J. Michael Bishop (2015) - A Virus, a Gene and Cancer: An Anatomy of Discovery

I will explore a sequence of discoveries that spanned three-quarters of a century and culminated in the realization that the seeds of cancer reside in our own genomes. Harold Varmus will then explain where that realization has taken us in the struggle to understand and control cancer

Thank you very much. It's nice once again to be here. I want to say that it was impressive that Eric Betzig did some of his crucial work in a living room, somebody's living room. This story starts with chickens. I don't think that would work. So late in... There we go. Late in the year 1909, a farmer on Long Island in New York noticed a tumour on the breast of one of his Plymouth Rock hens. He watched this tumour grow for several months, and then took it to the Rockefeller Institute in New York City to see what might be done. The farmer was referred to Peyton Rous, a young pathologist with an interest in cancer, although not much of a publication record in the field. He's said to have been a very forceful, even fiery individual. So perhaps by virtue of his personality, he was able to convince the farmer to donate his chicken to medical research. So this serendipitous encounter launched a sequence of discoveries that spanned almost three quarters of a century, and culminated in the realization that the seeds of cancer reside in our own genomes. And my purpose today is to explore how all that happened, in an effort to illustrate how discoveries are made. And then in the following lecture, my colleague Harold Varmus will explain where these discoveries have taken us in the struggle to understand and control cancer. Now Rous began with a very simple experiment, by attempting to pass the tumours with grafts from one chicken to another. The experiment was not exactly a resounding success. In this example, with each passage... there you go... Finky taught me that... (laughs) only a single engraftment succeeded. That's the black squares there. Moreover, the transplantation succeeded only when Rous used chickens from the inbred flock of the farmer. The tumour would not grow in Plymouth Rock hens from other sources, nor in other breeds of birds. Rous explained this by saying that the tumours were obeying what he called the laws of tissue biology. We call it histoincompatibility. Now mundane as this experiment may seem to us, it's widely believed that the passaging of the tumour was serendipitously essential to the next step, which took Peyton Rous to a new dimension and to lasting fame. Beginning with the sixth passage of tumours, Rous began to make cell-free extracts of the tumours, and found that injection of these into chickens from the same flock could elicit the identical tumour, a spindle cell sarcoma. He announced this discovery with a two page article in the Journal of the American Medical Association. You will not find much about chickens in that journal in this day and age. Now, Rous realized that he had made, in his words, a unique and significant finding, but he was very careful about what that finding might connote. And I quote from his first paper: active in this sarcoma of the fowl as a minute parasitic organism. But an agency of another sort is not out of the question. For the moment, we have not adopted either hypothesis." That sort of language would not get you into many journals these days either. Now within a year, however, Rous had identified a second filterable agent that caused a different kind of chicken tumour, an osteochondrosarcoma, and at that point, he succumbed to using the recently coined term "virus," the very concept of which was just about a decade old. In his writings, Rous was never particularly illuminating about his inspiration for his work. He explained his effort to transplant the tumour by pointing out that transplantation of tumours had succeeded in mammals, so why not try it in chickens? He justified his landmark experiments with filterable extracts by pointing out that such work had never succeeded with mammals, so why not try it in chickens? That's literally the case. Perhaps his motive was best captured by Nobel laureate Renato Dulbecco in his biographical sketch of Rous, who wrote that Rous was a medical man who wished to learn about cancer as a disease, and a biologist who did not want to follow the beaten path, willing to hunt for new clues in well-designed but slow experiments. The work with chicken viruses was greeted with what Rous described in his Nobel lecture as downright disbelief. Nobody really took it seriously. And Rous himself eventually became disillusioned when he failed to identify causative viruses in transplantable tumours of mammals, particularly rodents. It would be fifty-five years before his discovery of the chicken tumour virus earned him the Nobel Prize, and Finky, if you're in the audience, that's the real record. Okay. Rous certainly deserved the Nobel Prize, because he had fashioned two momentous legacies. The first, the eventual recognition that viruses are major causes of human cancer, something that Rous had toyed with but abandoned after his failure with rodent tumours. That's a story that Professor zur Hausen could tell you. The second legacy represents an unbroken chain of research that would eventually link wayward genes to cancer. For several decades after Rous, his sarcoma virus lay fallow. Beginning in the 1960s however, the pace quickened, and it became apparent that Rous's virus was an archetype for a vast and seemingly ubiquitous family of what came to be called RNA tumour viruses, signalling the nature of their newly discovered genome, RNA. The discovery of Peyton Rous now blossomed from a two page report in the Journal of the American Medical Association to a 1500 page monograph, and I doubt that many have ever read it cover to cover. I first encountered these viruses when I arrived at UCSF, University of California San Francisco, in 1968, to take up what proved to be my only academic job. As a newly minted assistant professor whose research concerned the replication of polio viruses, I really was not very much aware of RNA tumour viruses at the time. And there I was introduced to a fellow newcomer to the faculty, Warren Levinson, who was schooled in the biological aspects of Rous sarcoma virus. And all of us pretty much looked like that in those days. Under Warren's tutelage, it quickly became apparent to me that this virus represents a potentially powerful tool with which to probe the secrets of the cancer cell. It was a simple and tractable experimental system whose biological properties were actually pretty well characterized. It could transform cells in vitro, in a petri dish, to neoplastic phenotype, literally overnight. There was a well-established and highly reproducible bioassay for the virus in vitro, which among other things made the virus amenable to genetic analysis. The virus could be propagated and purified in very large quantities, sufficient for biochemical and structural analysis. And its inability to replicate in human cells meant it posed little if any threat to those of us who were working with it, and so it could be worked with under relatively unconstrained conditions. At the time, no other RNA tumour virus offered such a powerful suite of advantages. So we bashed ahead with the chicken virus. Warren and I joined to study Rous sarcoma virus, and two great puzzles defined the field at the time. First, it appeared that the viral genome could be established as a heritable property of the host cell. How could this happen with a virus whose genome was RNA rather than DNA? And second, there was that powerful tumorigenic potential to be explained. Warren and I resolved to take on the replication of Rous sarcoma virus, just how does it propagate, about which virtually nothing was known at the molecular level. And in doing so, we implicitly took on the puzzle of how the virus could establish itself as a heritable property of the host cell. And I can dramatize that puzzle by reviewing what happens when Rous sarcoma virus is applied to rodent cells. At first it appears that nothing has happened, because the virus cannot replicate in those cells. But in due course, clones of neoplastic cells emerge, cells that will form a tumour in the same species of animal. And although these cells produce no virus, their morphological phenotype is determined by the particular strain of virus that was used. And mirabile dictu, if at any subsequent point the transformed cells are fused with normal chicken cells, the virus re-emerges, phenotype intact. Where had it been hiding? Now looming over that puzzle was the central dogma, enunciated with special authority by Francis Crick, but generally ingrained in most biologists at the time. The transfer of genetic information was thought to be unidirectional from DNA to RNA to protein. It turns out that future events about, which I'll talk in a moment, would prompt Francis Crick in a bit of hindsight to point out that chemistry may preclude direct transfer of information from protein to RNA, but there had been no inherent reason to discredit transfer from RNA to DNA. But that bias was existent and powerful. In any event, two individuals paid little heed to the central dogma: Howard Temin and David Baltimore. The two first crossed paths in 1955 at a science camp for high school students put on by the Jackson Laboratories in Bar Harbor, Maine. At the time, Temin was a student at Swarthmore College who was serving as the guru for the camp, the one adult presence. Baltimore was a high school student from New York City who attended the camp. Temin is on the right, Baltimore is on the left. Look