Johann Deisenhofer (2014) - Structural Studies on Cholesterol Transport

Cholesterol has two essential functions in our bodies: It is an important component of cell membranes and it serves as the starting material for the synthesis of bile acids, steroid hormones, and other compounds. The human body obtains necessary cholesterol by intracellular synthesis and by dietary uptake

Good morning. I first thank the Committee for inviting me, inviting me actually almost every year. Maybe the reason is that I'm a local, I was born about 80 miles from here. And so attending the Lindau meetings was always a good opportunity to visit home. This here is the Southwestern Medical Center in Dallas, a rough outline. And I have arrived there in 1988 in February. Then a little bit later I had a very significant event in my private life. And finally same year in October the Nobel Committee added its part to a very, very exciting year, 1988, for me. This Medical Center has of course clinical and basic science departments. And one of the main topics at the time when I arrived was the study of cholesterol. And here’s cholesterol, an almost all-carbon-and-hydrogen compound. Very hydrophobic, it has just 1 hydroxyl group here. And it is an essential component of all cell membranes. It is also a precursor for the biosynthesis of steroid hormones, bile acids, and vitamin D etc. It has to be available throughout the body and it is transported in the blood, often in the form of cholesteryl ester. And that is a fatty acid, is linked to this oxygen here and so that there are 2 hydrophobic parts of the structure and a slightly hydrophilic in the middle. The transport of this cholesterol is of course highly organised. Here’s a diagram I found on the internet. And it's from this paper here, where it shows that there are 2 pathways for lipids in general, including cholesterol. One of them the exogenous pathway with dietary lipids coming through the intestine and packed into things that are called chylomicrons, which have 4 different proteins and are relatively big. And they go through the blood... the arteries and veins in the blood transport, and they are processed with lipoprotein, lipases, and as remnants picked up by the liver. The liver itself can make cholesterol. That’s where for example studying drugs are attacking an overabundance of cholesterol by inhibiting one of the key enzymes in cholesterol synthesis, there are about 20 of those, and the one that’s inhibited by statins is called HMG-CoA reductase. This cholesterol in the liver then forms another form of soluble particles called VLDLs, that’s very-low-density lipoprotein, and they have 3 proteins: E, C and B-100. The B-100 is the complete form of this here, B48; B48 is the first and terminal 48% of B100. And so it is also processed by circulating in the blood; the proteins E and C are lost. There’s intermediate-density lipoprotein and finally low-density lipoprotein. About at least two-thirds of the lipids circulating in the blood, are packaged in low-density lipoprotein. And in this form it can be taken up again either by the liver, so that there is a circulation of lipids packaged in these different proteins. They also can be taken up by extra liver cells and provide the necessary cholesterol for the various processes I mentioned. In our interest, I concentrated on this part here, the LDL and the LDL receptor. And we could make use of pioneering work that had been done at UT Southwestern way before I arrived. But first what is low-density lipoprotein? It’s a huge complex of this apolipoprotein B-100, which is one of the biggest proteins known, 4,536 amino acids. It packs cholesterol esters, phospholipids, cholesterol and triglycerides. And the mixture is not well defined, it changes and therefore the low-density lipoprotein is actually a whole spectrum of species containing different percentages of these compounds. And this, as I try to mention the entry of low-density lipoprotein was the research subject of my colleagues Mike Brown and Joe Goldstein who received the 1985 Nobel Prize in Medicine for essentially composing this diagram, of course all backed up by experiments, and it goes as follows: There is this receptor that’s drawn as a Y shaped figure, it is synthesised, secreted into the endoplasmic reticulum, glycosylated and then exported to the membrane. It’s a membrane protein, as Hartmut described. Many of the proteins that are