Thomas A. Steitz (2014) - From the Structure of the Ribosome to New Antibiotics

Structural studies of the ribosome exemplify the evolution of structural studies in cell biology from the early negatively stained images of macromolecular assemblies in whole cells, to a detailed atomic understanding of the mechanisms of action of a large assembly

Well, it’s a pleasure to be here once again. And I’m going to talk about our studies again with the ribosome and eventually trying to understand antibiotic resistance. I just wanted to say a couple of words on how I... what my pathway was. In 1968 Brian Hartley who was an enzymologist in Cambridge at the LMB suggested my first project. There’s Brian. He came up to me in the hall which is what happened in Cambridge. And he said: “Tell me, what are you going to do when you go on for your next job?” And I said: He patted me on the back and he said: “There, there my boy, you ought to do something you can do. I suggest hexokinase.” So I thanked him and I ran off to the laboratory to find out what hexokinase did. And I discovered that Dan Koshland had used hexokinase as a model for why one had to have induced fit. He asked the question: “Why is it that ATP is not hydrolysed in the absence of glucose because glucose is just a water molecule with some carbon atoms?” And he said: “It’s because the glucose...” He proposed, he hypothesised glucose is inducing the conformational change necessary for catalysis. So we said: “Ok let’s find out.” And we solved the structure of hexokinase without glucose. And then we did it with glucose. And indeed it goes (click). And Koshland was right. But then we decided we had to move forward. And having been at both Harvard and Cambridge and knowing both Watson and Crick, I decided it was important to study the central dogma put forward by Crick. That is DNA gets copied into DNA. So we worked on replication, the replisome for many, many years. Gets transcribed into RNA by RNA polymerases. And is regulated at this stage. We’ve studied that for many years. And then finally as you heard in the last talk the ribosome reads out the tickertape and arranges the tRNase on the ribosome for protein synthesis. And so I’m going to concentrate on that last stage. Just as an aside, in 1989 about 20 years after my conversation with Brian Harley we solved the structure of glutamyl tRNA synthetase complex with glutamine tRNA. It was very... it was the first time and it was very interesting. And once again Hartley was right. You have to do the right problem at the right time. It’s great to have great ideas but you must do it at just the right time. So we then decided to start on the ribosome. This is what Jim Watson told me the ribosome was about. And when I was at Harvard, large sub-unit, small sub-unit, tRNA in the E-site, P-site, peptide. And then synthesis occurs. There were a few things that weren’t known then. Didn’t know the structure of tRNA. Didn’t know there was a tunnel for the exit. Didn’t know there was an E-site tRNA. And structural details were missing a bit. Then Jim Lake did some studies of the ribosome by electron microscopy, did the individual sub-units, found that they snuggle up together to form a complex. That was pretty good. Still didn’t tell you much about molecular detail. And then Joachim Frank actually in 1995 published this cryo-EM. The first cryo-EM which is now a method taking off I would say. But at this point it’s still relatively low resolution. And the positions of the tRNA were not exactly right. But getting there. So we decided in 1995 that it was time to move on to solve the structure of the ribosome. And there were 2 pivotally important individuals, Nenad Ban to begin with and then Poul Nissen who grew the crystals and started the structure and were important in solving the structure of the 50S ribosomal sub-unit. This is what the low resolution cryo-EM looked like. You can sort of make out what the structure is. There is a person holding a torch on his knees. You know it’s hard to get molecular detail out of this. But in 1998 we got our first 9 angstrom resolution map. That began to show some of the details but had the same shape. So we knew we were on the right path. And then we moved to higher resolution. And in 2000 we got a 2.4 angstrom resolution map. And there’s the structure that we saw in 2000 of the 50S ribosomal sub-unit. And it was kind of a surprise to us and to everybody to know that the RNA was so tightly packed. We had no idea that RNA could be quite so tightly packed. And there’s the peptidyl transferase centre marked by this inhibitor. Mostly there’s no protein in the neighbourhood. And there’s a lot of tightly packed RNA. Proteins scattered around on the surface. Now if you split the ribosome sub-unit in half like an apple, you can see the peptidyl transferase centre. And now you can see the tunnel, about 100 angstroms long. And in green are proteins that are extending into the interior of the ribosome. So there are bits of the protein that go into the ribosome and stabilise the structure. But you can see how tightly the RNA, in white, is packed. So here is the 70S ribosomal sub-unit with the RNA curved around and making complex structure. There it is, very complex. To misquote Watson: RNA is not boring like DNA. It has very complex structure. And the proteins are scattered around on the surface. And the tRNA, the decoding centre as you’ve heard is in the small ribosomal sub-unit. And the peptide bond formation is in the large sub-unit. So one of the things we wanted to study was the source of the ribosome’s catalytic power and peptide bond formation. Crick hypothesised in 1968 that the ribosome was a ribozyme realising of course that how could you have a machine that makes proteins, be made out of protein before there was a protein. So he suggested it must be RNA. And indeed we found that turns out to be true. I had a marvellous graduate student, Martin Schmeing who initiated this work and did most of the work, I’ll talk briefly about, and made the movie that you’ll see. And this is the reaction that’s catalysed by the ribosome. We have an amino acid on the A-site tRNA. The alpha amino group attacks the carbonyl carbon of the peptidyl group and the peptidyl tRNA in the P-site to form a tetrahedral intermediate which then breaks down to give the products. I’m going to show you some results of the structural work but in the 50S sub-unit we only use CCA amino acid or peptide. More recently of course one can use the whole ribosome and tRNase and we’ve done that as well. So again splitting the ribosome 50S sub-unit in half, here is the polypeptide exit tunnel. Inside the box is where peptide bond formation occurs. And then without going into all of the many, many structures that were solved of the substrate complexes, this is eventually what Martin Schmeing and co-workers, what he found in the lab was happening at the catalytic site. The orientation of the P-site substrate here where the carbonyl carbon to be attacked there. And there’s the alpha amino group from the A-site substrate in a position to attack the carbonyl carbon interacting with the 2’ hydroxyl here and oriented by A2451. So what’s the mechanism? There’s a lot more known now and I won’t go into the details because it’s too much for this short talk. But the first step in understanding was Andrea Barta in Austria, her lab had proposed a proton shuttle mechanism in which a proton went from the alpha amino group of the attacking amino group, was transferred to the leaving 3 prime hydroxyl group. Now what we’ve subsequently found is it’s a much larger network of hydrogen bonds, including water and other side chains. But there is a sort of proton shuttling going on. So what’s the source of catalytic power? Actually like most enzymes the primary source of catalytic power is orienting the substrates properly for the chemistry. Get rid of that pesky entropy that has the molecules wandering around. The proton shuttle mechanism contributes chemically to it. And there may be some stabilisation of transition state, which is done by most enzymes. There are many steps in ribosome protein synthesis. And there’s an elongation cycle in which you have