William Moerner (2015) - Fun with Light and Single Molecules

Well good morning everybody. It's a great pleasure to be here and I'm very happy to have this opportunity to talk to the young scientists. Let me first give you a quick road map of what's going to happen. I want to start out by telling you about the historical overview to give you the feeling of what happened in the very first days of detecting single molecules. It's a beautiful story of spectroscopy but also statistics so I hope you're awake now. We're going to talk a little bit about mathematics in a few moments. Then in the middle, I'm going to give you some things that you can use. That you students and young scientists can use to tell your friends about molecules and show them about molecular fluorescents. Then I'll talk about the super resolution idea and how it works and give you a few examples to wind up. So first of all, back to the history. Let's go back to the middle of the 1980's and at that time, many amazing things were happening produced by many of the Nobel Laureates who are here actually. People were looking at individual ions in a vacuum trap and looking at single quantum systems in various ways and the question that arose, why not molecules? Shouldn't we be able to look at a single molecule as well as these single ions? Of course, there was a bit of a problem. This great physicist, one of the founders of quantum mechanics, Erwin Schrödinger, wrote in 1952 that we never experiment with just one electron atom or molecule. He had this feeling of course but it's sort of one of the dangers of saying, "What can not be done," if you like. (laughs) But there were plenty of other people who felt that detecting a single molecule optically might be very difficult. So what I have to do first is to explain how we got to the point to believe that is was possible. That requires talking a little bit about spectroscopy. So think about this kind of a molecule, this is a terrylene molecule. It has conjugated pi systems so it has absorption in the visible and at room temperature you could measure a UV-vis spectrum of it, you would see absorption bands. But let's cool it to low temperatures, in a solid, in a transparent host of para-Terphenyl. What happens when you cool down, you get rid of all the phonons, of course, and the absorption lines get very, very narrow, so narrow that I'm now showing those absorption lines here, this is the first electronic transition, there's not really four of them, there are four different sites inside the crystal, so think of this as the lowest electronic transition of the molecule and it's gotten very narrow. We can't even see the width very well. Let's expand the scale a little bit to try to do a more high resolution spectrum and here these lines appear to be resolved. But they have this big width, this I've now switched to pentacene, it's another molecule that's similar to terrylene and it has four sites but I'm only showing to of them. The question is, is that all there is? Well it shouldn't be of course. This molecule with all the phonones turned off and all vibrations turned off at this low temperature, ought to have it's first transition to be narrow, really on the order of 10 MHz because of the excited state lifetime should be the only thing limiting the width of the spectral line. So what's going on? Well what's going on here is something that is called Inhomogeneous Broadening. It's really like this picture shown on the right. There are very narrow absorption lines for the molecules because of what I just said but there is a distribution of central frequencies coming from the different environments in the solid that have slightly different stresses and strains. These absorption lines have gotten so narrow that now you can see the perturbations or the shifts produced by these individual, or different local environments. Inhomogeneous Broadening prevents you from seeing the homogeneous widths underneath it. So there were a number of techniques invented to measure the homogeneous width such as photon echoes. Another one is spectral-hole burning. A way of marking this inhomogeneous line or making a dip in the inhomogeneous line to see the homogeneous width. There was a lot of beautiful research being done on these topics in the 70's and 80's. I was at IBM research at this time where we were trying to use this spectral-hole burning idea as an optical storage scheme. Well the beauty of that particular research lab and those environments in those days is that we also could ask fundamental questions about this particular idea. I was intrigued by the following question, is there some sort of a spectral roughness on this inhomogeneous line that might represent some limit to signal-to-noise of writing data in this inhomogeneously broadened line that might be coming from statistical number fluctuations? So remember, this picture that had been measured of the inhomogeneous line, it sort of looked like a smooth Gaussian and so we're sort of asking the question, is this a smooth Gaussian or not? Now to understand what's going on here, I want to give a quick probability exercise for you this morning okay? Suppose we have these 10 boxes and we're going to throw 50 balls at these 10 boxes and all of the boxes are going to be equally likely for the balls to fall into the boxes. Here's one possibility, what do you think? Do you think this is a probable situation or not? How many think this is a probable situation? How many think this in an improbable situation? Ah good, okay, you know, that in this kind of an experiment, what is more likely to happen even though, they all have equal probability that you'll get different numbers in those different bins. Basically, scattering according to the square root of N around the mean. That's what I mean by number fluctuations. It's the well known number fluctuation effect. Who's amplitude is about the square root of N. It rises from the fact that the molecules are independent when they enter these boxes. So now, think of this horizontal axis here as a frequency axis or this spectral axis that I was just showing you a few moments ago and everyone of these bins is a homogeneous width in size and so now you'll see that the number of molecules that might fall into different regions of frequency space if they're going to spread all over like this, should vary with frequency. There should be some spectral roughness on the inhomogeneous line. Here's a quick simulation. Now I'm using a Gaussian shape probability which is smooth but in this simulation, you'd still see that there's this roughness on this inhomogeneously broadened line. In the mid 80's, no one had ever observed this roughness directly. So we set out to measure it. My postdoc Tom Carter and I, for pentacene in para-terphenyl at low temperatures and now you want to think of this inhomogeneously broadened line as being spread out tremendously so it's essentially horizontal on the scale of the stage and we used a laser technique, a powerful laser, high resolution technique to ask whether there is any such spectral structure and here's what we saw. It's amazing, there's this unbelievable structure that is, in fact, not noise. See, I'm not calling it noise, it's a roughness. If you measure it once, you see that shape. If you measure it again, you see exactly the same shape. That's because at low temperatures, this is static inhomogeneous broadening and this is coming from the effect I just described, that every spectral window, even though the probability of molecules landing at different frequencies is uniform, we see the number fluctuations. So we call this Statistical Fine Structure, where the average absorption, of course, scales as N, in fact, essentially everything you measure in experiments normally scales as N or if there's no linear effects maybe N squared or others. But having a spectral feature who's RMS size scales as the square root of N is pretty different, pretty interesting, something to wake you up okay on a Thursday morning early. Now, let me say that this was detected by using a special technique called FM spectroscopy. I won't describe all the details of that but it is uniquely suited to measuring the deviations of the absorption from the average value, that's what we needed here, admitted by Gary Bjorklund, 1980 and also in this area was developed a lot by Jan Hall and his collaborators. I want to emphasize one key thing here. I'm scanning a tunable single frequency laser to measure this and the laser line width is about 1 MHz, notice the scale here 400 MHz here. Every feature here is fully resolved. There is no limit produced by the measuring device. The measuring device is narrower than every spectral feature. These widths or the shapes, the ultimate narrowness of these things is being produced by the width of the molecules absorption. So everything in resolved here. Remember that because we're going to talk about resolution later in the spatial domain. So this was interesting to observe and it also had another effect for me. It made it clear that the single molecule limit was obtainable. Why is that? Well if the average absorption scales is N and let's say N is 1,000 in this case, then that means that the RMS amplitude of these features is about square root of 1,000 or 32 which means that once you see this, you only have to work 32 times harder to get to the single molecule limit. Only 32 times harder. Not 1,000 times harder. Believe me, that's a lot better. So we decided to push on with this method. That sort of came out of the blue, out of right field or something at this research that was going on on an optical storage scheme at this industrial lab. Can we push it to the N equal to one limit? Indeed, in 1989, Lothar Kador, my postdoc at the time, and I did push it to the single molecule limit and measured single molecule absorption by detecting these tiny changes in the transmitted light. For pentacene molecules as dopants in para-terphenyl. Now, this was an important advance because we showed that it could be done and a useful model system we had found. That method can be quantum limited and can be very, very sensitive but you can't get a lot of power on the detector in these measurements. Otherwise you'll