Robert Huber (2014) - Structural Biology and its Translation into Practice and Business: My Experience

As a student in the early 1960s, I had the privilege to attend winter seminars organized by my mentor, W. Hoppe, and by M. Perutz, which took place in a small guesthouse in the Bavarian-Austrian Alps

Good morning. Now you saw many beautiful biological molecular structures in the presentations throughout the conference. And there is a history behind and I would like to start out with that history, which leads us more than 100 years back. So the story began with this I would say ugly diffraction photograph of a crystal taken by Laue and his associates Friedrich Knepping, yet they made a revolution. This photo showed the crystals of three-dimensional lattices and X-rays or electromagnetic radiation, offering a chance to determine crystal structures. This is Laue's publication in the 'Berichte der Bayerischen Akademie der Wissenschaften', a journal in modern terminology of 'impact tract is zero', yet the Stockholm committee members read it and they gave him Nobel Prize 2 years later. This is Laue at one of the very early Lindau conferences showing to Count Bernadotte, the founder of the Lindau meetings, a crystal lattice. These are the founding fathers of X-ray diffraction, Röntgen, of course, the discoverer of x-rays, Laue. These are the original machines that you can see in Munich on display in the Deutsches Museum. Now, father and son Bragg who worked in England heard about Laue's experiment, repeated it, confirmed it and immediately understood that one can determine crystal and molecular structures; founded a school, by the way, in Cambridge, England, where Max Perutz worked, the father of protein crystallography, who found a way to decipher the complex diffraction patterns of proteins. Now this is the growth of biological crystallography, a slow beginning. I started in '68 working on a red insect protein and surprisingly found out that it is related the whale myoglobin - first example of molecular evolution by structure determination. Slow growth and then an explosive exponential growth from about 1990 on. So why? Because of the technical advances - no time to talk about that. The fact that we have to see the molecules to understand biology and application in medicine biotechnology on which I'll try to focus. The short review of what techniques we do have, this is NMR - of course you heard Kurt Wüthrich about it and its special properties. This is crystallography in which I will focus. And the wonderful progress in electron microscopy which we face in the last 10 or 15 years - again by the technical and methodological advances. There is a synergy between crystallography and electron microscopy. And I would like to show that with a work that I was involved in with Michel Ehrmann and Tim Clausen, where we had determined the structure of a intracellular protease and chaperone called DegQ, a ubiquitous protein with some variations. Now this is inactive as we crystallise it. But in the presence of substrate it will ligomerise and become active. So it turns from a trimer or a heximer into a 24-mer which we could crystallise, or a 12-mer, which then was analysed by electron microscopy with Helen Saibil into the shape that we get by electron microscopy. We can fit the higher resolution crystal structure and get a pseudo-atomic model. Just one sentence about another X-ray diffraction method of molecules in solution: small-angle X-ray scattering which has also progressed enormously and gives us possibility to determine shapes. In this particular case we looked at an actin-spire complex. We had high resolution crystals but we could not see from the crystals how the arrangement in solution is, simply because the actin was well ordered, the spire was well ordered, but the linkers between these individual force bio domains were disordered in the crystals; so we did not know from the crystal structure which belongs to which. But the distance constraints then gave 3 solutions, unique solutions: so this, this or this - an easy discrimination by the small-angle X-ray scattering. Now I come to the focus of my presentation - structure-based ligand design. I will illustrate this with one example, this thrombin, which we analysed about 25 years ago, a major enzyme in the clotting cascade and a major focus of drug design: the apoenzyme, ligand binding site, the substrate binding site. Chemical intuition then led us to this small ligand which is already a very good inhibitor. The lock and key principle. Simple, you would say: chemical intuition, space complementarity, electrostatic complementarity. And this is of course where computers can help. There are programmes around that define binding pockets and detect the cavities. Now they actually make it possible to merge the enormous chemical space that we have with the protein space, which is much smaller by selecting sublibraries from this chemical space. Now I would like to put some flesh onto this drug design experiment and show you a recent example that I carried out with my small Emeritus group working on kinases which are extremely important drug targets for pharma research and development. The problem is that there are more than 500 protein kinases with different physiological functions, and if we would like to target one then we run into difficulties because they all have a principle structural scaffold. So how can we specifically target the right one? And what we especially focused on is not only to improve affinity but to improve residence time, which turns out to be a major issue in drug development. So what we did was working on CDK8/CycC transcriptional kinase, which regulates the activity of foreign polymerase by way of a huge mediator complex. So we determined the structure of CDK8/CycC that you see here, and of course the structure immediately explained one of the special properties of CDK8: its specificity for cyclin and many other things. There is a small inhibitor bound here. What we tried to do is to increase residence time in a rational way. And how did we go about it? We chose a starting ligand that has an anchor there and then a conserved linker group, a urea moiety, where the substituents increased actually in that way, in this process; so the residence time is from less than a minute to 1,600 min. Another example that leads me further back to my academic research, that is the work on thrombin inhibitors. This is the coagulation cascade. Meanwhile we do have structural information on almost all these components in the coagulation cascade. First one was thrombin that we analysed 25 years ago and this is what we saw. So modelling a small inhibitor here and then improving it by increasing the size of one of the substituents here. Let me continue and tell you the story about the use of natural compounds as guides for drug design. So we looked at the natural thrombin inhibitors that are found in blood eating animals. This is the leech thrombin Hirudin; Hirudin actually is an approved anticoagulant drug. These are others. And also variants of the Hirudin have been made, semisynthetic chimeric variants which used the C-terminal tail that we saw as important in Hirudin, connected to a chemical substituent that targets the active site. So nature guided us in that case. Where are the problems with translation? The problems are that here is academic research with wonderful ideas, but not yet progressed enough for industry to become interested. So there is a gap, which I may call financing gap, translation gap, or innovation gap, and how to bridge this gap to really allow academic ideas to enter the industrial pharma world. I mentioned an attempt by the Max Planck society which I am associated, was associated, which founded an elite discovery centre that tries to bridge this gap by taking up ideas or materials at an early stage from academia, developing it further such that they become interesting for industry. I approached this new institution and suggested the proteasome as a project. This slide shows...summarises the regulatory mechanism that we discovered in 30 or more years of protease research. Proteases and their natural inhibitors and the various ways how proteolytic activity, which may be very dangerous but is also essential in physiology, how this is regulated. I have no time to discuss these various mechanisms that we saw, but go on to the proteasome and the novel regulatory mechanism that we saw there. Because what we found is that the proteasome is a huge particle consisting of 28 subunits and it has its active sites internal, inside the particle, inaccessible, because the protein complex has closed gates and regulation is by opening these gates, such that the substrate can diffuse inside the particle and be turned over. This I will not discuss, but it is a novel quite interesting regulatory mechanism that we and Clausen and Ehrmann saw in the DegQs which I mentioned already. They are intercellular protease, they swim around in the cell in an inactive form, and in the presence of substrate they become activated in a way that we do understand. And not only become active but they form large shelves of ligamers of 20-mers or 12-mers. Now back to the proteasome, which plays an essential role in cell life. You heard Aaron Ciechanover talking about the ubiquitination cascade. The executioner of this is the proteasome which degrades poly-ubiquitinated substrate. The proteasome is only the base cleaner, it recognises denatured proteins, degrades them and if they are foreign then it makes the antigenic peptides which trigger in complex with MHC class I molecules the t-cells immune response - so absolutely essential you would say. This is the proteasome as we determined it first in a simplified version in our hair. Simplified in the sense that it has the basic architectural features of the eukaryotic proteasome; it has the basic mechanism of the eukaryotic proteasome. But it's chemically very much simpler. It has only alpha subunits and beta subunits - 28 of them. Then later we moved on to the eukaryotic proteasome where all the alphas and all the betas are different. So a