related to disease are membrane proteins; this is one of them. It has just one membrane-spanning part; and the main part; its extra membrane is outside. And it's on the surface; there the pH is about 7.5. And here’s where LDL, shown as these blue spheres, is floating in the blood and the receptors pick up this LDL. The receptors meanwhile are also concentrated in patches, and these patches are then forming coated pits first and then coated vesicles. And then, in the form of the coated vesicles, there is a lowering of pH caused by pumping of protons by specific proton pumps into the inside of the vesicle. And when the pH drops below 6, the LDL receptor releases LDL - perhaps not completely but releases most of its LDL. And then, according to this diagram, the vesicle is split in a part that contains only LDL and another one that contains only receptor. The receptor is going back to the surface of the membrane and repeating this cycle many times. Here is a statistic: 10 minutes round-trip, 20 hours lifetime, and of course making... being stable during large pH swings. The LDL is in lysosome - we heard from Aaron Cienchanover about lysosomes - is degraded. The protein is completely degraded. The cholesterol esters are turned back into cholesterol. The lipids are taken care of and the cholesterol is then transported into the cytoplasm to the places where it's needed. So that’s the pathway that was described first by Mike Brown and Joe Goldstein. And we wanted to add some structural information to this. And when I say 'we' I mean especially these 2 ladies working in my lab at the time: One is Gabby Rudenko, a postdoc, and Lisa Henry, a technician. And they by a combination of amazing persistence, ingenuity, ideas, solved problems related to this structural analysis. The first thing I want to describe, this is not in chronological order, is Gabby’s work about cyro-EM of LDL, and this is a collaboration with colleagues at the Baylor College of Medicine in Houston: Steve Ludtke, Wah Chiu and Henry Pownall. And the goal was to try and see whether binding of the LDL receptor to LDL particles can be seen with the electron microscope. And I already described the problem of heterogeneity of LDL, there is no clear pure species of LDL. So the whole thing was a task of picking in raw pictures, picking particles called... the task is called boxing, throwing a box around and then let the computer sort these sort these and finally combine them into averages and then construct a complete picture from these projections. And so this was done. As you can see these particles have internal structure. And I will say something about that. The dimension are about 250 angstroms in this direction, a little bit less in this direction, and a 150 or so in this direction. Here’s a more detailed picture with some interpretation. Here’s a density scale. So there are regions of different densities and that’s a picture taken at about 28 angstrom resolution. And it shows the structure of LDL as it is at 4°C. So the particles were stored at 4°C and then flash-frozen and then subjected to EM. That low temperature leads to the formation of a liquid-crystal internal structure and it shows striations that are at distances that can be interpreted as the dimensions of a cholesteryl ester molecule. If that interpretation is true then there are about 1,200 of these in such an LDL particle. I cannot say it often enough, this is a subset of the LDL particles. There are particles that contain lots of triglycerides and they don’t form these internal striations. And it seems as if the more cholesterol there is, there more likely or the higher is the transition temperature to this crystalline structure; and that may even have something to do with the interaction with the receptor. This is a hot topic right now in assessing the health effect of cholesterol. So this thing has to be internalised. By the way I forgot to mention this is, there’s a little bump here in the complex structure, which is interpreted as a part of the LDL receptor. LDL receptors actually are a little bit too small for EM and that is in part a consequence of its elongated structure. It’s a model of protein of 839 amino acids starting with 7 ligand binding repeats into about 40 amino acids. Then a so-called EGF precursor homology domain with EGF-A, EGF-B, EGF-C domains that are somewhat similar to these, and a bigger so-called beta-propeller domain. And