Venkatraman Ramakrishnan (2015) - Seeing is Believing - A Hundred Years of Visualizing Molecules

It has been a hundred years since molecules were first visualized directly by using x-ray crystallography. That gave us our first look at molecules as simple as common salt to one as complex as the ribosome that has almost a million atoms

Kurt Wuethrich said, "You aren't 120 years old“ because my talk was called "120 Years of Visualizing Molecules“. So clearly, it's not going to be about my work. But after hearing 2 of the last 3 talks, I should say it's "100 years of visualizing molecular structure", because those are 2 somewhat different things. The first thing is, how did we even get to the idea that there are molecules? That's an amazing intellectual journey made by humans in the 18th and 19th century. And for those of you who are interested in knowing how we went from knowing nothing about the organization of ordinary matter to understanding molecular structure, I highly recommend this book. The point is that even before we could see molecules, we really knew a lot about what molecules were like and what their structures would be like. How do we actually see molecules? How do we directly visualize molecules? You heard 2 really amazingly brilliant talks about how to resolve fluorescent molecules beyond the Abbe limit and even in live cells, and that's really transforming biology. But now we come to the reality check that was discussed in the last talk. These techniques can show us where molecules are but not what their structure itself is. Because most of the atoms are not fluorescent, they simply scatter light, and so for the vast majority of atoms in any sample, the Abbe limit unfortunately still applies. In fact, it's ironic that if you want to know the structure of a fluorescent molecule or GFP, you can't use these super-resolution microscopy. You have to use something else. And what that something else is for the last 100 years was x-rays. X-rays are waves, and for that Max von Laue, for that discovery, won the Nobel Prize in, I believe, 1914. He showed that when he hit x-rays on a crystal, he would get these spots. Actually, he misinterpreted these spots, so he didn't get the analysis of these spots correct. That was done by a graduate student, Lawrence Bragg who, for his PhD work, went on to become the youngest ever Nobel laureate and still is the youngest one in science. In fact, because it was his original work, his supervisor didn't get the Nobel Prize because these were all published on his own. And that still remains something of a Cambridge tradition, not always honoured, I'm afraid, but still there. How did this work? What Bragg realized is that if you take crystals, which are regular 3-dimensional arrays of molecules, and you hit them with a beam of x-rays, then, because you have these arrays, you'll get interference. And that interference reinforces the x-rays only in certain directions and that gives rise to spots, which are now called Bragg reflections. If you collect these spots, then that's what this looks like. The point is that these scattered rays are there, whether there's a lens there or not. So the light rays - you can have a lens that recombines these scattered rays to form an image. With x-rays, you don't have a convenient lens, and so you have to recombine them in some other way. What you do is you measure them and you recombine them mathematically, which is equivalent to doing a Fourier transform, and you then get an image of the object. Since x-rays have wavelengths of about 1.5 Angstroms or now even shorter, you can resolve things, which are less than 1 Angstrom apart. And so you can actually resolve the atoms apart in a molecule. The first such structures were determined using guess work because there were only a few spots, so you could guess at the structure of your molecule and you could see if it agreed with the pattern of spots. Using that was the first surprise. The first molecule structure that Bragg discovered was was sodium chloride, just has 2 atoms, sodium and chlorine, and he found there was no sodium chloride molecule. This caused a big fight with the chemist who said that he's a physicist and he doesn't understand any chemistry and he's talking nonsense. Of course, this is one of the many ways in which crystallography has actually influenced chemistry. Now, subsequently, as it got more complex, people had to use mathematics to recombine those spots using Fourier methods to reconstruct an image of the molecule in order to be able to interpret it. In those days, there were no computer graphics. And so what they had to do was to take the Fourier density and contour it on these plastic plates and stack them up, That's how they'd look at their three-dimensional image of the molecule, But you can see here that these round blobs represent the atoms, you can actually see separate atoms, and so you can see what the atomic structure of the molecule is. This particular molecule was penicillin determined by Dorothy Hodgkin who is shown here on the postage stamp. She's the only scientist, I believe, in Britain who has 2 postage stamps at 2 different times after her. This shows the structure of penicillin, which again was a little bit of a controversy because of this rather square beta-lactam ring, which some chemist didn't believe existed because it would cause strain. Again, it's an example of how molecular structure has illuminated chemistry. Now, these kinds of methods were useful for molecules for a few up to a hundred atoms or even a couple of hundred atoms. But when you get to proteins, they consist of thousands of atoms, and that required another way of calculating the image. That was done by 2 people who founded the lab where I work, which is Max Perutz, who was Bragg's protégé, and John Kendrew, who was Bragg's PhD student originally. These are the molecules that they looked at at the bottom. This is haemoglobin and this is myoglobin. These are 2 oxygen-carrying proteins in our blood. That person in the middle is Gisela, who is Max's wife, and she's pinning a carnation on his coat doing the Nobel ceremony. Now, when you get a typical protein structure, you don't have enough detail to see individual atoms as little spheres as you saw in that picture of penicillin. So the question is, how would you go about looking at a molecule at an image and actually getting an atomic structure out of it. It's a little bit like solving a jigsaw puzzle. This would be what a 3-dimensional image of the molecule looks like. This happens to be the small subunit of the ribosome. It has about 200,000 atoms in it. What you would do is you would zoom in on it and look for things you recognize. If you see here, there are 2 ridges, 1 here and 1 here, and if you know what you're doing, you realize that these are 2 chains of nucleic acid that are wrapped around each other to form a double helix. And so suddenly you can start building in your molecular pieces into this image just like you would fit in a jigsaw puzzle, except it's a 3-dimensional puzzle, and you don't know the answer beforehand because it's not on the cover of the box. Now you suddenly have a molecular structure from an image. But it's only part of the structure, so what you have to do is figure out where it is, and you have to keep on building until you've essentially interpreted this entire molecule. Basically, until you've got no density, which is no part of the image left to interpret, you just keep on going and you end up with a complete structure. Now, this is a sort of process by which every molecule has been directly imaged for the last 100 years, just about. There are other ways of determining molecular structure. Kurt Wuethrich, as you know, invented a way of determining molecular structure by NMR, but this is by a set of constraints on a chain, which tells you how the chain will be folded and how groups in the chain will be arranged. It's not a direct visualization, or imaging, like crystallography or like optical microscopy. This technique went from sodium chloride, which is 2 atoms, and it's capable of determining the complete atomic structure of something like a whole ribosome, which is half a million atoms. And in fact, now we have a structure of the ribosome from higher organisms, which is close to a million atoms. So you can see it's an incredibly powerful technique that's transformed chemistry, and