Stefan W. Hell (2016) - Optical Microscopy: the Resolution Revolution

Throughout the 20th century it was widely accepted that a light microscope relying on conventional optical lenses cannot discern details that are much finer than about half the wavelength of light (200-400 nm), due to diffraction

Vielen Dank! Ich denke, jeder hier kennt den Spruch: „Ein Bild sagt mehr als tausend Worte“ oder „Sehen ist Glauben“. Das trifft nicht nur auf unser Alltagsleben zu, sondern auch auf die Wissenschaften. Und dies ist auch der Grund, weshalb die Mikroskopie eine derartige Schlüsselrolle in der Entwicklung der Naturwissenschaften gespielt hat. Mit der Lichtmikroskopie hat die Menschheit entdeckt, dass jedes Lebewesen aus Zellen als strukturelle und funktionelle Grundeinheiten besteht. Bakterien wurden entdeckt usw. Wir haben aber in der Schule gelernt, dass die Auflösung eines Lichtmikroskop durch die Beugung grundsätzlich auf eine halbe Wellenlänge begrenzt ist. Und wenn man kleinere Dinge sehen möchte, muss man auf die Elektronenmikroskopie zurückgreifen. Tatsächlich hat die Entwicklung des Elektronenmikroskops in der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts die Dinge dramatisch geändert: Man konnte kleinere Dinge sehen, wie Viren, Proteinkomplexe und, in einigen Fällen, kann man eine räumliche Auflösung erzielen, die so gut ist wie die Größe eines Moleküls oder Atoms. Und daher stellt sich die Frage, wenigstens für einen Physiker: Warum sollte ich mich um eine optisches Mikroskop und seine Auflösung kümmern, wo wir jetzt das Elektronenmikroskop haben? Die Antwort auf diese Frage steht auf der nächsten Folie, auf der ich die Zahl der Veröffentlichungen, die ein Elektronenmikroskop nutzten, und der, die ein optisches Mikroskop nutzten, in dieser grundlegenden Medizinzeitschrift gezählt habe. Und jetzt sehen Sie, welche der beiden Methoden gewonnen hat. Das ist tatsächlich ziemlich repräsentativ. Die Antwort ist daher, dass das Lichtmikroskop immer noch das gängigste Mikroskopiemodell in den Lebenswissenschaften ist. Und zwar aus 2 wichtigen Gründen: Der erste Grund ist, dass es der einzige Weg ist, mit dem man in das Innere einer lebenden Zelle sehen kann. Das funktioniert nicht mit einem Elektronenmikroskop. Man muss sie normalerweise dehydrieren und die Elektronen bleiben an der Oberfläche hängen. Aber Licht kann die Zelle durchdringen und Informationen aus dem Inneren herausbekommen. Es gibt noch einen zweiten Grund. Wir wissen bereits, dass es unterschiedliche Organellenarten gibt. Aber wir möchten wissen, was die spezifischen Proteine machen. Es gibt bestimmte Proteinspezies, es gibt 10.000 unterschiedliche Moleküle in einer Zelle. Und das kann man mit der Lichtmikroskopie relativ leicht durchführen, indem man beispielsweise ein fluoreszierendes Molekül an das interessante Protein anhängt. Und wenn man dann das Molekül anhängt, kann man das fluoreszierende Molekül sehen. Und dann weiß man genau, wo das betreffende Molekül ist. Hier ist also der Punkt, wenn Sie wollen, wo die Chemie Einzug hält. Sie hängen ein fluoreszierendes Molekül an das betreffende Protein. Und weil es ein fluoreszierendes Molekül ist - wenn man beispielsweise grünes Licht auf es scheint, kann es ein grünes Photon absorbieren. Dann geht es in einen hochliegenden, elektronisch angeregten Zustand über. Und dann gibt es etwas Vibration und Zerfall. Und nach etwa einer Nanosekunde relaxiert das Molekül, indem es ein Fluoreszenzphoton aussendet, das wegen des Vibrationsenergieverlustes leicht ins Rote verschoben ist. Nun, diese Rotverschiebung ist sehr nützlich, da es die Methode sehr empfindlich macht. Man kann das Fluoreszenzlicht leicht vom Anregungslicht trennen. Das macht die Methode extrem leicht reagierend. Tatsächlich kann man ein einzelnes Protein in einer Zelle markieren, und immer noch dieses einzelne, sagen wir, fluoreszierende Molekül sehen, und daher dieses einzelne Protein sehen, nur durch die Tatsache, dass diese Methode so leicht reagierend ist, so untergrundunterdrückend. Aber, es ist klar, wenn es ein zweites Molekül gibt, eine drittes, ein viertes, eine fünftes, das dem ersten sehr nahe kommt, näher als 200 Nanometer, dann kann man sie nicht auseinanderhalten. Ich sage das, um an die Tatsache zu erinnern, dass es bei der Auflösung um die Fähigkeit geht, Dinge auseinanderzuhalten. Daher ist es klar, dass man in der Lichtmikroskopie, und natürlich auch in der Fluoreszenzmikroskopie, trotz ihrer Empfindlichkeit, Dinge nicht auseinanderhalten kann, wenn etwas dichter als 200 Nanometer angeordnet ist. Und wenn man diese Barriere überwinden kann, tut man etwas Gutes für das Gebiet und daher auch für die Lebenswissenschaften. Nun möchte ich ein wenig bei der Frage verweilen, warum es diese Beugungsgrenze gibt. Ich bin sicher, Sie alle kennen sie. Und Sie haben vielleicht von der Abbeschen Theorie gehört, einer sehr eleganten Erklärung der Beugungsgrenze. Sie ist sehr elegant, aber in meinen Augen auch sehr irreführend. Manchmal können elegante Theorien sehr irreführend sein. Und vielleicht ist die beste Erklärung die, die man einem Biologen geben würde. Sie ist hier dargestellt. Man kann sagen, dass das grundlegendste oder wichtigste Element eines Lichtmikroskops das Objektiv ist. Die Aufgabe des Objektivs ist keine andere als die, Licht auf einen einzigen Punkt zu konzentrieren, es in einem Punkt zu fokussieren. Und weil Licht sich wie eine Welle ausbreitet, bekommen wir das Licht nicht in einem dramatischen Brennpunkt fokussiert. Wir erhalten einen Lichtfleck, der hier verschmiert ist. Das beträgt mindestens etwa 200 Nanometer in der Brennebene und bestenfalls etwa 500 Nanometer in der optischen Achse. Und dies zieht natürlich wichtige Konsequenzen nach sich. Die Konsequenz ist, dass, wenn wir hier mehrere Merkmale haben, sagen wir Moleküle, dann würden sie mehr oder weniger zur selben Zeit mit dem Licht überflutet. Und daher streuen sie das Licht in mehr oder weniger derselben Zeit zurück. Wenn wir jetzt den Detektor hier positionieren, um das fluoreszierende Licht nachzuweisen, wird der Detektor nicht in der Lage sein, das Licht von den Molekülen auseinanderzuhalten. Nun werden Sie sagen, ok, ich würde den Detektor aber nicht hier platzieren, das ist nicht klug. Ich benutze das Objektiv, um das Licht zurück zu projizieren. Aber gut, Sie haben hier dasselbe Problem, weil jedes der Moleküle hier fluoresziert. Wenn man das Licht sammelt, produziert es ebenfalls einen Lichtfleck des fokussierten Lichts hier, der als Ergebnis der Beugung eine minimale räumliche Ausdehnung hat. Und wenn man einen zweiten, einen dritten, einen vierten, einen fünften usw. hat, dann erzeugen sie auch Lichtflecke. Und das Ergebnis der Beugung – nun, kann man sie nicht auseinanderhalten. Es spielt keine Rolle, welchen Detektor Sie dorthin platzieren, sei es ein Fotomultiplier, das Auge oder sogar eine Pixeldetektor wie eine Kamera, sie können die Signale dieser Moleküle nicht auseinanderhalten. Mehrere Menschen erkannten dieses Problem am Ende des 19. Jahrhunderts. Ernst Abbe war vielleicht derjenige, der die profundeste Einsicht hatte. Er stellte diese Gleichung der Brechungsgrenze auf, die seinen Namen trägt. Wie Sie wissen, findet man diese Gleichung in jedem Lehrbuch der Physik, Optik, aber auch in den Lehrbüchern der Zell- und Molekularbiologie wegen der enormen Relevanz, die die Beugung in der optischen Mikroskopie für dieses Gebiet hat. Aber man findet sie auch auf dem Denkmal, das zu Ernst Abbes Ehre in Jena errichtet wurde, wo er lebte und arbeitete. Und dort findet man diese Gleichung in Stein gemeißelt. Und alle glaubten dies während des gesamten 20. Jahrhunderts. Sie glaubten es nicht nur, es war auch eine Tatsache. Als ich am Ende der 80er-Jahre als Student in Heidelberg war und ein bisschen optische Mikroskopie durchführte – konfokale Mikroskopie, um genau zu sein -, war das die Auflösung, die man zu der Zeit erhalten konnte. Dies ist ein Bild, aufgenommen innerhalb des Gerüsts eines Teils der Zelle. Und man kann einige verschwommene Merkmale hier drin sehen. Die Entwicklung der STED-Mikroskopie, über die ich gleich reden werde, zeigte, dass es Physik gibt, sozusagen, in dieser Welt, die es erlaubt, diese Beugungsgrenze zu überwinden. Und wenn man diese Physik mit Klugheit nutzt, kann man Merkmale sehen, die viel feiner sind. Man kann Details erkennen, die jenseits der Beugungsgrenze sind. Diese Entdeckung hat mir einen Anteil des Nobelpreises gebracht. Und persönlich, ich glaube, dass sehr oft - und Sie werden es auf diesem Treffen hören – die Entdeckungen bestimmter Leute mit deren persönlicher Geschichte eng verbunden sind. Und darum verweile ich ein wenig damit, zu erzählen, wie ich tatsächlich die Idee hatte, an diesem Problem zu arbeiten und die Beugungsgrenze zu überwinden. Einige von Ihnen werden das wissen, manche nicht: Ich wurde im Jahr 1962 im westlichen Teil Rumäniens geboren. Ich gehörte zu der Zeit einer deutschen ethnischen Minderheit an. Und im Alter von 13 Jahren nahm ich wahr, dass es ein kommunistisches Rumänien war. Und