Avram Hershko (2015) - Roles of the Ubiquitin System in Health and Disease

The selective degradation of many short–lived proteins in eukaryotic cells is carried out by the ubiquitin-mediated proteolytic system. In this pathway, proteins are targeted for degradation by covalent ligation to ubiquitin, a highly conserved small protein

It's always a pleasure to come to Lindau and to talk to young students. You are really the future. And my talk is also directed to younger people in the audience. I would like to tell you first, very, very briefly, about the history of the discovery of the ubiquitin system for protein degradation, and then what can be learned from my story, which may help you in your future in science. So, I am interested for quite a long time now in the problem of how proteins are degraded in cells. And this was a subject that didn't interest too much most of the science at that time when I started to work. But it was already clear at that time that intercellular protein degradation is a basically important process because it was known, that abnormal proteins that are produced by, for example, damages to our proteins by oxidative agents, are recognized and are rapidly eliminated from our tissues. But it was known also that protein degradation is not just a wastebasket to remove abnormal proteins, because completely normal proteins are also selectively degraded at very widely different rates. So some of our proteins are degraded within minutes, half time of minutes, where some others stay on for many days or weeks. And it was also known that the levels of some specific proteins in animal cells can be regulated not only by changes in the rates of synthesis, but also by the changes in rates of degradation. So these were summarized in the review by Schimke in 1970 when I started to work on this. So, it was known, it was clear, for those that were interested, already at that time, that protein degradation is basically important cellular process, but it was not known how proteins are degraded at such a high selectivity and regulation. So this was the knowledge that was existing at the time when I was a young postdoc, and I came to the lab of Gordon Tomkins in the UCSF to work for my postdoc. And at that time Tomkins was interested in the problem of how specific proteins are used or are made by steroid hormones in liver cells, so gene induction in eukaryotes. But when I got there I saw that this was a large group of about 25 postdocs, and they were all working on the same problem of how a certain protein is in use in liver cells by steroid hormones. So I saw that this was kind of too congested, and I asked him for a different project, and he suggested, "Why don't you study the degradation of the same protein?" Tyrosine aminotransferase it was called, because it also regulates the levels, degradation also regulates the levels of this protein. So this was how I got on the problem of protein degradation, a problem that I am working ever since. And the next slide shows one of the first experiments that I did when I was in the lab of Tomkins. I then added a certain agent, potassium fluoride, to hepatoma cells, liver cells. And I looked at the degradation of this enzyme, tyrosine aminotransferase, and I actually saw that maybe degradation would go on faster because they are deprived of energy. Potassium fluoride inhibits cellular energy production, but actually the opposite happened, and as you can see, when potassium fluoride was given at any time, the degradation of this protein was completely arrested. So I was very much impressed by these results, because they showed that intercellular protein degradation, at least of these specific proteins, but also it's also true of other proteins, requires cellular energy. Now, why would energy be required for protein degradation? The action of proteases that were known at that time, like trypsin or chymotrypsin did not require any energy. Actually, it released some energy. So I saw that maybe there is some kind of a novel, as yet unknown system that requires an energy dependent system. That degrades intercellular proteins, that was not known. And maybe energy is required to attain the high selectivity of intercellular protein degradation. So, that is a thermodynamic consideration, but it led to the mechanism. So why is energy required for intercellular protein degradation? So I continued with this, and I continued after I returned home to Israel to a laboratory. In the Technion in Haifa, I continued to work on the mechanisms of intercellular protein degradation for the reasons shown in this slide. So as I said, protein degradation was known to be important for the control of the levels of some cellular proteins, so it obviously had important cellular roles. But as I also said, the biochemical pathways responsible for this highly selective degradation of cellular were not known. And the energy dependence that I just showed you of protein degradation suggested that there might be a novel biochemical mechanism. And the important reason for working on it is that not many were interested, so I did not have to worry about the competition. So I worked on this project, and this shows how I thought to begin to work on it. I thought to begin with by the biochemical analysis, by a biochemical way. And the first step in looking at a complex system, at how a complex system works by biochemistry, is to make a cell-free extract that reproduces the process in the test tube. So it's easy to make a cell-free extract to burst the cells, to open the cells, but it's not easy to make them in a way that they will reproduce faithfully the process as it happens in the cells. In our case, I looked for a cell-free system that degrades proteins in requirement of energy. And once you have it, you fractionize the extract so the extract is made of cells and cell proteins and you quite arbitrarily fractionate these to different fractions and try to look whether you have the active component in different fractions. And then, you purify each enzyme component because a complex system is usually made of many enzymes. So you purify from each fraction the active component, you isolate it, you characterize it, and then the final step is the reconstitution of the activity of the complete system by the addition of all the isolated components. So I like to liken it to trying to find out how a watch, a mechanical watch works. You first have to open the watch, very carefully, and then you take out the different parts, the springs, the wheels, you examine them, and then you know, you learn how they work, you put them back and if the watch works again, then you really understood the mode in which the watch works. So that is what I tried to do, and this shows our first successful experiments. For several years it did not work, but then we could, we, by me, I mean, together with my Aaron Ciechanover, who was my graduate student at that time, we could reconstitute a cell-free system made from reticulocytes, which are immature red-blood cells, which degraded certain proteins in dependence of ATP. ATP is the coin of energy as you know in cells. So as you can see, the degradation of globin in this cell-free system was greatly stimulated by ATP, an energy-dependent cell-free system. And then I tried to do a little, tried to do fractionation, as I said, we fractionated this lysate to two crude fractions, that was the very beginning. Fraction one where all the proteins that did not bind to a certain anion exchanger. Fraction two where all the other proteins that bound to the anion exchanger and were diluted with high salt. And as you can see, we did not have any activity in fraction one, either in the absence of or presence of ATP. But in fraction two where we had all the other proteins, we also lost most of the activity, a little bit remained, but, however, when we combined back fraction one to fraction two, we could recover again all the ATP-dependent protein degradation activity. So this was the first step in which we showed that a system is actually composed of several components here, and we showed that at least two components. So that was the first step. It was published in a very small, not very prestigious journal by BBRC, but I'm still very fond of this publication, because that was the first step in the right direction. So once we did that, we had to purify. And I kind of chose to purify first the active component from fraction one, because it looked simpler. And actually that was a very fortunate choice, because the purification of the active component from this fraction was the key to the understanding of the mode of the action of the complete system. And then when we purified it, we found it to be a small protein. Here is the pure protein in increasing amounts run on a gel. For those who are not from biology, when you want to know, this gel separates proteins according to their size, and the small proteins migrate forward, the larger proteins are slower. Invariably you get one band then the protein is reasonably pure. So here we had a reasonably pure small protein that was required for energy-dependent, or ATP-dependent protein degradation system in the test tube. And we called it at that time APF-1, or factor one of the ATP proteolytic system, and later it was found that it is similar to another small, to a small protein that was known before, that was called ubiquitin, because it's ubiquitous in all organisms, and in all tissues, but its role was not known. So even though we learned about the identity of APF one with ubiquitin, I have not used this term to describe the function. And then our next question was, what is the function of this small protein? It did not look like an enzyme, it was much smaller, so we thought maybe it's an activator of an enzyme. But here we had a great surprise, and we found that ubiquitin is actually covalently linked to the protein substrate that have to be degraded. And that is the original experiment, published in 1980, in which the experiment was that we took pure ubiquitin, as I showed you we could purify it, labelled it radioactively, and incubated it with crude fraction two in the absence or in the presence of ATP, and then we ran the products on the denaturing gel. And as you can see, when you run it after incubation without ATP, then the protein, which is a small protein, ran ahead in the gel. However, following incubation with ATP, it got covalently linked to a huge number of higher molecular weight proteins. And we knew that it was covalent, because it was under very denaturing conditions. So non-covalent interactions would be disrupted under these conditions. So when we saw that awful smear, then that was a revelation. We understood suddenly that ubiquitin is not an activator. It's actually linked to substrates, to protein substrates of the system, because the crude fraction two contains not only the enzymes, the other enzymes that get involved in the system, but also endogenous proteins that are degraded by the system substrates. And