Steven Chu (2016) - Optical Microscopy 2.0

In the past decade, there has been an explosion of new imaging technologies in biology that include super-resolution microscopy, structured illumination and adaptive optics. In parallel with the revolution in optical microscopy, similar dramatic advances are occurring in electron microscopy, particularly cryo-EM

Thank you very much. So let me just begin and talk about what is very important philosophy. This is the greatest American philosopher of the 20th century. Just in case you’re wondering who that is, that is a catcher for the New York Yankees named Yogi Berra. And on the right he’s in a very philosophical conversation. He said many wise things, for example, if you come to a fork in the road, take it. He also said, you can observe a lot by just watching. And many advances in physics, in biology, in particular in medicine, actually have been made by advances in imaging technologies. This is a small sampling of inventions that were useful. The inventions were all awarded Nobel Prizes. The ones in white have to do with optical microscopy, and so you might think, optical microscopy, wasn’t that done long, long ago and reached its prime in the 1920s or ‘30s? - but not quite. But let me bring you back a little bit to the invention of the very first good optical microscope by Leeuwenhoek, and that microscope is on the right hand side. What you see is actually not a compound microscope but a simple spherical lens. But that lens, made by drawing a fibre and turning it into a nearly perfect sphere that’s fire polished, coupled with your eye, made the first really good optical microscope. Now, he started working on this, beginning to see strange things, people started hearing rumours about this - one great Brit visits Leeuwenhoek and encourages him to submit a paper to the Royal Society. So he writes it up and submits it and then he gets this reply from the secretary of the Royal Society in October 1676: Dear Mr. Anthony van Leeuwenhoek. Your letter of October 10th has been received here with amusement. Your account of the myriad “little animals” seen swimming in rainwater ... led one member to imagine that your “rainwater” might have contained an ample portion of distilled spirits – imbibed by the investigator. For myself, I withhold judgement as to the sobriety of your observations and the veracity of your instrument. However, a vote has been taken ... [and] it’s been decided not to publish your communication ... However, all here wish your “little animals” health, prodigality and good husbandry by their ingenious “discoverer”. That is surely a letter of rejection. (Laughter) Well, they didn’t believe it but soon they did and off it went. Now, let me fast forward in time, and in 2014 the Nobel Prize in Chemistry was awarded to 3 physicists, as it should be. So normally the resolution of an optical microscope is dictated by the uncertainty principle. If you want to localise something and make an image, and that means you want to know that the light is coming from a little spot delta X along this dimension, then you need to make the delta P of the light coming out as broad as possible. So how do you make delta P wide? Well, you open up the angles so the lens has to collect as much light as possible and, of course, you go to short wavelengths. So short wavelengths and a bigger angle means that delta P, the spread in momentum, becomes bigger. And so that is actually what defines the diffraction limit. In most modern optical microscopes the diffraction limit in green light is something around 200 to 300 nanometres. And that’s that blur circle, that’s the minimum diffraction or uncertainty principle. But if you ask a different question and you ask, what’s the centre of that blob of light? That really depends on the width of that blob of light divided by the signal-to-noise. So if the signal-to-noise is 10 to 1 you in principle get 10 times better signal, 100 to 1 in principle 100 times better. Now, if you have 1 dye molecule and you look at it for a while it goes away and you look at another dye molecule and another dye molecule and another dye molecule, not all at the same time because clearly if you see this all at the same time, you see a big blob. So sequentially in some stochastic way if you see them one at a time, finding the centre of each one, you can create a better image. And so that was the idea that Eric Betzig and his collaborators introduced. W. E. Moerner was the first to detect molecules in absorption. But also he found that you can photoactivate these molecules. A different method was invented by Stefan Hell who is here at this meeting and I encourage you to go and find him. But here is what you see. On the left-hand side you see an optical resolution microscope and on the right-hand side you see this reconstructed image when you see dots blinking on and off one at a time you go to higher resolution. Now, the scale bars are half a micron and you see in this blown up thing 0.1 microns, 0.2 microns. Each little dot is a single dye molecule that’s identifying a particular protein. Stefan Hell, again I’m not going to explain this, because I encourage you to go and find him. If you’re looking at some nuclear proteins in a membrane this is what you might see in the highest-resolution confocal microscope. But the image is greatly improved if you go to these so-called super-resolution images. And in that little white square you can blow that up, and again the scale bar is 150 microns. So this was very exciting and in my group we adapted those methods looking at the cholera, this is a conventional image of something but this is what it looks like in super-resolution. You blow that up and again the scale bar being 200 nanometres and so you’re seeing about 15 nanometre resolution. Let me tell you one example of how you can, instead of just seeing pretty pictures, how can it be actually useful in science. So there’s a study where you’re looking at a particular molecule involved in a signalling pathway. The signalling pathway works as follows: If you’re a cell embodied in an organism, in a tissue, you don’t willy-nilly divide, that’s considered very anti-social behaviour. You divide when the surrounding tissue says it’s ok to divide, to replace, to repair, whatever. But if you willy-nilly divide, divide, divide, saying me, me, me, that’s called cancer. And so in this particular molecule a protein, one amino acid chain in this protein causes cancer. And in this particular instance 90% of all pancreatic cancers are caused by this single-point mutation. Now, I’m going to show you a little – let’s see if I can play this – a cartoon movie made by Genetec of, of – oh, this thing not works. So let me start this thing. And so there’s a signal coming from the outside, that so-called yellow thing or ligand, it attaches to the receptors. And when it attaches to the receptors you see that these receptors on the outside of the cell extend through the cell and the tail ends down here in the cell get together. They induce other molecules to come along, these molecules have names, the names are not important unless you’re a biologist, finally recruiting a membrane protein called RAS. The story then continues, it’s pretty complicated. There’s a cascade of molecules being turned on, the RAS then recruits another molecule called RAF. After that is recruited and activated it goes on to a scaffolding inside the cell which then activates a molecule called MEK, a molecule called ERK. ERK diffuses into the nucleus of the cell, works its magic and then tells the cell to proliferate. Alright, about half of that is wrong. For example, it was discovered in 2009 that that single RAF molecule wasn’t enough, the RAF molecules had to pair up and it’s the double paired RAF molecules that presented the signal. And so a drug was invented that keeps them from pairing and, lo and behold, multiple myeloma at least temporarily had a dramatic cure. You take this drug and within weeks all the tumours disappear. No, not multiple myeloma - melanoma, it's a very, very deadly skin cancer. And so it was the first miracle drug, a targeted therapy and it was great. What about RAF? We didn’t know about RAF and so it’s a suspicion that perhaps RAF would also have to pair up before it was able to send its signal to the RAF molecule. And in single molecule work it becomes actually pretty simple. What you have is you look at, this is on a cell membrane, each little dot of light is the centroid of a single RAS molecule, RAS molecule. And at certain cell density, in this case, we can up-regulate the expression of these molecules. And we find that in the case of