Teil einer Minderheit zu sein, wohl nicht die beste Art, sein Leben in einem kommunistischen Land zu verbringen. Daher überzeugte ich im Alter von 13 Jahren meine Eltern, das Land zu verlassen und nach Westdeutschland auszuwandern, indem wir unseren deutschen ethnischen Hintergrund nutzten. Und daher waren wir, nach einigen Schwierigkeiten, in der Lage, uns 1978 hier in Ludwigshafen niederzulassen. Ich mochte die Stadt, weil sie recht nah an Heidelberg liegt. Ich wollte Physik studieren und wollte mich in Heidelberg einschreiben, um Physik zu studieren. Das machte ich, nachdem ich mein Abitur hatte. Wie die meisten Physikstudenten, und ich denke, das ist heute noch so, hat die moderne Physik mich fasziniert, natürlich die Quantenmechanik, Relativitätstheorie. Ich wollte Teilchenphysik machen, wollte natürlich ein Theoretiker werden. Aber damals musste ich entscheiden, welches Thema ich für meine Doktorarbeit auswählen wollte. So sah ich damals als Doktorand aus, ob Sie es glauben oder nicht. Ich verlor meinen Mut, ich verlor den Mut und es ist ganz verständlich, da meine Eltern sich noch immer darum bemühten, im Westen anzukommen. Meine Eltern hatten Arbeit, aber mein Vater war von Arbeitslosigkeit bedroht. Meine Mutter wurde damals mit Krebs diagnostiziert und starb schließlich. Ich fühlte damals, dass ich etwas machen muss, das meine Eltern unterstützt, keine theoretische Physik usw. Und die älteren Semester sagten mir: „Mach keine theoretische Physik - du könntest sonst als Taxifahrer enden.“ Also mach das nicht, mach das nicht. Ich schrieb mich daher entgegen meiner Neigung bei einem Professor ein, der eine Start-up-Firma gegründet hatte, die sich auf die Entwicklung der Lichtmikroskopie spezialisierte – der konfokalen Mikroskopie, um genau zu sein, für die Inspektion von Computerchips usw. Ich schrieb mich ein. Mein Thema war es, Computerchips zu inspizieren und die Computerchips mit einem optischen Mikroskop auszurichten. Und ich dachte, wenn du das machst, bekommst du einen Job bei Siemens oder IBM usw. Aber nun, wie Sie sich vorstellen können, wenn man andere Neigungen hat, arbeitete ich ein halbes Jahr, sogar ein Jahr, aber ich war gelangweilt. Es war fürchterlich. Ich hasste es, ins Labor zu gehen. Ich war kurz davor aufzuhören. Ich schaute mich insgeheim nach anderen Themen um. Und ich hatte jetzt 2 Optionen: entweder konnte ich unglücklich werden oder darüber nachdenken ob ich noch irgendetwas Interessantes mit der Lichtmikroskopie machen konnte. Mit dieser Physik des 19. Jahrhunderts, die nichts war, nur Beugung und Polarisation, nichts mit dem man etwas anfangen konnte. Na gut, vielleicht gibt es den einen oder anderen Abbildungsfehler, aber das ist langweilig. Also dachte ich: Was bleibt noch übrig? Und dann merkte ich: die Beugungsgrenze zu brechen, das wäre doch cool, weil alle glauben, dass das unmöglich ist. Ich war von dieser Idee so fasziniert und erkannte irgendwann, dass es möglich sein müsste. Meine Logik war sehr einfach. Ich sagte mir, diese Beugungsgrenze wurde im Jahr 1873 formuliert - jetzt war es Ende der 80er-Jahre. So viel Physik war in der Zwischenzeit passiert, da muss es wenigstens ein Phänomen geben, das mich für irgendeine Ausführungsart jenseits der Beugungsgrenze bringt. Könnte Reflexion sein, Fluoreszenz, was auch immer - ich bin nicht wählerisch. Es muss doch irgendein Phänomen geben, das mich jenseits der Beugungsgrenze bringt. An einem Punkt schrieb ich diese Philosophie auf. Ich merkte, dass es nicht funktionieren würde, wenn ich die Art der Fokussierung änderte, weil man das nicht ändern kann, wenn man Licht benutzt. Aber vielleicht wenn man in einem Fluoreszenzmikroskop sich die Zustände der Fluorophore ansieht, ihre spektralen Eigenschaften. Vielleicht gibt es einen quantenoptischen Effekt. Man könnte vielleicht mit der Quantennatur des Lichts spielen, sozusagen, und es machen. Das war also die Idee. Ich sollte dazusagen, dass es zu der Zeit schon ein Konzept gab. Darum habe ich hier ‚Fernfeld‘ geschrieben auf etwas, das Nahfeldlichtmikroskop genannt wird. Und das benutzt eine winzige Spitze. Es ist wie ein Rastertunnelmikroskop, um eine Licht-Präparat-Wechselwirkung hier auf kleine Maßstäbe zu beschränken. Aber ich hatte das Gefühl, sah das wie ein Lichtmikroskop aus? Natürlich nicht, es sah aus wie ein Rasterkraftmikroskop aus. Ich wollte die Brechungsgrenze für Lichtmikroskope besiegen, die wie ein Mikroskop aussehen und wie ein Lichtmikroskop arbeiten – etwas, was niemand vorhersah. Und so versuchte ich damit mein Glück in Heidelberg, aber ich fand keine Stelle dafür. Aber ich hatte das Glück, jemand zu treffen, der mir die Chance gab, hier in Turku, in Finnland zu arbeiten. Ich wollte eigentlich nicht dorthin, aber ich hatte keine Wahl, und so landete ich dort. Im Herbst ‘93, an einem Samstagmorgen, machte ich, was ich immer machte: Ich durchsuchte Lehrbücher, um ein Phänomen zu finden, das mich jenseits der Barriere brachte. Ich öffnete dieses Lehrbuch in der Hoffnung, etwas Quantenoptisches zu finden: gequentschtes Licht, verschränkte Photonenpaare und solche Sachen. Und ich öffnete diese Seite und sah 'stimulierte Emission'. Und plötzlich traf es mich wie ein der Blitz und ich sagte: Toll, das könnte ein Phänomen sein, das mich jenseits der Barriere bringt, wenigstens für die Fluoreszenzmikroskopie. Und ich sage Ihnen jetzt, warum ich so fasziniert war. Ich ging zurück ins Labor und führte einige Berechnungen durch, um die Idee zu erklären. Ich sagte, dass man die Tatsache nicht ändern kann, dass all diese Moleküle mit Licht geflutet werden. Und daher würden sie normalerweise diesen Lichtfleck hier erzeugen. Das können wir natürlich nicht ändern. Wir könnten aber vielleicht die Tatsache ändern, dass die Moleküle, die alle mit Licht geflutet werden, mit Anregungslicht, am Ende in der Lage sind, Licht am Detektor zu erzeugen. Anders ausgedrückt, wenn man es fertigbringt, diese Moleküle hier in einen Zustand versetzen, wo sie kein Licht beim Detektor erzeugen können, dann kann ich diese separieren, die die können von denen, die nicht können. Und daher, wenn ich in der Lage wäre, diese Moleküle in einen stillen Zustand zu versetzen, wo sie kein Licht beim Detektor erzeugen können, dann kann ich dieses Molekül vom Rest trennen. Die Idee ist daher, wie ich gesagt habe, nicht mit der Fokussierung zu spielen, sondern mit den Zuständen der Moleküle. Das war daher die entscheidende Idee: die Moleküle im dunklen Zustand zu halten. Und ich sagte, was sind die dunklen Zustände bei einem fluoreszierenden Molekül? Ich schaute auf das grundlegende Energiediagramm. Es gibt den Grundzustand und den angeregten Zustand. Der angeregte Zustand ist natürlich ein heller Zustand. Aber der Grundzustand ist ein dunkler Zustand, weil das Molekül kein Licht emittieren kann, wenn es im Grundzustand ist. Das ist ziemlich offensichtlich. Und nun raten Sie, warum ich so aufgeregt war. Ich wusste, dass stimulierte Emission genau dies machte: Moleküle erzeugen, die im Grundzustand sind, Moleküle vom hellen Zustand zurück zum Grundzustand schicken. Ich bin an dem stimulierten Photon natürlich nicht interessiert. Aber ich bin an Tatsache interessiert, dass das Phänomen der stimulierten Emission Moleküle im dunklen Zustand erzeugt. Und es ist sehr offensichtlich. Man hat eine Linse, man hat eine Probe, man hat einen Detektor, man hat Licht, um die Moleküle anzuschalten. Also regen wir sie an, bringen sie zur Fluoreszenz, sie gehen in den hellen Zustand über. Und dann haben wir natürlich einen Strahl, um die Moleküle abzuschalten. Wir schicken sie vom hellen Zustand zurück zum Grundzustand, damit sie sozusagen nach Belieben den Grundzustand sofort einnehmen. Und die Bedingung, um sicherzustellen, dass dieser Übergang passiert, ist natürlich, dass man darauf achtet, dass es bei dem Molekül ein Photon gibt, wenn das Molekül angeregt wird. Anders gesagt, man benötigt eine bestimmte Intensität, um den spontanen Zerfall der Fluoreszenz zu übertreffen. Also muss man dahin ein Photon innerhalb von dieser Lebenszeit von einer Nanosekunde bringen. Das bedeutet, dass man eine bestimmte Intensität haben muss, die hier gezeigt ist, die Intensität des stimulierenden Strahls. Man muss eine bestimmte Intensität beim Molekül haben, um sicherzustellen, dass dieser Übergang wirklich stattfindet. Und dies ist eine Besetzungswahrscheinlichkeit des angeregten Zustands als Funktion der Helligkeit des stimulierenden Strahls. Und wenn man diese Schwelle einmal erreicht hat, kann man sicher sein, dass das Molekül kein Licht emittieren kann, obwohl es dem grünen Licht ausgesetzt ist. Natürlich gibt es ein stimuliertes Photon, das hierhin fliegt, aber das kümmert uns nicht. Weil uns nur interessiert, dass das Molekül nicht vom Detektor gesehen wird. Und daher können wir Moleküle nur durch die Präsenz des stimulierenden Strahls abschalten. Und jetzt können Sie sich vorstellen, dass wir nicht alle Moleküle hier in der Beugungszone abschalten wollen, weil das unklug wäre. Also was machen wir? Wir modifizieren den Strahl, sodass