankungen und ähnlichen Phänomenen beteiligt, ebenso wie sie natürlich bei Diabetes, Alzheimer, Parkinson, chronischer myelogener Leukämie, Bakterieninfektionen wie Cholera und der Pest und bei Virenerkrankungen wie den Pocken eine Rolle spielt. Man erkennt auch immer deutlicher, welche Bedeutung ihr bei Krebs zukommt. Um nur ein [weiteres] Beispiel zu nennen: Die ungeheure Virulenz von Yersinia pestis, dem Erreger der Beulenpest bzw. des „Schwarzen Todes“, dem in vergangenen Jahrhunderten ein Großteil der Menschen zum Opfer fiel, beruht darauf, dass das Bakterium ein Tyrosinphosphat in die Wirtszellen injiziert, das augenblicklich zu einer Reihe katastrophaler Tyrosindephosphorylierungen führt, die die Immunabwehr der Zelle vollständig zerstören. Wenn man dieses Enzym aus dem Bakterium entfernt, wird es vollkommen harmlos und löst keine Krankheit mehr aus, wie Jack Dixon gezeigt hat. Ed und ich wurden oft gefragt, ob uns zu Beginn unserer Arbeit klar war, dass wir eine allgegenwärtige und daher äußerst grundlegende Reaktion gefunden hatten. Ganz und gar nicht: Wir dachten, es sei ein elegantes System, wir hielten es für interessant, wie arbeiteten weiter darüber, doch wir hätten die enorme Entwicklung, die dann stattfand, niemals vorausahnen könne. Tatsächlich standen damals im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit der meisten Leute die von Jacques Monod entdeckten allosterischen Effekte oder die induzierte Anpassung [„induced fit“] von Danny Koshland, die vorhin von Tom Seitz erwähnt wurden. Ja, bei Konferenzen fragte man sich, ob dieses System durch das allosterische System von Monod oder die induzierte Anpassung von Danny Koshland gesteuert wurde. Und Jacques Monod, mit dem ich wirklich eng befreundet war, glaubte keinen Augenblick, dass eine kovalente Regulierung eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Zellabläufe spielen könnte. Mit seinem Tod vor 35 Jahren und dann dem Tod von Danny Koshland, der hier links zu sehen ist und P. P. Cohen in der Mitte – mit Dannys Tod vor 5 Jahren und dann jetzt mit dem von Ed Krebs vor nur 2 Jahren haben wir das Ende einer wirklich außergewöhnlichen Ära erlebt. Ich danke Ihnen sehr.

Edmond Fischer on the ubiquity of protein phosphorylation
(00:25:06 - 00:26:42)

 

The identification of nitric oxide as a messenger molecule, which is involved in the regulation of a large number of biological processes, has unraveled novel molecular targets and spurs on drug discovery and development not only in the field of cardiovascular diseases. For good reason, as Ferid Murad shows in his Lindau lecture from 2007, “the nitric oxide field is gone absolutely bananas” – from Murad’s first paper in 1977 to 82,000 publications thirty years later:


Ferid Murad (2007) - Nitric oxide as a messenger molecule and its role in drug development

So after this wonderful start of the meeting, we heard about the Big Bang, and I think the following talk also can be considered that it has been a Big Bang in biomedicine. That was the discovery of nitric oxide. It’s a great pleasure to ask Professor Ferid Murad from Houston, Texas to give his lecture to us here. He won the Nobel Prize in physiology and medicine in 1998. And it was listed for the discoveries concerning nitric oxide as a signalling molecule in the cardiovascular system. Professor Murad. This is my first visit to Lindau. It looks like a very exciting opportunity for the speakers as well as the students and I’m going to enjoy the week, I can assure you. Shortly after the Nobel Prize was announced, my office received numerous phone calls from the local schools in Houston, the high schools, the colleges, asking me to give lectures and meet students and I did that. But the requests really got to be enormous and I couldn’t keep up with it. So I went to the audiovisual television department in the Texas Medical Center and asked if they would help me put a video together. So this morning is going to be movies and films. This department is really an excellent department. They prepare tapes and videos for patients, how do they manage their ileostomy bags, how do they manage their renal shunts for dialysis and so forth. So we got together and put a dialogue together, we exchanged a lot of information back and forth and finally one Saturday morning they showed up at my home and we prepared this video and I think you’ll enjoy it. Now, it was prepared for teenagers but I’ve shown it to 4 year olds, 85 year olds and everybody seems to enjoy it because it’s science in lay language that all of you should understand. So let’s start with the video. Girl 1: Gosh, what’s with all the awards shows? TV: And the winner is... Congratulations. And now I ask you to step forward and receive your Nobel Prize. Girl 1: Nobel Prize? What is that? Girl 2: Beats me. Prof. Dr. Ferid Murad: What? You don’t know what the Nobel Prize is? We have to do something about that. Girl 1: Wow! Girl 2: What’s up with this? Boy: Hey, you’re just coming out of the TV! It’s like aliens. Prof. Dr. Ferid Murad: May I? Girl 1: Yeah sure, why not? So, what’s your story? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, my name is Ferid Murad. You can call me Fred. I’m a doctor and researcher and a scientist at the University Of Texas Medical School. And, oh, by the way I got the “Nobel Prize” in medicine in 1998. Girl 2: So, what is that “Nobel Prize” anyway? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, the Nobel Prize is one of the greatest awards you can get in the world. Boy: Aha... Prof. Dr. Ferid Murad: It’s recognition from other scientists. Girl 2: So? Prof. Dr. Ferid Murad: Hmm. Well, you get to be on TV all over the world. There’s a big party in Sweden. You even get to meet the King and Queen of Sweden. You get a gold medal. Then of course there is the money. Boy: Money? Girl 1: Party? Girl 2: Royalty? Prof. Dr. Ferid Murad: Yeah. Maybe it would be better if I showed you. May I? Girl 1: Mmm...sure. Prof. Dr. Ferid Murad: Thanks. Scientist on TV: Thanks, Fred. Welcome to my world of science and my laboratory. You know, the Nobel Prize wouldn’t even be around if it wasn’t for...dynamite. Anyway. Alfred Nobel, the Swedish inventor and businessman who invented the Nobel Prizes, was the guy who invented dynamite. Nitro-glycerine is the explosive chemical in dynamite. And even though it was very dangerous, Mr. Nobel figured out a way to contain nitro-glycerine so that it could be put to good use like to build stuff. You could say his discovery rocked the world. But nitro-glycerine has other uses. When Nobel started having heart problems, his doctor actually prescribed nitro-glycerine for his heart. But Nobel said: “No way.” So he blew it. Nobody knew why it worked. But it did. and he shared the 1998 Nobel Prize in Medicine with Dr. Robert Furchgott and Dr. Luis Ignarro for figuring it out. Boy: So you’re the dude that figured out why nitro-glycerine helps peoples’ hearts? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, yeah. Girl 2: So? Prof. Dr. Ferid Murad: So what? Girl 2: So why does it work? Prof. Dr. Ferid Murad: We were trying to answer the question to how nitro-glycerine works to help with chest pain. I did experiment, observed the results and collected data. Then I found out if what I thought was right or wrong. Anyway, what I did find was that nitro-glycerine releases nitric oxide and that nitric oxide does a lot of important stuff in the body. Girl 1: So, what is nitric oxide? And what exactly did you figure out that got you this “Nobel Prize”? Prof. Dr. Ferid Murad: Let me show you. Announcer on TV: It protects the heart. It stimulates the brain. It kills bacteria. And it’s a real gas. It’s nitric oxide. No one can say no to NO. Nitric oxide or NO is a simple molecule with two adapts, nitrogen and oxygen. And yes, it’s a colourless, odourless gas. A scientific sensation sweeps the globe. Nitric oxide is everywhere. It’s coming in toxic pollution depletes the ozone layer. It’s even found in car exhaust and cigarette smoke. But from super-menace to superhero. Nitric oxide is also found inside the human body and it helps send very important messages which are not from our sponsors. When blood flows through your blood vessels, the inner lining or endothelium releases nitric oxide. The nitric oxide signals your blood vessel to relax and widen. So what? This in turn lowers blood pressure, the force which the blood exerts on the vessel walls. If your blood vessels make enough nitric oxide, this signals your blood vessel to relax. Then your blood flows on through. No problem. But if blood doesn’t flow through, blood plugs forks. Then... (heart attack). And that’s not all! Scientist on TV: So relaxed blood vessels allow more blood to flow and nitric oxide can have an impact on all different parts of the body. For example, nitric oxide is already saving the lives of babies who are born too early by breathing in very small doses of this gas. It helps their lungs and improves their breathing. And that’s good! In nerve cells nitric oxide can stimulate the brain affecting things like behaviour. Oh behave, baby! As part of the body’s self-defence system nitric oxide defends against tumour cells and bacteria too. It’s amazing stuff. But nitric oxide is no laughing matter and not to be confused with nitrous oxide, better known as laughing gas. Ha-ha... somebody turn of that gas. Boy: So how do you think of all that anyway? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, over time I became very interested in how cells talk to each other. But most other scientists didn’t think that was very important. Scientist on TV: Dr. Murad figured out that when cells talk to each other, it’s like one cell sends an e-mail to another cell somewhere in the body. And the e-mail is the gas nitric oxide. The e-mail can break into another cell and take over how the cell works. It may contain a message like instructions for a blood vessel to relax. Or it may contain some other kind of instructions. For example, if the message is being sent to a cancer cell, the nitric oxide may kill the cancer and then self-destruct. Hasta la vista, baby. Nitric oxide in your body affects so many things. It’s like having a worldwide internet system inside your own body. Girl 1: So why did you go into science in the first place? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, it’s really a lot of fun to figure out how stuff like this works. And you don’t have to be brilliant to get ahead. You just have to have some goals and be prepared to work very hard. Scientist on TV: As a scientist you get to do something for the first time that nobody else has ever done. And that’s exciting! Sometimes your discovery opens the door to a whole new way of thinking and even more new discoveries. It is really cool! It’s kind of like the “Science Olympics” and the goal is the Nobel Prize. Teams of scientists from around the world compete with each other. It’s fun. Who’s going to finish first? Who’s going to win the prize? Prof. Dr. Ferid Murad: One of you could be a Nobel Prize winner someday. Who knows? Boy: Hey! I have some more questions. Girl 2: Yeah, me too. Girl 1: Well, I guess we have to find out more on our own. Girl 2: Maybe we could check the internet. Boy: Yeah, and look out for science and the Nobel Prize. Prof. Dr. Ferid Murad: They’re gone and they left some popcorn, didn’t they? Yum! I was very fortunate in that I was one of the first MD PhD students in the United States when the program began in Cleveland and I decided that that’s what I wanted to do somehow. I wasn’t sure how I made that decision. I was excited about chemistry and biology. I guess I was confused more than anything else. And said I’m going to try both and see which way to go and I got hooked and I’ve always straddled the fence the rest of my life. My mentors were Earl Sutherland and Ted Rall. They had just discovered cyclic AMP a year before I joined their laboratory. And what an exciting time this was for a young student. My assignment was to figure out how catecholamines, adrenalin regulates cyclic AMP production in tissues and whether it works through the beta adrenergic receptor or the alpha receptor. And that was a pretty straightforward and actually simple assignment. But to see this whole era of cell signalling and messengers evolve was a remarkably exciting time. To see all the hormones that work through these pathways and all the drugs that were evolving that I became hooked on second messenger systems and cell communication. Cell communication is really an old concept, probably first introduced by Pavlov more than 100 years ago. As you recall from your psychology classes Pavlov had a patient with a gunshot wound to his abdomen who developed a gastric fistula to the exterior. And whenever the patient would see or smell food, he would enhance his gastric secretions. Well, Pavlov was clever enough that he developed pouches and fistulas in dogs and showed them food and they too would enhance their gastric secretions. But he decided to condition these dogs by ringing a bell. And ultimately all he had to do was ring a bell and they would enhance their secretion without having to show them food. That told him that the brain was talking to the stomach, cells communicate with each other. Of course we know today that lots of cells and tissues in the body communicate with each other. And this is summarised for you in this cartoon, in this first slide. This represents three different populations of cells that are going to talk to each other. They can be any cells but I’m going to call cell 1 a neuronal cell. It can be a central neuron or a peripheral neuron. Cell 2 I will call an endothelial cell lining a blood vessel and cell 3 a smooth muscle cell in the wall of that blood vessel. Cell 1 wants to talk to cell 2 and also cell 3. And it does it by producing molecules that Earl Sutherland called first messengers. Today we call them hormones, we call them cytokines, we call them growth factors, we call them a variety of things, paracrine substances, autacoids etc. They come in different shapes and sizes and flavours. Some are small amino acids; some are large proteins like the cardiac troponins. The point is they’re released into the interstitial space in the blood stream and they home the body to find its target. It identifies its target cell by the presence in their membrane of a macromolecule that we call a receptor. Sometimes these receptors are inside of the cell, as with steroids and thyroid hormone, but most often they’re transmembrane proteins, integral membrane proteins in the membrane surface. These ligands or first messengers interact with their appropriate cells that only possess those receptors. That’s where the specificity of the reaction occurs. They fit together conformationally, like a key in a lock. And they then only perturb the cells that have the appropriate receptor. The ligand doesn’t necessarily have to enter inside of the cell to cause the cascade of biochemistry to result in some physiologic response. They can just interact with the receptor, it tweaks it and then all of a sudden, voila, there are lots of different intracellular second messengers that accumulate. The first such second messenger was cyclic AMP. What Sutherland and Rall discovered: This is how glucagon and epinephrine regulated glycogen degradation in the liver. We know today that lots of pathways utilise that messenger. We also know that there are other second messengers besides cyclic AMP: cyclic GMP, calcium, diacylglycerol, nitric oxide. And while there are hundreds and hundreds of first messengers, there are a modest number of intracellular second messengers. Perhaps no more than a dozen at present but there will be more, I’m sure, in the future. These second messengers accumulate and carry out the function within the cell that was brought by this first messenger to the cell surface. What is unique about nitric oxide as an intracellular second messenger is that it’s a gas. It’s a free radical with an unshared electron and a very simple molecule. And because it’s uncharged, the physiologic pH, like all the other messengers, it doesn’t go in and out of membranes... it goes in and out of membranes much more readily than the other messengers that often require energy or transporters to do that. So it not only regulates the biochemistry in the cell in which it’s made, nitric oxide, but it can come out and travel a couple of hundred Angstrom, microns, to regulate adjacent cells to produce other second messengers such as cyclic GMP. So it’s a very unique messenger molecule. It’s the only messenger I’m aware of that functions both intracellularly as well as extracellularly. It can be a paracrine substance, a local autacoid. It can also bind with other carriers, glutathione, thiols, albumen, other proteins and be transported a distance to be released again and function therefore as a hormone. No other messengers can do that. Nitric oxide is a very old molecule and I have a theory that it participated also in evolution. It was probably one of the first messenger molecules 3 billion years ago, as cells began to communicate with each other. But I won’t get into that story because time doesn’t permit. But today we know that it’s very important as a pollutant. And this is when it became popular about 50 or 60 years ago when it was apparent that all fossil fuels when combusted with oxygen produced a family of nitrogen oxides, NO, NO2, N2O3 etc. All of these nitrogen oxides will interact with ozone and deplete the ozone layer and are responsible for global warming along with the greenhouse gases. But I’m going to tell you that not only is the nitric oxide a pollutant but it’s the mechanism of action of some very important cardiovascular drugs and it’s a very important messenger molecule in the body. And this is just a partial list of the biology that it regulates. And the list is much, much longer than this. It includes muscle relaxation, platelet aggregation, penile erection, killing of parasites and microorganisms and the list goes on and on. We’ll come back to some of that shortly. In 1963, 7 years after the discovery or 6 years after the discovery of cyclic AMP, a couple of chemists discovered for the first time cyclic GMP, another cyclic nucleotide, a cousin of cyclic AMP. All you do is shift the amino group on the purine ring and you have a different structure. They administered inorganic P32 phosphate to rats, harvested the urine and found two major organic phosphates in urine, cyclic AMP, the other being cyclic GMP. That was the first demonstration of cyclic GMP as a natural product. That stimulated a few laboratories to become interested in cyclic GMP, to look for enzymes that made it, enzymes that hydrolysed it etc. And the story began to evolve in the late 1960s, early 1970s just as I was finishing my training and getting ready to join the faculty at the University of Virginia. We know today that there is a family of enzymes called guanylyl cyclases and there are at least seven or eight members of this family and we think there will be even more with splice variants that we’re now isolating. All of these enzymes convert GTP to cyclic GMP and pyrophosphate. The reaction is very analogous to add an OH cyclase that converts ATP to cyclic AMP and pyrophosphate. In fact the catalytic domains of all of the cyclases are homologous with the change of one or two amino acids, one enzyme can make the other nucleotide. The cyclic GMP can be inactivated by a family of phosphodiesterases; there are at least 10 or 11 members in this gene family. And they hydrolyse the phosphodiester bond to convert the cyclic nucleotide to the corresponding monophosphate, either 5’ GMP or 5’ AMP and it becomes inactive. As you will hear later in the week from Doctor Fischer, many of the intracellular second messengers, cyclic AMP, cyclic GMP, diacylglycerol, calcium etc., often activate a protein kinase that then phosphorylates a variety of protein substrates by transferring the gamma phosphate from ATP to a serine-threonine residue or perhaps a tyrosine residue. There are I’m told now as many as 500 or 600 protein kinases. So while the concept of cell communication is pretty simple, a ligand or hormone regulates the second messenger production which then regulates the protein kinase which phosphorylates a protein, the problem is the matrix gets pretty hairy when you consider all the cyclases, the diastasis, the protein kinases and the numerous proteins that can be phosphorylated. When these proteins are phosphorylated, as you’ll hear from Doctor Fischer, their conformation changes. If they’re structural proteins they can influence motility and other processes, contractility. If they’re enzymes they can be activated or inhibited. So as this story was beginning to unfold with cyclic GMP, I decided to desert cyclic AMP and switch my interest to cyclic GMP. As a new young faculty member in the early 1970’s the cyclic AMP field in my opinion was becoming rather crowded, large groups of people around the world. And I didn’t think that I could compete with all these huge laboratories and cyclic GMP was evolving and I said I’m going to go in this new direction. And I wanted to address two questions. We knew that a couple of hormones could increase cyclic GMP accumulation in a couple of tissues, acetylcholine in heart preparations, prostaglandins in vascular preparations. But we didn’t know the molecular coupling mechanism. If we understood ligand binding to the receptor and the coupling to the guanylyl cyclase to make cyclic GMP, we could presumably influence that coupling process with various chemicals and drugs to potentiate a hormone response or block it and maybe come up with some novel therapies for various endocrine diseases. That was quite rational. The second is, although cyclic GMP was a natural product, we had no idea what it did or what its function was. So we began our studies by looking at the enzyme in some detail that made cyclic GMP and the first big surprise was that there wasn’t just a