Stefan W. Hell (2015) - Optical Microscopy: the Resolution Revolution

Thank you much for inviting me here. I think everyone of us is familiar with the saying "a picture's worth a thousands words" or "seeing is believing," and this not only applies to our daily lives, it also applies to the sciences. It's probably not a coincidence that the beginning of the natural sciences as we know them today very much coincides in time with the invention of the light microscope. Because of the light microscope, mankind was able to see for the first time that every living being consists of cells as basic units of structure and function and many organisms of course were discovered with the light microscope. However, we also learned in school that the resolution of a light microscope is fundamentally limited to about half the wavelengths of light. And if you want to see smaller details we have to resort to electron microscopy. There's no doubt about the fact that electron microscopy has achieved a much higher spatial resolution, in a number of cases even down to the size of a molecule. So the question comes up, why do we still care for the light microscope and its spatial resolution? The answer is given in the next slide where I made a little experiment. I counted the number of studies here that used a light microscope and those that used an electron microscope in this basic medicine journal. Now you see which of the two won. It is a fact that light microscopy still is the most widely applied microscopy technique in the life sciences and that for two good reason. The first reason is that light microscopy is the only way of which you can look into the inner part of a cell and material for cell with minimal invasion or even into living tissue with minimal invasion. It doesn't work with an electron microscope and there is another reason. Of course there are many thousand types of biomolecules proteins in the cell and you want to see them specifically. You want to highlight a certain type of protein, you want to know what it does, what the protein interacts with and so on and so you have to do something to highlight it. It is possible relatively easily in a light microscope by doing fluorescence contrast modalities. Meaning that to the molecule of interest we attach a florescent molecule and this florescence molecule has a very basic feature. It has energy ground state and it has an energy excited state. And of course if you put the right beam of light onto that molecule the molecule will absorb a photon, in this case a green photon. Then would be raised to highlighted energy state and there it wiggles, its atoms wiggle a bit. And then eventually the molecule comes down emitted a fluorescent photon. Because some of the energy is lost in the wiggling of the atoms, the florescent photons are red-shifted in wavelength. This makes florescence microscopy enormously sensitive because you can easily separate the florescent light out of the illumination light. In fact, florescence microscopy can be so sensitive that you can detect even single molecules, as has been discovered by my co-laureate W. Moerner and also by others. Then of course this means that you can really see individual molecules that really are in a body of a cell for example. However if there is a second molecule, a third molecule, a fourth molecule coming close to that first molecule, close in distance of 200 nanometers, then you cannot tell them apart. You see resolution is about telling things apart. It must not be confused with sensitivity. And therefore it's clear that a lot of your information is lost actually at the nanometre scale simply because we cannot tell things apart. And if we manage to overcome this barrier, this would have an impact in the life sciences and possibly beyond. In order to understand how we can overcome this barrier, of course we have to understand where it comes from. There are several ways of explaining it but the most profound way of explaining a diffraction barrier is the simplest one fortunately. Well we can say that the most basic element of a microscope is the objective lens, and role of the objective lens and nothing but to concentrate the light in space, to focus the light. However, because light propagates as a wave it's not possible for the lens to concentrate the light in a single point, a focal point. Rather the light would be smeared out on this diffraction blob here of about 200 nanometer extent in the focal plane and 500 nanometer along the optic axis. And so there's a major consequence out of this. If there are several features falling within this range, then they will be flooded at the same time with light, there's no way out. And hence they will also produce light, back scatter light or fluoresce at the same time. So if you place the detector here, the detector will not be able to tell the single features apart because they produce light basically at the same time. Even if you collect this light, say florescent light with a lens and image it onto the detection plane, even then we couldn't tell them apart. Why? Because each of these little features, say molecules, would produce a blob of diffracted light, focused light here as well and you see the neighboring one would have another one and the neighboring one again and again and again. So, these blobs of light, they will overlap in space and no detector would be able to tell them apart. Be it a photo-multiplier of the eye or even a pixelated detector such as a camera. Now the person who realized that diffraction poses a severe problem was this man, Ernst Abbe, who lived at the end of 19th century and he coined this diffraction barrier equation that is named after him. It's saying in order to be separable in a light focusing microscope, two features of the same kind have to be further away than the wavelengths divided by the numeric aperture of the objective lens. This equation can be found basically in any textbook of physics or optics, but also in textbooks of cell biology because of the enormous relevance of light microscopy to this field. It can also be found on a memorial which was erected in Ernst Abbe's honor in Jena, in Germany where he lived and worked, and there it is written in stone. This is what scientists believe throughout many centuries that it is the practical limit of resolution. And it was the limit. When I was a student, at the end of the eighties in Heidelberg, student of physics, this was the maximum resolution that you could achieve for example if you wanted to look into the cytoskeleton structure of a cell. But now we can do much better. As the development of the super resolution microscope, in this case STED microscopy, has shown that you can overcome to diffraction barrier. There is so to speak physics or physio-chemistry in this world, that gets you sharper images. This of course is a substantial addition in the field. Now, I believe as any substantial addition, development or discovery, it has a personal story. A story behind the story and this is definitely the case in my case. Something about my background: I was born in Romania in the western part of Romania. And it was communist Romania. At the age of thirteen I realized that in this country I wouldn't have a great future of course and I convinced my parents to immigrate to West Germany, which they finally managed. Two years later actually at the age of fifteen, we emigrated to west Germany where I got my high school leaving certificate and eventually studied physics in Heidelberg, which I always wanted to do because I was fascinated with physics. Now like most physics students of course I was fascinated by the basic physics, by particle physics and all this fascinating developments that took place at the time. However, at the time I had to decide for my PhD thesis, this is what I looked like back then, believe it or not. By the time I had to make the decision, I must admit I lost courage. No surprise because my parents who had to struggle settling in the west as you can imagine. My father was threatened with unemployment, my mother was diagnosed with a life threatening disease. I said to myself: it's better not to get unemployed as well because most people were saying, oh with the particle physics you'll get unemployed most likely, and so on. I opted for something that is very applied and I signed up with a thesis advisor that had set up a start-up company, Heidelberg Instruments in Heidelberg. The start-up company investigated confocal microscopy and the use of confocal microscopes for the inspection of microlithography, so computer chips. I felt okay again. I would get a job with him or IBM and so on and I should do that. However when I did that after a year I was totally unhappy because this was not the kind of the physics that I wanted to do actually. This was too technical. There was no physical phenomenon in it. Just polarization and diffraction. Microscopy was the physics of the 19th century. So I had two options. Misery that would have been the first option and the second option to think about something fundamental. Is there still a problem left in light microscopy that is interesting and where a change could be possible? Then I realized, breaking the diffraction barrier, that would be cool. That's an interesting problem. That's a problem to work on. I thought to myself, could that be possible and I realized at some point, yes. My thinking was the following. Where does diffraction barrier was coined in 1873 and at that time, we had 1988, 1990. So much physics came up in the 20th century. Quantum mechanics was invented, molecules, spectroscopy, there must be at least one phenomenon that gets beyond the barrier and gets sharper images. There should be something although in the beginning I didn't know