at that. I've never had one of those before. Now, although Baltimore went on to attend Swarthmore as well, Temin apparently had nothing to do with that, the two parted ways until the spring of 1970, when they independently wreaked havoc with the central dogma. Now, Temin and Baltimore came at the puzzle of Rous sarcoma virus from very different vantage points. Temin began work with the virus as a graduate student at Caltech, where he first of all helped develop the quantitative bioassay that we all then used thereafter. And at Caltech, he became familiar with the phenomenon of lysogenic conversion of bacteria by viruses that we call bacteriophage. And during the course of infection, the phage can go into hiding by inserting its genome into the genome of the host cell and from that position can bestow new properties on the host cell. The phage can be brought out of hiding by irradiating the cell. Temin thought this might just well represent how Rous sarcoma viruses might replicate, stabilize its genome in the host, and initiate neoplastic transformation of the host cell. There was only one problem with this of course. Lysogenic phage had double stranded DNA genomes, whereas Rous sarcoma virus has a single stranded RNA genome. How could that create a lysogenic phenomenon in the host cell? By 1964, Temin had solved this problem in his own mind by proposing what he called the DNA provirus hypothesis. The RNA genome of Rous sarcoma virus must be transcribed into DNA, which then serves as template for the synthesis of both viral messenger and genome RNA. Temin ruefully remarked in his Nobel lecture that for the next six years this hypothesis was essentially ignored. He might well have said soundly denigrated. I heard that done on many occasions. Most observers absolutely loathed the idea. Undeterred by criticism, Temin produced a variety of suggestive data to support his idea. Using chemical inhibitors, he demonstrated that infection by Rous sarcoma virus requires both new DNA synthesis and DNA dependent RNA synthesis. And using molecular hybridization, he claimed to have detected viral DNA in Rous sarcoma virus infected cells, although in all honesty the data were quite frail. In 1969 however, Satoshi Mizutani joined Temin's laboratory and in his first experiments, literally his very first experiments, he demonstrated that new protein synthesis was necessary for the early stages of Rous sarcoma virus replication. That result was actually never published, but it allowed Mizutani and Temin to conclude that the RNA directed DNA polymerase required by the provirus hypothesis must pre-exist infection. And at the time there was no precedent for such an enzyme in normal cells. We all know better now. So in that case ignorance was indeed bliss, because it directed Mizutani and Temin to look for a DNA polymerase in the virions of Rous sarcoma virus itself. David Baltimore came at the problem from a completely different perspective: the replication of animal viral genomes, which I have portrayed here, in terms of how the viral messenger RNA is generated in order to get replication underway. Baltimore had cut his research teeth on picornaviruses such as polio virus, whose single stranded RNA genomes serve directly as messenger RNA once they have gained access to the cell, so that's... yes. Consequently, we define the polarity of the genome as positive. That's a convention in the field. The messenger in turn produces all the necessary viral proteins including an RNA polymerase that replicates the viral genome. Baltimore discovered this RNA replicase while a graduate student. He completed, incidentally, he completed his thesis work in 18 months. The replicase was the first enzyme of its kind to be uncovered, and it was consistent with the idea, the conventional view that virus particles themselves contain nothing but the viral genome and the requisite structural proteins. That view was changed by the discovery that a variety of viruses carry within their virions an enzyme encoded by the viral genome and required to initiate infection by producing viral messenger RNA. And in chronological order of those discoveries: An RNA polymerase was discovered within the virions of the large pox viruses that transcribes the double stranded DNA genome of these viruses into messenger RNA. An RNA polymerase that transcribes the double stranded RNA genome of reoviruses into viral messenger RNA. And an RNA polymerase that transcribes RNA genomes of negative polarity into messenger RNA. And it was the last of these that carried the greatest weight for Baltimore because he and Alice Huang discovered the first such example in vesicular stomatitis virus and followed that by finding a similar polymerase in Newcastle disease virus. Like Rous sarcoma virus, these are envelope viruses with single stranded RNA genomes. But they have a negative polarity, remember. And although the genome of Rous sarcoma virus has a positive polarity, Baltimore was struck by the possibility that it might utilize a virion polymerase for its replication. So even before publishing the results on the negative stranded RNA genome viruses, Baltimore went looking for both RNA and DNA polymerases in the virions of RNA tumour viruses. And he had to get the virus from other labs, he had never laid a pipette on an RNA tumour virus before. He literally leaped into the field unannounced. He was undeterred by the reigning scepticism about Temin's DNA provirus hypothesis, because as he explained in his Nobel lecture, "I had no experience in the field and no axe to grind." And that too can be a state of bliss for the right scientist. In the late spring of 1970, the paths of Temin and Baltimore finally converged again when they simultaneously reported their respective discoveries of an RNA directed DNA polymerase within the virions of RNA tumour viruses, which soon acquired the name reverse transcriptase. And in turn the RNA tumour viruses were reffered to as retroviruses. Now the discovery of reverse transcriptase of course was a transformative event intellectually. But it also provided a powerfully enabling technique: the ability to copy any single stranded RNA into DNA, which made it invaluable to both fundamental research and the burgeoning biotechnology industry. For my colleagues and me it was a godsend. Now we could make probes so that we could examine infected cells for viral nucleic acids at will, and we quickly set up assays to do so. So, the means by which the virus could produce proviral DNA were at hand, but was there really a stable provirus in the infected cell, and if so, where was it hiding? Was infection by Rous sarcoma virus truly an analogue of lysogeny? The first credible sighting of proviral DNA was actually biological in nature. Introduction of DNA taken from Rous sarcoma virus infected cells into uninfected cells by transfection gave rise to the original virus. The entire viral genome must have been lurking in the DNA of infected cells. But exactly where was the provirus and what did it look like? Those questions were taken up by Harold Varmus, who joined me in San Francisco in 1970, and we were to work together for the next sixteen years. Here we are in 1978, with me as usual one step behind Harold. Well, his legs were considerably longer than mine. And using molecular hybridization with radioactive probe copied from the Rous sarcoma's genome, we and others were able to demonstrate where and when the provirus was synthesized, what molecular forms it took within the infected cell, its eventual integration into the chromosomal DNA of the host cell, where it is perpetuated and expressed as an unwelcome addition to the cellular genome. Now all of this adhered to what Howard Temin had posited a decade before. And contemplating this intimate interaction between viral and cellular genomes prepared us for what was soon to follow. Meanwhile progress was made towards solving a second great puzzle: How does Rous sarcoma virus elicit malignant growth? The first step was the demonstration by genetic analysis that the virus possesses an oncogene that is responsible for malignant transformation of host cells. This is a beautiful story which time does not permit me to tell, but it was fundamental to the field. And this oncogene was dubbed src because it causes sarcomas in chickens. Now src proved to be one of the only four genes, simply put, in the Rous sarcoma virus. And remarkably this gene plays no role in viral replication. That's the job of the other three genes in this exquisitely compact and efficient genome. Now src gene itself raised two puzzles of its own. First, what is the biochemical mechanism by which the gene elicits cancerous growth, and second, why does the virus have such a gene, given that it is not required for replication? The mechanism puzzle was solved with a discovery by Art Levinson in our lab and Mark Collett and Ray Erickson's lab in Denver that src encodes a protein kinase. Two years later, Tony Hunter at the Salk Institute surprised himself and everyone else with the discovery that the src kinase carries out a heretofore unknown reaction, phosphorylation of tyrosine. And there is a direct line from this line of experimentation to modern therapeutic practices, but that's also a story for another time. The ways in which these discoveries emerged are illuminating. In Denver, it was an inspired guess, based on the pleiotropism of src. Protein phosphorylation ranks among the most versatile agents of change known to biochemists. What better way to evoke the myriad changes that give rise to the neoplastic cell? In San Francisco, shrewd enzymology by Art Levinson led to the recognition that the src protein was