this is followed by an oxygen-linked sugar domain, the membrane-spanning domain I mentioned, and the C-terminal tail. And I think part of the reason why this topic was picked up by Mike Brown and Joe Goldstein is that about two thirds of all cases of familial hypercholesterolemia are caused by mutations in the LDL receptor. This is a disease where now people have in an inheritable fashion very abnormally high cholesterol, leading to significant shortening of their life expectancy. So Gabby and Lisa really fought a very hard fight to solve the structure of this. And here is the result of about 5 years of work and most if it spent in trying to find crystals that defract reasonably well - none of them defracted really well. The resolution here is 3.7 angstroms and what you can see are the ligand binding domains. The number 1 is missing, it's disordered in the crystal. Here are the EGF-AB, the beta-propeller and the C. And these crystals were grown at pH 5.3 and it shows, according to Brown and Goldstein, a scheme, the form of the receptor that cannot bind LDL. And this is immediately understandable by seeing that the central ligand-binding domain form a close contact to the beta-propeller. Here it’s a little bit more schematic: R5 and R4 contact the beta-propeller. And this lower part seems to form a rigid structure. And the fact that this is a pH 5.3 suggests that perhaps at pH 7 things are different. But first there is a good reason to... a good indication to believe that this has a very important connection to the function of the receptor. Here are conserved residues marked by the Cs, or amino acids substitutions in hypercholesterolemia patients, or deletion/insertion mutants also in such patients. And there are quite a number of those and this is by no means complete. Especially what's important is 3 histidine residues in the middle; and these are chemical entities that can change the charge from neutral to positive, when they go from pH 7 to pH 5. And so most likely these are part of the switch that creates a new binding site for ligand binding domains on the surface of the beta-propeller domain and therefore leads to the release of LDL. Our colleagues Jeon and Blacklow from Harvard have done a calculation showing the electrostatic potential at the surface at pH 7, pH 5 according to calculations, assuming that the histidines change the charge. And we see that from somewhat negative - red is negative, blue is positive - it goes to mostly positive. There are patches on these ligand-binding domains that are complementary to positive patches, they are negatively charged. So we thought okay we have a working model at pH 5. The receptor is inactive, it is binding itself. At pH 7 it can open and then bind LDL. LDL itself must have some kind of pH-sensitive patches on the surface, because otherwise it would not be possible to release it. And this was all wonderful, except that in 2003 a paper appeared that came up with a new genetic locus for autosomal dominant hypercholesterolemia. Published by a group in France, very big group. They were investigating groups, large groups of patients in a sort of scanning procedure. And they came up, they discovered families in which hypercholesterolemia was inherited. But not through the LDL receptor nor through APB100. They found finally a mutation in this protein - I will explain in a second what it is. Also in Dallas we still have a so-called Dallas Heart Study that is led by, or has been led by Helen Hobbs. And they also look at a selection of patients, I shouldn't say patients, of people many of them are quite healthy, they just agreed to participate in this study. And they look for patients, for people with nonsense mutations in PCSK9, that means mutations that prevent the transcription of a complete protein, function of protein. And they discovered that these people have very low LDL cholesterol in their blood, significantly lower than the average. And so this already showed that there must be another, at least one other factor in this whole LDL picture. And especially electrifying was this finding here of a compound heterozygote they call II.2. I just read the quote from the paper, again from the Helen Hobbs group:- fertile, normotensive, college-educated woman with normal liver and renal function tests (including urinalysis) who works as an aerobics instructor.” So basically an ideally healthy person except she has almost no LDL