what it was. But at some point the idea materialized and I put it down in writing. I knew that it wouldn't work just by changing the way the light is focused. No way. But maybe if one exploits the properties of the fluorophores, the states of the fluorophores, spectroscopic changes and transitions in the fluorophores, maybe that's an option. Or maybe there's quantum phenomenon, a quantum optical phenomenon, that gets beyond the diffraction barrier. That was the strategy, the philosophy I had in mind. You see I put here far-field light microscopy. Why far-field? Because in those days there was already sub-diffraction optical microscope in existence. This was the near-field optical microscope that overcame the diffraction barrier by confining the light-specimen interaction with the tiny tip down to 30 nanometers. But that's not what I was attracted to because that's confined to specimen surfaces. And to me honestly, it did look like a microscope, like a light microscope. The assembly was getting a ton of a microscope. I wanted to overcome the diffraction barrier in a microscope that looks like a microscope and operates like a light microscope. But this was very difficult because it was a very unusual idea and when I tried to get institutional support in this country, in Germany, I failed. I was fortunate that there was a person in Turku, in Finland, who gave me some space and some freedom and a postdoctoral fellowship from the Finish Academy to work on this problem. Eventually I went to Turku, to Finland, a place I've never heard of before, very reluctantly and there of course I took my philosophy with me. About six weeks after I arrived there with this idea in mind, of course I started to screen text books, text book. Could there be a phenomenon that could be used? I opened this textbook on a Saturday morning hoping to find something in the quantum statistics of light and so on. And I opened this page and I came across the phenomenon of stimulated emission. This phenomenon I was familiar with from actually from my first year of physics studies and all of a sudden I was electrified. I felt not this could be a phenomenon, at least one phenomenon, that gets me beyond the diffraction barrier in fluorescence microscopy. This was the basic idea of course that started things going. Now, why was I so electrified? Let's get back to the situation. We have here the lens, we have here this blob of light and as a result of diffraction all the features here will be flooded at the same time with light. We cannot change that. All the molecules will produce light here at the same time because they're flooded at the same time with light. But maybe there's a solution there. What if we manage to make sure that not all the molecules that are flooded here with light, are in the end capable of producing light at a detector? So we keep some molecules in a state in which they are not able to produce light here. We should be able to separate those that can produce light from those that can't. If we manage to keep these molecules in a state in which they are dark, not sending light back, then we should be able to separate the bright ones from the dark ones. You see the idea has not changed the way the light is focused, but changed the state of the molecules transiently such that you produce two classes of molecules, bright ones and dark ones. Now you would say, this is the idea, use a dark state. Are there such things as dark states in a dye. Look at the basic energy diagram. We have here the ground state, we have the excited state. Of course the bright state is the excited state because the bright state produces the florescence. But the ground state of course doesn't produce florescence. The ground state is a dark state. Here we go. The basic states of the alpha of a dye. Give me a dark state that is the ground state. I'll guess what this phenomenon of stimulated emission does? Nothing but making dark state molecules. Stimulated emission pushes molecules from the bright state back down to the dark state and then of course we have these two classes of molecules, bright and dark, and they should allow us to get beyond on the diffraction barrier. And this is why I was electrified. This is the basic idea behind the STED microscope. We have a lens, we have a sample of course, we have a detector, and of course we have a green light for turning molecules on from the dark state to the bright state or the fluorescent state. Of course the green light will produce a blob of diffracted light in here and all the molecules will fluoresce as a result normally. You also have this red light and the red light is nothing but used stimulated emissions so this transitions back down to the ground state, so the job of the red light is to make dark state molecules. Make molecules that are dark. The condition for doing that is that you have the right wavelengths, it should be a red shifted wavelengths and that the beam has to be bright enough. Why? Because we have to ensure there is always a red photon at the molecule that is able to take the molecule down to the ground state. If the red beam is weak of course then, this phenomenon would not take place. This is displayed in here. So if you guarantee a certain intensity at the molecule, then it can turn the molecule off because that beam of light would instantly make the molecule dark, so prevent the molecule from occupying the on state, the excited state. We don't want to turn all molecules off. So what we do is actually we phase modulate, we change the beam such that it produces a ring, not just a spot of light and the role of the ring is to turn off the molecules in here. Let's assume we want to see only the single here from that the inner part of the object. This thread. So what do we do? We have to turn those molecules off and the way of doing that is just to make that red beam bright enough so that those molecules in here have to face an intensity that is higher than the threshold. And this way of course we turn those molecules off and only those molecules in the centre are left. You see we are there. Because now we can separate features that are closer than the diffraction barrier. We can separate the strands because the molecules that the belong to them, they are forced to emit time-sequentially because we played this on-off game and only these are capable of producing light by the detector. I'm removing now the donut just to make it clear, that this is a state game that we're playing, not a way of changing the way the light is, but the state game. You see this is a diffraction zone. These molecules in here, these molecules are forced to stay all the time here in the ground state, because as soon as they get up they are pushed back down instantly. And only those molecules in the centre are allowed to assume the on state. This is where we play two different states within the diffraction zone, we can tell the features apart. I'm putting the donut back on. This was the idea. You may say, oh this sounds logical, but believe it or not when I published this in 94 in Turku, hardly anyone believed it. In fact I applied to many places. To the States, to Germany, to Europe of course. Maybe 25 applications I sent out with this idea in mind, but to no avail. I didn't have the right pedigree, not from Stanford, Harvard, Bell Labs, anything. Turku was a place no one has heard of. It wasn't easy, so it was difficult to survive, both financially and of course academically. And not having a strong social background, believe me, it wasn't easy. But I worked on a fascinating problem and I was happier than in my thesis. Why? Because I wanted to do this. This was a subject that was fascinating. I was the only one who really believed in going far beyond the diffraction barrier and it was cool doing that. Of course at some point somebody has to rescue you and so I was fortunate that the Max Planck Institute for Biophysical Chemistry became aware of me and gave me a five years probation period actually to prove that I'm on the right track. So it was. After some development it was clear that you can overcome the diffraction barrier. This is the standard resolution, confocal. This is a STED resolution. And you see now the gain in spatial resolution is very obvious. Now we can see this molecular sub-units here of this nuclear pore complex in the eight-fold symmetry but in the standard case, confocal, which used to be the best of course, there's no way of seeing them. Of course if you have this high spatial resolution you get new information. I would like to give you just one example or two. Say virology, this is going to be important because viruses are between 30 and 150 nanometers in diameters, are smaller than the diffraction barrier. If you want to image say protein distributions on the virus with a normal microscope you just a blob of something smeared out, but if you do the sub-diffraction imaging with STED in this case you see that they form patterns dependent in this case on the maturation state of the virus. What has been found out here is that the mature particles, those that can infect the next cell, they have their Env proteins in a single place. So this is something to show that you can get inside of course with the high spatial resolution. Surprise, surprise. Well, I think the strengths of a light-focusing microscope is that you can of course image living cells. And living cell imaging at the extreme is of course to go straight to a living system. This is about 20 microns of the upper molecular layer of the brain of a transgenic mouse where some of the neurons expressed a yellow fluorescing protein. Now you see we can record the images. See these dendritic spines with much higher clarity than before, subtle movements. And the seeing of