actually phosphorylating itself, and thus might well phosphorylate other proteins as well. And at the Salk Institute, Tony Hunter's fortuitous use of an outdated buffer that's pH had gone off led to the separation of phosphotyrosine from phosphothreonine for the first time in recorded history. And here is Art Levinson, in creative costume at a lab Halloween party, many years before he became CEO of Genentech, chair of the Apple board of directors... he doesn't dress like that for those meetings... and most recently the founder of his own company, Calico. Now what about the second puzzle, the origin of the src gene in Rous sarcoma virus? Many years, two opposing lines of thought directed us to the genome of normal cells. First, there was the so-called virogene oncogene hypothesis, formulated by Robert Huebner and George Todaro. It was sort of an effort to create a universal theory of cancer. I for one didn't take it very seriously, but nevertheless it was out there. The thought was that retroviruses had deposited themselves with their oncogenes in the germ lines of ancient ancestors of modern species. And these genes were normally repressed by the cell, but they could be activated by various cancer-causing agents. By this account, we might possibly find src in normal cells, but it would be in the form of a retroviral oncogene, and its origin would remain unexplained. The opposing thought was Darwinian in nature. Since src is irrelevant to the viral life cycle, it is not likely to have arisen in concert with the remainder of the viral genome. There was no apparent selective pressure to accomplish that. Instead the intermittent interaction between viral and cellular genomes during the course of infection might have created an accident in which src was acquired from the cell, in essence reversing the hypothesis of Huebner and Todaro. And this thought also favoured a search for src in normal DNA. The search required a radioactive probe that could be used in molecular hybridization with the exquisite specificity to detect the src gene with great sensitivity. Now in his previous work as a postdoctoral fellow, Harold had used deletion mutants of bacteriophage to detect the expression of individual genes by molecular hybridization. And we were able to adapt this technique to our purposes. Because our collaborator Peter Vogt had isolated spontaneous deletion mutants of Rous sarcoma virus that appeared to remove the bulk of src. So as illustrated here, we could use the RNA of one of these deletion mutants to perform what later came to called subtractive hybridization. First transcribe the genome, the entire genome, both the replication genes and the src gene, into complementary radioactive cDNA. Then second, hybridize that cDNA to RNA from the deletion mutant which would capture all the DNA except that representing src. And finally remove the double stranded hybrids, leaving the single stranded cDNA for src, the probe we needed. The preparation and use of the src probe was laborious, given that the work far antedated the advent of recombinant DNA. And the requisite experiments occupied more than three years. The fact that they were done at all was a tribute to the valiant efforts of two postdoctoral fellows, Ramareddy Guntaka, who demonstrated that we could probably make the probe we needed. And Dominique Stehelin, shown here, who carried the work to its decisive conclusion. Today, with the assistance of recombinant DNA and other contemporary technologies you could probably have it done in a matter of weeks or months, but I for one am very glad we didn't wait. By 1974 we knew that our probe could detect sequences homologous to the oncogene of Rous sarcoma virus in the DNA of various avians. The top panel here demonstrates the specificity of the probe. It reacted with the RNA from which it had been transcribed, but not with RNA from the deletion mutant. The middle panel shows that the src probe reacted with normal chicken DNA, but so did a probe for the deletion mutant. And that reflects the presence of what we call endogenous retroviruses, known to pollute the genomes of many species, ourselves included. The bottom panel is the crucial one. Only the src probe reacted with DNA from other avians, and this was our first indication that we were picking up something that was not linked to a retrovirus, and unlike the genomes of endogenous retroviruses, was conserved across substantial phylogenetic distances. Note the results with emu DNA, among the most primitive of surviving avians. We published these findings in 1976 as a brief note in Nature, two figures and two tables. The simplicity belied the extraordinary difficulty of the underlying experiments, and the remarkable paradigm shift that they represented. We were pleased and so apparently was the Nobel committee. But oh how times have changed. A week ago, a colleague told me that he had asked a class of graduate students to read that paper. Their reaction? They got the Nobel Prize for that? Yeah, we did. Gradually, we built the case that our probe was detecting a normal cellular gene. We found that it was conserved across vast phylogenetic distances, suggesting that it serves a vital function. We found that normal cells contained a protein with the same biochemical properties, the same size as the viral src protein, and that this was expressed in numerous tissues. And when at long last we could use recombinant DNA to clone cellular src, we sealed the deal. Cellular src had the structural hallmarks of a normal cellular gene, the viral oncogene src had indeed been pirated from the host cell as a fully spliced version of the progenitor, and at some point the cellular gene had sustained a mutation which converted it to an oncogene. And it soon became apparent that src was more than an isolated curiosity. The inventory of retroviral oncogenes mounted steadily, and each of these had been derived from the genome of a normal cell. Thus for each viral oncogene, there was a cognate proto-oncogene in the cell. Accidents of nature had uncovered a battery of potential cancer genes in normal cells. The cellular src proto-oncogene is a well behaved and vital switch in the signalling network of normal cells, we know a great deal about that now. The viral src oncogene, however, is a mutant malefactor, whose gene product has been constitutively activated, a genetic gain of function that creates a cancer gene. Gain of function, by one means or another, proved true for all the other retroviral oncogenes as well. It was easy to imagine that the battery of cellular proto-oncogenes could be a keyboard on which all manner of carcinogens could play, independent of viruses, creating cellular oncogenes without the intervention of a retrovirus, for example. Such has proven to be the case. Proto-oncogenes that have suffered gain of function are a virtually inevitable feature of all human tumours. And as such they are major drivers for tumour genesis, and consequently, candidates as targets for new therapeutics, and that is a thriving industry now. With the assistance of modern genomic tools, the number of these genes has been expanded well beyond two hundred. The gain of function that creates oncogenes can be affected by various means. First, gain of chromosomes, or focal gene amplification, both of which increase gene dosage. Chromosomal translocations, which can either disturb the control of gene expression, or create mongrel gene products that malfunction. Point mutations, which can disrupt the control of gene expression, or create malfunctioning gene products. And defective epigenetic control of gene expression. All of these have been found in human tumours. But the end result is always the same: The equivalent of a jammed accelerator with the capacity to drive tumour genesis. The transduction of normal cellular genes into oncogenes by retroviruses, an accident of nature, had brought genetic seeds of cancer to view for the very first time. What are the factors that drove this line of discovery? Well here are a few, for the students. First of all, an eye for the main chance. David Baltimore discovered a reverse transcriptase with his very first experiment with an RNA tumour virus. He was not thinking about it before, but he saw an opportunity and seized it. Judicious disregard for received wisdom. Consider Temin and Baltimore's benign neglect of the central dogma. A willingness to gamble. Consider the years invested in the pursuit of cellular src, in what could easily have been a fool's errand. Faith in the universality of nature. The example? Our conviction that there was something to be learned about human cancer from studying a chicken virus, albeit not in anybody's living room. The choice of experimental system. The attractions that drew me to Rous sarcoma virus. Technical innovation. The assay that found cellular src. And self-confidence. Howard Temin's steadfast pursuit of his ideas during more than a decade in intellectual exile while he promulgated the provirus hypothesis to disbelieving ears. So I conclude with a shout out to Rous sarcoma virus, which has been a fecund friend of cancer research. Consider its offspring. Demonstration that viruses can cause cancer. Reverse transcriptase, a truly disruptive and generative discovery. The first example of a gene that can directly cause cancer, src. Nothing like it had been seen before. The role of protein kinases in tumorigenesis. Phosphorylation of tyrosine, now a prime player in cell signalling and a prime target in cancer therapeutics. Proto-oncogenes, the first glimpse of a genetic keyboard for carcinogens. And to date, for what it's worth, five Nobel laureates. Not bad for a chicken. Thank you.