cholesterol in her blood. And that means of course that we don’t need really high LDL cholesterol levels. And especially we don’t really need PCSK9. Now what is PCSK9? This is a Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9, which means it is a proteolytic enzyme that can in principle at least split other proteins that are synthesised in an active precursor form and here is the schematic: There’s a signal sequence, a pro-domain, a cleavage site, a catalytic domain and a C-terminal domain. And the coloured dots here are posttranslational modifications and here’s the catalytic triad Aspartate-Histidine-Serine. And this protein can activate itself, but that’s the only catalytic event it undergoes, because the pro-domain remains stuck to it and doesn’t allow further antomatic action. And of course the pharmaceutical industry involved in cholesterol-lowering medication were very electrified by this. And so crystal structures of PCSK9 were published in 2007 by Amgen, Novartis and Pfizer almost simultaneously. And now what is happening? Why does it work? And again Helen Hobbs's groups found answers. Here’s the LDL receptor structure at pH 5.3. And they found that it binds very specifically to this EGF-A domain. And as you can read from the title: Binding of Proprotein Convertase Subtilsin/Kexin 9 to epidermal growth factor-like repeat A of LDL decreases receptor recycling and increases degradation. So what PCSK9 does is, it undermines part of the cycle of the LDL receptor, and in effect causes a diminished concentration of receptors on the cell surface and therefore a lower efficiency of the whole system to pick up LDL from the blood. Hyock Kwon in my lab crystallised the complex of PCSK9 with the EGF-A domain And you can see here the pro-domain in purple, the catalytic domain in green and the C-terminal domain in brown. And here’s the EGF-A. This is of course a very attractive drug target; if it were possible to disrupt this binding one could essentially counteract the effect of PCSK9. But that seems to be a very hard task. We tried to understand the action of PCSK9, and here’s a model at pH5 of the LDL receptor crystal structure and of Hyock Kwon's structure where the EGF-A is overlayed. And one can easily see that this PCSK9 does not interfere with LDL binding; especially if this structure was unchanged and the pH was raised, it would certainly allow LDL binding. But then a group in Rome managed to crystallise the LDL receptor propeller domain of EGF-C, propeller B and A, together with PCSK9 at pH7 - very importantly. And they found that now PCSK9 and the propeller are forming a slight contact. And maybe if we compare these 2 structures, overlayed with the EGF-A domain, we can see that perhaps the PCSK9 has enough influence on the position of the beta-propeller that it doesn’t allow or always allows or slows down the formation of the inactive form at pH5 and therefore the disassociation of the receptor from LDL. So the PCSK9 is also a secreted protein. It binds here at the cell surface to the LDL receptor, is internalised and then probably prevents or slows down or makes inefficient this step and the receptor goes this way and therefore it's missing from the recycling pathway. Of course the question comes up, if you don’t need PCSK9 and there are completely healthy people who don’t have PCSK9 and there’s no other really convincing data on other functions, what is it for? And so people come to very desperate sounding explanations. I think the best one is this one from my colleagues Roger Unger and Phil Scherer, who interpreted some part of the bible apparently as a possible reason or PCSK9. I don’t think they were very serious. So finally the people again Gabby Rudenko, Hyock Kwon, Lisa Henry from my group; Keith Henderson from synchrotron; and then our collaborators Mike Brown, Joe Goldstein, Jay Horton and Konstantin Ichtchenko who had a very important role in the beginning of the project. And at Baylor College of Medicine: Gang Ren, Wah Chiu, Steve Ludtke, Henry Pownall Thank you very much.