these movements requires of course the high resolution because otherwise it would smear out. Of course there's more work to be done. There's no doubt about it. In fact, however, I have all reasons to believe that in the end we will be able to see the distribution of molecules here at a synapse and perhaps give a visual cue to the mouse and see what's going on in the brain at the molecular level. With that I'm coming back to the resolution question. Being a physicist of course I want to know what is the spatial resolution that we can get now with this method? What is the end of it? What's the conceptual limit? What's the practical limit? Now the conceptual limit can be answered very easily. Of course if we increase the brightness of this beam, then more and more molecules will be turned off on average so the region in which the molecules are allowed to assume the on state would become smaller and smaller. And in fact the size here would depend on the ratio between the brightness of this donut or ring at the crest and the threshold intensity which is a characteristic of the molecule of course, and this means now that we have to modify Abbe‘s equation so that d is not diffraction limited but this ratio of course is here in the denominator. You see if this becomes large then it goes down to zero, meaning that the conceptual limit now is the size of the molecule. And this is not a surprise because we separate using molecules, and of course then the conceptual limit has to be the molecule, the size of the molecule. We can have conceptual molecular scale resolution. Now the practical resolution depends of course on how well you can play this game, this on-off game. For getting molecule for STED we are at 20 to about 40 nanometers depending on the molecule, depending on the molecular environment. Just to make sure that this concept can be worked out and developed further, if you use a fluorophore so to speak, that allow themselves to be turned on and off as many times as you want, for example, these color centers in diamond in this case, you can show very extreme resolution potential. For example here 4.2 down to 2.4 nanometers, so given the fact that this is wavelength of 775, that's a small fraction of it. Now this may look just like a proof of principal experiment. But there is also applications for this because this color centers, the charged nitrogen vacancies are very popular with physicists because they can be used for example as qubits for quantum information at room temperature or for magnetic sensing at the nano-scale, so there's more than life science. It's not just the life sciences. With that I'm coming back to the basic concept again. I said the name of the game that you play is on-off. We have the offset here, we have onset here, this is a more basic state, and this is the most basic transition imaginable. Going up by light, going down by light. But of course, once you realize this is about on-off, not just about making simulated emission in here, then you know, maybe there sorts of other states in the molecule that allow you to do the same game. For example, you can push the molecule to a meta state with dark state, like a triplet state. Or if you look into chemistry books then you will find such thing as cis-trans photoisomerisation. You can relocate the atoms so to speak and play on-off in this way. And now you must say, why do you care for this transitions if you have a very fundamental one here that applies to any fluorophore so to speak? Well, there is a very strong reason. Don't forget: we separate by transiently putting the molecules into a different state. On versus off. Then this on then this off. Then of course the lifetime of the state matters and it's obvious that the longer the lifetime, the easier it is to create a difference in states. But here the state disappears after nanoseconds. Here lasts longer, microseconds, milliseconds. Here we have something that is optical bistable and if it's bistable there's more time. Meaning that we need less light per unit or less photons fuel force by using time to do this kind of game, meaning that this threshold intensity goes down, meaning that the intensity required of course goes down so you can break the diffraction barrier at lower light levels if you do for example the cis-trans isomerisation. This was of course fascinating because you can do this also in switchable fluorescent proteins. I would like to show you one example where this concept has worked out. I couldn't have it called STED anymore because there is stimulated emission in it. If you did little light, as is the case here, then you could produce many rings or holes or donuts or whatever, and this has been done in here. You can parallelise the whole thing and then recording a large area becomes very quick and even at relatively low light levels, because this is a metastable transition with long-lived states. Here actually this living cell, these filaments, were recorded with a 100,000 donuts in less than two seconds. I'm just showing development goes on, not only that it's the molecular transition that is decisive. That in turn is the performance of the system. With that I'm coming back to the last question I'm putting up now. What does it take to get the best resolution? Let's assume you would have asked this question in the 20th century. What have been the answer? Well, good lenses, why? Because the separation of features is done by the focusing of light and then if you produce small spots you can separate better. Producing a spot of light here, as sharper spots would be producing a spot of light here, that determines the resolution. But that is of course diffraction limited. If you have several features falling within that spot of light, we cannot tell them apart. What was the solution to this problem? The solution was not to separate just by the phenomenon of focusing but to separate by a state transition. Prepare the molecules in two different states within this diffraction zone and then you can tell them apart. I'll give you a few examples of state transitions that can be used. And so in this concept STED and is derivatives, we use a pattern of light so to speak that determines where the molecules are on here and where they're off to predetermine actual position and play this on-off game. You control actually the states and the position of the states using a pattern of light. How does it compare with the other seminal concept that was done first and suggested by Eric Betzig, based on the discovery that you can detect individual molecules by W. Moerner? Well, in this case, the on-off game is played individually. Individual per each molecule and this way of course makes the features different. This is a fundamental difference. It's really a fundamental difference because now you can play the on-off game on a single molecule basis which has a number of advantages. If you do it stochastically, if you do it stochastically in space, then you don't know where the molecule is located. What's the solution? Well you have to resort to states that produce many photons in a bunch, here at a camera, and a pixelated detector then gives you the coordinates and eventually you will know the position as well. Of course, you need always many photons to either find out the coordinate or define the coordinate because one photon goes astray here, here, here or there within the diffraction zone. Only with many photons you can deal with coordinates. But that's just the coordinate which is critical and needed but for the separation which is needed to tell features apart you need the state transition. As a matter of fact, in order to separate features now what you need is a state transition which in the simplest case, on and off. You flood everything with light but only one molecule is allowed is to emit or only a group of molecules at a certain location is allowed to emit and this is how you overcome the diffraction barrier. It's the state transitions that is a critical element that gets us super resolution. It's not a coincidence that it was fluorescence and non-fluorescence that allowed us to overcome the diffraction barrier because that's the easiest to play with, to turn on and off. In the 20th century it was the lenses, but now what determines the resolution, what determines performance, it's the molecules. So it has to kind of become a chemistry topic. You want to push this you, have to push the molecules here. The story goes on, because you can imagine not only on-off in fluorescence but you can also imagine absorption, non-absorption, scattering, non-scattering, spin ups, spin down, binding, non-binding. There are different ways of playing out this idea of transiently placing the molecules into different states within the diffraction zone. With that I'm coming to almost last slide. It's very easy now to expand Abbe‘s equation. We just have to put in this square root factor and this square root factor tells us that we can go down to the molecular scale. What does it stand for? What does it stand for? It stands for a state transition obviously. So what I'm saying is light microscopy resolution is not just about waves. It's about waves and states, and if you put in the states into your equation literally then you change the game. And this is what changed the game in the resolution in a focusing light microscope. With that I'm acknowledging the people who have worked and contributed to this development in my lab. We had a lot of fun even at a time when we were about the only ones who worked in this field. But one little point I would like to make at the very end. Well, it wasn't this guy who started the development, don't forget it. It was this guy and actually it's him who deserves the prize. Thank you very much.