to test this, I put it this way at increasing amounts of a non-physiological, but a good substrate, there's lysozyme, and as you can see, several bands showed up, which we analysed and found to be increasing numbers of ubiquitin, like 80 to one lysozyme. So based on these results, we postulated in 1980, that is the original postulate, that proteins are targeted for degradation by being linked to ubiquitin APF one, or ubiquitin, and that ATP or energy is needed in this process for this targeting of ubiquitin because that was a covalent amide bond. And we also postulated that once a protein is marked with ubiquitin, it is degraded by a certain protease that degrades only proteins that are linked to ubiquitin. And then, ubiquitin would be released for further use. And in the next 10 years or so, I worked on the details of these proposals, and actually it was shown to be, this will be correct. We found that there are three enzymes that are involved in the ligation of ubiquitin for protein. I won't go through the details, it's all now in the textbooks, but what I want to show, what I want to stress, that the most important of these enzymes is the third enzyme, or E3, because it recognizes proteins to be degraded, and it transfers ubiquitin to these specific proteins. So the selectivity and many times the regulation of protein degradation is determined by the substrate specificity of these ubiquitin ligases. And now, about more than 600 different ubiquitin ligases are known to be present in the human genome, and we need this high number of ubiquitin ligases to select, to recognize specific proteins that have to be targeted for degradation. And once proteins are linked to ubiquitin, they are degraded by a protease complex that is called the 26S proteasome that was discovered by other people. So now we got to about 1990 in our story, and I saw that we have more or less the basic biochemistry of the ubiquitin system, and now the question is, what are some of its roles in the cells, because until now I used non-physiological model substrates. And I got interested in the roles of ubiquitin in the cell cycle, and more specifically, in degradation of the certain proteins called cyclin, cyclin B. And cyclin B was discovered by others and found to be an activator of a protein kinase called CDK in the cell cycle. So CDK is not active, and it's not bound to cyclin. Cyclin B is synthesized in the interphase, in the early embryonic cell cycle. It binds to CDK and converts it to an active form, which is called MPF, or mitosis promoting factor. And this mitotic promoting factor is a protein kinase. It's a major protein kinase that causes major events in mitosis. And to get out of mitosis, MPF has to be inactivated, and this inactivation is carried out by the rapid degradation of cyclin B at the end of mitosis. So I got interested in this question, and then asked whether cyclin B is degraded by the ubiquitin system, and if so, is there a specific ubiquitin ligase that targets it for degradation and the end of mitosis. And for that I needed again a cell-free system, because I wanted to go by biochemistry, by biochemical isolation of this putative ubiquitin ligase. And in this case, look for a cell-free system, led me to this organism, to the clam. It's a very big clam that is found in the Eastern coast of the United States. It is usually used to make clam chowder, but it also has some other more scientific causes and in the marine biological laboratory in Woods Hole, it is used for studies on cell division, because the female clam contains huge amounts, hundreds of millions of oocytes. Any then you can take these oocytes, fertilize them in the test tube, and you get cell division at a very high synchrony. So all these millions of oocytes begin to divide within minutes of each other. And the cell-free extracts can be made and studied in cell-cycle related problems. So I used cell-free extracts from these clams to look at the degradation of cyclin B. And together with collaborators, we isolated a large complex that contains cyclin ubiquitin ligase activity, which we called the cyclosome. Other called it the anaphase promoting complex, or APC, and now it is called by these two names, APCC, and it has very important roles, not only in the degradation of cyclin B, but also in the regulation of the exit from mitosis and some other phases in the cell cycle. And based on these results, we proposed in 1996, I think, the following scheme. The ubiquitin ligase APCC is inactive, is in a large complex, or here, it's a very hypothetical cartoon, now that we know there are many more subunits, but that's how we drew it, so it is inactive in the interphase, and it is converted to the active phase by phosphorylation. And the protein kinase that phosphorylates the ubiquitin ligase is actually a substrate. It is a CDK1 cyclin B, or the MPF. So it phosphorylates it, then with some other reactions, it's converted to the active form. Now the active ubiquitin ligase, ubiquitinates cyclin B and targets it for degradation. So the active ubiquitin ligase inactivates a protein kinase, and then the protein kinase is turned into the inactive form. And the ubiquitin ligase is turned back to the inactive form also by the action of some phosphotases. So here you have a kind of regulation loop in which the active protein kinase converts the ubiquitin ligase to the active form. And then the active ubiquitin ligase converts, or inactivates the protein kinase to its inactive form. And this mutual interaction is really that determines the oscillation of cyclin B in the cell cycle. And I think that I am getting ahead, so I would like to skip what others are doing, and to skip some important uses of the ubiquitin system and to go to the lessons, because I think that's important for the young people in the audience. So what did I learn from my life in science thus far? I am not finished, so thus far. One, that it is very important to have good mentors in science. You cannot learn how to do good science just from reading the literature. So don't misunderstand me, you should read the literature, but should also look for good mentors, and I was very lucky to get good mentors at the very beginning of my life in science. And in my PhD, I got a very good education from my mentor, Jacob Mager at the Hebrew University in Jerusalem. He was a biochemist of immense knowledge. He also was a very rigorous experimentalist. So every single, all experiments had to be done with all the controls. Positive controls, negative controls, every aspect, statement has to be verified, so I got a very, a good, strong education in rigorous biochemistry from Jacob Mager. But then I went to my postdoctoral fellowship, as I mentioned to you, Gordon Tomkins. He was a completely different scientist. He did not care much about controls. Actually, that led him to some trouble. But he had great inspiration. He had imagination, he had inspiration. He was a source of great inspiration to many others in that time. And he was also a source of inspiration to me. So I think that it was very fortunate for me to have these two mentors, because I could combine. I could combine in science you need inspiration, imagination, but then you have to examine yourself very rigorously. And to do it with very rigorously controlled experiments to see whether your idea is really correct. So try to look for good mentors at the very beginning of your life in science. And then, another important lesson from what I told you is to find an important subject that is not yet interesting to others. Otherwise the big guys will get ahead of it before you. So do not go with the mainstream. So as I told you, I began to be interested in protein degradation because I thought it was very important, but also because I saw that not many people are interested. So I was not with the mainstream. I was not against the mainstream, I was kind of somewhere, at the side where other people were not interested. So try to find a good subject that is not in the mainstream, because otherwise, there is no point in doing that. But it should be important. Otherwise, also, there is no point in doing the research. Now, another lesson is that accidental observations may be the most important ones. So try to grab your luck when it gets next to you. So we may always, we may get lucky many times, but we don't always know that we are lucky. So try to grab it. And sometimes, as I just told you, I started to get interested in protein degradation because I thought it was important, but I started to get really interested in it when I found out that it was energy dependent. Now, that was an accidental observation. I actually, I saw that the results of the experiments were completely unexpected. It's actually, I expected the opposite results. But when you find an observation, which is not according to the line, but when you think that's important, try to grab it, because that is your lucky moment. So don't let go of your lucky moments. Now one more lesson is that use whatever experimental approach is needed for your objective. It may not necessarily be the most fashionable or state-of-the-art technology. So when I began to work on it in the late '70s, especially in the early '80s, then the powerful technologies of molecular biology became into general use, and that was very important, and very great, technical advance. And as a result, many biochemists became molecular biologists. But sometimes you do not get what you want by using the latest technology. So to find out what are the components of the system that are involved in the protein degradation, and then how ubiquitin works, you could not use yet molecular genetics. You had to do biochemistry, including purification, fractionation reconstitution, and afterwards, of course, others could use your results for molecular genetics. Others clone the gene for ubiquitin, for E one, for the different Es to these, and this was very important, because that's how they got the many functions of the ubiquitin system in cellular physiology, which I didn't have time to describe. So use whatever approach is most needed for your objective. And then, something that maybe not was evident by what I told you, that science should be an adventure, a curiosity-driven adventure. You should always be very excited about what you are doing. Don't do it just as a chore. So we have many chores in our life in science. We have to publish papers in order to get a promotion, to get a grant. But don't just collect data in order to publish papers and then to be able to collect more data to publish more papers, because you got a grant, or you got a promotion. Of course, you have to be practical. You have to publish papers in order to get grants. But, don't get your chores overcome you. Don't get... I hope I am clear, don't let the chores be the main thing in your science. The main thing is the curiosity, driven by your science. And then the sixth point is not so important, so I think I stop here. Thank you very much.