single enzyme but a couple of enzymes. The enzyme activity was in soluble fractions as well as particulate fractions. The kinetic properties of this isoforms was different. I suspected there would be isoforms. I had thought to myself: If there are different compartments and isoforms of guanylyl cyclase, perhaps they’re regulated by different groups of hormones, wouldn’t that be a fun project to sort out. And a lot of that all turned out to be true intuition at the time. Well, to prove that we were dealing with isoforms was going to take a lot of work. We had to purify these soluble particulate activities, clone them, express them, restudy them. We did that, it took us 12 or 15 years of work to do all that. But initially I took a shortcut. I said the cooperativity of the particulate isoform, whereas the typical Michaelis-Menten kinetics of the soluble could be artifactual because these were crude preparations that possessed nucleotidases, phosphatases, phosphodiesterases. So we created a cocktail and added it to our incubations to inhibit all these competing pathways. We made a cocktail pyrophosphate, fluoride, azide, hydroxylamine, sodium nitrite, methylxanthines etc. And quite accidentally, as science often is the case, we found compounds that activated the enzyme. While our goal was to figure out hormonal regulation, we couldn’t do that because once we disrupted tissues, the hormone coupling was lost. Hormones no longer activated extracts of the enzyme. But the small molecules now would activate and maybe they could be our surrogates for understanding hormonal regulation. Much as fluoride was a valuable resource for understanding hormonal regulation of adenylate cyclase. The activators were azide, hydroxylamine and sodium nitrite. And to make a long story short, the effects of the azide were oxygen dependent, enhanced with thiols, had a time lag before the rate of the reaction became maximal. They were tissue specific because tissues possessed inhibitors and activators of the pathway. And we were convinced that these activators were precursors or prodrugs being converted to something else in our incubation. And it became quite a mystery story for several years to figure out what that activator was going to be. We put azide and hydroxylamine and nitrite on cell cultures in tissues. And indeed they would elevate cyclic GMP levels and would also activate the enzyme and extracts. So they would work in both systems. One of the tissues, again fortunately, that we were working with was tracheal smooth muscle. As a student I knew that cyclic AMP relaxed smooth muscle, vascular and airway smooth muscle. And I thought cyclic GMP might antagonise cyclic AMP. So we prepared a smooth muscle preparation that was relatively homogenous in order to do some biochemistry and compare it with a physiologer. We put azide on those smooth muscle preparations, the cyclic GMP levels went up, but the muscle didn’t contract, it relaxed. The opposite of what we expected. The dose response curves, the time courses, everything told us that azide was a smooth muscle relaxant, mediating its effects through cyclic GMP and that’s how it worked. And that was the first physiologic function of cyclic GMP. We said: If these drugs cause relaxation and elevate G, what do the other smooth muscle relaxants do? Nitro-glycerine, which had been around for 100 years, nitroprusside? A lot of popular drugs in the cardiovascular intensive care units. They decreased after load, lowered blood pressure in patients with infarction and so forth. We put them on our preparations, they relaxed as expected. The surprise was that they elevated cyclic GMP levels. So now we had a family of compounds that we called nitrovasodilators that were capable of activating guanine cyclase in cell free preparations and elevating cyclic GMP levels in various tissues. These compounds included hydroxylamine, azide, sodium nitrite, some hydrazines, nitro-glycerine, nitroprusside, nitrosoureas, nitrosamines and a long list of other compounds, all NO donors. They all have nitrogen. Some are converted spontaneously based on redox and pH incubations. Some are converted insomatically, azide requires catalase conversion. And we reasoned that the intermediate for all of these prodrugs or precursors had to be nitric oxide. And the reason we thought it was nitric oxide is because azide’s tissue specificity was in part influenced by the presence of haemoglobin and myoglobin in our tissue extracts. These were inhibitors. We knew from the literature that NO had a very high affinity for the heme prosthetic group of haemoglobin, myoglobin. So we reasoned that all of these prodrugs or precursors were converted to nitric oxide. When we generated nitric oxide in the fume hood chemically, sodium nitrite, ferrous sulphate, sulphuric acid, ventilated the gas into our incubations, every preparation was activated. What an exciting period that was. The first demonstration that a free radical could activate an enzyme. And I thought that would be interesting chemistry. Lots of folks were sceptical. They all thought of free radicals and the nitric oxides as pollutants and toxic materials and sure enough it activated. Some people argued: Murad, you’re inhibiting an inhibitor, you’re disinhibiting in your crude preparations. So we were obliged to purify the enzyme to homogeneity and when we did the concentration the nitric oxide required to activate kept becoming lower, lower, lower as we moved scavengers and sinks from our incubation. Transition metals, thiols, proteins and sucked it up, you know. Nanomolar concentrations of NO would activate the enzyme and the Vmax would increase 200- to 400-fold, as it would lower the Km for GTP. So we realised that we had figured out the mechanism of action of the nitrovasodilators, such as nitro-glycerine that had been used clinically for 100 years. As a pharmacologist, when you find an exogenous material that does something in a biological system, you should ask yourself: Is it mimicking a natural pathway that’s already there? And is it working through a similar mechanism? So I proposed in some review articles in the late ‘70s that perhaps the effects of various hormones to increase cyclic GMP levels were because they were increasing the production of nitric oxide from some endogenous precursor, perhaps by altering some redox pathway. We couldn’t prove that hypothesis because the technology was not there to measure nitric oxide in its oxidation products at animals or concentrations back in the 70’s. There were crude colorimetric assays. So to prove this took another seven or eight years of technology development before we and others were able to prove that it turned out to be the case. But we expected that nitric oxide was going to be an intracellular second messenger and that was heresy. And it was enough to show that it activates... a free radical activates an enzyme, now you're saying a free radical is a second messenger and it turned out to be true, we turned out to be right. And basically that’s the reason we went to Stockholm. Shortly after this Robert Furchgott, a vascular pharmacologist in New York, showed for the first time that a group of agents would relax vascular segments in the organ bath in the laboratory. Agents such as acetylcholine, histamine, bradykinin that were known to be hypotensive in man or animals had always failed to cause relaxation in the laboratory. He found, if he preserved the integrity of the endothelium in his blood vessel preparations, they would cause relaxation. And that was an exciting turn of events in 1980. I heard him present this work, he said that these substances caused the release of a factor from the endothelium which he called endothelium-derived relaxant factor, or EDRF, and had a half-life of only several seconds. I said: Bob, this is a reactive species, maybe a free radical, maybe it works in cyclic G, maybe it’s going to be related somehow to NO. Let’s figure this out. Well, we moved to Stanford, Bob went to New York, his wife developed breast cancer and that collaboration never took place. But a couple of years later we became impatient and moved on ourselves and showed that that hypothesis was in fact the case. This is a blood vessel precontracted with norepinephrine. And then after five or seven minutes we introduced an endothelial dependent vasodilator, acetylcholine, bradykinin, ATP ionophore, histamine etc. And if the endothelium is present, cyclic GMP levels increased within seconds, returned to basals and this is followed by relaxation in the muscle. But that only occurs if the endothelium is intact, if there’s no endothelium there’s no increase in cyclic G, no relaxation. So we knew by the early 1980s there were now two pathways converging on guanylyl cyclase to regulate cyclic GMP synthesis. The NO donors in the endothelial dependent vasodilator pathway. We spent a couple of years showing that this resulted in the activation of protein kinase G in vascular smooth muscle preparations. We then chased the phosphorylation of a variety of proteins with P32 incorporation. And to put all of the story together for you, it’s summarised on this slide. This cartoon represents a blood vessel with the endothelial lining on the left and the smooth muscle compartment on the right and in red are three categories of vasodilators that work by enhancing cyclic GMP production. The nitrovasodilators that are converted spontaneously based on pH oxygen tension etc. or the enzymatically converted, such as nitro-glycerine, to nitric oxide which activates the soluble guanylyl cyclase. Soluble guanylyl cyclase is a heterodimer with an alpha-beta-subunit and the beta-subunit has a heme prosthetic group at the histamine 105 position. The iron in that heme has to be ferrous, NO binds to the ferrous, changes the liganding of the heme to the beta-subunit which then talks to the catalytic domain down at the C-terminal, resulting in activation of the enzyme. The cyclic GMP activates a cyclic G dependent protein kinase. There are a couple of these, soluble and particulate that phosphorylate numerous proteins. These proteins regulate the concentration of cytosol calcium by altering distribution within the cell from stores or through channels in the membrane. And we know that the myosin light-chain kinase is a calcium calmodulin dependent enzyme. So when you decrease calcium, you decrease the kinase, myosin light-chain accumulates in the dephosphorylated state. If you take actin and myosin filaments, when you phosphorylate the myosin light-chain, they slide together for contraction. You dephosphorylate they slide apart and you get relaxation. Since this work it’s been shown that cyclic GMP also regulates the phosphatase activity perhaps. The endothelial dependent vasodilators do exactly the same thing; however, the receptors for these endothelial dependent vasodilators are only on the endothelial cells, not the smooth muscle cells. That’s why patients with arthrosclerosis and cardiovascular disease get direct acting NO donors, nitro-glycerine, nitroprusside etc. They don’t get endothelial dependent vasodilators because their endothelium is abnormal. And I’ll tell you more about that in a moment. But they produce EDRF, which we know is nitric oxide, to work through the same pathway. A third category are the atriopeptins. It was found some years ago by deBold that the granules and atria possess a peptide called atrial natriuretic factor and we found that that factor, atriopeptins and the family of these, activate the particulate isoforms of guanylyl cyclase and there are several of these. It turns out the particulate cyclases are receptor cyclases. For atriopeptins, guanylyl, e-coli enterotoxin etc. And by elevating cyclic G, they too will cause relaxation. Now, you can relax smooth muscle in other ways with agents that alter calcium, agents that increase cyclic AMP, phosphodiesterase inhibitors etc. These are the mechanisms in which you cause relaxation by enhancing cyclic GMP production. But you can start combining this information now to create novel combination therapies for various cardiovascular diseases and I’ll show you how to do that in a moment. There was some other very important observations along the way and I’m going to have to skip them. But it became apparent by the mid and late 1980s that there had to be a pathway that was making nitric oxide. People were finding nitride and nitrate in their condition media, people were finding arginine activation of the pathway. And it turns out indeed there’s a family of enzymes called nitric oxide synthases, very ubiquitous, found in most tissues. And there are 3 isoforms, initially called neuronal NOS, inducible NOS, endothelial NOS, the tissues which they were first purified and characterised. Because they’re so ubiquitous, I’ve suggested we call them NOS-1, 2 and 3 in the chronological order in which they were first characterised, purified, cloned. Very homologous, about 50% to 60% homology with each other. Some are soluble, some are particulates, lots of opportunity for post-translational modifications. Some are acylated with polmitate or myristate; many of them are phosphorylated by various kinases. A very complicated family. Normally this NOS-2 or inducible NOS is not found in tissues. You don’t see transcript or protein unless there’s been an inflammatory insult. So it’s become a biomarker of inflammation. You can enhance its production by anything that turns on the NF-kappaB pathway, endotoxin, pro-inflammatory cytokines, IO1, interfering gamma etc. And you make a lot of enzyme which is a high output production stage for nitric oxide that will participate in a lot of cytoxic and inflammatory processes. All of these enzymes catalyse this reaction. They oxidise the guanidino nitrogen of arginine. They oxidise the turtle guanidino nitrogen to an intermediate hydroxy arginine, further oxidised NO and citrulline. The enzymes are only active as homodimers. They have a heme prosthetic group. They require NADPH oxygen flavines, heme as a prosthetic group. Very complicated. If the bioptron is oxidised to the dihydro, it no longer makes NO but the enzyme now makes super-oxide, one of the worse things you can do in nitric oxide biology. So let me put this pathway together for you. We know now that various hormones and ligands will interact with their appropriate receptors to regulate various co-factors for the nitric oxide synthase pathways to convert arginine to nitric oxide and cytroline. This then activates soluble guanylyl cyclase to make cyclic GMP which activates a kinase and the cascade goes on to cause some processor event. We can influence this pathway in a variety of ways now with pharmacological tools. We have compounds that are receptor agonist and antagonist. We can modify the availability of the cofactors. We have compounds that are arginine analogues or guanidino analogues to block and inhibit the nitric oxide synthases. Some of these are in clinical trials for septic shock and inflammatory diseases. We can scavenge the NO not only with haemoglobin and monoglobin but also with various thiols that are also in clinical trials. There are compounds available that activate the cyclase without NO. We have a mutant enzyme that doesn’t require NO for gene therapy some day we think. You can also enhance the activation by NO or another gas, carbon monoxide, which is a weak activator in the presence of compounds, and there are inhibitors available as well. So we have tools now to begin to approach this system. But the system is a little bit more complicated than that, it always is. When you make nitric oxide, what it wants to do is activate guanylyl cyclase to make cyclic G, to inhibit platelet aggregation, to act as a neurotransmitter, to influence smooth muscle relaxation, all the beneficial sorts of things. However it can get oxidised to nitrite nitrate, it can form complexes with other transition metals. It will form complexes with various thiol groups and proteins. More than 100 proteins get nitrosated on the cysteine residues and one of the important pathways is the interaction of nitric oxide with superoxide anion. This reaction is almost diffusion limited. So whenever you’ve got either in contact with one another, that’s the reaction that will take place and it acts as a steal or a sink to pull it away from the cyclic G pathway. And you make peroxynitrite, which is even more toxic than nitric oxide or superoxide. Peroxynitrite will nitrate protein residues adjacent to the hydroxyl and tyrosines, perhaps sterically inhibiting or interfering with tyrosine kinase phosphorylation in some cases. So maybe the two systems are talking to each other. The tyrosine kinase pathway, the NO pathway, perhaps. There’s been very little evidence in vivo showing that, most of the evidence so far as been in vitro. There is an important disease called endothelial dysfunction. Many of us, certainly the older folks in this audience, have endothelial dysfunction, maybe not so many of the younger people yet. It occurs with hypertension, atherosclerosis, diabetes, tobacco use and perhaps obesity. In all of these disorders there’s oxidated stress, the formation of reactive oxygen species, hydrogen peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical and the tissue of blood vessels don’t make sufficient quantities of nitric oxide, for a variety of reasons and I’m not going to go through all the reasons. But the net outcome is your blood vessels don’t make enough NO. They tend to be vasoconstricted, you accelerate the atherosclerotic process. You diminish perfusion in diabetic ulcers and lesions. So it’s a vicious cycle, as you get more constricted more reactive oxygen species, less NO. It gets worse and worse. So you’ve got to interrupt it, you’ve got to treat the underlying disease and perhaps come along with some new approaches, perhaps arginine supplementation to make more NO, antioxidants to get rid of the reactive oxygen species. And there are a lot of clinical, a lot of annual studies to support that. There are some clinical studies. The clinical studies have been very controversial. Almost through here, another slide. The nitric oxide field is gone absolutely bananas. Our first paper on the biological effects was in 1977. Almost as many as cyclic AMP, more than G proteins and a lot of other things. It’s incredible. That is about 6,000 to 8,000 papers per year, in the last 5 to 10 year period. That’s 20 to 30 papers a day. There’s no one in the world to keep up with it. It’s very frustrating for all of us in the field. But it’s also very exciting to see this interest and enthusiasm. I’ve created a partial list for you, this slide and the next, to show you where this field is going to go I think in the next decade with regard to a novel drug development and how you can take these biochemical molecular targets that we and others have described and turn them around now in high throughput screens and other assays to find chemical leads to make new therapeutics. We know, as I said, that NO is participating as a neurotransmitter in the brain, in some regions of the brain, both centrally and peripherally. If you make a NOS-1 knockout mouse and induce a cerebral infarct, the size of the infarct is smaller. If you make a NOS-3 knockout mouse, induce an infarct, the infarct is bigger. If you do a double knockout, NOS-1 and NOS-3, the mouse is not very smart anymore, it can’t get through the water maze just to find the flow. So the participations of nitric oxide is transmitters in various regions, also with memory and we certainly haven’t figured all that out. We know it plays a role in fluid production and re-absorption, in the eye for glaucoma, retinal neuronal degeneration. We talked a lot about vasodilation; pulmonary hypertension was mentioned in the movie. It’s been exciting to see that develop. Premature babies maintained in in vivo circulation, they don’t need to profuse their lungs because they get their oxygen from the placenta from their mother. If they’re born prematurely, their blood vessels are constricted, their lungs are not developed, they need surfactant, you need to dilate those blood vessels and they shunt right to left, so they’re hypoxic babies. If you give them a little nitric oxide in the nasal catheter, they dilate the vessels, they don’t shunt quite as much, they become oxygenated. There’s been a marvellous improvement to eliminate the need for ECMO therapy, which is rather nasty. You all know about Viagra. It came out of this research, not us but we developed the concepts. We used to joke in the lab, we’ll fill condoms with vasodilators and NO donors and PD inhibitors, they work. Viagra is an inhibitor of the type 5 phosphodiesterase which is found predominantly in blood vessels, both in the corpus cavernosum as well as the systemic vessels. This is why patients who take Viagra and now take NO donors, nitro-glycerine, can get severe hypertension, arrhythmia, strokes etc. So one has to be careful, it’s not a street drug, it can get you in trouble. It participates in wound healing and angiogenesis, atherosclerosis. If you look at exhalation of NO in your breath, it’s a wonderful marker of the severity of asthma. The more inflammation in your lungs, the more induction of NOS-2, the more NO you make, the more NO in your breath, so the clinician can have you breathe into a bag or tube and if the NO is elevated, he knows that your asthma is out of control and he’ll readjust therapy. It’s been very useful. There are clinical studies for septic shock, platelet aggregation. We know that NO regulates genes, both up and down from micro array studies on cells. We’ve become very interested in stem cell biology, the last several years we know that nitric oxide and cyclic G influence embryonic human and mouse stem cell proliferation and differentiation. We think we can force cells into different lineages by playing games with NO and cyclic G. And there are other applications, this is only a partial list, we can’t do everything. Thank you very much.