the peptidyl tRNA in the P-site, an empty A-site and an EF-Tu protein factor delivers a tRNA. And then it leaves and the tRNA with the amino acid is oriented. And then you get peptide bond formation. This is a low resolution structure of the process. But we have to know what the process is. And then this other factor, elongation factor G, EF-G comes in and causes translocation. And so the question I have is: how does this happen? Mostly what’s known is it comes in and it just sort of slips along. Well it must be more complex than that. So how does it go from here to here? What’s causing this change? What is the EF-G doing? It’s not just doing this on the fly. And we’ve discovered that’s true. Now with Peter Moore, a very important collaborator over the years on this project, we solved the structure EF-G by itself. But more recently we’ve solved the structure of complexes. Now the Ramakrishnan lab solved this structure of the complex of the EF-G in the post translocation state. We’ve solved the structure recently. Hopefully we can find a journal that’s willing to publish it because it’s so novel and you know you have to be... They don’t want to publish anything like this. And the compact confirmation. So this factor, the components of the factor have moved dramatically from where they are in the elongation complex. If you look at 4 and then see where 4 moves to. It’s moved a lot. And so then the question is: What’s happening? You know these 2 very large changes in the structure. And what’s happening? Well, look it’s swinging in like that. And so the thought is that maybe, maybe the conformational change is causing the translocation. We can make a movie of that with the thing moving. But we just conclude that it’s the conformational change occurs in going from that pre-translocation state to the post translocation state that pushes the tRNase along to the next stage. So my last 10 minutes or so I’m going to turn my attention to again antibiotics and antibiotic resistance. And you’ve seen many articles about the problems of antibiotic resistance and the resulting deaths due to it. And the question is how do antibiotics bind in 50S ribosomal sub-unit and what are the mechanisms of the resistance. You’ve just heard some thoughts on that matter. Our work was done initially by Jeff Hanson a postdoc and then subsequently by others. And the tRNA binding site here split through the ribosome. There are different locations for antibiotics that we’re going to talk about. The tuberactinomycins here, capreomycin and viomycin bind near the decoding centre. And they’re important for TB. They’re A-site inhibitors, which I won’t talk about. And then the macrolides are a little bit about a bind down the tunnel a bit. And we’ve looked at many of them but I’ll just talk to you about a couple, just to give an example. The macrolides, there are different size macrolide rings. They all bind in the same place down the tunnel. They have different substituents which interact with the ribosomal RNA in different ways. There can be changes in the side chain basis from the ribosome. But mostly it’s pretty steady. And this is where peptide bond formation occurs. So what the macrolide is doing is blocking the process. So how does it work? Here again looking through the split tunnel, there’s the binding site. The macrolide is in red. And in green are bases whose mutation gives rise to resistance. And you can see that they’re all interacting. This group is all interacting with the macrolide. And so you might assume and I think correctly that it’s the change in the shape of the binding site that stops the binding. Now this is in the absence of the macrolide. And this is in the presence of the macrolide. We’re looking up the tunnel. And so how does the macrolide function? It’s functioning by what I call molecular constipation. It blocks the egress of the polypeptide down the tunnel. So the mutation of A2058 to a G lowers the binding constant by 10,000 fold. And it’s a G in haloarcula marismortui and it doesn’t bind a lot of antibiotics, that one. And if we look at where the macrolide binds, you can see that the N2 of that G is right under the macrolide ring. To look at this Daqi Tu and Gregor Blaha mutated the G to an A in the haloarcula making it a pseudo bacteria. And the binding constant changed by many orders of magnitude. We could see where it bound. And in fact it binds exactly in the same place, the same orientation, except that the macrolide ring is displaced presumably due to this pesky N2 that comes into the position. So what do we do with this information? There are different families of antibiotics that bind to many sites and nearby sites as you’ve heard in the last talk. So here the binding sites near the peptidyl transferase centre are close together. And so what’s being done is a company which started out being Rib-X founded by a number of us who were interested in this area and now Melinta Therapeutics are using these structures to design new antibiotics. And the slides I’m going to show now are all theirs. I’m just the conveyer of the information. So here again is the peptidyl transferase centre with different families of antibiotics all bound near to each other in the peptidyl transferase centre. And so what you want... The strategy is, is to take a piece of one and chemically tie it to a piece of another one. So here for example are 3 antibiotics. And the first one called Radezolid has quite increased potency. Actually I’ll mention a bit more about that. It’s again combining fragments here. And then you can also combine the macrolide. And most importantly -and I can’t... I have no slides to show what they’ve actually done- is to take this whole area and design a whole new family of antibiotics. And that’s looking very promising work against gram positive and gram negative bacteria. So this RX-01 family. This takes Linezolid which has no potency against a number of strains. Red is bad, anything over 4 is bad, very bad. If you make the Radezolid, the combo, it works very well. And also is true looking at various enterococci. You see that Linezolid is not so great. RX-02, that’s the enhanced macrolide. The same thing. If you look at the macrolide, the azithromycin very bad, very, very, very bad, 128 is nothing against all these strains. Make the combo and it’s very good. So the strategy works. And I should just say that it works and it’s being developed. The Linezolid has completed phase 2 clinical trials. And other things are along the way. And then just one last thing about the A-site binding sites and this is our work showing that the viomycin and capreomycin bind to the A-site. And it binds to the small sub-unit. And there is the binding site. It’s interacting with large and small sub-units. And this shows where it’s located. It interacts with the tRNA of the large sub-unit and the small sub-unit. And here is where the decoding happens. So it’s locking the ribosome in this position. So it can’t move forward. Ok, that’s nice to know. But what are you going to do with it? Well, it turns out there are many compounds now that are known that bind in this neighbourhood. There’s the viomycin here but there are many other compounds. And so if one could make money off of a TB antibiotic, not so obvious, and if one could get a drug company to develop it, I speculate that one could put these together in some way or other. Or to just use the surface to design a new compound that would work against TB. So the idea is that you could use this information to create an antibiotic that would be active against all these resistant strains. And this is a major problem because the XDR strain is resistant to everything. So this is a major point that, a major closing point that I want to make. And that is that basic research is very important. Basic research on the structure and function of the ribosome is leading to the development of new antibiotics that are proving effective against resistant bacterial strains. And there’s a lot of push in the US and other places for the NIA to support translational research. And I have to say the only translational research I’m in favour of is the ribosome. And so I’ll stop there. Thank you. Applause.