broaden the absorption's and then you won't have as much sensitivity. A year later, a very important advance occurred, Michel Orrit, in France at that time, decided to detect the single molecule absorption also for pentacene in para-Terphenyl but by detecting the emitted light, the fluorescents from the molecules. This method, of course, could be difficult to do if you have backgrounds or scattered light. You have to detect this tiny signal from the individual molecules but they showed it could be done as very important advance in the field. You got better signal-to-noise by this method so everyone switched to fluorescents detection afterwards. So immediately the surprises started to occur. Here's some examples of where we're scanning the laser and detecting the molecules. You can see the molecular absorption's there. But look what's going on. There's something crazy. These molecules are moving around in frequency space, they're moving back and forth in a digital sort of fashion. When my postdoc Pat Ambrose saw this, he came running in and said, "The molecules "are jumping around." (laughs) We go, "Wow, that's really interesting." This is a surprise for us. We're at low temperatures, liquid helium in a crystal and so forth for a very stable molecule why would this be happening? Well, some theorists like Jim Skinner and others helped us to understand that this is coming from some dynamics in the host crystal that are changing at that low temperature to shift the molecules back and forth. Anyway, if I set the laser at one fixed frequency here some times the molecule will be in resonance and you'll see a signal. Other times it will be off, on, off, on and so you could also see blinking effects with these molecules at this early time, in 1991. Another surprise, Thomas Bass, now we've change to perylene in polyethylene, another host and look what happens here. You scan a molecule, scan it again, scan it again, nothing's changing and then if you go into resonance and just sit on top of the molecule for a little bit then you see the fluorescence drop down and if you quickly scan again, you see it's gone. It's moved somewhere, it's moved somewhere way off the screen to another wave length very far away. You've changed something in the nearby host. You've flipped a two level system that's made the molecule's absorption move. Amazingly, after another moment, the molecule comes exactly back. You scan it again and you see it again and again and again with no change. Go into resonance with it, you can drive it away. So, we were excited about this too because we could switch the molecule back and forth with laser light. These two effects, blinking and optical control are useful for things that are going to happen later. So now I want to, just for a moment, ask this question, why should we study single molecules? Of course you know that we've removed ensemble averaging and we can watch the individuals and see whether they are behaving differently or not. I just gave you some great examples of when they do behave differently. Now for your pedagogical interest, I just want to give you a way of explaining this issue to your friends. Why study single molecules? Let's think about baseball for a moment. If you think back to 2004, there was this team in The United States, the Red Sox, who were the Series champs and here are the rankings of the various teams and their team batting averages. So here's the team batting averages here and this is the ensemble measurement of course but if you measure the batting average player-by-player and then make a distribution like I'm showing here, then you see something interesting beyond the average. On the left, now you see that there's a distribution but there's also some outliers here. What are the outliers? Anybody know? (laughs) Pitchers, exactly, so here they are. (laughs) So basically, what we're doing is translating this idea from baseball to the molecular scale. Are the molecules marching to different drummers or not and maybe that is something else you might use. Another thing to explain to your friends is well, what is this business of molecular fluorescents? What is it really? Well you know it's like their day glow... ways of having socks or whatever but there's another cool way to demonstrate fluorescents to your friends and I'm going to show you that in a moment. But first you have to explain to them that first molecules start in a ground state and after absorbing the proper photon they go to an excited state of course. But then, there's some molecular relaxation, some vibrations are emitted etcetera and when the photon is emitted, it's shifted to a longer wavelength okay? It has lower energy. Well, I want to show you a neat way to demonstrate that. There's a very easy, simple demo that I'd like to describe. So what you need to do to demonstrate this is get one of these orange highlighters that you can buy. Make sure you get the cheap one. Don't get the no smudge variety, the no smudge variety doesn't dissolve as well in water. The cheap ones dissolve in water much better. And then you've got a little vial with water in it, that's what I've go here. All I have to do is open this highlighter and stick it into the water just for a few seconds, twirl it around a little bit, that's all I had to do. That's the highlighter done. Close the vial and we're going to just shake it a little bit, that's all we'll do. And then, of course the next thing you need is your green laser pointer which you have. You don't need a fancy one. You don't need high power. You don't need anything like that just five milliwatts is plenty. Now if you're prepared to turn off the lights, I'll show you what you can do with this. And I'll get this off as well. Well, it's not completely dark but maybe you'll see it. I hope you can. So it's really cool okay? (laughs) Now what's cool about this is that it's a little light saber right? And it's got that color. Remember the laser's green and this light coming out of the sample is more like orange and you can demonstrate that even though when the light goes through this, it emits green when it's going through but look, it's orange when it goes through but look, the transmitted light is still green. You haven't used up all of the light from the laser, the transmitted light is green. And that's a good example of, we only needed a few molecules to get this light coming out and to see it clearly. So what we're doing in our experiments of course, is reducing the concentration in that sample down to an unbelievably low level. Down to the single molecule limit. Also reducing the volume and detecting that light from the individual molecules. Well it turns out, you can even do that with your own eyes. In the experiments that are done at room temperature these days now, here let me just remind you how we are doing them at room temperature. We're not using FM spectroscopy but we're pumping from the ground state to the excited state and detecting this fluorescent shift into long wave lengths. Typically, we look at these little, small molecules which are about a nanometre in size or two. Aequorea green fluorescent protein and attach that to the molecule of interest and then here is, let's say a cell for example, where you have these molecules inside but in order to detect single molecules then, we focus the laser down to the smallest spot possible and that size is limited by diffraction to lend over two times the numberical aperture. So to get to the single molecule limit, you have to dilute the molecules. You have to have them farther apart then the width of this small focal spot. That's how we detect single molecules at room temperature and work at room temperature of course, even started back with the work of Keller and many others beginning even in 1990 but the near-field techniques and confocal techniques and wide-field techniques were demonstrated all along the way. So to show you some real data on a real system just see what it's like. This is the system composed of a cell where the transmembrane protein, which is called MHCII is in the cell membrane and it's been labeled by labeling an antigen that has a Fluor-4 on it. So each one of these spots in this image is coming from the light from individual MHCII complex. By the way, as I said, you can see this light with your very own eyes. You can look into our microscopes, get dark adapted, you could see the light from single molecules with your own eyes. They're very wonderful detectors. If you now watch this movie as a function of time, that's where the excitement comes. We're able to do this in living cells and this is room temperature. You can see that they're diffusing around. They're moving all over the cell membrane having this dance on the surface of the cell. They also turn off, that's some of the photo bleaching processes. There maybe some blinking in this experiment too that we'll talk about in a moment. That's an example of what can be done with single molecules at room temperature. We're still in, this happens to be from 2002 but there's one thing that happened in the 1990's that I want to mention. We decided to look at single copies of these fluorescent proteins that were being developed by Robert Tsien and others that you've already met and heard about at this wonderful meeting. I was at UC San Diego at that time, where Roger was and I asked him for some protein and Andy Cubitt gave us something that was called, at that time, a yellow fluorescent protein which had a few mutations to stabilize the longer wavelength absorption of GFP and we wanted to see, can we detect them and image them at room temperature and here's some examples. Yes, Rob Dickson was able to do that. This had not been done before at that time and so immediately new surprises appeared. We saw blinking, that is we saw the molecules emit, emit, emit, frame after frame but then turn off for a long time and then turn back on again and turn off and turn on and so forth in a stochastic sort of way. In other words, we were pumping and collecting photons but after some time period, the system went into a dark state, probably some isomerization of the chromophore from which it could return thermally and start emitting again. Another surprise is that after