Nachdem dieses Treffen so wunderbar angefangen hat, haben wir etwas über den Urknall gehört, und ich denke, dass das Thema des folgenden Vortrags ebenfalls als ein Urknall in der Biomedizin angesehen werden kann. Das war die Entdeckung von Stickstoffmonoxid. Es ist mir eine große Freude, Professor Ferid Murad aus Houston, Texas zu bitten, uns hier seinen Vortrag zu halten. die Stickstoffmonoxid als ein Signalmolekül im Herz-Kreislauf-System spielt. Professor Murad. Dies ist mein erster Besuch in Lindau. Es sieht nach einer sehr spannenden Gelegenheit sowohl für die Redner als auch für die Studenten aus, und ich werde diese Woche genießen, das kann ich Ihnen versichern. Kurz nachdem der Nobelpreis bekannt gegeben worden war, erhielt mein Büro zahlreiche Anrufe von den örtlichen Schulen, den High Schools und Colleges in Houston. Man bat mich, Vorträge zu halten und mit den Schülern zusammenzutreffen, und das tat ich. Aber es kamen enorm viele Nachfragen, und ich konnte nicht mehr mit ihnen Schritt halten. Daher fragte ich in der audiovisuellen TV-Abteilung im Texas Medical Center, ob man mir dabei helfen könne, ein Video zusammenzustellen. Heute Morgen wird es also Filme geben. Diese Abteilung ist wirklich eine sehr aufregende Abteilung. Sie erstellen Videos und Tonbänder für Patienten: wie sie mit ihren Kolostomiebeuteln zurechtkommen, wie sie mit ihren Nieren-Shunts für die Dialyse umgehen sollten usw. Wir setzten uns also zusammen und entwarfen einen Dialog. Wir tauschten viele Informationen untereinander aus. Schließlich kamen sie an einem Samstagmorgen zu mir nach Hause und wir drehten dieses Video, und ich denke, es wird Ihnen gefallen. Das Video wurde für Teenager erstellt, aber ich habe es auch Fünfjährigen und 85-Jährigen gezeigt, und allen scheint es zu gefallen, denn es ist Wissenschaft in Laiensprache, die Sie alle verstehen sollten. Lassen Sie uns also mit dem Video anfangen. Meine Güte, was soll das denn mit diesen ganzen Preisverleihungen? Und der Preisträger ist ... Herzlichen Glückwunsch. Ich bitte Sie jetzt nach vorne zu kommen und Ihren Nobelpreis in Empfang zu nehmen. Nobelpreis? Was ist denn das? Da bin ich überfragt. Was? Ihr wisst nicht, was der Nobelpreis ist? Dagegen müssen wir etwas unternehmen. Wow! Was ist denn das? Hey, Sie kommen einfach aus dem Fernseher! Das ist ja wie Aliens. Gestatten? Ja klar, warum nicht? Also - was haben Sie uns zu berichten? Nun, mein Name ist Ferid Murad. Ihr könnt mich Fred nennen. Ich bin Arzt und Forscher und Wissenschaftler an der University of Texas Medical School. Ach, und übrigens, ich habe 1998 den "Nobelpreis" für Medizin bekommen. Ok, was ist denn nun dieser "Nobelpreis"? Der Nobelpreis ist eine der größten Auszeichnungen der Welt, die man bekommen kann. Aha ... Er bedeutet Anerkennung durch andere Wissenschaftler. Und? Hm. Tja, man ist auf der ganzen Welt im Fernsehen. In Schweden gibt es eine große Feier. Man trifft sogar den König und die Königin von Schweden. Man bekommt eine goldene Medaille. Und dann ist da natürlich noch das Geld. Geld? Party? König und Königin? Ja. Vielleicht ist es besser, wenn ich es euch zeige. Darf ich? Mm ... na klar! Danke. Danke, Fred. Willkommen in meiner Welt der Wissenschaft und in meinem Labor. Wissen Sie, den Nobelpreis gäbe es nicht, wenn da nicht ... Dynamit gewesen wäre. Wie auch immer. Alfred Nobel, der schwedische Erfinder und Geschäftsmann, der die Nobelpreise erfand, war derjenige, der das Dynamit erfand. Nitroglycerin ist die explosive Chemikalie in Dynamit. Und obwohl es sehr gefährlich war, fand Herr Nobel einen Weg, um das Nitroglycerin so einzulagern, dass es für sinnvolle Zwecke verwendet werden konnte, zum Beispiel um Dinge zu bauen. Man könnte sagen, dass seine Erfindung die Welt erschütterte. Nitroglycerin hat jedoch noch andere Anwendungsbereiche. Als Nobel anfing, an Herzbeschwerden zu leiden, verschrieb ihm sein Arzt tatsächlich Nitroglyzerin für sein Herz. Aber Nobel sagte: "Auf keinen Fall." Also war die Sache für ihn "geplatzt". nicht gut für das Herz sein konnte. Niemand wusste, warum es wirkte. Aber das tat es. und er teilte sich 1998 den Nobelpreis für Medizin mit Dr. Robert Furchgott und Dr. Luis Ignarro, weil er die Antwort auf diese Frage herausfand. Sie sind also der Typ, der herausfand, dass Nitroglyzerin gut für das Herz ist? Äh, ja. Und? Und was? Und warum wirkt es? Wir versuchten die Frage zu beantworten, auf welche Art und Weise Nitroglyzerin bei Brustschmerz hilft. Ich führte Experimente durch, betrachtete die Ergebnisse und sammelte Daten. Dann fand ich heraus, ob, was ich dachte, richtig oder falsch war. Jedenfalls fand ich heraus, das Nitroglyzerin Stickstoffmonoxid freisetzt und dass Stickstoffmonoxid eine Menge wichtiger Dinge im Körper erledigt. Was ist denn Stickstoffmonoxid? Und was genau haben Sie herausgefunden, das Ihnen diesen "Nobelpreis" einbrachte? Lasst es mich euch zeigen. Es schützt das Herz. Es stimuliert das Gehirn. Es tötet Bakterien. Und es ist ein echtes Gas. Es ist Stickstoffmonoxid. Niemand kann zu NO nein sagen. Stickstoffmonoxid oder NO ist ein einfaches Molekül mit zwei Atomen, Stickstoff und Sauerstoff. Und ja, es ist ein farb- und geruchloses Gas. Eine wissenschaftliche Sensation fegt über die Welt. Stickstoffmonoxid ist überall. Im Zuge der Umweltverschmutzung durch Umweltgifte trägt es zur Zerstörung der Ozonschicht bei. Man findet es sogar in Autoabgasen und Zigarettenrauch. Aber kommen wir von der Superbedrohung zum Superhelden. Man findet Stickstoffmonoxid auch im menschlichen Körper und es hilft dabei, wichtige Signale zu senden, die nicht von unserem Sponsor stammen. Wenn Blut durch Ihre Blutgefäße fließt, dann setzt deren Innenverkleidung oder Ihr Endothel Stickstoffmonoxid frei. Stickstoffmonoxid signalisiert Ihren Blutgefäßen, dass sie sich entspannen und erweitern sollen. Und dann? Das wiederum führt zu einer Senkung des Blutdrucks, der Kraft, die das Blut auf die Gefäßwände ausübt. Wenn Ihre Blutgefäße genug Stickstoffmonoxid bilden, signalisiert dies Ihren Blutgefäßen, dass sie sich entspannen sollen. Dann fließt Ihr Blut weiter hindurch. Kein Problem. Aber wenn das Blut nicht hindurchfließt, bilden sich Blutklumpen. Dann ... (Herzinfarkt). Und das ist nicht alles! Entspannte Blutgefäße lassen also mehr Blut hindurchfließen und Stickstoffmonoxid kann Auswirkungen auf alle möglichen Bereiche des Körpers haben. Beispielsweise rettet Stickstoffmonoxid schon das Leben von zu früh geborenen Babys, die sehr kleine Dosierungen dieses Gases einatmen. Es hilft ihren Lungen und verbessert ihre Atmung. Und das ist gut! Bei Nervenzellen kann Stickstoffmonoxid das Gehirn stimulieren und damit Dinge wie das Verhalten und Benehmen beeinflussen. Oh, benimm dich, Baby! Als Teil des Selbstverteidigungssystems des Körpers verteidigt Stickstoffmonoxid uns auch gegen Tumorzellen und Bakterien. Es ist ein erstaunliches Zeug. Aber Stickstoffmonoxid ist nicht zum Lachen und sollte nicht mit Distickstoffoxid, besser bekannt als Lachgas, verwechselt werden. Ha-ha ... kann jemand bitte dieses Gas abstellen? Wie kommen Sie überhaupt auf das alles? Nun, mit der Zeit begann ich mich sehr dafür zu interessieren, wie Zellen miteinander reden. Aber die meisten anderen Wissenschaftler hielten das nicht für sehr wichtig. Dr. Murad fand heraus, dass, wenn Zellen miteinander reden, dies so ähnlich ist, als wenn eine Zelle einer anderen Zelle irgendwo im Körper eine E-Mail schickt. Und diese E-Mail ist das Gas Stickstoffmonoxid. Die E-Mail kann in eine andere Zelle einbrechen und die Arbeitsweise dieser Zelle übernehmen. Sie kann eine Botschaft enthalten, zum Beispiel die Anweisung an ein Blutgefäß, dass es sich entspannen soll. Oder sie kann eine andere Art von Anweisungen enthalten. Wenn die Botschaft beispielsweise an eine Krebszelle geschickt wird, kann es sein, dass das Stickstoffmonoxid den Krebs tötet und dann sich selbst zerstört. Hasta la vista, Baby. Stickstoffmonoxid bewirkt so viele Dinge in Ihrem Körper. Es ist, als hätte man in seinem eigenen Körper ein weltweites Internetsystem. Warum sind Sie überhaupt in die Wissenschaft gegangen? Nun, es macht wirklich viel Spaß, herauszufinden, wie solche Dinge funktionieren. Und man muss nicht brillant sein, um voranzukommen. Man muss nur Ziele haben und sich darauf einstellen, sehr hart zu arbeiten. Als Wissenschaftler kann man etwas zum ersten Mal tun, das kein anderer jemals getan hat. Und das ist spannend! Manchmal öffnet Ihre Entdeckung die Tür zu einer ganz neuen Art und Weise des Denkens und zu noch mehr neuen Entdeckungen. Das ist wirklich cool! Es ist so etwas wie die "Wissenschaftsolympiade" und das Ziel ist der Nobelpreis. Wissenschaftlerteams aus aller Welt treten gegeneinander an. Es macht Spaß. Wer wird als erster fertig sein? Wer wird den Preis gewinnen? Einer von euch könnte eines Tages ein Nobelpreisgewinner sein. Wer weiß? Hey! Ich habe noch ein paar Fragen! Ja, ich auch. Tja, ich glaube, wir müssen auf eigene Faust mehr herausfinden. Vielleicht finden wir etwas im Internet. Ja, und halte Ausschau nach Wissenschaft und dem Nobelpreis. Sie sind weg und haben noch etwas Popcorn übrig gelassen, oder? Mjam! Für mich fügte es sich sehr glücklich, dass ich, als das Programm in Cleveland startete, einer der ersten medizinischen Doktoranden in den USA war, und ich entschied irgendwie, dass es das war, was ich tun wollte. Ich war mir nicht sicher, wie ich zu der Entscheidung kam. Ich war begeistert von Chemie und Biologie. Ich glaube, mehr als alles andere war ich verwirrt. Und ich sagte, ich werde beides versuchen und schauen, in welche Richtung ich gehen sollte, und ich wurde süchtig danach und sitze seither auf diesem Zaun [zwischen Chemie und Biologie]. Meine Mentoren waren Earl Sutherland und Ted Rall. Ein Jahr, bevor ich in ihr Labor kam, hatten sie gerade ein zyklisches AMP (Adenosinmonophosphat) entdeckt. Was war das für eine aufregende Zeit für einen jungen Studenten! Die mir zugewiesene Aufgabe bestand darin, herauszufinden, wie Katecholamine, Adrenalin, die Produktion von zyklischem AMP in den Geweben reguliert und ob dies über den Beta-Adrenorezeptor oder den Alpha-Rezeptor geschieht. Dies war eine ziemlich einfache und in der Tat leichte Aufgabe. Allerdings war es eine außergewöhnlich spannende Zeit, in der wir erlebten, wie sich dieser ganze Bereich der Zellsignale und Botenstoffe herausbildete. All diese Hormone, die über diese Signalwege wirken, und all diese Medikamente, die entwickelt wurden, zu betrachten - das war es, wonach ich süchtig wurde: sekundäre Botenstoff-Systeme und Zellkommunikation. Zellkommunikation ist eigentlich ein altes Konzept, das wahrscheinlich vor mehr als 100 Jahren zum ersten Mal von Pawlow bekannt gemacht wurde. Wie Sie aus Ihren Psychologie-Kursen wissen, hatte Pawlow einen Patienten mit einer Schussverletzung am Bauch, bei dem sich eine Magen-Fistel bis nach außen entwickelte. Wann immer der Patient Nahrung sah oder roch, verstärkte dies die Magensaftsekretion. Pawlow war nun so clever, dass er bei Hunden Hautsäcke und Fisteln heranzüchtete. Er zeigte den Hunden Futter und auch bei ihnen verstärkte sich die Magensaftsekretion. Aber er entschloss sich, diese Hunde zu konditionieren, indem er eine Glocke läutete. Letztendlich musste er nur eine Glocke läuten und bei den Hunden verstärkte sich die Sekretion, ohne dass er ihnen Futter zeigen musste. Dies sagte ihm, dass das Gehirn mit dem Magen sprach, dass Zellen miteinander kommunizieren. Natürlich wissen wir heute, dass viele Zellen und Gewebe im Körper miteinander kommunizieren. Das wird hier für Sie in diesem Cartoon, in diesem ersten Dia zusammengefasst. Dies stellt drei verschiedene Zellpopulationen dar, die miteinander sprechen werden. Sie können jede Art von Zellen sein, aber ich werde Zelle 1 eine Nervenzelle nennen. Sie kann ein zentrales oder ein peripheres Neuron sein. Zelle 2 werde ich eine Endothelzelle nennen, die ein Blutgefäß auskleidet, und Zelle 3 werde ich eine glatte Muskelzelle in der Wand jenes Blutgefäßes nennen. Zelle 1 möchte mit Zelle 2 und auch mit Zelle 3 sprechen. Und sie tut das, indem sie Moleküle produziert, die Earl Sutherland als primäre Botenstoffe bezeichnete. Heute bezeichnen wir sie als Hormone, wir bezeichnen sie als Zytokine, wir bezeichnen sie als Wachstumsfaktoren, wir bezeichnen sie als eine Vielzahl von Dingen, parakrine Substanzen, Autakoide usw. Sie kommen in verschiedenen Formen und Größen und Arten aromatischer Verbindungen vor. Einige sind kleine Aminosäuren, andere sind große Moleküle wie die Herztroponine. Wichtig ist für uns hier, dass sie in den interstitiellen Raum, in den Blutstrom ausgeschüttet werden und zielgerichtet durch den Körper wandern, um ihr Ziel zu finden. Sie finden ihre Zielzelle mithilfe eines Makromoleküls in ihrer Membran, das wir als einen Rezeptor bezeichnen. Manchmal befinden sich diese Rezeptoren im Inneren der Zelle, wie bei Steroiden und Schilddrüsenhormonen, aber in den meisten Fällen handelt es sich um Transmembran-Proteine, integrale Membranproteine auf der Oberfläche der Membran. Diese Liganden oder primären Botenstoffe interagieren mit ihren entsprechenden Zellen, die die einzigen mit diesen Rezeptoren sind. Das ist der Punkt, an dem sich die Spezifität der Reaktion ereignet. Sie passen konformativ zueinander, wie ein Schlüssel in ein Schloss. Und sie "stören" nur die Zellen, die über den entsprechenden Rezeptor verfügen. Der Ligand muss nicht unbedingt in das Innere der Zelle gelangen, um zu bewirken, dass die biochemische Kaskade in einer physiologischen Antwort resultiert. Sie können einfach mit dem Rezeptor interagieren, sie zwicken ihn ein bisschen und auf einmal, voilà, haben wir viele verschiedene intrazelluläre sekundäre Botenstoffe, die sich ansammeln. Der erste dieser sekundären Botenstoffe war zyklisches AMP. Sutherland und Rall entdeckten Folgendes: Auf diese Art und Weise regulierten Glukagon und Epinephrin den Abbau von Glykogen in der Leber. Wir wissen heute, dass viele Signalwege sich dieses Botenstoffs bedienen. Wir wissen auch, dass es neben zyklischem AMP noch andere sekundäre Botenstoffe gibt: zyklisches GMP (Guanosinmonophosphat), Kalzium, Diacylglycerin, Stickstoffmonoxid. Und während es Hunderte und Hunderte von primären Botenstoffen gibt, kennen wir nur eine bescheidene Anzahl von intrazellulären sekundären Botenstoffen. Heute sind es vielleicht nicht mehr als ein Dutzend, aber ich bin sicher, dass es in der Zukunft mehr sein wird. Diese sekundären Botenstoffe sammeln sich an und führen innerhalb der Zelle die Funktion aus, die von diesem primären Botenstoff zur Zelloberfläche gebracht worden war. Das Einzigartige an Stickstoffmonoxid als einem intrazellulären sekundären Botenstoff ist, dass es ein Gas ist. Es ist ein freies Radikal mit einem ungeteilten Elektron und ein sehr einfaches Molekül. Und da es ungeladen ist, der physiologische pH-Wert, wie alle anderen Botenstoffe, durchquert es die Membranen sehr viel schneller als die anderen Botenstoffe, die oft Energie oder ein Transportmittel benötigen, um das zu tun. Stickstoffmonoxid reguliert also nicht nur die Biochemie der Zelle, in der es produziert wurde, sondern es kann sie auch verlassen und ein paar hundert Ångström, Mikrometer, wandern, um angrenzende Zellen zu regulieren und zu veranlassen, dass sie andere sekundäre Botenstoffe wie zyklisches GMP produzieren. Es ist also ein ganz einzigartiges Botenstoff-Molekül. Meines Wissens ist es der einzige Botenstoff, der intrazellulär ebenso funktioniert wie extrazellulär. Es kann eine parakrine Substanz sein, ein lokales Autakoid. Es kann sich mit anderen Trägern verbinden, Glutathion, Thiole, Albumin, andere Proteine, und über eine Entfernung transportiert werden, um dort wieder freigesetzt zu werden und als Hormon zu wirken. Keine anderen Botenstoffe können das. Stickstoffmonoxid ist ein sehr altes Molekül, und ich habe eine Theorie, dass es auch an der Evolution beteiligt war. Wahrscheinlich war es eines der ersten Botenstoff-Moleküle vor drei Milliarden Jahren, als die Zellen begannen, miteinander zu kommunizieren. Allerdings werde ich diese Geschichte nicht vertiefen, da die Zeit dies nicht erlaubt. Heute wissen wir jedoch, dass es als Schadstoff von großer Bedeutung ist. Dadurch wurde es vor ungefähr 50 oder 60 Jahren bekannt, als offenkundig wurde, dass alle fossilen Brennstoffe bei der Verbrennung mit Sauerstoff eine Familie von Stickstoffoxiden produzierten, NO, NO2, N2O3 usw. Alle diese Stickstoffoxide interagieren mit Ozon und führen zum Abbau der Ozonschicht und sind zusammen mit den Treibhausgasen verantwortlich für die globale Erwärmung. Aber ich werde Ihnen sagen, dass Stickstoffmonoxid nicht nur ein Umweltschadstoff, sondern auch das Wirkprinzip einiger sehr wichtiger Herz-Kreislauf-Medikamente und ein Botenstoff-Molekül von großer Bedeutung im Körper ist. Und dies ist nur eine unvollständige Liste der Biologie, die es reguliert. Die Liste ist sehr, sehr viel länger als das. Sie beinhaltet Muskelentspannung, Blutplättchenaggregation, die Erektion des Penis, die Tötung von Parasiten und Mikroorganismen - und die Liste geht weiter und weiter. Auf einiges davon werden wir in Kürze zurückkommen. Im Jahr 1963, sieben oder sechs Jahre nach der Entdeckung des zyklischen AMP, entdeckten ein paar Chemiker zum ersten Mal zyklisches GMP, ein weiteres zyklisches Nukleotid und ein Cousin des zyklischen AMP. Man verschiebt einfach die Amino-Gruppe auf dem Purin-Ring und hat eine andere Struktur. Man verabreichte Ratten anorganisches P32-Phosphat und fand in ihrem Urin zwei wichtige organische Phosphate, zyklisches AMP und zyklisches GMP. Dies war der erste Nachweis von zyklischem GMP als ein natürliches Produkt. Das veranlasste einige Labore, sich für zyklisches GMP zu interessieren und nach Enzymen zu suchen, die es herstellten, Enzyme, die es hydrolysierten usw. Und die Geschichte entwickelte sich in den späten 1960er, frühen 1970er Jahren, als ich gerade meine Ausbildung beendete und mich darauf vorbereitete, mich der Fakultät an der University of Virginia anzuschließen. Wir wissen heute, dass es eine Familie von Enzymen gibt, die Guanylylzyklasen genannt werden. Es gibt mindestens sieben oder acht Mitglieder dieser Familie und wir glauben, dass es mit den Spleißvarianten, die wir zur Zeit isolieren, sogar noch mehr sein werden. Alle diese Enzyme wandeln GTP (Guanosintriphosphat) zu zyklischem GMP und Pyrophosphat um. Die Reaktion ist in hohem Maße analog, wenn man eine OH-Zyklase hinzufügt, die ATP (Adenosintriphosphat) zu zyklischem AMP und Pyrophosphat umwandelt. In der Tat sind die katalytischen Domänen aller Zyklasen homolog, mit der Veränderung von einer oder zwei Aminosäuren, ein Enzym kann das andere Nukleotid produzieren. Das zyklische GMP kann durch eine Familie von Phosphodiesterasen inaktiviert werden. Diese Gen-Familie umfasst mindestens zehn oder elf Mitglieder. Sie hydrolysieren die Phosphodiester-Bindung, um das zyklische Nukleotid in das entsprechende Monophosphat umzuwandeln, entweder 5'-GMP oder 5'-AMP, und es wird inaktiv. Wie Sie im Laufe der Woche von Dr. Fischer hören werden, aktivieren viele der intrazellulären sekundären Botenstoffe, zyklisches AMP, zyklisches GMP, Diacylglycerin, Kalzium usw., häufig eine Proteinkinase, die dann eine Reihe von Protein-Substraten phosphoryliert, indem sie das Gamma-Phosphat von ATP zu einem Serin-Threonin-Rest oder vielleicht einem Tyrosin-Rest überträgt. Man hat mir gesagt, dass wir nun nicht weniger als 500 oder 600 Proteinkinasen kennen. Das Konzept der Zellkommunikation ist ziemlich einfach: Ein Ligand oder Hormon reguliert die Produktion des sekundären Botenstoffs, der dann die Proteinkinase reguliert, die ein Protein phosphoryliert. Das Problem besteht nun darin, dass die Matrix ziemlich brenzlig vertrackt wird, wenn man alle Zyklasen, die Diastasen, die Proteinkinasen und die vielen Proteine berücksichtigt, die phosphoryliert werden können. Wenn diese Proteine phosphoryliert werden, dann verändert sich, wie Sie von Dr. Fischer hören werden, ihre Konformation. Wenn es sich um Strukturproteine handelt, können sie die Motilität und andere Prozesse, die Kontraktilität, beeinflussen. Wenn es sich um Enzyme handelt, werden sie aktiviert oder gehemmt. Als sich nun diese Geschichte mit dem zyklischen GMP entfaltete, beschloss ich, mich vom zyklischen AMP abzuwenden und mein Interesse auf das zyklische GMP zu verlagern. Für ein neues, junges Fakultätsmitglied war in den frühen 1970er Jahren meiner Ansicht nach das Forschungsgebiet des zyklischen AMP ziemlich überfüllt, mit großen Gruppen von Leuten überall auf der Welt. Ich dachte nicht, dass ich mit all diesen großen Laboren konkurrieren könnte, und da sich das Gebiet des zyklischen GMP herausbildete, sagte ich, dass ich in diese neue Richtung gehen würde. Ich wollte zwei Fragestellungen angehen. Wir wussten, dass ein paar Hormone die Anreicherung von zyklischem GMP in einigen Geweben steigern konnten - Acetylcholin bei Herzpräparaten, Prostaglandine bei Gefäßpräparaten -, aber wir kannten den molekularen Mechanismus der Kopplung nicht. Wenn wir die Bindung des Liganden an den Rezeptor und die Kopplung an die Guanylylzyklase, um zyklisches GMP zu produzieren, verstehen würden, könnten wir vermutlich diesen Kopplungsprozess mit verschiedenen Chemikalien und Medikamenten beeinflussen, um eine Hormonreaktion zu verstärken oder zu blockieren, und vielleicht sogar ein paar neue Therapien für verschiedene endokrinologische Erkrankungen zu entwickeln. Das war ziemlich vernünftig. Das zweite Problem bestand darin, dass wir, obwohl zyklisches GMP ein natürliches Produkt war, keine Ahnung hatten, was es tat oder worin seine Funktion bestand. Wir begannen also unsere Studien, indem wir das Enzym, das zyklisches GMP produziert, detailliert untersuchten. Die erste große Überraschung war, dass es sich nicht um ein einzelnes Enzym, sondern um ein paar Enzyme handelte. Die Enzymaktivität war in löslichen Fraktionen wie auch in partikulären Fraktionen vorhanden. Die kinetischen Eigenschaften dieser Isoforme waren unterschiedlich. Ich vermutete, dass es Isoforme geben würde. Ich hatte mir gedacht: Falls es verschiedene Abteilungen und Isoforme von Guanylylzyklasen gibt, werden sie vielleicht von verschiedenen Gruppen von Hormonen reguliert - wäre es nicht ein tolles Projekt, das zu klären und zu sortieren? Viel davon erwies sich als echte Intuition zu jener Zeit. Der Beweis, dass wir es mit Isoformen zu tun hatten, erforderte viel Arbeit. Wir mussten diese löslichen und partikulären Aktivitäten purifizieren, sie klonen, exprimieren und erneut untersuchen. Wir taten dies, und die Arbeit dauerte zwölf oder 15 Jahre. Aber zunächst nahm ich eine Abkürzung. Ich sagte: Die Kooperativität des partikulären Isoforms - im Gegensatz zur typischen Michaelis-Menten-Kinetik des löslichen Isoforms - konnte ein Artefakt sein, da es sich um krude Präparate handelte, die Nukleotidasen, Phosphatasen, Phosphodiesterasen enthielten. Wir erstellten also einen Cocktail und fügten ihn unseren Inkubationen hinzu, um alle diese konkurrierenden Pfade zu hemmen. Wir erstellten einen Cocktail aus Pyrophosphat, Fluor, Azid, Hydroxylamin, Natriumnitrit, Methylxanthine etc. und rein zufällig - wie es in der Wissenschaft häufig der Fall ist - fanden wir Verbindungen, die das Enzym aktivierten. Während es unser Ziel war, die Hormonregulation zu verstehen, konnte uns das nicht gelingen, denn sobald wir die Gewebe störten, ging die Hormonbindung verloren. Extrakte des Enzyms wurden durch Hormone nicht mehr aktiviert. Die kleinen Moleküle wurden jedoch aktiviert, und vielleicht konnten sie unser Ersatz für das Verständnis der hormonalen Steuerung sein. Ähnlich wie Fluor eine wertvolle Ressource für das Verständnis der hormonellen Regulation der Adenylatzyklase war. Die aktivierenden Verbindungen waren Azid, Hydroxylamin und Natriumnitrit. Und um eine lange Geschichte kurz zu fassen: die Wirkungen des Azids waren von Sauerstoff abhängig, wurden durch Thiole verstärkt und zeichneten sich durch eine lange Zeitverzögerung aus, bevor die Reaktionsrate ihr Maximum erreichte. Sie waren gewebespezifisch, denn Gewebe besaßen Inhibitoren und Aktivatoren des Stoffwechselweges. Und wir waren davon überzeugt, dass diese Aktivatoren Vorläufer von Pro-Pharmaka waren, die in unseren Inkubationen zu etwas anderem umgewandelt wurden, und es wurde mehrere Jahre lang zu einer ziemlich geheimnisvollen Geschichte, welcher Aktivator das sein würde. Wir fügten Azid und Hydroxylamin und Nitrit zu Zellkulturen in Geweben hinzu. Und tatsächlich führten sie zu einer Erhöhung der