it's one reason why so many chemistry Nobel Prizes have gone for molecular structure. The problem is that when you're studying more and more complex molecules, it's harder and harder to get them to crystallize. Many of my people have spent years trying to crystallize something unsuccessfully. The other problem is many molecular assemblies are transient. They don't stay stable enough and they're not confirmationally homogeneous enough to be able to crystallize them and solve by x-ray crystallography. It leads to a question. I'm a ribosome biologist. I'm not really what you would call an x-ray crystallographer, and so it made me realize, what exactly is my goal? If you don't understand what your goal is, you can be in trouble. When I was a child, if someone had told me that Kodak would go bankrupt, I would've thought they were completely insane. And yet, after 131 years, Kodak became bankrupt because it didn't realize that its goal, it was in the imaging business, not in the film business. In fact, although they made one of the first really good digital chips for photography, some guy in Kodak apparently decided that they didn't want to push that too much because it would cannibalize their film business. Bad mistake. Okay. I didn't want to make that sort of mistake. So looking around, there is another technique, which is electron microscopy, which has the right sort of wavelength to look at molecular structure. This is Ernst Ruska on the left and that's his electron microscope on the right. What you'll notice is that he had to wait 53 years after his discovery to get his Nobel Prize, and he only died 2 years after he got his Nobel Prize. It's something of a record for the amount he had to wait for the Nobel Prize. Material scientists have also always been able to determine atomic structures using electron microscopy, almost since its inception. But the contrast and complexity of biological molecules meant you couldn't do it that for biological molecules. How did electron microscopy get used in biology? A classic way is to cut sections of cells and stain them with some heavy atom and look at what the cells look like, so these are ultra-structures of cells that are familiar from every textbook. But that's not what I mean. What I mean is how do you get at molecular structures using electron microscopy in biology? One of the first big advances was done by David De Rosier and Aaron Klug. This is a picture, a diagram from their paper in Nature in 1968, which was reproduced in Aaron Klug's Nobel Lecture in 1982. The idea is that if you have a sample here and you shine a beam of electrons, what you get when you have an image, when you focus it to form an image, is a 2-dimensional projection of the molecule or of the object. Now, if you were to look at it from a different direction, you would get a different 2-dimensional projection and same here. If you were able to combine all these 2-dimensional projections, you might be able to get a 3-dimensional structure of the object. Of course, in an electron microscope you don't change the direction of the beam. What you would do is you would tilt the sample, you would rotate the sample and that way you would sample different views. One of the things that De Rosier and Klug realized is that if you take a Fourier transform of the 2-dimensional image of the object, it would be like a plane in Fourier space. And so if you collected all these planes and then did a reverse transform of the Fourier planes, you would get back a 3-dimensional image of the object. Those of you who are more in the cell biology medical side, I can tell you this is exactly how CAT scan works. You get different projections of your object, and there's a way to recombine the projections to get a 3-dimensional image. The problem with this is that biological samples have very low contrast, so you have to stain them in order to see them very well. That's one problem. The other problem is if you don't stain them, the contrast is so low that you have to hit them with enough electrons to see them. And electrons are damaging, so if you rotate your sample, you have to collect a whole series of images. By the time you finish collecting your series, your sample is dead. You've destroyed your molecular structure. There are a couple of ways around that. One is if you have a mixture of the same molecule and you're looking at all of them at the same time, these molecules will all be in different orientations, and each of them will give rise to a different projection. Now, the trick is to find out which orientation of this molecule gave rise to this projection and same for this molecule and same for this molecule. If you can figure that out, then you know that if you have a molecule, you know that this projection here corresponds to this view, this projection here corresponds to this view, this projection corresponds to this view, so you get thousands of views at the same time. What this means also is that you don't have to hit the molecules very hard. You get the power of averaging from all these thousands of molecules, and so you can get a 3-dimensional structure. The other really major advance that has come out is that, by embedding these molecules in ice that has been cooled so rapidly that it doesn't crystallize to form crystalline ice (so it's what we call vitreous ice), you can look at these molecules in effectively their native state. And so you can look at very large complexes in their native state. The problem is that even when you do that, they're incredibly noisy. This is a field of ribosomes, which are fairly large molecules, and people in this field joke that the ribosomes are a particularly easy sample to work with. But nevertheless, if you look at what an individual projection of the molecule looks like, you can see it's barely visible. You can hardly see what it looks like and let alone get some sort of atomic structure. And yet, remarkably, this technique was used to get something at about 27 Angstroms resolution of the ribosome. It's the first time in the ribosome that you could actually visualize tRNA molecules inside the ribosome. Even though crystals of the ribosome had been around for about 15 years at this point, these were in 1995 by far the best images we had of ribosomes. Of course, they were soon superseded in the next few years by crystallographic methods. But nevertheless, it showed that you could get something about the shape of molecules by using this. But could you use this method to get structures of biological molecules? No one thought it was possible at the time, in 1995, because a very large molecule, which should be easy to see in a line, could only give you about 27 Angstroms resolution. But that very same year, there was actually a seminal paper that was published by another person who works in my lab - who was the director of the lab, who actually hired me, although I'm now his boss, I should say. He published this paper, which was essentially a theoretical paper that had come out of studies he had done on bacteriorhodopsin. And what he suggested was that with electrons, if you had molecules which were only about 100,000 Daltons or bigger, you should be able to determine the atomic structure with only 10,000 molecules. What did he mean by atomic structure? He meant 3 Angstroms resolution. Now, 15 years later, there were still no atomic structures except for viruses, which involved very large symmetric molecules that combined millions and millions of copies of the molecules. It wasn't clear that this thing would ever materialize, although no one could ever find a mistake in Richard's paper. In fact, everybody agreed that he was right and it wasn't clear what was happening, although Richard, himself, knew what the limitations were and was working on them for the last 20 years. Now, we have another Resolution Revolution - and that's not my term, that's the term of Werner Kuhlbrandt who wrote this perspective that accompanied our paper in Science last year on the mitochondrial ribosome. If you want to know in detail what's happened, I suggest that you read this very short perspective, which gives you an idea of what's happened in the field. But I'll just briefly tell you. There are 2 main advances. Firstly, we've had better microscopes over the last 20 years. We have better stages, more stable microscopes, et cetera, but that didn't take us to this point. It