a longer radiation, we saw that these molecules went into a long lived dark state. We thought they might have been photo bleached but Rob used a little bit of shorter wave length blue light and he could restore those molecules back that had been turned off. You could then have them emit again for a long time and then if they finished, you could restore them back with 405 nanometers. So it was both blinking and light induced photo recovery that we observed in these experiments. This work and others, led to a huge increase in development of switchable fluorescent proteins. The photo activatable GFP was generated later DRONPA for switching by Miyawaki and others. The basic idea though is that the sort of dynamics that we had seen at low temperatures was also available at room temperature. Note by the way, here's this patent that Roger and I got for this particular process (laughs) at that time but what was in our mind? We weren't thinking about a super resolution. We were thinking about optical storage. We were thinking about using these molecules to store individual bits in the days. Remember I came from IBM and that was in our minds at the time. Now let's talk about the super resolution. Circumventing the optical diffraction limit. To illustrate this in a simple way for everyone. Here is a bacterial cell, only a couple of microns long and maybe 500 nanometers across and a particular protein has been labeled with yellow fluorescent protein in this case and you might think that all you have to do is buy one of those really, really expensive microscopes, the best microscope you can buy. Really expensive and here it is. Here's that expensive microscope but the problem is, you don't see any more detail, you want to see the shapes and the positions that those molecules might have and you're thwarted, you're thwarted by all these diffraction limit. Even though the emitters are really small, just a few nanometres in size, they appear to be a few hundred nanometres in size due to this particular important physical effect that's coming from the wavelength of light and numerical aperture that you're using. So, the reason that super resolution is exciting to many people today is that you can go from this kind of an image to that kind of an image. Tremendous increase in detail. Tremendous increase in what can be measured and quantified about what's going on inside the cell. In order to explain this, even though you heard beautiful explanations earlier in week from both Stefan and Eric. Let me just describe it in a very general way that I like to use. I like to say that first you need to detect single molecules and then you need two essential ingredients. Please note, I'm only going to describe the super resolution based on single molecules. Stefan already did a wonderful job talking about STED and the other methods that depend upon a patterned light beam to turn molecules on and off. First you have to super localize the individual molecules. A neat way to think about that. Here's a cinder cone inside a volcanic lake at Crater Lake Oregon and if you get a chance to go there, you should go. It's really a beautiful lake and here's a cinder cone inside that lake and of course, I have my obligatory scale bar. Now you know very well that if you just walk up to the top of this mountain with your cell phone, you can read out the GPS coordinates of the peak of the mountain. That's basically what we're doing. Here's one of our single molecule images. Now this is a molecule YFP, Yellow Fluorescent Protein, in a bacterium and I've now turned it into a 3-D picture just to show you the brightness here on the Z-axis. You see that that single molecule has a width that is coming from diffraction. What we do is we spread out the spot on a pixilated detector and we get multiple samples of the shape of that spot. By having those samples, you can fit the shape and get a very good estimate of the position that's much better then the diffraction limit, then the width of the mountain. The other key idea, I like to think of it as active control of the emitting concentration. This is something the experimenter has to do, has to actively choose a mechanism that controls the emitting concentration. So why is that at all useful? Well first of all, here's the structure. Suppose that we want to observe that structure and you decorate it with those fluorescent labels that I've been talking about. Now if you just turn on the laser then all of them will emit at the same time and that of course, is the problem. You see that all of the spots from the individual molecules overlap and that's the low resolution situation. What we do then is we use an on/off process. We use some way of having the molecules be in either an admissive state or in a dark state and use that to control the concentration at a low level. Then, you only turned a few on and then localize them. Do that again and do it again and ultimately, you can use a pointillist technique, connection to art here, a pointillist technique to reconstruct the underlying structure. This idea I heard about first in 2006 from Eric Betzig calling it PALM. Later we heard about STORM from Zhuang, F-PALM and then a whole variety of acronyms appeared showing different mechanisms for doing this. We started to use, at that time then, our YFP reactivation that I just showed you and we didn't give it an acronym so, of course, that's been forgotten right? So here's an acronym to add something back to the pile just for fun, that's mechanism independent, Single-Molecule Active Control Microscopy or SMACM. How does this work in a real system? Here's an image with many single molecules. There are these spots appearing on the right that are coming from localizing the molecules and when you do this many times, then you can build up the data required to reconstruct this high resolution image of the underlying structure. It also works in bacteria but I want to show you in bacteria how yellow fluorescent protein does this for you. YFP, that I was showing you earlier, blinks beautifully. Here's some bacterial cells and here's the fluorescents from those cells where there's something labeled in the cells. It's this that we're really using in our data taking. This beautiful blinking of the individual fluorescent proteins gives us information about where those molecules are located. And that approach then allows us to go from these kinds of diffraction limited images of several different proteins to these kinds of super resolution images of all those proteins. It's really a wonderful way to see the structure that was not observable before. These are actually our live cells. This is a fixed cell. We have this both in fixed and live situations. To show you that you can get more information that's a little bit of time dependence from this scheme, I want to mention the paint idea that came from Robin Hochstrasser. The way that paint works is that you have a structure that you want to observe and you bring fluorophores in from the outside, from the solution, fluorophores are zooming around while they're in the solution and you can't detect them easily but when they bind to something, they sit there and give you all that light and then you localize the ones that have bound. So we use that idea based on now a fluorescently labeled ligand, fluorescently labeled saxitoxin, to light up voltage gated sodium channels in a neuronal model cell, a PC12 cell. That's what this picture's showing you. This is one of the axonal projections outside of a differentiated PC12 cell and the beauty, of course, is in the movie. This is a movie where we're essentially averaging on the 500 millisecond time scale. All localization's we see within the 500 millisecond time and then playing that back as a sort of a sliding box car and you see all of these structures that grow and disappear over time as the cell is continuously growing. Time is very short so I'm going to have to skip a few things. I'll skip the applications of this to Huntington's disease. Here's some beautiful aggregates that we can observe by super resolution that are aggregates of the Huntington protein. I'm going to skip another example and end up with a few lessons that I would like to sort of give you that you can go tell your friends to end up today. You've all seen this beautiful Nobel medal. You can see, of course, Alred Noble's picture on this side of the medal. But I bet you haven't seen the back of the medal. Here's the back of the Nobel medal. It's really very, very beautiful. It's a beautiful, beautiful rendition. Here on the left is nature. Nature's holding a cornucopia and on the right is science. And science is lifting the veil off of nature. It's just amazing. So you want to communicate that science is fun. Help lift this veil of nature in our world. But there's more that you want to think about and communicate to those younger. Basically, the undergraduates and those who are getting interested in science. It's always important to find your passion. That's incredibly essential because it can be hard work to work through the problems that we do in our very methodical way. You have to be determined, persistent and methodical but having fun along the way is really important. It's all based on asking how things work. There's too many people that take their cell phone for granted, take some of the technology in our world so much for granted. We really ought to be asking more about how things actually work on the deep fundamental level all the way down to single molecules. So that means pushing beyond conventional wisdom and questioning assumptions. So, of course, we believe that science provides a rational and predictive way to understand our world and that's why we do it. So I want to thank my past students, postdocs and collaborators and of course, the current Guacamole team. Here they are being very serious as you can see. It's right before Halloween. Thanking our agencies as well. Here's a little fun, it's our No Ensemble Averaging logo. Which stands for single molecule spectroscopy. I forgot to say, why are we called the Guacamole team? Well, you know, one molecule is one guacamole right? One over avocado's number of moles. So with that, thank you very much for your attention.