Ich danke Ihnen. Es ist schön, wieder hier zu sein. Ich möchte anmerken, ich fand es beeindruckend, dass Eric Betzig einige seiner zentralen Arbeiten in einem Wohnzimmer durchgeführt hat. Diese Geschichte beginnt mit Hühnern. Ich glaubte nicht, dass es da geklappt hätte. Also Ende des… Da haben wir es. Ende des Jahres 1909 bemerkte ein Bauer auf Long Island in New York an der Brust einer seiner Plymouth Rock Hennen einen Tumor. Mehrere Monate lang beobachtete er das Wachsen des Tumors, dann brachte er sie in das Rockefeller Institute in New York City, um zu sehen, ob man da was tun könnte. Der Bauer wurde an Peyton Rous verwiesen, einen jungen Pathologen, der sich für Krebs interessierte, obgleich seine Publikationsliste dazu nicht groß waren. Über ihn wird gesagt, er sei eine sehr energische, sogar hitzige Person gewesen. Vielleicht war er dank seiner Persönlichkeit fähig, den Bauer davon zu überzeugen, dieses Huhn der medizinischen Forschung zu schenken. Diese zufällige Begegnung startete eine Reihe von Entdeckungen, die sich beinahe über drei Viertel eines Jahrhunderts erstreckten und zu der Erkenntnis führte, dass der Keim des Krebses in unseren eigenen Genomen sitzt. Ich möchte heute untersuchen, wie sich das alles zugetragen hat, um zu zeigen, wie Entdeckungen gemacht werden. Im darauf folgenden Vortrag wird mein Kollege Harold Varmus erläutern, wohin uns diese Entdeckungen im Kampf gegen Krebs geführt haben. Rous fing mit einem sehr einfachen Experiment an: er versuchte, den Tumor mittels Körpergewebe von einem Huhn auf ein anderes weiterzugeben. Das Experiment war nicht unbedingt ein voller Erfolg. In diesem Beispiel, mit jedem Durchgang… da haben wir es…Finky hat mir das beigebracht… (lacht) Es war nur eine Übertragung erfolgreich. Es ist dieses schwarze Quadrat. Zudem war die Transplantation nur erfolgreich, wenn Rous Hühner aus der durch Inzucht gewachsenen Hühnerschar des Bauern verwendete. Der Tumor wuchs nicht bei Plymouth Rock Hühnern aus anderen Quellen, auch nicht bei anderen Vogelarten. Rous erklärte dies damit, dass die Tumore dem folgten, was er die Gesetze der Gewebebiologie nannte. Wir nennen es Histokompatibilität. So banal uns dieses Experiment auch scheinen mag, es wird allgemein angenommen, dass die Weitergabe des Tumors glücklicherweise für den nächsten Schritt essentiell war, der Peyton Rous in eine neue Dimension führte und ihm bleibenden Ruhm verschaffte. Beginnend mit den sechs Passagen von Tumoren, begann Rous aus den Tumoren zellfreie Extrakte herzustellen und entdeckte, dass deren Injektionen bei Hühnern aus der gleichen Schar einen identischen Tumor hervorrufen konnten, ein Spindelzellsarkom. Er veröffentlichte diese Entdeckung in einem zweiseitigen Artikel im Journal of the American Medical Association. In jenen Tagen und zu jener Zeit werden Sie nicht viel über Hühner in dieser Fachzeitschrift finden. Rous erkannte, dass er, mit seinen eigenen Worten, eine einzigartige und signifikante Entdeckung gemacht hatte, er war aber sehr vorsichtig dahingehend, was diese Entdeckung implizieren könnte. Ich zitiere aus seinem ersten Artikel: in diesem Sarkom des Geflügels als einen winzigen parasitären Organismus zu betrachten. Aber eine andersartige Wirkung ist nicht ausgeschlossen. Zu diesem Zeitpunkt haben wir uns keiner der beiden Hypothesen verschrieben.“ Mit einer solchen Sprache könnten Sie heutzutage nicht in vielen Fachzeitschriften landen. Doch innerhalb eines Jahres hatte Rous einen zweiten filtrierbaren Erreger identifiziert, der eine andere Art Tumor bei Hühnern verursachte, ein Osteochondrosarkom, und an diesem Punkt erlag er der Versuchung, den vor Kurzem geprägten Begriff „Virus“ zu verwenden, ein Konzept, das erst seit einem Jahrzehnt vorlag. In seinen Schriften war Rous nie besonders eindeutig hinsichtlich der Inspiration zu seiner Arbeit. Er erklärte seine Bemühung den Tumor zu transplantieren, indem er darauf verwies, dass die Transplantation von Tumoren bei Säugetieren erfolgreich war, warum es also nicht auch an Hühnern ausprobieren? Er begründete seine Meilenstein-Experimente mit filtrierbaren Extrakten indem er darauf verwies, diese Arbeit sei bei Säugern nie erfolgreich gewesen, also warum es nicht mal an Hühnern versuchen? Das ist wortwörtlich der Fall. Vielleicht wird sein Motiv am besten von dem Nobelpreisträger Renato Dulbecco in seiner biographischen Schrift über Rous erklärt, der schrieb, dass Rous ein Mediziner war, der mehr über Krebs als Krankheit erfahren wollte und ein Biologe, der nicht den ausgetretenen Pfaden folgen wollte - gewillt, nach neuen Spuren in gut konzipierten, aber langsamen Experimenten zu suchen. Die Arbeit mit den Hühnerviren wurde, wie Rous es in seinem Nobelpreisvortrag beschreibt, ausgesprochen uninteressiert aufgenommen. Keiner nahm das wirklich ernst. Rous war schließlich selbst desillusioniert, da es ihm nicht gelang, die verursachenden Viren in den transplantierbaren Tumoren der Säugetiere, besonders der Nager, zu bestimmen. Es dauerte fünfundfünfzig Jahre, ehe seine Entdeckung des Hühnertumor-Virus ihm den Nobelpreis einbrachte und Finky, solltest du hier unter den Zuhörern sein, das ist wirklich ein Rekord. Gut. Rous hat sicherlich den Nobelpreis verdient, denn er hat zwei bedeutsame Vermächtnisse geformt. Das Erste ist die letztendliche Anerkennung, dass Viren eine Hauptursache für Krebs beim Menschen sind, etwas, mit dem Rous gespielt hatte, dies aber nach seinem Misserfolg mit Tumoren bei Nagern verwarf. Das ist eine Geschichte, die Ihnen Professor zur Hausen erzählen kann. Das zweite Vermächtnis stellt eine ununterbrochene Forschungskette dar, die schließlich fehlentwickelte Gene mit Krebs in Verbindung brachte. Einige Jahrzehnte lang nach Rous lag sein Sarkom-Virus brach. Doch Anfang der 1960er kam Tempo in die Angelegenheit und es wurde offensichtlich, dass das Rous Virus ein Archetyp einer umfangreichen und scheinbar ubiquitären Familie dessen war, was RNA-Tumorviren genannt wurde, was auf die Beschaffenheit ihres neu entdeckten Genom, RNA, hinwies. Die Entdeckung von Peyton Rous wuchs nun von einem zweiseitigen Bericht im Journal of the American Medical Association zu einer 1500 Seiten starken Monographie und ich habe meine Zweifel, ob es viele gibt, die diese Seite für Seite gelesen haben. Ich begegnete diesen Viren zum ersten Mal nachdem ich an der University of California San Francisco im Jahre 1968 begann, beim Antritt einer Stelle, die sich als meine einzige akademische Anstellung herausstellen sollte. Als frischgebackener Assistant Professor, dessen Forschungsarbeiten sich mit der Reproduktion von Polioviren befassten, wusste ich damals wirklich kaum etwas über RNA-Tumorvieren. Dann wurde ich