Ich freue mich sehr, wieder hier sein zu können. Und ich werde auch diesmal über unsere Forschung zum Ribosom berichten und wie wir letztendlich versuchen, die Antibiotikaresistenz zu verstehen. Ich möchte Ihnen kurz erzählen, wie ich… wie mein Weg war. Er kam in der Eingangshalle in Cambridge, wo man sich üblicherweise begegnete, auf mich zu und sagte: Und ich antwortete: „Nun, ich möchte zur Struktur des Aminoacyl-tRNA-Synthetasekomplexes mit tRNA arbeiten.“ Er klopfte mir auf die Schultern und sagte: Ich bedankte mich bei ihm und rannte ins Labor, um herauszufinden, welche Bedeutung die Hexokinase hat. Und ich fand heraus, dass Dan Koshland die Hexokinase als ein Modell dafür verwendet hatte, wozu man das „Induced fit”-Konzept braucht. Er stellte nämlich die Frage: Warum wird dieses ATP in Abwesenheit von Glucose nicht hydrolysiert, wenn doch Glucose nur ein Wassermolekül mit einigen Kohlenstoffatomen ist? Und er sagte: Das ist deshalb der Fall, weil die Glucose… Er vermutete, dass Glucose die Konformationsänderung herbeiführt, die für die Katalyse benötigt wird. Wir sagten also: Okay, das wollen wir herausfinden. Und wir klärten die Struktur der Hexokinase ohne Glucose auf. Und dann machten wir das Gleiche mit Glucose. Und das funktioniert tatsächlich (klick). Koshland hatte also Recht. Aber dann beschlossen wir, dass wir noch weitergehen sollten. Und nachdem ich sowohl in Harvard als auch in Cambridge gewesen war und sowohl Watson als auch Crick kannte, hielt ich es für wichtig, das zentrale Dogma zu untersuchen, das Crick aufgestellt hatte. Nämlich: DNA wird in DNA kopiert. So arbeiteten wir also lange, lange Jahre an der Replikation, dem Replisom, das durch RNA-Polymerasen auf RNA transkribiert und in dieser Phase reguliert wird. Wir haben das viele Jahre lang untersucht. Letztendlich, wie Sie im letzten Vortrag gehört haben, greift das Ribosom den „Lochstreifen“ ab und arrangiert die tRNase für die Proteinsynthese auf dem Ribosom. Und deshalb werde ich mich hier auf diese letzte Phase konzentrieren. Nur als Randbemerkung: klärten wir die Struktur des Glutamyl-tRNA Synthetasekomplexes mit Glutamin-tRNA auf. Das war sehr… das war das erste Mal und es war sehr interessant. Und wieder einmal hatte Hartley Recht behalten. Man muss sich zum richtigen Zeitpunkt mit dem richtigen Problem befassen. Es ist großartig, tolle Ideen zu haben, aber man muss sie auch zum richtigen Zeitpunkt umsetzen. Wir entschieden uns dann, mit dem Ribosom zu beginnen. Das hier hat mir Jim Watson über das Ribosom erzählt, als ich in Harvard war. Große Untereinheit, kleine Untereinheit, tRNA an der E-Stelle, P-Stelle, Peptid. Und dann findet die Synthese statt. Einiges war damals noch nicht bekannt. Man kannte die Struktur der tRNA nicht. Man wusste nicht, dass es einen Tunnel für den Ausgang gab. Man wusste nicht, dass es die E-Stellen-tRNA gibt. Und auch strukturelle Details waren nicht bekannt. Und dann führte Jim Lake einige Untersuchungen des Ribosoms mit dem Elektronenmikroskop durch. Er beschäftigte sich mit den einzelnen Untereinheiten und stellte fest, dass sie sich aneinander drücken, um einen Komplex zu bilden. Das war schon ziemlich gut, sagte aber immer noch nicht viel über die molekularen Details aus. Und dann veröffentlichte Joachim Frank schließlich 1995 diese Kryo-EM. Das war die erste Kryo-EM. Inzwischen ist diese Methode so richtig durchgestartet, würde ich sagen. Aber damals hatte das noch eine relativ geringe Auflösung. Und die Positionen der tRNA waren nicht exakt richtig, aber auf einem guten Weg. Deshalb beschlossen wir 1995, weiter an der Aufklärung der Ribosomenstruktur zu arbeiten. Und da hatten vor allem zwei Menschen eine zentrale Bedeutung: Nenad Ban und Poul Nissen, die die Kristalle züchteten, mit der Bestimmung der Struktur begannen und wichtig für die Aufklärung der Struktur der ribosomalen 50S-Untereinheit waren. Und so sah die Kryo-EM mit geringer Auflösung aus. Man kann die Struktur irgendwie erkennen. Da hält jemand eine Taschenlampe auf seinen Knien. Es ist sehr schwer, daraus die molekularen Details zu entnehmen. Aber 1998 hatten wir unsere erste Karte mit einer Auflösung von 9 Angström. Da waren zum ersten Mal ein paar Details zu erkennen, das hatte aber die gleiche Form. Wir wussten also, dass wir auf dem richtigen Weg waren. Und dann machten wir mit einer höheren Auflösung weiter. Und 2000 hatten wir dann eine Karte mit einer Auflösung von 2,4 Angström. Und das hier ist die Struktur der ribosomalen 50S-Untereinheit, wie wir sie im Jahr 2000 sahen. Und die dichte Bepackung