a certain concentration that you see in the upper left hand corner, you find that they’re mostly singles, very, very few doubles or triples, probably accidental, and there is no using more conventional biochemical techniques, there is no downstream signalling that tells the cell to proliferate. When you up the concentration, let’s say 7 fold and you’ve got a lot more dots you see, voilà, pairing. How do you see pairing? Because the dots are together. It becomes really naïve data analysis, oh I see dumbbells. And when you see dumbbells, but not that many, only 20% of them are pairs, it’s sufficient actually to send the downstream signalling to say, aha, proliferate - without an outside signal. So this is just a trivial example of how super-resolution immediately gives you something very important. If you can prevent the pairing of the RAS molecules then you can defeat this. And it’s very much important to make this molecule double. Anything upstream is a better drug because as you go downstream the number of molecules multiplies. I spent about 10 years sabbatical worrying about energy. And I’m still not off that sabbatical completely, I still worry about energy and climate change and I’m having a master class this afternoon on that. But when I got back from being Secretary of Energy I said, well, time to look for some new things to do. And, in fact, time to look for new technology. Indeed, all my life what I would try to do is to say, ok, if there’s a new technology that can advance science and apply it to the problems I’m interested in, including this signalling problem, that would be good. So I sat down, fresh out of government with no lab, no students, no post docs, no money. The only thing I could do was think. And that turns out to be liberating. And so I put together a Christmas Wish List for new probes. I wanted the probes to be photostable that would last forever, give out millions of photons over periods of seconds but really last forever, Because I knew already that if you can get 5 million photons from a probe, and there were other caveats, you can actually get sub-nanometre spatial resolution. That was a paper my colleagues and I published in 2010. If they were bright enough, you can follow the dynamics of what’s happening in a live cell with 1 millisecond time scales, and finally is it possible to look through several millimetres of tissue. So in order to do that these probes weren’t available commercially at the time. So we started looking at rare earth impurities embedded in nanocrystals that a lot of work had been done on, up-converting particles for this, but more recently, in the last 3 or 4 years, a lot of work has been done in biology. So I’m going to be describing the work of 2 post docs in my group. And here we’re comparing organic dye molecules that are used in single-molecule super-resolution experiments. And compare that to the light emitted by rare earth embedded in crystals, and you see that they’re narrower, and these happen to be synthesised by another person in my group. But that’s not really why we’re doing this. We’re doing this because you can dope a crystal with maybe 5,000, 10,000 impurities and you can put them so they emit at a certain colour of light in the near infrared, 800 nanometres. You can take another crystal and you can dope it equally with 2 impurities, so they emit at 880 nanometres. Another crystal can emit this colour. Another crystal can emit with a different ratio of colours. And so it doesn’t take much imagination to say if you can see high, medium, nothing in 3 colours, you build up combinatorily the number of different crystals you can see. So instead of 1, 2 or 3 specially resolved probes you can get 10, 12, 20. And indeed it’s this essentially spectral bar coding that was very attractive. Now, the other thing my guys wanted to do would be to see if you can combine this with electron microscopy. This is a very famous photograph of the gap between one neuron and another neuron. If this is a neuron and this is the axon of the neuron, voltage spikes go down here, they go to the tips of the axon. They open up calcium channels. And those calcium channels induce a set of proteins on the cell membrane to take these little spheres, vesicles full of neurotransmitters, to very quickly, sub-millisecond times, a 10th of a millisecond, to fuse the vesicles into the cell membrane, releasing neurotransmitters, they diffuse across the gap, only 40 nanometres across, and they hit on receptors. And so that happens very, very quickly. And that’s how one neuron talks to another neuron. But you have this beautiful black and white picture. But you want to see what are the roles of the proteins and where are they located to really figure out how this thing works. So to this end what they did is they were borrowing a Lawrence Berkeley Laboratory microscope. Two people over there in the Molecular Foundry have put together a microscope with a scanning electron beam but they also attached a light-collecting mirror. So you also can look at what are called cathodoluminesence, the electron beams excite something and it fluoresces. And so if you take that light and divide it spectrally by a few dichroic filters into photon counting photodiodes you can actually read the spectral bar code. You can do this with a scanning electron microscope or a scanning transmission electron microscope. So this is an example, this is a part of a He-La cell, it’s a cancer cell labelled with rare earth particles, I have these arrows to show these tiny little dots of rare earth particles on the He-La cell. And in an optical microscope, in a best high resolution confocal microscope, you get your 200 or so nanometre spatial, And the fluorescent or luminescence signal that you see is actually dictated by the size of the particle because it is an electron microscope. So that’s the thing you see, that’s the image you see and that’s what you see in the electron microscope of the structure of the particle. But remember the electron microscope is taking the structure, the microstructure or the nanostructure, of the sample itself. As we improve we’re getting down, this is signal- to-noise, this is the size, and we’re pretty confident we can get down to maybe 10 nanometre size nanoparticles and still have a signal-to-noise of 10 to 1 which is sufficient to do the spectral bar coding. So that is good. Work is going apace on that to really combine multiple protein labelling with electron microscopy resolution with the identification of multiple proteins. Another thing about these rare earth particles is that they can be made to emit and absorb light in the most transparent region of human tissue, or animal tissue, in the visible light range. This is the effect of plotting on this axis, on a log axis, is the effective absorption and light scattering of visible light, but once you go on to the near infrared above 650 nanometres all the way out to 1,300, 1,400 nanometres, you’re up in transmission by roughly an order of magnitude. Alright, so we’d like to do that. That means we have the potential of seeing more deeply into tissue. But here you see the red glow of some red particles coming out of a mouse but they’re scattered. So the scattered beam actually distorts the image. So to that end we’re going to adopt something else that’s been used first in astronomy, called adaptive optics. In this picture there’s a bright green laser that illuminates the sodium layer in the upper atmosphere, creates an artificial guide star, and then you know that that’s a point light, you adjust the mirror of the telescopes and the secondary mirror, and you adjust it to take out the intrinsic fraction changes of the air and you take out the twinkle of the star with the hopes that you get closer to diffraction limit. In optical microscopy you have the same situation. If the light propagates in air you have a wonderful image but as it goes through scattering medium the wave fronts get distorted, they mess up the resolution and, in fact, in strongest scattering media it turns out it’s like looking into fog. And so the question is can you make adaptive optics do the right thing and fix up the image, looking deeper into tissue. And we began collaborating with Bruce Macintosh who recently joined Stanford Physics Department. And his guide stars, he’s looking for extrasolar plants, he’s looking for planets. And if you get the resolution high enough you’re looking at the star, that’s your guide star. And if it’s high enough you can actually see the planet traverse. Ok, so I’m going to now show you work not done in my group but done by others. This is in the lab of Na Ji, also in