einem weiteren Neuling der Fakultät, Warren Levinson, vorgestellt, der bei den biologischen Aspekten des Rous-Sarkom-Virus bewandert war. Damals sahen wir so ziemlich alle so aus. Unter Warrens Anleitung wurde es mir schnell deutlich: dieses Virus stellte eine potentiell kraftvolles Instrument dar, um die Geheimnisse der Krebszelle zu erforschen. Die Experimente waren einfach, die biologischen Grundmerkmale des Virus recht gut charakterisiert. Es konnte Zellen in vitro in einer Petrischale buchstäblich über Nacht in einen krebsartigen Phänotyp umwandeln. Es gab ein gut etabliertes und stark reproduzierbares Bioassay für das Virus in vitro, die das Virus unter anderem für die genetische Analyse nutzbar machte. Das Virus ließ sich in großen Mengen, die für eine biochemische und strukturelle Analyse ausreichten, vermehren und reinigen. Seine Unfähigkeit zur Vermehrung in menschlichen Zellen bedeutete, es würde kaum, wenn überhaupt, eine Bedrohung für diejenigen darstellen, die damit arbeiteten, weshalb man unter relativ lockeren Bedingungen würde arbeiten können. Zu der Zeit bot kein anderes RNA-Tumorvirus so viele Vorteile. Wir preschten also mit dem Hühnervirus vor. Warren und ich taten uns zusammen, um das Rous-Sarkom-Virus zu studieren, und zu der Zeit gab es zwei große Rätsel. Erstens: es schien, als könnte das virale Genom zu einer vererbbaren Eigenschaft der Wirtszelle werden. Wie war das mit einem Virus möglich, dessen Genom RNA statt DNA war? Und zweitens, gab es dieses starke tumorerregende Potential, das es zu erklären galt. Warren und ich entschieden, uns mit der Vermehrung des Rous-Sarkom-Virus zu befassen - einfach mal sehen, wie es sich vermehrt, wovon auf der molekularen Ebene so gut wie nichts bekannt war. Damit befassten wir uns implizit mit dem Rätsel, wie sich das Virus selbst als eine vererbbare Eigenschaft in der Wirtszelle herausbilden konnte. Ich kann dieses Rätsel noch weiter herausarbeiten, indem ich prüfe was geschieht, wenn das Rous-Sarkom-Virus in die Zellen von Nagern eingesetzt wird. Zuerst sieht es so aus, als würde nichts geschehen, da sich das Virus in diesen Zellen nicht vermehren kann. Doch zu gegebener Zeit tauchen Klone krebsartiger Zellen auf; Zellen, die einen Tumor in der gleichen Tierspezies formen werden. Obgleich diese Zellen keine Viren erzeugen, wird ihr morphologischer Phänotyp durch den verwendeten speziellen Virenstamm bestimmt. Und, mirabile dictu, werden irgendwann die umgewandelten Zellen mit normalen Hühnerzellen verschmolzen, taucht das Virus wieder auf, der Phänotyp ist intakt. Wo hat er sich versteckt? Über diesem Rätsel schwebte das zentrale Dogma, ausgesprochen durch die Autorität Francis Crick, damals aber auch ganz allgemein in den meisten Biologen tief verwurzelt. Man dachte nämlich, die Übertragung genetischer Informationen geschehe in einer Richtung von der DNA zur RNA zum Protein. Zukünftige Ereignisse, die ich gleich ansprechen werde, veranlassten Francis Crick, in einer etwas späten Einsicht, darauf hinzuweisen, dass die Chemie vielleicht die direkte Übertragung vom Protein zur RNA ausschloss, es gab aber keinen Grund, die Übertragung von der RNA zur DNA in zu verwerfen. Doch diese Grundannahme war vorhanden und sehr mächtig. Auf jeden Fall schenkten zwei Personen diesem zentralen Dogma wenig Aufmerksamkeit: Howard Temin und David Baltimore. das die Jackson Laboratories in Bar Harbor, Maine, veranstaltet hatten. Damals war Temin Student des Swarthmore College, der als Experte für das Camp amtierte, der einzig anwesende Erwachsene. Baltimore war ein Gymnasiast aus New York City, ein Teilnehmer des Camps. Temin ist rechts, Baltimore ist links zu sehen. Sehen Sie sich das an. So eines hatte ich noch nie. Obgleich Baltimore weiterhin in Swarthmore blieb, hatte Temin damit nichts mehr zu tun; die beiden gingen verschiedene Wege bis zum Frühjahr 1970, als sie unabhängig voneinander gegen das zentrale Dogma wüteten. Temin und Baltimore gingen aus sehr verschiedenen Blickwinkeln das Rätsel des Rous-Sarkom-Virus an. Temin fing als Doktorand bei Caltech an, mit dem Virus zu arbeiten, wobei er zuerst an der Entwicklung des quantitativen Bioassay mitwirkte, das wir danach alle verwendeten. Bei Caltech wurde er mit dem Phänomen der lysogenen Umwandlung von Bakterien durch Viren, die wir Bakteriophage nennen, bekannt. Im Laufe einer Infektion, kann der Phage sich verbergen, indem er sein Genom in das Genom der Wirtszelle einfügt. Aus dieser Position kann er der Wirtszelle neue Eigenschaften zuteilen. Der Phage lässt sich durch Bestrahlen der Zelle aus dem Versteck herausholen. Temin glaubte, dies könne vielleicht gut erklären, wie die Rous-Sarkom-Viren sich vermehren, ihr Genom im Wirt stabilisieren und krebsartige Transformationen der Wirtszelle auslösen. Es gab bei diesem Verlauf nur ein Problem: Der lysogene Phage hat doppelsträngige DNA-Genome, während das Rous-Sarkom-Virus ein einsträngiges RNA-Genom hat. Wie konnte dadurch ein lysogenes Phänomen in einer Wirtszelle erzeugt werden? den er die DNA-Provirus-Hypothese nannte. Das RNA-Genom des Rous-Sarkom-Virus muss in die DNA transkribiert werden, was dann als Schablone für die Synthese sowohl der viralen Boten-RNA und des RNA-Genom diente. Temin bemerkte in seinem Nobelpreisvortrag, dass seine Hypothese im wesentlich während der nächsten sechs Jahre ignoriert wurde. Er hätte auch sagen können, sie wurde entschieden verunglimpft. Ich habe das bei vielen Gelegenheiten gehört. Die meisten Beobachter verabscheuten diese Idee. Unbeirrt von der Kritik stellte Temin eine Vielfalt aussagekräftiger Daten her, um seine Idee zu stützen. Unter Verwendung von chemischen Inhibitoren demonstrierte er, dass die Infektion durch den Rous-Sarkom-Virus sowohl eine neue DNA-Synthese als auch eine DNA-abhängige RNA-Synthese erforderte. Mit der molekularen Hybridisierung beanspruchte er für sich, die virale DNA in den durch den Rous-Sarkom-Virus infizierten Zellen entdeckt zu haben, auch wenn, ehrlich gesagt, die Daten ziemlich schwach waren. Doch 1969 wurde Satoshi Mizutani Mitarbeiter in Temins Labor und in seinen ersten Experimenten, buchstäblich in seinen allerersten Experimenten, demonstrierte er, dass eine neue Proteinsynthese in den frühen Stadien der Rous-Sarkom-Virus-Reproduktion notwendig war. Dieses Ergebnis wurde nie publiziert, doch erlaubte es Mizutani und Temin die Schlussfolgerung, dass die RNA-abhängige DNA-Polymerase, die die Provirus-Hypothese forderte, vor der Infektion vorhanden sein musste. Zu dieser Zeit gab es keine Präzedenz für ein solches Enzym in normalen Zellen. Heute wissen wir es besser. In diesem Falle war Ahnungslosigkeit in der Tat ein Segen, denn sie veranlasste Mizutani und Temin, nach