Vielen Dank für die Einladung, hier sprechen zu dürfen. Ich denke, jeder von uns ist mit dem Sprichwort vertraut "ein Bild sagt mehr als tausend Worte" oder "Sehen ist Glauben", und dies gilt nicht nur für unseren Alltag, es gilt sie auch für die Wissenschaften. Es ist wohl kein Zufall, dass der Beginn der Naturwissenschaften, wie wir sie heute kennen, zeitlich mit der Erfindung des Lichtmikroskops zusammenfällt. Aufgrund des Lichtmikroskop, war die Menschheit in der Lage, das erste Mal zu sehen, dass jedes Lebewesen aus Zellen als Grundeinheiten und mit Strukturen und Funktion bestehen und viele Organismen wurden natürlich mit dem Lichtmikroskop entdeckt. Allerdings haben wir auch in der Schule gelernt, dass die Auflösung eines Lichtmikroskops grundsätzlich auf etwa die Hälfte der Wellenlängen von Licht begrenzt ist. Und wenn Sie kleinere Details sehen wollen, müssen wir auf die Elektronenmikroskopie greifen. Es besteht kein Zweifel darüber, dass die Elektronenmikroskopie in einigen Fällen eine viel höhere räumliche Auflösung, in einer Reihe von Fällen erreicht hat, sogar bis zu der Größe eines Moleküls. So stellt sich die Frage, warum wir immer noch in das Lichtmikroskop und dessen räumliche Auflösung interessiert sind? Die Antwort finden Sie auf der nächsten Folie, wo ich ein kleines Experiment darstelle. Ich habe die Anzahl der Studien gezählt, die ein Lichtmikroskop verwendeten und diejenigen, die ein Elektronenmikroskop in diesem medizinischen Magazin verwendet haben. Jetzt sehen Sie, welche der beiden gewonnen hat. Es ist eine Tatsache, dass die Lichtmikroskopie immer noch die am häufigsten angewandte Mikroskopietechnik in den Lebenswissenschaften ist, und zwar aus zwei guten Gründen. Der erste Grund ist, dass die Lichtmikroskopie die einzige Möglichkeit ist, den inneren Teil einer Zelle, und das Material für Zellen mit minimaler Invasion oder sogar lebendes Gewebe mit minimaler Invasion zu betrachten. Dies funktioniert nicht mit einem Elektronenmikroskop und es gibt einen weiteren Grund. Natürlich gibt es viele tausend Arten von Biomolekülproteinen in den Zellen und man will sie gezielt sehen. Sie möchten eine bestimmte Art von Protein hervorheben, Sie möchten wissen, was es tut, mit was das Protein interagiert usw., daher muss man es irgendwie markieren. Dies erreicht man relativ leicht mit einem Lichtmikroskop, indem Fluoreszenzkontrast-Modalitäten verwendet werden. Wir befestigen also an das gewählte Molekül ein fluoreszierendes Molekül und dieses Fluoreszenz-Molekül hat eine sehr grundlegende Funktion: Es hat über einen Energiegrundzustand und es hat einem energieangeregten Zustand. Und natürlich, wenn Sie den richtigen Lichtstrahl auf dieses Molekül setzten, absorbiert dieses Molekül ein Photon, in diesem Fall ein grünes Photon. Dann ergibt sich ein hervorgehobener Energiezustand, und es beginnt zu wackeln, seine Atome wackeln ein wenig; dann beruhigt es sich wieder wobei schließlich das Molekül ein fluoreszierendes Photon emittiert. Da ein Teil der Energie in dem Gewackel der Atome verloren geht, erscheinen die Fluoreszenzphotonen rotverschoben in der Wellenlänge. Dies macht fluoreszierende Mikroskopie enorm sensitiv, weil Sie leicht das fluoreszierende Licht vom Beleuchtungslicht trennen können. In der Tat kann fluoreszierende Mikroskopie so empfindlich sein, dass man sogar einzelne Moleküle erkennen kann, wie es von Mit-Preisträger W. Moerner und anderen entdeckt wurde. Dann bedeutet dies natürlich auch, dass man wirklich einzelne Moleküle sehen kann, die sich wirklich in einem Zellkörper befinden. Wenn jedoch ein zweites Molekül, ein drittes Molekül, und ein viertes Molekül diesem ersten Molekül nahe kommt, also innerhalb von 200 Nanometer-Entfernung, dann kann man sie nicht unterscheiden. Sie sehen, bei der Auflösung geht es darum, Dinge auseinander zu halten. Nicht zu verwechseln mit Sensitivität. Und deshalb ist es klar, dass viele der Informationen tatsächlich im Nanometerbereich verloren gehen, einfach deshalb, weil wir die Dinge nicht auseinanderhalten können. Und wenn es uns gelingt, diese Barriere zu überwinden, hätte dies eine Auswirkung auf die Biowissenschaften und möglicherweise darüber hinaus. Um zu verstehen, wie wir diese Barriere überwinden können, müssen wir natürlich verstehen, woher sie kommen. Es gibt mehrere Möglichkeiten dies zu erklären, aber die grundlegendste Art und Weise eine Beugungsgrenze zu erklären, ist zum Glück die Einfachste. Wir können sagen, dass das grundlegendste Element eines Mikroskops die Objektivlinse ist, und die Rolle der Objektivlinse ist nichts weiteres, als sich auf das Licht im Raum zu konzentrieren, um das Licht zu fokussieren. Da Licht sich jedoch wie eine Welle ausbreitet, ist es für die Linse nicht möglich, sich auf einen einzigen Punkt, eine Anlaufstelle, zu konzentrieren. Vielmehr wird das Licht auf diesem Beugungsklecks in einem Radius von 200 Nanometer in der Brennebene und 500 Nanometer entlang der optischen Achse verschmiert. Und so ergibt sich eine wichtige Konsequenz aus dem Ganzen. Wenn mehrere Funktionen in diesen Bereich fallen, dann werden sie zur gleichen Zeit von Licht durchflutet werden, es gibt keinen Ausweg. Und daher werden sie auch Licht erzeugen, Rückstreuungslicht oder Fluoreszenz zur gleichen Zeit. Wenn Sie den Detektor also an diese Stelle platzieren, dann ist der Detektor nicht in der Lage, die einzelnen Funktionen voneinander zu trennen, weil sie Licht grundsätzlich zur gleichen Zeit erzeugen. Auch wenn Sie dieses Licht sammeln, sagen wir, fluoreszierendes Licht mit einer Linse und es auf die Detektionsebene projizieren, selbst dann könnten wir sie nicht auseinander halten. Warum? Weil jedes dieser kleiner Gebilde, sagen wir, die Moleküle, einen Klecks von gebeugtem Licht, konzentriertem Licht hier ebenfalls erzeugen würden, und Sie sehen der Benachbarte hat einen weiteren, und der Benachbarte genauso usw. Diese Lichtkleckse, überlappen sich im Raum und kein Detektor wäre in der Lage, sie auseinanderzuhalten. Sei es mit einem Fotovervielfacher, das Auge, oder sogar eines pixelierten Detektors, wie beispielsweise einer Kamera. Die Person, die erkannte, dass Beugungen ein schwerwiegendes Problem darstellen, war dieser Mann, Ernst Abbe, der Ende des 19. Jahrhunderts lebte, und er prägte den Begriff der Beugungsgrenzgleichung, die nach ihm benannt ist. Es besagt, dass um trennbar sichtbar mittels eines fokussierenden Lichtmikroskops zu sein, müssen zwei Funktionen der gleichen Art weiter entfernt als die Wellenlängen sein, dividiert durch die numerische Apertur der Objektivlinse. Diese Gleichung kann grundsätzlich in jedem Lehrbuch der Physik oder Optik gefunden werden, aber auch in den Lehrbüchern der Zellbiologie, aufgrund der enormen Bedeutung der Lichtmikroskopie für diesen Bereich. Es kann auch auf ein Denkmal gefunden werden, das zu Gedenken von