Es ist mir immer ein Vergnügen, nach Lindau zu kommen und zu junge Studenten zu sprechen. Sie sind die Zukunft. Und meine Rede ist auch an die jüngeren Leute im Publikum gerichtet. Ich möchte Ihnen zunächst ganz kurz etwas über die Geschichte der Entdeckung des Ubiquitin-Systems für den Proteinabbau erzählen, und dann zusammenfassen, was man aus meiner Geschichte lernen kann und was Ihnen in Ihrer zukünftigen Entwicklung in der Wissenschaft helfen kann. Ich interessiere mich jetzt schon für eine recht lange Zeit dafür, wie Proteine in Zellen abgebaut werden. Und hierbei geht es um ein Thema, das nicht allzu viel Interesse aus dem Kreis der Wissenschaft auf sich zog, als ich anfing daran zu arbeiten. Aber schon damals war klar, dass der interzelluläre Proteinabbau ein grundlegend wichtiger Prozess ist, weil bekannt war, dass abnormale Proteine, die beispielsweise durch Schäden an Proteinen durch Oxidationsmittel entstehen, erkannt und schnell in unserem Gewebe eliminiert werden. Aber es war auch bekannt, dass der Proteinabbau nicht nur einem Papierkorb gleicht, um abnormale Proteine zu entfernen, denn ganz normale Proteine werden ebenfalls selektiv in sehr unterschiedlichem Tempo abgebaut. Einige unserer Proteine werden innerhalb von Minuten abgebaut, genauer: mit Halbwertzeiten von Minuten, wobei einige andere für viele Tage oder Wochen weiter existieren. Und es war auch bekannt, dass die Werte bestimmter spezifischer Proteine in tierischen Zellen nicht nur durch Änderungen in der Häufigkeit der Synthese, sondern auch durch die Veränderungen in der Häufigkeit des Abbaus geregelt werden. Dies wurde im Bericht von Schimke 1970 zusammengefasst, als ich begann, daran zu arbeiten. Es war also denjenigen bekannt, die schon damals daran interessiert waren, dass der Proteinabbau ein grundsätzlich wichtiger zellulärer Prozess ist, aber es war nicht bekannt, wie Proteine zu einer solch hohen Selektivität und Regulierung abgebaut wurden. Dies wusste man also zu der Zeit, als ich ein junger Post-Doc war, und ich erhielt eine Post-Doc-Stelle im Labor von Gordon Tomkins an der UCSF. Zu jener Zeit ist Tomkins der Frage nachgegangen, wie spezifische Proteine verwendet werden oder durch Steroidhormone in den Leberzellen entstehen, also der Genregulation bei Eukaryoten. Als ich dort anfing, sah ich, dass es sich hier um eine große Gruppe von etwa 25 Post-Docs handelte und sie alle am gleichen Problem arbeiteten, und zwar wie ein gewisses Protein in Leberzellen von Steroidhormonen eingesetzt wird. Es war also etwas überlaufen, daher fragte ich ihn, ob ich nicht an einem anderen Projekt arbeiten könne und er schlug vor: Tyrosin-Aminotransferase wurde es genannt, weil es auch den Gehalt... also der Abbau auch den Proteingehalt reguliert. So stieß ich also auf das Problem des Proteinabbaus, ein Problem, an dem ich seit jeher arbeitete. Auf der nächsten Folie sehen Sie eins meiner ersten Experimente im Labor von Tomkins. Hier fügte ich den Hepatomazellen, Leberzellen, einen bestimmten Agenten, Kaliumfluorid hinzu. Und ich untersuchte den Abbau dieses Enzyms, der Tyrosin-Aminotransferase, und ich entdeckte, dass der Abbau vielleicht schneller von statten gehen würde, weil es keinen Zugang zu Energie hat. Kaliumfluorid hemmt die zelluläre Energieproduktion, aber tatsächlich geschah das Gegenteil, und wie Sie sehen können, wenn Kaliumfluorid zu einer beliebigen Zeit hinzugefügt wurde, stellte sich der Abbau dieses Proteins vollständig ein. Ich war also sehr von diesen Ergebnissen beeindruckt, weil sie zeigten, dass der interzelluläre Proteinabbau, zumindest dieser spezifischen Proteine – dies trifft allerdings auch auf andere Proteine zu - zelluläre Energie erfordert. Nun, warum ist für den Proteinabbau Energie erforderlich? Die Aktivitäten von Proteasen, die zu dieser Zeit bekannt waren, wie Trypsin oder Chymotrypsin, brauchten keine Energie. Sie gaben sogar etwas Energie frei. Also dachte ich mir, dass dies vielleicht etwas Neues ist, ein bisher unbekanntes System, das ein energieabhängiges System benötigt. Das interzelluläre Proteine abbaut und noch nicht bekannt war. Und vielleicht wird Energie benötigt, um die hohe Selektivität des interzellulären Proteinabbaus zu erfüllen. Das ist also die thermodynamische Betrachtung, aber es führte auch zu einem Mechanismus. Warum ist Energie für den interzellulären Proteinabbau erforderlich? Ich setzte also meine Forschung in diesem Bereich fort und tat dies auch noch als ich zurück nach Hause, in ein Labor in Israel, kehrte. Im Technion in Haifa, setzte ich meine Arbeit er Mechanismen des intrazellulären Proteinabbau aus den auf dieser Folie gezeigten Gründen fort. Wie schon gesagt, der Proteinabbau ist für die Kontrolle des Gehalts einiger zellulärer Proteine wichtig, daher nahm es offensichtlich wichtige zelluläre Funktionen ein. Aber wie ebenfalls schon erwähnt, die biochemischen Prozesse, die für diesen hochselektiven