einer DNA-Polymerase in den Viria des Rous-Sarkom-Virus selbst zu suchen. David Baltimore näherte sich dem Problem aus einer vollkommen anderen Perspektive: Die Replikation tierischer viraler Genome, die ich hier porträtiert habe, in Hinblick auf die virale Boten-RNA wird erzeugt, um Replikationen in Gang zu setzen. Baltimore hatte sich bei seiner Forschung auf Picornaviren, wie etwa das Polio-Virus konzentriert, dessen einzelsträngiges RNA-Genom direkt als eine Boten-RNA diente, sobald dies einen Zugang zu den Zellen erlangte, so ist das… ja. Folglich definieren wir die Polarität des Genoms als positiv. Das ist in diesem Bereich eine Konvention. Der Bote wiederum erzeugt alle notwendigen viralen Proteine, einschließlich einer RNA- Polymerase, die das virale Genom kopiert. Baltimore entdeckte diese RNA-Replikase als Doktorand. Nebenbei bemerkt schloss er seine Doktorarbeit innerhalb von 18 Monaten ab. Die Replikase war das erste Enzym dieser Art, das aufgedeckt wurde, und es stimmte mit der konventionellen Ansicht überein, wonach Viruspartikel selbst nichts außer dem viralen Genom und den erforderlichen strukturellen Proteinen enthalten. Diese Ansicht änderte sich durch die Entdeckung einer Vielzahl an Viren, die in ihren Viria ein Enzym enthielten, kodiert durch das virale Genom, das für die Anfangsinfektion erforderlich war, da es die virale Boten-RNA erzeugte. Hier in chronologischer Folge die Entdeckungen: Eine RNA- Polymerase wurde in den Viria eines großen Pockenvirus entdeckt, die das doppelsträngige DNA-Genom dieser Viren in Boten-RNA transkribiert. Eine RNA-Polymerase die das doppelsträngige RNA-Genom von Reoviren in virale Boten-RNA transkribiert. Und eine RNA-Polymerase, die RNA-Genome von negativer Polarität in Boten-RNA transkribiert. Das Letztere hiervon hatte für Baltimore das größte Gewicht, da er und Alice Huang das erste entsprechende Beispiel im Vesicular Stomatitis Virus entdeckten und in der Folge eine ähnliche Polymerase im Newcastle Disease Virus. Wie das Rous-Sarkom-Virus sind dies verkapselte Viren mit einzelsträngigen RNA-Genomen. Doch erinnern Sie sich, sie haben eine negative Polarität. Und obgleich das Rous-Sarkom-Virus eine positive Polarität hat, war Baltimore von der Möglichkeit beeindruckt, es könne eine Virion-Polymerase zu seiner Replikation verwenden. Noch bevor die Ergebnisse der negative-strängigen RNA-Genom-Viren publiziert wurden, suchte Baltimore in Viria der RNA-Tumorviren sowohl nach RNA und DNA-Polymerasen. Er musste das Virus aus anderen Labors bekommen, er hatte zuvor nie ein RNA-Tumorvirus mit der Pinzette berührt. Er sprang buchstäblich unangekündigt in dieses Feld hinein. Er ließ sich nicht durch die herrschende Skepsis hinsichtlich Termins DNA-Provirus-Hypothese beirren, denn, wie er in seinem Nobelpreisvortrag erläuterte: „Ich hatte auf diesem Feld keine Erfahrung und auch keine persönlichen Interessen.“ Auch das kann für einen richtigen Wissenschaftler ein wahrer Segen sein. Schließlich, im späten Frühjahr 1970 führten die Wege von Temin und Baltimore erneut zueinander. Sie berichteten gleichzeitig von ihren jeweiligen Entdeckungen einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase in den Viria der RNA-Tumorviren, welches bald reverse Transkriptase genannt wurde. Die RNA-Tumorviren wiederum wurden als die Retroviren bezeichnet. Diese Entdeckung der reversen Transkriptase bedeutete eine Umkehr vom normalen Denken. Es bot aber auch eine viele neue Möglichkeiten: Die Fähigkeit, eine einzelsträngige RNA in die DNA zu kopieren, was für die Grundlagenforschung und die im Entstehen begriffene industriell genutzte Biotechnologie von unschätzbarem Wert war. Für mich und meine Kollegen war es ein Geschenk des Himmels. Wir konnten jetzt beliebig infizierte Zellen auf virale Nukleinsäuren untersuchen und wir bauten sehr schnell Assays dafür auf. Die Mittel, mit denen das Virus provirale DNA erzeugen konnte, waren vorhanden. Gab es in der infizierten Zelle aber wirklich einen stabilen Provirus, und wenn dem so war, wo versteckte er sich? War die Infektion durch das Rous-Sarkom-Virus wirklich eine Nachbildung der Lysogenie? Die erste glaubwürdige Sichtung der proviralen DNA war biologischer Natur. Die Einführung der DNA, aus Rous-Sarkom-Virus infizierten Zellen in nichtinfizierte Zellen durch Transfektion, riefen das ursprüngliche Virus hervor. Das ganze virale Genom hatte sich offenbar in der DNA der infizierten Zellen versteckt. Doch wo genau war das Provirus und wie sah es aus? Dies Fragen wurden von Harold Varmus aufgegriffen, der 1970 in San Francisco zu mir stieß und wir arbeiteten dann die folgenden 16 Jahre zusammen. Hier sind wir im Jahr 1978, ich, wie gewöhnlich, einen Schritt hinter Harold. Nun, seine Beine waren sehr viel länger als meine. Unter Verwendung molekularer Hybridisierung mit radioaktiven Sonden, kopiert vom Rous-Sarkom-Genom, waren wir und andere in der Lage aufzuzeigen, wo und wann das Provirus synthetisiert wurde, welche molekularen Formen es innerhalb der infizierten Zelle annahm, seine endgültige Integration in die chromosomale DNA der Wirtszelle, in der es als ein unerwünschter Zusatz zum zellulären Genom bewahrt und ausgedrückt wird. Alles das stimmte mit dem überein, was Howard Temin bereits vor einem Jahrzehnt postulierte. Und das Nachdenken über diese innige Wechselwirkung zwischen viralen und zellulären Genomen bereiteten uns auf das vor, was bald darauf folgte. Inzwischen gab es Fortschritte beim Lösen des zweiten großen Rätsels: Wie löste das Rous-Sarkom-Virus das maligne Wachstum aus? Der erste Schritt war der Beweis der Genanalyse, dass das Virus über ein Onkogen verfügte, welches für die maligne Transformation der Wirtszelle verantwortlich war. Es ist eine schöne Geschichte, aber ich habe nicht die Zeit, sie Ihnen zu erzählen, Sie war für dieses Gebiet jedoch grundlegend. Dieses Onkogen wurde Src genannt, da es Sarkome in Hühnern verursacht. Es zeigte sich, Src war, vereinfach gesagt, eines von nur vier Genen des Rous-Sarkom-Virus. Bemerkenswerter Weise spielt dieses Gen keine Rolle bei der viralen Replikation. Das ist die Aufgabe der anderen drei Gene in diesem ausnehmend kompakten und effizienten Genom. Nun werden durch das Src Gen selbst zwei Rätsel gestellt. Erstens: Was ist der biochemische Mechanismus, durch den das Gen das maligne Wachstum auslöst? Und zweitens: Warum verfügt das Virus über ein solches Gen, obwohl es dies nicht zur Replikation benötigt? Das Rätsel des Mechanismus wurde in unserem Labor durch die Entdeckung von Art Levinson, und im Labor von Mark Collett und Ray Erickson in Denver gelöst: Das Src kodiert eine Proteinkinase. Zwei Jahre danach überraschte Tony Hunter am Salk Institute