Konzentration von zyklischem GMP und sie aktivierten außerdem die Enzyme und Extrakte. Sie würden also in beiden Systemen funktionieren. Eines der Gewebe, mit denen wir - wiederum zufälligerweise - arbeiteten, war glatte Muskulatur der Luftröhre. Als Student lernte ich, dass zyklisches AMP die glatte Muskulatur entspannt, die glatte Muskulatur der Gefäße und Luftwege. Und ich dachte, dass zyklisches GMP vielleicht ein Gegenspieler von zyklischem AMP sein könnte. Wir fertigten also eine Zubereitung aus glatter Muskulatur an, die relativ homogen war, um einige biochemische Tests daran durchzuführen und einen Physiologen dafür zu konsultieren. Wir fügten diesen Zubereitungen aus glatter Muskulatur Azid hinzu, der Spiegel des zyklischen GMP stieg an, doch die Muskeln kontrahierten sich nicht, sie entspannten sich. Dies war das Gegenteil von dem, was zu erwarten war. Die Dosis-Reaktions-Kurven, die Zeitverläufe: alles sagte uns, dass Azid ein Entspannungsmittel glatter Muskulatur war, das seine Wirkung durch zyklisches GMP vermittelte, und so funktioniert es, und das war die erste physiologische Funktion von zyklischem GMP. Wir sagten: diese Mittel führen zu einer Entspannung und zur Erhöhung von G. Worin besteht die Wirkung der anderen Entspannungsmittel der glatten Muskulatur? Von Nitroglycerin, das man schon seit etwa 100 Jahren kannte, von Nitroprussid, einer Menge der Medikamente, die auf Intensivstationen für Erkrankungen der Herzkranzgefäße beliebt sind? Sie senkten den Gefäßwiderstand, senkten den Blutdruck von Infarktpatienten usw. Wir fügten sie unseren Zubereitungen hinzu, und sie führten erwartungsgemäß zu einer Entspannung der Muskulatur. Überraschend war, dass sie die Konzentration des zyklischen GMP ansteigen ließen. Wir verfügten nun also über eine Familie von Verbindungen, die wir als NO-Pharmaka (nitrovasodilators) bezeichneten und die in zellfreien Zubereitungen Guaninzyklase aktivieren und in verschiedenen Geweben die Konzentration von zyklischem GMP anheben konnten. Zu diesen Verbindungen gehörten Hydroxylamin, Azid, Natriumnitrit, einige Hydrazine, Nitroglycerin, Nitroprussid, Nitrosoharnstoffe, Nitrosamine sowie eine lange Liste anderer Verbindungen, die alle Donoren von Stickstoffmonoxid (NO) waren. Sie alle enthalten Stickstoff. Einige von ihnen wandelten sich spontan um, basierend auf Redox- und pH-Inkubationen. Einige von ihnen werden nicht im Körper umgewandelt, Azid erfordert eine Katalase-Konversion. Und wir überlegten uns, dass die Zwischenstufe aller dieser Pro-Pharmaka oder Vorstufen Stickstoffmonoxid sein musste. Der Grund, warum wir dachten, es sei Stickstoffmonoxid, war folgender: Weil die Gewebespezifität von Azid teilweise durch das Vorhandensein von Hämoglobin und Myoglobin in unseren Gewebeextrakten beeinflusst wurde. Dies waren Inhibitoren. Wir wussten aus der Literatur, dass NO eine hohe Affinität zur prosthetischen Hämgruppe von Hämoglobin, Myoglobin, hat. Also zogen wir den Schluss, dass alle diese Pro-Pharmaka oder Vorstufen in Stickstoffoxid umgewandelt wurden. Wenn wir durch chemische Reaktionen Stickstoffoxid im Laborabzug erzeugten, Natriumnitrit, Eisen(II)-Sulfat, Schwefelsäure, und das Gas in unsere Zubereitungen ventilierten, wurde jede von ihnen aktiviert. Was für eine spannende Zeit das war! Der erste Beweis dafür, dass ein freies Radikal ein Enzym aktivieren konnte. Und ich dachte, das würde eine sehr interessante Chemie sein. Viele Leute waren skeptisch. Sie alle hielten freie Radikale und Stickstoffoxide für schädliche Verbindungen und giftige Stoffe, doch es bestand kein Zweifel daran: Sie hatten eine aktivierenden Wirkung. Einige Leute hielten mir entgegen: Murad, du inhibierst einen Inhibitor. Du führst in deinen primitiven Zubereitungen eine Aufhebung der Inhibition durch. Also mussten wir die Enzyme bis zur Homogenität reinigen, und wenn wir die Konzentration vornahmen, wurde die Menge des zur Aktivierung benötigen Stickstoffmonoxids geringer und immer geringer, noch niedriger, als wir Stoffe aus unserer Inkubation entfernten, die NO absaugten und verschluckten. Übergangsmetalle, Thiole, Protein saugten NO auf, wissen Sie. Nanomolare Konzentrationen von NO führten zu einer Aktivierung des Enzyms, und der Vmax-Wert stieg um das 200- bis 400-fache an, wie sie auch den Km-Wert für GTP senkten. So erkannten wir, dass wir den Wirkungsmechanismus der NO-Pharmaka (nitrovasodilators) herausgefunden hatten, wie etwa von Nitroglycerin, das seit 100 Jahren klinisch verwendet wurde. Findet man als Pharmakologe ein exogenes Material, das in einem biologischen System etwas bewirkt, sollte man sich fragen: Imitiert es einen natürlichen Stoffwechselpfad, der bereits existiert, sowie: Arbeitet es durch einen ähnlichen Mechanismus? Daher schlug ich in einer Buchbesprechung in den späten siebziger Jahren vor, dass die Wirkung verschiedener Hormone, d. h. die Erhöhung der Konzentration des zyklischen GMP, vielleicht darauf zurückzuführen sei, dass sie die Produktion von Stickstoffmonoxid über irgend einen endogenen Vorläufer verstärkte, möglicherweise dadurch, dass sie einen Redox-Stoffwechselweg änderten. Wir konnten diese Hypothese nicht überprüfen, weil in den siebziger Jahren die Technologie noch nicht vorhanden war, um Stickstoffmonoxid in seinen Oxidationsprodukten oder bei Tieren oder Konzentrationen zu messen. Es gab primitive kalorimetrische Untersuchungen. Dies zu beweisen erforderte sieben oder acht Jahre technologischer Entwicklung, bevor wir selbst oder andere zeigen konnten, dass es sich so verhielt. Doch wir erwarteten, dass Stickstoffmonoxid ein sekundärer, intrazellulärer Messenger war, und das war Häresie. Und es genügte zu zeigen, dass es aktiviert ... Ein freies Radikal aktivierte ein Enzym. Nun sagte man, dass ein freies Radikal ein sekundärer Messenger war, und es erwies sich als wahr, es zeigte sich, dass wir Recht hatten. Und im Wesentlichen ist das der Grund, warum wir nach Stockholm kamen. Wenig später zeigte Robert Furchgott, ein Gefäßpharmakologe aus New York, erstmals, dass eine Gruppe von Wirkstoffen Gefäßsegmente in einem Organbad im Labor entspannte. Von Wirkstoffen wie zum Beispiel Acetylcholin, Histamin, Bradykinin war bekannt, dass sie beim Menschen oder in Tierversuchen den Blutdruck senkten. Im Labor hatten sie jedoch niemals eine Entspannung bewirkt. Er stellte fest, dass diese Stoffe, wenn er die Integrität des Endothels in seinen Blutgefäßversuchsanordnungen bewahrte, eine Entspannung verursachte. Und das war 1980 ein aufregendes neues Ereignis. Ich hörte ihm zu, als er seine Arbeiten vorstellte. Er sagte, dass diese Substanzen die Abgabe eines Faktors aus dem Endothel bewirkten, den er EDRF (endothelium-derived relaxant factor) nannte. Er hatte eine Halbwertszeit von nur ein paar Sekunden. Ich sagte: Bob, dies ist eine reaktive Spezies, vielleicht ein freies Radikal. Vielleicht funktioniert es bei zyklischem G, vielleicht stellte es sich als irgendwie mit NO verwandt heraus. Lass uns der Sache auf den Grund gehen. Nun ja, wir gingen nach Stanford, Bob zog nach New York. Seine Frau bekam Brustkrebs, und diese Zusammenarbeit kam nie zustande. Doch einige Jahre später wurde ich ungeduldig, und ich ging der Sache selbst nach und zeigte, dass diese Hypothese tatsächlich zutraf. Dies ist ein Blutgefäß, das zuvor mit Norepinephrin kontrahiert wurde. Und dann gaben wir nach fünf oder sieben Minuten eine vom Endothel abhängige, gefäßerweiternde Substanz hinzu: Acetylcholin, Bradykinin, ATP-Ionophor, Histamin etc. Und wenn das Endothel vorhanden war, stiegen die Werte für zyklisches GMP innerhalb von Sekunden an, gingen wieder auf die Basiswerte zurück, und anschließend entspannte sich der Muskel. Doch dies geschieht nur, wenn das Endothel intakt ist. Wenn kein Endothelium vorhanden ist, kommt es zu keinem Anstieg des zyklischen G, zu keiner Entspannung. Wir wussten also in den frühen 1980er Jahren, dass es zwei Stoffwechselpfade gibt, die in der Guanylylzyklase konvergieren, um die Synthese von zyklischem GMP zu steuern: die NO-Donoren im endothelabhängigen Stoffwechselpfad zur Gefäßerweiterung. Wir verbrachten einige Jahre damit zu zeigen, dass dies in Zubereitungen des glatten Muskels der Blutgefäße zur Aktivierung der Proteinkinase G führt. Anschließend untersuchten wir die Phosphorylierung einer Vielzahl von Proteinen mit Hilfe der Einfügung von P32. Um die verschiedenen Teile der Geschichte für Sie zusammenzufassen, sind sie auf dem folgenden Dia übersichtlich dargestellt. Dieser Cartoon stellt ein Blutgefäß dar, mit der Endothelauskleidung auf der linken Seite und dem Anteil des glatten Muskels auf der rechten Seite. In rot sind drei Kategorien von gefäßerweiternden Substanzen dargestellt, die eine Verstärkung der Produktion von zyklischem GMP bewirken: die NO-Pharmaka (nitrovasodilators), die aufgrund der pH-Sauerstoff-Spannung etc. spontan umgewandelt werden, wie etwa Nitroglycerin, bis zu Stickstoffmonoxid, das die lösbare Guanylylzyklase aktiviert. Die lösbare Guanylylzyklase ist ein Heterodimer mit einer Alpha-Beta-Untereinheit, und die Beta-Untereinheit verfügt über eine prosthetische Gruppe in der Histamine-105-Position. Das Eisen in diesem Häm muss zweiwertig sein, NO bindet sich an diesen doppelwertigen Liganden, ändert die Bindung des Häm an die Beta-Untereinheit, die dann mit der katalytischen Domäne unten am C-Terminal kommuniziert, was zu einer Aktivierung des Enzyms führt. Das zyklische GMP aktiviert eine zyklische, G-abhängige Proteinkinase. Es gibt zwei von diesen: eine lösbare und eine partikelförmige, die zahlreiche Proteine phosphorylieren. Diese Proteine regulieren die Konzentration von Kalzium im Zytosol, indem sie die Verteilung innerhalb der Zelle aus Vorräten oder durch Kanäle in der Membran ändern. Und wir wissen, dass die Myosin-leichte-Ketten-Kinase ein von Kalzium/Calmodulin abhängiges Enzym ist. Wenn man die Kalziummenge reduziert, verringert man die Kinase, Myosin-leichte-Ketten sammeln sich im dephosphorylierten Zustand an. Wenn man die Aktin- und Myosin-Filamente nimmt, wenn man Myosin-leichte-Ketten phosphoryliert, gleiten sie zur Kontraktion aneinander vorbei. Wenn man Myosin-leichte-Ketten dephosporyliert, kommt es zur Entspannung. Seit dieser Arbeit ist gezeigt worden, dass zyklisches GMP möglicherweise auch die Phosphatase-Aktivität reguliert. Die vom Endothel abhängigen, gefäßerweiternden Substanzen tun genau dasselbe. Die Rezeptoren für diese vom Endothel abhängigen, gefäßerweiternden Substanzen befinden sich jedoch nur auf den Endothelzellen, nicht auf den Zellen der glatten Muskulatur. Das ist der Grund dafür, warum Patienten mit Arteriosklerose und Erkrankungen der Herzkranzgefäße direkt wirkende NO-Donoren verabreicht werden: Nitroglyzerin, Nitroprussid etc. Sie erhalten keine vom Endothel abhängige, gefäßerweiternden Substanzen, weil ihr Endothel nicht normal ist. Ich werde Ihnen sogleich mehr darüber erzählen. Doch sie produzieren EDRF, von dem wir wissen, dass es sich dabei um Stickstoffmonoxid handelt, um über denselben Stoffwechselweg zu arbeiten. Eine dritte Gruppe sind die Atriopeptine. DeBold stellte vor einigen Jahren fest, dass die Granulate und Atria über ein als atrialen natriuretischen Faktor bezeichnetes Peptid verfügen, und wir haben herausgefunden dass dieser Faktor, die Atriopeptine und die Familie dieser Substanzen die partikelförmigen Isoformen der Guanylylzyklase aktivieren, und es gibt mehrere von diesen. Es hat sich herausgestellt, dass die partikelförmigen Zyklasen Rezeptorzyklasen sind, für Atriopeptine, Guanylyl, e-coli-Enterotoxin etc. Und durch die Erhöhung der Konzentration von zyklischem G führen auch Sie zu einer Entspannung. Nun, man kann glatte Muskulatur auch auf andere Weise entspannen: mit Wirkstoffen, die die Kalziumkonzentration ändern, die Konzentration von zyklischem AMP ändern, mit Phosphodiesterase-Inhibitoren etc. Dies sind die Mechanismen, bei denen man durch die Verstärkung der Produktion von zyklischem GMP eine Entspannung herbeiführt. Man kann nun jedoch darangehen, diese Informationen zu kombinieren, um für verschiedene Erkrankungen der Herzkranzgefäße neuartige Kombinationstherapien zu konzipieren, und ich werde Ihnen gleich zeigen, wie man das macht. Es gab noch einige andere sehr wichtige Beobachtungen während unserer Arbeit, aber ich werde sie übergehen müssen. Um die Mitte und gegen Ende der 1980er Jahre wurde jedoch deutlich, dass es einen Stoffwechselweg geben musste, der Stickstoffmonoxid produziert. Die Leute fanden Nitrid und Nitrat in ihren Medien, die Leute fanden die Argininaktivierung des Stoffwechselweges. Und es stellte sich heraus, dass es tatsächlich eine Familie von Enzymen gibt, die man als Stickstoffoxid-Synthasen bezeichnet, die fast allgegenwärtig und in den allermeisten Geweben zu finden sind. Und es gibt drei Isoformen, die ursprünglich als neuronale NOS, induzible NOS und endotheliale NOS bezeichnet wurden, nach den Geweben, aus denen sie zuerst in reiner Form gewonnen und dann beschrieben wurden. Da sie so weit verbreitet sind, habe ich vorgeschlagen, dass wir sie als NOS-1, -2 und -3 bezeichnen, gemäß der chronologischen Reihenfolge, in der sie zuerst beschrieben, in reiner Form gewonnen und dann geklont wurden. Sie sind sehr homolog. Die Homologie zwischen ihnen beträgt etwa 50-60 %. Einige von ihnen sind löslich, andere liegen partikelförmig vor. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten für post-translationale Modifikationen. Einige von ihnen werden mit Polmitat oder Myristat acyliert. Viele von ihnen werden durch verschiedene Kinasen phosphoryliert. Eine sehr komplizierte Familie. Normalerweise ist dieses NOS-2 oder induzibles NOS in Geweben nicht zu finden. Man sieht keine Transkription oder kein Protein, sofern keine Entzündung aufgetreten ist. So wurde es zu einem Biomarker für Entzündungen. Sie können ihre Produktion durch alles verstärken, das zu einer Aktivierung des NF-kappaB-Stoffwechselpfades führt: Endotoxin, proinflammatorische Zytokinen, IO1, Interferon Gama etc. Und sie erzeugen sehr viel Enzym, bei dem es sich um ein Produktionsstadium für Stickstoffmonoxid mit hohem Output handelt, das an vielen zelltoxischen und entzündlichen Prozessen beteiligt ist. Alle diese Enzyme katalysieren diese Reaktion: sie oxidieren den Guanidino-Stickstoff von Arginin. Sie oxidieren den Schildkröten-Guanidino-Stickstoff zu einem Hydroxy-Arginin-Zwischenprodukt, und oxidieren außerdem NO und Citrullin. Diese Enzyme sind nur als Homodimere aktiv. Sie verfügen über eine prosthetische Hämgruppe. Sie benötigen NADPH-Sauerstoff-Flavine, Häm als prosthetische Gruppe. Sehr kompliziert. Wenn das Bioptron zu Dihydro oxidiert wird, produziert es kein NO mehr, sondern das Enzym produziert jetzt Superoxid, eines der schlimmsten Dinge, die man in der Stickstoffoxid-Biologie tun kann. Lassen Sie mich also diesen Stoffwechselpfad für Sie zusammensetzen. Wir wissen jetzt, dass verschiedene Hormone und Liganden mit ihren entsprechenden Rezeptoren zusammenarbeiten werden, um unterschiedliche Co-Faktoren für die Stoffwechselpfade der Stickstoffoxid-Synthase zu regulieren, um Arginin in Stickstoffoxid und Cytrolin umzuwandeln. Dies aktiviert dann die lösliche Guanylylzyklase, um zyklisches GMP zu produzieren, das eine Kinase aktiviert, und die Kaskade läuft weiter, um irgendein Prozessorereignis zu verursachen. Mit Hilfe pharmakologischer Werkzeuge können wir diesen Stoffwechselweg auf vielfache Weise beeinflussen. Wir haben Verbindungen, bei denen es sich um Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten handelt. Wir können die Verfügbarkeit der Co-Faktoren ändern. Wir verfügen über Verbindungen, bei denen es sich um Arginin- oder Guanidino-Analoge handelt, um die Stickstoffoxid-Synthasen zu blockieren und zu hemmen. Mit einigen von ihnen werden klinische Versuche zur Behandlung von septischen Schocks und Entzündungskrankheiten durchgeführt. Wir können das NO nicht nur mit Hämoglobin und Myoglobin "aufsaugen", sondern auch mit verschiedenen Thiolen, die sich ebenfalls in klinischen Tests befinden. Es gibt Verbindungen, die die Zyklase ohne NO aktivieren. Wir glauben, dass wir eines Tages über ein mutiertes Enzym verfügen werden, das für die Gentherapie kein NO benötigt. Man kann die Aktivierung durch NO oder ein anderes Gas auch verstärken, z.B. durch Kohlenmonoxid, bei dem es sich um einen schwachen Aktivator in Gegenwart von Verbindungen handelt, und es gibt auch Inhibitoren. Wir verfügen also nun über Werkzeuge, um damit zu beginnen, auf dieses System genauer eingehen. Doch das System ist etwas komplizierter als das. So ist es immer. Wenn Sie Stickstoffmonoxid produzieren, will es Folgendes tun: die Guanylylzyklase aktivieren, um zur Verhinderung der Blutplättchenaggregation, zur Verwendung als Neurotransmitter, zur Beeinflussung der Entspannung der glatten Muskulatur zyklisches G herzustellen: für alle diese hilfreichen Dinge. Es kann jedoch auch zu Nitrit/Nitrat oxidiert werden, es kann Komplexe mit anderen Übergangsmetallen bilden. Es bildet mit verschiedenen Thiolgruppen und Proteinen Komplexe. Mehr als 100 Proteine werden an den Cysteinresten nitrosiert, und einer der wichtigen Stoffwechselpfade ist die Interaktion von Stickstoffmonoxid mit Superoxidanionen. Diese Reaktion ist fast diffusionsbegrenzt. Wann immer man also die eine Verbindung mit der anderen in Kontakt bringt, ist dies die Reaktion, die stattfinden wird, und sie "verschluckt" oder stiehlt das NO vom Stoffwechselpfad des zyklischen G. Und dies führt zur Entstehung von Peroxynitrit, das sogar noch giftiger ist als Stickstoffoxid oder Superoxid. Peroxynitrit nitriert Proteinreste, die an Hydroxyl und Tyrosine angrenzen, indem es die Phosporylierung der Tyrosinkinase möglicherweise räumlich hemmt oder in einigen Fällen störend darauf einwirkt. Möglicherweise kommunizieren die beiden Systeme also miteinander: der Stoffwechselweg der Tyrosinkinase und der von NO. Vielleicht. Es gibt sehr wenige in vivo Hinweise darauf, die meisten Hinweise waren bislang in vitro. Es gibt eine wichtige, als endotheliale Dysfunktion bezeichnete Krankheit. Viele von uns, mit Sicherheit die Älteren unter uns, haben eine endotheliale Dysfunktion, von den jungen Leuten möglicherweise noch nicht so viele. Sie tritt zusammen mit Bluthochdruck, Arterioskelerose, Diabetes, Tabakkonsum und möglicherweise auch mit Übergewicht auf. Bei allen diesen Krankheiten kommt es zu oxydiertem Stress, der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, Wasserstoffperoxid, Superoxidanionen, Hydroxylradikalen, und die Gewebe der Blutgefäße erzeugen keine ausreichenden Mengen von Nitritoxid, aus einer Vielzahl von Gründen; ich kann diese Gründe nicht alle durchgehen. Doch das Nettoergebnis ist, dass die Blutgefäße nicht genug NO produzieren können. Sie tendieren dazu, verengt zu sein, wodurch der atherosklerotische Prozess beschleunigt wird. Die Durchblutung wird durch diabetische Geschwüre und Verletzungen verringert. Es handelt sich demnach um einen Teufelskreis: Je mehr die Blutgefäße verengt sind, umso mehr reaktive Sauerstoffspezies entstehen, umso weniger NO. Es wird schlimmer und schlimmer. Man muss den Kreislauf also unterbrechen. Man muss die zugrundeliegende Krankheit behandeln und möglicherweise mit einige neuen Therapien darangehen, möglicherweise mit der Zuführung von zusätzlichem Arginin, um mehr NO zu produzieren; oder mit Antioxidantien, um die reaktiven Sauerstoffspezies zu beseitigen. Und es gibt viele klinische, viele Jahresstudien, die dies belegen. Es gibt einige klinische Untersuchungen. Die klinischen Untersuchungen waren sehr umstritten. Wir sind fast am Ende. Hier ist ein weiteres Dia. Das Forschungsgebiet um Stickstoffmonoxid ist völlig verrückt geworden. Unser erster Aufsatz über die biologischen Wirkungen erschien 1977. Fast ebenso viele wie zu zyklischem AMP, mehr als zu G-Proteinen und vielen anderen Themen. Es ist unglaublich. Das entspricht etwa 6000 bis 8000 Aufsätzen im Jahr, im Zeitraum der letzten 5 bis 10 Jahre. Das sind 20 bis 30 Aufsätze am Tag. Niemand auf der Welt kann darüber den Überblick behalten. Es ist für alle von uns in diesem Forschungsfeld sehr frustrierend. Es ist aber auch sehr spannend, dieses Interesse und diese Begeisterung zu sehen. Ich habe eine Teilliste für Sie zusammengestellt, dieses Dia und das nächste, um Ihnen zu zeigen, wohin sich dieses Feld meiner Meinung nach in den nächsten 10 Jahren bewegen wird, was die Entwicklung neuer Medikamente betrifft, und wie wir diese biochemischen, molekularen Zielobjekte, die wir und andere beschrieben haben, nehmen können, und sie nun in Prüfverfahren mit hohem Durchsatz und andern Untersuchungen verwenden können, um chemische Hinweise zur Herstellung neuer Heilmittel zu finden. Wir wissen, wie ich bereits sagte, dass NO als Neurotransmitter am Hirnstoffwechsel beteiligt ist, in manchen Bereichen des Gehirns, sowohl zentral, als auch an der Peripherie. Wenn Sie eine Maus mit NOS-1 versehen und einen zerebralen Infarkt herbeiführen, ist der Umfang des Infarktes kleiner. Wenn Sie eine Maus mit NOS-3 versehen und einen zerebralen Infarkt herbeiführen, so ist der Umfang des Infarktes größer. Wenn Sie eine Maus mit NOS-1 und ohne NOS-3 versehen , ist die Maus nicht mehr sehr clever. Sie kommt nicht mehr durch aus dem Wasserlabyrinth. Es gibt also die Beteiligung von Stickstoffmonoxid als Transmitter in verschiedenen Bereichen, auch im Gedächtnis, und wir haben all das keineswegs verstanden. Wir wissen, dass es, bei einem Glaukom, bei der Produktion und Aufnahme von Flüssigkeit im Auge eine Rolle spielt, bei der neuronalen Degeneration der Retina. Wir haben ausführlich über die Gefäßerweiterung gesprochen, Bluthochdruck in der Lunge wurde im Film angesprochen. Es war eine aufregende Sache, diese Entwicklung mitzuverfolgen. Ungeborene Babys, verbunden mit der mütterlichen in vivo-Zirkulation, müssen ihre Lungen nicht aufblähen, weil sie ihren Sauerstoff von der Plazenta der Mutter bekommen. Wenn sie zu früh geboren wurden, sind ihre Blutgefäße verengt, ihre Lungen sind nicht entwickelt, sie benötigen einen oberflächenaktiven Stoff. Man muss diese Blutgefäße erweitern, ihr Blut fließt von der rechten in die linke Herzkammer, die Babys leiden an Sauerstoffmangel (Hypoxie). Wenn man ihnen über einen Nasenkatheder ein wenig Stickstoffmonoxid gibt, erweitert dies die Gefäße, der Blutfluss von der rechten in die linke Herzkammer geht zurück, ihr Blut wird mit Sauerstoff angereichert. Es hat eine wunderbare Verbesserung gegeben, mit der sich das Erfordernis einer ECMO-Therapie, die höchst unangenehm ist, eliminieren ließ. Sie haben alle von Viagra gehört. Es ging aus dieser Forschung hervor, nicht aus unserer, aber wir entwickelten die Konzepte. Wir haben im Labor Witze darüber gemacht: dass wir Kondome mit gefäßerweiternden Substanzen füllen würden, und mit NO-Donoren und PD-Inhibitoren. Sie funktionieren. Viagra ist ein Inhibitor der Typ-5-Phosphodiesterase, die man hauptsächlich in Blutgefäßen findet, sowohl im corpus cavernosum, als auch in den systemischen Gefäßen. Dies ist der Grund dafür, warum Patienten, die Viagra nehmen und nun zusätzlich NO-Donoren, Nitroglyzerine, sehr hohen Blutdruck, Herzrhythmusstörungen, Schlaganfälle etc. bekommen können. Man muss also vorsichtig sein. Es ist kein Medikament, das aus nichtmedizinischen Gründen genommen werden sollte, es kann zu Komplikationen führen. Es ist an der Wundheilung und der Angiogenese beteiligt, an der Atherosklerose. Wenn Sie sich die Menge ausgeatmeten NOs ansehen, ist dies ein wunderbarer Marker für die Schwere von Asthma. Je mehr Entzündungen in Ihrer Lunge sind, umso mehr Induktion von NOS-2, umso mehr NO produzieren Sie, umso mehr NO gelangt in die von Ihnen ausgeatmete Luft. Der Arzt kann Sie daher in einen Beutel oder eine Röhre blasen lassen, und wenn der NO-Gehalt erhöht ist, weiß er, dass Ihr Asthma außer Kontrolle ist und er passt die Therapie daran an. Das ist sehr nützlich gewesen. Es gibt klinische Studien für septischen Schock, Blutplättchenaggregation. Wir wissen aus Mikroarray-Studien an Zellen, dass NO Gene reguliert, sowohl hoch- als auch herunterreguliert. Wir haben großes Interesse an der Stammzellenbiologie entwickelt. Seit den letzten paar Jahren wissen wir, dass Stickstoffmonoxid und zyklisches G die Vermehrung embryonaler Stammzellen beim Menschen und bei Mäusen beeinflusst. Wir glauben, dass wir Zellen auf unterschiedliche Entwicklungsbahnen zwingen können, indem wir mit NO und zyklischem G herumspielen. Und es gibt noch andere Anwendungen, dies ist nur eine Teilliste. Wir können nicht alles tun. Haben Sie vielen Dank.