improved things but not to the point where we could get atomic structures. What has happened in the last few years is that we've had better detectors and better ways of processing the data. The first thing are better detectors. Classically, the way to detect electrons was by using film. Film is a reasonably good electron detector. It is actually a direct detector. To call these new electronic detectors 'direct detectors' is a slight misnomer, because so is film. Film is also slow and laborious. You have to scan it. It has its own problems of uniformity and noise and so on. Along the way, CCD detectors came out. But CCD detectors are actually a very bad electron detector because they take electrons, convert them to fluorescent light, and then that light is detected via fibre-optic into a CCD chip. Richard used to tell people that if you want to degrade your data and get worse data, then you should abandon film and go to CCDs. In the meantime, a new class of detectors based on CMOS chips have combined the advantages of film in that they directly detect electrons with the convenience of CCDs in that you don't have to develop and scan films and so on. They have better signal to noise than film, significantly better DQE than film, so they're more sensitive than film. The other thing that's happened is better image processing, better algorithms to look at these very noisy images and get the most out of them. The way we got into EM is because this post-doc, Israel Sanchez, spent 3 years trying to crystallize a ribosomal complex and was getting nowhere. And out of frustration, he decided to collaborate with another post-doc, Xiao-Chen Bai, who was working for my colleague, Sjors Scheres, and these 2 guys were doing electron microscopy. What they did was to figure out what his samples looked like. But to do that, first he thought, let me just put a test sample of ribosomes and see what I can get now, and then I'll look at my complex. Now, there are 2 things that happened. One is that it turns out that whenever electrons hit a sample, they ionize the sample. And if you're in a non-conductive medium like ice, vitreous ice, this creates very large local fields. It's a phenomenon called charging. And the molecules start to move because they're charged and they're experiencing these strong local fields. The moment you hit your sample, from the minute you start looking at it, the samples are moving around. This is just to show you what beam-induced movements look like. I'm showing it to you after the fact because now we can actually track them, but this is a problem. Now, the thing about these new detectors is that they're very fast, so we may be able actually be able to do something about these beam-induced movements. The first thing that these new algorithms do is that if you look at this image here, it's extremely noisy. And what you have to do is ask, what is the orientation of the molecule that gave rise to this particular projection? In order to do that, you do a mathematical thing. You calculate all possible projections and you decide which projection matches the observed projection. That's basically the essence of the idea. But if it's noisy, an incorrect projection can sometimes give you better agreement than the real orientation of the molecule. This is a classic problem with noisy data that you can converge on the wrong minimum. What Sjors Scheres did was apply a very well-known statistical method called Bayesian likelihood to this problem. So rather than asking what's the best align orientation of the molecule that matches this projection, he asked, By storing that entire Bayesian probability and then using all of that to do the recombination, you can arrive with a very robust and much more accurate 3-dimensional reconstruction of the molecule. The other thing I alluded to was the beam movement. Now, it turns out that these detectors are so fast, that what you're seeing here is a 1-second image, and that's what a 1-second projection of a particle looks like. But this 1-second image is actually 16 frames that are shown here. You might ask, if I could just watch this molecule move along these frames, then I might be able to track the movement of the molecules. In order to do that, you have to be able to detect the molecule within the frames. Now, clearly, if you add up all 16 frames, there's enough signal there to see the molecule and align it. Now, it turns out for ribosomes, you can do it for 8 frames, you can do it for 6 or 4 frames, but you can't do it for 2 frames - because it becomes so noisy that you get errors in the location and orientation of the molecule, so it's not good enough. What we can do is do a 4-frame average and then do a moving 4-frame window across those 16 frames. And what this does is it allows you to track the movement of the molecule during that 1 second. Once you can track it, what you can do is you can apply a correction for the movement to each one of those frames, and then add up the corrected frames. So now you have a projection that's corrected for the movement, so it's not blurred; it's effectively deblurred. Doing that what Sjors and his colleagues along with my post-doc, Israel, did was they took just 30,000 particles of the ribosome, and they could actually separate these molecular strands, which are called beta strands. And they could look at the helical structure of alpha helices and even see density for the side chains of helices. Suddenly, it looked like you could do atomic structures by electron microscopy. That indeed is what 2 other post-docs in my lab applied to a problem that had essentially defeated crystallographic methods for over a decade. And that is the structure of mitochondrial ribosomes. This is Alexey Amunts, who essentially started this mitochondrial project in my lab and really drove all of the biology. And this is Alan Brown, who did a brilliant job of interpreting what was an amazingly complex structure about which very little was known previously. These structures were published in 3 papers in Science over the last year, and that's just to tell you that the Nobel Prize doesn't have to mean the kiss of death. I know that there is a temptation after you get the prize to go around giving talks and being wined and dined. But if you say no to most of these invitations and really drive science in your lab and remember what actually got you into science in the first place, you can still be publishing important papers. Incidentally, Alexey Amunts is going to where Astrid works, which is the University of Stockholm, as a faculty member. The question is what are mitochondrial ribosomes and why are they interesting? Mitochondria are the energy powerhouses of our cell; they're organelles in our cell, But the way they are thought to have originated is that 2 billion years ago, 1 cell swallowed another cell. And the cell that it swallowed, which was now inside a bigger cell, eventually evolved to become mitochondria. But because, as species diverged, the mitochondria from 1 species could not recombine with the mitochondria from other species, the mitochondria of various species diverged in their own way and they're incredibly divergent. What Alexey did was to look at these mitochondrial ribosomes, and he found that there were a mixture of many different types of particles. And so this is not something that would ever have crystallized. Yet, using this method of electron microscopy, we can sort out mixtures of particles, and it can even sort out mixtures of different confirmations of the same particle in the object, which a crystallographic method could never do. He could get images that were detailed enough to build a molecular structure, so he and Alan Brown went on to build this molecule, which has almost a million atoms in its entirety. In fact, we have built 80 proteins, which have very little sequence homology with what was known. What this does is, it means that people who want to look at molecular structure are no longer at the mercy of having to crystallize something, which involves producing large amounts of stable homogeneous material. They can look at even mixtures of samples. They can look at molecules that assemble transiently and so on. And so just as these revolutions in optimal microscopy are going to transform cell biology, the revolution in electron microscopy is going to transform molecular structural biology. Thank you very much.