zellulären Abbau verantwortlich sind, waren nicht bekannt. Und die Energieabhängigkeit des Proteinabbaus, die ich Ihnen gerade gezeigt habe, suggerierte, dass es einen neuartigen biochemische Mechanismus geben könnte. Und ein wichtiger Grund für die Arbeit daran ist, dass nicht viele daran interessiert waren, somit musste ich mir keine Gedanken über den Wettbewerb machen. Ich arbeitete also an diesem Projekt, und hier wird gezeigt, wie ich begann, daran zu arbeiten. Ich dachte, ich fange mit einer biochemischen Analyse an, nehme einen biochemischen Weg. Der erste Schritt, wenn man ein komplexes System untersucht und sehen will wie ein komplexes System in der Biochemie funktioniert, ist einen zellfreien Extrakt zu erzeugen, das den Prozess im Reagenzglas reproduziert. Es ist einfach einen zellfreien Extrakt zu erzeugen, um die Zellen zu öffnen, aber es ist nicht einfach, es so zu machen, dass sie getreu das Verfahren wiedergeben, wie es in den Zellen vonstatten geht. In unserem Fall, suchte ich nach einem zellfreien System, das Proteine mithilfe von Energie abbaut. Und sobald man dieses System gefunden hat, fraktioniert man den Extrakt, sodass dieser aus Zellen und Zellproteinen besteht, und diese werden dann ganz willkürlich in verschiedene Fraktionen unterteilt und man versucht zu sehen, ob man die aktive Komponente in verschiedenen Fraktionen findet. Dann reinigt man jede Enzymkomponente, da ein komplexes System in der Regel aus vielen Enzymen besteht. So zieht man also aus jeder Fraktion die aktive Komponente heraus, man isoliert, kennzeichnet sie, und dann besteht der letzte Schritt aus der Wiederherstellung der Aktivität des Gesamtsystems durch das Hinzufügen von allen isolierten Komponenten. Ich ziehe gerne den Vergleich mit dem Versuch herauszufinden, wie eine mechanische Uhr funktioniert. Zuerst muss man die Uhr ganz vorsichtig öffnen, und dann nimmt man die verschiedenen Teile heraus, die Federn, die Räder, man untersucht Sie, und dann lernt man, wie sie funktionieren, man setzt sie wieder in die Uhr ein und wenn die Uhr wieder funktioniert, dann haben Sie wirklich verstanden, wie eine Uhr funktioniert. Das ist also das, was ich versucht habe zu tun, und hier sieht man unsere ersten erfolgreichen Experimente. Ein paar Jahre lang funktionierte es nicht, aber dann konnten wir, und mit wir meine ich Aaron Ciechanover, der damals mein Doktorand war, ein zellfreies System bestehend aus Retikulozyten rekonstruieren, das aus noch nicht ausgereiften roten Blutkörperchen bestand, die bestimmte Proteine in Abhängigkeit von ATP abbauten. ATP ist der Energiekern, wie Sie ihn von Zellen kennen. Wie Sie also sehen können, wurde der Abbau von Globin in diesem zellfreien System sehr stark von ATP stimuliert, einem energieabhängigen zellfreien System. Und dann habe ich versucht etwas zu fraktionieren, wir fraktionierten dieses Lysat in zwei Rohfraktionen, und so fing alles an. In der ersten Fraktion handelte es sich um alle Proteine, die sich nicht an einen gewissen Anionenaustauscher binden wollten. In der zweiten Fraktion befanden sich alle anderen Proteinen, die sich an einen Anionenaustauscher banden und mit hohem Salzgehalt verdünnt wurden. Wie Sie sehen können, hatten wir keine Aktivität in der ersten Fraktion, weder bei Anwesenheit noch beim Fehlen von ATP. Aber in der zweiten Fraktion, wo wir all die anderen Proteinen hatten, verloren wir ebenfalls die meiste Aktivität, ein wenig war noch vorhanden; als wir allerdings die erste Fraktion wieder an die zweite Fraktion banden, konnten wir wieder die ganze ATP-abhängige Proteinabbauaktivität herstellen. Hierbei handelte es sich also um den ersten Schritt, bei dem wir zeigen konnten, dass ein System tatsächlich aus mehreren Komponenten besteht, und mindestens aus zwei Komponenten. Das war der erste Schritt. Es wurde in einer sehr kleinen, nicht sehr renommierten Fachzeitschrift von BBRC veröffentlicht, aber ich bin immer noch stolz auf diese Publikation, weil es der erste Schritt in die richtige Richtung war. Danach ging es also an die Reinigung. Ich beschloss zunächst die aktive Komponente der ersten Fraktion zu reinigen, weil es einfacher aussah. Und tatsächlich war dies eine sehr glückliche Wahl, da die Reinigung der aktiven Komponente aus dieser Fraktion der Schlüssel dazu war, die Wirkungsweise des Gesamtsystems zu verstehen. Als wir es reinigten, sahen wir, dass es sich hierbei um ein kleines Protein handelte. Hier ist das reine Protein in zunehmenden Mengen auf einem Gel. Für diejenigen, die es interessiert und die nicht aus dem Feld der Biologie stammen, dieses Gel trennt Proteine nach ihrer Größe, und die kleinen Proteine wandern nach vorne, die größeren Proteine sind langsamer. So erhält man ein Band mit einem ziemlich reinen Protein. Wir hatten also ein ziemlich reines kleines Protein, das für ein energieabhängiges, oder ATP-abhängiges Proteinabbausystem im Reagenzglas