Ferid Murad on interfering with nitric oxide signals
(00:45:14 - 00:48:05)

 

For his discoveries concerning nitric oxide as a signaling molecule, Murad shared the Nobel Prize in Physiology or Medicine 1998 with Robert Furchgott and Louis Ignarro. Eleven years later, Elizabeth Blackburn, Carol Greider and Jack Szostak received the Nobel Prize in Physiology or Medicine for the elucidation of a completely different but not less important physiological process. They had discovered that chromosomes are protected against degradation during cell division by telomeres. These caps on the ends of chromosomes are built by the enzyme telomerase. Telomeres delay the ageing of the cell, an effect that is desirable for healthy cells but not for cancer cells, which apparently escape senescence by preserving their telomeres. Therefore telomerase inhibitors one day might offer a new treatment option for some cancers, while on the other hand the stimulation of telomerase could offer new opportunities to treat degenerative diseases associated with ageing, including some other cancers. In her lecture in Lindau in 2011, Elizabeth Blackburn spoke about the potential therapeutic scope of her discovery:

Elizabeth H. Blackburn (2011) - Telomeres and Telomerase in Human Health and Disease

Thank you very much and good morning everybody, it's wonderful to see so many faces here this morning. I feel as if I'm looking out at the future hope of much of what we'll see I think in biomedical research and medical research and biological research in the future. So welcome, I'm very glad to be here and giving this talk today. So my talk is going to be telling you something about the science which has been my journey from basic science and which has led us more recently into issues of human health and disease. And so I'm going to tell you just a very little bit about the early part of our work and then go into the aspect which is the human health and disease related part of it. And tell you a little bit about how I started that and then take you into how we're looking at, more recently we're looking at the interesting ramifications of all of this. So telomeres, they're the ends of chromosomes. And this kind of blobby picture where you sort of see the telomere lit up in pink here, that was pretty much what we knew about telomeres from about, you know from the stage when cytogeneticists looked at chromosomes under microscopes and could see that telomeres were, you know something at the end of chromosomes. And when I say something they were more defined by what they weren't. They didn't behave like DNA breaks, they didn't you know try to heal themselves when a break appeared, they're the end but they were not a broken end. And so it was conceptualised that they were really very different from breaks, but what were they. There was an absence of things that they did that more defined a telomere than what it actually was. So I was fortunate to be able to approach this question because. So first of all cast your minds back to the possibility that imagine a world in which you couldn't sequence DNA. Ok so that was the world in which I started my project in Cambridge in England in the lab of Fred Sanger who subsequently developed methods of DNA. But we didn't know how to sequence DNA. So there was this wonderful mystery of what on earth was the DNA like at the ends of the chromosome. And so being in Fred Sanger's lab I got very, you know well-acquainted with the then nascent methods of trying to sequence DNA, which was to try and piece together nucleotides in little patches by using a variety of chemical and biological methods. It doesn't matter but in other words you couldn't believe how impossible it was to sequence DNA in those days. But at least it seemed as if the ends might be a way of accessibility. And so I turned to a system by going to Yale University and the lab of Joe Gall where you could actually get at the ends of chromosomal DNA's, that is the DNA's of eukaryotes and their chromosomes which of course is linear. And this was because Joe Gall and others had discovered that there are very short chromosomes and large numbers of them. And one particular kind in this beast, shown in the slide here, which is the ciliated protozoan tetrahymena. Now this is not a famous organism in the sense that it doesn't cause diseases and it's not one of the favourite model systems although it's very well used now for certain questions relating to telomeres but it was just an obscure pond organism. But it had these large numbers of linear short chromosomes and that allowed me to biochemically if you will, using molecular techniques to get my hands on these, purify them out and analyse what might be going on at the ends of these chromosomes. And in fact I found that they ended up with these repeated sequences, very strange, you know there was no president for why they would do this. And they ended with short repeated sequences and that's the repeat unit shown there. And so they were the chromosomes in tetrahymena and then ending with short repeats. And then in collaboration with Jack Szostak who was in a different institution, we found the same thing was going on in yeast. And I should say that this was an example of where it's marvellous to go to meetings and have conversations because Jack and I struck up a conversation. I had just been talking about the telomeres of tetrahymena and we talked about how would you make, how would you use this information and see if you could get at telomeres in yeast, to cut a long story short. And so we did and we were able to see somewhat similar kinds of repeated sequences. Now a little bit irregular as you see from the formula on the slides. But the same kind of thing, at the end of yeast chromosomes. So this wasn't a peculiarity of this strange little beast that lived in pond scum, this was something that was more general. And indeed it had been found by others, starting to show up in slide moulds and you know, so these kinds of things were showing up at the end of chromosomes. So it looked as if it would be pretty general. And in fact, you know we did know from molecular biology, even back then, before we could sequence DNA properly, we did know that underlying principles of course of life were very similar as you look right across the living world. And so it wasn't too surprising to find some generalities here. But still it was good to find. So basically that then let us address a question which had been asked by others and which arose from the mechanism of DNA replication which as you recall occurs by a very beautiful complicated DNA replication enzymes, beautiful set of these enzymes which beautifully copy all the internal regions of chromosomal DNA. That is any linear DNA but they're just terrible at copying the very ends, because of the mechanistic aspects of how DNA replication occurs. And I won't go into the details, it's all in every text book, but the point is that the beautifully complicated sophisticated DNA replication machinery that so successfully and faithfully copies the genetic information inside chromosomes is terrible at copying the ends. So the ends can't get replicated. So every time a DNA replicated, if it's linear and unless something happened, it would just get shorter and shorter and shorter and shorter. So this was a mystery, well recognised from the early 1970's onwards and explicated by Olovnikov and Watson for example. This was a mystery. And now we knew what was at the ends of chromosomes. So there was the problem and there was a whole lot of interesting pieces of information. And I'm going to list them here because sometimes it sounds as though, when you say well you discovered telomeres, it sounds as though it just sort of fell out of the sky or something or we stumbled on it. Didn't work that way and I think this is more typical of real science, how real science works. What happened was that there were pieces of evidence, not all from one system, there were pieces of evidence in tetrahymena that the numbers of repeats at the ends of the chromosomes differed in the population of molecules. You could find that during the development of new chromosomes in this organism, has a very complicated lifestyle but it makes new telomeres and they got added on to non-telomeres. How did that happen? There was an interesting observation in the organism that causes sleeping sickness, these organisms when propagated, you could see the end DNA getting longer and longer. How did that happen? And Jack Szostak and I found that when you put a tetrahymena and a telomere into yeast, yeast telomere repeats, it got joined on to the tetrahymena repeats. So that was mysterious. And I was intrigued by another observation from the geneticist, the cytogeneticist who really conceptualised and named the features of telomeres, although not the name of telomeres, that is important, Barbara McClintock, maize geneticist and she had conceptualised telomeres and had even found a mutant that failed to heal broken ends which can normally happen if ends are broken at certain stages in development. Now when you've got a mutant that fails to do something, that says ah ha, there must be a normal process here. So all these pieces of the puzzle were there. Was there something going on in cells that could extend telomere DNA. So now as my little advice for the young moving into their careers here, ok so this was the question, we had a lot of interesting hints here that there may be something going on. Now you can't sit and write a grant application and say well I think I might find a new enzyme. Doesn't go down well with the review sections, ok. But you can, you can have wonderful funding which opens up the possibility which says let's look at how telomeres work. And I'm so grateful to a funding agency like the NIH that said you have a grant that's called structure and function of telomerics and within that I could run with the question. But I also want to tell you another very important thing that matter to me and that helped. Now I was studying the telomeric DNA, I was studying proteins associated with telomeric DNA. And what I then did was I got tenure and I had my grant and so I felt really brave, I thought ah I can do anything I like, I've got tenure, I've got a grant, right. So there's a very empowering feeling, even though of course I realised, you know later that that's not always true, that you can't do everything you like. But I felt very empowered because I had tenure and I had a grant, so I thought I'm just going to start looking for this enzyme activity. Now we kept the normal sort of things in our lab going, right, things that were on the grant application, things that were, you know things that were producing steady results. But I thought well I'll just try and do these experiments. And started to get hints that it was working. And then another important thing happened was that I would present this to people as they decided to join the lab and I'd say I've got this project, so one of my very sober post doctoral fellows said I think, when he came, he said I think Liz I don't think I'll work on this rather risky project. But Carol Greider, my graduate student who joined the lab, Carol was happy to do that and she thought it was the most interesting project in the lab and so I think that's very important, you know to find PhD students who want to go for what they think is the most interesting projects in the lab, even though it mightn't be the one that generates results. But in this case it did and so what in the end we were able to do was to have a synthetic DNA and I'd been doing this with restriction enzymes and pieces of DNA and seeing bits of DNA added on that looked like telomeric DNA was being added. But we refined it down to putting in a DNA oligonucleotide. And we were just able to get them, again grab the technology when it becomes available because synthetic DNA, oligonucleotides were just becoming available to the research community, so we grabbed this opportunity, had a synthetic DNA made and then we found that it could get elongated after a lot of painful work with cell extracts. We could find an enzymatic activity that made that DNA longer by adding more repeats. And so the important point was that here I had a student who was willing to take on a project that was risky but this person thought, Carol thought this was the most interesting of the projects in the lab. And then as I said we could take advantage of technologies, there was terrific biochemical technologies in terms of enzymologist out there, we could use the precedence that people had from DNA replication studies to make our cell extracts and so forth and incubate and make reactions. And as I said along came the technology which happened to be DNA oligo synthesis. So what we found was this enzyme telomerase, so now I'm depicting the end of a chromosome in the ciliated protozoan tetrahymena which being a rich source of short DNAs, I reasoned would probably be a rich source of any enzyme that might be making these DNAs. And so sure enough if you look at a chromosome end in tetrahymena very simplified, just showing the DNA here, what it does is it gets elongated by the enzyme telomerase which is a truly fascinating enzyme because it's made up of both RNA and DNA. They both help the reaction work, although the catalytic, sorry it's made of RNA and protein, the catalytic site is actually the protein, it's not the RNA. But the RNA plays crucial roles in making that protein catalytic site work. It's a fascinating collaboration of protein and RNA. In that RNA and the crucial thing that I've shown you on the slide here is a short RNA sequence that's copied into DNA, just by adding nucleotides and so the DNA gets elongated. So here was in the test tube the wherewithal for overcoming that DNA replication problem, the end replication problem that I alluded to. So here it was in the test tube, did it actually work this way in cells. And so we used tetrahymena and my student Guo-Liang Yu developed a technology for introducing genes back into tetrahymena. So we had to sort of build it up from the roots so to speak. But we could get the first evidence that you needed telomerase in cells. Now in tetrahymena, I didn't tell you but these organisms are mortal, they just keep growing, if you feed them and talk to them nicely they'll keep on multiplying, right, forever, they're immortal, right. So they must have very good DNA repair systems by the way. And they had plenty, so to speak of telomerase. Now were those 2 facts related, right. So what do you do, well you experimentally interfere with the telomerase and genetically make it not work anymore. So that's what we did. And so then we found that now in the next 20 or so generations the telomeres progressively shortened and shortened and the cells ceased to divide. Now when I say genetically kill telomerase, I'll make a confession to you. This sounds all very deliberate, right, like we set out to kill it. Actually we were doing a different experiment at the time. We were looking at the RNA and asking about its templating ability. But we were very lucky because one of the mutations turned out not to be copied into the DNA and we were very frustrated by it but then we noticed oh look the telomeres are getting shorter and the cells are dying. And then we found that the enzyme was no longer active in the cells. And so then ah this was a very useful mutant. But we hadn't actually set out to ask that immediate question. But again what the take home from this was, always look at what the organism is telling you, right, we hadn't designed that particular experiment with that in mind but it turned out to be absolutely the perfect experiment to answer the question of do you need telomerase because we inadvertently made a mutation that ablated or ruined, spoiled, killed the activity of the enzyme in cells. And so that enabled us to ask the question, that I now put up here and looks as though I planned to say this and do this, planned to do this experiment but we actually just lucked into it. We probably would have tried this experiment next but we were lucky and got a mutant that worked. And so what it did was we struck at the heart of the activity of the ability of these cells to multiple, so this was really, you know these cells all died, right. The telomeres ran down and they died. So the important message was an immortal organism, all you had to do was mutate the component of telomerase. It was the RNA, we knew what it was, very, very exactly and the cells became mortal. So that told us that telomerase was maintaining telomeres. Ok so now we knew something about telomere structure which has repeated DNA, these DNA sequences are made by telomerase and they're maintained by telomerase in a very complex highly regulated process. And what that accomplishes for the cells is to make a platform, a platform of DNA binding sites upon which bind a great many very interesting, interactive proteins that bind the DNA sequence specifically. They have protein partners and they very dynamically associating and disassociating with the telomere. But the point is they make a sheath and that protective sheath is the whole point for the telomeres and that's the cap, that's the protective cap, ok. And we always liked it, you know it's like the aglet at the end of your shoe lace, right. But as I said there's this inherent problem and that is that telomeres because of their inherent replication properties and because now we know nuclease activities, telomeres have a propensity to shorten. So it's like the shoe lace end frayed away, right, the tip got lost and now you have a frayed shoe lace. And this is a very bad situation, the cell responds very clearly to this. And what happens is that that very shortened telomere sends a signal to the cells and the cells will not multiple. And in fact they can undergo genomic instabilities. So this frayed end if you will, which is just a metaphor is very literally a shortened telomere or telomeres and that prevents cells from multiplying. So bottom line is that if you have too much erosion the cells will not live, ok. Now let's got to human situations. Ok so now we're going to switch to well how does this all work out in humans. So now we have a very different situation from say tetrahymenas or yeasts and things like that, that just keep multiplying. We have now us and you know in developed societies for example where conditions are good, you know we can expect life expectances of something like 80 degrees, 80 years, sorry, thinking of the warm weather we're having in Lindau today. We have in life expectancy around 80 years. And you know maximum life span is what, somewhere around 120, that kind of thing, right. So now our lives are lived out over many, many decades. Well we certainly know that the underlying molecular machineries are going to be similar, you know across all the eukaryotes that's been amply seen. You know we have telomerase just as do tetrahymenas and yeast and so forth. But the important point is that the kinetics of all of this is now going to be played out over very long, you know decades of life. So how does it all play out? So that's been the subject of research for many, many different labs in the last few decades. So a simple observation, very broad brush and there will be exceptions, is that in a general way telomerase is often limiting in adult human cells. And so they do in fact undergo some shortening and various systems in the body one can see evidence that this is likely to be occurring, that the telomeres are progressively shortening and senescence is occurring. And one can see evidence for that in vivo, in people. Now the question was does that cellular phenomenon play out in our lifetimes, you know does the candle burning down for the telomeres so to speak, does that actually get reflected in human life courses or not. So that was the question that many, many labs had been collecting evidence for. And so I'm going to tell you first of all just a very brief overview of what's been seen and then I want to take you into some aspects of what might influence this process. Ok so back to the basics, what would first influence this process would be whether you have telomerase or not. And so many analysis have been done on where do we find telomerase in human cells. First of all normal cells, well in normal cells, in cells that are going to have to be effectively immortal or have very long replicated life spans you find actually plenty of telomerase. Like in stem cells, in germ cells, germ lineage cells, you know we're all here today, that's because our germ lineages have telomerase. Keeps the telomeres going from generation to generation. And in certain stem cells that will have long proliferative properties throughout life, notably the immune system. But you also find telomerase in other cells and we found that actually quite instructive, to look at other cells and particularly cells of the immune system and particularly cells in peripheral blood where you can take a sample from somebody with a pretty non-invasive blood draw. And healthy people will give you blood and you can study telomeres and how they're being maintained using the white blood cells, the immune system cells from a blood draw as a kind of a window into the cells. And now we can even find, as I'll show you later, we can even do it with saliva as well because there's a lot of cells that leak out into your saliva and it gives you a nice source of genomic DNA as well. And so we can quantify the telomerase in blood cells and so you might expect, you know more or less telomerase will be influencing how short the telomeres get, how quickly. And we also can measure telomere length, obviously in such cells. Now another thing that's important is that we do find that telomerase is very highly activated in cancer cells. And cancer cells as you know have among their many undesirable properties, the property of too much replication. The cells proliferate too much because they've undergone mutations and epigenetic changes that have now made them ignore signals to cease multiplying and to go to the right places in the body and so forth. And so cancer cells are rogue cells, they're out of control and telomerase allows those out of control cells to maintain their telomeres and keep on multiplying. So in the context of cancer cells, telomerase is actually very bad news. But the cancer cells have undergone a great many other changes. And in fact the high telomerase often doesn't appear in the common cancers until they're pretty advanced. I'm actually not going to talk about telomerase in cancer cells today, it's a fascinating question, there are interesting questions of can you inhibit it or monkey around with it to kill cancer cells but I want to focus today on the normal cells, ok. So let's just imagine what situations we might expect to play out over the decades of you know of human life. So imagine in germ cells, well we'll have the cells stay maintained, you know just like tetrahymena or yeast and so you know we expect a balance between shortening and lengthening because the telomeres over all are maintained. And there's a great deal of genetic and non-genetic control of these processes as I'll talk about in a moment. But you can also imagine the balance goes in the other direction and this has been seen for certain immune cells as they go through certain multiplicative stages in the body, telomeres actually get longer in normal differentiated cells. So that generality I showed you, they don't always have to get shorter but they often do get shorter. And so if you have some telomerase, you could imagine that they would be getting shorter by those natural processes shortening but telomerase might try and keep them up and so you know it might be able to stave off the, you know terrible moments when the telomeres get too short, for quite a while but senescence would eventually come. And that would be later than everything else being equal if there were less telomerase. And then it would, you know not be able to stave off senescence for so long. So how would all these things work and we know even from a yeast cell which has 350 genes, at least and counting which influence telomere lengths and length distributions. So we know this process is going to be under many, many elaborate genetic controls. So we expect genetic controls and we expect non-genetic controls because everything is influenced by non-genetic effects too. That will be the main topic that I'll get to but I just wanted to tell you that the reason that we got very interested in this is that over the years many groups have seen that many of the common diseases of aging and including cancers but many of these diseases that characterise aging humans have been linked to shorter telomeres in the normal cells. This is just a sampling of the kinds of diseases in which you see this association and the list of the authors on the right is extremely incomplete, it's just a little sampling. On the left is the common diseases and if you look at these diseases you can see that they include some of the big killers and the big serious medical problems in populations, cancer, pulmonary fibroses, cardiovascular disease, vascular dementia, degenerative conditions, diabetes, in fact risk factors for some of these. This has been seen in associative studies. And so let's just think about it, let's think about this means. And we are interested in this symposium, in this wonderful meeting on big questions of global health. And this just shows the graph for, I think this is the US numbers and it's going to be true in different degrees around the world, that we have a situation where there's an aging population first of all and I just pulled something from an article that was published on the 25th of June just a couple of days ago, nearly 10% of the world's adults have diabetes. The prevalence is rising and the point is that it's not just in developed countries, this is arising in developing countries, this is really a world-wide problem, 10% almost of the world's adults in all countries across the world have diabetes. And the prevalence is only going up. So we've got some big health issue and we heard about several of them yesterday. But I think we really have to think about these ones as well. And today I bring up these ones because our research has tied what we are understanding about telomere maintenance in humans to this kind of disease, of which diabetes is one example. Ok so it's a rising problem. Ok so what have I just said, I've just said that telomere shortness in the general population, that's people overall, in mini cohorts around the world, has been associated with common diseases of aging, ok. And so what's going on. Well is it telomere maintenance that's causing the shortness. So what you do is of course, you turn to human genetics and you look at rare Mendelian mutations and you say what can you learn from those. They've been very instructive in humans and people have deliberately using mouse models removed telomerase from mice and it's very clear that in humans the rare telomerase mutations that occur in people, that are known to cause telomere shortness, because they make telomerase work less well. They interrupt the enzymatic activity of telomerase or its ability to add telomeres, ok. So mutated telomerase genes which is just, you know the luck of the draw, right, the roulette wheel you know spins and your parents give you some combination of genes, right. So that's the luck of the genes. And in this case the bad luck of the genes. And that leads to telomere shortness. And it's very clear that there's a disease impact of this, both in people and in the mouse models where it's been done experimentally. And these sorts of diseases, their prevalence goes way up, they become very prone to these diseases. And look at that list, it starts to remind you of the list that I showed you before, these common diseases of aging in the general population. Which are associated with telomere shortness. Here in these rare mutations we've got causality so now of course the interesting question is well what about the common snips, the common variations in the genome that cause telomeres to be shorter, do they also lead to disease. Those studies which are much more complex epidemiologically and people have only just started posing them, are already suggesting yes. And there's a beautiful case, case of cancer where a certain cancer, it's bladder cancer, quite a common one, you can see that a snip that causes telomere shortness also causes bladder cancer. And part of that effect is mediated through the telomere shortening, ok. So that genetically speaking we know is the case. Now I'm going to turn to what's been very interesting to us and that is non-genetics. And do know when you think about future challenges, you know genetics, I'd say we've got genetics, if you will well in hand. Now I mean that's a trivial statement in some ways because of course there's huge complexities still, but we get it, we get it with genetics. We understand yes genes have effects, yes the genes interact, yes we know they're important to varying degrees. You know there's a lot of ways we can study this. And it's being done very activity and very productively. Let's do something harder. You know let's have some fun here, right let's choose something that's more difficult, non-genetic things. And this was, my next sort of point is that when somebody comes to you with a really interesting question that just grabs you and you think that person is good at that kind of research, go for it. So we started a collaboration. And this was wonderful because our friends in the UCSF department of psychiatry were very interested in chronic stress and we found low and behold that we could interact with them and show that people in which chronic stress by the way is a known risk factor for common diseases such as cardiovascular, that telomere shortness was associated with chronic stress. And my timing is up and so what I'm going to do is, that was the message, the important thing was that we found that it causes telomere shortening. Things that happen to you in childhood such as multiple trauma exposures influence your telomeres when you're an adult. And that's what this graph here is showing. And so we've become very, very fascinated by this question. And so now we've realised when I'm just going to zoom through all this, I had much too much to say to you, I knew I'd be so excited. And we're really trying to understand the interactions between chronic stress, telomere shortening which we know it causes and diseases. And how these all interact. So the bottom line was that we look over time and we see effects but my wonderful technician decided he would set up a machine for analysing 100,000 telomere lengths, he built a very complicated robot and here it is in action here, ok. So we were able to get, you know tones of telomeric DNA information out. And so now I'm going to end with this because this is going to be my plea to all of you who are really interested in huge complicated data sets and how you analyse those. Because what we did was we generated, as my marvellous technician said, more telomere length data than ever before, right. So here it is, you know this is the just the raw data right, tones, 100,000 people but the beauty is that it's tied in with a wonderful project of genome wide association, 675,000 different snips on these 100,000 people. And 20 years of clinical information all longitudinal electronic health records, data. So this is going to be so exciting to use all of this marvellous information and start relating all these things together. Because the end is that we really want to understand this road of life, we want to understand telomere loss on the one hand, telomere gain on the other hand, telomere maintenance. We know there's genetic components and what I didn't tell you but it's published, is we know adverse childhood events and chronic psychological stress are putting you on the telomere shortness and disease risk side of things. Education I'm very happy to tell you is clearly related to longer telomeres as is exercise and stress reduction. So on this happy note I want to finish and just tell you why we think this is important because I think there's so much more to be learned. And these are the folks in my lab and our collaborators with whom we have so much fun addressing what I think are important questions when we think about the question of human health, we're seeing very common sorts of disease situations which are growing world-wide. So I want to throw the challenge out to you, once we've solved these acute problems, these severe problems of infectious diseases and the major health problems in the world, why don't you look ahead to the next decades and say what are we left with, we're left with these other chronic diseases and these other diseases and I think we should think about how do we deal with the very complex problem of preventing these diseases. We want to treat the acute ones, let's think about how we prevent the other diseases that we're going to be left with now we survive all of the acute infectious and other diseases. Thank you very much.