Ernst Abbe in Jena errichtet wurde, in Deutschland, wo er lebte und arbeitete, und dort ist es in Stein gemeißelt. Wissenschaftler glaubten über viele Jahrhunderte hinweg, dass dies die praktische Grenze der Auflösung ist. Und es war die Grenze. Als ich ein Student, Student der Physik, Ende der achtziger Jahre in Heidelberg war, war dies die höchste Auflösung, die Sie erreichen konnten, wenn Sie beispielsweise in die Zytoskelettstruktur einer Zelle schauen wollten. Aber jetzt können wir dies viel besser. Wie die Entwicklung des Superresolutions-Mikroskops, in diesem Fall das STED-Mikroskopie, gezeigt hat, dass Sie die Beugungsgrenze überkommen können. Die Physik oder die Physio-Chemie in diesem Bereich, kann uns dabei helfen, schärfere Bilder zu erzeugen. Das ist natürlich ein wesentlicher Beitrag in diesem Bereich. Ich glaube, wie bei jedem wesentlichen Beitrag, jeder Entwicklung oder Entdeckung, dass eine persönliche Geschichte dahinter steckt. Eine Geschichte hinter der Geschichte, das trifft auf jeden Fall bei mir zu. Etwas zu meiner Geschichte: Ich wurde in Rumänien, im westlichen Teil Rumäniens, geboren. Damals war es noch das kommunistische Rumänien. Im Alter von dreizehn Jahren erkannte ich, dass ich in diesem Land keine große Zukunft haben würde und ich überzeugte meine Eltern davon, in die Bundesrepublik Deutschland auszuwandern, was sie letztendlich auch taten. Zwei Jahre später, im Alter von fünfzehn Jahren, emigrierten wir in die Bundesrepublik Deutschland, wo ich meinen Abitur machte und schließlich Physik in Heidelberg studierte, was ich schon immer machen wollte, denn ich war von der Physik fasziniert. Wie die meisten Physikstudenten war ich natürlich von der Grundlagenphysik fasziniert, von der Teilchenphysik und all diesen faszinierenden Entwicklungen, die zu der damaligen Zeit stattgefunden haben. Aber zu der Zeit, musste ich eine Entscheidung bezüglich meiner Doktorarbeit treffen - so sah ich damals aus, ob Sie es glauben oder nicht. Zu der Zeit musste ich eine Entscheidung treffen, und ich muss zugeben, ich verlor den Mut. Kein Wunder, denn meine Eltern hatten Schwierigkeiten sich im Westen einzuleben, wie Sie sich vorstellen können. Mein Vater war von Arbeitslosigkeit bedroht, meine Mutter wurde mit einer lebensbedrohlichen Krankheit diagnostiziert. Ich sagte mir: Es ist besser, nicht arbeitslos zu bleiben, denn die meisten sagten, mit der Teilchenphysik wird es sehr wahrscheinlich schwierig sein, einen Job zu kriegen usw. Ich entschied mich für etwas, das sehr angewendet wurde und ich suchte mir einen Doktorvater, der eine neues Unternehmen gegründet hatte, Heidelberg Instruments in Heidelberg. Das Start-up-Unternehmen untersuchte die konfokale Mikroskopie und die Verwendung von konfokalen Mikroskopen zur Inspektion von Mikrolithographie, also Computerchips. Also, da dachte ich, okay, ich würde einen Job bei ihm oder IBM bekommen etc. und daher sollte ich das auch tun. Aber nachdem ich diesen Weg einschlug, war ich nach einem Jahr total unglücklich, weil es nicht die Art der Physik war, mit der ich arbeiten wollte. Es war zu technisch. Es gab kein neues physikalisches Phänomen. Nur Polarisation und Beugung. Mikroskopie war die Physik des 19. Jahrhunderts. Also hatte ich zwei Optionen. Trübsal, das war die erste Option und die zweite Option war, über etwas Grundlegendes nachzudenken. Gab es noch ein Problem in der Lichtmikroskopie, das interessant ist und wo eine Änderung möglich sein könnte? Dann erkannte ich, dass das Durchbrechen der Beugungsgrenze cool wäre. Das ist eine interessante Frage. Das ist ein Problem, an dem ich arbeiten möchte. Ich dachte mir, könnte das möglich sein, und an einem gewissen Punkt erkannte ich, dass es möglich ist. Meine Überlegungen sahen wie folgt aus. Die Beugungsgrenze wurde in 1873 ins Leben gerufen und zu der Zeit hatten wir 1988, 1990. Es gab so viel Neues in der Physik im 20. Jahrhundert. Quantenmechanik wurde erfunden, Moleküle, Spektroskopie, es muss mindestens ein Phänomen geben, dass über die Barriere hinausging und schärfere Bilder produzierte. Es musste etwas geben, obwohl ich am Anfang nicht wusste, was es war. Aber irgendwann wurde die Idee verwirklicht und ich schrieb es auf. Ich wusste, dass es nicht funktionieren würde, indem man nur die Fokussierung des Lichts ändert. Auf keinen Fall. Aber vielleicht, wenn man die Eigenschaften der Fluorophore, die Zustände der Fluorophore, spektroskopischen Veränderungen und Übergänge in den Fluorophoren nutzt, vielleicht ist das eine Option. Oder vielleicht gibt es ein Quantenphänomen, ein Phänomen in der Quantenoptik, das über die Beugungsgrenze hinausginge. Das war die Strategie, die Philosophie, die ich im Sinn hatte. Sie sehen, ich habe hier Fernfeld-Lichtmikroskopie genannt. Warum Fernfeld? Weil es zu jenen Tagen bereits Teilbeugungslichtmikroskope gab. Hierbei handelte es sich um das optische Nahfeld-Mikroskop, das die Beugungsgrenze durchbricht, indem die Licht-Proben-Wechselwirkung mit der kleinen Spitze bis auf 30 Nanometer beschränkt wird. Aber darum ging es mir nicht, weil dies auf die Oberfläche der Exemplare beschränkt war. Und ehrlich gesagt, es sah wie ein Mikroskop, wie ein Lichtmikroskop aus. Die Versammlung erhielt ein Tonnen-Mikroskop. Ich wollte die Beugungsgrenze in einem Mikroskop überwinden, das wie ein Mikroskop aussieht und wie ein Lichtmikroskop arbeitet. Aber das war sehr schwierig, denn es war eine sehr ungewöhnliche Idee und als ich versuchte, die institutionelle Unterstützung in diesem Land, Deutschland, zu bekommen, scheiterte ich. Ich hatte das Glück, dass es eine Person in Turku, in Finnland, gab, die mir etwas Platz und Freiheit verschaffte und ein Postdoc-Stipendium von der Finnish Academy anbot, um an diesem Problem zu arbeiten. Schließlich ging ich sehr widerstrebend nach Turku, Finnland, einem Ort, von dem ich nie zuvor gehört hatte, und natürlich nahm ich meine Philosophie mit mir. Nach sechs Wochen nach meiner Ankunft dort mit dieser Idee im Hinterkopf, habe ich natürlich angefangen Lehrbücher zu durchsuchen. Könnte es sich um ein Phänomen handeln, das genutzt werden konnte? Ich öffnete dieses Lehrbuch an einem Samstagmorgen in der Hoffnung, etwas in der Quantenstatistik von Licht und so weiter zu finden. Und ich öffnete diese Seite und entdeckte das Phänomen der stimulierten Emission. Dieses Phänomen war mir aus meinem ersten Jahr der Physikstudien bekannt und plötzlich war ich elektrifiziert. Ich dachte, das könnte ein Phänomen sein, zumindest ein Phänomen, das mich über die Beugungsgrenze in der Fluoreszenzmikroskopie hinausbringt. Das war natürlich die Grundidee, die die Dinge ins Rollen brachte. Warum war ich also so elektrisiert? Gehen wir zurück zu der Situation. Hier haben wir die Linse, hier haben wir den Lichtkleks und als Ergebnis der Beugung werden alle Eigenschaften zur gleichen Zeit