collaboration with Eric Betzig at Janelia Farms. And this is looking 400 microns into a brain of a mouse. But it’s better than that, the mouse is alive, it’s interacting and they’re showing pictures to the mouse. And they want to show what is the brain doing when it sees these pictures. On the left-hand side is no adaptive optics correction, on the right-hand side you have adaptive optics correction. You’re going to see flashes of light. There is a dye, a genetic dye that’s introduced into the mouse and when the neuron fires, I told you that neurons, the voltage spikes go down, they open up calcium channels, the calcium channels induce the vesicles to fuse. This dye actually makes those calcium channels visible. And so here you have in a live mouse, so that the image is wiggling around because it’s looking around, trying to make, they’re putting images in front of it, it’s blinking and deciding, his brain is deciding what to do. So this is in the visual cortex of a mouse. Pretty spectacular but the image is a little better, a little brighter, but it’s an important step forward. It’s actually very spectacular work. Here is something, another type of work. This is now shining 2 photon light into a mouse, again a live mouse. This time we’re not going to open up the skull cap, we’re going to just look through the skull And, again, adaptive optics tries to correct the distortions - this technique works in a different way. On the left-hand side, you can barely see it, but there’s maybe faint green that you might see here. But if you adjust the adaptive optics to correct for the strongly scattered medium, the actual skull of the mouse, at a certain depth, and you do that by locking on to a little bright spot over here, shown by the little arrow – I guess I can also show it here, this little bright spot – you wiggle the mirror elements. After you wiggle the mirror elements this is what you see. And you’re really achieving your optical resolution 400 microns. Now looking through 150 microns intact skull and further 180 microns into the brain. So that’s all fine and good. These are using WFp photons that are strongly absorbing light. So the question is, if you go deeper into the infrared, can you look not 500 microns but maybe 5 millimetres? This is an open question. We’re working on this, we’ve gotten down to a millimetre, but we’ll see. Another few applications of these probes. An imaging embryo development and also seeing if we can watch stem cells migrate and cancer metastasis. We approached a geneticist at Stanford, Hiro Nakauchi, and said, why don’t we collaborate and see if we can put nanoparticles into a developing embryo and as the embryo develops and differentiates you can actually track them. So to this end we put 100,000 nanodiamonds into the embryo by simply injecting them in. And this first set of experiments is done in a petri dish. The cells divide, divide, divide. As they divide, since there are now diamonds are in the cytosol of the cell, they’re evenly divided and they seemed to divide. And here are the late-stage, the mid-stage blastocysts, you see it in there. So the next thing we did is we put these 100,000 Nano diamonds into the eggs and put them in surrogate mothers, waited 13 days. It takes 22 days to reach full gestation. By 13 days you see the skull and you see the spine, you see developed organs. And we were trying to figure out do we see nanoparticles also and we were trying to figure out where they went. So you can see time points, but the real pay dirt is if you can look through the tummy of the mother mouse, looking several millimetres in and every day you check on what’s happening as the nanoparticles divide, where are they? That’s what we really want to do. And cancer metathesis also you have a solid tumour, they go into the blood stream, they migrate around. It turns out as they pop out somewhere else most of those cells, those tumour cells, metastasising cells don’t make it. These microtumours do not make it, the natural body defences squash them; very few of them do make it. What if you can put labels on to these cancer cells as they multiply and move around and you can see as they move around through the skin without opening the mouse, then you can actually do single needle biopsies and try to figure out which ones make it, why do they make it, by analysing the RNA DNA. These are single-cell technologies that have really lurched forward. Now, these cells are too small to put lots of particles into cells. It’s not a big egg, fertilised egg of 80 microns, these are somatic cells. So how do you inject nanoparticles into them? You can just drop them on in the endocytose. But then they end up in little stomachs, lysosomes of the cell. And we’d like to put them in the cytoplasm so when the cells divide, divide, divide, they divide evenly. Otherwise they would be a point source emission. So to this end we found luckily that there’s a fellow at Stanford who is making nanostraws. He takes the standard nanopore filter, this is b over here, it’s plastic polymer film, and you make little channels, you coat this with 3 layers of aluminium oxide, you etch it away with lithographic techniques. You put some cellular binding thing on the cell, the cells like to lay down, thousands and thousands of cells lay down, about 8% of the little straws poke into the cell. And Nick Melosh and his group have shown that you can actually get dyes into this. You can get DNA out of the cell. And very recently, in collaboration with us, it was shown that you can now begin to get nanoparticles into the cell and into the cytosol. So it’s another little piece. Diamonds, fluorescence diamonds is another particle we’re looking at. This is a diamond. And if you have a silicon impurity in a diamond, it’s too big to fit into lattice-size, so it fits into interstitial. Nitrogen-vacancy diamonds are available commercially. They’re made in bulk, they’re ground up and they’re sorted. And so that’s the state of the art. We are trying to grow nanodiamonds from the ground up using diamond structure molecules laid on a surface in a CVD process. And so it’s either a microwave CVD on a direct plasma or an indirect plasma. Again colleagues, I found colleagues at Stanford and they were making these. These are nanodiamonds clearly showing the diamond facets. This is Nick Melosh, Zhi-Xun Shen, and the graduate student working on the project graduated. And one of my post docs, Yan Kai Tzeng, decided why not make a poor person’s indirect CVD, put the wafer on its edge, the plasma is on the top and see what you get. What you get, as you go down from the top plasma, is really rotten stuff up here, getting better and better and better. If you look at the Raman spectrum, by the time you’re several millimetres down, you see a very clear Raman spectrum that looks like a diamond and not graphite which is this peak over here. So that’s a better looking diamond. That’s one micron diamond, looks to be single crystal. That’s 500 nanometres, 200 nanometres, 100 nanometres, 50 nanometres. All look to be single crystal. How small can you get? - Well, 5 to 10 nanometres. Now, if you stare at this long enough you might convince yourself that there’s a little facet that looks like that. But that’s wishful thinking, you say. You can take a Fourier transform of that, a lattice image, and you do get the lattice spacing. But there’s a better way. Just focus the electron beam on the little particle and take a diffraction image and what you see is the background silicon lattice and you see the diamond lattice and you see one diamond lattice. So it appears that that too is a single crystal. We do calculations on the growth conditions, as you go up from the top of the plasma the temperature goes from about 900 degrees C to 500 degrees C. Where you make the best diamonds is about 600 degrees C which is 200 degrees less than the standard fabrication method. This is the density of hydrogen in there. We think that atomic hydrogen eats away the graphite if it forms to preserve the pristine diamond surface. The optical spectra is pretty good. This is in a big diamond, 100 nanometres in diameter, and the linewidth is very narrow compared to a diamond film. So we believe that probably it may be possible to get linewidth-1 diamonds. We know how to put diamonds, other impurities, chromium, we’re able to put in germanium, we’re able to put in impurities and we’re just right now in the process of seeing how small we can make these colour centres. Of course, you know, all this microscopy always had precursors, even earlier than Leeuwenhoek. So I end by just noting that there was even earlier microscopes. Thank you.