Guten Morgen. Ich möchte mich zunächst beim Kuratorium für die fast jährlich wiederkehrende Einladung bedanken. Vielleicht liegt dies in der Tatsache begründet, dass ich aus der Gegend stamme; ich wurde etwa 130 Kilometer von hier geboren. Die Tagung in Lindau war also stets eine gute Gelegenheit meiner Heimat einen Besuch abzustatten. Das hier ist das Southwestern Medical Center in Dallas, in dem ich ab Februar 1988 tätig war. Wenig später kam es in meinem Privatleben zu einem bedeutsamen Ereignis und schließlich wurde dieses für mich unglaublich aufregende Jahr im Oktober mit der Entscheidung des Nobelpreiskomitees gekrönt. Das Medical Center verfügt natürlich über verschiedene Abteilungen für klinische Forschung und Grundlagenforschung. Als ich dort meine Tätigkeit begann, beschäftigte man sich gerade eingehend mit dem Thema Cholesterin. Wie Sie sehen, handelt es sich bei Cholesterin um eine Verbindung, die fast ausschließlich aus Kohlenstoff und Wasserstoff besteht und stark hydrophob ist, da sie nur eine Hyxdroxylgruppe an dieser Stelle besitzt. Cholesterin ist ein Hauptbestandteil aller Zellmembranen, aber auch ein Vorläufer für die Biosynthese von Steroidhormonen, Gallensäuren, Vitamin D etc. Es muss im gesamten Körper verfügbar sein und wird, häufig in Form von Cholesterinester, über das Blut transportiert. Cholesterinester ist eine an diesen Sauerstoff gebundene Fettsäure, deren Struktur aus zwei hydrophoben Abschnitten und einem leicht hydrophilen Mittelteil besteht. Selbstverständlich erfolgt der Cholesterintransport hochorganisiert. Diese Darstellung, die ich im Internet gefunden habe, stammt aus diesem Paper und zeigt, dass bei Lipiden einschließlich Cholesterin grundsätzlich zwei Verarbeitungswege existieren. Zum einen werden exogen mit der Nahrung aufgenommene Lipide vom Darm resorbiert und in Form relativ großer, aus vier Proteinen bestehender so genannter Chylomikronen über die Arterien und Venen transportiert. Dabei kommt es zu einer Abspaltung durch Lipoproteinlipasen. Die Abbauprodukte, die so genannten Remnants, werden von der Leber aufgenommen. Die Leber kann selbst Cholesterin herstellen. Daher wirken beispielsweise Statine einem erhöhten Cholesterinspiegel entgegen, indem sie eines der 20 wichtigsten Enzyme der Cholesterinsynthese, die so genannte HMG-CoA-Reduktase inhibieren. In der Leber wird das Cholesterin in lösliche VLDL-Partikel (VLDL = Very-low-density-Lipoprotein) umgewandelt, die aus drei Proteinen besteht: E, C und B-100. Bei B-100 handelt es sich um die vollständige Form von B48 (das 48% des Polypeptids des N-Terminus von B-100 darstellt). Die Verarbeitung erfolgt daher bereits beim Transport durch das Blut, wobei die Proteine E und C abgespalten werden. Auf diese Weise entsteht IDL (Intermediate-density-Lipoprotein) und schließlich LDL (Low-density-Lipoprotein). Mindestens etwa zwei Drittel der im Blutkreislauf zirkulierenden Lipide liegen als LDL vor. In dieser Form können sie erneut aufgenommen werden, zum einen von der Leber zum anderen von extrahepatischen Zellen, die das notwendige Cholesterin für die genannten Prozesse zur Verfügung stellen. Wir konzentrierten uns auf LDL und seinen Rezeptor. Dabei konnten wir uns die lange vor Beginn meiner Tätigkeit am Southwestern Medical Center in diesem Bereich geleistete Pionierarbeit zunutze machen. Doch was ist LDL überhaupt? Es handelt sich dabei um einen riesigen Komplex aus Apolipoprotein B-100, einem der größten bekannten Proteine mit 4536 Aminosäuren, in den Cholesterinester, Phospholipide, Cholesterin und Triglyceride verpackt sind. Die Mischung ist nicht genau definiert und veränderlich; daher umfasst LDL eigentlich ein ganzes Spektrum an Partikeln aus Verbindungen in unterschiedlichen Prozentsätzen. Die Aufnahme von LDL war das Arbeitsgebiet meiner Kollegen Mike Brown und Joe Goldstein, die 1985 für die experimentelle Erforschung der in dieser Abbildung dargestellten Verarbeitungswege den Nobelpreis für Medizin erhielten. Diese läuft folgendermaßen ab: Dieser Y-förmige gezeichnete Rezeptor wird synthetisiert, in das endoplasmatische Retikulum sezerniert, glycolysiert und anschließend zur Membran exportiert. Es handelt sich also, wie von Hartmut beschrieben, um ein Membranprotein. Viele krankheitsrelevante Proteine sind Membranproteine, so auch dieses. Es verfügt nur über einen membranüberspannenden Abschnitt und liegt größtenteils außerhalb der Membran. Der pH-Wert der Membranoberfläche liegt bei etwa 7,5. Hier schwimmt das als blaue Punkte dargestellte LDL im Blut und bindet sich an die Rezeptoren. Die Rezeptoren sind in Patches konzentriert und bilden anschließend die so genannten Coated Pits und dann Coated Vesicles. Durch Einpumpen von Protonen in diese Vesikel mittels spezieller Protonenpumpen wird der pH-Wert gesenkt. Fällt er unter 6, setzt der