beautiful example of evolution that is maintaining the basic features in architecture and in enzymatic mechanism but diversifying, differentiating, generating specificity. Now the surprise came when it was found that the proteasome is a drug target. That was a finding by serendipity of an American company. They of course had information on our published structure, and they designed a simple boronate peptide which, as we have later shown, binds covalently to the proteasome and they discovered that it offers a novel strategy against cancer, in particular against multiple myeloma. Much excitement because it was an entirely novel principle. It was an enormous commercial success - not for us but for the company. It spurred interest around the world, a lot of activities: screening libraries, chemical libraries and in particular natural compounded libraries. Many of the compounds which were found active were sent to us for structural analysis. This is a very small collection that you see here. Highlighted in yellow are natural compounds - compounds that have been discovered in natural compound libraries since sponges and bacteria and what have you. Very different chemical as you can see, quite exciting - what nature does to make specific proteasome inhibitors for purposes that we still don't understand. This is an example we had been directly involved in collaboration with a plant biologist who looked at the pathogen that kills bean plants. And they found that these serums need a virulence factor of that structure. We found out that it inhibits the proteasome, that is the electron density of the ligand covalently bound to one of the 28 subunits of this macromolecule. It leads to an accumulation of polyubiquitin-labelled cyclinB1 in the plant cell which then causes apoptosis. Of course this has been synthesised, variants have been made, there is some activity of drug design, a development with this new chemical entity as well. Now as I said I had suggested this to LDC to develop further - until we realised that we compete with dozens of big pharmas and we probably as a small group had no chance. So we thought about a niche and my suggestion of such a niche was to look at immunoproteasome. Now the constitutive proteasome is present in all the cells but in hematopoietic cells, in particular under inflammatory conditions, there is a preferred expression of the immunoproteasome. Which is almost identical to the constitutive proteasome except the exchange of 2 type-3 subunits for others, for the immune subunits which show a somewhat different specificity, and in particular they show enhanced activity. I can come back to that later. So we then 2 years ago, one and a half years ago focused on immunoproteasome to develop specific inhibitors. Why? Simply because all the constitutive proteasome inhibitors which are important in market show very serious toxicity, in particular against neurons. And there were already indications that the immunoproteasome and its inhibition does not have this kind of toxicity. In addition inhibiting the immunoproteasome would offer a new strategy against autoimmune disorders. So we were quite happy to shift gears and develop then immune proteasome-specific inhibitors. Thousands of compounds have been made and there is enormous progress. But this I would like to mention because it's very recent work of my small group finding out the general rule that makes ligands immune-specific. And we had data of about 50 proteins, yeast proteasome ligand complexes, and all of them looked very much the same. Of course we saw well defined the inhibitor but there were no obvious structural changes in the proteasome itself by simply overlaying these molecules, until we then applied a technique that the molecular dynamics community knows very well and has developed, that is Principal Component Analysis. This is a way to define clusters of structures and the structural differences between them. Now what we found is that these yeast proteasome complexes fall clearly in 2 clusters, the black and the red cluster. And the black cluster encompasses the apo-form and the non-peptidic ligands, and the red cluster encompasses the peptidic ligand complexes. What does this mean? This is a peptidic ligand, intercalated between 2 strands of the receiving active subunit and forming exactly 4 hydrogen bonds. This is the signature for peptidic ligand and what this does when this ligand binds, it causes a domain closure to enable the formation of these hydrogen bonds. This we saw in yeast. Then we projected onto the principle eigenvector the murine and later then also the human proteasome ligand complexes. In the constitutive mouse proteasome we found exactly that same structural change, domain closure. And to our great surprise and joy we found the immunoproteasome does not require this structural change, which means that the immunoproteasome does not have to undergo this structural change when it binds ligands. So it's already in the preferred configuration for ligand binding, immediately explaining the enhanced activity. Which of course means for drug design that we should prefer or develop further compounds that allow this kind of hydrogen bonding. This is a molecular dynamic simulation of all the relevant murine species which showed stable conformers for about 20 nanoseconds. When we, however, removed the peptidic ligand from the murine constitutive species then we saw an immediate transition into the apo-form. This did not occur with the immunoproteasome - beautifully confirming what we saw experimentally before. Well, I'm now in the last few minutes that I have and I have to rush. I thought about founding a company together with a collaborator earlier, a doctoral student, which now has 70 collaborators, they have their own building in Martinsried, close to the biochemical Max Planck Institute. Now apart from all the pleasures that I have to see the science being done there, I'm particularly pleased to have helped to generate 70 jobs. And I tell the young people there is beautiful and interesting research outside academia in industry, in big companies and in medium-sized companies like here. What do they offer? They offer the whole work flow that is necessary for structural determination. Now they do it for clients. They do it for big pharma, determine protein target ligand structures. This is what they have on the shelf that is ready to go. If a client comes and wants a crystal structure with his ligand of one of these kinases, then he can get the answer within a few weeks. Well, I have to speed up. I have a work place there and what I'm particularly interested in is in the aspect of improving crystals. Now we have heard that the largest hurdle in protein crystallography is making crystals, but often if you have crystals they are not good enough for a detailed diffraction study. And we had developed earlier on in the academic setting, and now continued in this industrial setting, a way to a needle protein crystal by precise change of the humidity. What this photo shows is what happens when you change precisely the humidity just by a few percent: you find that from an initial low ordered crystal you can in steps generate new crystal phases with an enormously improved crystalline order. Well, we have continued with that and quite recently - this is work which just appeared in Acta Cryst - found out that we do not have to change the humidity, we can make it simpler by infrared irradiation - very precise again either pulsed or continuous and at the same time monitoring the volume of the crystal. Now the volume of the crystal changes with the humidity or, in that case, with the infrared irradiation. And then there is a kink in this curve, then this is indication of a new crystal phase which is then occasionally better or like - in this case CLK kinase where we moved from 3.5 angstrom to 1.75 angstrom. Well I skip... I use the last minute again to describe briefly a second company which I co-founded 10 years ago with 2 collaborators, that has an entirely different business plan, namely the development of a new therapeutic agent, namely Fc-receptors for autoimmune diseases. This is an old story, it's an antibody structure on which we worked. You see Hans Deisenhofer here is co-author of this very early work in the mid-70s when we analysed the first antibody structures. And the antibodies as you know are central in the cellular immune response, in the humoral immune response. And we were then particularly interested in the cellular immune response which is due to the interaction of an opsonised antigen. So there are antibodies bound to this bacteria with Fc-receptors. Now these are cell bound...membrane bound receptors which occur in 2 versions: It's the interplay between these 2 which maintains proper immune response. So of course we did what we always do, namely determining structures of the Fc part with the receptor. And then we thought that we can make use of this information by using a soluble receptor as an antagonist for the cellbound receptor and in that way then prevent or modulate an immune response. Now we still don't know whether this is the mode of action, or it's a part of the mode of action. But the animal experiments which we still did in the academic setting then showed fantastic activity in various animals models of autoimmune diseases. Oh - well, I'm at the end. I just wanted to show how slow this development and how costly it actually is, but it is in Clinical Phase I and Clinical Phase II and the investors, which were necessary of course, were still patient. So later on the other approach is to have specific antibodies against the inhibitory receptor and again there is crystallography behind, showing that the antibody that we have does not overlap with the Fc binding which is a prerequisite for diffraction. I show this not only because it's my beautiful home country - Munich, which you should visit; I think it's very close, 170 km. But I show it because this is the Munich University, the old part, this is where Laue worked, where Röntgen was professor of Experimental Physics and where everything that I told you began. Thank you.