von Licht durchflutet. Wir können das nicht ändern. Alle Moleküle produzieren hier Licht zur gleichen Zeit, weil sie zur gleichen Zeit mit Licht durchflutet werden. Aber vielleicht gibt es eine Lösung hier. Was, wenn wir es schafften, dass nicht alle Moleküle, die hier von Licht durchflutet werden, am Ende Licht am Detektor produzieren könnten? Also haben wir einige Moleküle in einen Zustand gelassen, in dem sie nicht in der Lage sind, Licht zu produzieren. Wir sollten in der Lage sein, diejenigen, die Licht produzieren können von denen zu trennen, die es nicht können. Wenn es uns gelingt, diese Moleküle in einem Zustand zu belassen, in dem sie dunkel sind, also kein Licht zurücksenden, dann sollten wir in der Lage sein, die hellen von den dunklen zu trennen. Sie sehen, die Idee hat nicht die Art geändert, wie das Licht fokussiert wird, aber den Zustand der Moleküle vorübergehend so verändert, dass Sie zwei Klassen von Molekülen, helle und dunkle, produzieren. Jetzt sagen Sie, das ist die Idee, verwende einen dunklen Zustand. Gibt es so etwas wie Dunkelzustände in einem Farbstoff? Schauen Sie sich das Grundenergiediagramm an. Hier haben wir den Grundzustand, und den angeregten Zustand. Natürlich ist der helle Zustand der angeregte Zustand, weil der helle Zustand die Fluoreszenz produziert. Aber der Grundzustand produziert natürlich keine Fluoreszenz. Der Grundzustand ist ein Dunkelzustand. Na bitte! Die Grundzustände eines Farbstoffes geben einen dunklen Zustand, der dem Grundzustand entspricht. Raten Sie jetzt, was dieses Phänomen der stimulierten Emission macht? Nichts außer dunkle Zustandsmoleküle. Stimulierte Emission drückt Moleküle aus dem hellen Zustand zurück in den dunklen Zustand, und dann haben wir natürlich auch diese beiden Klassen von Molekülen, hell und dunkel, und sie sollten es uns ermöglichen über die Beugungsgrenze hinauszugehen. Und darum war ich wie elektrifiziert. Dies ist die Grundidee hinter dem STED-Mikroskop. Wir haben eine Linse, wir haben natürlich eine Probe, wir haben einen Detektor, und natürlich haben wir ein grünes Licht, um Moleküle aus einem dunklen Zustand in einen hellen Zustand oder den fluoreszierenden Zustand zu versetzen. Natürlich produziert das grüne Licht einen Fleck gebeugten Lichts hier und alle Moleküle werden infolgedessen normalerweise fluoresziert. Sie haben auch dieses rote Licht und das rote Licht ist nichts anderes, als verwendete stimulierte Emission so dass diese wieder zurück in den Grundzustand versetzt werden, die Aufgabe des roten Lichts ist es also, dunkle Zustandsmoleküle zu produzieren. Moleküle zu produzieren, die dunkel sind. Die Voraussetzung dafür ist, dass Sie die richtigen Wellenlängen haben, es sollte eine rot versetzte Wellenlänge sein und der Strahl muss hell genug sein. Warum? Um sicherzustellen, dass es immer ein rotes Photon am Molekül gibt, das in der Lage ist, das Molekül in den Grundzustand zu versetzen. Wenn der rote Strahl natürlich schwach ist, dann kann dieses Phänomen nicht stattfinden. Dies ist hier dargestellt. Wenn Sie also eine bestimmte Intensität im Molekül gewährleisten, dann kann es das Molekül ausschalten, weil dieser Lichtstrahl dieses Molekül sofort dunkel machen würde, um zu verhindern, dass das Molekül aus dem besetzten Zustand in den angeregten Zustand versetzt wird. Wir wollen nicht alle Moleküle ausschalten. Was wir also tun, wir phasenmodulieren, wir ändern den Strahl so, dass es einen Ring produziert, nicht nur einen Lichtpunkt und die Rolle des Ringes ist, die Moleküle hier drin abzuschalten. Nehmen wir an, wir wollen nur das Einzelne hier sehen, aus dem inneren Teil des Objekts. Nur diesen Strang. Was können wir also machen? Wir müssen diese Moleküle ausschalten und wir tun dies, indem wir den roten Strahl hell genug machen, so dass diese Moleküle hier drin einer Intensität ausgesetzt sind, die höher ist, als die Beugungsgrenze. Und auf diese Weise schalten wir diese Moleküle ab und nur die Moleküle in der Mitte bleiben übrig. Und schon haben wir es geschafft. Denn jetzt können wir Funktionen trennen, die näher als die Beugungsgrenze sind. Wir können die Stränge trennen, weil die dazugehörigen Moleküle, gezwungen sind zeitsequentiell zu emittieren, weil wir dieses Ein-/Ausschaltsspiel gespielt haben, und nur diese in der Lage sind, Licht durch den Detektor zu produzieren. Ich entferne jetzt den Donut, nur um es deutlich zu machen, dass dies ein Zustandsspiel ist, das wir hier spielen, und nicht eine Möglichkeit, um die Art des Licht zu verändern, sondern den Zustand. Hier sehen Sie eine Beugungszone. Dieses Molekül hier drin, diese Moleküle sind gezwungen, die ganze Zeit hier im Grundzustand zu verbleiben, denn sobald sie nach oben gelangen, werden sie sofort wieder nach unten geschoben. Und nur die Moleküle im Zentrum sind berechtigt, den Ein-Zustand einzunehmen. Hier spielen wir zwei verschiedene Zustände innerhalb der Beugungszone und wir können die Funktionen auseinander halten. Ich setze den Donut wieder ein. Das war die Idee. Sie können sagen, oh, das klingt logisch, aber ob sie es glauben oder nicht, als ich dies im Jahre 1994 in Turku veröffentlichte, hat kaum jemand daran geglaubt. In der Tat habe ich mich an vielen Orten beworben, in den Vereinigten Staaten, in Deutschland, in Europa natürlich. Ich habe vielleicht 25 Bewerbungen mit dieser Idee herausgeschickt, aber vergeblich. Ich hatte nicht die richtigen Voraussetzungen - war nicht in Stanford, Harvard, Bell Labs gewesen, nichts. Turku war ein Ort, von dem niemand gehört hatte. Es war nicht leicht. Es war daher schwierig zu überleben, sowohl finanziell als natürlich auch akademisch. Und keinen starken sozialen Hintergrund zu haben, glauben Sie mir, bedeutete, es war nicht einfach. Aber ich arbeitete an einem faszinierenden Problem, und ich war glücklicher als während meiner Doktorarbeit. Warum? Weil ich es wollte, weil ich daran arbeiten wollte. Dies war ein Thema, das mich faszinierte. Ich war der einzige, der wirklich daran glaubte, weit über die Beugungsgrenze hinausgehen zu können, und es war cool dies zu tun. Natürlich irgendwann muss jemand zu Hilfe kommen, und ich hatte das Glück, dass das Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie von mir erfuhr und mir eine So war es. Nach einigem Fortschritt wurde klar, dass man die Beugungsgrenze überwinden kann. Dies ist die Standard-Auflösung, konfokal. Dies ist eine STED-Auflösung. Und Sie sehen, dass die Verstärkung der räumlichen Auflösung sehr offensichtlich ist. Jetzt können wir diese molekularen Untereinheiten der Kernporenkomplexe hier in der achtfachen Symmetrie sehen, aber im Standardfall, konfokal, was natürlich zu den Besten gehörte, gibt es keine Möglichkeit, sie zu sehen. Natürlich, wenn Sie diese hohe räumliche Auflösung haben, erhalten Sie neue Informationen. Ich möchte Ihnen nur ein oder zwei Beispiele