erforderlich war. Damals nannten wir es APF-1 oder erster Faktor des ATP proteolytischen Systems, und später wurde festgestellt, dass es Ähnlichkeiten mit einem anderen kleinem Protein hat, das zuvor schon bekannt war, das Ubiquitin genannt wurde, weil es in allen Organismen und in allen Geweben allgegenwärtig ist, aber seine Rolle war nicht bekannt. Auch wenn wir die Identität des APFs mithilfe von Ubiquitin feststellten, so habe ich diesen Begriff nicht verwendet, um die Funktion zu beschreiben. Und dann fragten wir uns als nächstes, was ist die Funktion dieses kleinen Proteins? Es sah nicht wie ein Enzym aus, es war sehr viel kleiner, so dass wir dachten, dass es vielleicht ein Aktivator eines Enzyms ist. Aber hier erlebten wir eine große Überraschung, und wir fanden heraus, dass Ubiquitin kovalent an das Proteinsubstrat, das abgebaut werden muss, gebunden ist. Dies war das ursprüngliche Experiment, das 1980 veröffentlicht wurde. Bei dem Experiment nahmen wir reines Ubiquitin, reinigten es, wie ich es Ihnen zuvor gezeigt habe, markierten es als radioaktiv, und inkubierten es mit der zweiten Rohfraktion sowohl in Abwesenheit als auch Gegenwart von ATP, und trugen es dann auf dem denaturierenden Gel auf. Und wie Sie sehen können, wenn Sie es nach der Inkubation ohne ATP auftrugen, dann wanderte das Protein, ein kleines Protein, auf dem Gel nach vorne. Jedoch nach der Inkubation mit ATP, wurde es kovalent an eine Vielzahl von höhermolekularen Proteinen gebunden. Und wir wussten, dass es kovalent war, weil es unter sehr denaturierenden Bedingungen stattfand. Nicht-kovalente Interaktionen würden also unter diesen Bedingungen gestört werden. Als wir diese schreckliche Schmiere sahen, war das für uns wie eine Offenbarung. Wir verstanden plötzlich, dass Ubiquitin kein Aktivator ist. Tatsächlich war es an Substrate gebunden, an Proteinsubstrate des Systems, weil die zweite Rohfraktion nicht nur Enzyme enthält - die anderen Enzyme, die sich im System integrieren - sondern auch körpereigene Proteine, die von den Systemsubstraten abgebaut werden. Und um dies zu testen, habe ich es auf diese Weise bei steigenden Mengen eines nicht-physiologischen, aber eines guten Substrats, also Lysozyme, generiert und wie Sie sehen können, tauchten verschiedene Bänder auf, die wir analysierten und wir fanden erhöhtes Vorkommen von Ubiquitin, ca. 80 bei einem Lysozym. Basierend auf diesen Ergebnissen, postulierten wir 1980, unser ursprüngliches Postulat, dass Proteinabbau dadurch erfolgt, indem sie an ein Ubiquitin-APF, oder Ubiquitin gebunden werden, und dass ATP oder Energie in diesem Verfahren für diesen Anbindung von Ubiquitin notwendig ist, denn hierbei handelt es sich um eine kovalente Amidbindung. Und wir postulierten ebenfalls, dass sobald ein Protein mit Ubiquitin markiert ist, es durch eine bestimmte Protease abgebaut wird, die nur Proteine abbaut, die an Ubiquitin gebunden sind. Danach wird das Ubiquitin zur weiteren Verwendung freigegeben. In den darauf folgenden etwa 10 Jahren, arbeitete ich an den Details dieser Theorie und tatsächlich konnte gezeigt werden, das wird hier richtig lagen. Wir fanden, dass es drei Enzyme gibt, die bei der Ligase des Ubiquitin-Proteins beteiligt sind. Ich gehe hier nicht weiter ins Detail, das findet man jetzt alles in den Lehrbüchern, was ich Ihnen aber zeigen will, was ich hervorheben möchte, ist, dass der wichtigste dieser Enzyme das dritte Enzym oder E3 ist, weil es die abzubauenden Proteine erkennt und es Ubiquitin auf diese spezifischen Proteine überträgt. Die Selektivität und oft auch die Regulierung des Proteinabbaus wird durch die Substratspezifität dieser Ubiquitin-Ligasen bestimmt. Heutzutage weiß man, dass über 600 verschiedene Ubiquitin-Ligasen im menschlichen Genom vorhanden sind, und wir brauchen diese hohe Anzahl von Ubiquitin-Ligasen, um spezifische Proteine zu wählen bzw. zu erkennen, die zum Abbau angezielt werden müssen. Sobald Proteine mit einem Ubiquitin verbunden sind, werden sie durch einen Protease-Komplex, das 26S Proteasom, das von anderen Forschern entdeckt wurde, abgebaut. Jetzt befinden wir uns ca. im Jahr 1990 in unserer Geschichte, und ich sah, dass wir mehr oder weniger die Grundlagen der Biochemie des Ubiquitin-System verstanden, und nun standen wir vor der Frage, welche Rolle es in den Zellen spielt, denn bis jetzt verwendete ich nicht-physiologische Modellsubstrate. Ich fing an mich für die Rolle von Ubiquitin im Zellzyklus zu interessieren, und insbesondere für den Abbau bestimmter Proteine, genannt Cyclin, Cyclin B. Cyclin B wurde von anderen Forschern entdeckt und man fand heraus, dass es ein Aktivator einer Proteinkinase namens CDK im Zellzyklus ist. CDK ist nicht aktiv, und es ist nicht an Cyclin gebunden. Cyclin B wird in der Interphase synthetisiert, also im frühen embryonalen Zellzyklus. Es bindet sich an CDK und wandelt es in eine aktive Form um, die MPF- oder Mitose-fördernder