Kurt Wüthrich sagte: „Sie sind nicht 120 Jahre alt“, denn mein Vortrag wurde als „120 Jahre Visualisierung von Molekülen" betitelt. So wird es also klar: es geht nicht um meine Arbeit. Aber nach 2 der letzten 3 Diskussionen würde ich sagen, es lautet korrekt „100 Jahre Visualisierung der molekularen Struktur“, weil diese 2 etwas andere Themen angehen. Zunächst geht es um die Frage, wie wir auf die Idee gekommen sind, dass es Moleküle gibt. Das ist eine erstaunliche intellektuelle Reise der Menschen ins 18. und 19. Jahrhundert. Und für diejenige von euch, die es interessiert, wie wir vom Nichtwissen über die Organisation der herkömmlichen Materie zu Erkenntnis der Molekülstruktur kamen, empfehle ich dieses Buch. Es geht darum, dass noch bevor wir die Moleküle sehen konnten, wir wirklich viel darüber wussten, wie sie aussehen und wie ihre Strukturen aussehen. Wie sehen wir Moleküle? Wie können wir Moleküle visualisieren? Sie hörten 2 wirklich erstaunlich brillante Vorträge darüber an, wie man fluoreszierende Moleküle jenseits des Abbe-Limits und sogar in lebenden Zellen auflöst, und das ändert die Biologie ganz grundlegend. Aber jetzt kommen wir zum Realitätscheck, der während der letzten Diskussion angesprochen wurde. Diese Verfahren können uns zeigen, wo Moleküle sind, aber nicht, wie ihre Struktur ist. Da die Mehrheit von Atomen nicht fluoreszierend ist, streuen sie einfach das Licht, und dadurch gilt das Abbe-Limit leider noch immer für die überwiegende Mehrheit von Atomen in den Proben. Tatsächlich ist es ironisch, dass wenn Sie die Struktur eines Fluoreszenzmoleküls oder eines GFP wissen möchten, dann können Sie diese superauflösende Mikroskopie nicht benutzen. Sie müssen etwas anderes nutzen. Und etwas anderes schließt im Zeitrahmen der letzten 100 Jahre auch Röntgenstrahlen ein. Die Röntgenstrahlen sind die Wellen, für deren Entdeckung Max von Laue den Nobelpreis gewann, ich glaube 1914. Er zeigte, dass bei der Bestrahlung eines Kristalls mit den Röntgenstrahlen diese Flecken erscheinen. Eigentlich missdeutete er diese Flecken und erstellte eine fehlerhafte Analyse dieser Flecken. Das wurde von einem graduierten Studenten Lawrence Bragg gemacht, der für seine Doktorarbeit zum jüngsten Nobelpreisträger wurde und es immer noch ist. Und weil es seine eigene Arbeit war, erhielt sein Studiengangsleiter keinen Nobelpreis, weil die Arbeit ohne seine Hilfe veröffentlicht wurde. Und so etwas gehört noch immer zur Cambridge Tradition, leider nicht immer gebührend umgesetzt, aber noch immer existent. Wie sind die Details dazu? Bragg stellte fest, dass wenn man Kristalle nimmt, die reguläre dreidimensionale Anordnungen von Molekülen darstellen, und diese mit einem Röntgenstrahlenbündel bestrahlt, man dann eine Interferenz erhält, weil die Moleküle eine besondere Anordnung haben. Und die Interferenz verstärkt die Röntgenstrahlen nur in bestimmten Richtungen und verursacht Flecken, die jetzt als Bragg-Reflexionen bekannt sind. Wenn sie diese Flecken sammeln, dann sieht es so aus. Der Punkt ist, dass diese Streustrahlen da sind, unabhängig davon, ob eine Linse dort vorhanden ist oder nicht. Auch die Lichtstrahlen - man kann eine Linse haben, die diese Streustrahlen rekombiniert, um ein Abbild zu schaffen. Mit Röntgenstrahlen haben Sie keine geeignete Linse und deswegen müssen Sie diese auf eine andere Weise neu rekombinieren. Sie müssen sie messen und mathematisch rekombinieren, wie bei einer Fourier-Transformation, und Sie erhalten dann ein Abbild des Objekts. Da die Röntgenstrahlen Wellenlängen von etwa 1,5 Angström oder kürzer aufweisen, können sie Objekte auflösen, die weniger als 1 Angström voneinander entfernt sind. Und damit können Sie effektiv die Atome in einem Molekül auflösen. Die ersten solchen Strukturen wurden durch eine Raterei bestimmt, weil es nur ein paar Flecken gab, so dass man anhand der Struktur der Molekül Vermutungen anstellte, und man dann prüfte, ob sie mit dem Fleckenmuster übereinstimmte. Das bot die erste Überraschung. Die erste Molekülstruktur, die Bragg entdeckte, war Natriumchlorid, und hatte nur 2 Atome, Natrium und Chlor, und er fand heraus, dass es kein Natriumchlorid-Molekül gab. Dies rief einen großen Streit mit den Chemikern hervor, die sagten, er sei ein Physiker und er verstehe nichts von der Chemie und er rede Unsinn. Natürlich, ist es eine der vielen Arten, mit denen die Kristallographie tatsächlich Chemie beeinflusste. Nunmehr, da es immer komplizierter wurde, mussten die Menschen die Mathematik verwenden, um diese Flecken mit Fourier-Methoden zu rekombinieren, um so ein Abbild des Moleküls zu rekonstruieren und es zu interpretieren. Damals gab es keine Computergrafik. Und sie mussten die Fourier-Dichte nehmen, sie auf diesen Kunststoffplatten umreißen und die aufstapeln. Dadurch konnten sie ihr dreidimensionales Bild des Moleküls sehen, Aber Sie können hier sehen, dass diese runden Punkte die Atome darstellen, Sie können tatsächlich vereinzelte Atome sehen und damit können Sie sehen, wie die Atomstruktur des Moleküls aussieht. Dieses spezielle Molekül war Penicillin, das durch Dorothy Hodgkin bestimmt wurde, die hier auf der Briefmarke abgebildet ist. Sie ist die einzige Wissenschaftlerin, so glaube ich, die in Großbritannien auf 2 Briefmarken zu 2 verschiedenen Zeiten dargestellt wurde. Dies zeigt die Struktur von Penicillin, die wiederum aufgrund dieses eher quadratischen Beta-Lactam-Rings etwas umstritten war, weil einige Chemiker nicht einmal an deren Existenz glaubten, da sie Ringspannungen haben würden. Wiederum