Haben Sie vielen Dank und guten Morgen zusammen. Es ist wunderbar an diesem Morgen so viele Gesichter hier zu sehen. Ich habe das Gefühl, als schaute ich auf die Zukunftshoffnung von so vielem, was wir, denke ich, in der biomedizinischen, medizinischen und biologischen Forschung in Zukunft sehen werden. Seien Sie also alle willkommen. Ich freue mich sehr, heute hier sein und diesen Vortrag halten zu können. Mein Vortrag wird Ihnen etwas über die Wissenschaft erzählen, über meine Reise, die mit der Grundlagenforschung begann und mich in letzter Zeit zu Fragen geführt hat, die mit menschlicher Gesundheit und menschlichen Erkrankungen in Zusammenhang stehen. Ich werde Ihnen ein wenig über die Anfangsphase meiner Arbeit erzählen und dann zu demjenigen Aspekt übergehen, der mit der menschlichen Gesundheit und mit Krankheiten zu tun hat. Und ich werde Ihnen ein bisschen davon erzählen, wie ich damit angefangen habe. Dann werde ich Ihnen berichten, wie wir in letzter Zeit angefangen haben, die interessanten Implikationen all dieser Dinge zu untersuchen. Also Telomere sind die Enden von Chromosomen. Und dieser Art von unscharfem Bild, auf dem Sie die Telomere hier in rosa aufleuchten sehen: Das war so ziemlich alles, was man über Telomere wusste, in dem Stadium, in dem die Zytogenetiker Chromosomen unter dem Mikroskop betrachteten und sehen konnten, dass Telomere etwas am Ende von Chromosomen sind. Und wenn ich sage "etwas", dann meine ich, Sie waren mehr durch das definiert, was sie nicht sind. Sie verhielten sich nicht wie Brüche des DNA-Strangs, sie versuchten sich nicht selbst zu reparieren, wenn es zu einem Bruch kam. Sie waren zwar das Ende der DNA, aber kein "abgebrochenes" Ende. Und so entwickelte man die Vorstellung, dass sie sich von DNA-Brüchen deutlich unterschieden. Doch was waren sie dann? Ein Telomer wurde mehr durch das definiert, was er nicht tat, als durch das, was er in Wirklichkeit war. Ich hatte also das Glück, mich mit dieser Frage zu beschäftigen. Denken Sie also zunächst an die Möglichkeit zurück, denken Sie an eine Welt, in der sich die DNA nicht sequenzieren lässt, ok. Das war die Welt, in der ich in Cambridge in England im Labor von Fred Sanger, der später selbst Methoden der DNA-Sequenzierung entwickelte, die Arbeit an meinem Projekt begann. Doch wir wussten nicht, wie man die DNA-Sequenz analysiert. Und da gab es dieses wundervolle Rätsel: Wie war die DNA an den Enden der Chromosomen nur beschaffen? Und da ich im Labor von Fred Sanger war, wurde ich mit den damals aufkommenden Methoden sehr vertraut, die man bei dem Versuch, die DNA Sequenz zu analysieren, entwickelt hatte. Sie bestanden darin, dass man mithilfe einer Vielzahl chemischer und biologischer Methoden versuchte, Nukleotide in kleinen Abschnitten zusammenzufügen. Auf die Einzelheiten kommt es nicht an, doch ich will damit sagen, dass Sie sich nicht vorstellen können, wie unmöglich es damals war, die Sequenz der DNA zu analysieren. Doch zumindest schien es so, als seien die Enden ein Zugangsweg zur DNA. Und so wendete ich mich, indem ich an die Yale Universität und das Labor von Joe Gall ging, einem System zu, mit dem man tatsächlich an die Enden der chromosomalen DNA herankam, d.h. an die DNA von Eukaryoten und ihre Chromosomen, die natürlich linear sind. Der Grund hierfür war, dass Joe Gall und andere entdeckt hatten, dass es sehr kurze Chromosomen gibt, und zwar in sehr großer Zahl. Und eine bestimmte Art von ihnen fand man in diesem Tier, das auf diesem Dia dargestellt ist. Es handelt sich dabei um das mit Cilien besetzte Urtierchen Tetrahymena. Und dies ist insofern kein berühmter Organismus in dem Sinne, als er keine Krankheiten verursacht und es ist keines der beliebten Modellsysteme. Er wird allerdings heute für bestimmte Fragen, die mit Telomeren in Zusammenhang stehen, sehr häufig verwendet. Es war lediglich ein unbekannter Organismus, der in Teichen lebt. Doch er verfügte über diese große Anzahl linearer, kurzer Chromosomen, und das erlaubte mir - wenn Sie so wollen auf biochemische Weise - molekulare Techniken zu verwenden, mit denen ich an diese herankommen, sie isolieren und so analysieren konnte, was sich an den Enden dieser Chromosomen abspielte. Tatsächlich fand ich heraus, dass sie mit sich wiederholenden Sequenzen endeten. Es war sehr seltsam, wissen Sie. Es gab keinen vergleichbaren Fälle, die hätten erklären können, warum sie dies tun sollten. Sie endeten mit kurzen sich wiederholenden Sequenzen. In dieser Abbildung hier sehen Sie die Wiederholungseinheit. Dies also waren die Chromosomen in Tetrahymena, und sie endeten in kurzen Wiederholungssequenzen. Zusammen mit Jack Szostak, der an einem anderen Institut arbeitete, fanden wir dann heraus, dass dasselbe bei der Hefe geschieht. Und ich sollte Ihnen sagen, dass dies ein Beispiel dafür ist, wie wunderbar es sein kann, zu Treffen zu gehen und Gespräche zu führen. Denn Jack und ich kamen ins Gespräch. Ich hatte gerade über die Telomere von Tetrahymena gesprochen, und wir sprachen darüber - um eine lange Geschichte kurzzufassen - wie man diese Information nutzen könnte, um an die Telomere der Hefe heranzukommen. Wir verfolgten die Sache und wir konnten am Ende der Hefechromosomen in etwa ähnliche Formen von Wiederholungssequenzen beobachten. Nun, ein bisschen unregelmäßig, wie Sie anhand der Formeln auf diesen Dias sehen können, doch von derselben Art. Dies war also keine Besonderheit dieses merkwürdigen kleinen Tieres, das im Oberflächenfilm von Tümpeln lebte. Dies war etwas wesentlich Allgemeineres. Und in der Tat wurde dies auch von anderen gefunden. Man fand es in kriechenden Schimmelpilzen, und diese Art von Sequenzen zeigten sich an den Enden von Chromosomen. Es sah also so aus, als sei dies ein recht allgemeingültiges Phänomen. Und wissen Sie, aus der Molekularbiologie wussten wir tatsächlich - selbst damals schon, bevor wir die DNA-Sequenz korrekt analysieren konnten -, dass die grundlegenden Prinzipen des Lebens, wenn man es sich in seiner Breite anschaut, natürlich sehr ähnlich waren. Es war also nicht weiter erstaunlich, dass man hier einige allgemein gültige Entdeckungen machte. Dennoch war es gut, dies herausgefunden zu haben. Dies erlaubte es uns also im Prinzip eine Frage zu stellen, die schon von anderen gestellt worden war und die aus dem Mechanismus der DNA-Replikation hervorging, der - wie Sie sich erinnern - mit Hilfe wunderschöner, komplizierter DNA-Replikationsenzyme abläuft, eines wunderschönen Satzes dieser Enzyme, die auf wunderbare Weise alle internen Regionen der chromosomalen DNA kopiert, d.h. sämtliche lineare DNA. Doch wenn es um das Kopieren dieser Enden geht, sind sie einfach hoffnungslos überfordert, und zwar aufgrund der mechanischen Aspekte der DNA-Replikation. Ich werde die Einzelheiten nicht erläutern. Man findet sie in jedem Lehrbuch. Worum es mir geht, ist jedoch Folgendes: Der wunderbar komplizierte, intelligente DNA-Replikationsmechanismus, der die genetische Information im Inneren der Chromosomen so erfolgreich und originalgetreu kopiert, versagt an den Enden der Chromosomen. Die Enden können also nicht repliziert werden. Jedes Mal, wenn eine DNA repliziert wird, wenn sie linear ist und sofern nicht etwas anderes passiert, wird sie kürzer und kürzer und immer kürzer. Dies war also ein Rätsel, das seit den frühen 1970er Jahren wohl bekannt war, und zum Beispiel von Olovnikov und Watson als solches auch klar formuliert worden war. Dies war ein Rätsel. Und nun wussten wir, was sich am Ende der Chromosomen befindet. Es gab also dieses Problem, und zusätzlich gab es eine ganze Menge interessanter Teilinformationen. Ich werde sie hier auflisten. Denn manchmal klingt es so - wenn man sagt, dass man Telomere entdeckt hat - als seien sie aus dem Himmel gefallen oder als sei man darüber gestolpert. So war es nicht. Ich glaube, dies ist typischer für die tatsächliche Wissenschaft, dafür wie, die wirkliche Wissenschaft voranschreitet. Was geschah, war Folgendes: Es gab verschiedene Hinweise, die nicht alle aus einem System stammten. Es gab in Tetrahymena Hinweise darauf, dass die Zahl der Wiederholungen an den Chromosomenenden in der Molekülpopulation unterschiedlich war. Man konnte feststellen, dass während der Entwicklung neuer Chromosomen in diesem Organismus - er hat einen sehr komplizierten Lebensstil - neue Telomere erzeugt werden, und sie werden an Nicht-Telomere angefügt. Wie ging das vor sich? Es gab eine interessante Beobachtung in dem Organismus, der die Schlafkrankheit verursacht: Wenn diese Organismen sich vermehrten, konnte man beobachten, wie die Enden der DNA länger und immer länger wurden. Wie kam es dazu? Und Jack Szostak und ich fanden heraus, dass - wenn man ein Tetrahymena-Telomer in Hefe bringt - dass dieses Telomer wiederholt wird: Es wurde an die Wiederholungssequenzen von Tetrahymena angefügt. Dies war höchst geheimnisvoll. Und ich war von einer anderen Beobachtung der Genetiker, der Zytogenetiker fasziniert, die die Eigenschaften der Telomere auf den Begriff gebracht und benannt hatten, obwohl sie den Begriff Telomere nicht erfunden hatten, das ist wichtig. Barbara McClintock, eine Genetikerin, die sich mit Mais befasste, hat Telomere theoretisch beschrieben. Sie fand sogar eine Mutante, der es nicht gelang, gebrochene Enden zu reparieren. Diese treten in der Regel in bestimmten Stadien der Entwicklung auf. Wenn man also eine Mutante gefunden hat, die etwas Bestimmtes nicht tun kann, kommt es zu einem Aha-Erlebnis: Es muss hier einen normalen Prozess geben. Alle Teile des Puzzles lagen vor uns: Fand in den Zellen etwas statt, wodurch die Telomer-DNA verlängert werden konnte? Nun möchte ich den Jungen, die am Beginn ihrer Karriere stehen, einen kleinen Ratschlag geben, ok. Dies war also die Frage. Wir verfügten über eine Fülle interessanter Hinweise, dass hier möglicherweise etwas geschah. Nun kann man sich nicht hinsetzen und einen Antrag für Forschungsgelder schreiben und sagen: Das kommt bei den Leuten, die diese Anträge durchsehen, nicht gut an, ok. Doch man kann, man kann wunderbare finanzielle Unterstützung kommen, die einem die Forschungsmöglichkeit eröffnet, indem man sagt: "Lasst uns untersuchen, wie Telomere funktionieren." Ich bin einem Geldgeber wie dem NIH so dankbar, der sagte: Sie haben ein Stipendium mit dem Titel: "Struktur und Funktion der Telomerik". Unter dieser Überschrift kann ich der Frage nachgehen. Doch ich möchte Ihnen außerdem noch eine andere äußerst wichtige Sachen erzählen, die mir wichtig ist und die mir geholfen hat. Ich untersuchte nun also die DNA der Telomere. Ich studierte Proteine, die mit der DNA der Telomere in Zusammenhang standen, und dann geschah Folgendes: Ich erhielt eine feste Stelle und meine Forschungsgelder. Dadurch fühlte ich mich sehr mutig. Ich dachte mir: "Ah, ich kann tun, was ich will! Ich habe eine feste Stelle, ich habe Forschungsgelder, oder etwa nicht?" Dies war ein sehr bestärkendes Gefühl, obwohl ich natürlich später erkannte, dass das nicht immer wahr ist, dass man nicht alles tun kann, was man möchte. Doch ich fühlte mich sehr dadurch bestärkt, dass ich eine feste Stelle und Forschungsgelder hatte, und so dachte ich mir: Wir ließen also die normalen Arbeiten in unserem Labor weiterlaufen, ok, Arbeiten, die in dem Forschungsantrag beschrieben waren und die stetige Ergebnisse lieferten. Doch ich dachte mir: "Ok, ich werde einfach versuchen, diese Experimente durchzuführen", und ich erhielt Hinweise darauf, dass dies tatsächlich funktionierte. Dann geschah noch etwas Wichtiges: Ich stellte dies Leuten vor, als sie sich dem Labor anschlossen, und ich sagte ihnen: Einer meiner sehr nüchternen PostDoc-Fellows sagte, glaube ich, als er ankam: Doch Carol Greider, eine Doktorandin von mir, die in unser Labor kam, war bereit dies zu tun. Sie meinte, dies sei das interessanteste Projekt im Labor. Ich denke, es ist sehr wichtig, wissen Sie, Doktoranden zu finden, die sich auf das einlassen, was sie für das interessanteste Projekt am Labor halten, selbst wenn es nicht dasjenige ist, das Ergebnisse liefert. Doch in diesem Fall lieferte es Ergebnisse, und was uns schließlich gelang, war die Herstellung synthetischer DNA. Ich hatte dies bereits mit Restriktionsenzymen und DNA-Bruchstücken getan, und es zeigte sich dabei, dass DNA-Bruchstücke, die wie Telomer-DNA aussahen, angefügt wurden. Doch wir entwickelten die Sache zur Einfügung eines DNA-Oligonukleotids weiter. Und wir waren in der Lage davon zu profitieren, dass wir DNA-Oligonukleotids bekommen konnten. Wieder konnten wir Technologie nutzen, als sie soeben erst verfügbar geworden war, da synthetische DNA, Oligonukleotide, der Forschergemeinschaft gerade erst verfügbar geworden waren. Also griffen wir diese Gelegenheit beim Schopf und ließen eine synthetische DNA herstellen. Dann stellten wir fest, dass sie nach langer, mühevoller Arbeit mit Zellextrakten verlängert werden konnte. Wir konnten eine Enzymaktivität finden, die die DNA dadurch verlängerte, dass sie weitere Wiederholungssequenzen anfügte. Der wichtigste Aspekt war also, dass ich da eine Studentin hatte, die bereit war, ein riskantes Projekt zu übernehmen, aber diese Person, Carol, dachte, dies sei das interessanteste Projekt im Labor. Und dann konnten wir, wie gesagt, die Vorteile von Technologien nutzen. Es gab fantastische biochemische Technologien in der Enzymologie. Wir konnten, um unsere Zellextrakte herzustellen usw. und um Inkubationen und Reaktionen durchzuführen, die früheren Erfahrungen nutzen, die Leute in DNA-Replikationsstudien gesammelt hatten. Wie ich bereits erwähnte, lief uns die Technologie über den Weg, bei der es sich zufällig um die DNA-Oligosynthese handelte. Was wir fanden, war dieses Enzym Telomerase. Jetzt zeige ich Ihnen das Ende eines Chromosoms im cilienbesetzten Urtierchen Tetrahymena, bei dem es sich um eine reiche Quelle kurzer DNAs handelt. Ich ging davon aus, dass dieser Organismus wahrscheinlich auch eine reiche Quelle für jegliche Enzyme sein würde, die diese DNAs herstellen würden. Und tatsächlich: Wenn man sich ein Chromosomende in Tetrahymena sehr vereinfacht anschaut, nur die DNA hier betrachtet, so geschieht hier Folgendes: Es wird durch das Enzym Telomerase verlängert. Dies ist ein wahrhaft faszinierendes Enzym, weil es sowohl aus RNA als auch aus DNA besteht. Beide Teile tragen zum Erfolg der Reaktion bei, obwohl der katalytische - Entschuldigung, es besteht aus RNA und Protein. Die katalytische Stelle ist tatsächlich das Protein. Es ist nicht die RNA. Doch die RNA spielt eine entscheidende Rolle dabei, diesen Ort der Proteinkatalyse funktionsfähig zu machen. Es ist eine faszinierende Zusammenarbeit zwischen einem Protein und der RNA. Und die entscheidende Sache, die ich Ihnen auf dem Dia hier gezeigt habe, ist eine kurze RNA-Sequenz, die in die DNA kopiert wird, einfach indem Nukleotide hinzugefügt werden, und auf diese Weise wird die DNA verlängert. In diesem Reagenzglas hatten wir also, was man brauchte, um das Problem der DNA-Replikation zu lösen, das Problem der Replikation der Enden, auf das ich angespielt habe. Hier war es also im Reagenzglas. Funktionierte es auch auf diese Weise in Zellen? Also verwendeten wir Tetrahymena und mein Student Guo-Liang Yu entwickelte eine Technologie, mit der man die Gene wieder in Tetrahymena zurückbringen konnte. Wir mussten die Sache sozusagen "von den Wurzeln her" wieder aufbauen. Doch wir erhielten die ersten Hinweise darauf, dass man Telomerase in Zellen benötigt. Nun, die Tetrahymena, ich habe Ihnen dies nicht gesagt, aber diese Organismen sind unsterblich. Sie vermehren sich einfach immer weiter. Wenn man sie füttert und freundlich mit ihnen spricht, vermehren sie sich endlos weiter. Sie sind unsterblich. Sie müssen also, nebenbei bemerkt, über sehr gute DNA-Reparatursysteme verfügen. Und sie besaßen jede Menge Telomerasen, sozusagen. Hingen diese beiden Tatsachen zusammen? Was tut man also? Nun, man manipuliert die Telomerase experimentell, und sorgt mit genetischen Methoden dafür, dass sie nicht mehr funktioniert. Das also taten wir. Dann stellten wir fest, dass in den nächsten 20 Generationen oder so, die Telomere nach und nach immer kürzer und kürzer wurden, und die Zellen hörten auf sich zu teilen. Wenn ich nun davon rede, dass wir die Telomerase genetisch zerstört haben, mache ich Ihnen ein Geständnis. Dies klingt alles sehr absichtlich nicht wahr, als hätten wir den Plan gehabt, sie zu zerstören. Tatsächlich führten wir damals ein anderes Experiment durch. Wir betrachteten die RNA und fragten uns nach ihrer Fähigkeit, als Schablone zu dienen. Doch wir hatten sehr großes Glück, weil es sich herausstellte, dass einige der Mutationen nicht in die DNA kopiert wurde, was uns sehr frustrierte. Doch dann bemerkten wir: "Oh, seht mal. Die Telomere werden kürzer und die Zellen sterben". Und dann stellten wir fest, dass das Enzym in den Zellen nicht mehr aktiv war. Und dies war nun also eine sehr nützliche Mutante. Doch wir hatten nicht damit begonnen, diese unmittelbare Frage zu stellen. Wieder war die Lektion dieser Sache: Schau immer nach dem, was der Organismus dir sagt. Wir hatten dieses besondere Experiment nicht mit dieser Frage im Hinterkopf entworfen. Doch es erwies sich als das absolut perfekte Experiment zur Beantwortung der Frage: "Braucht man Telomerase?" Denn wir hatten zufällig eine Mutation erzeugt, die die Aktivität der Enzyme in den Zellen beeinträchtigt oder ruiniert, verdirbt, zerstört. Und dies versetzte uns also in die Lage, die Frage zu stellen, die ich jetzt hier oben hinstelle. Und es sieht so aus, als ob ich die Absicht gehabt hätte, dies zu sagen und zu tun, als ob ich geplant hätte, dieses Experiment durchzuführen. Doch wir sind einfach durch einen glücklichen Zufall darüber gestolpert. Wahrscheinlich hätten wir dieses Experiment als nächstes durchzuführen versucht. Doch wir hatten Glück und erhielten eine Mutante, die funktioniert. Und was dies für uns bedeutete, war: Wir hatten das Zentrum der Fähigkeit dieser Zellen gefunden, sich zu vermehren. Dies war also wirklich.... Wissen Sie, alle diese Zellen starben. Die Telomere wurden immer kürzer und sie starben. Die wichtige Lektion war also ein unsterblicher Organismus: Wir mussten lediglich die Komponente der Telomerase mutieren. Es war die RNA. Wir wussten, was es war, sehr, sehr genau. Und die Zellen wurden sterblich. Das sagte uns, dass die Telomerase die Telomere erhielt. Nun gut, wir wussten nun also etwas über die Telomerstruktur, bei der es sich um sich wiederholende DNA handelt. Diese DNA-Sequenzen werden durch Telomerase hergestellt, und sie bleiben durch einen sehr komplizierten, hochgradig gesteuerten Prozess erhalten. Und was leistet das für die Zellen? Es erstellt eine Plattform, eine Plattform von DNA-Bindungsstellen, an die sich sehr viele sehr interessante interaktive Proteine binden, die speziell die DNA-Sequenz binden. Sie haben Proteinpartner und gehen auf dynamische Weise mit dem Telomer Verbindungen ein und lösen sie wieder auf. Doch das Wichtige ist: Sie