sich selbst und alle anderen mit der Entdeckung, dass die Src Kinase bislang unbekannte Reaktionen vornahm, nämlich die Phosphorylierung von Tyrosin. Es besteht eine direkte Linie zwischen dieser Reihe von Experimenten zu modernen therapeutischen Behandlungen, doch auch das ist eine Geschichte für einen anderen Zeitpunkt. Die Arten, auf denen diese Entdeckungen gemacht wurden, sind wegweisend. In Denver war es eine inspirierte Vermutung auf Basis der Pleiotropie des Src. Proteinphosphorylierung zählt zu den unter Biochemikern bekannten vielseitigsten Wirkstoffen für Veränderungen. Was eignete sich besser für das Hervorrufen einer Unzahl von Veränderungen, die Anlass für eine neoplasmatische Zelle geben? In San Francisco hatte die schafsinnige Enzymologie Art Levinsons zu der Erkenntnis geführt, dass das Src-Protein selbst eine Phosphorylierung war und daher durchaus andere Proteine phosphorylieren könnte. Am Salk Institute hatte Tony Hunters zufällige Verwendung eines veralteten Puffers, dessen pH abgelaufen war, zum ersten Mal seit Menschengedenken zu einer Trennung des Phosphotyrosin vom Phosphothreonin geführt. Das hier ist Art Levinson in einem Fantasiekostüm bei der Halloween-Party des Labors, viele Jahre ehe er der CEO von Genentech, Vorsitzender des Apple-Vorstands wurde…. er kleidet sich für solche Sitzungen nicht so ein… und seit Kurzem ist er Gründer des eigenen Unternehmens Calico. Wie steht es nun mit dem zweiten Rätsel, dem Ursprung des Src-Gens im Rous-Sarkom-Virus? Viele Jahre lang haben uns zwei entgegengesetzte Ansätze zum Genom normaler Zellen geführt. Einmal war da die sogenannte virogene Onkogenhypothese, aufgestellt von Robert Huebner und George Todaro. Es war ein Bestreben, eine universelle Theorie über Krebs aufzustellen. Ich selbst bewertete sie nicht sehr hoch, doch es gab sie. Der Gedanke war, Retroviren hätten sich mit ihren Onkogenen selbst in die Keimbahnen der Urahnen der modernen Spezies deponiert. Diese Gene wurden gewöhnlich durch die Zelle unterdrückt, konnten aber durch verschiedene krebsverursachende Wirkungen aktiviert werden. Unter der Voraussetzung können wir Src möglicherweise in normalen Zellen finden, das wäre aber in Form eines retroviralen Onkogens, dessen Ursprung ungeklärt bliebe. Der entgegengesetzte Gedanke war darwinistischer Natur. Da Src für den viralen Lebenszyklus ohne Bedeutung ist, ist es unwahrscheinlich, dass es gemeinsam mit dem Rest des viralen Genoms entstanden ist. Es gab keinen ausreichend selektiven Druck, der dies erreicht hätte. Statt dessen könnte die periodische Wechselwirkung zwischen viralen und zellulären Genomen im Laufe einer Infektion eine Störung verursacht haben, in der Src von der Zelle gewonnen wurde; im Wesentlichen wurde damit die Hypothese von Huebner und Todaro umgekehrt. Dieser Gedanke befürwortete auch die Suche nach Src in der normalen DNA. Die Suche erforderte eine radioaktive Sonde, die bei molekularer Hybridisierung verwendet wurde, um ein Src-Gen mit großer Sonden-Empfindlichkeit zu entdecken. In seiner vorherigen Arbeit als Post-Doc, hatte Harold Deletionsmutanten des Bakteriophagen verwendet, um die Expressionen einzelner Gene durch molekulare Hybridisierung zu erkennen. Wir waren in der Lage diese Technik für unsere Zwecke zu übernehmen. Denn unser Mitarbeiter Peter Vogt hatte den spontanen Deletionsmutanten des Rous-Sarkom-Virus isoliert, der den Hauptteil von Src zu entfernen schien. Wie hier dargestellt, konnten wir die RNA eines dieser Deletionsmutanten verwenden, um später das durchzuführen, was dann Substrathybridisierung genannt wurde. Zuerst transkribiert man das Genom, das gesamte Genom, sowohl die Replikationsgene und das Src-Gen in komplimentäre radioaktive cDNA. Als zweites hybridisiert man vom Deletionsmutanten cDNA mit RNA, was die gesamte DNA erfasst, ausgenommen jener, die Src repräsentiert. Schließlich entfernt man die doppelsträngigen Hybriden und lässt die einzelsträngige cDNA für Src über für die Sonde. Die Vorbereitung und Verwendung der Src-Sonde war mühselig, in Anbetracht, dass die Arbeit weit vor Erscheinen der rekombinanten DNA erfolgte. Die erforderlichen Experimente beanspruchten dann drei Jahre. Dass sie überhaupt durchgeführt wurden war das Verdienst zweier Post-Docs: Ramareddy Guntaka, der nachwies, dass wir die notwendige Sonde vermutlich herstellen können, und Dominique Stehelin, der hier zu sehen ist, hat die Arbeit bis zu ihrer entscheidenden Schlussfolgerung durchgeführte. Heute, mit Hilfe der rekombinanten DNA und weiteren zeitgemäßen Technologien, hätte man das vermutlich innerhalb von Wochen oder Monaten erreicht, ich bin allerdings froh, dass wir nicht gewartet haben. Onkogen des Rous-Sarkom-Virus in der DNA verschiedener Vogelarten. Die obere Tafel hier zeigt die Genauigkeit der Sonde. Sie reagiert mit der RNA aus der sie transkribiert wurde, nicht aber mit der RNA des Deletionsmutanten. Die mittlere Tafel zeigt dass die Src-Sonde mit normaler Hühner-DNA reagiert, doch das tat auch eine Sonde für den Deletionsmutanten. Das beweist die Anwesenheit dessen, was wir endogene Retroviren nannten, die dafür bekannt sind, dass sie die Genome vieler Spezies, auch die unseren, angreifen. Die untere Tafel ist die Entscheidende. Nur die Src-Sonde reagierte mit der DNA anderer Vogelarten und dies war unsere erste Indikation dafür, dass wir etwas erfasst hatten, das nicht mit dem Retrovirus verknüpft war, und anders als die Genome der endogenen Retroviren, über bedeutende phylogenetische Distanzen konserviert wurde. Beachten Sie die Ergebnisse mit Emu DNA, unter den primitivsten überlebenden Vogelarten. Wir publizierten diese Ergebnisse 1976 in einer kurzen Notiz in Nature, zwei Abbildungen und zwei Tabellen. Die Simplizität täuschte über die außerordentliche Schwierigkeit der zugrundeliegenden Experimente und den bemerkenswerten Paradigmenwechsel hinweg. Wir waren erfreut, und offenbar auch das Nobelpreiskomitee. Wie haben die Zeiten sich jedoch geändert. Vor einer Woche erzählte mir ein Kollege, er habe eine Klasse Studenten gebeten, das Papier zu lesen. Ihre Reaktion? Die haben dafür einen Nobelpreis erhalten? Ja, das haben wir. Schrittweise arbeiteten wir daran, dass unsere Sonde ein normales zelluläres Gen erkennen konnte. Wir entdeckten, es war über weite polygenetische Distanzen konserviert, was seine lebenswichtige Funktion nahelegte. Wir entdeckten, dass normale Zelle ein Protein mit den gleichen biochemischen Eigenschaften enthielten, von gleicher Größe wie die des Src-Proteins und das in zahllosen Geweben exprimiert war. Und als wir endlich die rekombinante DNA verwenden konnten, um zelluläres Src zu klonen, hatten wir das Ganze besiegelt. Zelluläres Src verfügte über