der RNA war für uns und alle ziemlich überraschend. Wir hatten keine Vorstellung, dass RNA so dicht gepackt sein konnte. Und hier ist das Peptidyl-Transferase-Zentrum mit dem markanten Inhibitor. Meistens ist kein Protein in der Nähe. Und es gibt jede Menge dicht gepackte RNA und Proteine sind auf der Oberfläche verstreut. Wenn man die Ribosom-Untereinheit wie einen Apfel halbiert, sieht man das Peptidyl-Transferase-Zentrum. Und jetzt erkennen Sie den Tunnel, rund 100 Angström lang. Das Grüne sind die Proteine, die in das Innere des Ribosoms reichen. Kleinste Teilchen des Proteins dringen also in das Ribosom ein und stabilisieren die Struktur. Aber Sie sehen, wie dicht die RNA, in Weiß, gepackt ist. Hier ist die ribosomale 70S-Untereinheit mit der RNA darum herum, die eine komplexe Struktur bildet. Hier sehen Sie das. Sehr komplex. Um Watson falsch zu zitieren: RNA ist nicht so langweilig wie DNA. Es hat eine sehr komplexe Struktur. Und die Proteine sind rundum auf der Oberfläche verstreut. Und die tRNA, das dekodierende Zentrum, wie Sie gehört haben, befindet sich in der kleinen ribosomalen Untereinheit. Die Bildung von Peptid-Bindungen erfolgt in der großen Untereinheit. Eines der Dinge, die wir herausfinden wollten, war die Quelle der katalytischen Eigenschaften des Ribosoms und der Bildung von Peptid-Bindungen. Crick hatte 1968 die Hypothese aufgestellt, dass das Ribosom ein Ribozym sei, wobei er sich natürlich die Frage realisierte, wie es sein könnte, dass eine Maschine, die Proteine herstellt, aus Protein bestehen kann, bevor ein Protein da ist? Deshalb vermutete er, dass es sich um RNA handeln musste. Und in der Tat fanden wir heraus, dass das stimmte. Ich hatte einen fantastischen Doktoranden, Martin Schmeing, der diese Arbeit initiiert hat und den größten Teil der Arbeiten durchgeführt hat, über die ich kurz erzählen werde und der das Video hergestellt hat, dass Sie noch sehen werden. Und das ist die Reaktion, die vom Ribosom katalysiert wird. Wir haben eine Aminosäure an der A-Stellen-tRNA. Die Alpha-Aminogruppe attackiert den Carbonyl-Kohlenstoff der Peptidylgruppe und die Peptidyl-tRNA an der P-Stelle bildet ein vierflächiges Zwischenprodukt, das dann aufbricht und die Produkte ergibt. Ich werde Ihnen einige Ergebnisse der strukturellen Arbeit zeigen, aber in der 50S-Untereinheit verwenden wir nur CCA-Aminosäure oder Peptid. Inzwischen kann man natürlich das ganze Ribosom und die tRNase verwenden und das haben wir auch gemacht. Also nochmal: Wenn man die ribosomale 50S-Untereinheit halbiert, hat man hier den Polypeptid-Ausgangstunnel. Innerhalb des angezeigten Feldes erfolgt die Bildung der Peptid-Bindung. Und dann, ohne all die vielen, vielen Strukturen zu besprechen, die aus dem Substratkomplexen aufgeklärt wurden, ist schließlich hier das, was Martin Schmeing und Kollegen…was er im Labor herausgefunden hat, was an der katalytischen Stelle passiert. Die Ausrichtung des P-Stellen-Substrats hier, der Carbonyl-Kohlenstoff, der angegriffen wird, hier. Und das ist die Alpha-Aminogruppe vom A-Stellen-Substrat in einer Position, in der sie den Carbonyl-Kohlenstoff attackieren kann, der hier mit dem 2’-OH interagiert und durch A2451 ausgerichtet wird. Welcher Mechanismus liegt dem zugrunde? Heute wissen wir wesentlich mehr und ich werde nicht auf die Details eingehen, weil das im Rahmen dieses kurzen Vortrags zu viel wäre. Aber den ersten Verständnisschritt dazu hat Andrea Barta in Österreich beigetragen. Ihr Labor vermutete einen Protonenshuttle-Mechanismus, bei dem ein Proton von der Alpha-Aminogruppe, von der angreifenden Aminogruppe, auf die zurück gelassene 3‘-OH-Gruppe übertragen wurde. Später haben wir herausgefunden, dass es ein wesentlich größeres Netz von Wasserstoffbrücken gibt, insbesondere Wasser und andere Seitenketten. Aber auf jeden Fall erfolgt eine Art Protonenshuttle. Woher kommen diese katalytischen Eigenschaften? Tatsächlich ist die primäre Quelle der katalytischen Eigenschaften wie bei den meisten Enzymen die richtige Ausrichtung der Substrate für die Chemie. Die lästige Entropie, die die Moleküle herumwandern lässt, soll beseitigt werden. Der Protonenshuttle-Mechanismus trägt chemisch zu diesem Vorgang bei. Und es könnte eine gewisse Stabilisierung des Übergangszustands dazukommen, zu dem die meisten Enzyme beitragen. Es gibt viele Schritte in der Ribosom-Protein-Synthese. Und es läuft ein Elongationszyklus ab, bei dem es eine Peptidyl-tRNA an der P-Stelle gibt, eine leere A-Stelle und einen EF-Tu-Proteinfaktor, der eine tRNA liefert. Und dann zieht er sich