Guten Morgen. Im Verlauf der gesamten Konferenz haben Sie in den Präsentationen viele schöne biologische Molekularstrukturen gesehen. Dahinter steht eine Geschichte, und ich möchte mit dieser Geschichte beginnen, die uns mehr als 100 Jahre in die Vergangenheit zurückführt. Also, die Geschichte begann mit diesem - ich würde sagen: hässlichen - Lichtbrechungsfoto eines Kristalls, das von Laue und seinen Mitarbeitern Friedrich und Knepping aufgenommen wurde, und dennoch starteten sie eine Revolution. Dieses Foto zeigte, dass Kristalle dreidimensionale Gitter sind, und Röntgenstrahlen oder elektromagnetische Strahlung, boten somit die Möglichkeit, die Struktur von Kristallen aufzuklären. Dies ist Laues Veröffentlichung in den 'Berichte[n] der Bayerischen Akademie der Wissenschaften', einer Fachzeitschrift, die in der heutigen Terminologie einen Impact-Faktor von null hatte, doch die Komiteemitglieder in Stockholm lasen sie trotzdem und gaben ihm zwei Jahre später den Nobelpreis. Dies ist Laue auf einer der sehr frühen Lindau-Konferenzen. Hier zeigt er Graf Bernadotte, dem Gründer der Lindau-Treffen, ein Kristallgitter. Dies sind die Gründungsväter der Röntgenstrahlenbrechung: Röntgen natürlich, der Entdecker der Röntgenstrahlen, und Laue. Dies sind die Originalgeräte, die sie im Deutschen Museum in München ausgestellt finden können. Nun, Vater und Sohn Bragg, die in England arbeiteten, hörten von Laues Experiment, wiederholten es, bestätigten es, und begriffen sofort, dass man damit Kristall- und Molekularstrukturen aufklären konnte. Nebenbei bemerkt, gründeten sie eine Schule, in Cambridge, England, wo Perutz arbeitete, der Vater der Proteinkristallografie, der eine Methode fand, mit der man die komplexen Brechungsmuster von Proteinen entziffern konnte. Nun, dies ist die Entwicklung der biologischen Kristallographie, eine langsamer Anfang. Ich begann 1968 an einem roten Insektenprotein zu arbeiten und fand erstaunlicherweise heraus, dass es Verwandtschaft mit Wal-Myoglobin hatte - das erste Beispiel der molekularen Evolution durch Strukturaufklärung. Eine langsame Entwicklung und dann ein explosives exponentielles Wachstum ab etwa 1990. Warum also? Aufgrund der technischen Fortschritte - ich habe keine Zeit darüber zu sprechen. Tatsache ist, dass wir die Moleküle sehen müssen, um ihre Biologie und die Anwendung in der medizinischen Biotechnologie, worauf ich mich versuchen werde zu konzentrieren, zu verstehen. Ein kurzer Überblick über die Techniken, die uns zur Verfügung stehen: dies ist NMR. Sie haben natürlich Kurt Wüthrich darüber und über seine besonderen Eigenschaften gehört. Dies ist die Kristallographie, auf die ich mich konzentrieren werde. Und dann gibt es da noch den wundervollen Fortschritt in der Elektronenmikroskopie, den wir in den letzten 10 oder 15 Jahren beobachten können - wiederum aufgrund von technischen und methodischen Fortschritten. Es gibt eine Synergie zwischen der Kristallographie und der Elektronenmikroskopie. Und ich möchte das anhand einer Arbeit demonstrieren, an der ich mit Michael Ehrmann und Tim Clausen beteiligt war. Wir hatten die Struktur einer intrazellularen Protease und des Chaperones namens DegQ aufgeklärt, eines ubiquitinösen Proteins mit einigen Variationen. Nun, dies ist inaktiv, da wir es kristallisieren. In Gegenwart eines Substrats oligomerisiert es jedoch und wird aktiv. Es verwandelt sich von einem Trimer oder einem Hexomer in ein 24mer, den wir kristallisieren konnten, oder ein 12mer, der dann von Helen Saibil elektronenmikroskopisch analysiert wurde. In die Form, die wir durch Elektronenmikroskopie erhalten, können wir die hochauflösende Kristallstruktur einpassen und erhalten ein Pseudo-Atommodell. Nur ein Satz über die Methode der Röntgenstrahlbrechung an Molekülen in Lösung: eine Röntgenstrahlstreuung in kleinen Winkeln, die ebenfalls enorme Fortschritte gemacht hat und uns die Möglichkeit gibt, räumliche Gestalten zu ermitteln. In diesem besonderen Fall schauten wir uns einen Spire-Aktin-Komplex an. Wir hatten hochauflösende Kristalle, wir konnten jedoch den Kristallen nicht entnehmen, wie ihre Anordnung in Lösung war, ganz einfach deshalb, weil das Aktin wohlgeordnet war, der Spire wohlgeordnet war, die Verbindungen zwischen den BAR-Domänen der individuellen Kräfte in den Kristallen jedoch nicht. Wir konnten der Kristallstruktur also nicht entnehmen, was wozu gehört. Die Abstandsrestriktionen ergaben dann jedoch drei Lösungen, einzigartige Lösungen: also diese, diese oder diese - eine leichte Unterscheidung mithilfe der Kleinwinkel-Röntgenstrahlstreuung. Nun komme ich zum zentralen Punkt meiner Präsentation: dem strukturbasierten Liganden-Design. Ich werde dies anhand eines Beispiels veranschaulichen, mit diesem Thrombin, das wir vor etwa 25 Jahren analysiert haben. Es ist ein wichtiges Enzym in der