Guten Morgen zusammen. Es ist mir eine besondere Freude, hier zu sein, und ich freue mich sehr über diese Möglichkeit, zu jungen Wissenschaftlern zu sprechen. Zunächst ein kleiner Überblick über den folgenden Vortrag. Ich beginne mit einem geschichtlichen Überblick, damit Sie ein Gefühl für die Geschehnisse in den Anfangstagen der Entdeckung einzelner Moleküle erhalten. Dabei handelt es sich um eine schöne Geschichte der Spektroskopie sowie der Statistik, hoffentlich sind Sie jetzt wach. Wir werden in Kürze auch ein wenig über Mathematik sprechen. Etwa in der Mitte werde ich über einige Dinge sprechen, die Sie selbst nutzen können. Die Sie als Studenten und junge Wissenschaftler nutzen können, um Freunden Moleküle und molekulare Fluoreszenz zu zeigen. Dann spreche ich über die Idee der Super-Resolution und wie sie funktioniert und gebe zum Schluss einige Beispiele. Zunächst einmal zurück zur Geschichte. Gehen wir zurück in die Mitte der 1980er-Jahre und in eine Zeit, in der viele erstaunlich Dinge passierten, übrigens hervorgebracht von vielen Nobelpreisträger, die ebenfalls hier sind. Leute schauten sich einzelne Ionen in einer Vakuumkammer an und betrachteten einzelne Quantensysteme auf verschiedene Weisen. Und die Frage kam auf, warum nicht auch Moleküle? Sollte es nicht möglich sein, so wie diese einzelnen Ionen auch ein einzelnes Molekül zu betrachten? Natürlich gab es da gewisse Probleme. Der großartige Physiker und Mitbegründer der Quantenmechanik, Erwin Schrödinger, schrieb 1952, dass wir nie mit einem einzelnen Atom, Elektron oder Molekül experimentieren. Er hatte so ein Gefühl, aber hierin steckt auch die Gefahr: zu sagen, was nicht möglich ist, wenn Sie so wollen (lacht). Es gab aber viele andere Leute, die meinten, dass die optische Entdeckung eines einzelnen Moleküls sehr schwierig wäre. Ich muss Ihnen also zunächst erklären, wie es dazu kam, dass man es überhaupt für möglich hielt. Dazu muss ich ein wenig über Spektroskopie sprechen. Denken Sie also an diese Art von Molekül, es handelt es um ein Terylen-Molekül. Es besitzt konjugierte Pi-Systeme, absorbiert also im Lichtspektrum und unter Raumtemperatur könnte man sein UV-VIS-Spektrum messen und würde Absorptionsbanden sehen. Aber lassen Sie es uns auf niedrige Temperatur herunterkühlen, zu einer festen, transparenten Masse aus para-Terphenyl. Durch das Herunterkühlen beseitigt man natürlich alle Phonone und die Absorptionslinien werden sehr, sehr schmal. So schmal, dass ich Ihnen nun diese Absorptionslinien hier zeige, dies ist der erste elektronische Übergang, es gibt nicht wirklich vier davon, es gibt innerhalb des Kristalls vier verschiedene Ansichten, also stellen Sie es sich als niedrigsten elektronischen Übergang des Moleküls vor und dass es sehr schmal geworden ist. Selbst die Breite können wir nicht sehr gut sehen. Dehnen wir also den Maßstab ein wenig, um mehr hochauflösendes Spektrum zu erhalten und diese Linien scheinen hier behoben zu sein. Sie haben aber diese große Breite. Ich habe hier auf Pentacen gewechselt, ein weiteres Terylen-ähnliches Molekül, das vier Ansichten besitzt, von denen ich aber nur zwei zeige. Dieser niedrigste elektronische Übergang entspricht eher einer Wellenzahl oder 30 GHz in der Breite. Nun stellt sich die Frage: Ist das wirklich alles? Natürlich sollte dem nicht so sein. Bei diesem Molekül, bei dem unter dieser niedrigen Temperatur alle Phonons und Vibrationen abgestellt wurden, sollte der erste Übergang schmal sein, eher im Bereich von 10 MHz aufgrund der Lebensdauer im angeregten Zustand. Dies sollte als Einziges die Breite der Spektrallinie einschränken. Was ist da also los? Nun, hier findet etwas statt, was als inhomogene Verbreitung bezeichnet wird. Auf dem rechten Bild kann man es gut sehen. Aufgrund des eben Gesagten gibt es für die Moleküle sehr schmale Absorptionslinien, es gibt aber eine Verteilung von zentralen Frequenzen, die aus den verschiedenen Umgebungen des Festkörpers kommen, die unter leicht anderen Belastungen und Spannungen stehen. Diese Absorptionslinien sind so dünn geworden, dass man nun die von diesen einzelnen oder unterschiedlichen lokalen Umgebungen produzierten Störungen oder Verlagerungen beobachten kann. Inhomogene Verbreitung verhindert die Betrachtung der darunterliegenden homogenen Breiten. Es wurden also verschiedene Techniken zur Messung der homogenen Breite wie etwa Photonechos erfunden. Bei einer weiteren handelt es um spektrales Lochbrennen. Eine Methode zur Markierung dieser inhomogenen Linie oder zu deren Senkung, um die homogene Breite sichtbar zu machen. In den 70er- und 80er-Jahren gab es zu diesen Themen viele schöne Untersuchungen. Zu dieser Zeit arbeitete ich bei IBM Research, wo wir versuchten, die Idee des spektralen Lochbrennens als System zur optischen Speicherung zu nutzen. Das Schöne an diesem Untersuchungslabor und dessen Umgebungen damals war, dass wir uns auch fundamentale Fragen zu dieser speziellen Idee stellen konnten. Eine Frage faszinierte mich besonders: Gibt es eine Art spektrale Rauigkeit auf dieser inhomogenen Linie, die vielleicht eine Grenze zum Störabstand bei Schreiben von Daten in dieser inhomogen verbreiterten Linie repräsentierte, die eventuell durch Fluktuation statischer Zahlen erzeugt wurde? Erinnern Sie sich, dieses Bild, das aus der inhomogenen Linie gemessen worden war, sah in etwa wie eine glatte Gaußsche aus, und wir stellen uns also im Prinzip die Frage, ob es sich tatsächlich darum handelte oder nicht? Für ein besseres Verständnis möchte ich Ihnen jetzt eine kurze Wahrscheinlichkeitsaufgabe stellen. Nehmen wir an, wir haben diese 10 Kisten und werfen 50 Bälle auf diese 10 Kisten, und alle Kisten haben dieselbe Wahrscheinlichkeit, dass die Bälle in diese Kisten fallen. Hier ist eine Möglichkeit, was halten Sie davon? Halten Sie dies für eine wahrscheinliche Situation oder nicht? Wer denkt, dass es sich um eine wahrscheinliche Situation handelt? Wer denkt, dass es sich um eine unwahrscheinliche Situation handelt? Ah, gut, okay, Sie wissen, dass es bei dieser Art von Experiment, obwohl alle dieselbe Wahrscheinlichkeit haben, wahrscheinlicher ist, eine unterschiedliche Anzahl in den verschiedenen Kisten zu erhalten. Im Prinzip Streuung gemäß der Quadratwurzel von N um den Durchschnitt. Das meine ich mit Zahlenfluktuation. Es handelt sich um den wohlbekannten Effekt von Zahlenfluktuation, dessen Größe in etwa die Quadratwurzel von N beträgt. Er steigt aufgrund der Tatsache, dass die Moleküle beim Eintritt in diese Kisten unabhängig sind. Stellen Sie sich nun diese horizontale Achse als Frequenzachse oder spektrale Achse, die ich Ihnen kurz zuvor gezeigt hatte, vor, und jede dieser Kisten hat eine homogene Breite. Und nun werden Sie sehen, dass die Anzahl der Moleküle, die in verschiedene Regionen des Frequenzraumes fallen könnten, falls sie sich so gleichmäßig verteilen, in der Häufigkeit variieren sollten. Auf der inhomogenen Linie sollte sich eine gewisse spektrale Rauigkeit befinden. Hier haben wir