Vielen Dank! Lassen Sie mich damit beginnen, über eine sehr wichtige Philosophie zu sprechen. Dies ist der größte amerikanische Philosoph des 20. Jahrhunderts. Nur für den Fall, dass Sie sich fragen, wer das ist - es ist ein Fänger für die New York Yankees namens Yogi Berra. Und rechts befindet er sich in einer sehr philosophischen Unterhaltung. Er hat viele weise Dinge gesagt, beispielsweise: "Wenn Sie an eine Weggabelung kommen, dann nehmen Sie sie." Er sagte auch: "Man kann nur durch Zusehen viel beobachten." Und viele Fortschritte in der Physik, aber auch in Biologie und insbesondere in Medizin, wurden wirklich durch Fortschritte in Abbildungstechnologien gemacht. Dies ist eine kleine Sammlung von Erfindungen, die nützlich waren. Die Erfindungen wurden alle mit Nobelpreisen ausgezeichnet. Die weißen befassen sich mit der Lichtmikroskopie. Und man könnte denken, Lichtmikroskopie wurde schon seit langer Zeit durchgeführt und erreichte ihren Zenit in den 1920er- oder 30er-Jahren, aber nicht ganz. Aber lassen Sie mich ein wenig in der Zeit zurückgehen zur Erfindung des ersten guten Lichtmikroskops durch Leeuwenhoek, und dieses Mikroskop ist rechts zu sehen. Sie sehen eigentlich kein zusammengesetztes Mikroskop, sondern eine einfache Kugellinse. Aber durch diese Linse, gefertigt durch Ziehen eines Fadens und Verwandlung in eine nahezu perfekte Kugel, die feuerpoliert wurde, in Verbindung mit dem Auge, entstand das erste wirklich gute Lichtmikroskop. Er begann, damit zu arbeiten und merkwürdige Dinge zu sehen. Es fing an, dass es Gerüchte darüber gab, wie zum Beispiel: Ein bedeutender Brite besuchte Leeuwenhoek und ermutigte ihn, eine Veröffentlichung zur Royal Society zu einzusenden. Also schrieb er es auf, schickte es ein, und bekam im Oktober 1676 diese Antwort vom Sekretär der Royal Society: Ihr Bericht der Unzahl von „kleinen Tierchen“, die man im Regenwasser schwimmen sehen kann ..., führte dazu, dass ein Mitglied sich vorstellte, dass Ihr „Regenwasser“ eine gehörige Portion destillierten Alkohol enthalten haben könnte – der durch den Forscher getrunken wurde. Ich selbst enthalte mich des Urteils über die Nüchternheit Ihrer Beobachtungen und der Wahrheitsliebe ihres Instruments. Aber eine Abstimmung fand statt ... [und] es wurde entschieden, Ihre Mitteilung nicht zu veröffentlichen ... Wir alle hier wünschen aber Ihren „kleinen Tieren“ Gesundheit, Fülle und gute Vermehrung durch ihren findigen 'Entdecker'." Wenn das mal kein Ablehnungsschreiben ist. (Lachen) Nun, sie glaubten ihm nicht, aber schon bald taten sie es und von da ging es los. Lassen Sie mich in der Zeit schnell nach vorne spulen. Im Jahr 2014 wurde der Nobelpreis in der Chemie an 3 Physiker vergeben, wie es auch sein sollte! (Lachen und Applaus) Normalerweise wird die Auflösung eines Lichtmikroskops durch das Unschärfeprinzip bestimmt. Wenn man etwas lokalisieren möchte und ein Foto macht – und das bedeutet, dass man wissen möchte, dass das Licht von einen kleinen Fleck Delta X entlang dieser Achse kommt -, dann muss man das Delta P des herauskommenden Lichts so groß wie möglich machen. Wie macht man Delta P groß? Nun, man öffnet die Winkel so, dass die Optik soviel Licht wie möglich sammelt und geht auf kurze Wellenlängen über. Kurze Wellenlängen und ein größerer Winkel bedeutet, dass Delta P, die Impulsverteilung, größer wird. Und dies definiert tatsächlich die Beugungsgrenze. In den meisten Lichtmikroskopen ist die Beugungsgrenze im grünen Licht etwa 200 bis 300 Nanometer. Und das ist dieser Verschwommenheitskreis, das ist die minimale Beugung oder das Unschärfeprinzip. Aber wenn man eine andere Frage stellt und zwar: Was ist das Zentrum dieses Lichtflecks? Das hängt in Wirklichkeit von der Breite des Lichtflecks geteilt durch das Signal-Rausch-Verhältnis ab. Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis 10 zu 1 ist, dann bekommt man prinzipiell ein zehnfach besseres Signal, Wenn man ein Farbstoffmolekül hat und es sich ansieht, während es weggeht und sich noch ein weiteres Farbstoffmolekül ansieht und noch eins und noch eins - nicht alle zur selben Zeit, weil man natürlich einen großen Fleck sieht, wenn man alle zusammen ansieht. Wenn man in irgendeiner stochastischen Weise sich eines nach dem anderen ansieht, das Zentrum eines jeden findet, dann kann man ein besseres Bild erzeugen. Das war die Idee, die Eric Betzig und seine Mitarbeiter einführten. W. E. Moerner war der Erste, der Moleküle in Absorption erfasste. Aber er fand auch heraus, dass man diese Moleküle photoaktivieren kann. Stefan Hell, der hier auf diesem Treffen ist, erfand eine andere Methode, und ich ermutige Sie, zu ihm zu gehen. Das hier ist, was Sie hier sehen - auf der linken Seite sehen Sie ein Mikroskop mit optischer Auflösung und auf der rechten Seite sehen Sie dieses rekonstruierte Bild. Wenn die Punkte an und ausgehen, einer nach dem anderen, dann bekommt man eine höhere Auflösung. Die Skalenbalken sind ein halbes Mikrometer, und Sie sehen in dieser Vergrößerung 0,1 Mikrometer, 0,2 Mikrometer. Jeder kleine Punkt ist ein einzelnes Farbstoffmolekül, das ein spezielles Proton identifiziert. Stefan Hell - ich werde das nicht erklären, weil ich Sie ermutige, zu ihm zu gehen. Wenn man sich Zellkernproteine in einer Membrane ansieht, könnte man dies mit dem konfokalen Mikroskop der höchsten Auflösung sehen. Das Bild wird aber stark verbessert, wenn man zu diesen sogenannten Superauflösungsbildern übergeht. Und man kann das in dem kleinen weißen Quadrat vergrößern, und wieder ist der Skalenbalken 150 Mikrometer. Das war sehr aufregend. Wir haben diese Methoden in meiner Gruppe angepasst, um uns Cholera anzuschauen. Dies ist ein gewöhnliches Bild von irgendetwas, aber so sieht es in Superauflösung aus. Man vergrößert dies und der Skalenbalken ist wieder 200 Nanometer, und dann sieht man eine Auflösung von etwa 15 Nanometer. Lassen Sie mich