Blutgerinnungskaskade und ein zentraler Gegenstand der Medikamentenentwicklung: das Apoenzym, die Bindungsstelle des Liganden, die Bindungsstelle des Substrats. Die chemische Intuition führte uns dann zu diesem kleinen Liganden, der bereits ein sehr guter Inhibitor ist. Das Schlüssel-Schloss-Prinzip. Einfach, könnte man sagen: chemische Intuition, räumliche Komplementarität, elektrostatische Komplementarität. Und an dieser Stelle können natürlich Computer helfen. Es gibt Programme, die Bindetaschen definieren und Aushöhlungen entdecken. Nun, sie haben es tatsächlich ermöglicht, den enormen chemischen Raum, den wir haben, mit dem Proteinraum zusammenzuführen, der wesentlich kleiner ist, indem Sub-Libraries aus diesem chemischen Raum ausgewählt wurden. Nun, ich möchte ihnen bezüglich dieses Medikamentenentwicklungsexperiments einige weitere Einzelheiten mitteilen und Ihnen ein Beispiel aus jüngster Zeit zeigen, an dem ich mit meiner kleinen Emeritus-Arbeitsgruppe zu Kineasen, die für die Pharmaforschung und -entwicklung äußerst wichtige Targets von Medikamenten sind, geforscht habe. Das Problem ist, dass es mehr als 500 Proteinkinasen mit unterschiedlichen physiologischen Funktionen gibt, und wenn wir auf eine abzielen, stellen sich uns Schwierigkeiten, da sie alle ein prinzipielles Strukturgerüst haben. Wie können wir also genau auf das richtige abzielen? Und worauf wir uns besonders konzentriert haben, war nicht nur die Verbesserung der Affinität, sondern die Verbesserung der Verweildauer, wobei es sich um ein Hauptproblem in der Medikamentenentwicklung handelt. Wir arbeiteten also über die CDK8/CycC-Transkriptionskinase, die die Aktivität der fremden Polymerase anhand eines riesigen Mediatorkomplexes reguliert. Wir erforschten also die Struktur von CDK8/CycC, das sie hier sehen, und die Struktur erklärte natürlich sofort eine der besonderen Eigenschaften von CDK8: seine Spezifität für Zyklin und andere Dinge. An dieser Stelle ist ein kleiner Inhibitor gebunden. Was wir versuchten, war, die Verweildauer auf eine rationale Weise zu verlängern. Und wie gingen wir dabei vor? Wir wählten einen Startliganden, der dort über einen Anker verfügt, und dann eine konservierte Linker-Gruppe, eine funktionelle Gruppe der Harnsäure, variierten die Substituenten in diesem Prozess auf diese Weise, sodass die Verweildauer tatsächlich statt weniger als eine Minute 1600 Minuten betrug. Ein weiteres Beispiel, das mich weiter zurück in meine akademischen Forschung führt: Dies ist die Arbeit über Thrombin-Inhibitoren. Dies ist die Koagulationskaskade. In der Zwischenzeit verfügen wir über strukturelle Daten zu fast allen diesen Komponenten der Koagulationskaskade. Als erstes haben wir Thrombin, das wir vor 25 Jahren untersuchten, und dies ist, was wir herausfanden. Wir erstellten hier also das Modell eines kleinen Inhibitors und verbesserten es dann, indem wir einen dieser Substituenten hier vergrößerten. Lassen Sie mich fortfahren und ihnen die Geschichte über die Verwendung von natürlichen Komponenten erzählen, die als Richtungsweiser für das Medikamentendesign verwendet werden. Wir schauten uns also die natürlichen Thrombin-Inhibitoren an, die man bei blutfressenden Tieren findet. Dies ist das Thrombin Hirudin des Blutegels. Hirudin ist übrigens ein anerkanntes Anti-Koagulationsmedikament. Dies sind andere. Außerdem wurden Varianten von Hirudin hergestellt, halbsynthetische, chimärische Varianten, die den C-terminalen Schwanz verwenden, den wir bei Hirudin als wichtig erkannt haben, verbunden mit einem chemischen Substituenten, der auf die aktive Stelle abzielt. In diesem Fall hat uns also die Natur den Weg gewiesen. Worin bestehen die Probleme mit der Translation? Das Problem besteht darin, dass es hier eine akademische Forschung mit wunderbaren Ideen gibt, diese jedoch noch nicht weit genug fortgeschritten sind, um die Industrie daran zu interessieren. Hier ist also eine Lücke, die ich als Finanzierungslücke bezeichnen möchte, eine Übersetzungslücke oder Innovationslücke, und die darin besteht, wie man diese Lücke überbrückt, um es zu erlauben, dass akademische Ideen in die Welt der Pharmaindustrie gelangen. Ich erwähnte einen Versuch der Max-Planck-Gesellschaft, mit der ich verbunden bin, verbunden war, die ein Elite-Forschungszentrum gründete, das versucht, diese Lücke zu überbrücken, indem es Ideen oder Substanzen in einem frühen Stadium der Entwicklung aus dem Bereich der akademischen Forschung nimmt und sie so weiterentwickelt, dass sie für die Industrie interessant werden. Ich ging auf diese neue Institution zu und schlug als Projekt das Proteasom vor. Dieses Dia zeigt....fasst die Regelmechanismen zusammen, die wir in 30 oder mehr Jahren der Forschung über das Proteasom entdeckt haben: Proteasen und ihre natürlichen Inhibitoren und die verschiedenen Wege, wie