die strukturellen Besonderheiten eines normalen zellulären Gens, Das virale Onkogen Src hatte sich tatsächlich unerlaubt von der Wirtszelle als vollständig gespleißte Version des Vorfahren kopiert und zugleich hatte das zelluläre Gen eine Mutation erhalten, die es in ein Onkogen umwandelte. Bald wurde klar: Src war mehr als eine abseitige Merkwürdigkeit. Der Bestand der introviralen Onkogene wuchs ständig und jedes davon wurde vom Genom einer normalen Zelle abgeleitet. Für jedes virale Onkogen gab es in der Zelle ein verwandtes Proto-Onkogen. Zufälligkeiten der Natur hatten eine Batterie potentieller Krebsgene in normalen Zellen aufgedeckt. Das zelluläre Src Proto-Onkogen ist ein sich anständig verhaltender und vitaler Schalter im Signalgebungsnetzwerk normaler Zellen. Darüber wissen wir inzwischen eine Menge. Das virale Src-Onkogen ist jedoch ein mutanter Übeltäter, dessen Genprodukt ständig aktiviert wird, mit einer genetischen “Gain-of-function”, die Krebszellen erzeugt. Die Gain-of-function erwies sich in der einen oder anderen Weise auch für alle weiteren retroviralen Onkogene als richtig. Es war leicht sich vorzustellen, dass die Vielzahl zellulärer Proto-Onkogene gleichsam eine Klaviatur sein kann, auf der alle denkbaren Karzinogene spielen konnten und - unabhängig von den Viren - zelluläre Onkogene erzeugten, wobei beispielsweise kein Retrovirus intervenieren konnte. Dies hat sich als zutreffend herausgestellt. Proto-Onkogene, die eine Gain-of-function erhalten haben, sind praktisch unvermeidbare Eigenschaften aller menschlichen Tumore. Als solches sind sie wesentliche Triebkräfte für die Tumorentstehen und folglich Kandidaten für Ziele von neuen Therapeutika, was nun ein blühender Wirtschaftszweig ist. Mit Hilfe moderner Genominstrumente ließ sich die Zahl dieser Gene auf weit über zweihundert erweitern. Die Gain-of-function, die Onkogene erzeugt, lässt sich durch verschiedene Methoden beeinträchtigen. Zuerst die Gewinne von Chromosomen oder fokale Genamplifikation, die beide die Gendosierung erhöhen. Chromosomale Translokationen, die entweder die Steuerung der Genexpression stören oder Bastard-Genprodukte erzeugen, die nicht richtig arbeiten. Punktmutationen, die die Steuerung der Genexpression unterbrechen oder nichtfunktionierende Genprodukte schaffen, und defekte epigenetische Steuerung der Genexpression. Alles das wurde in menschlichen Tumoren gefunden. Das Endergebnis ist aber immer das Gleiche: Das Äquivalent eines blockierten Gaspedals mit der Kapazität, die Tumorentstehung voranzutreiben. Die Signalübertragung normaler zellulärer Gene in Onkogenen durch Retroviren, ein Missgeschick der Natur, zeigte zum allerersten Mal die genetischen Merkmale von Krebs. Was sind die Faktoren, die diese Entdeckung förderten? Hier sind einige für die Studenten. Zu allererst, ein Auge für die beste Gelegenheit. David Baltimore entdeckte bei seinem allerersten Experiment eine reverse Transkriptase mit einem RNA-Tumorvirus. Er hatte zuvor nicht daran gedacht, aber er sah die Gelegenheit und ergriff sie. Umsichtige Missachtung der bestehenden Weisheit. Beachten Sie Temin und Baltimores wohlwollende Vernachlässigung eines zentralen Dogmas. Den Willen, etwas aufs Spiel zu setzen. Beachten Sie all die Jahre, die sie der zellulären Src nachjagten, was sich leicht als närrischer Irrtum hätte herausstellen können. Vertrauen in die Allgemeingültigkeit der Natur. Das Beispiel? Unsere Überzeugung, es gäbe etwas über den menschlichen Krebs zu lernen, indem man einen Hühnervirus untersuchte, wenn auch nicht in irgendjemandes Wohnzimmer. Die Wahl des experimentellen Systems. Der Anziehungskraft, die mich zum Rous-Sarkom-Virus führte. Technische Innovation. Das Assay, mit dem das zelluläre Src gefunden wurde. Und Selbstvertrauen. Howard Temins fokussiertes Verfolgen einer Idee über mehr als ein Jahrzehnt im intellektuellen Exil, wobei er die Provirus-Hypothese ungläubigen Ohren verkündete. Ich schließe also mit einem lauten Ruf zum Rous-Sarkom-Virus, der ein wertvoller Freund der Krebsforschung wurde. Bedenken Sie seinen Ursprung. Die Demonstration, dass Viren Krebs erregen. Reverse Transkriptase, eine wahrhaft revolutionäre und produktive Entdeckung. Das erste Beispiel eines Gens, das unmittelbar Krebs verursacht, Src. Dergleichen hatte man zuvor nie gesehen. Die Rolle der Protein-Kinasen bei der Tumorentstehung. Phosphorylierung von Tyrosin, nun maßgeblich bei der Zell-Signalgebung und vorrangiges Ziel bei Krebstherapien. Proto-Onkogene, der erste flüchtige Blick auf eine genetische Klaviatur für Karzinogene. Und bis heute, das auch noch: fünf Nobelpreise. Nicht schlecht, für ein Huhn. Vielen Dank

J. Michael Bishop (2015)

A Virus, a Gene and Cancer: An Anatomy of Discovery

J. Michael Bishop (2015)

A Virus, a Gene and Cancer: An Anatomy of Discovery

Abstract

I will explore a sequence of discoveries that spanned three-quarters of a century and culminated in the realization that the seeds of cancer reside in our own genomes. Harold Varmus will then explain where that realization has taken us in the struggle to understand and control cancer. In 1911, Peyton Rous reported the discovery of a virus that can cause sarcomas in chickens. Disparaged by many and neglected for decades, Rous Sarcoma Virus (RSV) eventually emerged as a highly tractable experimental system with which to probe the secrets of the cancer cell. RSV posed two great puzzles: how might its RNA genome be replicated and stabilized in the host cell, and how does the virus convert cells to malignant behavior? The first puzzle was solved by the discovery of reverse transcriptase, an enzyme in the viral particle that copies RNA into DNA, which is then inserted into the host genome. The second puzzle was solved when the virus was found to have an “oncogene” (v-src) that encodes a protein tyrosine kinase. The fact that v-src plays no role in viral replication raised the possibility that the gene had not originated in concert with the remainder of the viral genome, but instead had been acquired by accident from an external source. That proved to be the case, when a virtually identical homologue of v-src (c-src) was found in avian and other vertebrate cells. By elaborate molecular gymnastics, a cellular gene (or “proto-oncogene”) had been copied into the viral genome, in the process suffering a mutation that created an oncogene. It soon became apparent that normal vertebrate cells contain a large variety of proto-oncogenes, perversions of which have been implicated in the genesis of human cancer. A first step had been taken towards the realization that all cancer arises from the malfunction of genes.

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