ein Beispiel erzählen, wie man, statt nur nette Bilder anzuschauen, wie es tatsächlich in der Wissenschaft brauchbar sein kann. Hier ist eine Untersuchung, in der man sich ein spezielles Molekül ansieht, das in einem Signalpfad involviert ist. Der Signalpfad funktioniert wie folgt: Wenn man eine Zelle ist, die sich in einem Organismus, in einem Gewebe befindet, dann teilt man sich nicht einfach so, das wird als sehr antisoziales Verhalten angesehen. Man teilt sich, wenn das umgebende Gewebe sagt, es ist ok sich zu teilen, zu ersetzen, zu reparieren, was auch immer. Aber wenn man sich einfach so teilt, teilt, teilt und dabei ich, ich, ich sagt, dann wird das Krebs genannt. In diesem speziellen Molekül verursacht ein Protein, eine Aminosäurekette in diesem Protein Krebs. In diesem speziellen Fall werden 90 % aller Fälle von Bauchspeicheldrüsenkrebs durch diese Einzelmutation verursacht. Ich werde Ihnen nun einen kleinen – schauen wir mal, ob ich das abspielen kann – Trickfilm von Genetec zeigen von, von – oh, das funktioniert nicht. Lassen Sie mich es starten. Hier ist das von außen kommende Signal, dieses sogenannte gelbe Ding oder Ligand. Es bindet sich an die Rezeptoren. Und wenn es sich an die Rezeptoren bindet, sehen Sie, dass diese Rezeptoren außerhalb der Zelle durch die Zelle hindurchgehen und die Schwanzenden hier unten in der Zelle zusammenkommen. Sie veranlassen andere Moleküle zu kommen. Diese Moleküle hier haben Namen, die Namen sind nicht wichtig, es sei denn Sie sind Biologe. Am Ende rekrutieren sie ein Membranprotein, das RAS genannt wird. Die Geschichte geht dann weiter, es ist ziemlich kompliziert. Eine Abfolge von Molekülen wird eingeschaltet, das RAS rekrutiert dann ein weiteres Molekül, dass RAF genannt wird. Nachdem das rekrutiert und aktiviert ist, geht es zu einem Gerüst innerhalb der Zelle, das dann ein Molekül aktiviert, das MEK, ein Molekül, das ERK genannt wird. ERK diffundiert in den Zellkern, tut seine Arbeit und sagt dann der Zelle, sich zu vermehren. Gut, etwa die Hälfte davon ist falsch. Im Jahr 2009 wurde beispielsweise entdeckt, dass ein einzelnes RAF-Molekül nicht genug war - das RAF-Molekül muss sich paaren. Und es ist dass doppelte Paar des RAF-Moleküls, das das Signal darstellt. Daher wurde ein Medikament erfunden, das diese Paarbildung verhindert. Und siehe da, das multiple Myelom hatte wenigstens zeitweilig eine dramatische Heilung. Man nimmt dieses Medikament und innerhalb von Wochen verschwinden die Geschwüre. Nein, nicht multiple Myelom - Melanom, das ist ein sehr, sehr gefährlicher Hautkrebs. Und daher war es das erste Wundermedikament, eine gezielte Therapie, und es war großartig. Was ist mit RAF? Wir wussten nichts über RAF und es ist daher eine Vermutung, dass sich vielleicht RAF auch paaren muss, bevor es sein Signal an das RAF-Molekül senden kann. In der Arbeit mit einzelnen Molekülen wird es tatsächlich ziemlich einfach. Was man hier hat, ist eine Zellmembrane,auf der jeder kleine Lichtfleck der Schwerpunkt eines einzelnen RAS-Moleküls ist. Bei einer bestimmten Zelldichte, in diesem Fall, können wir die Expression dieser Moleküle vermehren. Und wir fanden heraus, dass im Fall einer bestimmten Konzentration, die man in der oberen linken Ecke sehen kann, es hauptsächlich einzelne sind, sehr, sehr wenige doppelte oder dreifache, vermutlich zufällig. Bei Verwendung konventioneller biochemischer Techniken gibt es keine weitergereichten Signale, die der Zelle sagen, sich zu vermehren. Wenn man die Konzentration erhöht, sagen wir siebenfach, bekommt man viel mehr Flecken, sehen Sie, siehe da: Paarungen. Wie sieht man Paarungen? Weil die Flecken zusammen sind. Es wird eine wirklich harmlose Datenanalyse - oh, ich sehe Hanteln. Und wenn man Hanteln sieht, aber nicht so viele, nur 20 % davon sind Paare, reicht es eigentlich, das Signal weiterzusenden und zu sagen, aha, vermehrt sich - ohne ein Signal von außen. Dies ist nur ein triviales Beispiel, wie die Superauflösung Ihnen sofort etwas sehr Wichtiges sagt. Wenn man die Paarung der RAS-Moleküle verhindern kann, dann kann man dies besiegen. Und es ist sehr wichtig, dieses Molekül zu verdoppeln. Alles weiter zum Anfang hin ist das bessere Medikament, weil sich die Zahl der Moleküle vervielfacht, je weiter man voranschreitet. Ich verbrachte einen 10-jährigen Forschungsurlaub, um mich um Energie zu kümmern. Und ich habe diesen Forschungsurlaub noch immer nicht ganz beendet. Ich sorge mich immer noch um Energie und Klimaveränderung, und ich habe eine Masterklasse über das Thema heute Nachmittag. Aber als ich von meinem Posten als Energieminister zurückkam, sagte ich, es ist Zeit, mich nach neuer Arbeit umzusehen. Und eigentlich Zeit, eine neue Technologie zu suchen. Eigentlich versuchte ich mein ganzes Leben lang es folgendermaßen zu machen: Ok, wenn es eine neue Technologie gibt, die die Wissenschaft weiterentwickelt, und man es auf die Probleme anwenden kann, an denen ich Interesse habe, dieses Signalisierungsproblem eingeschlossen, das wäre toll. Also setzte ich mich hin, gerade zurück von der Regierung, ohne Labor, ohne Studenten, ohne Postdocs, ohne Geld. Das Einzige, was ich tun konnte, war zu denken. Und es stellte sich heraus, dass das befreiend war. Daher habe ich eine Wunschliste zu Weihnachten für neue Sonden zusammengestellt. Ich wollte, dass die Sonden lichtbeständig sind, ewig funktionieren würden. Millionen Photonen über Zeitspannen von Sekunden emittieren, wirklich ewig funktionieren. Weil ich schon wusste, dass man, wenn man 5 Millionen Photonen von einer Sonde bekommt - und es gab weitere Vorbehalte -, dann kann man tatsächlich eine räumliche Auflösung von weniger als einem Nanometer erzielen. Dies war eine Veröffentlichung, die meine Kollegen und ich im Jahr 2010 publizierten. Wenn sie hell genug wären, dann kann man die Dynamik des Geschehens in einer lebenden Zellen innerhalb von