eine kurze Simulation. Jetzt benutze ich eine Gauß-förmige Wahrscheinlichkeit, die glatt ist, aber in dieser Simulation sieht man trotzdem noch, dass es diese Rauigkeit auf dieser inhomogen verbreiterten Linie gibt. Aber Mitte der 80er-Jahre hatte noch niemand diese Rauigkeit jemals direkt beobachtet. Wir machten uns also daran, sie zu messen, mein Postdoc Tom Carter und ich, anhand von Pentacen und para-Terphenyl in niedrigen Temperaturen. Und nun müssen Sie sich diese inhomogen verbreitete Line als extrem ausgedehnt vorstellen, so dass sie im Prinzip horizontal ist, und wir benutzen dafür Lasertechnik, eine leistungsstarke Laser-High-Resolution-Technik um zu schauen, ob eine solche spektrale Struktur existierte, und haben das hier gesehen. Es ist erstaunlich, es gibt eine unglaubliche Struktur, bei der es sich in der Tat nicht um Störung handelt. Ich nenne es nicht Störung, es handelt sich um eine Rauigkeit. Wenn man sie einmal misst, sieht man diese Form. Wenn man sie erneut misst, sieht man die exakt gleiche Form. Weil es sich hier bei niedrigen Temperaturen - hier handelt es sich um statische inhomogene Verbreitung, was von dem eben beschriebenen Effekt kommt: dass wir bei jedem Spektralfenster die Zahlenfluktuation sehen, selbst wenn die Wahrscheinlichkeit, dass die Moleküle bei verschiedenen Frequenzen landen, konstant ist. Wir bezeichnen dies als statistische Feinstruktur, in der die durchschnittliche Absorption natürlich den Maßstab N hat, wobei bei jeder Messung in Experimenten normalerweise N der Maßstab ist, oder N zum Quadrat oder ähnliches, wenn es keine linearen Effekte gibt. Aber ein Spektralmerkmal, dessen RMS-Größe den Maßstab Quadratwurzel von N hat, ist ziemlich anders, ziemlich interessant, und lässt einen an einem frühen Donnerstagmorgen recht gut wach werden. Dies wurde mithilfe einer speziellen Technik namens FM Spektroskopie entdeckt. Ich werde nicht alle Details dessen beschreiben, aber es ist besonders zur Messung der Abweichungen der Absorption vom Durchschnittswert geeignet, also genau, was wir hier brauchten. Es wurde 1980 von Gary Bjorklund entwickelt, wobei auf diesem Gebiet auch viel Entwicklung von Jan Hall und dessen Mitarbeitern beigetragen wurde. Ich möchte hier eine Schlüsselkomponente hervorheben. Ich scanne für diese Messung einen einstellbaren Einzelfrequenzlaser und die Breite der Laserlinie beträgt in etwa 1 MHz - bitte beachten Sie den Maßstab hier von 400 MHz. Jedes Merkmal ist hier also vollauf aufgelöst. Es gibt keine vom Messgerät erzeugte Einschränkung. Das Messgerät ist schmaler als jedes Spektralmerkmal. Diese Formen, die endgültige Enge dieser Dinge wird durch die Breite der Molekülabsorption erzeugt. Somit ist hier alles aufgelöst. Behalten Sie dies im Hinterkopf, da wir später noch über Auflösung im Raumbereich sprechen werden. Dies war also eine interessante Beobachtung, die für mich einen weiteren Effekt hatte. Sie machte deutlich, dass die Grenze des einzelnen Moleküls erreichbar war. Warum dem so ist? Wenn der durchschnittliche Absorptionsmaßstab N ist und sagen wir N in diesem Fall 1.000 beträgt, dann bedeutet dies, dass die RMS-Amplitude dieser Merkmale etwa die Quadratwurzel von 1.000, also 32 beträgt, was bedeutet, dass es, sobald man an diesem Punkt ist, Nur 32-mal mehr anstrengen. Nicht 1.000-mal anstrengen. Glauben Sie mir, dass ist sehr viel besser. Wir entschlossen uns also, diese Methode voranzutreiben. Das kam ein wenig aus dem Nichts oder aus heiterem Himmel: Können wir diese Untersuchungen zum System optischer Speicherung in jenem Industrielaboratorium, können wir sie bis zur Grenze von N gleich Eins bringen? Tatsächlich schafften Lothar Kador, mein damaliger Postdoc, und ich es 1989 an die Grenze des Einzelmoleküls und maßen die Absorption des Einzelmoleküls anhand dieser winzigen Veränderungen im übertragenden Licht. Für Pentacen-Moleküle als Dopanten in para-Terphenyl. Hierbei handelte es sich um einen wichtigen Vorstoß, da wir gezeigt hatten, dass es ging, und dabei ein nützliches Modellsystem gefunden hatten. Jene Methode kann quantenbegrenzt und sehr, sehr empfindlich sein, aber man bekommt in diesen Messungen nicht viel Energie auf den Detektor. Sonst verbreitert man die Absorptionen und hat dadurch weniger Sensitivität. Ein Jahr später fand ein sehr wichtiger Vorstoß statt, diesmal in Frankreich, wo Michel Orrit die Absorption des Einzelmoleküls auch für Pentacen in para-Terphenyl entdeckte, allerdings indem er das abgestrahlte Licht entdeckte, die Fluoreszenzen der Moleküle. Diese Methode konnte natürlich schwierig in der Ausführung sein, falls es zu Störungen oder Lichtstreuung kam. Man muss dieses winzige Signal der Einzelmoleküle finden, aber sie zeigten, dass es funktionierte, was einem sehr wichtigen Schritt in dem Gebiet gleichkam. Mit dieser Methode erhielt man ein besseres Signal-Stör-Verhältnis, weshalb danach alle zum Fluoreszenz-Detektor wechselten. Und sofort ging es mit Überraschungen los. Hier sehen Sie einige Beispiele, wo wir den Laser scannen und die Moleküle entdecken. Die molekulare Absorption können Sie dort sehen. Aber schauen Sie, was hier passiert. Da ist etwas Verrücktes. Diese Moleküle bewegen sich im Frequenzraum umher, sie bewegen sich in digitaler Art und Weise hin und her. Als mein Postdoc Pat Ambrose dies sah, kam er reingerannt und meinte: "Die Moleküle hüpfen umher!" (lacht) Und wir sagten: "Prima, das ist echt interessant." Weil das war für uns eine Überraschung. Wir befinden uns in niedrigen Temperaturen, flüssiges Helium in einem Kristall und so weiter, warum sollte dies also bei einem sehr stabilen Molekül passieren? Nun, einige Theoretiker wie Jim Skinner und andere halfen uns dabei zu verstehen, dass dies von einigen Kräftespielen im Wirtskristall kam, die sich bei dieser niedrigen Temperatur verändern und die Moleküle hin und her bewegen. Wenn ich den Laser hier auf eine feste Frequenz stelle, schwingt das Molekül manchmal mit und man sieht ein Signal. Manchmal aber ist es aus; an, aus, an und daher konnte man in den Anfangszeiten, 1991, auch Blinkeffekte bei diesen Molekülen sehen. Eine weitere Überraschung durch Thomas Basché: Jetzt wurde zu Perylen in Polyethylen als anderen Wirt gewechselt und schauen Sie, was hier passiert. Man scannt das Molekül, scannt es wieder und wieder, nichts verändert sich, und wenn man dann in Resonanz geht und für eine kleine Weile nur auf dem Molekül sitzt, dann sieht man wie die Fluoreszenz sinkt. Und wenn man schnell wieder scannt, dann sieht man, dass er verschwunden ist. Er ist woandershin gewandert, irgendwo weit abseits des Bildschirms auf eine andere, weit entfernte Wellenlänge. Man hat etwas beim nahegelegenen Wirt verändert. Man hat ein zweistufiges System gedreht, was zur Bewegung der Molekülabsorption geführt hat. Erstaunlicherweise kehrt das Molekül einen Moment später genau an seinen Platz zurück. Man scannt wieder und man sieht es wieder und wieder und wieder ohne Veränderung. Geht man mit ihm in Resonanz, so kann man es