es ist ein Beispiel dafür, wie Molekülstruktur die Chemie verbessert. Diese Verfahren waren für Moleküle hilfreich, die aus wenigen bis 100 Atomen, oder sogar einigen 100 Atomen bestanden. Aber wenn man Proteine nimmt, wird sich herausstellen, dass die aus Tausenden Atomen bestehen, und somit eine andere Art der Berechnung des Abbildes nötig ist. Das wurde von 2 Personen gemacht, die das Labor gründeten, in dem ich arbeite: Max Perutz, der ein Protegé von Bragg war, und John Kendrew, der ursprünglich ein Doktorand von Bragg war. Dies sind die Moleküle, die sie betrachteten. Es handelt sich um Hämoglobin und Myoglobin, Hier in der Mitte ist Gisela, die Frau von Max, und sie heftet eine Nelke auf sein Jackett während der Nobel-Zeremonie. Wenn Sie eine typische Proteinstruktur haben, gibt es nicht genug Details, um einzelne Atome als kleine Kugeln zu sehen, wie es beim Penicillin der Fall war. Also ist die Frage, wie Sie vom Abbild des Moleküls zu seiner eine Atomstruktur kommen können. Es sieht ein bisschen so aus, als wäre das ein Puzzlespiel. Ungefähr so sieht ein 3-dimensionales Bild des Moleküls aus. Hier wird die kleine Untereinheit des Ribosoms gezeigt. Es weist etwa 200.000 Atome auf. Sie müssen nur das Bild vergrößern und nach den erkennbaren Teilen suchen. Wenn Sie hierher sehen, finden Sie 2 Kämme, einen hier und einen hier, und wenn Sie wissen, was Sie tun, werden Sie erkennen, dass es sich um zwei Ketten der Nukleinsäure geht, die umeinander in der Form einer Doppelhelix gewunden sind. Und plötzlich können Sie wie bei einem Puzzle die molekularen Stücke zu einem Bild zusammenfügen, mit dem Unterschied, dass es ein 3-dimensionales Puzzle ist, und Sie die Antwort im Voraus nicht wissen, weil sie nicht auf dem Deckel der Schachtel abgebildet ist. Und jetzt haben Sie plötzlich aus einem Bild eine Molekülstruktur abgeleitet. Aber es ist nur ein Teil der Struktur und Sie müssen herausfinden, wohin es gehört, und Sie müssen weiterbauen, bis Sie das gesamte Molekül zusammengesetzt haben. Eigentlich bauen Sie so lange, bis Sie keine Dichte mehr haben, die Teil des zu deutenden Bildes wäre, und haben am Ende dann eine komplette Struktur. Nun, dies ist eine Art von Prozess, mit dessen Hilfe jedes Molekül direkt während der letzten 100 Jahre abgebildet wurde. Es gibt andere Möglichkeiten zur Bestimmung der Molekülstruktur. Kurt Wüthrich, wie Sie wissen, erfand eine Methode zur Bestimmung der Molekülstruktur durch NMR, durch eine Reihe von Einschränkungen innerhalb einer Kette, die die Form der Kette und Anordnung der Gruppen an der Kette definiert. Es ist nicht eine direkte Visualisierung oder Bildgebung wie es die Kristallographie oder die Lichtmikroskopie ist. Dieses Verfahren kam von Natriumchlorid, das aus 2 Atomen besteht, und es kann die vollständige Atomstruktur von so etwas wie einem ganzen Ribosom bestimmen, das eine halbe Million Atome aufweist. Und in der Tat, jetzt haben wir eine Struktur des Ribosoms von höheren Organismen mit fast einer Million Atomen abgebildet. So können Sie sehen wie dieses unglaublich leistungsfähige Verfahren die Chemie veränderte und es ist ein Grund, warum so viele Nobelpreise für Chemie auf dem Gebiet der Molekülstruktur verliehen wurden. Das Problem besteht darin, dass wenn Sie immer komplexere Moleküle studieren, es immer schwerer wird, sie zu kristallisieren. Viele meiner Leute haben jahrelang erfolglos versucht, bestimmte Moleküle zu kristallisieren. Das andere Problem besteht darin, dass viele Molekülgebilde instabil sind. Sie bleiben nicht stabil genug und sie sind nicht konformativ homogen genug, um zu kristallisieren und durch Röntgenkristallographie abgebildet zu werden. Das wirft eine Frage auf. Ich bin ein Biologe der Struktur von Ribosomen untersucht. Ich bin kein echter Röntgen-Kristallograph, und daher kam mir die Frage, was ich wirklich sein will und tun will. Falls Sie nicht wissen, was Ihr Ziel ist, können Sie in Schwierigkeiten geraten. Falls jemand früher gesagt hätte, dass Kodak Pleite gehen würde, hätte ich ihn für verrückt gehalten. Und jetzt 131 Jahre später ist Kodak bankrott, weil die Firma nicht erkannte, dass ihre Zukunft im Bildverarbeitungsgeschäft und nicht im Filmgeschäft lag. Und das obwohl sie einen der ersten wirklich guten digitalen Chip für die Fotografie bauten, denn irgendjemand bei Kodak beschloss offenbar, nicht zu weit zu entwickeln um das Filmgeschäft nicht zu gefährden. Ein großer Fehler. Gut. Ich wollte nicht solche Fehler begehen. Wenn man sich umsieht, findet man eine andere Technik - die Elektronenmikroskopie, die die richtige Wellenlänge hat um Molekülstruktur zu betrachten. Hier links ist Ernst Ruska und hier rechts ist sein Elektronenmikroskop. Sie werden sehen, dass er 53 Jahre auf die Verleihung des Nobelpreises warten musste, und er starb nur 2 Jahre nachdem er den Nobelpreis erhielt. Es muss so etwas wie die Rekord-Wartezeit für den Nobelpreis sein. Die Materialwissenschaftler waren auch immer in der Lage, die Atomstruktur mit Hilfe der Elektronenmikroskopie fast seit ihrer Erfindung zu bestimmen. Aber der Kontrast und die Komplexität der biologischen Moleküle bedeuteten, dass man es bei biologischen Molekülen nicht machen konnte. Wie wurde die Elektronenmikroskopie in der Biologie eingesetzt? Ein klassischer Weg wäre, die Schnitte von Zellen zu machen und diese mit Schweratomen zu färben und dann die Zellen anzusehen, jene Feinstrukturen von Zellen, die uns aus jedem Lehrbuch vertraut sind. Aber das habe ich nicht gemeint. Was ich meinte ist, wie man die