Zeitskalen einer Millisekunde verfolgen. Und schlussendlich ist es möglich, durch mehrere Millimeter an Gewebe hindurchzusehen. Um dies zu tun - diese Sonden waren zu der Zeit nicht kommerziell erhältlich – begannen wir daher, uns Verunreinigungen mit seltenen Erden anzusehen, eingebettet in Nanokristalle, worüber schon viel Arbeit geleistet wurde, und Teilchen dafür umzuwandeln. Aber in jüngster Zeit, den letzten 3 oder 4 Jahren, wurde viel Arbeit dazu in der Biologie gemacht. Ich werde daher die Arbeit zweier Postdocs in meiner Gruppe beschreiben. Hier vergleichen wir organische Farbstoffmoleküle, die in Einzelmolekül-Superauflösungsexperimenten verwendet werden. Und vergleichen das mit dem Licht, das seltene Erden eingebettet in Kristallen emittieren, und man sieht, sie sind schmaler, und diese wurden zufälligerweise durch jemand anderen in meiner Gruppe synthetisiert. Aber das ist nicht der Grund, warum wir das tun. Wir machen dies, weil man einen Kristall mit vielleicht 5.000, 10.000 Verunreinigungen dotieren kann. Und dann kann man es so machen, dass sie eine bestimmte Lichtfarbe im nahen Infrarot emittieren, 800 Nanometer. Man kann einen weiteren Kristall nehmen und ihn auch mit 2 Verunreinigungen dotieren, so dass sie bei 880 Nonmeter emittieren. Ein weiterer Kristall kann diese Farbe emittieren. Ein weiterer Kristall kann mit unterschiedlichen Verhältnissen der Farben emittieren. Es braucht nicht viel Vorstellungskraft, um zu sagen, wenn man viel, mittel, nichts in 3 Farben sehen kann, erhöht man kombinatorisch die Anzahl der unterschiedlichen Kristalle, die man sehen kann. Anstelle von 1, 2, 3 speziell aufgelösten Sonden kann man 10, 12, 20 haben. Und tatsächlich war es im Wesentlichen dieser spektrale Barcode, der sehr attraktiv war. Das andere, das meine Leute tun wollten, war zu sehen, ob man das mit der Elektronenmikroskopie verbinden konnte. Die ist ein sehr berühmtes Foto der Lücke zwischen 2 Neuronen. Wenn dies ein Neuron ist, und dies das Axon des Neurons, dann fließen Spannungsstöße hier herunter, sie fließen zu den Spitzen des Axon. Sie eröffnen Kalziumkanäle, und diese Kalziumkanäle veranlassen einen Proteinsatz auf der Zellmembrane, diese Kügelchen, Vesikel voller Neurotransmitter, zu nehmen und sehr schnell, innerhalb von Millisekunden, einem Zehntel einer Millisekunde, zu verschmelzen, die Vesikel in die Zellmembrane zu verschmelzen und dabei Neurotransmitter freizusetzen. Diese diffundieren durch die Lücke, die nur 40 Nanometer breit ist, und treffen auf Rezeptoren. Und das passiert sehr, sehr schnell. Und so spricht ein Neuron mit einem anderen. Aber es gibt dieses wunderschöne Schwarz-Weiß-Bild. Aber man will sehen, welche Rolle die Proteine spielen und wo sie lokalisiert sind, um wirklich herauszubekommen, wie das funktioniert. Zu diesem Zweck borgten sie sich ein Mikroskop vom Lawrence Berkeley Laboratory. Dort haben 2 Leute von der Molekularschmiede ein Mikroskop mit einem rasternden Elektronenstrahl gebaut, aber sie haben auch einen lichtsammelnden Spiegel hinzugefügt. Damit man sich auch das anschauen kann, was Kathodolumineszenz genannt wird: Ein Elektronenstrahl regt etwas an und es fluoresziert. Und wenn man das Licht nimmt und es über ein paar zweifarbige Filter in photonenzählende Photodioden aufspaltet, kann man tatsächlich den spektralen Barcode lesen. Man kann dies mit einem Rasterelektronenmikroskop oder einen Rastertransmissionselektronenmikroskop machen. Dies ist also ein Beispiel: Dies ist Teil einer He-La-Zelle, es ist eine Krebszelle, die mit seltenen Erdpartikeln gekennzeichnet ist. Die Pfeile sind dazu da, um diese winzig kleinen Flecken der seltenen Erdpartikel an der He-La-Zelle zu zeigen. Und mit einem Lichtmikroskop, mit dem besten hochauflösenden konfokalen Mikroskop erzielt man etwa 200 - 250 Nanometer räumliche Auflösung. Das Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignal, das man sieht, ist tatsächlich durch die Partikelgröße bestimmt, weil es ein Elektronenmikroskop ist. Das ist das Bild, das man sieht, und das sieht man in dem Elektronenmikroskop von der Struktur des Partikels. Aber erinnern Sie sich, das Elektronenmikroskop macht das Bild der Struktur, die Mikrostruktur oder Nanostruktur der Probe selbst. Mit der Verbesserung werden wir niedriger: Das ist das Signal-Rausch-Verhältnis, das ist die Größe. Wir sind sehr zuversichtlich, dass wir vielleicht sogar auf Nanoteilchen in der Größe von 10 Nanometer heruntergehen können und immer noch ein Signal-Rausch-Verhältnis von 10 zu 1 haben, was für den spektralen Barcode ausreicht. Das ist also gut. Die Arbeit schreitet schnell voran, um tatsächlich multiple Proteinmarkierung mit der Elektronenmikroskopie-Auflösung und der Identifizierung vieler Proteine zu kombinieren. Eine andere Sache mit diesen Teilchen seltener Erden ist, dass man sie so herstellen kann, dass sie Licht in den transparentesten Bereich des menschlichen Gewebes oder tierischen Gewebes im sichtbaren Lichtbereich emittieren und absorbieren. Das ist der Effekt, wenn man s auf dieser Achse zeichnet: Das ist die effektive Absorption und Lichtstreuung des sichtbaren Lichts. Aber wenn ich zum infraroten Licht über 650 Nanometer weitergehe, ganz hoch bis 1.300, 1.400 Nanometer, dann erhöht sich die Transmission um etwa eine Größenordnung. Also, das möchten wir machen. Das bedeutet, wir haben die Chance, tiefer in das Gewebe hineinzusehen. Hier sehen Sie das rote Glühen einiger roter Teilchen, die aus einer Maus herauskommen, aber sie sind gestreut. Der gestreute Strahl verzerrt eigentlich das Bild. Deswegen werden wir etwas anderes nehmen, das zuerst in der Astronomie benutzt wurde, sogenannte adaptive Optik. In diesem Bild gibt es einen hellen grünen Laser, der die Natriumschicht in der oberen Atmosphäre beleuchtet, einen künstlichen Leitstern erzeugt, und dann weiß man, dass dieses eine Punktlichtquelle ist. Man