proteolytische Aktivität Mir fehlt die Zeit, diese verschiedenen Mechanismen, die wir gefunden haben, zu erläutern. Ich gehe direkt zum Proteasom und dem neuen Regelmechanismus, den wir dort entdeckt haben. Was wir jedoch feststellten, war, dass es sich bei dem Proteasom um einen riesigen Partikel handelt, der aus 28 Untereinheiten besteht und dessen aktive Stellen sich in seinem Inneren befinden, innerhalb des Partikels, unzugänglich, da der Proteinkomplex geschlossene Tore hat und die Regulation durch die Öffnung dieser Tore geschieht, so dass das Substrat ins Innere des Partikels diffundieren und umgewandelt werden kann. Ich werde dies nicht diskutieren, aber es handelt sich um einen neuartigen ziemlich interessanten Regelmechanismus, den ich mit Clausen und Ehrmann, die ich vorhin erwähnte, in den DegQs gefunden habe. Es handelt sich dabei um interzelluläre Proteasen, sie schwimmen in der Zelle in einer inaktiven Form herum, und in Gegenwart des Substrats werden sie auf eine Weise aktiviert, die wir verstehen. Und sie werden nicht nur aktiv sondern bilden auch große Gebilde von Ligameren, von 20- oder 12meren. Nun zurück zum Proteasom, das eine unerlässliche Rolle im Leben der Zelle spielt. Sie haben Aaron Ciechanovers Vortrag über die Ubiquitinationskaskade gehört. Das ausführende Element dieser Kaskade ist das Proteasom, das ein poly-ubiquiniertes Substrat abbaut. Das ist lediglich der Grundreiniger: Es erkennt denaturierte Proteine, baut sie ab, und handelt es sich um fremde Proteine, dann produziert es die Antigen-Peptide, die in einem Komplex mit MHC-Klasse 1-Molekülen die t-Zell-Immunreaktion auslösen - also absolut unerlässlich, würde man sagen. Dies ist das Proteasom, wie wir es zunächst in einer vereinfachten Version in Urbakterien analysiert haben. Vereinfacht in dem Sinne, dass es über die grundlegenden architektonischen Eigenschaften eines eukaryotischen Proteasoms verfügt. Es verfügt über die grundlegenden Mechanismen des eukaryotischen Proteasoms. Es ist chemisch jedoch sehr viel einfacher. Es verfügt nur über Alpha- und Beta-Untereinheiten - 28 von ihnen. Später gingen wir dann weiter zum eukaryotischen Proteasom, bei dem sämtliche Alphas und alle Betas anders sind. Also ein schönes Beispiel der Evolution, dass die grundlegenden Eigenschaften in der Architektur und in enzymatischen Mechanismen bewahrt: durch Diversifizierung, Differenzierung und die Erzeugung von Spezifität. Nun, die Überraschung kam, als festgestellt wurde, dass das Proteasom ein Target von Medikamenten ist. Das wurde rein zufällig in einem amerikanischen Unternehmen herausgefunden. Sie besaßen natürlich Informationen über unsere veröffentlichte Struktur und sie entwickelten ein einfaches Boronat-Peptid, das - wie wir später zeigten - sich kovalent an das Proteasom bindet, und sie entdeckten, dass es eine neue Strategie gegen Krebs bietet, insbesondere gegen das multiple Myelom. Dies war eine große Aufregung, da es sich um ein völlig neues Prinzip handelte. Es war ein riesiger kommerzieller Erfolg - nicht für uns, aber für das Unternehmen. Es erregte weltweit Interesse, führte zu einer Vielzahl von Aktivitäten: Screening-Bibliotheken, chemischen Bibliotheken und insbesondere Bibliotheken natürlicher Verbindungen. Viele der Komponenten, von denen man feststellte, dass sie aktiv waren, schickte man uns zur Strukturanalyse zu. Sie sehen hier eine sehr kleine Auswahl. Gelb hervorgehoben sind die natürlichen Komponenten - Komponenten, die in Bibliotheken natürlicher Verbindungen gefunden wurden: in Schwämmen, Bakterien und wer weiß noch wo. Sehr unterschiedliche chemische Verbindungen, wie Sie sehen, sehr aufregend, was die Natur unternimmt, um spezifische Proteasom-Inhibitoren zu produzieren, für Zwecke die wir immer noch nicht verstehen. Dies ist ein Beispiel, bei dem wir durch Mitarbeit mit einem Pflanzenbiologen direkt involviert waren. Er untersuchte das Pathogen, das Bohnenpflanzen tötet. Und sie fanden heraus, dass diese Pseudomonas einen Virulenzfaktor dieser Struktur benötigen. Wir fanden heraus, dass er das Proteasom inhibiert. Dies ist die Elektronendichte des kovalent an eine der 28 Untereinheiten dieses Makromoleküls gebundenen Liganden. Es führt zu einer Akkumulation des mit Polyubiquitin markierten CyclinB1 in der Pflanzenzelle, die dann zur Apoptose führt. Dies wurde natürlich synthetisiert, Varianten wurden hergestellt, es gibt einige Aktivität in Richtung Medikamentendesign, auch eine Entwicklung mit dieser neuen chemischen Einheit. Nun, wie bereits erwähnt, hatte ich dies dem LDC zur weiteren Entwicklung vorgeschlagen - bis uns klar wurde, dass wir mit Dutzenden von großen Pharmaunternehmen konkurrieren und als kleine Gruppe wahrscheinlich keine Chance hatten. Also dachten wir über eine Nische nach, und mein Vorschlag bezüglich einer solchen Nische war, dass