erstellen eine Hülle, und diese Schutzhülle ist der ganze Zweck der Telomere. Und das ist diese Kappe. Das ist die Schutzkappe, ok. Ich vergleiche sie immer mit der Hülse am Ende von Schnürsenkeln. Doch wie ich sagte, gibt es dieses inhärente Problem, dass Telomere - aufgrund der ihnen wesentlichen Replikationseigenschaften und weil wir mittlerweile Nuklease-Aktivitäten kennen - dass Telomere die Tendenz haben, kürzer zu werden. Es ist also so, wie das verschlissene Ende eines Schnürsenkels: Sie haben die schützende Hülse verloren, und nun dröselt sich der Schnürsenkel auf. Und dies ist eine sehr schlechte Situation. Die Zelle reagiert eindeutig darauf. Was passiert, ist Folgendes: Dieses sehr verkürzte Telomer sendet ein Signal an die Zellen, und die Zellen stellen ihre Teilung ein. Tatsächlich können sie Instabilitäten ihres Genoms durchmachen. Und dieses "verschlissene Ende" - bei dem es sich lediglich um eine Metapher handelt - ist im wahrsten Sinne ein verkürztes Telomer oder es sind verkürzte Telomere, und das hindert Zellen an der weiteren Teilung. Zusammenfassend lässt sich also sagen: Wenn man zu viel Abnutzung hat, leben die Zellen nicht weiter, ok? Schauen wir uns nun also Situation beim Menschen an. Wir kommen nun zu der Frage: "Wie funktioniert all dies beim Menschen?" Wir haben jetzt eine deutlich andere Situation vor uns, als bei Tetrahymena oder Hefen und solchen Organismen, die sich einfach endlos weiter teilen. Wir haben es jetzt mit uns selbst zu tun. Und Sie wissen, dass wir in den Industriegesellschaften, in denen die Lebensbedingungen gut sind, zum Beispiel eine Lebenserwartung von etwa 80 Grad haben, Entschuldigung, von 80 Jahren - ich denke an das warme Wetter, das wir heute in Lindau haben. Wir haben eine Lebenserwartung von etwa 80 Jahren. Und die maximale Lebensdauer beträgt etwa 120 Jahre. Sie entspricht in etwa diesem Wert. Unser Leben erstreckt sich heute über viele Jahrzehnte. Nun, wir wissen mit Sicherheit, dass die dem zugrundeliegenden molekularen Prozesse bei allen Eukaryoten ähnlich sein werden. Das hat man umfassend beobachtet. Wissen Sie, wir haben Telomerase ebenso wie Tetrahymena und Hefen usw. Doch der wichtige Aspekt hieran ist, dass die Genetik all dieser Dinge sich nun über einen sehr langen Zeitraum manifestiert, über Jahrzehnte des Lebens. Wie also spielt sich das alles ab? Das war in vielen, vielen verschiedenen Labors in den letzten paar Jahrzehnten das Forschungsthema. Eine einfache Beobachtung also - grob umrissen, und es wird Ausnahmen geben - lautet, dass die Telomerase durch einen allgemeinen Vorgang häufig die erwachsenen menschlichen Zellen an weiteren Teilungen hindert. Sie werden also tatsächlich kürzer, und in vielen Systemen des Körpers findet man Hinweise darauf, dass wahrscheinlich Folgendes geschieht: dass die Telomere immer kürzer werden und der Alterungsprozess voranschreitet. Man kann Hinweise darauf in vivo, bei Menschen beobachten. Nun, die Frage lautete: Spielt sich dieses zelluläre Phänomen im Laufe unseres Lebens ab? Brennt die Kerze sozusagen für die Telomere ab? Zeigt sich das tatsächlich im Lauf des menschlichen Lebens, oder nicht? Das war die Frage, zu deren Beantwortung viele, viele Labors Beweismaterial zusammengetragen haben. Und so werde ich Ihnen also als erstes einen sehr kurzen Überblick über das geben, was man beobachtet hat. Anschließend möchte ich mit Ihnen einige Aspekte dessen bedenken, was diesen Prozess beeinflussen könnte. Ok, gehen wir also zurück zum Grundsätzlichen! Was diesen Prozess als erstes beeinflussen würde, wäre die Tatsache, ob man über Telomerase verfügt oder nicht. Es wurden so viele Analysen dazu durchgeführt, wo wir in menschlichen Zellen Telomerase finden. Zunächst die normalen Zellen: Nun, in normalen Zellen, in Zellen, die tatsächlich unsterblich sein müssen oder die eine sehr lange Replikationslebensspanne haben, findet man sehr viel Telomerase, zum Beispiel in Stammzellen, Keimzellen, Keimbahnzellen. Wissen Sie, wir alle sind heute hier, weil die Zellen unserer Keimbahnen Telomerase enthalten. Sie erhalten die Telomere von Generation zu Generation. Und in bestimmten Stammzellen, die während ihres ganzen Lebens über lange andauernde proliferative Eigenschaften verfügen, besonders im Immunsystem. Doch man findet Telomerase auch in anderen Zellen, und wir fanden das eigentlich sehr instruktiv, andere Zellen anzuschauen und besonders Zellen des Immunsystems und Zellen des peripheren Blutes, wo sie jemandem mit einer ziemlich nicht-invasiven Blutentnahme eine Probe entnehmen können. Gesunde Leute geben einem Blut, und man kann anhand der weißen Blutkörperchen, der Zellen des Immunsystems aus einer Blutprobe, die Telomere untersuchen und wie sie erhalten werden, als eine Art Fenster in die Zellen. Heute können wir dies sogar, wie ich Ihnen später zeigen werde, anhand von Speichel untersuchen, denn es gibt viele Zellen, die in Ihren Speichel gelangen, und er gibt einem auch eine gute Quelle genomischer DNA. Und so können wir die Telomerase in Blutzellen quantifizieren, und so könnte man erwarten, dass die Telomerase mehr oder weniger beeinflussen wird, wie kurz die Telomere werden, und in welcher Zeit. In solchen Zellen können wir natürlich auch die Länge der Telomere bestimmen. Eine weitere wichtige Entdeckung war, dass die Telomerase in Krebszellen stark aktiviert ist. Und Krebszellen haben, wie Sie wissen, außer ihren vielen anderen unerwünschten Eigenschaften, die Eigenschaft, zu viel zu wachsen. Die Zellen wachsen zu viel, weil sie mutiert sind und epigenetischen Änderungen unterlagen, die dazu geführt haben, dass sie die Signale ignorieren, die ihnen zeigen, dass sie die Vermehrung einstellen und sich an die richtige Stelle im Körper bewegen sollen usw. Krebszellen sind also bösartige Zellen, die keiner Kontrolle unterliegen, und die Telomerase erlaubt diesen unkontrollierten Zellen, ihre Telomere zu erhalten und sich weiter zu vermehren. Im Zusammenhang mit Krebszellen ist die Telomerase wirklich eine schlechte Sache. Doch die Krebszellen haben zahlreiche andere Änderungen durchgemacht. Tatsächlich erscheint in gewöhnlichen Krebszellen eine erhöhte Telomerase-Konzentration erst, wenn sie sich in einem ziemlich fortgeschrittenen Stadium befinden. Über die Telomerase in Krebszellen werde ich heute nicht sprechen. Es ist eine faszinierende Frage. Es gibt interessante Fragen darüber, ob man sie hemmen oder manipulieren kann, um die Krebszellen zu zerstören. Doch für heute werde ich mich auf die normalen Zellen konzentrieren, ok? Stellen wir uns also einfach vor, von welchen Situationen wir erwarten könnten, dass sie sich in den nächsten Jahrzehnten im menschlichen Leben ereignen werden. Stellen Sie sich die Situation in Keimzellen vor. Nun, die Zellen werden erhalten bleiben, genau wie bei Tetrahymena oder der Hefe. Und daher wissen wir, dass wir eine Balance zwischen der Verkürzung und Verlängerung erwarten, da die Telomere im Großen und Ganzen erhalten bleiben. Es gibt eine Menge genetischer und nicht-genetischer Steuerungen dieser Prozesse, wie ich Ihnen sogleich erklären werden. Doch Sie können sich auch vorstellen, dass die Balance in die andere Richtung geht, und dies hat man bei bestimmten Immunzellen beobachtet, während sie verschiedene multiplikative Stadien im Körper durchlaufen. In normalen differenzierten Zellen werden Telomere tatsächlich länger. Also diese Allgemeingültigkeit, die ich Ihnen gezeigt habe: Sie müssen nicht immer kürzer werden, doch häufig werden sie kürzer. Und wenn die Zellen über etwas Telomerase verfügen, könnten Sie sich vorstellen, dass sie durch diese natürlichen Prozesse kürzer werden, doch die Telomerase könnte versuchen, ihre Länge zu erhalten. Sie könnte in der Lage sein, den furchtbaren Moment, in dem die Telomere zu kurz werden, eine ganze Zeit lang aufzuschieben. Doch der Alterungsprozess würde schließlich doch weitergehen. Und das wäre - wenn alles andere gleich bliebe - später als alles andere, wenn es weniger Telomerase gäbe. Und könnte sie die Alterung nicht so lange aufschieben. Wie würden alle diese Dinge funktionieren? Wir wissen sogar aus einer Hefezelle, dass sie 350 Gene hat - mindestens, wir zählen noch -, die die Länge der Telomere und die Längenverteilungen beeinflussen. Wir wissen also, dass dieser Prozess sehr vielen genetischen Steuerungen unterliegt. Wir erwarten demnach genetische Steuerungen und wir erwarten nicht-genetische Steuerungen, da alles auch von nicht-genetischen Einflüssen mitbestimmt wird. Das wird das Hauptthema sein, dem ich mich zuwende. Doch ich wollte Ihnen noch kurz sagen, dass der Grund dafür, warum wir hieran so ein großes Interesse entwickelten, der ist, dass viele Arbeitsgruppen erkannt hatten, dass viele übliche Erkrankungen des Alterns - einschließlich der Krebsleiden, aber auch viele Krankheiten, die für alternde Menschen charakteristisch sind - mit kürzeren Telomeren in den normalen Zellen in Zusammenhang gebracht worden sind. Dies ist nur eine kleine Auswahl der Krankheiten, bei denen Sie diese Zuordnung finden, und die Liste des Autors auf der rechten Seite ist äußerst unvollständig, es ist nur eine kleine Auswahl. Auf der linken Seite sehen Sie die üblichen Krankheiten. Wenn Sie sich diese Krankheiten ansehen, werden Sie erkennen, dass sich darunter einige der Krankheiten wiederfinden, die zu den häufigsten Todesursachen gehören, und die in den Bevölkerungen zu den ernsten medizinischen Problemen führen: Krebs, pulmonale Fibrosen, Herzkranzgefäßerkrankungen, vaskuläre Demenz, degenerative Zustände, Diabetes, sogar Risikofaktoren für einige von ihnen. Dies hat man in verwandten Studien erkannt. Lassen Sie uns einfach darüber nachdenken. Denken wir darüber nach, was dies bedeutet. Wir sind an diesem Symposium interessiert, an diesem wunderbaren Treffen zu den großen Fragen der globalen Gesundheit. Und dies zeigt das Diagramm für.... Ich glaube dies sind die Zahlen für die USA. Es wir in unterschiedlichem Ausmaß überall auf der Welt zutreffen: dass wir zunächst die Situation haben, in der die Bevölkerung überaltert. Ich haben soeben erst etwas aus einem Aufsatz entnommen, der am 25. Juni veröffentlicht wurde, vor nur wenigen Tagen. Fast 10 % der Erwachsenen haben Diabetes. Die Häufigkeit nimmt zu, und das Wichtige ist, dass dies nicht nur für die Industrienationen gilt. Sie steigt in den Entwicklungsländern. Dies ist ein wahrhaft globales Problem: 10 % der Erwachsenen weltweit, in allen Ländern, leiden an Diabetes. Und die Häufigkeit nimmt nur zu. Wir haben also einige große Gesundheitsfragen. Über mehrere von ihnen haben wir heute bereits etwas gehört. Doch ich denke, dass wir auch über diese Fragen nachdenken müssen. Ich spreche diese Fragen heute an, weil unsere Forschung das, was wir über die Erhaltung von Telomeren beim Menschen verstehen, mit dieser Art von Krankheiten, von denen Diabetes ein Beispiel ist, in Verbindung gebracht hat. Ok, es ist also ein wachsendes Problem. Ok, was habe ich soeben gesagt? Ich habe gesagt, dass die Kürze von Telomeren in der allgemeinen Bevölkerung, d.h. bei der Mehrzahl der Menschen, in kleinen Gruppen weltweit, mit häufigen Alterserkrankungen in Verbindung gebracht worden ist. Ok. Was geht also vor? Nun, sind es die "Wartungsarbeiten" an den Telomeren, was zu dieser Verkürzung führt? Was man in dieser Situation tut, ist natürlich, dass man sich der Humangenetik zuwendet und sich seltene Mendel'sche Mutationen anschaut, und man stellt fest, was man davon lernen kann. Sie sind beim Menschen sehr instruktiv gewesen. Und Forscher haben in Versuchen mit Mäusen absichtlich Telomerase entfernt. Außerdem ist es eindeutig, dass die seltenen Telomerase-Mutationen, die beim Menschen auftreten, die Enzymaktivität der Telomerase oder ihre Fähigkeit beeinträchtigen, Telomere hinzuzufügen. Sie unterbrechen die enzymatische Funktion der Telomerase oder ihre Fähigkeit, Telomere hinzuzufügen, ok. Mutierte Telomerasegene sind einfach reine Glückssache. Das Rouletterad dreht sich und Ihre Eltern geben Ihnen irgendeine Kombination von Genen. Es ist das Glück der Gene, und in diesem Fall das Unglück der Gene. Das führt zur Kürze der Telomere. Es ist sehr deutlich, dass dies eine Krankheitsfolge hat, sowohl beim Menschen als auch im Mausmodell, wo dies in Experimenten durchgeführt worden ist. Diese Art von Krankheiten, ihre Häufigkeit nimmt stark zu. Die betroffenen Organismen werden für diese Krankheiten sehr anfällig. Schauen Sie sich diese Liste an. Sie beginnt sie an die Liste zu erinnern, die ich Ihnen vorhin gezeigt habe, diese generellen Erkrankungen, die in der allgemein Bevölkerung mit dem Alterungsprozess und mit der Kürze von Telomeren in Zusammenhang stehen. Hier, bei diesen seltenen Mutationen, haben wir es mit einer Kausalkette zu tun. Die interessante Frage lautet nun: Wie verhält es sich mit den gewöhnlichen Verkürzungen, den allgemeinen Variationen im Genom, die zur Folge haben, dass Telomere kürzer sind. Führen auch sie zu Krankheiten? Diese Untersuchungen, die epidemiologisch wesentlich komplexer sind - man hat soeben erst begonnen, diese Frage zu stellen - legen bereits eine positive Antwort nahe. Und es gibt einen wunderbaren Fall, einen Fall von Krebs, bei dem man bei einem bestimmten Krebs - dem Blasenkrebs, einer ziemlich häufigen Form von Krebs - sehen kann, dass eine Verkürzung, die zu kürzeren Telomeren führt, auch Blasenkrebs verursacht. Ein Teil dieser Wirkung wird durch die Kürzung der Telomere vermittelt. Genetisch gesehen wissen wir, dass dies der Fall ist. Nun wende ich mich einem Thema zu, dass sehr interessant für uns gewesen ist: den nicht-genetischen Faktoren. Wissen Sie, wenn man über künftige Herausforderungen nachdenkt, die Genetik... Ich denke, wir haben die Genetik, wenn man so will, fest in der Hand. Nun, ich meine, dass das in mancher Hinsicht eine triviale Feststellung ist, denn natürlich gibt es nach wie vor ungeheur komplexe Zusammenhänge. Doch wir verstehen es, wir kommen mit der Genetik klar. Wir verstehen, dass Gene Auswirkungen haben. Ja, Gene wirken wechselseitig aufeinander ein. Ja, wir wissen, dass sie unterschiedlich wichtig sind. Es gibt viele verschiedene Wege, auf denen wir dies untersuchen können, und dies geschieht mit großer Intensität auf äußerst produktive Weise. Lassen Sie uns etwas Schwierigeres tun. Lassen Sie uns etwas Spaß haben, ok? Wählen wir etwas aus, was schwieriger ist: nicht-genetische Faktoren. Und mein nächster Punkt ist, wenn jemand mit einer wirklich interessanten Frage zu Ihnen kommt, die Sie einfach ergreift, und wenn Sie denken, dass diese Person für diese Art von Forschung gut geeignet ist, dann greifen Sie zu! Wir begannen also eine Zusammenarbeit. Und das war wunderbar, denn unsere Freunde in der Abteilung für Psychiatrie am UCSF waren sehr an chronischem Stress interessiert. Wir fanden - man höre und staune -, dass wir mit Ihnen zusammenarbeiten und zeigen konnten, dass Patienten, bei denen, nebenbei bemerkt, chronischer Stress ein bekannter Risikofaktor für allgemeine Erkrankungen war, etwa der Herzkranzgefäße, dass die Kürze von Telomeren mit chronischem Stress assoziiert war. Meine Zeit ist zu Ende, und was ich tun werde ist.... Das war die Botschaft. Das Wichtige war, dass wir herausfanden, dass Stress eine Verkürzung der Telomere bewirkt. Dinge, die einem in der Kindheit zustoßen, wie zum Beispiel mehreren Traumata ausgesetzt zu sein, haben einen Einfluss auf die Telomere, wenn man erwachsen ist. Das ist es, was aus diesem Diagramm hier hervorgeht. Daher hat uns diese Frage sehr, sehr fasziniert. Nun haben wir also erkannt... Wenn ich in einem Schritt durch alle diese Dinge gehe, ich hatte Ihnen viel zu viel zu sagen. Ich wusste, dass ich so aufgeregt sein würde. Wir versuchen wirklich die Interaktion zwischen chronischem Stress und der Verkürzung der Telomere zu verstehen, von der wir wissen, dass sie zu Krankheiten führt. Wir versuchen zu verstehen, wie alle diese Dinge miteinander zusammenhängen. Das Fazit war also, dass wir uns die Sachen in der zeitlichen Entwicklung anschauen, und wir sehen Auswirkungen. Doch mein wunderbarer technischer Assistent entschied, dass er eine Maschine zur Analyse der Länge von 100.000 Telomeren einrichten würde. Er baute einen sehr komplizierten Roboter, und hier sieht man ihn in Aktion, ok. Wir konnten also massenweise Informationen über die DNA der Telomere bekommen. Und nun werde ich hiermit enden, denn es ist meine Bitte an Sie alle, die sie an wirklich komplizierten Datensätzen interessiert sind und daran, wie man sie analysiert. Denn was wir taten, war, wir erstellten - wie mein wunderbarer technischer Assistent sagte - mehr Daten über Telomerlängen als jemals zuvor. Hier sind sie also. Dies sind einfach die rohen Daten, ok, tonnenweise, 100.000 Leute. Doch das Schöne ist, dass sie mit einem wunderbaren Projekt der genomweiten Assoziation verbunden sind: mit 675.000 Verkürzungen bei diesen 100.000 Leuten. Und 20 Jahren klinischer Daten, alles longitudinale, elektronische Gesundheitsdaten. Dies wird so faszinierend sein, diese wunderbaren Informationen zu verwenden und damit zu beginnen, sie miteinander in Beziehung zu setzen. Denn das eigentliche Ziel ist, dass wir diesen Lebensweg wirklich verstehen wollen. Wir möchten den Verlust der Telomere auf der einen Seite, den Gewinn von Telomeren auf der anderen verstehen, die Erhaltung der Telomere. Wir wissen, dass es genetische Komponenten gibt. Und was ich Ihnen nicht gesagt habe - es ist jedoch publiziert - wir wissen, dass negative Ereignisse in der Kindheit und chronischer psychischer Stress zu einer Verkürzung der Telomere und damit zu einem erhöhten Krankheitsrisiko führen. Bildung, das freue ich mich Ihnen sagen zu können, ist eindeutig mit längeren Telomeren assoziiert, ebenso wie körperliche Betätigung und Stressreduktion. Mit diesem erfreulichen Hinweis möchte ich schließen und Ihnen lediglich sagen, warum ich denke, dass dies so wichtig ist: Weil ich denke, dass es so viel mehr zu lernen gibt. Und dies sind die Leute in meinem Labor und unsere Mitarbeiter, mit denen wir so viel Spaß haben bei der Konfrontation mit Fragen, die meines Erachtens wichtig sind, wenn wir über Fragen menschlicher Gesundheit nachdenken. Wir sehen sehr allgemein verbreitete Krankheitssituationen, die weltweit zunehmen. Ich möchte Sie zur Annahme dieser Herausforderung einladen, nachdem wir die akuten Probleme, diese schweren Probleme der ansteckenden Krankheiten und der größten globalen Gesundheitsprobleme gelöst haben werden. Warum schauen Sie nicht in die Zukunft der nächsten Jahrzehnte und sagen, was uns noch bleibt. Uns bleiben diese anderen chronischen Erkrankungen und diese anderen Krankheiten, und ich denke, wir sollten uns um das sehr komplexe Problem kümmern, wie wir diese Krankheiten verhindern. Wir wollen die akuten Krankheiten behandeln. Lassen Sie uns darüber nachdenken, wie wir die anderen, die übrig bleiben werden, verhindern können, jetzt, da wir die akuten Infektionen und anderen Krankheiten überleben. Haben Sie vielen Dank.