Faktor - genannt wird. Und der Mitose-fördernde Faktor ist eine Proteinkinase. Es ist eine wichtige Proteinkinase, die sehr wichtige Vorgänge in der Mitose verursacht. Und um aus der Mitose heraus zu gelangen, muss MPF inaktiviert werden, und diese Inaktivierung wird durch den schnellen Abbau von Cyclin B am Ende der Mitose durchgeführt. Ich interessierte mich also für diese Frage, und fragte mich, ob Cyclin B durch das Ubiquitin-System abgebaut wird, und wenn ja, ob es eine spezifische Ubiquitinligase gibt, auf die es für den Abbau und das Ende der Mitose abzielt. Dafür brauchte ich erneut ein zellfreies System, weil ich mich der Biochemie bedienen wollte, einer biochemischen Isolation dieser vermeintlichen Ubiquitin-Ligase. Und in diesem Fall führte mich die Suche nach einem zellfreien System zu diesem Organismus, zu der Muschel. Es ist eine sehr große Muschel, die an der Ostküste der USA zu finden ist. Sie wird normalerweise verwendet, um Muschelsuppe zu machen, aber es hat auch einige andere wissenschaftliche Zwecke, und im Marine Biological Laboratory in Woods Hole, wird es für Studien zur Zellteilung verwendet, weil die weibliche Muschel riesige Mengen, Hunderte von Millionen von Eizellen trägt. Man nahm dann diese Eizellen, befruchte sie im Reagenzglas, und man erhielt eine Zellteilung bei einer sehr hohen Synchronie. Alle diese Millionen von Eizellen beginnen sich innerhalb von Minuten zu trennen. Und die zellfreien Extrakte können hergestellt und für die Untersuchung von Zellzyklusproblemen genutzt werden. Ich verwendete zellfreie Extrakte aus diesen Muscheln, um den Abbau von Cyclin B zu untersuchen. Gemeinsam mit Kollegen isolierten wir einen großen Komplex der Cyclin-Ubiquitin-Ligase-Aktivität, den wir Cyclosom nannten. Andere nannten es den Anaphase-Förderungskomplex oder APC, und nun ist es unter diesen beiden Namen bekannt, APCC hat eine sehr wichtige Rolle, nicht nur beim Abbau von Cyclin B, sondern auch bei der Regulierung des Austritts der Mitose und einigen anderen Phasen des Zellzyklus. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse 1996 schlugen wir das folgende Schema vor. Die Ubiquitin-Ligase APCC ist inaktiv, ist in einem großen Komplex, oder wie hier in einer sehr hypothetischen Zeichnung dargestellt - da wir jetzt wissen, dass es viele weitere Untereinheiten gibt, aber so zeichneten wir es damals - es ist also in der Interphase nicht aktiv, und es wird in die aktive Phase durch Phosphorylierung umgewandelt. Und die Proteinkinase, die die Ubiquitin-Ligase-phosphoryliert ist eigentlich ein Substrat. Es ist ein CDK1 Cyclin B, oder MPF. Es phosphoryliert es also, dann zusammen mit einigen anderen Reaktionen, wandelt es sich in die aktive Form um. Nun ubiquitiniert die aktive Ubiquitin-Ligase, Cyclin B und zielt es für den Abbau an. Die aktive Ubiquitin-Ligase inaktiviert eine Proteinkinase, und dann wird die Proteinkinase in eine inaktive Form umgewandelt. Die Ubiquitin-Ligase wird dann zurück in die inaktive Form durch die Wirkung von einigen Phosphotasen versetzt. Hier hat man also eine Art Regelkreis, bei dem die aktive Proteinkinase die Ubiquitin-Ligase in die aktive Form umwandelt. Und dann wandelt oder inaktiviert die aktive Ubiquitin-Ligase die Proteinkinase in seine inaktive Form um. Diese Wechselwirkung ist wirklich das, was die Schwingung von Cyclin B im Zellzyklus bestimmen. Ich glaube mir läuft die Zeit davon, daher möchte ich, das was andere tun und einige wichtige Anwendungen des Ubiquitin-Systems überspringen und zu dem übergehen, was wir gelernt haben, weil ich denke, dass dies für die jungen Leute im Publikum wichtig ist. Was habe ich also aus meinem Leben in der Wissenschaft bisher gelernt? Ich habe bisher noch nicht ausgelernt. Zunächst einmal ist es sehr wichtig, gute Mentoren in der Wissenschaft zu haben. Gute Wissenschaft lernt man nicht nur aus der Literatur. Verstehen Sie mich nicht falsch, Sie sollten die Literatur lesen, aber auch nach guten Mentoren suchen, und ich hatte das Glück, ganz am Anfang meines Wirkens in der Wissenschaft gute Mentoren zu haben. Während ich meinen Doktor machte erhielt ich eine sehr gute Ausbildung von meinem Mentor, Jacob Mager an der Hebrew University in Jerusalem. Er war ein Biochemiker mit immensem Wissen. Er war auch ein sehr rigoroser experimenteller Forscher. Jedes einzelne Experiment erfolgte also unter Beachtung aller Kontrollversuche. Positivkontrollen, Negativkontrollen, jeder Aspekt, jede Aussage musste überprüft werden, ich erhielt also eine sehr gute, solide Ausbildung in strikter, rigoroser Biochemie von Jacob Mager. Danach begann ich meinen Post-Doc, wie schon erwähnt mit Gordon Tomkins. Er war ein ganz anderer Wissenschaftler. Kontrollversuche interessierten ihn nicht allzu sehr. Das brachte ihm auch ein paar Schwierigkeiten ein. Aber er war sehr motiviert. Er hatte Einfallsreichtum, er war inspiriert. Er war eine Quelle großer