wir uns ein Immunoproteasome ansehen. Nun, das konstitutive Proteasom befindet sich in allen Zellen mit Ausnahme der blutbildenden Zellen. Insbesondere unter Entzündungsbedingungen gibt es eine bevorzugte Expression des Immunoproteasoms, welches fast identisch mit dem konstitutiven Proteasom ist, mit Ausnahme des Austausches von 2 Typ-3-Untereinheiten gegen andere, denn die Immununtereinheiten zeigen eine etwas andere Spezifität, und insbesondere zeigen sie eine verstärkte Aktivität. Ich kann später darauf zurückkommen. Also vor zwei Jahren - anderthalb Jahren - konzentrierten wir uns auf Immunoproteasome, um bestimmte Inhibitoren zu entwickeln. Warum? Ganz einfach deshalb, weil alle konstitutiven Proteasominhibitoren, die auf dem Markt wichtig sind, eine sehr hohe Toxizität zeigen, insbesondere gegen Nervenzellen. Und es gab bereits Hinweise darauf, dass das Immunoproteasom und seine Inhibitoren nicht über diese Toxizität verfügt. Außerdem würde die Hemmung des Immunoproteasoms eine neue Strategie gegen Autoimmunerkrankungen bieten. Wir waren also ziemlich glücklich mit unserer Richtungsänderung und entwickelten dann spezifische Inhibitoren gegen das Immunoproteasom. Tausende Komponenten wurden entwickelt, es gibt einen enormen Fortschritt. Dies möchte ich jedoch erwähnen, denn es handelt sich dabei um neuere Arbeiten meiner kleinen Gruppe, durch die wir die allgemeine Regel herausgefunden haben, die Liganden immunspezifisch macht. Wir verfügten über Daten von etwa 50 Proteinen, aus Ligandenkomplexen des Hefe-Proteasoms, und alle von ihnen sahen ziemlich gleich aus. Natürlich sahen wir den Inhibitor deutlich definiert, es gab jedoch keine offensichtlichen strukturellen Änderungen im Proteasom selbst, wenn wir die Moleküle einfach übereinanderlegten, bis wir eine Technik anwandten, die der Fraternität der Molekulardynamiker sehr gut bekannt ist und von ihr entwickelt wurde, d. h. die Hauptkomponentenanalyse. Hierbei handelt es sich um eine Methode der Definition von Strukturen-Clustern und der strukturellen Unterschiede zwischen ihnen. Was wir nun herausfanden war, dass diese Hefe-Proteasomkomplexe ziemlich deutlich in zwei Cluster zerfallen: den schwarzen und den roten Cluster. Der schwarze Cluster umfasst die Apo-Form und die nicht-peptischen Liganden und der rote Cluster die peptischen Ligandenkomplexe. Was bedeutet dies? Dies ist ein peptischer Ligand, eingeschaltet zwischen 2 Stränge der empfangenden, aktiven Untereinheit, der genau 4 Wasserstoffbindungen ausbildet. Dies ist das Kennzeichen für peptische Liganden, und was dies bewirkt, wenn sich dieser Ligand bindet, ist: es führt zu einer Domänenschließung, sodass es zur Ausbildung dieser Wasserstoffbindungen kommt. Dies haben wir bei Hefe beobachtet. Dann projizierten wir auf den prinzipiellen Eigenvektor den Proteasom-Ligandenkomplex der Mäuse und später auch des Menschen. Im konstitutiven Proteasom der Maus fanden wir die exakt gleiche strukturelle Änderung: die Domänenschließung. Und zu unserer großen Überraschung und Freude stellten wir fest, dass das Immunoproteasom diese strukturelle Änderung nicht erfordert, was bedeutet dass, das Immunoproteasom diese strukturelle Änderung nicht durchmachen muss, wenn es Liganden bindet. Es befindet sich bereits in der bevorzugten Konfiguration für die Bindung von Liganden, was seine verstärkte Aktivität unmittelbar erklärt. Für die Entwicklung von Medikamenten bedeutet dies natürlich, dass wir weitere Komponenten bevorzugen oder entwickeln sollten, die diese Art der Wasserstoffbindung erlauben. Dies ist eine Simulation der molekularen Dynamik sämtlicher relevanter Arten der Maus, die für etwa 20 Nanosekunden stabile Konformationen zeigten. Wenn wir jedoch den peptischen Liganden von den für die konstitutiven Arten der Maus entfernten, beobachteten wir einen sofortigen Übergang in die Apo-Form. Dies trat beim Immunoproteasom nicht auf - wodurch auf wunderschöne Weise bestätigt wurde, was wir experimentell bereits vorher herausgefunden hatten. Nun, ich bin in den letzten der mir zur Verfügung stehenden Minuten angekommen und muss mich beeilen. Ich hatte früher einmal darüber nachgedacht, mit einem Mitarbeiter, einem Doktoranden, der jetzt 70 Mitarbeiter hat, ein Unternehmen zu gründen. Sie haben ihr eigenes Gebäude in Martinsried, in der Nähe des Max-Planck-Instituts für Biochemie. Neben dem Vergnügen, dass es mir bereitet zu sehen, wie dort Wissenschaft betrieben wird, freut es mich besonders, das ich geholfen habe, 70 Arbeitsplätze zu schaffen. Und ich sage jungen Menschen: Es gibt schöne und interessante Forschungsarbeiten außerhalb der Universitäten in der Industrie, in großen Unternehmen und in Unternehmen mittlerer Größe, wie in diesem Fall. Was bieten sie an? Sie bieten den gesamten Arbeitsablauf an, der zur Aufklärung der Struktur erforderlich