zurück und die tRNA mit der Aminosäure ist ausgerichtet. Und so kommt es zur Bildung von Peptid-Bindungen. Das hier ist eine Darstellung der Prozessstruktur mit geringer Auflösung. Aber wir müssen wissen, wie der Prozess abläuft. Und dann kommt dieser andere Faktor, der Elongationsfaktor G, EF-G, ins Spiel und verursacht eine Translokation. Die Frage, die ich mir dann stelle, ist: Wie ist das möglich? Alles, was man weiß, ist, dass dieser Faktor eintrifft und irgendwie „vorbeigleitet“. Aber das muss wesentlich komplexer sein als das. Wie also entwickelt sich das von hier nach da? Was verursacht diese Veränderung? Was macht der EF-G? Das passiert nicht so mal eben. Und wir haben herausgefunden, dass das stimmt. Mit Peter Moore, einem über all die Jahre sehr wichtigen Kollegen in diesem Projekt haben wir die Struktur EF-G an sich aufgeklärt. In jüngerer Zeit haben wir sogar die Struktur von Komplexen aufgeklärt. Das Labor von Ramakrishnan hat diese Struktur des Komplexes von EF-G im Posttranslokationszustand aufgeklärt. Wir haben die Struktur vor kurzem aufgeklärt. Hoffentlich finden wir ein Fachjournal, das zur Veröffentlichung bereit ist, weil das so neu ist und man muss… die wollen einfach so etwas gar nicht veröffentlichen. Und die kompakte Konformation. Dieser Faktor, die Komponenten des Faktors haben sich weit von dem Punkt, an dem sie sich im Elongationskomplex befinden, wegbewegt. Wenn Sie die 4 betrachten und sehen, wo sich die 4 hinbewegt. Sie hat sich enorm bewegt. Und deshalb ist die Frage: Was passiert da? Man kennt diese beiden sehr großen Veränderungen in der Struktur. Was geschieht? Das schwingt da herein, wie hier dargestellt. Und deshalb denken wir, dass vielleicht die Konformationsänderung Ursache der Translokation ist. Wir können ein Video davon mit dem sich bewegenden Teil herstellen. Also wir gehen davon aus, dass es die Konformationsänderung ist, die auf dem Weg von diesem Prätranslokationsstatus zum Posttranslokationsstatus geschieht, die die tRNase zur nächsten Stufe treibt. In den letzten zehn Minuten meines Vortrags möchte ich meine Aufmerksamkeit erneut auf die Antibiotika und die Antibiotikaresistenz richten. Sie haben viele Artikel über die Probleme der Antibiotikaresistenz und die daraus resultierenden Todesfälle gelesen. Die Frage ist, wie Antibiotika sich an die ribosomale 50S-Untereinheit binden und welche Resistenzmechanismen bestehen. Sie haben gerade einige Gedanken dazu gehört. Unsere Arbeit wurde ursprünglich von Jeff Hanson, einem Postdoc-Mitarbeiter durchgeführt und dann von anderen fortgesetzt. Die tRNA-Bindungsstelle, hier ein Schnitt durch das Ribosom. Es gibt verschiedene Orte für Antibiotika, über die wir reden werden. Tuberactinomycine hier, Capreomycin und Viomycin binden neben dem Dekodierungszentrum. Und sie spielen eine wichtige Rolle für TB. Sie sind A-Bindungsstellen-Inhibitoren, worauf ich aber hier nicht eingehe. Und die Makrolide sind so ein bisschen etwas wie eine Bindung in den Tunnel hinein, ein bisschen. Und wir haben viele von ihnen untersucht, aber ich werde nur beispielhaft über einige reden. Bei den Makroliden gibt es verschieden große Makrolidenringe, die alle an derselben Stelle im Tunnel binden. Ihre unterschiedlichen Substituenten interagieren mit der ribosomalen RNA in unterschiedlicher Weise. Die Seitenkettenbasis vom Ribosom kann sich verändern. Aber meistens ist das Ganze ziemlich stabil. Und das hier ist die Stelle, an der die Bildung der Peptid-Bindung erfolgt. Das Makrolid blockiert also den Prozess. Wie funktioniert das? Wenn man sich hier im Aufriss erneut den Tunnel anschaut, sieht man die Bindungsstelle. Das Makrolid ist rot. Die Basen sind in Grün dargestellt und deren Mutation verursacht die Resistenz. Und Sie sehen, dass sie alle miteinander interagieren. Diese gesamte Gruppe interagiert mit dem Makrolid. Und so könnte man, wie ich denke richtigerweise, annehmen, dass die Änderung in der Form der Bindungsstelle die Bindung verhindert. Das hier ist ohne Makrolid. Und das hier ist mit Makrolid. Wir blicken den Tunnel hinauf. Wie wirkt nun das Makrolid? Es wirkt durch einen Vorgang, den ich als molekulare Obstipation bezeichne. Es blockiert den Austritt des Polypeptids aus dem Tunnel. Die Mutation von A2058 auf ein G verringert die Bindungskonstante um das 10.000-fache. Und das ist ein G im Haloarcula marismortui und dieser Organismus bindet nicht viel Antibiotika. Und wenn wir uns anschauen, wo das Makrolid bindet, sieht man, dass sich das N2 von diesem G hier direkt unter dem Makrolidring befindet. Für diese