Elizabeth Blackburn on telomeres and disease
(00:30:11 - 00:33:04)


Challenged by Unmet Expectations

Despite of promising discoveries of curiosity-driven basic research such as the ones of Blackburn and her co-laureates, however, the drug delivery pipelines of the pharmaceutical industry seem to have dried out since the turn of the century. The attrition rates in the process of drug development between target identification and the approval of a new drug have risen dramatically. The high hopes placed on the full sequencing of the human genome have not been fulfilled so far. Have the low-hanging fruits all been picked? Has the grace of serendipity left us? Are the complex processes of health and disease more complicated than anticipated? Why are we having trouble in making new drugs available for patients? Brian Kobilka, a medical doctor, who earned the Nobel Prize in Chemistry 2012 together with Robert Lefkowitz for their studies on GPCRs, shared his insights on this issue in his lecture in Lindau in 2013:


Brian Kobilka on current challenges for drug discovery
(00:05:50 - 00:13:01)

 

Many experts share Kobilka’s notion that the signaling behavior of receptors and their second messengers is too complex for a one target, one disease, and one drug approach. It may be necessary “to move away from the descriptions of single proteins, receptors and so on and to view the entire signal chain as the target”.[5] This approach may, for example, justify the success of the various multikinase inhibitors, which have amended traditional chemotherapies and considerably improved cancer treatment during the last decade. In the future, the success of this multi-target-approach will also depend on substantial input from systems biology. In times when “translational research” has become a mostly uncritically used buzz-word, it might perhaps also be advisable to remember the important role, which serendipity and careful clinical observations have played in the past: “In considering the historical perspective of drug discovery and the role of serendipity, it can be argued that the emphasis on translational research diverts scientists from pursuing basic-science studies that give rise to fundamental discoveries. In many cases, retro-translational research (from clinic to basic science) is necessary before the disease process can be understood well enough for scientists to develop therapeutics.”[6]


Footnotes:
[1] Cf. History of aspirin. (2014, May 31). In Wikipedia, The Free Encyclopedia. Retrieved 08:03, June 19, 2014, from http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=History_of_aspirin&oldid=610986069

[2] Drews J. Drug discovery: a historical perspective. Science, 17 March 2000; 287: 1960 - 1963.

[3] Imming P, Sinning C and Meyer A. Drugs, their targets and the nature and number of drug targets. Nature Reviews Drug Discovery, October 2006; 5: 821-834.

[4] Drews J. l.c. 

[5] Imming et al., l.c., p. 825.

[6] Fricker LD. Drug discovery over the past thirty years: Why aren’t there more new drugs? Einstein Journal of Biology & Medicine, March 2013; 29: 61-65, p.61. 


Additional Lindau Lectures on Drugs and Their Targets:

1958: Hans von Euler-Chelpin „Chemische Struktur und biochemische Wirkungen“

1964: Linus Pauling „The structure of molecules in relation to medical problems“

1972: Feodor Lynen „Cholesterol and arteriosclerosis“

2007: Craig Mello „RNAi and development in C. elegans“

2011: Peter Agre „Aquaporin water channels: From atomic structure to malaria“

2013: Aaron Ciechanover „Drug development in the 21st century – Are we going to cure all diseases?“



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