Inspiration für viele andere zu jener Zeit. Und er war auch eine Quelle der Inspiration für mich. Ich hatte sehr viel Glück diese beiden Mentoren zu haben, weil ich so kombinieren konnte. In der Wissenschaft braucht man die Inspiration und den Einfallsreichtum, aber gleichzeitig muss man sich auch sehr rigoros selbst prüfen. Dies sollte man mit sehr streng kontrollierten Experimenten tun, um zu sehen, ob Ihre Idee auch wirklich korrekt ist. Halten Sie also Ausschau nach guten Mentoren, wenn Sie ganz am Anfang Ihres Laufbahn in der Wissenschaft stehen. Eine weitere wichtige Lehre, die Sie aus dem ziehen können, was ich Ihnen erzählt habe, ist es, ein wichtiges Thema zu finden, für das sich sonst keiner interessiert. Sonst werden Sie von den großen Jungs schnell eingeholt. Folgen Sie also nicht der Masse. Wie schon zuvor erläutert, ich entwickelte ein Interesse für den Proteinabbau, weil ich sowohl dachte, dass es sich hier um ein wichtiges Gebiet handelte, aber auch, weil ich sah, dass nicht viele Leute daran interessiert waren. Ich folgte also nicht der Masse. Ich hatte nichts gegen das, was die Mehrheit machte, ich beschäftigte mich einfach mit Dingen, an denen kein anderer interessiert war. Versuchen Sie also ein gutes Gebiet zu finden, dass die Mehrheit nicht interessiert, sonst macht es keinen Sinn, darin Zeit zu investieren. Es sollte sich jedoch um ein wichtiges Thema handeln. Sonst macht es ebenfalls keinen Sinn, dieses Gebiet zu erforschen. Eine weitere Lehre ist, dass die zufälligen Beobachtungen in etwas Wichtiges resultieren könnten. Greifen Sie also nach dem Glück, wenn es zum Greifen nahe ist. Es kann sein, dass uns das Glück viele Male begegnet, wir uns aber dessen nicht immer bewusst sind. Versuchen Sie es also, es zu greifen, wenn sich die Chance ergibt. Und manchmal... Wie zuvor sagte, mein Interesse am Proteinabbau begann, weil ich dachte, dass es wichtig ist, aber mein wirkliches Interesse begann, als ich herausfand, dass es energieabhängig ist. Hierbei handelte es sich um eine zufällige Beobachtung. Ich sah, dass die Ergebnisse der Experimente völlig unerwartet waren. Ich hatte eigentlich genau gegenteilige Ergebnisse erwartet. Wenn man aber eine Beobachtung macht, die nicht mit dem übereinstimmt, was man erwartet, man aber denkt, dass es wichtig ist, dann machen Sie davon Gebrauch, denn hier stehen Sie vor einem Glücksmoment. Lassen Sie sich Ihre Glücksmomente nicht entgehen. Eine weitere Lehre ist, dass Sie jeden experimentellen Ansatz verwenden sollten, um an Ihr Ziel zu kommen. Es handelt sich dabei vielleicht nicht unbedingt um die angesagte oder modernste Technologie. Als ich meine Arbeit in den späten 70er Jahren begann, und vor allem in den frühen 80er Jahren, kamen leistungsstarke Technologien der Molekularbiologie in den allgemeinen Gebrauch, und das war sehr wichtig, und ein sehr großer technologischer Fortschritt. Viele Biochemiker wurden daraufhin Molekularbiologen. Aber manchmal bekommt man auch durch die neueste Technologie nicht das, was man will. Um also herauszufinden, was die Komponenten des Systems sind, die am Proteinabbau beteiligt sind, und dann, wie Ubiquitin funktioniert, konnte man damals man keine Molekulargenetik verwenden. Man musste die Lehren der Biochemie, einschließlich der Reinigung und fraktionierenden Rekonstitution, verwenden und danach konnten andere die Ergebnisse für die molekulare Genetik nutzen. Andere klonen das Gen für Ubiquitin, für Enzym E1, für die verschiedenen E-Enzyme, und das war sehr wichtig, denn so erhielten sie die vielen Funktionen des Ubiquitin-Systems in der zellulären Physiologie, auf die ich heute aus Zeitgründen nicht eingehen konnte. Verwenden Sie also jeglichen Ansatz, den Sie zur Erreichung Ihres Ziels benötigen. Etwas, das vielleicht nicht so eindeutig herausstach, was ich aber ebenfalls erwähnte, ist, dass die Wissenschaft ein Abenteuer sein sollte, ein aus Neugier getriebenes Abenteuer. Sie sollten immer mit sehr viel Engagement dabei sein. Machen Sie es nicht nur, weil es eine lästige Pflicht ist. Wir haben viele Aufgaben in unserer Laufbahn als Wissenschaftler. Wir müssen Publikationen verfassen, um gesponsert zu werden oder Fördergeld zu erhalten. Sammeln Sie nicht nur Daten, um Publikationen zu machen, um dann noch mehr Daten sammeln zu können, um noch mehr zu publizieren, weil Sie dafür Fördergeld erhalten oder einen Sponsor gefunden haben. Selbstverständlich muss man praktisch vorgehen. Sie müssen publizieren, um Zuschüsse zu erhalten. Aber erlauben Sie es nicht, dass Ihre Pflichten die Überhand gewinnen. Lassen Sie das nicht zu.... Ich hoffe, ich habe mir hier klar ausgedrückt, lassen Sie nicht zu, dass Ihre Pflichten den Hauptteil Ihrer Arbeit in der Wissenschaft einnehmen. Das Wichtigste ist die Neugier, die Ihre wissenschaftliche Tätigkeit antreibt. Und der sechste Punkt ist nicht so wichtig, also höre ich hier besser auf. Vielen Dank.