er nicht in eine Flächenscheibe fokussiert ist, in einen Fleck, sondern in einen Ring. Und dies kann sehr leicht über eine phasenmodifizierende Maske hier drin gemacht werden, die eine Phasenverschiebung in der Wellenfront generiert. Und dann erhalten wir einen Ring hier drin, der die Moleküle in der Präsenz der roten Intensität abschaltet. Aber jetzt lassen Sie uns natürlich annehmen, dass wir nur die Moleküle hier im Zentrum sehen wollen. Also müssen wir dieses und jenes abschalten. Was machen wir? Wir können den Ring nicht kleiner machen, weil auch er durch die Beugung begrenzt wird. Aber wir müssen das auch gar nicht tun, weil wir mit dem Zustand spielen können, das ist der Punkt. Wir machen den Strahl hell genug, sodass sogar in dem Bereich, in dem der rote Strahl schwach ist. Tatsächlich ist er hier im Zentrum null. Wo der rote Strahl in absolutem Maßstab schwach ist, ist jenseits der Schwelle, weil ich nur diesen Schwellwert benötige, um das Molekül abzuschalten. So erhöhe ich die Intensität so weit, dass nur eine kleine Region übrig bleibt, wo die Intensität unter der Schwelle bleibt. Und dann sehe ich nur diese Moleküle im Zentrum. Jetzt ist es offensichtlich, dass ich Merkmale trennen kann, die näher sind als die Beugungsgrenze. Weil diejenigen, die innerhalb der Beugungsgrenze nahe dran sind, vorübergehend abgeschaltet werden. Nun können Sie sagen: Was ich hier mache, ist, dass ich die Nichtlinearität dieses Übergangs sozusagen benutze. Aber das ist die altmodische Denkweise, die Denkweise des 20. Jahrhunderts. Und sie ist kein gutes Bild, weil es bei Nichtlinearität um die Photonenanzahl geht: dass viele hineingehen, dass viele herauskommen, oder weniger oder mehr. Hier geht es um Zustände. Um Ihnen das klar zu machen, entferne ich jetzt den Ring. Was wir machen, ist, die Moleküle innerhalb der Beugungszone in 2 unterschiedlichen Zuständen zu paaren. Sie sehen hier, dass die Moleküle gezwungen werden, die gesamte Zeit im Grundzustand zu verbringen, weil sie sofort zurückgestoßen werden, sobald sie hochkommen. Diese sind daher immer im Grundzustand. Dagegen dürfen jene im Zentrum den An-Zustand annehmen, den angeregten elektronischen Zustand. Und weil sie in 2 unterschiedlichen Zuständen sind, können wir sie trennen. Und auf diesem Weg werden in diesem Konzept Merkmale getrennt. Ich habe den Ring nur weggenommen, um Klarheit zu schaffen, sodass Sie die Notwendigkeiten sehen können, die Unterschiede in den Zuständen. Aber jetzt lege ich ihn zurück, damit Sie nicht vergessen, dass er da ist. Und jetzt könnten Sie sagen: Na gut, schlaue Idee. Die Leute werden begeistert sein, wenn ich das veröffentliche - was das nicht der Fall. Ich ging zu vielen Konferenzen, teilweise aus eigener Tasche bezahlt, weil ich ein armer Mensch war. Aber niemand glaubte wirklich an diese linsenbasierte Auflösung im Nanomaßstab. Es gab einfach zu viele falsche Propheten im 20. Jahrhundert, die das versprachen, aber nie lieferten. Und so sagten sie, warum sollte der Typ von hier erfolgreich sein. Das Überleben war daher sehr schwierig. Um zu überleben, verkaufte ich eine Lizenz, persönliche Patente, an eine Firma, und sie gaben mir im Austausch Forschungsgeld. Aber eine Sache möchte ich betonen: Ich war viel glücklicher als während meiner Doktorarbeit, weil ich das machen konnte, was ich wollte. Ich war von dem Problem fasziniert. Ich hatte eine Passion für meine Arbeit. Und auch wenn es schwierig war, wenn man sich die Fakten ansieht, machte ich es gern. Und so wurde ich erfolgreich. Am Ende entdeckte mich jemand von hier am Max-Planck-Institut in Göttingen. Und dann entwickelten wir es. Am Ende war es natürlich auch eine Teamanstrengung, über die Zeit. Und jetzt haben Sie diese Folie gesehen, sie ist bereits ein Klassiker geworden. Zunächst sah es so aus, und jetzt sieht es so aus - dies sind Kernporenkomplexe. Und man sieht sehr schön diese achtfache Symmetrie. Und ich vergleiche sie immer noch sehr gern mit der vorherigen Auflösung, muss ich zugeben. Und es ist sehr offensichtlich, dass am Ende die Methode funktionierte. Nicht nur funktionierte sie, natürlich kann man sie auch anwenden. Und dies ist die erste Anwendung auf Viren. Wenn man ein HIV-Teilchen hat - man hat hier beispielsweise Proteine, die interessant sind. Wie sind sie hier auf der Virenhülle verteilt? Wenn man nur die beugungslimitierte Mikroskopie nimmt, kann man es nicht sehen. Aber wenn man, sagen wir STED oder hochauflösende Abbildung, sieht man, wie sie Muster formen, alle Arten von Muster. Und was man dann herausgefunden hat, ist dass die, die in der Lage sind, die nächste Zelle zu infizieren, ihre Proteine, diese Proteine, an einer einzigen Stelle haben. Also lernt man etwas. Man kann auch dynamische Dinge mit schlechter Auflösung sehen, wenn man die Superauflösung nicht hat, das STED. Aber jetzt sieht man, wie Dinge sich bewegen, und man kann etwas über Bewegung lernen. So, dies ist eine Stärke des Lichtmikroskops. Eine weitere Stärke des Lichtmikroskops ist, natürlich, dass man in die Zelle fokussieren kann, wie angedeutet, und dreidimensionale Bilder aufnehmen kann. Und hier sehen Sie eine dreidimensionale Interpretation des Streckens eines Neurons. Nur um zu zeigen, was man damit als Methode machen kann. Die Methode wird in hunderten unterschiedlichen Laboratorien angewendet und ich werde Sie nicht mit Biologie langweilen. Ich komme auf eine eher physikalische Frage zurück und rede über die Auflösung. Und Sie werden fragen, was ist die Auflösungsgrenze, die wir jetzt haben? Zunächst, die erzielbare Auflösung wird nicht die Abbesche Auflösung sein. Weil offensichtlich die Auflösung durch die Region bestimmt wird, in der das Molekül seinen An-Zustand annehmen kann, den Fluoreszenzzustand, und der wird kleiner. Und das hängt natürlich von der Helligkeit des Strahls ab, der maximalen Intensität, und von der Schwelle, die natürlich ein Merkmal der Licht-Molekülwechselwirkung ist, natürlich molekülabhängig. Wenn man sie berechnet oder misst, findet man, dass dies wie gezeigt umgekehrt zum Verhältnis I geteilt durch IS. IS ist daher die Schwelle und I die angewandte Intensität. Und so kann man die räumliche Auflösung zwischen hoch und niedrig tunen, indem wir nur diese Region vergrößern oder verkleinern. Und dies ist sehr nützlich, weil man die räumliche Auflösung an das Problem anpassen kann, das man sich anschaut. Und das funktioniert nicht nur in der Theorie, es funktioniert auch in der Praxis. Hier haben wir etwas, es wird immer klarer, je höher man mit der Intensität geht. Man kann es natürlich auch herunterregeln, man kann es heraufregeln, oder man kann die Beugungsschranke so überspringen. Und daher ist dies ein wichtiges Merkmal. Aber schließlich sagt die Gleichung, d wird null, was heißt das? Wenn man 2 Moleküle hat und sie sind sehr nah, dann kann man sie nicht auseinanderhalten, weil sie zur selben Zeit emittieren können, wie man hier sieht. Was müssen wir machen, um sie zu trennen? Wir schalten dieses hier ab, so dass nur eins hereinpasst. Und dann können wir sie trennen, indem wir sie zeitlich hintereinander sehen. Warum? Weil wir den Rest abschalten und wir nur eins davon in diesem Fall sehen können. Und die Auflösungsgrenze ist am Ende die Größe des Moleküls. Nun, bei organischen Molekülen haben wir sie noch nicht erreicht. Aber man kann das bei bestimmten Molekülen, Arten der Moleküle, wie Defekte in Kristallen, wo man an und aus spielen kann. Und das ist klarerweise eine Begrenzung in diesem Konzept: wie oft man an und aus spielen kann. Man kann sehr, sehr kleine, sagen wir, Regionen zeigen - wie in diesem Fall 2,4 Nanometer. Man muss das daher ernst nehmen. Dies ist ein kleiner Bruchteil der Wellenlänge, und schließlich wird es auf 1 Nanometer hinuntergehen, da bin ich sehr zuversichtlich. Es gibt also andere Anwendungen. Beispielsweise gibt es, wie Sie erkannt haben, Stickstoff-Fehlstellen in Diamanten. Dies hat Implikationen für die magnetische Abtastung, Quanteninformation und so weiter. Es gibt also mehr als Biologie. Um das auf den Punkt zu bringen: Die Entdeckung war nicht, dass man stimulierte Emission machen sollte. Es war mir klar, dass es mehr als nur stimulierte Emission gibt, stimulierte Emission ist nur das erste Beispiel. Die Entdeckung war, dass man an und aus mit dem Molekülen spielen kann, um sie zu trennen. Das war für mich offensichtlich. Und obwohl stimulierte Emission natürlich sehr grundsätzlich ist – es ist die fundamentalste Ausschaltung, die man sich in einem Fluorophor vorstellen kann –, kann man auch andere Dinge ausspielen, wie die Moleküle in einen langlebigen dunklen Zustand zu versetzen. Es gibt mehr Zustände, als nur den ersten elektronisch angeregten Zustand. Oder, wenn Sie ein wenig Ahnung von Chemie haben, wissen Sie, dass Sie mit der Repositionierung von Atomen spielen können. Wie beispielsweise diese Cis-Trans-Isomerisierung wie hier. Und wenn eine davon, die Cis, beispielsweise fluoreszierend ist und man Licht auf sie scheint, fluoresziert sie. Oder wenn das Trans nicht fluoresziert, emittiert es kein