ist. Nun, sie tun dies für Kunden. Sie tun es für große Pharma-Unternehmen, klären Ligandenstrukturen von Protein-Targets auf. Diese haben sie auf dem Regal, und sie sind ist lieferbereit. Wenn ein Kunde kommt und eine Kristallstruktur mit seinem Liganden einer dieser Kinasen wünscht, dann kann er die Antwort in ein paar Wochen bekommen. Ok, ich muss mich beeilen. Ich habe dort einen Arbeitsplatz, und woran ich besonders interessiert bin, ist der Aspekt der Verbesserung von Kristallen. Nun, wir haben gehört, dass die größte Hürde in der Protein-Kristallografie die Herstellung von Kristallen ist, doch häufig sind Kristalle - wenn man darüber verfügt - nicht gut genug für eine detaillierte Diffraktionsanalyse. Wir haben früher in der akademischen Umgebung eine Methode entwickelt, und entwickeln sie in dieser industriellen Umgebung nun weiter, um die Proteinkristallstruktur durch eine präzise Änderung der Luftfeuchtigkeit zu verbessern. Dieses Foto zeigt, was geschieht, wenn man die Luftfeuchtigkeit präzise um nur wenige Prozent ändert. Man stellt fest, dass man von einem anfänglichen Kristall geringer Ordnung stufenweise neue Kristallphasen erzeugen kann, die eine enorm verbesserte Kristallordnung aufweisen. Nun, wir haben damit weitergemacht und erst vor kurzem - dies ist Arbeit, deren Ergebnisse soeben in Acta Cryst erschienen sind - herausgefunden, dass wir die Luftfeuchtigkeit nicht ändern müssen. Wir können es einfacher durch Infrarotbestrahlung erreichen. Auch in diesem Fall wieder sehr präzis, entweder pulsierend oder kontinuierlich, wobei wir gleichzeitig das Volumen des Kristalls beobachten. Nun ändert sich das Volumen des Kristalls mit der Luftfeuchtigkeit, oder - in diesem Fall - mit der Infrarotbestrahlung. Und dann weist diese Kurve einen Knick auf. Dies ist dann der Hinweis auf eine neue Kristallphase, die dann manchmal besser oder ähnlich ist - in diesem Fall der CLK-Kinase, wo wir von 3,5 zu 1,75 Å gelangten. Ok, ich überspringe .... Ich verwende auch die letzte Minute um kurz ein zweites Unternehmen zu beschreiben, das ich vor zehn Jahren zusammen mit zwei Mitarbeitern gründet habe und das einen völlig anderen Geschäftsplan hat, nämlich den der Entwicklung eines neuen Therapiestoffs, genauer gesagt von Fc-Rezeptoren für Autoimmunerkrankungen. Dies ist eine alte Geschichte. Es ist die Struktur eines Anti-Körpers, über die wir gearbeitet haben. Sie sehen Hans Deisenhofer hier. Er ist Co-Autor dieser frühen Arbeit aus der Mitte der siebziger Jahre, als wir die ersten Antikörperstrukturen analysierten. Und die Antikörper sind - wie Sie wissen - von zentraler Bedeutung für die Immunreaktion der Zelle, für die humorale Immunreaktion. Und wir interessierten uns damals besonders für die zelluläre Immunreaktion, die auf die Interaktion eines opsonierten Antigens zurückzuführen ist. Es gibt also Antikörper, die mit Fc-Rezeptoren an diese Bakterien gebunden sind. Nun, dies sind zell- ... membrangebundene Rezeptoren, die in zwei Versionen vorkommen: die eine ist ein inhibierender Rezeptor, die andere ein aktivierender Rezeptor. Es ist das Zwischenspiel dieser beiden Rezeptoren, was eine funktionierende Immunreaktion aufrechterhält. Natürlich taten wir, was wir immer tun, nämlich die Strukturen dieser Fc-Teile mit dem Rezeptor aufklären. Und dann dachten wir, dass wir von dieser Information Gebrauch machen können, indem wir einen lösbaren Rezeptor als Antagonisten für den zellgebunden Rezeptor verwenden und auf diese Weise die Immunreaktion dann verhindern oder abändern. Nun, wir wissen noch immer nicht, ob dies der Aktionsmodus oder ein Teil des Aktionsmodus ist. Aber die Tierversuche, die wir noch in der akademischen Umgebung durchgeführt haben, zeigten dann eine fantastische Aktivität in den verschiedenen Tiermodellen von Autoimmunerkrankungen. Wie auch immer - ich bin am Ende meines Vortrags angekommen. Ich wollte ihnen nur noch zeigen, wie langsam diese Entwicklung und wie teuer sie tatsächlich ist, doch sie befindet sich in der klinischen Phase 1 und der klinischen Phase 2 und die Investoren, die natürlich benötigt wurden, haben noch Geduld. Später wird der andere Ansatz darin bestehen, spezielle Antikörper gegen den inhibitorischen Rezeptor zu haben, und auch hier steht wieder die Kristallographie dahinter, um zu zeigen, dass der Antikörper, den wir haben, sich nicht mit der Fc-Bindung überlappt, was eine Voraussetzung für die Diffraktion ist. Ich zeige Ihnen dies nicht nur, weil dies meine schöne Heimatstadt, München, ist, die Sie besuchen sollten. Sie ist ganz in der Nähe, ich glaube, sie liegt nur 170 km entfernt. Sondern ich zeige es ihnen, weil dies die Universität München ist, der alte Teil. Hier hat Laue gearbeitet, hier war Röntgen Professor für Experimentalphysik, und hier hat alles, was ich Ihnen erzählt habe, angefangen. Vielen Dank.