Molekülstrukturen mittels der Elektronenmikroskopie in der Biologie erhält. Pioniere waren hier David De Rosier und Aaron Klug. Dies ist ein Bild, ein Diagramm, aus ihrem Artikel in Nature aus dem Jahr 1968, wiedergegeben in Aaron Klugs Nobelpreisrede im Jahre 1982. Die Idee bestand darin, dass wenn Sie eine Probe hier haben und sie mit einem Elektronenstrahl durchstrahlen, und das Bild dann bündeln um ein Bild zu erzeugen, dann haben Sie eine zweidimensionale Projektion des Moleküls oder des Objekts. Nun, wenn Sie aus einer anderen Richtung daraufschauen, würden Sie eine andere zweidimensionale Projektion erhalten. Falls Sie imstande sind, alle diese zweidimensionalen Projektionen zu kombinieren, könnten Sie möglicherweise eine 3-dimensionale Struktur des Objekts erstellen. Natürlich ändert man in einem Elektronenmikroskop nicht die Strahlrichtung. Man kann aber die Probe drehen und auf diese Weise verschiedene Ansichten verprüfen. De Rosier und Klug erkannten eine Regelmäßigkeit, dass wenn sie eine Fourier-Transformation des zweidimensionalen Abbildes des Objekts vornahmen, dann wäre sie wie eine Ebene im Fourier-Raum. Und wenn Sie alle diese Ebenen zusammenführen und dann die Fourier-Ebenen umgekehrt transformieren, erhalten Sie wieder ein 3-dimensionales Abbild des Objekts. Denjenigen unter Ihnen, die in der Zellbiologie mehr auf der medizinischen Seite sind, kann ich sagen, dass es genau wie Computertomographie funktioniert. Sie haben verschiedene Projektionen des Objekts, und es gibt einen Weg, diese Projektionen zu rekombinieren, um ein 3-dimensionales Abbild zu erhalten. Das Problem dabei ist, dass biologische Proben einen sehr niedrigen Kontrast aufweisen, und deswegen diese einzufärben sind um sie gut zu sehen. Das ist das eine Problem. Ein anderes Problem ist, wenn Sie diese nicht färben, dann ist der Kontrast so gering, dass Sie viele Elektronen brauchen um ein gutes Abbild zu haben. Und Elektronen sind schädigend, und bis Sie Ihre Messreihe abgeschlossen haben, die aus vielen Einzelmessungen besteht, wird Ihre Probe tot sein. Sie haben ihre Molekülstruktur zerstört. Es gibt ein paar Möglichkeiten, das zu vermeiden. Eine besteht darin eine Mischung aus dem gleichen Molekül zu haben und sie alle gleichzeitig zu betrachten. Denn dann befinden sich alle diese Moleküle in verschiedenen Ausrichtungen und jedes von ihnen führt zu einer unterschiedlichen Projektion. Und der Trick ist herauszufinden, welche Ausrichtung dieses Moleküls zu dieser Projektion führt und dasselbe für dieses Molekül und dasselbe für dieses Molekül. Wenn Sie es herausfinden können, dann wissen Sie, dass diese Projektion hier dieser Ansicht, diese Projektion hier dieser Ansicht, diese Projektion dieser Ansicht entspricht. Und haben damit Tausende Ansichten gleichzeitig. Das bedeutet auch, dass Sie die Moleküle nicht so stark bestrahlen müssen. Sie erhalten die Möglichkeit den Durchschnitt aus all diesen Tausenden Molekülen zu ermitteln, und so können Sie eine 3-dimensionale Struktur erhalten. Der andere wirklich große Fortschritt besteht darin, dass man die Moleküle in ihrem natürlichen Zustand betrachten kann wenn man Sie in Eis einbettet, welches sehr schnell abgekühlt wurde und somit nicht kristallin ist (so etwas, was wir als Glaseis bezeichnen). Und so können sie sehr große Molekül-Komplexe in ihrem natürlichen Zustand betrachten. Das Problem besteht darin, dass selbst dann sehr viele Störsignale vorhanden sind. Hier ist ein Bereich von Ribosomen, der aus ziemlich großen Molekülen besteht, und die Forscher machen Witze, dass man mit einer Ribosomprobe besonders leicht arbeiten kann. Aber gleichwohl, wenn Sie schauen wollen, wie eine einzelne Projektion des Moleküls aussieht, können Sie sie kaum sehen. Sie können kaum sehen, wie diese aussieht, ganz zu schweigen von irgendeiner Art von Atomstruktur. Und doch wurde dieses Verfahren verwendet, um etwas mit einer ungefähren Auflösung von 27 Angström beim Ribosom abzubilden. Es ist das erste Mal, dass man tatsächlich die tRNA-Moleküle innerhalb des Ribosoms visualisierte. Obwohl es Ribosom-Kristalle schon damals seit ca. 15 Jahren gab, waren diese Bilder aus dem Jahre 1995 bei weitem die besten, die wir von Ribosomen hatten. Natürlich wurden sie schon in den nächsten Jahren durch kristallographische Methoden abgelöst. Aber trotzdem, es zeigte, dass man dadurch etwas über die Form der Moleküle herausfinden konnte. Aber konnte man diese Methode einsetzen, um Strukturen von biologischen Molekülen zu erhalten? Es schien damals im Jahre 1995 unmöglich, weil ein sehr großes Molekül, das gut zu sehen war, trotzdem nur etwa 27 Angström Auflösung lieferte. Aber in demselben Jahr gab es tatsächlich eine bahnbrechende Veröffentlichung, von jemandem, der in meinem Labor arbeitete - dem damaligen Laborleiter, der mich eigentlich angestellt war, obwohl, apropos, zurzeit bin ich sein Chef. Er veröffentlichte diesen Artikel, der im Grunde eine theoretische Arbeit war, die ein Ergebnis seiner Studien an Bakteriorhodopsin darstellte. Und er schlug vor, für Moleküle mit etwa 100.000 Dalton oder darüber, mittels Elektronen die Atomstruktur mit nur 10.000 Molekülen zu bestimmen. Was hat er unter Atomstruktur gemeint? Er meinte, 3 Angström-Auflösung. Jetzt 15 Jahre später, gibt es noch keine Atomstrukturen mit Ausnahme von Viren, die sehr große symmetrische Moleküle miterfassen, die Millionen und Abermillionen Kopien von Molekülen vereinigen. Es war fraglich, wie diese Dinge jemals zustande kämen, obwohl niemand jemals einen Fehler im Artikel