Licht, wenn es im Trans-Modus ist. Man kann also an und aus mit den Cis- und Trans-Zuständen spielen. Ich hatte Schwierigkeiten, das zu veröffentlichen, darum steht hier ‘95 und nicht ‘94. Und sogar das wurde zurückgewiesen. Das ist also ein Reviewpaper, in dem ich das aufschrieb, und der Grund war der folgende: Man verstand nicht die Logik, obwohl dies in den Veröffentlichungen klar erklärt war. Die Logik war sehr einfach. Nun vergessen Sie nicht, wir trennen, indem wir ein Molekül ein- und das andere abschalten. Und dann ist es natürlich extrem günstig, wenn die Lebenszeit der involvierten Zustände lang ist oder relativ lang. Weil, wenn dies an und der Nachbar aus ist, muss ich mich nicht beeilen, die Photonen hier schnell hineinzukriegen. Ich muss mich nicht beeilen, die Photonen hier schnell herauszuholen. Die Intensität, die ich hier anwenden muss, um daher diesen Unterschied in den Zuständen, Skalen herzustellen, ist natürlich umgekehrt zur Lebenszeit der involvierten Zustände. Je länger die Lebenszeit, je höher die optische und Bio-Stabilität von etwas ist, desto weniger Intensität benötige ich. Die Schwellintensität wird also niedriger mit der Lebenszeit der involvierten Zustände. Das bedeutet, wenn dies hier 6 Größenordnungen größer wird, dann wird die Intensitätsschwelle 6 Größenordnungen kleiner. Und dies ist hier der Fall, weil wir wegen der langen Lebensdauern weniger Licht benötigen, um dieselbe Auflösung zu erzielen. Also wird das IS verkleinert und damit auch das I in der Gleichung. Insbesondere ein fluoreszierendes Protein zu schalten ist sehr, sehr attraktiv, einfach weil es schaltbare fluoreszierende Proteine gibt, die eine Cis-Trans-Isomerisierung machen. Und man kann die Beugungsgrenze bei sehr viel niedrigeren Lichtniveaus brechen. Das haben wir nach etwas Entwicklungsarbeit gezeigt. Es ist hier angezeigt, wenn man wenig Licht benötigt, dann könnte man doch sagen: Warum sollte ich nur einen Ring verwenden, wo ich doch viele dieser Ringe oder parallele Löcher nutzen könnte? Und daher wenden wir hier viele parallel an, um, sagen wir, eine Abschaltung durch Cis-Trans-Isomerisierung durchzuführen. Und man kann natürlich leicht das ganze Ding parallelisieren, indem man eine Kamera als Detektor nimmt und viele davon hat. Wenn sie weiter entfernt sind, dann ist die Beugungsgrenze kein Problem. Wir können sie immer trennen. Was wir daher hier machten, war, wir bildeten eine lebende Zelle mit mehr als 100.000 Ringen sozusagen in weniger als 2 Sekunden bei niedrigen Lichtniveaus ab. Der Grund warum ich Ihnen dies zeige: Es ist nicht mehr die Linse und der Detektor, die entscheidend sind, es ist der Zustandsübergang. Weil der Zustandsübergang, die Lebensdauer der Zustands, tatsächlich die Abbildungstechnik bestimmt, den Kontrast, die Auflösung – alles, was Sie sehen, dass der molekulare Übergang im Molekül das Entscheidende bei der Technik wird. Damit komme ich fast zum Ende. Was ist nötig, um die beste Auflösung zu erhalten? Angenommen, Sie hätten diese Frage im 20. Jahrhundert gestellt. Die Antwort wäre gewesen: Man benötigt ein gutes Objektiv – es ist ziemlich offensichtlich, weil man das Licht so gut wie möglich fokussieren muss. Also hätte man zu Zeiss oder Leica gehen müssen und um das beste Objektiv bitten. Aber wenn man natürlich die Merkmale trennt, indem man das Licht, wie ich erklärt habe, hier fokussiert oder dort, dann ist man offensichtlich durch die Beugung begrenzt. Weil man Licht nicht besser als bis zu einem gewissen Punkt fokussieren kann, der durch die Beugung bestimmt wird. Was war daher die Lösung des Problems? Die Lösung des Problems war, nicht durch das Phänomen der Fokussierung zu trennen, sondern zu trennen, indem man mit den molekularen Zuständen spielt. Hier trennen wir also nicht nur, indem wir den Brennpunkt so klein wie möglich machen – das brauchen wir nicht wirklich -, sondern indem wir eines der Moleküle oder eine Gruppe Moleküle in einem hellen Zustand haben, das (oder die) anderen in einem dunklen Zustand - 2 unterscheidbare Zustände. Ich habe Ihnen Beispiele für die Zustände genannt - und es gibt viele mehr die man sich vorstellen kann -, um diesen Unterschied in den Zuständen auszuspielen, um die Trennung durchzuführen. Und das ist der Punkt. Ich habe über die Methode 'STED' und die Ableitung von STED gesprochen. Sie verwendeten einen Lichtstrahl, um zu bestimmen, wo das Molekül im An-Zustand ist. Hier ist es im Zentrum an und hier ist es aus. Und es ist sozusagen eng kontrolliert, wo innerhalb der Probe das Molekül im An-Zustand und wo das Molekül im Aus-Zustand ist. Dies ist eines der Kennzeichen dieser Methode, die STED genannt wird, und ihrer Ableitungen. Wie Sie wissen, habe ich den Nobelpreis mit 2 Leuten geteilt. Eric Betzig entwickelte eine Methode, die auf einem fundamentalen Niveau mit der STED-Methode verwandt ist. Weil es auch diesen An-und-Aus-Übergang verwendet, um Dinge trennbar zu machen. Nun haben Sie hier 1 Molekül, der Rest ist dunkel. Aber der Hauptunterschied ist, dass nur 1 Molekül angeschaltet ist - das ist sehr kritisch. Und wenn man nur 1 Molekül im An-Zustand hat, dann hat man die Möglichkeit, die Position zu finden, indem man die von dem Molekül kommenden Photonen nutzt. Man nimmt daher einen Pixeldetektor, der Ihnen eine Koordinate gibt. Und wenn dieses Molekül das spezifische Merkmal besitzt, und es muss das haben, diesen An-Zustand, dann erzeugt es ein ganzes Bündel mit vielen Photonen. Man kann auch die Photonen, die hier emittiert werden, nutzen, um die Position herauszufinden. Man lokalisiert es hier, wie Steve Chu gestern zeigte. Man kann das sehr, sehr präzise durchführen, es gibt Ihnen die Koordinate. Aber der Zustandsunterschied ist unbedingt notwendig, um die Trennung durchzuführen. Dies gibt Ihnen daher die Koordinate. Hier benötigt man viele Photonen hier. Hier benötigt man viele Photonen hier. Man benötigt daher immer viele Photonen, um die Koordinate herauszufinden. - Warum? Weil ein Photon irgendwo in die Beugungszone fliegen würde. Aber wenn man viele Photonen hat, dann kann man natürlich den Mittelwert nehmen. Und dann kann man eine Koordinate sehr präzise definieren. Aber das ist nur die Definition der Koordinate. Das tatsächliche Element, dass es erlaubt, Merkmale zu trennen ist die Tatsache, dass eines der Moleküle hier im An-Zustand ist, der Rest ist aus. Sie werden alle mit Licht angestrahlt, aber nur diese eine darf emittieren. Sie werden alle mit Licht angestrahlt, aber nur diese Gruppe darf emittieren. Der Rest ist dunkel. Wenn Sie also mich fragen - und als Physiker will man immer das eine Element herausfinden, das wirklich das Ding auf die Bühne stellt -, dann ist es der An-/Aus-Übergang. Ohne das, wenn man es herausnähme, würden keine der sogenannten Superauflösungskonzepte funktionieren. Und das ist das Fazit. Also warum trennen wir jetzt Merkmale, die vorher nicht getrennt werden konnten? Es ist ganz einfach, weil wir einen Zustandsübergang induziert haben, der uns eine Trennung liefert. Fluoreszierend und nicht-fluoreszierend, es ist nur eine Möglichkeit, diesen Zustandsübergang zu spielen. Es ist der Einfachste, weil man das fluoreszierende Molekül einfach stören kann. Wenn ich es mit etwas anderem hätte tun können, dann hätte ich das getan, keine Sorge. Ich wollte es nicht unbedingt für die Lebenswissenschaften machen. Aber dies bringt mich natürlich zu dem Punkt, dass es im 20. Jahrhundert um Linsen und die Fokussierung des Lichts ging. Heute sind es die Moleküle. Und man kann das rechtfertigen, indem man sagt, dass es eine Entdeckung der Chemie, ein Chemiepreis ist. Weil das Molekül nun in den Vordergrund rückt, sind die Zustände des Moleküls wichtig. Aber dieses Konzept kann umgesetzt werden. Natürlich kann man sagen, 2 unterschiedliche Zustände, A und B, aber es könnte auch etwas Absorbierendes sein, Nichtabsorbierendes, Streuung, Spin-Up, Spin-Down. Solange man die Zustände trennt, ist man innerhalb des Rahmens dieser Idee. Nun, die Abbesche Beugungsgrenze. Die Gleichung bleibt nicht gültig, man kann das leicht korrigieren, ohne Probleme. Man kann diesen Wurzelfaktor einsetzen, und dann können wir auf die molekulare Größenordnung hinuntergehen. Und das bedeutet als eine Einsicht: Das Missverständnis war, dass Leute annahmen, für die Auflösung in der Mikroskopie wären nur Wellen wichtig. Aber das stimmt nicht. Für die Auflösung in der Mikroskopie sind Wellen und Zustände wichtig. Und wenn man es im Licht der Möglichkeiten der Zustände sieht, dann wird die Lichtmikroskopie sehr, sehr kraftvoll. Und das ist nicht das Ende der Geschichte. Es gibt noch mehr zu entdecken. Zum Schluss möchte ich die Leute herausstellen, die wichtige Beiträge zu dieser Entwicklung gemacht haben. Einige sind weggegangen und sind Professoren an anderen Institutionen, einige sind noch in meinem Labor und arbeiten mit mir oder haben eigene Firmen aufgebaut. Nun, noch eine Sache – es ist das Letzte, das ich am Ende erwähnen möchte: Sie sollten nicht vergessen, dass es nicht dieser Typ war, der die Idee hatte, es war der hier. Vielen Dank.