geben. Nehmen wir die Virologie, dies ist wichtig, denn Viren haben einen Durchmesser zwischen 30 und 150 Nanometer und sind kleiner als die Beugungsgrenze. Wenn Sie eine Proteinverteilungen auf dem Virus mit einem normalen Mikroskop projizieren wollen, ist es nur ein Klecks von etwas Verschmierten. Aber wenn man das Unterbeugungs-Imaging mit STED anwendet, dann sehen Sie, dass sich Muster bilden, die in diesem Fall abhängig vom Reifezustand des Viruses sind. Was hier festgestellt wurde, ist dass die reifen Teilchen, solche, die die nächste Zelle infizieren können, ihre Env-Proteine an einem einzigen Ort haben. Hier kann man zeigen, dass man das Innere mit der hohen räumlichen Auflösung sehen kann. Was für eine Überraschung! Nun, ich denke die Stärken eines fokussierenden Lichtmikroskops sind, dass man natürlich lebenden Zellen darstellen kann. Und die Bilderfassung lebender Zellen erfolgt selbstverständlich am besten, wenn man direkt zu einem lebenden System geht. Dies entspricht etwa 20 Mikrometer von der oberen molekularen Schicht des Gehirns einer transgenen Maus, bei der einige der Neuronen mithilfe eines gelb fluoreszierenden Proteins dargestellt sind. Jetzt sehen Sie, dass wir die Bilder aufzeichnen können. Was Sie sehen, sind diese dendritischen Dornen mit viel höherer Klarheit als zuvor, mit subtilen Bewegungen. Und das Sehen dieser Bewegungen erfordert natürlich auch die hohe Auflösung, denn sonst wäre es verschmiert. Natürlich gibt es noch viel mehr Arbeit in diesem Bereich. Es besteht kein Zweifel. Ich habe aber allen Grund zu glauben, dass wir am Ende in der Lage sein werden, die Verteilung von Molekülen hier an einer Synapse zu sehen und wir vielleicht einen visuellen Hinweis auf die Maus erhalten und sehen, was im Gehirn auf molekularer Ebene passiert. Damit komme ich zurück auf die Frage mit der Auflösung. Als Physiker möchte ich natürlich wissen, welche räumliche Auflösung wir jetzt mit dieser Methode erhalten können. Wo ist das Ende? Was ist die konzeptionelle Grenze? Was ist die praktische Grenze? Die Frage zur konzeptionellen Grenze kann sehr leicht beantwortet werden. Wenn wir natürlich die Helligkeit des Strahls erhöhen, dann werden immer mehr Moleküle im Durchschnitt abgeschaltet werden sodass die Region, in der die Moleküle den Ein-Zustand annehmen dürften, immer kleiner würde. Und in der Tat wäre die Größe hier vom Verhältnis zwischen der Helligkeit des Donuts oder Rings und dem Scheitel und der Schwellenintensität abhängig, was ein Charakteristikum des Moleküls ist. Und dies bedeutet jetzt, dass wir Abbes Gleichung so anpassen müssen, dass es keine Beugungsgrenze gibt, aber das Verhältnis hier im Nenner steht. Wenn es größer wird, dann geht es zurück auf Null, was bedeutet, dass die begriffliche Grenze jetzt die Größe des Moleküls ist. Und das ist keine Überraschung, da wir unter Verwendung von Molekülen trennen, und selbstverständlich dann muss die konzeptionelle Grenze das Molekül sein, die Größe des Moleküls. Wir können also konzeptionelle Molekular-Stufenauflösung haben. Nun hängt die praktische Lösung natürlich davon ab, wie gut Sie dieses Spiel spielen können, dieses Ein-Aus-Spiel. Um Moleküle für STED zu erhalten, brauchen wir welche, die zwischen 20 und 40 Nanometer lang sind, abhängig vom Molekül und von der molekularen Umgebung. Nur um sicherzugehen, dass dieses Konzept ausgearbeitet und weiterentwickelt werden kann, wenn Sie ein Fluorophor verwenden, dass sich erlaubt, so oft wie Sie wollen ein- und aus geschalten zu werden, diese Farbe zentriert sich beispielsweise in Diamanten, dann können Sie in diesem Fall ein sehr extremes Auflösungspotential erreichen. Hier beispielsweise 4,2 bis 2,4 Nanometer. Angesichts der Tatsache, dass dies einer Wellenlänge von 775 entspricht, ist das ein kleiner Bruchteil davon. Dies mag zwar nur wie ein experimenteller Beweis aussehen. Aber es gibt auch Anwendungen dafür, weil diese Farbzentren, die geladenen Stickstoffstellen, derzeit bei Physikern sehr beliebt sind, weil sie zum Beispiel als Qubits für die Quanteninformation bei Raumtemperatur verwendet werden können oder zur magnetischen Abtastung im Nanomaßstab, so dass es mehr als nur Biowissenschaften ist. Es geht hier nicht nur um die Biowissenschaften. Womit ich wieder auf das Grundkonzept zurückkomme. Ich sagte, der Name des Spiels, das wir spielen, ist Ein-Aus. Wir haben den Beginn hier, hier das Einsetzen, das ist der Grundzustand, und dies ist der denkbar einfachste Zustand. Es geht mit dem Licht nach oben, und mit dem Licht wieder nach unten. Aber natürlich, sobald Sie erkennen, dass es hier um Ein-Aus geht, nicht nur um die Herstellung von simulierten Emission, dann wissen Sie, vielleicht gibt es allerlei andere Zustände im Molekül, mit dem Sie das gleiche Spiel spielen können. Beispielsweise kann man das Molekül in einen Meta-Staat mit dem dunklen Zustand drücken, wie einen Triplett-Zustand. Oder wenn Sie in die Chemie-Bücher schauen, dann finden Sie so etwas wie Cis-Trans-Photoisomerisierung. Sie können die Atome sozusagen verlagern und so das Ein-Aus-Spiel spielen. Und jetzt fragen Sie sich, warum Ihnen diese Übergänge wichtig sind, wenn Sie einen sehr grundlegenden hier haben, der auf jeglichen Fluorophor zutrifft. Es gibt einen triftigen Grund. Vergessen Sie nicht: Wir trennen, indem wir die Moleküle vorübergehend in einen anderen Zustand versetzen. Dann dieses an, dann dieses aus. Dann ist natürlich die Lebensdauer des Zustands wichtig und es ist offensichtlich, dass je länger die Lebensdauer, desto leichter ist es, einen Unterschied in den Zuständen zu schaffen. Aber hier verschwindet der Zustand nach Nanosekunden. Hier dauert es länger, Mikrosekunden, Millisekunden. Hier haben wir etwas, das optisch bistabil ist und wenn es bistabil ist, gibt es mehr Zeit. Was bedeutet, dass wir für dieses Spiel weniger Licht pro Einheit oder weniger Photonen Brennstoffkraft unter Verwendung der Zeit benötigen. Was bedeutet, dass diese Schwellenintensität sinkt, was bedeutet, dass die erforderliche Intensität sinkt so können Sie die Beugungsgrenze bei geringerem Lichtpegel durchbrechen, wenn Sie beispielsweise die Cis-Trans-Isomerisierung anwenden. Das war natürlich faszinierend, weil Sie dies auch bei schaltbaren fluoreszierenden Proteinen tun können. Ich möchte Ihnen ein Beispiel zeigen, wo dieses Konzept funktioniert hat. Ich konnte es nicht mehr STED nennen, weil es angeregte Emissionen enthält. Wenn Sie wenig Licht haben, wie es hier der Fall ist, dann können Sie viele Ringe oder Löcher oder Donuts erzeugen oder was auch immer, und dies wurde hier gemacht. Sie können die ganze Sache parallelisieren und dann eine große Fläche sehr schnell aufnehmen und sogar bei relativ niedrigen Lichtverhältnissen, weil es sich hierbei um einen metastabilen Übergang mit langlebigen Zuständen handelt. Hier, diese lebenden Zelle, diese