LDL-Rezeptor das LDL vollständig oder zumindest größtenteils frei. Anschließend wird das Vesikel, wie auf dieser Abbildung dargestellt, in einen Teil, der ausschließlich LDL enthält, und einen Teil, der nur aus dem Rezeptor besteht, gespalten. Der Rezeptor wandert wieder zurück auf die Membranoberfläche und der Zyklus wiederholt sich viele Male. Hier haben wir ein paar statistische Angaben: Zyklus von 10 Minuten, Lebensdauer von 20 Stunden, natürlich selbst bei starken pH-Wert-Schwankungen stabil. Der vollständige Abbau von LDL erfolgt in den Lysosomen - Aaron Ciechanover hat uns bereits von diesen Zellorganellen berichtet. Die Cholesterinester werden wieder in Cholesterin umgewandelt, die Lipide zurückgeführt und das Cholesterin zu den Stellen im Zytoplasma transportiert, an denen es benötigt wird. Diesen Verarbeitungsweg haben Mike Brown und Joe Goldstein erstmals beschrieben. Wir wollten diese Daten noch durch einige Strukturinformationen ergänzen. Mit "wir" meine ich insbesondere diese beiden Damen, die damals in meinem Labor tätig waren: Gabby Rudenko, eine Postdoc-Studentin, und unsere technische Assistentin Lisa Henry. Sie lösten mit erstaunlicher Beharrlichkeit und Einfallsreichtum viele Probleme im Zusammenhang mit dieser Strukturanalyse. Zunächst möchte ich Gabbys kryoelektronenmikroskopische Untersuchungen beschreiben - ich gehe also nicht chronologisch vor. Sie erfolgten in Zusammenarbeit mit Kollegen vom Baylor College of Medicine in Houston, Steve Ludtke, Wah Chiu und Henry Pownall. Ziel war es herauszufinden, ob die Bindung des LDL-Rezeptors an die LDL-Partikel unter dem Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden kann. Ich habe das Problem der Heterogenität ja bereits beschrieben, es gibt keine reine LDL-Spezies. Daher arbeiteten wir mit einem Grafikprogramm zur Teilchenrekonstruktion in elektronenmikroskopischen Aufnahmen (Boxer); dabei wählt der Computer verschiedene Partikel aus, stellt sie in Kästchen dar (boxing), sortiert sie (das hier sind alles Projektionen der Teilchen in unterschiedlichen Ausrichtungen), kombiniert sie zu Mittelwerten und erzeugt schließlich aus diesen Projektionen ein vollständiges Bild. Wie Sie sehen, haben diese Teilchen eine innere Struktur, deren Abmessung in diese Richtung rund 250 Angström, in diese Richtung etwas weniger und in diese Richtung ca. 150 Angström beträgt. Hier haben wir eine etwas detailliertere Darstellung, die einige Interpretationen zeigt. Sie sehen außerdem eine Dichteskala; es gibt also Bereiche unterschiedlicher Dichte. Diese Aufnahme besitzt eine Auflösung von ca. 28 Angström und stellt die Struktur von LDL bei 4°C dar. Die Partikel wurden also bei 4°C aufbewahrt, anschließend schockgefroren und dann elektronenmikroskopisch untersucht. Aufgrund der niedrigen Temperatur entsteht im Inneren eine Flüssigkristallstruktur. Darin finden sich in bestimmten Abständen Streifen, die als Abmessungen eines Cholesterinestermoleküls interpretiert werden können. Erweist sich diese Auslegung als richtig, enthält ein LDL-Partikel etwa 1200 dieser Moleküle. Man kann es nicht oft genug wiederholen: Es handelt sich hierbei lediglich um eine Untergruppe der LDL-Teilchen. Es gibt Partikel, die zahlreiche Triglyceride enthalten und kein solches Streifenmuster im Inneren aufweisen. Je höher der Cholesteringehalt ist, umso höher scheint die Übergangstemperatur für diese kristalline Struktur zu liegen, was eventuell mit der Rezeptorwechselwirkung in Zusammenhang stehen könnte. Im Rahmen der Evaluierung der gesundheitlichen Auswirkungen von Cholesterin ist das momentan ein heißes Eisen. Es muss also eine Internalisierung erfolgen. Übrigens habe ich vergessen zu erwähnen, dass diese komplexe Struktur eine kleine Delle aufweist, die als Teil eines LDL-Rezeptors gedeutet wird. LDL-Rezeptoren sind für elektronenmikroskopische Untersuchungen eigentlich ein wenig zu klein, was teilweise ihrer länglichen Struktur zuzuschreiben ist. Das hier ist ein Modell eines aus 839 Aminosäuren bestehenden Proteins. Sie sehen hier 7 Liganden-bindende Wiederholungen aus jeweils etwa 40 Aminosäuren sowie eine so genannte EGF-Vorläufer-Homologie-Domäne bestehend aus EGF-A, EGF-B und EGF-C, Daran schließen sich eine sauerstoffgebundene Zuckerdomäne, die membranumspannende Domäne, die ich erwähnt habe, sowie der C-Terminus an. Ich denke, Mike Brown und Joe Goldstein haben sich dieses Themas unter anderem deswegen angenommen, weil familiäre