Vielen Dank! Ich denke, jeder hier kennt den Spruch: „Ein Bild sagt mehr als tausend Worte“ oder „Sehen ist Glauben“. Das trifft nicht nur auf unser Alltagsleben zu, sondern auch auf die Wissenschaften. Und dies ist auch der Grund, weshalb die Mikroskopie eine derartige Schlüsselrolle in der Entwicklung der Naturwissenschaften gespielt hat. Mit der Lichtmikroskopie hat die Menschheit entdeckt, dass jedes Lebewesen aus Zellen als strukturelle und funktionelle Grundeinheiten besteht. Bakterien wurden entdeckt usw. Wir haben aber in der Schule gelernt, dass die Auflösung eines Lichtmikroskop durch die Beugung grundsätzlich auf eine halbe Wellenlänge begrenzt ist. Und wenn man kleinere Dinge sehen möchte, muss man auf die Elektronenmikroskopie zurückgreifen. Tatsächlich hat die Entwicklung des Elektronenmikroskops in der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts die Dinge dramatisch geändert: Man konnte kleinere Dinge sehen, wie Viren, Proteinkomplexe und, in einigen Fällen, kann man eine räumliche Auflösung erzielen, die so gut ist wie die Größe eines Moleküls oder Atoms. Und daher stellt sich die Frage, wenigstens für einen Physiker: Warum sollte ich mich um eine optisches Mikroskop und seine Auflösung kümmern, wo wir jetzt das Elektronenmikroskop haben? Die Antwort auf diese Frage steht auf der nächsten Folie, auf der ich die Zahl der Veröffentlichungen, die ein Elektronenmikroskop nutzten, und der, die ein optisches Mikroskop nutzten, in dieser grundlegenden Medizinzeitschrift gezählt habe. Und jetzt sehen Sie, welche der beiden Methoden gewonnen hat. Das ist tatsächlich ziemlich repräsentativ. Die Antwort ist daher, dass das Lichtmikroskop immer noch das gängigste Mikroskopiemodell in den Lebenswissenschaften ist. Und zwar aus 2 wichtigen Gründen: Der erste Grund ist, dass es der einzige Weg ist, mit dem man in das Innere einer lebenden Zelle sehen kann. Das funktioniert nicht mit einem Elektronenmikroskop. Man muss sie normalerweise dehydrieren und die Elektronen bleiben an der Oberfläche hängen. Aber Licht kann die Zelle durchdringen und Informationen aus dem Inneren herausbekommen. Es gibt noch einen zweiten Grund. Wir wissen bereits, dass es unterschiedliche Organellenarten gibt. Aber wir möchten wissen, was die spezifischen Proteine machen. Es gibt bestimmte Proteinspezies, es gibt 10.000 unterschiedliche Moleküle in einer Zelle. Und das kann man mit der Lichtmikroskopie relativ leicht durchführen, indem man beispielsweise ein fluoreszierendes Molekül an das interessante Protein anhängt. Und wenn man dann das Molekül anhängt, kann man das fluoreszierende Molekül sehen. Und dann weiß man genau, wo das betreffende Molekül ist. Hier ist also der Punkt, wenn Sie wollen, wo die Chemie Einzug hält. Sie hängen ein fluoreszierendes Molekül an das betreffende Protein. Und weil es ein fluoreszierendes Molekül ist - wenn man beispielsweise grünes Licht auf es scheint, kann es ein grünes Photon absorbieren. Dann geht es in einen hochliegenden, elektronisch angeregten Zustand über. Und dann gibt es etwas Vibration und Zerfall. Und nach etwa einer Nanosekunde relaxiert das Molekül, indem es ein Fluoreszenzphoton aussendet, das wegen des Vibrationsenergieverlustes leicht ins Rote verschoben ist. Nun, diese Rotverschiebung ist sehr nützlich, da es die Methode sehr empfindlich macht. Man kann das Fluoreszenzlicht leicht vom Anregungslicht trennen. Das macht die Methode extrem leicht reagierend. Tatsächlich kann man ein einzelnes Protein in einer Zelle markieren, und immer noch dieses einzelne, sagen wir, fluoreszierende Molekül sehen, und daher dieses einzelne Protein sehen, nur durch die Tatsache, dass diese Methode so leicht reagierend ist, so untergrundunterdrückend. Aber, es ist klar, wenn es ein zweites Molekül gibt, eine drittes, ein viertes, eine fünftes, das dem ersten sehr nahe kommt, näher als 200 Nanometer, dann kann man sie nicht auseinanderhalten. Ich sage das, um an die Tatsache zu erinnern, dass es bei der Auflösung um die Fähigkeit geht, Dinge auseinanderzuhalten. Daher ist es klar, dass man in der Lichtmikroskopie, und natürlich auch in der Fluoreszenzmikroskopie, trotz ihrer Empfindlichkeit, Dinge nicht auseinanderhalten kann, wenn etwas dichter als 200 Nanometer angeordnet ist. Und wenn man diese Barriere überwinden kann, tut man etwas Gutes für das Gebiet und daher auch für die Lebenswissenschaften. Nun möchte ich ein wenig bei der Frage verweilen, warum es diese Beugungsgrenze gibt. Ich bin sicher, Sie alle kennen sie. Und Sie haben vielleicht von der Abbeschen Theorie gehört, einer sehr eleganten Erklärung der Beugungsgrenze. Sie ist sehr elegant, aber in meinen Augen auch sehr irreführend. Manchmal können elegante Theorien sehr irreführend sein. Und vielleicht ist die beste Erklärung die, die man einem Biologen geben würde. Sie ist hier dargestellt. Man kann sagen, dass das grundlegendste oder wichtigste Element eines Lichtmikroskops das Objektiv ist. Die Aufgabe des Objektivs ist keine andere als die, Licht auf einen einzigen Punkt zu konzentrieren, es in einem Punkt zu fokussieren. Und weil Licht sich wie eine Welle ausbreitet, bekommen wir das Licht nicht in einem dramatischen Brennpunkt fokussiert. Wir erhalten einen Lichtfleck, der hier verschmiert ist. Das beträgt mindestens etwa 200 Nanometer in der Brennebene und bestenfalls etwa 500 Nanometer in der optischen Achse. Und dies zieht natürlich wichtige Konsequenzen nach sich. Die Konsequenz ist, dass, wenn wir hier mehrere Merkmale haben, sagen wir Moleküle, dann würden sie mehr oder weniger zur selben Zeit mit dem Licht überflutet. Und daher streuen sie das Licht in mehr oder weniger derselben Zeit zurück. Wenn wir jetzt den Detektor hier positionieren, um das fluoreszierende Licht nachzuweisen, wird der Detektor nicht in der Lage sein, das Licht von den Molekülen auseinanderzuhalten. Nun werden Sie sagen, ok, ich würde den Detektor aber nicht hier platzieren, das ist nicht klug. Ich benutze das Objektiv, um das Licht zurück zu projizieren. Aber gut, Sie haben hier dasselbe Problem, weil jedes der Moleküle hier fluoresziert. Wenn man das Licht sammelt, produziert es ebenfalls einen Lichtfleck des fokussierten Lichts hier, der als Ergebnis der Beugung eine minimale räumliche Ausdehnung hat. Und wenn man einen zweiten, einen dritten, einen vierten, einen fünften usw. hat, dann erzeugen sie auch Lichtflecke. Und das Ergebnis der Beugung – nun, kann man sie nicht auseinanderhalten. Es spielt keine Rolle, welchen Detektor Sie dorthin platzieren, sei es ein Fotomultiplier, das Auge oder sogar eine Pixeldetektor wie eine Kamera, sie können die Signale dieser Moleküle nicht auseinanderhalten. Mehrere Menschen erkannten dieses Problem am Ende des 19. Jahrhunderts. Ernst Abbe war vielleicht derjenige, der die profundeste Einsicht hatte. Er stellte diese Gleichung der Brechungsgrenze auf, die seinen Namen trägt. Wie Sie wissen, findet man diese Gleichung in jedem Lehrbuch der Physik, Optik, aber auch in den Lehrbüchern der Zell- und Molekularbiologie wegen der enormen Relevanz, die die Beugung in der optischen Mikroskopie für dieses Gebiet hat. Aber man findet sie auch auf dem Denkmal, das zu Ernst Abbes Ehre in Jena errichtet wurde, wo er lebte und arbeitete. Und dort findet man diese Gleichung in Stein gemeißelt. Und alle glaubten dies während des gesamten 20. Jahrhunderts. Sie glaubten es nicht nur, es war auch eine Tatsache. Als ich am Ende der 80er-Jahre als Student in Heidelberg war und ein bisschen optische Mikroskopie durchführte – konfokale Mikroskopie, um genau zu sein -, war das die Auflösung, die man zu der Zeit erhalten konnte. Dies ist ein Bild, aufgenommen innerhalb des Gerüsts eines Teils der Zelle. Und man kann einige verschwommene Merkmale hier drin sehen. Die Entwicklung der STED-Mikroskopie, über die ich gleich reden werde, zeigte, dass es Physik gibt, sozusagen, in dieser Welt, die es erlaubt, diese Beugungsgrenze zu überwinden. Und wenn man diese Physik mit Klugheit nutzt, kann man Merkmale sehen, die viel feiner sind. Man kann Details erkennen, die jenseits der Beugungsgrenze sind. Diese Entdeckung hat mir einen Anteil des Nobelpreises gebracht. Und persönlich, ich glaube, dass sehr oft - und Sie werden es auf diesem Treffen hören – die Entdeckungen bestimmter Leute mit deren persönlicher Geschichte eng verbunden sind. Und darum verweile ich ein wenig damit, zu erzählen, wie ich tatsächlich die Idee hatte, an diesem Problem zu arbeiten und die Beugungsgrenze zu überwinden. Einige von Ihnen werden das wissen, manche nicht: Ich wurde im Jahr 1962 im westlichen Teil Rumäniens geboren. Ich gehörte zu der Zeit einer deutschen ethnischen Minderheit an. Und im Alter von 13 Jahren nahm ich wahr, dass es ein kommunistisches Rumänien war. Und Teil einer Minderheit zu sein, wohl nicht die beste Art, sein Leben in einem kommunistischen Land zu verbringen. Daher überzeugte ich im Alter von 13 Jahren meine Eltern, das Land zu verlassen und nach Westdeutschland auszuwandern, indem wir unseren deutschen ethnischen Hintergrund nutzten. Und daher waren wir, nach einigen Schwierigkeiten, in der Lage, uns 1978 hier in Ludwigshafen niederzulassen. Ich mochte die Stadt, weil sie recht nah an Heidelberg liegt. Ich wollte Physik studieren und wollte mich in Heidelberg einschreiben, um Physik zu studieren. Das machte ich, nachdem ich mein Abitur hatte. Wie die meisten Physikstudenten, und ich denke, das ist heute noch so, hat die moderne Physik mich fasziniert, natürlich die Quantenmechanik, Relativitätstheorie. Ich wollte Teilchenphysik machen, wollte natürlich ein Theoretiker werden. Aber damals musste ich entscheiden, welches Thema ich für meine Doktorarbeit auswählen wollte. So sah ich damals als Doktorand aus, ob Sie es glauben oder nicht. Ich verlor meinen Mut, ich verlor den Mut und es ist ganz verständlich, da meine Eltern sich noch immer darum bemühten, im Westen anzukommen. Meine Eltern hatten Arbeit, aber mein Vater war von Arbeitslosigkeit bedroht. Meine Mutter wurde damals mit Krebs diagnostiziert und starb schließlich. Ich fühlte damals, dass ich etwas machen muss, das meine Eltern unterstützt, keine theoretische Physik usw. Und die älteren Semester sagten mir: „Mach keine theoretische Physik - du könntest sonst als Taxifahrer enden.