passt den Teleskopspiegel an und den Hilfsspiegel. Man passt ihn an, um die intrinsischen, kleinen Änderungen der Luft zu kompensieren und das Funkeln der Sterne zu kompensieren, in der Hoffnung, näher an die Brechungsgrenze zu kommen. In der Lichtmikroskopie hat man dieselbe Situation. Wenn das Licht sich durch Luft fortpflanzt, hat man ein wunderbares Bild, aber wenn es durch ein streuendes Medium geht, werden die Wellenfronten verzerrt. Sie verschlechtern die Auflösung und in den am stärksten streuenden Medien ist es sogar, als ob man in einen Nebel sieht. Und so stellt sich die Frage: Kann man adaptive Optik dazu bringen, das Richtige zu tun und das Bild wiederherzustellen, wenn man tiefer und tiefer in Gewebe schaut? Wir begannen, mit Bruce Macintosh zusammenzuarbeiten, der vor kurzem zur Physikabteilung in Stanford gekommen ist. Seine Leitsterne, er sucht nach extrasolaren Planeten, er sucht nach Planeten. Und wenn man die Auflösung gut genug bekommt, schaut man sich einen Stern an, das ist dann der Leitstern. Und wenn sie gut genug ist, kann man tatsächlich sehen, wie der Planet ihn durchquert. Gut, ich werde Ihnen nur Arbeiten zeigen, die nicht in meiner Gruppe durchgeführt werden, sondern in anderen. Dies ist Na Jis Labor, der auch mit Eric Betzig bei Janelia Farm zusammenarbeitet. Und dies schaut 400 Mikrometer tief in das Hirn einer Maus. Aber es ist noch besser: die Maus lebt, sie interagiert und sie zeigen der Maus Bilder. Und sie wollen zeigen, was das Hirn macht, wenn es diese Bilder sieht. Auf der linken Seite gibt es keine Korrektur durch adaptive Optik, auf der rechten Seite gibt es eine Korrektur durch adaptive Optik. Sie werden Lichtblitze sehen. Dort ist ein Farbstoff, ein genetischer Farbstoff, der in die Maus eingebracht wird und wenn das Neuron zündet – ich habe erzählt, dass die Spannungsstöße hier hinunter fließen -, dann öffnen sie Kalziumkanäle. Die Kalziumkanäle veranlassen die Vesikel zu verschmelzen. Dieser Farbstoff macht tatsächlich diese Kalziumkanäle sichtbar. Und hier dies ist ein einer lebenden Maus, so dass das Bild wackelt, weil sie herumschaut und versucht – sie zeigen Bilder vor ihr, sie blinzelt, und entscheiden, ihr Gehirn entscheidet, was es tun soll. Dies ist in der Sehrinde einer Maus. Ziemlich spektakulär, aber dieses Bild ist ein wenig besser, ein wenig heller. Aber es ist ein wichtiger Schritt vorwärts. Es ist tatsächlich eine sehr spektakuläre Arbeit. Hier ist etwas, eine andere Art von Arbeit. Hier wird jetzt 2-Photonenlicht in eine Maus hineingeleuchtet, wieder eine lebende Maus. Diese Mal wird das knöcherne Schädeldach nicht geöffnet. Wir schauen nun durch den Schädel hindurch und adaptive Optik versucht dann, die Verzerrungen zu korrigieren. Diese Technik arbeitet anders. Auf der linken Seite kann, man es kaum sehen, aber da ist vielleicht ein schwaches grünes Licht, das Sie sehen können. Aber wenn man die adaptive Optik einstellt, sodass sie das stark streuende Medium korrigiert, den tatsächlichen Schädel der Maus bei einer gewissen Tiefe. Und man macht das, indem man auf einen kleinen Fleck hier aufschaltet, durch den kleinen Pfeil angezeigt – ich nehme an, ich kann es auch hier zeigen, dieser kleine helle Fleck. Man bewegt die Spiegelelemente; nachdem man die Spiegelelemente bewegt hat, kann man dies sehen. Und man erzielt wirklich die optische Auflösung von 400 Mikrometern. Man schaut jetzt durch 150 Mikrometer unbeschädigter Schädeldecke und weitere 180 Mikrometer in das Gehirn. So, dies ist alles schön und gut. Sie benutzen YFP-Photonen, die Licht stark absorbieren. Die Frage ist, wenn wir tiefer in das Infrarot gehen, kann man dann nicht 500 Mikrometer, sondern vielleicht 5 Millimeter tief schauen? Die Frage ist noch ungelöst. Wir arbeiten daran, wir sind bis zu einem Millimeter gekommen, aber wir werden sehen. Ein paar weitere Anwendungen dieser Sonden: Die Abbildung von der Embryoentwicklung und auch um zu sehen, ob wir Stammzellen während der Migration sehen können und Krebsmetastasen. Wir kontaktierten einen Stanford Genetiker, Hiro Nakauchi, und sagten: Warum sollten wir nicht zusammenarbeiten und schauen, ob wir Nanoteilchen nicht in einen sich entwickelnden Embryo einbauen und sie tatsächlich verfolgen können, während sich der Embryo entwickelt und differenziert. Dafür gaben wir 100,000 Nanodiamanten in den Embryo, indem wir sie einfach injizierten. Diese erste Experimentserie ist in einer Petrischale ausgeführt. Und die Zellen teilen sich, teilen sich, teilen sich. Und während sie sich teilen, da dort nun Diamanten in dem Zytosol der Zelle sind, teilen sie sich gleichmäßig auf. Und hier bei der Spätstufe, den Blastozysten der mittleren Stufe, man kann es sehen. Als nächstes gaben wir diese 100.000 Nanodiamanten in Eier, gaben sie Ersatzmüttern und warteten 13 Tage. Es dauert 22 Tage bis zur vollen Reife. Nach 13 Tagen kann man den Schädel sehen und die Wirbelsäule, man sieht entwickelte Organe. Wir versuchten herauszufinden, ob wir Nanoteilchen sehen und wir versuchten herauszufinden, wo sie hingingen. Sie können die Zeitpunkte sehen, aber der wirkliche Erfolg ist, wenn man durch den Bauch der Muttermaus schauen kann, mehrere Millimeter tief, und jeden Tag überprüfen kann, was passiert ist, während die Nanoteilchen sich aufteilen, wo sind sie? Das ist, was wir wirklich tun wollen. Und Krebsmetastasen auch. Es gibt einen festen Tumor, sie gehen in den Blutstrom, sie wandern herum. Es stellt sich heraus, während sie irgendwo auftauchen, dass es die meisten dieser Zellen, dieser Tumorzellen, metastasierende Zellen nicht schaffen. Diese Mikrotumore überleben es nicht. Die natürlichen Abwehrkräfte des Körpers zerquetschen sie, nur wenige überleben es. Was, wenn man diese Krebszellen markieren kann, während sie sich vervielfältigen und herumbewegen? Man kann sie durch die Haut sehen, während sie herumwandern, ohne die Maus