Filamente, wurden mit 100.000 Donuts in weniger als zwei Sekunden aufgezeichnet. Ich zeige nur, dass die Entwicklung weitergeht und nicht nur das; es ist der molekulare Übergang ist, der entscheidend ist und die Leistung des Systems bestimmt. Und damit komme ich zur letzten Frage, die ich hier untersuche. Was braucht es, um die beste Auflösung zu erhalten? Angenommen, Sie hätten diese Frage im 20. Jahrhundert gefragt. Was wäre die Antwort gewesen? Nun, gute Objektive, warum? Weil die Trennung der Funktionen durch die Fokussierung von Licht durchgeführt wird und wenn Sie dann kleine Flecken erzeugen, können Sie besser trennen. Hier einen Lichtpunkt zu produzieren, so scharf wie möglich, hier einen Lichtpunkt produzieren, auch so scharf wie möglich - das legt die Auflösung fest. Aber das ist natürlich beugungsbegrenzt. Wenn mehrere Funktionen innerhalb dieses Lichtpunkts fallen, können wir sie nicht auseinander halten. Was war die Lösung für dieses Problem? Die Lösung war nicht nur Mithilfe des Phänomens der Fokussierung zu trennen, sondern mithilfe eines Zustandsübergangs zu trennen. Bereiten Sie die Moleküle in zwei verschiedenen Zuständen innerhalb dieser Beugungszone vor und dann können Sie sie auseinander halten. Ich werde Ihnen ein paar Beispiele von Zustandsübergängen geben, die verwendet werden können. In diesem STED-Konzept und seinen Derivaten, verwenden wir ein Lichtmuster, um festzulegen, wo sich die Moleküle im "An"-Zustand befinden und wo sie "aus" sind, um deren Ist-Position vorherzubestimmen und dieses An-/Aus-Spiel zu spielen. Sie steuern also die Zustände und die Position der Zustände durch die Verwendung eines Lichtmusters. Wie lässt es sich mit dem anderen bahnbrechenden Konzept vergleichen, das zuerst gemacht wurde und, wie von Eric Betzig vorgeschlagen, auf der Entdeckung von W. Moerner basierte, dass man einzelne Moleküle erkennen kann? In diesem Fall wird das Ein-Aus-Spiel individuell gespielt. Individuell pro Molekül und auf diese Weise sind natürlich die Eigenschaften unterschiedlich. Dies ist ein grundlegender Unterschied. Es ist wirklich ein grundlegender Unterschied, denn jetzt können Sie das Ein-Aus-Spiel auf einer Einzel-Molekül-Basis spielen, was eine Reihe von Vorteilen hat. Wenn Sie es stochastisch tun, wenn Sie es stochastisch im Raum tun, dann wissen Sie nicht, wo sich das Molekül befindet. Was ist die Lösung? Sie müssen auf Zustände zurückgreifen, die viele Photonen in einem Bündel erzeugen, hier bei einer Kamera, und einem verpixelten Detektor, dann erhalten Sie die Koordinaten und irgendwann werden Sie auch die Position kennen. Natürlich brauchen Sie immer viele Photonen, um entweder die Koordinaten herauszufinden, oder um diese zu definieren, weil sich ein Photon hier oder hier oder dort innerhalb der Beugungszone verirrt. Nur mit vielen Photonen können Sie mit Koordinaten umgehen. Aber das ist nur die Koordinate, die natürlich entscheidend ist und benötigt wird, ist. Aber für die Trennung, die benötigt wird, um Funktionen auseinander zu halten, benötigen Sie den Zustandsübergang. In der Tat, um die Funktionen zu trennen, brauchen Sie jetzt, einen Zustandsübergang, der im einfachsten Fall ein- und ausgeschaltet werden kann. Sie fluten alles mit Licht, aber nur ein Molekül oder nur eine Gruppe von Molekülen an bestimmten Orten darf Licht emittieren und so überwinden Sie die Beugungsgrenze. Es sind die Zustandsübergänge, die die entscheidende Rolle spielen, damit wir zu einer Super-Resolution kommen. Es ist kein Zufall, dass es Fluoreszenz und Nicht-Fluoreszenz ist, die uns erlaubt die Beugungsgrenze zu überwinden, denn das ist das einfachste, womit man spielen kann: es ein- und auszuschalten. Im 20. Jahrhundert waren es die Objektive, aber was jetzt die Auflösung bestimmt, was die Leistung bestimmt, sind die Moleküle. Also muss es in der Chemie diskutiert werden. Sie möchten dies fördern, dann müssen Sie die Moleküle hier fördern. Die Geschichte geht weiter, weil Sie sich nicht nur das Ein-Aus in der Fluoreszenz vorstellen können, sondern Sie können sich auch Absorption, Nicht-Absorption, Streuung, Nicht-Streuung, Spin-ups, Spin-down, bindend, nicht-bindend vorstellen können. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, diese Idee der vorübergehenden Platzierung der Moleküle innerhalb der verschiedenen Zustände innerhalb der Beugungszone weiterzuentwickeln. Damit komme ich auf fast zu meiner letzten Folie. Jetzt ist es sehr einfach, Abbes Gleichung zu erweitern. Wir müssen nur diesen Quadratwurzelfaktor einsetzen und dieser Quadratwurzelfaktor sagt uns, dass wir uns auf die molekulare Ebene begeben müssen. Was bedeutet dies? Was bedeutet dies? Es bedeutet offensichtlich einen Zustandsübergang. Was ich also sage will, ist das Lichtmikroskopie-Auflösung nicht nur mit Wellen zu tun hat. Es geht um die Wellen und Zustände und wenn Sie die Zustände in Ihre Gleichung miteinbeziehen, dann können Sie das Spiel ändern. Und dies führt dazu, was das Spiel in der Auflösung in einem fokussierenden Lichtmikroskop verändert hat. Hiermit möchte ich meine Anerkennung für die Arbeit der Menschen in meinem Labour zum Ausdruck bringen, die zu dieser Entwicklung beigetragen haben. Wir hatten eine Menge Spaß, auch zu Zeiten, als wir die einzigen waren, die in diesem Bereich tätig waren. Eine letzte Sache möchte ich am Ende noch erwähnen. Es war nicht dieser Kerl, der die Entwicklung in diesem Bereich begann. Sondern es war er, und er ist derjenige, der eigentlich den Preis verdient. Vielen Dank.

Stefan W. Hell (2015)

Optical Microscopy: the Resolution Revolution

Stefan W. Hell (2015)

Optical Microscopy: the Resolution Revolution

Abstract

Throughout the 20th century it was widely accepted that a light microscope relying on conventional optical lenses cannot discern details that are much finer than about half the wavelength of light (200-400 nm), due to diffraction. However, in the 1990s, the viability to overcome the diffraction barrier was realized and microscopy concepts defined, that can resolve fluorescent features down to molecular dimensions. In this lecture, I will discuss the simple yet powerful principles that allow neutralizing the limiting role of diffraction1,2. In a nutshell, feature molecules residing closer than the diffraction barrier are transferred to different (quantum) states, usually a bright fluorescent state and a dark state, so that they become discernible for a brief period of detection. Thus, the resolution-limiting role of diffraction is overcome, and the interior of transparent samples, such as living cells and tissues, can be imaged at the nanoscale.

 

1. Hell, S.W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science 316, 1153-1158 (2007).
2. Hell, S.W. Microscopy and its focal switch. Nature Methods 6, 24-32 (2009).


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