Avram Hershko (2015)

Roles of the Ubiquitin System in Health and Disease

Avram Hershko (2015)

Roles of the Ubiquitin System in Health and Disease

Abstract

The selective degradation of many short–lived proteins in eukaryotic cells is carried out by the ubiquitin-mediated proteolytic system. In this pathway, proteins are targeted for degradation by covalent ligation to ubiquitin, a highly conserved small protein. The ligation of ubiquitin to protein involves the successive action of three types of enzymes: the ubiquitin-activating enzyme E1, a ubiquitin-carrier protein E2 and a ubiquitin-protein ligase, E3. The selectivity and the regulation of the degradation of a specific protein are usually determined by the properties of its specific ubiquitin ligase (E3) enzyme. We have been studying two ubiquitin ligase complexes that have important roles in different aspects of cell cycle regulation. One is the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome (APC/C), which is activated at the end of mitosis and targets for degradation mitotic cyclins and securin, an inhibitor of anaphase initiation. A different complex, which belongs to the SCF (Skp1-Cullin-F-box protein) family of ubiquitin ligases, is involved in the degradation of p27, a mammalian G1 cyclin-dependent kinase inhibitor, following mitogenic stimulation.
Work from other laboratories has shown that ubiquitin-mediated degradation of regulatory proteins is involved in a large variety of basic biological processes including the control of cell proliferation, inflammation and immunity, embryonic development, signal transduction and gene expression. Abnormalities in protein degradation are involved in diseases such as some types of cancer and neurodegenerative disorders. The mode of the involvement of the ubiquitin system in cancer will be discussed.

References:

1. Hershko, A. (2005) The ubiquitin system for protein degradation and some of its roles in the control of cell division (Nobel lecture). Cell Death Differ. 12, 1191-1197.
2. Hershko, A. (2009) Some lessons from my work on the biochemistry of the ubiquitin system. J. Biol. Chem. 284, 10291-10295.

Content User Level

Beginner  Intermediate  Advanced 

Cite


Specify width: px

Share

COPYRIGHT

Content User Level

Beginner  Intermediate  Advanced 

Cite


Specify width: px

Share

COPYRIGHT


Related Content