von Richards finden konnte. In der Tat waren alle einig, dass er Recht hatte, und es war nicht klar, was genau vorging, obwohl Richard selbst vom Umfang der Einschränkungen wusste und daran die letzten 20 Jahre arbeitete. Jetzt haben wir eine weitere Revolution in der Auflösung - und das ist nicht mein Begriff, das ist der Begriff von Werner Kühlbrandt, der diese Zusammenfassung verfasste, die unserem Artikel über das mitochondriale Ribosom im Magazin Science vom letzten Jahr beilag. Wenn Sie im Detail wissen möchten, worum es ging, rate ich ihnen, diese sehr kurze Zusammenfassung zu lesen, um eine Vorstellung davon zu haben, was auf dem Gebiet passiert. Aber ich werde Ihnen ganz kurz darüber berichten. Es gibt zwei Hauptfortschritte. Zunächst sind die Mikroskope in den letzten 20 Jahren immer besser geworden. Wir haben bessere Objekttische, stabilere Mikroskope, usw., aber das alles hat nicht zu dieser Verbesserung geführt. Natürlich war es eine Verbesserung, aber nicht so sehr um Atomstrukturen zu sehen. In den letzten Jahren gab es Folgendes: wir bekamen bessere Detektoren und bessere Möglichkeiten zur Datenverarbeitung. Zunächst bessere Detektoren. Ein klassischer Weg zur Ermittlung der Elektronen ist die Verwendung des Filmes. Der Film ist ein einigermaßen guter Elektronendetektor. Eigentlich ist er ein Direktdetektor. Die Benennung dieser neuen elektronischen Detektoren als Direktdetektoren ist eine unglückliche Benennung, denn Film ist auch ein Direktdetektor. Der Film ist dazu zeit- und arbeitsaufwendig. Man muss ihn scannen. Er hat seine eigenen Probleme wie Homogenität und Störanfälligkeit und so weiter. Dann kamen CCD-Detektoren. Aber CCD-Detektor ist eigentlich ein sehr schlechter Elektronendetektor, denn er wandelt Elektronen in Fluoreszenzlicht um und danach wird das Licht über Glasfaser von einem CCD-Chip erfasst. Richard pflegte den Menschen zu sagen, dass wenn sie Ihre Daten ruinieren und noch schlechtere Daten haben möchten, dann sollten Sie auf Film verzichten und zu CCD wechseln. In der Zwischenzeit vereinigte eine neue Klasse von Detektoren auf Grundlage des CMOS-Chips die Vorteile des Films, direkt Elektronen zu ermitteln, mit der Bequemlichkeit des CCD, indem die Entwicklung und Scannen des Films usw. entfallen. Sie haben ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis als Film und erheblich bessere detektive Quanten-Ausbeute als Film, so dass sie viel empfindlicher als Film sind. Zu den anderen Innovationen gehört eine bessere Bildverarbeitung, und bessere Algorithmen zur Optimierung von sehr verrauschten Bildern. Wir kamen auf die Elektronenmikrospie, weil dieser Postdoktorand, Israel Sanchez, Und aus Frustration entschied er sich mit einem anderen Postdoktorand, Xiao-Chen Bai, zusammenzuarbeiten, der für meinen Kollegen Sjors Scheres arbeitete, und diese 2 Männer beschäftigten sich mit der Elektronenmikroskopie. Sie gingen so vor, dass sie sich seine Proben im Detail ansahen. Um da voranzukommen nahm er zunächst Proben von Ribosomen, und danach Komplexe, um sie zu betrachten. Und dabei hat er zwei Entdeckungen gemacht. Eine war, dass die Probe ionisiert wird, wenn Elektronen auftreffen. Und wenn das in einem nicht leitfähigen Medium wie Eis, Glaseis geschieht, schafft es sehr große lokale Felder. Dieses Phänomen heiß Aufladung. Und die Moleküle beginnen sich zu bewegen, weil sie geladen sind und das ist ihre Reaktion auf die starken lokalen Felder. Sobald Ihre Probe getroffen wird, von der ersten Minute, wenn Sie die zu beobachten beginnen, bewegen sich die Proben. Ich zeige es Ihnen, um die strahlinduzierte Bewegung zu veranschaulichen. Ich zeige es Ihnen, obwohl wir das Problem jetzt im Griff haben, aber es war mal ein Problem. Nun, diesen neuen Detektoren sind sehr schnell, so sind wir in der Lage, tatsächlich etwas gegen diese strahlinduzierte Bewegung zu tun. Erstens, was diese neuen Algorithmen erstellen, wie sie auf diesem Abbild hier sehen, ist ziemlich verrauscht. Es bleibt uns nur noch übrig zu fragen, welche Ausrichtung die Moleküle haben, die zu dieser bestimmten Projektion führte? Um darauf die Antwort zu kriegen, machen sie eine mathematische Berechnung. Sie berechnen alle möglichen Projektionen und entscheiden, welche Projektion mit der beobachtenden Projektion übereinstimmt. Im Grunde genommen, ist das die Essenz der Idee. Aber wenn es verrauscht ist, kann Ihnen eine ungenaue Projektion manchmal eine bessere Übereinstimmung geben als die tatsächliche Ausrichtung des Moleküls. Das ist ein klassisches Problem mit verrauschten Daten, dass Sie nämlich das falsche Minimum als Basislevel definieren. Und was Sjors Scheres tat, war die Anwendung einer sehr bekannten statistischen Methode, die als Bayessche Wahrscheinlichkeit bekannt ist. Also anstatt zu fragen, welche angepasste Ausrichtung des Moleküls am besten mit dieser Projektion übereinstimmt, fragte er: Mit der Implementierung dieser Bayesschen Wahrscheinlichkeit und danach mit deren Benutzung für die Rekombination, können Sie zu einer sehr besseren und sehr viel genaueren 3-dimensionalen Rekonstruktion des Moleküls gelangen. Die andere Sache, worauf ich hingewiesen habe, ist die Strahlbewegung. Jetzt stellt sich heraus, dass diese Detektoren so schnell sind, das was Sie hier sehen, ist ein 1-Sekunden-Abbild, und das hier, wie eine 1-Sekunden-Projektion eines Teilchens aussieht. Aber dieses 1-Sekunden-Abbild stellt eigentlich 16 Einzelbilder dar, die hier gezeigt werden. Sie können fragen, falls ich die Bewegung dieses Moleküls von einem Einzelbild