“ Also mach das nicht, mach das nicht. Ich schrieb mich daher entgegen meiner Neigung bei einem Professor ein, der eine Start-up-Firma gegründet hatte, die sich auf die Entwicklung der Lichtmikroskopie spezialisierte – der konfokalen Mikroskopie, um genau zu sein, für die Inspektion von Computerchips usw. Ich schrieb mich ein. Mein Thema war es, Computerchips zu inspizieren und die Computerchips mit einem optischen Mikroskop auszurichten. Und ich dachte, wenn du das machst, bekommst du einen Job bei Siemens oder IBM usw. Aber nun, wie Sie sich vorstellen können, wenn man andere Neigungen hat, arbeitete ich ein halbes Jahr, sogar ein Jahr, aber ich war gelangweilt. Es war fürchterlich. Ich hasste es, ins Labor zu gehen. Ich war kurz davor aufzuhören. Ich schaute mich insgeheim nach anderen Themen um. Und ich hatte jetzt 2 Optionen: entweder konnte ich unglücklich werden oder darüber nachdenken ob ich noch irgendetwas Interessantes mit der Lichtmikroskopie machen konnte. Mit dieser Physik des 19. Jahrhunderts, die nichts war, nur Beugung und Polarisation, nichts mit dem man etwas anfangen konnte. Na gut, vielleicht gibt es den einen oder anderen Abbildungsfehler, aber das ist langweilig. Also dachte ich: Was bleibt noch übrig? Und dann merkte ich: die Beugungsgrenze zu brechen, das wäre doch cool, weil alle glauben, dass das unmöglich ist. Ich war von dieser Idee so fasziniert und erkannte irgendwann, dass es möglich sein müsste. Meine Logik war sehr einfach. Ich sagte mir, diese Beugungsgrenze wurde im Jahr 1873 formuliert - jetzt war es Ende der 80er-Jahre. So viel Physik war in der Zwischenzeit passiert, da muss es wenigstens ein Phänomen geben, das mich für irgendeine Ausführungsart jenseits der Beugungsgrenze bringt. Könnte Reflexion sein, Fluoreszenz, was auch immer - ich bin nicht wählerisch. Es muss doch irgendein Phänomen geben, das mich jenseits der Beugungsgrenze bringt. An einem Punkt schrieb ich diese Philosophie auf. Ich merkte, dass es nicht funktionieren würde, wenn ich die Art der Fokussierung änderte, weil man das nicht ändern kann, wenn man Licht benutzt. Aber vielleicht wenn man in einem Fluoreszenzmikroskop sich die Zustände der Fluorophore ansieht, ihre spektralen Eigenschaften. Vielleicht gibt es einen quantenoptischen Effekt. Man könnte vielleicht mit der Quantennatur des Lichts spielen, sozusagen, und es machen. Das war also die Idee. Ich sollte dazusagen, dass es zu der Zeit schon ein Konzept gab. Darum habe ich hier ‚Fernfeld‘ geschrieben auf etwas, das Nahfeldlichtmikroskop genannt wird. Und das benutzt eine winzige Spitze. Es ist wie ein Rastertunnelmikroskop, um eine Licht-Präparat-Wechselwirkung hier auf kleine Maßstäbe zu beschränken. Aber ich hatte das Gefühl, sah das wie ein Lichtmikroskop aus? Natürlich nicht, es sah aus wie ein Rasterkraftmikroskop aus. Ich wollte die Brechungsgrenze für Lichtmikroskope besiegen, die wie ein Mikroskop aussehen und wie ein Lichtmikroskop arbeiten – etwas, was niemand vorhersah. Und so versuchte ich damit mein Glück in Heidelberg, aber ich fand keine Stelle dafür. Aber ich hatte das Glück, jemand zu treffen, der mir die Chance gab, hier in Turku, in Finnland zu arbeiten. Ich wollte eigentlich nicht dorthin, aber ich hatte keine Wahl, und so landete ich dort. Im Herbst ‘93, an einem Samstagmorgen, machte ich, was ich immer machte: Ich durchsuchte Lehrbücher, um ein Phänomen zu finden, das mich jenseits der Barriere brachte. Ich öffnete dieses Lehrbuch in der Hoffnung, etwas Quantenoptisches zu finden: gequentschtes Licht, verschränkte Photonenpaare und solche Sachen. Und ich öffnete diese Seite und sah 'stimulierte Emission'. Und plötzlich traf es mich wie ein der Blitz und ich sagte: Toll, das könnte ein Phänomen sein, das mich jenseits der Barriere bringt, wenigstens für die Fluoreszenzmikroskopie. Und ich sage Ihnen jetzt, warum ich so fasziniert war. Ich ging zurück ins Labor und führte einige Berechnungen durch, um die Idee zu erklären. Ich sagte, dass man die Tatsache nicht ändern kann, dass all diese Moleküle mit Licht geflutet werden. Und daher würden sie normalerweise diesen Lichtfleck hier erzeugen. Das können wir natürlich nicht ändern. Wir könnten aber vielleicht die Tatsache ändern, dass die Moleküle, die alle mit Licht geflutet werden, mit Anregungslicht, am Ende in der Lage sind, Licht am Detektor zu erzeugen. Anders ausgedrückt, wenn man es fertigbringt, diese Moleküle hier in einen Zustand versetzen, wo sie kein Licht beim Detektor erzeugen können, dann kann ich diese separieren, die die können von denen, die nicht können. Und daher, wenn ich in der Lage wäre, diese Moleküle in einen stillen Zustand zu versetzen, wo sie kein Licht beim Detektor erzeugen können, dann kann ich dieses Molekül vom Rest trennen. Die Idee ist daher, wie ich gesagt habe, nicht mit der Fokussierung zu spielen, sondern mit den Zuständen der Moleküle. Das war daher die entscheidende Idee: die Moleküle im dunklen Zustand zu halten. Und ich sagte, was sind die dunklen Zustände bei einem fluoreszierenden Molekül? Ich schaute auf das grundlegende Energiediagramm. Es gibt den Grundzustand und den angeregten Zustand. Der angeregte Zustand ist natürlich ein heller Zustand. Aber der Grundzustand ist ein dunkler Zustand, weil das Molekül kein Licht emittieren kann, wenn es im Grundzustand ist. Das ist ziemlich offensichtlich. Und nun raten Sie, warum ich so aufgeregt war. Ich wusste, dass stimulierte Emission genau dies machte: Moleküle erzeugen, die im Grundzustand sind, Moleküle vom hellen Zustand zurück zum Grundzustand schicken. Ich bin an dem stimulierten Photon natürlich nicht interessiert. Aber ich bin an Tatsache interessiert, dass das Phänomen der stimulierten Emission Moleküle im dunklen Zustand erzeugt. Und es ist sehr offensichtlich. Man hat eine Linse, man hat eine Probe, man hat einen Detektor, man hat Licht, um die Moleküle anzuschalten. Also regen wir sie an, bringen sie zur Fluoreszenz, sie gehen in den hellen Zustand über. Und dann haben wir natürlich einen Strahl, um die Moleküle abzuschalten. Wir schicken sie vom hellen Zustand zurück zum Grundzustand, damit sie sozusagen nach Belieben den Grundzustand sofort einnehmen. Und die Bedingung, um sicherzustellen, dass dieser Übergang passiert, ist natürlich, dass man darauf achtet, dass es bei dem Molekül ein Photon gibt, wenn das Molekül angeregt wird. Anders gesagt, man benötigt eine bestimmte Intensität, um den spontanen Zerfall der Fluoreszenz zu übertreffen. Also muss man dahin ein Photon innerhalb von dieser Lebenszeit von einer Nanosekunde bringen. Das bedeutet, dass man eine bestimmte Intensität haben muss, die hier gezeigt ist, die Intensität des stimulierenden Strahls. Man muss eine bestimmte Intensität beim Molekül haben, um sicherzustellen, dass dieser Übergang wirklich stattfindet. Und dies ist eine Besetzungswahrscheinlichkeit des angeregten Zustands als Funktion der Helligkeit des stimulierenden Strahls. Und wenn man diese Schwelle einmal erreicht hat, kann man sicher sein, dass das Molekül kein Licht emittieren kann, obwohl es dem grünen Licht ausgesetzt ist. Natürlich gibt es ein stimuliertes Photon, das hierhin fliegt, aber das kümmert uns nicht. Weil uns nur interessiert, dass das Molekül nicht vom Detektor gesehen wird. Und daher können wir Moleküle nur durch die Präsenz des stimulierenden Strahls abschalten. Und jetzt können Sie sich vorstellen, dass wir nicht alle Moleküle hier in der Beugungszone abschalten wollen, weil das unklug wäre. Also was machen wir? Wir modifizieren den Strahl, sodass er nicht in eine Flächenscheibe fokussiert ist, in einen Fleck, sondern in einen Ring. Und dies kann sehr leicht über eine phasenmodifizierende Maske hier drin gemacht werden, die eine Phasenverschiebung in der Wellenfront generiert. Und dann erhalten wir einen Ring hier drin, der die Moleküle in der Präsenz der roten Intensität abschaltet. Aber jetzt lassen Sie uns natürlich annehmen, dass wir nur die Moleküle hier im Zentrum sehen wollen. Also müssen wir dieses und jenes abschalten. Was machen wir? Wir können den Ring nicht kleiner machen, weil auch er durch die Beugung begrenzt wird. Aber wir müssen das auch gar nicht tun, weil wir mit dem Zustand spielen können, das ist der Punkt. Wir machen den Strahl hell genug, sodass