Hypercholesterinämie zu zwei Dritteln durch Mutationen im LDL-Rezeptor verursacht wird. Menschen mit dieser Veranlagung weisen einen pathologisch erhöhten Cholesterinspiegel auf, was ihre Lebenserwartung signifikant verkürzt. Für Gabby und Lisa bedeutete die Aufklärung dieser Struktur harte Arbeit. Hier sehen Sie das Ergebnis ihrer fünfjährigen Bemühungen. Den Großteil der Zeit suchten wir nach Kristallen, die sich für eine Elektronenbeugung eignen - das war nämlich eigentlich bei keinem der Kristalle der Fall. Diese Aufnahme besitzt eine Auflösung von 3,7 Angström und stellt die Liganden-bindenden Domänen dar. Die erste Domäne fehlt, sie befindet sich im Kristall nicht an der richtigen Stelle. Das sind die Domänen EGF-A, EGF-B, Beta-Propeller und EGF-C. Dieser Kristall wurde bei einem pH-Wert von 5,3 gezüchtet und stellt nach Angaben von Brown und Goldstein eine Rezeptorform dar, die sich nicht an LDL binden kann. Dies wird augenblicklich verständlich angesichts der engen Verbindung zwischen der zentralen Liganden-bindenden Domäne und der Beta-Propeller-Domäne. Hier ist das Ganze ein wenig schematischer dargestellt: R5 und R4 treten mit der Beta-Propeller-Domäne in Kontakt. Dieser untere Teil scheint eine starre Struktur anzunehmen. So sieht die Situation bei einem pH-Wert von 5,3 aus; bei einem pH-Wert von 7 könnten die Dinge möglicherweise anders liegen. Dennoch stellt dies einen Hinweis darauf dar, dass hier ein sehr wichtiger Zusammenhang mit der Rezeptorfunktion bestehen könnte. Bei den mit C bezeichneten Abschnitten handelt es sich um konservierte Gruppen, substituierte Aminosäuren bei Patienten mit Hypercholesterinämie bzw. Deletions- oder Insertionsmutanten bei diesen Patienten. Es gibt eine ganze Reihe solcher Entitäten; diese Darstellung ist beileibe nicht vollständig. Von Bedeutung sind vor allem diese drei Histidinreste in der Mitte; bei ihnen handelt es sich um chemische Gebilde, die bei einer Senkung des pH-Wertes von 7 auf 5 ihre Ladung von neutral zu positiv ändern können. Sie gehören höchstwahrscheinlich zu einem Schalter, der eine neue Bindungsstelle für die Liganden-bindende Domäne auf der Oberfläche der Beta-Propeller-Domäne erzeugt und so zur Freisetzung von LDL führt. Unsere Kollegen Jeon und Blacklow aus Harvard haben das elektrostatische Potential auf der Oberfläche bei einem pH-Wert von 7 bzw. 5 berechnet, ausgehend von der Annahme, dass die Histidine ihre Ladung ändern. Wir sehen, dass es dabei zu einem Übergang von eher negativ - rot ist negativ, blau positiv - zu eher positiv kommt. Auf diesen Liganden-bindenden Domänen gibt es Stellen, die zu den positiven Stellen komplementär sind; sie sind negativ geladen. Wir verfügten nun also über ein Arbeitsmodell. Bei pH 5 ist der Rezeptor inaktiv; bei pH 7 kann er sich öffnen und an LDL binden. Zudem muss die Oberfläche von LDL pH-empfindliche Stellen aufweisen, da ansonsten keine Freisetzung möglich ist. Das war alles wunderbar, bis eine große Forschergruppe aus Frankreich 2003 ein Paper veröffentlichte, in dem ein neuer Genlocus für die autosomal-dominante Hypercholesterinämie vorgestellt wurde. Die Autoren hatten große Patientengruppen anhand einer Art Rasteranalyse untersucht. Dabei waren sie auf Familien gestoßen, in denen Hypercholesterinämie vererbt wurde, allerdings weder über den LDL-Rezeptor noch über Apolipoprotein B-100. Sie fanden schließlich eine Mutation in diesem Protein - ich werde Ihnen das gleich erläutern. In Dallas führte Helen Hobbs eine ähnliche Studie durch, die so genannte Dallas Heart Study. Auch darin wurden bestimmte Patientenkollektive untersucht - wobei ich nicht Patienten sagen sollte, denn bei den meisten Studienteilnehmern handelt es sich um Freiwillige, die völlig gesund waren. Hobbs hatte nach Probanden mit Nonsense-Mutationen in PCSK9 gesucht, d.h. Mutationen, die die Transkription eines funktionellen Proteins verhindern. Sie stellte fest, dass der LDL-Cholesterinspiegel im Blut dieser Probanden im Vergleich zum Durchschnitt signifikant erniedrigt war. Das ist bereits ein Hinweis darauf, dass unser Bild von LDL um mindestens einen weiteren Faktor ergänzt werden muss. Besonders elektrisierend war die Entdeckung einer Compound-Heterozygote namens II.2. Ich zitiere kurz eine Stelle aus dem Paper der Arbeitsgruppe von Helen Hobbs: handelt es sich bei II.2 ganz offensichtlich um eine gesunde Frau im gebärfähigen Alter mit College-Abschluss, und normotone Blutdruckwerte