zu einem anderen beobachten konnte, dann könnte ich die Bewegung der Moleküle verfolgen. Um das zu tun, müssen Sie in der Lage sein, das Molekül innerhalb der Einzelbilder zu erkennen. Natürlich, wenn Sie alle 16 Einzelbilder addieren, gibt es hier eine genügende Zeichengabe zur Erkennung des Moleküls und dessen Ausrichtung. Jetzt stellt sich für die Ribosomen heraus, dass Sie es mit 8 Einzelbilder tun können, und Sie können es mit 6 oder 4 Einzelbildern aber nicht mit 2 Einzelbilder tun, da es so verrauscht wird, dass Sie eine fehlerhafte Position und Ausrichtung des Moleküls bekommen, was nicht gut genug ist. Wir können eine 4-Einzelbild-Zusammenfassung machen und dann dies über jene 16 Einzelbilder bewegen. Und das führt dazu, die Bewegung des Moleküls während dieser 1 Sekunde verfolgen zu können. Sobald Sie in der Lage sind, es zu verfolgen, können Sie eine Korrektur für die Bewegung in jedem dieser Einzelbilder vorzunehmen und dann die korrigierten Einzelbilder zusammenzufügen. So, jetzt haben Sie eine Projektion, deren Bewegung korrigiert ist, und so ist es nicht verschwommen; es ist gut scharfgestellt. Was Sjors und seine Kollegen zusammen mit meinem Postdoktorand Israel diese Arbeit taten, war, Sie nahmen nur 30.000 Teile des Ribosoms, und Sie konnten tatsächlich diese Molekülstränge abtrennen, die als beta-Stränge bezeichnet werden. Und Sie konnten die spiralförmige Struktur der alpha-Helices betrachten und sogar die Dichte an den Seitenketten-Helices erkennen. Plötzlich sah es so aus als ob sie Atomstrukturen mittels Elektronenmikroskopie bestimmen könnten. Das ist was 2 andere Postdoktoranden in meinem Labor gegen das Problem taten, und die kristallographischen Methoden damit in den Schatten gestellt hatten. Und hier ist die Struktur der mitochondrialen Ribosomen. Das ist Alexey Amunts, der dieses mitochondriale Projekt in meinem Labor anging und sich wirklich mit der Biologie beschäftigte. Und das hier ist Alan Brown, der eine brillante Interpretation einer erstaunlich komplexen Struktur durchführte, worüber vorher sehr wenig bekannt war. Diese Strukturen wurden in 3 Artikeln in Science binnen des letzten Jahres veröffentlicht, und das sage ich Ihnen um zu verdeutlichen, dass der Nobelpreis kein "Todeskuss" sein muss. Ich weiß, dass es eine Versuchung ist, nach der Auszeichnung des Preises Vorträge zu halten und zu Galas willkommen geheißen zu werden. Aber wenn Sie "Nein" zu den meisten dieser Einladungen sagen und sich wirklich mit der Wissenschaft in ihrem Labor beschäftigen und sich daran erinnern, was Sie tatsächlich in die Wissenschaft gebracht hat, können Sie immer noch wichtige Artikel veröffentlichen. Übrigens geht Alexey Amunts dorthin, wo Astrid arbeitet: an die Universität Stockholm als ein Fakultätsmietglied. Die Frage ist, was sind die mitochondrialen Ribosomen und warum sind sie interessant? Mitochondrien sind die Energiekraftwerke unserer Zelle; sie sind Organellen in unserer Zelle, aber man glaubt, dass sie dadurch entstanden, dass vor 2 Milliarden Jahren eine Zelle eine andere verschluckte. Und die Zelle, die verschlungen wurde, die nun in einer größeren Zelle war, sich schließlich zu Mitochondrien entwickelte. Aber weil, in dem Maße, wie Arten divergieren, die Mitochondrien von der 1. Art mit den Mitochondrien von anderen Arten nicht rekombinieren konnten, gingen die Mitochondrien verschiedener Arten ihren eigenen Weg auseinander und sie sind unglaublich divergent. Alexey sah sich diese mitochondrialen Ribosomen an, und er fand heraus, dass es eine Mischung aus vielen verschiedenen Arten von Teilchen gab. Und es ist nichts, was jemals herauskristallisiert wäre. Doch mit diesem Verfahren der Elektronenmikroskopie können wir Mischungen von Teilen sortieren, und sogar Mischungen verschiedener Konfirmationen des gleichen Teilchens im Objekt sortieren, was mit einer kristallographischen Methode nicht machbar ist. Er konnte Abbilder erhalten, die detailliert genug waren, um eine Molekülstruktur abzuleiten, und dann baute er mit Alan Brown dieses Molekül, das fast eine Million Atome umfasst. In der Tat haben wir 80 Proteine erstellt, die sehr wenig Sequenzhomologie zu dem haben, was zuvor bekannt war. Es bedeutet, dass Menschen, die die Molekülstruktur ansehen möchten, nicht mehr kristallisieren mussten was die Produktion von großen Mengen an stabilem homogenem Material voraussetzte. Sie können die gleichförmigen Mischungen von Proben ansehen. Sie können Molekülen ansehen, die instabil sind. Und auf dieselbe Weise, wie diese Revolutionen in der optischen Mikroskopie die Zellbiologie transformieren werden, wird die Revolution in der Elektronenmikroskopie die molekulare Strukturbiologie ändern. Vielen Dank.

Venkatraman Ramakrishnan (2015)

Seeing is Believing - A Hundred Years of Visualizing Molecules

Venkatraman Ramakrishnan (2015)

Seeing is Believing - A Hundred Years of Visualizing Molecules

Abstract

It has been a hundred years since molecules were first visualized directly by using x-ray crystallography. That gave us our first look at molecules as simple as common salt to one as complex as the ribosome that has almost a million atoms. In the last few years, electron microscopy has offered an alternative to directly obtaining the structure of very large molecules. I will describe some highlights in this journey with an emphasis on the recent developments in electron microscopy and how it is creating a new range of possibilities for visualizing biological structures.

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