sogar in dem Bereich, in dem der rote Strahl schwach ist. Tatsächlich ist er hier im Zentrum null. Wo der rote Strahl in absolutem Maßstab schwach ist, ist jenseits der Schwelle, weil ich nur diesen Schwellwert benötige, um das Molekül abzuschalten. So erhöhe ich die Intensität so weit, dass nur eine kleine Region übrig bleibt, wo die Intensität unter der Schwelle bleibt. Und dann sehe ich nur diese Moleküle im Zentrum. Jetzt ist es offensichtlich, dass ich Merkmale trennen kann, die näher sind als die Beugungsgrenze. Weil diejenigen, die innerhalb der Beugungsgrenze nahe dran sind, vorübergehend abgeschaltet werden. Nun können Sie sagen: Was ich hier mache, ist, dass ich die Nichtlinearität dieses Übergangs sozusagen benutze. Aber das ist die altmodische Denkweise, die Denkweise des 20. Jahrhunderts. Und sie ist kein gutes Bild, weil es bei Nichtlinearität um die Photonenanzahl geht: dass viele hineingehen, dass viele herauskommen, oder weniger oder mehr. Hier geht es um Zustände. Um Ihnen das klar zu machen, entferne ich jetzt den Ring. Was wir machen, ist, die Moleküle innerhalb der Beugungszone in 2 unterschiedlichen Zuständen zu paaren. Sie sehen hier, dass die Moleküle gezwungen werden, die gesamte Zeit im Grundzustand zu verbringen, weil sie sofort zurückgestoßen werden, sobald sie hochkommen. Diese sind daher immer im Grundzustand. Dagegen dürfen jene im Zentrum den An-Zustand annehmen, den angeregten elektronischen Zustand. Und weil sie in 2 unterschiedlichen Zuständen sind, können wir sie trennen. Und auf diesem Weg werden in diesem Konzept Merkmale getrennt. Ich habe den Ring nur weggenommen, um Klarheit zu schaffen, sodass Sie die Notwendigkeiten sehen können, die Unterschiede in den Zuständen. Aber jetzt lege ich ihn zurück, damit Sie nicht vergessen, dass er da ist. Und jetzt könnten Sie sagen: Na gut, schlaue Idee. Die Leute werden begeistert sein, wenn ich das veröffentliche - was das nicht der Fall. Ich ging zu vielen Konferenzen, teilweise aus eigener Tasche bezahlt, weil ich ein armer Mensch war. Aber niemand glaubte wirklich an diese linsenbasierte Auflösung im Nanomaßstab. Es gab einfach zu viele falsche Propheten im 20. Jahrhundert, die das versprachen, aber nie lieferten. Und so sagten sie, warum sollte der Typ von hier erfolgreich sein. Das Überleben war daher sehr schwierig. Um zu überleben, verkaufte ich eine Lizenz, persönliche Patente, an eine Firma, und sie gaben mir im Austausch Forschungsgeld. Aber eine Sache möchte ich betonen: Ich war viel glücklicher als während meiner Doktorarbeit, weil ich das machen konnte, was ich wollte. Ich war von dem Problem fasziniert. Ich hatte eine Passion für meine Arbeit. Und auch wenn es schwierig war, wenn man sich die Fakten ansieht, machte ich es gern. Und so wurde ich erfolgreich. Am Ende entdeckte mich jemand von hier am Max-Planck-Institut in Göttingen. Und dann entwickelten wir es. Am Ende war es natürlich auch eine Teamanstrengung, über die Zeit. Und jetzt haben Sie diese Folie gesehen, sie ist bereits ein Klassiker geworden. Zunächst sah es so aus, und jetzt sieht es so aus - dies sind Kernporenkomplexe. Und man sieht sehr schön diese achtfache Symmetrie. Und ich vergleiche sie immer noch sehr gern mit der vorherigen Auflösung, muss ich zugeben. Und es ist sehr offensichtlich, dass am Ende die Methode funktionierte. Nicht nur funktionierte sie, natürlich kann man sie auch anwenden. Und dies ist die erste Anwendung auf Viren. Wenn man ein HIV-Teilchen hat - man hat hier beispielsweise Proteine, die interessant sind. Wie sind sie hier auf der Virenhülle verteilt? Wenn man nur die beugungslimitierte Mikroskopie nimmt, kann man es nicht sehen. Aber wenn man, sagen wir STED oder hochauflösende Abbildung, sieht man, wie sie Muster formen, alle Arten von Muster. Und was man dann herausgefunden hat, ist dass die, die in der Lage sind, die nächste Zelle zu infizieren, ihre Proteine, diese Proteine, an einer einzigen Stelle haben. Also lernt man etwas. Man kann auch dynamische Dinge mit schlechter Auflösung sehen, wenn man die Superauflösung nicht hat, das STED. Aber jetzt sieht man, wie Dinge sich bewegen, und man kann etwas über Bewegung lernen. So, dies ist eine Stärke des Lichtmikroskops. Eine weitere Stärke des Lichtmikroskops ist, natürlich, dass man in die Zelle fokussieren kann, wie angedeutet, und dreidimensionale Bilder aufnehmen kann. Und hier sehen Sie eine dreidimensionale Interpretation des Streckens eines Neurons. Nur um zu zeigen, was man damit als Methode machen kann. Die Methode wird in hunderten unterschiedlichen Laboratorien angewendet und ich werde Sie nicht mit Biologie langweilen. Ich komme auf eine eher physikalische Frage zurück und rede über die Auflösung. Und Sie werden fragen, was ist die Auflösungsgrenze, die wir jetzt haben? Zunächst, die erzielbare Auflösung wird nicht die Abbesche Auflösung sein. Weil offensichtlich die Auflösung durch die Region bestimmt wird, in der das Molekül seinen An-Zustand annehmen kann, den Fluoreszenzzustand, und der wird kleiner. Und das hängt natürlich von der Helligkeit des Strahls ab, der maximalen Intensität, und von der Schwelle, die natürlich ein Merkmal der Licht-Molekülwechselwirkung ist, natürlich molekülabhängig. Wenn man sie berechnet oder misst, findet man, dass dies wie gezeigt umgekehrt zum Verhältnis I geteilt durch IS. IS ist daher die Schwelle und I die angewandte Intensität. Und so kann man die räumliche Auflösung zwischen hoch und niedrig tunen, indem wir nur diese Region vergrößern oder verkleinern. Und dies ist sehr nützlich, weil man die räumliche Auflösung an das Problem anpassen kann, das man sich anschaut. Und das funktioniert nicht nur in der Theorie, es funktioniert auch in der Praxis. Hier haben wir etwas, es wird immer klarer, je höher man mit der Intensität geht. Man kann es natürlich auch herunterregeln, man kann es heraufregeln, oder man kann die Beugungsschranke so überspringen. Und daher ist dies ein wichtiges Merkmal. Aber schließlich sagt die Gleichung, d wird null, was heißt das? Wenn man 2 Moleküle hat und sie sind sehr nah, dann kann man sie nicht auseinanderhalten, weil sie zur selben Zeit emittieren können, wie man hier sieht. Was müssen wir machen, um sie zu trennen? Wir schalten dieses hier ab, so dass nur eins hereinpasst. Und dann können wir sie trennen, indem wir sie zeitlich hintereinander sehen. Warum? Weil wir den Rest abschalten und wir nur eins davon in diesem Fall sehen können. Und die Auflösungsgrenze ist am Ende die Größe des Moleküls. Nun, bei organischen Molekülen haben wir sie noch nicht erreicht. Aber man kann das bei bestimmten Molekülen, Arten der Moleküle, wie Defekte in Kristallen, wo man an und aus spielen kann. Und das ist klarerweise eine Begrenzung in diesem Konzept: wie oft man an und aus spielen kann. Man kann sehr, sehr kleine, sagen wir, Regionen zeigen - wie in diesem Fall 2,4 Nanometer. Man muss das daher ernst nehmen. Dies ist ein kleiner Bruchteil der Wellenlänge, und schließlich wird es auf 1 Nanometer hinuntergehen, da bin ich sehr zuversichtlich. Es gibt also andere Anwendungen. Beispielsweise gibt es, wie Sie erkannt haben, Stickstoff-Fehlstellen in Diamanten. Dies hat Implikationen für die magnetische Abtastung, Quanteninformation und so weiter. Es gibt also mehr als Biologie. Um das auf den Punkt zu bringen: Die Entdeckung war nicht, dass man stimulierte Emission machen sollte. Es war mir klar, dass es mehr als nur stimulierte Emission gibt, stimulierte Emission ist nur das erste Beispiel. Die Entdeckung war, dass man an und aus mit dem Molekülen spielen kann, um sie zu trennen. Das war für mich offensichtlich. Und obwohl stimulierte Emission natürlich sehr grundsätzlich ist – es ist die fundamentalste Ausschaltung, die man sich in einem Fluorophor vorstellen kann –, kann man auch andere Dinge ausspielen, wie die Moleküle in einen langlebigen dunklen Zustand zu versetzen. Es gibt mehr Zustände, als nur den ersten elektronisch angeregten Zustand. Oder, wenn Sie ein wenig Ahnung von Chemie haben, wissen Sie, dass Sie mit der Repositionierung von Atomen spielen können. Wie beispielsweise diese Cis-Trans-Isomerisierung wie hier. Und wenn eine davon, die Cis, beispielsweise fluoreszierend ist und man Licht auf sie scheint, fluoresziert sie. Oder wenn das Trans nicht fluoresziert, emittiert es kein Licht, wenn es im Trans-Modus ist. Man kann also an und aus mit den Cis- und Trans-Zuständen spielen. Ich hatte Schwierigkeiten, das zu veröffentlichen, darum steht hier ‘95 und nicht ‘94. Und sogar das wurde zurückgewiesen. Das ist also ein Reviewpaper, in dem ich das aufschrieb, und der Grund war der folgende: Man verstand nicht die Logik, obwohl dies in den Veröffentlichungen klar erklärt war. Die Logik war sehr einfach. Nun vergessen Sie nicht, wir trennen, indem wir ein Molekül ein- und das andere abschalten. Und dann ist es natürlich extrem günstig, wenn die Lebenszeit der involvierten Zustände lang ist oder relativ lang. Weil, wenn dies an und der Nachbar aus ist, muss ich mich nicht beeilen, die Photonen hier schnell hineinzukriegen. Ich muss mich nicht beeilen, die Photonen hier schnell herauszuholen. Die Intensität, die ich hier anwenden muss, um daher diesen Unterschied in den Zuständen, Skalen herzustellen, ist natürlich