zu öffnen. Dann kann man tatsächlich eine Einspritzenbiopsie durchführen und versuchen herauszufinden, welche es schaffen, warum sie es schaffen, indem man die RNA und DNA analysiert. Dies sind Einzellentechnologien, die sich rasant entwickelt haben. Nun, diese Zellen sind zu klein, um viele Teilchen in die Zellen hineinzutun. Es ist kein großes Ei, befruchtetes Ei von 80 Mikrometer, dies sind Körperzellen. Wie injizieren wir daher Nanoteilchen in sie hinein? Man kann sie einfach in die Endozytose einbringen. Aber dann verbleiben sie in kleinen Mägen, den Lysosomen der Zellen. Und wir möchten sie in das Zytoplasma tun, damit sie sich gleichmäßig aufteilen, wenn die Zellen sich immer wieder teilen. Sonst hätte man eine punktuelle Emission. Zu diesem Zweck fanden wir glücklicherweise, dass es in Stanford jemanden gibt, der Nanoröhrchen herstellt. Er nimmt einen Standard-Nanoporenfilter, dies ist b hier drüben, es ist ein Plastikpolymerfilm. Und man erzeugt kleine Kanäle, man beschichtet ihn mit 3 Schichten Aluminiumoxid, man ätzt es weg mit Lithografietechniken. Man gibt etwas für die Zellbindung auf die Zelle. Die Zellen mögen es, sich draufzulegen, abertausende Zellen legen sich darauf, etwa 8 % der kleinen Röhrchen ragen in die Zelle. Und Nick Melosh mit seiner Gruppe hat gezeigt, dass man tatsächlich Farbstoffe einfügen kann. Man kann DNA aus der Zelle herausbekommen. Und kürzlich, in Zusammenarbeit mit uns, konnte gezeigt werden, dass man jetzt beginnen kann, Nanoteilchen in die Zelle und in das Zytosol bekommen kann. Dies ist daher ein weiteres kleines Stück. Diamanten, fluoreszierende Diamanten sind ein weiteres Teilchen, das wir uns anschauen. Dies ist ein Diamant. Und wenn man eine Siliziumverunreinigung in einem Diamanten hat, ist es zu groß, um in die Gittergröße zu passen, also passt es in die Zwischengitterstelle. Stickstofffehlstellendiamanten sind kommerziell erhältlich. Sie werden in großer Menge hergestellt, sie werden gemahlen und sortiert - das ist der Stand der Technik. Wir versuchen die Zucht von Nanodiamanten vom Anfang her, indem wir Diamantstrukturmoleküle mit einem CVD-Prozess auf eine Oberfläche ablegen. Und es ist entweder Mikrowellen-CVD mit einem direkten Plasma oder einem indirekten Plasma. Ich fand wieder Kollegen in Stanford, die diese erzeugten. Dies sind Nanodiamanten, die klar die Diamantkristallflächen aufweisen. Dies sind Nick Melosh, Z.-X. Shen und der Student, der an dem Projekt arbeitet, hat den Abschluss gemacht. Einer meiner Postdocs, Yan Kai Tzeng, entschied, warum nicht einen indirekten CVD eines Armen machen: den Wafer auf die Kante stellen, das Plasma ist darüber und sehen, was man bekommt. Was man bekommt, wenn man hier vom oberen Plasma heruntergeht, ist wirklich fürchterliches Zeug hier oben, dann wird es besser und besser und besser. Wenn man sich das Ramanspektrum anschaut, wenn man mehrere Millimeter weiter herunter geht, sieht man ein sehr klares Ramanspektrum, das wie Diamant aussieht - und nicht Grafit, das ist der Peak hier drüben. So, dieser Diamant sieht besser aus. Dies ist ein 1-Mikrometer-Diamant, sieht aus wie ein Einkristall. Das sind 500 Nanometer, 200 Nanometer, 100 Nanometer, 50 Nanometer. Alle sehen wie Einkristalle aus. Wie klein kann das werden - 5 bis 10 Nanometer. Wenn man sich dies lang genug ansieht, könnte man überzeugt sein, dass es eine kleine Kristallfläche ist, die so aussieht. Aber das ist Wunschdenken, könnte man sagen. Man kann eine Fouriertransformierte davon nehmen, ein Gitterbild, und man bekommt den Gitterabstand. Aber es gibt einen besseren Weg: einfach den Elektronenstrahl auf das kleine Teilchen fokussieren und ein Beugungsbild machen, und man sieht den Hintergrund des Siliziumgitters, man sieht ein Diamantgitter. Es scheint, als ob dies auch ein Einkristall ist. Wir berechnen die Zuchtbedingungen: Wenn wir von der Spitze des Plasmas hochgehen, gehen die Temperaturen von etwa 900 °C zu 500 °C. Man bekommt die besten Diamanten bei etwa 600 °C, das ist 200 Grad weniger als bei der Standardherstellungsmethode. Das ist die Wasserstoffdichte darin. Wir denken, dass der atomare Wasserstoff das Grafit auffrisst, wenn es sich formiert, um die unverfälschte Diamantenoberfläche zu bewahren. Das optische Spektrum ist ziemlich gut. Dies ist für einen großen Diamanten, 100 Nanometer Durchmesser, und die Linienbreite ist sehr klein verglichen mit einem Diamantfilm. Wir glauben, dass es wahrscheinlich möglich ist, Diamanten mit 1 Linienbreite zu bekommen. Wir wissen, wie wir andere Verunreinigungen, Chrom, in Diamanten bekommen, wir können Germanium hineintun. Wir sind in der Lage, Verunreinigungen hineinzutun, und wir sind gerade jetzt dabei zu schauen, wie klein wir diese Farbzentren machen können. Natürlich, wissen Sie, all diese Mikroskopie hatte Vorläufer, sogar noch früher als Leeuwenhoek. Ich schließe, indem ich konstatiere, dass es sogar noch ältere Mikroskope gab. Vielen Dank.

Steven Chu (2016)

Optical Microscopy 2.0

Steven Chu (2016)

Optical Microscopy 2.0

Abstract

In the past decade, there has been an explosion of new imaging technologies in biology that include super-resolution microscopy, structured illumination and adaptive optics. In parallel with the revolution in optical microscopy, similar dramatic advances are occurring in electron microscopy, particularly cryo-EM.

Our work on the development and application of photo-stable, near infrared rare earth nanoparticle probes, and in combining electron microscopy and cathodo-luminescence imaging of multiple proteins will be discussed. Using adaptive optics methods, our work of the imaging of nanoparticle probes into several millimeters of tissue in live organisms will be presented. Finally, progress on our synthesis of luminescent nano-diamond synthesis for biological applications will be given.

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