Untersuchung haben Daqi Tu und Gregor Blaha im Haloarcula das G zu einem A mutiert und es so zu einem Pseudobakterium gemacht. Die Bindungskonstante veränderte sich um viele Größenordnungen. Wir konnten sehen, wo es gebunden hat. Und tatsächlich bindet es exakt an der gleichen Stelle, in derselben Ausrichtung, mit der Ausnahme, dass der Makrolidring verdrängt wird, vermutlich wegen dieser lästigen N2, die die Position einnimmt. Was machen wir mit diesen Informationen? Es gibt verschiedene Antibiotikafamilien, die an viele Stellen und benachbarte Stellen binden, wie Sie im letzten Vortrag gehört haben. Die Bindungsstellen neben dem Peptidyl-Transferase-Zentrum liegen dicht beieinander. Einige von uns, die Interesse an diesem Gebiet haben, haben eine Firma gegründet, Rib-X, heute Melinta Therapeutics, die diese Strukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika nutzt. Und die Folien, die ich jetzt zeige, stammen alle von denen. Ich bin also nur der Überbringer der Botschaft. Hier ist also wieder das Peptidyl-Transferase-Zentrum mit verschiedenen Antibiotikafamilien, die alle dicht aneinander im Peptidyl-Transferase-Zentrum gebunden sind. Und worum es dann geht…die Strategie ist, ein Stück von einer zu nehmen und sie chemisch mit einem Stück von einer anderen zu verbinden. Hier sind also beispielsweise drei Antibiotika. Und das erste mit der Bezeichnung Radezolid hat eine ziemlich erhöhte Potenz. Und dazu möchte ich noch etwas erklären. Hier werden erneut Fragmente miteinander kombiniert. Und dann kann man das Makrolid kombinieren. Und am wichtigsten ist es - und ich habe keine Folien, um Ihnen zu zeigen, was die tatsächlich gemacht haben -, diesen gesamten Bereich zu nehmen und eine völlig neue Antibiotikafamilie zu entwickeln. Und das sieht ziemlich vielversprechend aus, was die Bekämpfung von gram-positiven und gram-negativen Bakterien betrifft. Das ist die RX-01 Familie. Diese nimmt Linezolid, die bei zahlreichen Stämmen nicht wirksam ist. Rot ist schlecht, alles über 4 ist schlecht, sehr schlecht. Wenn man Radezolid nimmt, die Kombination, funktioniert das sehr gut. Und das gilt auch für verschiedene Enterokokken. Sie sehen, dass Linezolid nicht zu großartig ist. RX-02, das ist das verbesserte Makrolid. Genau das gleiche. Wenn man das Makrolid betrachtet, das Azithromycin... sehr schlecht, sehr, sehr, sehr schlecht, Stellt man die Kombination her, wird alles richtig gut. Die Strategie funktioniert also. Und ich sollte vielleicht einfach sagen, dass es funktioniert und dass es entwickelt wird. Linezolid hat die klinischen Studien der Phase 2 absolviert. Und weitere Dinge sind auf den Weg gebracht. Und dann noch eine Anmerkung zu den A-Bindungsstellen. In unserer Arbeit weisen wir nach, dass Viomycin und Capreomycin an die A-Stelle binden. Und es bindet an die kleine Untereinheit. Und dort ist die Bindungsstelle. Sie interagiert mit den großen und kleinen Untereinheiten. Und hier ist zu sehen, wo sich das befindet. Es interagiert mit dem tRNA der großen Untereinheit und der kleinen Untereinheit. Und an dieser Stelle erfolgt die Dekodierung. Dadurch wird das Ribosom in dieser Position blockiert. Es kann sich also nicht weiterbewegen. Das ist gut zu wissen. Aber was kann man damit machen? Es hat sich herausgestellt, dass jetzt viele Verbindungen bekannt sind, die in dieser Nachbarschaft binden. Es ist das Viomycin hier, aber das gilt auch für viele andere Verbindungen. Und wenn man Geld locker machen könnte für ein TB-Antibiotikum – was nicht so naheliegend ist – und wenn man ein Pharmazieunternehmen dazu bewegen könnte, so etwas zu entwickeln, könnte man die, so vermute ich, in irgendeiner Weise kombinieren oder einfach die Oberfläche nutzen, um eine neue Verbindung zu entwickeln, die gegen TB wirksam wäre. Die Idee ist also ist die, diese Informationen zur Entwicklung eines Antibiotikums zu nutzen, das gegen all diese resistenten Stämme wirksam wäre. Und das ist ein großes Problem, weil der XDR-Stamm gegen alles resistent ist. Das ist ein bedeutender Punkt, auf den ich noch hinweisen möchte. Nämlich der, dass Grundlagenforschung sehr wichtig ist. Grundlagenforschung zur Struktur und Funktion des Ribosoms führt zur Entwicklung neuer Antibiotika, die sich als wirksam gegen resistente Bakterienstämme erweisen. Es gibt eine Menge Anstöße in den USA und an anderen Orten für die NIA, die Translationsforschung zu unterstützen. Und ich muss sagen, dass die einzige Translationsforschung, die ich befürworte, die Ribosom-Forschung ist. Und hier damit möchte enden. Vielen Dank. Applaus..