wegtreiben. Davon waren wir ebenfalls begeistert, weil wir das Molekül mit Laserlicht hin und her schalten konnten. Diese beiden Effekte, Blinken und optische Kontrolle, sind für die Dinge, die später passieren, nützlich. Jetzt will ich Ihnen kurz folgende Frage stellen: Warum sollten wir Einzelmoleküle untersuchen? Sie wissen natürlich, dass wir den Ensemblemittelwert entfernt haben und die Individuen beobachten und dabei sehen können, inwiefern sie sich anders verhalten. Für ein unterschiedliches Verhalten habe ich Ihnen gerade einige gute Beispiele genannt. Im Sinn Ihres pädagogischen Interesses möchte ich Ihnen eine Weise zeigen, wie Sie diese Thematik Ihren Freunden erklären können. Warum Einzelmoleküle untersuchen? Denken wir für einen Moment an Baseball. Wenn wir uns an das Jahr 2004 zurückerinnern, gab es da dieses Team in den USA, die Red Sox, die die Meisterschaft gewonnen hatten. Und hier sehen Sie die Rangliste der verschiedenen Teams und deren Schläger-Durchschnittsleistungen. Hier also die teamübergreifenden Schläger-Durchschnittsleistungen, und wie Sie wissen, entspricht dies dem Ensemblemittelwert. Wenn man jedoch die Schläger-Durchschnittsleistung von Spieler zu Spieler misst und dann eine solche Aufteilung wie hier erstellt, dann sieht man etwas Interessantes. Über die Durchschnittverteilung auf der linken Seite hinaus gibt es daneben auch eine Verteilung, aber mit einigen Ausreißern. Was sind die Ausreißer? Weiß das jemand? (lacht) Werfer, genau, die haben wir hier. (lacht) Im Prinzip übersetzen wir diese Idee aus dem Baseball in den molekularen Maßstab. Tanzen die Moleküle aus der Reihe oder nicht? Das ist vielleicht eine weitere Analogie, die Sie nutzen können. Was Sie Ihren Freunden ebenfalls erklären können, ist, worum es in der molekularen Fluoreszenz geht. Was ist das eigentlich? Sie kennen vielleicht diese Socken oder sowas, die bei Tageslicht leuchten. Es gibt aber eine weitere lässige Art und Weise, wie man seinen Freunden Fluoreszenz zeigen kann, und die zeige ich Ihnen gleich. Aber zunächst müssen Sie ihnen erklären, dass Moleküle in einem Grundzustand beginnen, und nach der Absorption des richtigen Photons gehen Sie natürlich in einen angeregten Zustand über. Dann gibt es eine gewisse molekulare Entspannung, einige Vibrationen werden ausgestoßen usw. Und wenn das Photon abgestoßen wird, hat es sich zu einer längeren Wellenlänge verschoben, okay? Es hat niedrigere Energie. Ich möchte Ihnen zeigen, wie sie das auf ziemlich geschickte Art und Weise zeigen können. Es gibt eine sehr leichte, einfache Vorführung, die ich beschreiben möchte. Um dies zu demonstrieren, müssen Sie sich einen dieser orangen Textmarker besorgen, die man überall kaufen kann. Nehmen Sie auf jeden Fall einen von den billigen. Nehmen Sie keinen von denen, die nicht verschmieren, die lösen sich in Wasser nicht so gut auf. Die billigen lösen sich in Wasser viel besser auf. Dann brauchen Sie ein kleines Fläschchen mit Wasser, wie ich es hier habe. Und ich muss lediglich diesen Textmarker öffnen und ihn für einige Sekunden ins Wasser stecken, ein bisschen herumdrehen, mehr brauche ich gar nicht machen. Mit dem Textmarker sind wir dann fertig. Das Fläschchen verschließen und ein bisschen schütteln, mehr braucht man nicht machen. Und als Nächstes braucht man einen grünen Laserpointer, den die meisten von uns haben. Es braucht kein besonders toller zu sein. Man braucht keine hohe Kraft. All das braucht man nicht, fünf Milliwatt sind vollkommend ausreichend. Wenn jetzt das Licht ausgemacht wird, zeige ich Ihnen, was Sie hiermit machen können. Das schalte ich auch aus. Es ist nicht komplett dunkel, aber vielleicht können Sie es trotzdem sehen. Das hoffe ich zumindest. Das ist doch echt lässig, oder? (Iacht) Das Lässige daran ist, dass es ein kleines extra Licht ist. Und es diese Farbe hat. Wie Sie wissen, ist der Laser grün, und das Licht aus dieser Probe ist eher orange, und Sie können zeigen, dass obwohl das Licht orange abstrahlt, wenn es hier durch geht, das übertragene Licht immer noch grün ist. Man hat nicht das gesamte Licht des Lasers aufgebraucht, das übertragene Licht ist grün. Und dies ist ein gutes Beispiel dafür, dass wir nur ein paar Moleküle brauchten, um dieses Licht herauszuholen und es deutlich zu sehen. Was wir also in unseren Experimenten machen, ist natürlich, dass wir die Konzentration in der Probe auf ein unglaublich niedriges Niveau reduzieren, bis auf die Grenze des Einzelmoleküls und dabei auch das Volumen reduzieren und das Licht der einzelnen Moleküle feststellen. Wie man sieht, kann man das sogar mit den eigenen Augen machen. Bei den Experimenten, die heutzutage bei Raumtemperatur durchgeführt werden, lassen Sie mich Sie kurz erinnern, wie wir sie bei Raumtemperatur durchführen. Wir nutzen keine FM-Spektroskopie, sondern pumpen vom Ausgangszustand zum angeregten Zustand und stellen dabei diese Fluoreszenzverlagerung in langen Wellenlängen fest. Normalerweise betrachten wir diese kleinen, winzigen Moleküle, die etwa ein bis zwei Nanometer groß sind, oder ein grünes Fluoreszenzprotein, und verbinden das mit einem Molekül, das uns interessiert, beispielsweise eine Zelle, wo man diese Moleküle innen hat. Aber um einzelne Moleküle festzustellen, konzentrieren wir den Laser auf den kleinstmöglichen Punkt herunter und diese Größe wird durch Beugung eingeschränkt, um über zwei Mal der numerischen Blende zu landen. Um also zur Grenze des Einzelmoleküls zu gelangen, muss man die Moleküle verdünnen. Man braucht sie weiter auseinander als die Breite dieses kleinen Brennflecks. So stellen wir Einzelmoleküle bei Raumtemperatur fest. Und die Arbeit bei Raumtemperatur begann natürlich mit der Arbeit Kellers und vielen anderen Anfang 1990, aber die Nahfeld-Techniken und konfokalen Techniken und Weitfeld-Techniken wurden alle schon währenddessen gezeigt. Um Ihnen einige echte Daten über ein echtes System zu zeigen, damit Sie sehen, wie das aussieht: Hier ist das aus einer Zelle gebildete System, bei der sich das transmembrane Protein namens MHCII in der Zellmembran befindet, und das durch Markierung eines Antigens, das Fluor-4 an sich hat, markiert wird. Jeder der Punkte auf diesem Bild kommt also von dem Licht vom individuellen MHCII-Komplex. Übrigens, wie ich bereits sagte, kann man dieses Licht mit den eigenen Augen sehen. Man kann in unsere Mikroskope schauen, sich ans Dunkel anpassen, und das Licht einzelner Moleküle mit den eigenen Augen sehen. Deshalb lohnt es sich, die Augen zu schützen. Sie sind großartige Detektoren. Schaut man sich diesen Film als zeitabhängige Funktion an, dann wird es wirklich spannend. Wir können das mit lebendigen Zellen und bei Raumtemperatur machen. Man sieht, dass sie sich ausbreiten. Sie bewegen sie über die ganze Zellmembran und tanzen regelrecht auf der Oberfläche der Zelle. Sie gehen auch aus, das ist ein Teil der Fotobleichungsprozesse. Es kann in diesem Experiment auch zu Blinken kommen, worüber wir gleich sprechen werden. Das ist ein Beispiel