Robert Huber (2014)

Structural Biology and its Translation into Practice and Business: My Experience

Robert Huber (2014)

Structural Biology and its Translation into Practice and Business: My Experience

Abstract

As a student in the early 1960s, I had the privilege to attend winter seminars organized by my mentor, W. Hoppe, and by M. Perutz, which took place in a small guesthouse in the Bavarian-Austrian Alps. The entire community of a handful of protein crystallographers assembled in a room which served as living and dining room and as auditorium for the lectures. Today structural biologists organize large congresses with thousands of attendants and there exist many hundreds of laboratories specialized in this field. It appears to dominate biology and biochemistry very visibly if we count covers in scientific journals displaying macromolecular structures.
Structural biology was successful, because it was recognized that understanding biological phenomena at the molecular and atomic level requires that we see these molecules. Structural biology revealed the structure of genes and their basic mechanism of regulation, the mechanism of enzymes’ function, the structural basis of immune diversity, the mechanisms of energy production in cells by photosynthesis and its conversion into energy-rich chemical compounds and organic material, the mechanism that makes muscle work, the architecture of viruses and multi-enzyme complexes, and many more.
New methods had a profound impact on the development of structural biology. Methods seemed to become available in cadence with the growing complexity of the problems and newly discovered methods brought biological problems within reach for researchers, a co-evolutionary process of the development of methods and answerable problems.
An important additional incentive for structural biology came from its potential application for drug design and development by the use of knowledge of drug receptors at the atomic level. The commercial interest in application spurred this direction of research enormously.
My lecture will start out with the history of protein crystallography and describe the major factors contributing to its development, illustrated with examples contributing to our understanding of the physical and chemical basis behind biological phenomena. I then will let you share my experience with the foundation and development of two biotech companies with different business models, but both based on basic academic research in structural biology: Proteros (www.Proteros.com) offers enabling technology services for pharmaceutical and crop science companies imbedding all steps of the workflow that molecular and structural biology can provide, and commands and uses its platform for the generation of leads from identified targets to in vivo proof of concept (PoC). Suppremol (www.Suppremol.com) specializes in the development of novel immunoregulatory therapeutics for the treatment of autoimmune diseases on the basis a recombinant, soluble, non-glycosylated version of the human Fc gamma receptor IIB.

Content User Level

Beginner  Intermediate  Advanced 

Cite


Specify width: px

Share

COPYRIGHT

Content User Level

Beginner  Intermediate  Advanced 

Cite


Specify width: px

Share

COPYRIGHT


Related Content