umgekehrt zur Lebenszeit der involvierten Zustände. Je länger die Lebenszeit, je höher die optische und Bio-Stabilität von etwas ist, desto weniger Intensität benötige ich. Die Schwellintensität wird also niedriger mit der Lebenszeit der involvierten Zustände. Das bedeutet, wenn dies hier 6 Größenordnungen größer wird, dann wird die Intensitätsschwelle 6 Größenordnungen kleiner. Und dies ist hier der Fall, weil wir wegen der langen Lebensdauern weniger Licht benötigen, um dieselbe Auflösung zu erzielen. Also wird das IS verkleinert und damit auch das I in der Gleichung. Insbesondere ein fluoreszierendes Protein zu schalten ist sehr, sehr attraktiv, einfach weil es schaltbare fluoreszierende Proteine gibt, die eine Cis-Trans-Isomerisierung machen. Und man kann die Beugungsgrenze bei sehr viel niedrigeren Lichtniveaus brechen. Das haben wir nach etwas Entwicklungsarbeit gezeigt. Es ist hier angezeigt, wenn man wenig Licht benötigt, dann könnte man doch sagen: Warum sollte ich nur einen Ring verwenden, wo ich doch viele dieser Ringe oder parallele Löcher nutzen könnte? Und daher wenden wir hier viele parallel an, um, sagen wir, eine Abschaltung durch Cis-Trans-Isomerisierung durchzuführen. Und man kann natürlich leicht das ganze Ding parallelisieren, indem man eine Kamera als Detektor nimmt und viele davon hat. Wenn sie weiter entfernt sind, dann ist die Beugungsgrenze kein Problem. Wir können sie immer trennen. Was wir daher hier machten, war, wir bildeten eine lebende Zelle mit mehr als 100.000 Ringen sozusagen in weniger als 2 Sekunden bei niedrigen Lichtniveaus ab. Der Grund warum ich Ihnen dies zeige: Es ist nicht mehr die Linse und der Detektor, die entscheidend sind, es ist der Zustandsübergang. Weil der Zustandsübergang, die Lebensdauer der Zustands, tatsächlich die Abbildungstechnik bestimmt, den Kontrast, die Auflösung – alles, was Sie sehen, dass der molekulare Übergang im Molekül das Entscheidende bei der Technik wird. Damit komme ich fast zum Ende. Was ist nötig, um die beste Auflösung zu erhalten? Angenommen, Sie hätten diese Frage im 20. Jahrhundert gestellt. Die Antwort wäre gewesen: Man benötigt ein gutes Objektiv – es ist ziemlich offensichtlich, weil man das Licht so gut wie möglich fokussieren muss. Also hätte man zu Zeiss oder Leica gehen müssen und um das beste Objektiv bitten. Aber wenn man natürlich die Merkmale trennt, indem man das Licht, wie ich erklärt habe, hier fokussiert oder dort, dann ist man offensichtlich durch die Beugung begrenzt. Weil man Licht nicht besser als bis zu einem gewissen Punkt fokussieren kann, der durch die Beugung bestimmt wird. Was war daher die Lösung des Problems? Die Lösung des Problems war, nicht durch das Phänomen der Fokussierung zu trennen, sondern zu trennen, indem man mit den molekularen Zuständen spielt. Hier trennen wir also nicht nur, indem wir den Brennpunkt so klein wie möglich machen – das brauchen wir nicht wirklich -, sondern indem wir eines der Moleküle oder eine Gruppe Moleküle in einem hellen Zustand haben, das (oder die) anderen in einem dunklen Zustand - 2 unterscheidbare Zustände. Ich habe Ihnen Beispiele für die Zustände genannt - und es gibt viele mehr die man sich vorstellen kann -, um diesen Unterschied in den Zuständen auszuspielen, um die Trennung durchzuführen. Und das ist der Punkt. Ich habe über die Methode 'STED' und die Ableitung von STED gesprochen. Sie verwendeten einen Lichtstrahl, um zu bestimmen, wo das Molekül im An-Zustand ist. Hier ist es im Zentrum an und hier ist es aus. Und es ist sozusagen eng kontrolliert, wo innerhalb der Probe das Molekül im An-Zustand und wo das Molekül im Aus-Zustand ist. Dies ist eines der Kennzeichen dieser Methode, die STED genannt wird, und ihrer Ableitungen. Wie Sie wissen, habe ich den Nobelpreis mit 2 Leuten geteilt. Eric Betzig entwickelte eine Methode, die auf einem fundamentalen Niveau mit der STED-Methode verwandt ist. Weil es auch diesen An-und-Aus-Übergang verwendet, um Dinge trennbar zu machen. Nun haben Sie hier 1 Molekül, der Rest ist dunkel. Aber der Hauptunterschied ist, dass nur 1 Molekül angeschaltet ist - das ist sehr kritisch. Und wenn man nur 1 Molekül im An-Zustand hat, dann hat man die Möglichkeit, die Position zu finden, indem man die von dem Molekül kommenden Photonen nutzt. Man nimmt daher einen Pixeldetektor, der Ihnen eine Koordinate gibt. Und wenn dieses Molekül das spezifische Merkmal besitzt, und es muss das haben, diesen An-Zustand, dann erzeugt es ein ganzes Bündel mit vielen Photonen. Man kann auch die Photonen, die hier emittiert werden, nutzen, um die Position herauszufinden. Man lokalisiert es hier, wie Steve Chu gestern zeigte. Man kann das sehr, sehr präzise durchführen, es gibt Ihnen die Koordinate. Aber der Zustandsunterschied ist unbedingt notwendig, um die Trennung durchzuführen. Dies gibt Ihnen daher die Koordinate. Hier benötigt man viele Photonen hier. Hier benötigt man viele Photonen hier. Man benötigt daher immer viele Photonen, um die Koordinate herauszufinden. - Warum? Weil ein Photon irgendwo in die Beugungszone fliegen würde. Aber wenn man viele Photonen hat, dann kann man natürlich den Mittelwert nehmen. Und dann kann man eine Koordinate sehr präzise definieren. Aber das ist nur die Definition der Koordinate. Das tatsächliche Element, dass es erlaubt, Merkmale zu trennen ist die Tatsache, dass eines der Moleküle hier im An-Zustand ist, der Rest ist aus. Sie werden alle mit Licht angestrahlt, aber nur diese eine darf emittieren. Sie werden alle mit Licht angestrahlt, aber nur diese Gruppe darf emittieren. Der Rest ist dunkel. Wenn Sie also mich fragen - und als Physiker will man immer das eine Element herausfinden, das wirklich das Ding auf die Bühne stellt -, dann ist es der An-/Aus-Übergang. Ohne das, wenn man es herausnähme, würden keine der sogenannten Superauflösungskonzepte funktionieren. Und das ist das Fazit. Also warum trennen wir jetzt Merkmale, die vorher nicht getrennt werden konnten? Es ist ganz einfach, weil wir einen Zustandsübergang induziert haben, der uns eine Trennung liefert. Fluoreszierend und nicht-fluoreszierend, es ist nur eine Möglichkeit, diesen Zustandsübergang zu spielen. Es ist der Einfachste, weil man das fluoreszierende Molekül einfach stören kann. Wenn ich es mit etwas anderem hätte tun können, dann hätte ich das getan, keine Sorge. Ich wollte es nicht unbedingt für die Lebenswissenschaften machen. Aber dies bringt mich natürlich zu dem Punkt, dass es im 20. Jahrhundert um Linsen und die Fokussierung des Lichts ging. Heute sind es die Moleküle. Und man kann das rechtfertigen, indem man sagt, dass es eine Entdeckung der Chemie, ein Chemiepreis ist. Weil das Molekül nun in den Vordergrund rückt, sind die Zustände des Moleküls wichtig. Aber dieses Konzept kann umgesetzt werden. Natürlich kann man sagen, 2 unterschiedliche Zustände, A und B, aber es könnte auch etwas Absorbierendes sein, Nichtabsorbierendes, Streuung, Spin-Up, Spin-Down. Solange man die Zustände trennt, ist man innerhalb des Rahmens dieser Idee. Nun, die Abbesche Beugungsgrenze. Die Gleichung bleibt nicht gültig, man kann das leicht korrigieren, ohne Probleme. Man kann diesen Wurzelfaktor einsetzen, und dann können wir auf die molekulare Größenordnung hinuntergehen. Und das bedeutet als eine Einsicht: Das Missverständnis war, dass Leute annahmen, für die Auflösung in der Mikroskopie wären nur Wellen wichtig. Aber das stimmt nicht. Für die Auflösung in der Mikroskopie sind Wellen und Zustände wichtig. Und wenn man es im Licht der Möglichkeiten der Zustände sieht, dann wird die Lichtmikroskopie sehr, sehr kraftvoll. Und das ist nicht das Ende der Geschichte. Es gibt noch mehr zu entdecken. Zum Schluss möchte ich die Leute herausstellen, die wichtige Beiträge zu dieser Entwicklung gemacht haben. Einige sind weggegangen und sind Professoren an anderen Institutionen, einige sind noch in meinem Labor und arbeiten mit mir oder haben eigene Firmen aufgebaut. Nun, noch eine Sache – es ist das Letzte, das ich am Ende erwähnen möchte: Sie sollten nicht vergessen, dass es nicht dieser Typ war, der die Idee hatte, es war der hier. Vielen Dank.

Stefan W. Hell (2016)

Optical Microscopy: the Resolution Revolution

Stefan W. Hell (2016)

Optical Microscopy: the Resolution Revolution

Abstract

Throughout the 20th century it was widely accepted that a light microscope relying on conventional optical lenses cannot discern details that are much finer than about half the wavelength of light (200-400 nm), due to diffraction. However, in the 1990s, the viability to overcome the diffraction barrier was realized and microscopy concepts defined, that can resolve fluorescent features down to molecular dimensions. In this lecture, I will discuss the simple yet powerful principles that allow neutralizing the limiting role of diffraction. In a nutshell, feature molecules residing closer than the diffraction barrier are transferred to different (quantum) states, usually a bright fluorescent state and a dark state, so that they become discernible for a brief period of detection. Thus, the resolution-limiting role of diffraction is overcome, and the interior of transparent samples, such as living cells and tissues, can be imaged at the nanoscale.

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