dafür, was mit Einzelmolekülen bei Raumtemperatur gemacht werden kann. Das war aus dem Jahr 2002, aber es gibt noch ein Ereignis aus den 1990er-Jahren, das ich erwähnen möchte. Wir hatten uns entschlossen, uns einzelne Abzüge dieser fluoreszierenden Proteine anzuschauen, die von Roger Tsien und anderen, die Sie bereits bei diesem wunderbaren Meeting getroffen oder von denen Sie gehört haben, entwickelt wurden. Ich war zu der Zeit an der UC San Diego, wo auch Roger war, und bat ihn um ein Protein. Und Andy Cubitt gab uns etwas, was zu der Zeit als gelb fluoreszierendes Protein (YFP) bezeichnet wurde und das einige Mutationen besaß, und die längere Wellenlängenabsorption von YFP zu stabilisieren- Und wir wollten schauen, ob wir diese bei Raumtemperatur feststellen und abbilden konnten. Und hier sind einige Beispiele. Ja, Rob Dickson ist das gelungen. Das hatte zu dem Zeitpunkt noch niemand gemacht und gleich traten neue Überraschungen auf. Wir sahen Blinken, das heißt wie die Moleküle Bild für Bild ausstrahlten, ausstrahlten, ausstrahlten und dann für lange Zeit abschalteten und dann wieder angingen und ausgingen und angingen und so weiter auf sozusagen zufällige Art und Weise. Anders gesagt pumpten wir und sammelten Photonen, aber nach einer gewissen Zeitspanne ging das System in einen Dunkelzustand, wahrscheinlich eine Isomerisierung des Chromophors, von dem aus es thermisch zurückkehren und wieder ausstrahlen konnte. Eine weitere Überraschung bestand darin, dass wir nach einer langen Bestrahlung sahen, wie diese Moleküle in einen langlebigen Dunkelzustand übergingen. Wir dachten, dass sie vielleicht fotogebleicht wurden, aber Rob benutzte ein klein wenig blaues Licht mit kürzerer Wellenlänge und konnte so die zuvor ausgeschalteten Moleküle wiederherstellen. Man konnte sie dann wieder für eine lange Zeit ausstrahlen lassen und wenn sie dann aufhörten, konnte man sie mit 405 Nanometern wieder herstellen. Bei diesen Experimenten beobachteten wir also sowohl Blinken als auch lichtinduzierte Fotowiederherstellung. Diese und andere Arbeiten führten zu einem hohen Anstieg der Entwicklung von schaltbaren fluoreszierender Proteine. Das fotoaktivierbare YFP wurde später entwickelt, DRONPA zum Schalten von Miyawaki und anderen. Die Grundidee bestand jedoch darin, dass das Kräftespiel, das wir bei niedrigen Temperaturen gesehen hatten, auch bei Raumtemperatur verfügbar war. Hier ist übrigens das Patent, das Roger und ich für diesen speziellen Prozess damals erhalten haben (lacht). Aber was hatten wir im Sinn? An Super-Resolution dachten wir gar nicht. Wir dachten an optische Speicher. Wir dachten damals daran, diese Moleküle zur Speicherung einzelner Stücke zu nutzen. Wie gesagt kam ich von IBM und an solche Dinge dachten wir damals. Lassen sie uns nun über die Super-Resolution sprechen. Umgehung der optischen Auflösungsgrenze. Um dies für alle auf einfache Weise darzustellen, haben wir hier eine Bakterienzelle, gerade mal ein paar Mikrometer lang und vielleicht 500 Nanometer breit. Und ein bestimmtes Protein wurde in diesem Fall mit gelb fluoreszierendem Protein markiert. Und man könnte denken, dass man lediglich eins dieser richtig, richtig teuren Mikroskope kaufen braucht, das beste Mikroskop, das es zu kaufen gibt, richtig teuer. Hier haben wir es. Hier ist das teure Mikroskop. Aber das Problem ist, dass man keine weiteren Einzelheiten sieht. Man möchte die möglichen Formen und Positionen dieser Moleküle sehen, und das wird durch die offensichtliche Auflösungsgrenze vereitelt. Obwohl die Emitter sehr klein sind, gerade mal ein paar Nanometer groß, sehen sie aus, als wären sie mehrere hundert Nanometer groß, was an diesem speziellen wichtigen physikalischen Effekt liegt, der von der Wellenlänge von Licht und der numerischen Apertur, die man benutzt, stammt. Der Grund dafür, warum Super-Resolution für viele Menschen heute aufregend ist, besteht darin, dass man von dieser Art Bild zu dieser Art Bild gelangt. Ein gewaltiger Anstieg im Detail. Ein gewaltiger Anstieg dessen, was darüber, was in der Zelle passiert, gemessen und quantifiziert werden kann. Um dies zu erklären, obwohl Sie zu Beginn der Woche bereits wunderschöne Erklärungen von Stefan und Eric gehört haben, möchte ich es auf eine sehr allgemeine Art und Weise beschreiben. Ich sage gerne, dass man zunächst Einzelmoleküle erfassen muss und dann zwei wesentliche Zutaten benötigt. Wohlgemerkt beschreibe ich die Super-Resolution nur auf der Basis von Einzelmolekülen. Stefan hat bereits wunderbare Arbeit bei der Besprechung von STED und anderen Methoden, die auf einem gemusterten Lichtstrahl beruhen, um Moleküle ein- und auszuschalten, geleistet. Zunächst muss man die Einzelmoleküle super-lokalisieren. So kann man sich das auf hübsche Art und Weise vorstellen: Hier haben wir einen Aschekegel in einem vulkanischen See am Crater Lake in Oregon. Falls Sie mal die Möglichkeit haben, dorthin zu reisen, sollten Sie sie nutzen. Es ist wirklich ein schöner See und es gibt einen Aschekegel in diesem See. Und selbstverständliche habe ich meinen obligatorischen Kartenmaßstab: 120 mal 10 hoch 9 Nanometer. Jetzt wissen Sie natürlich ganz genau, dass man, wenn man mit dem Handy auf die Spitze des Berges geht, die GPS-Koordinaten des Berggipfels auslesen kann. Das ist es im Prinzip, was wir machen. Hier ist eins unserer Einzelmolekül-Bilder. Hierbei handelt es sich um ein YFP-Molekül, gelb fluoreszierendes Protein, in einer Bakterie, und ich habe es in ein 3D-Bild umgewandelt, um Ihnen diese Helligkeit hier auf der Z-Achse zu zeigen. Wie Sie sehen besitzt das Einzelmolekül eine Breite, die von Beugung hervorgerufen wird. Wir verbreitern also diese Stelle auf einem verpixelten Detektor und nehmen mehrere Proben der Form dieser Stelle. Anhand dieser Proben kann man die Form zusammensetzen und ein sehr gutes Aufmaß der Position erhalten, welches viel besser als die Auflösungsgrenze, als die Breite des Berges ist. Die andere Schlüsselidee bezeichne ich gerne als aktive Kontrolle der abgestrahlten Konzentration. Ein Forscher muss sich aktiv für einen Mechanismus entscheiden, der die abgestrahlte Konzentration kontrolliert. Warum das überhaupt nützlich ist? Hier haben wir zunächst die Struktur. Stellen Sie sich vor, dass wir diese Struktur beobachten wollen und sie dafür mit den fluoreszierenden Markern versehen, von denen ich vorhin gesprochen habe. Wenn man jetzt einfach den Laser einschaltet, dann strahlen alle von ihnen gleichzeitig ab, worin selbstverständlich das Problem besteht. Wie man sieht, überlappen sich alle Punkte der Einzelmoleküle, so sieht die Situation bei niedriger Auflösung aus. Wir nutzen dann einen Ein-/Aus-Prozess. Wir nutzen eine Methode, um die Moleküle entweder in einen Grundzustand oder einen Dunkelzustand zu versetzen, und nutzen dies zur Kontrolle der Konzentration auf einem niedrigen Niveau. Dann schaltet man nur einige an und ortet diese. Das macht man wieder und wieder und kann schließlich eine pointillistische Technik, ein