Thomas A. Steitz (2014)

From the Structure of the Ribosome to New Antibiotics

Thomas A. Steitz (2014)

From the Structure of the Ribosome to New Antibiotics

Abstract

Structural studies of the ribosome exemplify the evolution of structural studies in cell biology from the early negatively stained images of macromolecular assemblies in whole cells, to a detailed atomic understanding of the mechanisms of action of a large assembly. The earliest electron microscopic (EM) images by George Palade capturing the ribosome in the cell were initially called Palade particles. Biochemical studies in the 60s showed that the larger subunit of this 2.6 MDal RNA-protein assembly catalyzed peptide bond formation while interactions of the anticodon of tRNA with mRNA bound to the small subunit effected translation of the message; the binding of the aminoacyl-tRNA to the A site and binding of the peptidyl-tRNA to the P site were identified, and translocation of the peptidyl-tRNA from the A site to the P site following peptide bond formation was hypothesized. Proceeding from the early reconstructions of the shapes of the two interacting subunits from negatively stained images by Jim Lake (1976) to the current atomic resolution structures of the 70S ribosome and of its large and small subunits captured in various functional states, the mechanistic level of structural insights into ribosome function now exceeds that achieved in the early structural studies of lysozyme, carboxypeptidase and ribonuclease.

Mechanistic details of the decoding of messenger RNA at the atomic level have been derived by the Ramakrishnan lab from 3.0 Å resolution structures of the 30S ribosomal subunit complexed with mRNA and tRNA substrate fragments as well as more recent structures of tRNA substrates or fragments complexed with the 70S ribosome determined at resolutions between 3.7 Å and 2.8 Å by the Noller and Ramakrishnan labs. Structural insights into the peptidyl transferase reaction, as well as its inhibition by antibiotics, have come from structures of substrate and intermediate complexes with the 50S ribosomal subunit at resolutions that range variously between 3.3 Å and 2.3 Å from the Steitz lab. The first atomic model of the 70S ribosome derived from a 5.5 Å resolution map by the Noller lab using the atomic structures of the 30S and 50S subunits showed the interactions between the two subunits and the general positions of tRNA molecules bound to the A-, P- and E-sites, while the most recent higher resolution structures of the 70S ribosome show further details of the interactions made by tRNAs with the P site and E site. Also, a more complete and detailed structure of the ligand free 70S E. coli ribosome from the Cate lab has shown two conformations of the “head” domain of the small subunit that is related to the process of tRNA and mRNA translocation. Structures of the release factors 1 and 2 and the appropriate mRNAs bound to the 70S ribosome calculated from the Noller and Ramakrishnan labs provide insights into the termination of polypeptide synthesis. More recent crystal structures of the 70S ribosome captured in various states of tRNA delivery by elongation factor Tu and the post-translocation state by elongation factor G from the Ramakrishnan lab have shown EF-Tu delivering an aminoacyl-tRNA and EF-G promoting translocation as well as rachet-like relative rotations of the large and small subunits. Most recently, we have obtained the structure of the 70S ribosome with EF-G in a compact pre-translocation state which suggests how EF-G promotes translocation; our recent structure with a back-translocation factor, LepA, bound to the ribosome suggests how back translocation is achieved.

Also recently, we have also obtained structures of the 70S ribosome with protein factors. The protein factor EFP stimulates the formation of the first peptide bond, and our structure of the 70S ribosome with f-met-tRNA and EFP bound shows that the EFP binds adjacent to the P-site

tRNA interacting with both the anticodon stem-loop and the acceptor stem. It is presumably positioning the P-site tRNA for peptide bond formation. We have also determined the structures of the 70S ribosome with two different hibernation factors. One binds the A site on the 30S subunit that overlaps with the P-site and A-site tRNAs, thereby preventing their binding. The other factor binds near the 3' end of the 16S rRNA where the Shine-Delgano m-RNA sequence binds, which would also prevent the initiation of protein synthesis.

These structural studies of the ribosome not only provide a detailed look at the process of protein synthesis, but also demonstrate that the ribosome a ribozyme and that rRNA undergoes substrate ligand-induced conformational changes in order to achieve specificity, just as is seen in protein enzymes. The ribosome is 2/3 RNA and 1/3 protein. Our structural studies of the Haloarcula marismortui (Hma) large subunit showed that the site of peptide bond formation (the peptidyl transferase center) consists entirely of rRNA and our structures of many different complexes of the large subunit with various substrate, intermediate and product analogues, along with kinetic and biochemical studies of others, have illuminated the mechanism of peptide bond formation. Binding of the correct substrate to the A site results in a conformational change in the rRNA and a reorientation of the peptidyl group of the P-site substrate. The 2'OH of A76 of the
A-site tRNA is H-bonded to the α-amino group of the A-site substrate. This structure of the pre-reaction substrate complex and other kinetic and biochemical data support a proton shuttle
mechanism in which the 2'OH of A76 receives a proton from the attacking α-amino group thereby enhancing its nucleophilicity, while it donates a proton to the 3' oxygen of A76 of the
peptidyl-tRNA as it is being deacylated. A movie of this process (with music) based on many structures will show the mechanism of peptide bond formation.

The ribosome is a major target of antibiotics which are seen to bind either the large or the small subunit or to both subunits simultaneously. We have determined the structures of many different families of antibiotics bound to the Hma large subunit or to the Thermus thermophilus (T.th.) 70S ribosome, and those structures inform how the various antibiotics inhibit protein synthesis by the ribosome. They also suggest why various resistance mutations in the ribosome make the ribosome insensitive to specific antibiotics. We have also determined the structures of complexes of mutant ribosomes with antibiotics to validate the proposed mechanisms of antibiotic resistance produced by the mutations.

The rise of antibiotic-resistant bacteria is becoming a major global health problem. MRSA is reported to now result in about 100,000 deaths annually world-wide. The structures of our antibiotic complexes with the ribosome are currently being used for structure-based drug design to create new compounds that are effective against MRSA and other antibiotic-resistant bacterial strains. The strategy being employed by Rib-X Pharmaceuticals, Inc. (now Melinta Therapeutics, Inc.), in New Haven, Connecticut is to design new compounds that chemically link a portion of one known antibiotic to a part of another antibiotic that is observed to bind to an adjacent site.
Using computational approaches for the design of new compounds, many cycles of compound synthesis and evaluation are resulting in new potential antibiotics that are effective against resistant strains are being created. One compound made by Rib-X Pharmaceuticals, Radezolid, has successfully completed phase II clinical trials and many other compounds are in their antibiotic development pipeline.

Our structural studies of the ribosome and its complexes with many functionally important ligands are not only providing important insights into how this macromolecular machine works, but are now also leading to practical benefits to human health.

References:

Moore, P.B. and Steitz, T.A. The roles of RNA in the synthesis of protein. In: RNA World, 3rd edition, (R.F. Gesteland, T.R. Cech and J.F. Atkins, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 257-285 (2006).

Steitz. T.A. A structural understanding of the dynamic ribosome machine. Nature Reviews: Mol. Cell Biol. 9: 243-253 (2008).

Steitz, T.A. From the structure and function of the ribosome to new antibiotics. Angew. Chem. Int. Ed. (Nobel Lecture) 49: 4381-4398 (2010).

Schmeing, T.M. and Ramakrishnan, V. What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation. Nature 46: 1234-1242 (2009).

Blaha, G.M., Polikanov, Y.S. Steitz, T.A. Elements of ribosomal drug resistance and specificity. Curr. Opin. Struct. Biol. 22: 750-758 (2012).

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