Begriff aus der Kunst, eine pointillistische Technik zur Rekonstruktion der zugrunde liegenden Struktur verwenden. Von dieser Idee hörte ich 2006 zum ersten Mal von Eric Betzig, der dies als PALM bezeichnete. Später hörte man von STORM von Zhuang, F-PALM und dann erschien eine ganze Reihe von Akronymen, die für verschiedene Mechanismen mit dieser Funktion standen. Wir begannen damals mit der Nutzung unserer YFP-Reaktivierung, die ich Ihnen gerade zeigte, und gaben dem kein Akronym, was natürlich der Grund dafür ist, dass es in Vergessenheit geriet. Hier also ein Akronym, um dem Stapel spaßeshalber ein weiteres hinzuzufügen, Single Molecule Active Control Microscopy (Einzelmolekül-Aktivsteuerungs-Mikroskopie), kurz SMACM. Wie funktioniert diese Arbeit in einem echten System? Hier ein Bild mit vielen Einzelmolekülen. Diese rechts erscheinenden Punkte entstehen durch die Lokalisierung von Molekülen, und wenn man dies viele Male tut, dann kann man die Daten aufbauen, die man braucht, um dieses hochauflösende Bild der zugrunde liegenden Struktur zu rekonstruieren. Das funktioniert auch in Bakterien, aber ich will Ihnen zeigen, wie gelb fluoreszierendes Protein (YFP) in Bakterien funktioniert. YFP, das ich Ihnen vorhin gezeigt hatte, blinkt wunderschön. Hier sind einige Bakterienzellen und hier die Fluoreszenzen dieser Zellen, in denen etwas markiert ist. Genau dies verwenden wir in unserer Datenaufnahme. Das schöne Blinken der einzelnen fluoreszierenden Proteine gibt uns Aufschluss darüber, wo sich diese Moleküle befinden. Und dieser Ansatz half uns, von diesen Arten von auflösungsbegrenzten Bildern mehrerer verschiedener Proteine zu diesen hochauflösenden Bildern all jener Proteine zu gelangen. Es handelt sich um eine wirklich wunderbare Art, um die Struktur zu sehen, die vorher nicht beobachtbar war. Hierbei handelt es um Live-Zellen. Hier eine fixierte Zelle. Wir haben es also sowohl in fixierten als auch in Live-Situationen. Um Ihnen zu zeigen, dass man weitere Informationen erlangen kann, die von diesem Schema etwas zeitabhängig sind, möchte ich die von Robin Hochstrasser entwickelte PAINT-Idee erwähnen. Bei PAINT nimmt man die Struktur, die man beobachten möchte, und bringt Luminophore von außen hinein, von außerhalb der Lösung. Luminophore schwirren herum, wenn sie sich in der Lösung befinden, und lassen sich nicht einfach auffinden, wenn sie sich aber mit etwas verbinden, dann sitzen sie dort und geben einem all das Licht, mit dem man dann die Verbundenen ortet. Also nutzen wir diese Idee auf der Basis eines nun mit Fluoreszenz markierten Liganden, mit Fluoreszenz markierten Saxitoxinen, um spannungsversperrte Natriumkanäle in einer neuronalen Modellzelle, einer PC12-Zelle, zu beleuchten. Dies wird auf diesem Bild gezeigt. Dies ist eine der axonalen Projektionen außerhalb einer abgegrenzten PC12-Zelle, und die Schönheit steckt selbstverständlich im Film. Bei diesem Film beträgt der Durchschnitt rund 500 Millisekunden. Wir sehen alle Ortungen während des Zeitfensters von 500 Millisekunden und spielen dies wie bei einem Daumenkino ab, und man sieht, wie all diese Strukturen mit der Zeit wachsen und verschwinden, während die Zelle fortlaufend wächst. Die Zeit rennt mir davon, weshalb ich einige Dinge überspringen muss. Ich überspringe diese Anwendungen bei der Huntington-Krankheit. Hier einige schöne Gesamtsummen, die wir mit Super-Resolution bei Aggregaten des Huntington-Proteins beobachten können. Ich werde ein weiteres Beispiel überspringen und mit einigen Lehren abschließen, die ich Ihnen gerne mitgeben möchte, damit Sie diese mit Ihren Freunden teilen können. Sie alle kennen diese schöne Nobel-Medaille. Selbstverständlich sieht man Alfred Nobels Abbild auf dieser Medaillenseite. Ich würde aber wetten, dass Sie die Rückseite der Medaille noch nie gesehen haben. Hier die Rückseite der Nobel-Medaille. Sie ist wirklich sehr, sehr schön. Eine schöne, bewundernswerte Darbietung. Hier auf der linken Seite ist die Natur, die Natur, die ein Füllhorn hält, und auf der rechten Seite ist die Wissenschaft. Und die Wissenschaft lüftet den Schleier der Natur. Es ist ganz erstaunlich. Ihr Ziel sollte es sein zu kommunizieren, dass Wissenschaft Spaß macht. Helfen Sie mit, den Schleier der Natur in unserer Welt zu lüften. Es gibt aber mehr, über das Sie nachdenken und das Sie an die Jüngeren kommunizieren sollten, hauptsächlich an die Studenten im Vorstudium und jene, die sich für Wissenschaft zu interessieren beginnen. Es ist immer wichtig, seine Passion zu finden. Das ist unerlässlich, weil es schwere Arbeit sein kann, sich durch die Aufgabenstellungen zu arbeiten, die wir auf unsere eigene methodische Art stellen. Man muss dafür entschlossen, hartnäckig und methodisch sein, aber es ist von großer Wichtigkeit, dabei auch Spaß zu haben. Alles basiert auf der Frage, wie Dinge funktionieren. Zu viele Menschen betrachten ihr Handy für selbstverständlich, betrachten einige der Technologien in unserer Welt für zu selbstverständlich. Wir sollten wirklich öfter hinterfragen, wie Dinge auf einer tiefen, fundamentalen Ebene wirklich funktionieren, bis hin zu einzelnen Molekülen. Mit der Konsequenz, dass man über konventionelles Wissen hinausgeht und Annahmen hinterfragt. Natürlich glauben wir, dass uns Wissenschaft eine rationale und voraussehende Methode bietet, unsere Welt zu verstehen, und aus diesem Grund üben wir sie aus. Deshalb möchte ich meinen ehemaligen Studenten, Postdoktoranten und Mitarbeitern und natürlich dem jetzigen Guacamole-Team danken. Hier können Sie sehen, wie ernst sie sein können. Das ist kurz vor Halloween. Danke auch an unsere Agenturen. Und hier noch etwas zum Spaß, unser Kein-Ensemblemittelwert-Logo, das für Einzelmolekül-Spektroskopie steht. Ich vergaß zu sagen, warum wir Guacamole-Team heißen. Nun, Sie wissen ja, ein Molekül entspricht einer Guacamole. Eins hoch die Anzahl der Mole in der Avocado. In diesem Sinn, vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.

William Moerner (2015)

Fun with Light and Single Molecules

William Moerner (2015)

Fun with Light and Single Molecules

Abstract

More than 25 years ago, single molecules were first detected optically, but how do we really detect a single molecule today, and what good is it? It is an amazing fact that you can even detect single molecules with your own eyes. When a new regime of science is breached, surprises often occur: single molecules show amazing dynamics, blink on and off, and can even be controlled by light. Far from being only an esoteric effect, these “switching properties” of molecules can be used to obtain “super-resolution” and thus circumvent the fundamental optical diffraction limit, roughly half the wavelength used. Essentially, with tiny single-molecule light sources decorating a structure, the on/off process is used to light up only subsets at a time, and a pointillist reconstruction reveals the hidden structure, opening up a new frontier.

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