sowie unauffällige Leber- und Nierenfunktionswerte (einschließlich Urinstatus) aufweist die als Aerobic-Trainerin arbeitet." Im Prinzip ist diese Probandin also kerngesund - abgesehen von ihrem extrem niedrigen LDL-Cholesterinspiegel im Blut. Das bedeutet natürlich, dass wir einen hohen LDL-Cholesterinspiegel eigentlich gar nicht brauchen, geschweige denn PCSK9. Bei PCSK9 handelt es sich um die Proproteinkonvertase Subtilisin/Kexin Typ 9, d.h. ein proteolytisches Enzym, das zumindest prinzipiell andere Proteine, die als aktive Vorstufe synthetisiert werden, spalten kann. Diese Abbildung zeigt eine Signalsequenz, eine Prodomäne, eine Spaltstelle, eine katalytische Domäne und eine C-terminale Domäne. Die farbigen Punkte sind posttranslationale Modifikationen und das hier ist die katalytische Triade Aspartat-Histidin-Serin. Dieses Protein kann sich selbst aktivieren; das ist jedoch der einzige katalytische Vorgang, den es durchläuft, denn die Prodomäne bleibt an ihm haften und gestattet keine weitere enzymatische Aktivität. Natürlich waren Pharmaunternehmen, die Cholesterinsenker herstellten, davon begeistert. Amgen, Novartis und Pfizer veröffentlichten daher fast zeitgleich 2007 Kristallstrukturen von PCSK9. Doch wie wirkt PCSK9? Auch darauf fand die Arbeitsgruppe von Helen Hobbs Antworten. Sie sehen hier die Struktur des LDL-Rezeptors bei einem pH-Wert von 5,3. Hobbs fand heraus, dass sich PCSK9 ganz spezifisch an die EGF-A-Domäne von LDL bindet, was, wie die Überschrift bereits ausdrückt, die Rückführung des Rezeptors in den Kreislauf unterbindet und den Abbau verstärkt. PCSK9 behindert also teilweise den Zyklus des LDL-Rezeptors und führt de facto zu einer verringerten Rezeptorkonzentration auf der Zelloberfläche, was eine weniger wirksame Aufnahme von LDL aus dem Blut zur Folge hat. Hyock Kwon aus meinem Labor gelang die Kristallisation des PCSK9-Komplexes mit der EGF-A-Domäne. Eigentlich arbeitete er mit EGF-A/B, doch EGF-B befindet sich im Kristall nicht an der richtigen Stelle. Sie sehen hier die violette Prodomäne; die katalytische Domäne ist grün, die C-terminale Domäne braun dargestellt. Das hier ist EGF-A. Natürlich handelt es sich dabei um ein sehr verlockendes Drug Target; durch Unterbrechung des Bindungsvorganges würde die Wirkung von PCSK9 aufgehoben. Das ist aber sehr schwierig. Wir haben versucht die Wirkweise von PCSK9 zu verstehen - das hier ist ein Modell der Kristallstruktur des LDL-Rezeptors, das hier die Struktur von Hyock Kwon, jeweils bei einem pH-Wert von 5, wobei sich die EGF-A-Domäne überlagert. Man kann gut sehen, dass PCSK9 die LDL-Bindung nicht behindert. Eine pH-Wert-Erhöhung bei unveränderter Struktur würde also auf jeden Fall eine LDL-Bindung gestatten. Doch dann gelang einer Arbeitsgruppe in Rom die Kristallisation der Propeller-, EGF-A-, EGF-B- und EGF-C-Domänen des LDL-Rezeptors einschließlich PCSK9 bei pH 7 - ein wichtiger Schritt. Es stellte sich heraus, dass zwischen PCSK9 und der Propeller-Domäne eine Verbindung besteht. Vergleicht man diese beiden Strukturen, überlagert von der EGF-A-Domäne, sieht man, dass PCSK9 die Position des Beta-Propellers möglicherweise dahingehend beeinflusst, dass sie die Bildung der inaktiven Form bei pH 5 entweder gar nicht erlaubt, grundsätzlich erlaubt oder verlangsamt und damit die Dissoziierung des Rezeptors von LDL. Bei PCSK9 handelt es sich also um ein sezerniertes Protein, das sich an der Zelloberfläche an den LDL-Rezeptor bindet, internalisiert wird und anschließend wahrscheinlich diesen Schritt verhindert, verlangsamt oder seine Wirkung aufhebt, so dass der Rezeptor zurückgeführt wird und somit aus dem Zyklus herausfällt. Natürlich stellt sich die Frage nach dem Zweck dieses Proteins, wenn unser Körper es nicht braucht, es kerngesunde Menschen ohne PCSK9 gibt und auch sonst keine wirklich überzeugenden Daten zu anderweitigen Funktionen vorliegen. Die Erklärungsversuche klingen daher oftmals recht verzweifelt. Am besten haben es meiner Ansicht nach meine Kollegen Roger Unger und Phil Scherer formuliert, die PCSK9 anhand einer Bibelstelle auszulegen versuchten. Das war aber wohl nicht ganz ernst gemeint. Ich möchte zum Schluss noch einmal Gabby Rudenko, Hyock Kwon und Lisa Henry aus meiner Arbeitsgruppe danken, aber auch Keith Henderson vom Synchrotron, unseren Mitarbeitern Mike Brown, Joe Goldstein, Jay Horton und Konstantin Ichtchenko, die zu Beginn unseres Projektes eine sehr wichtige Rolle gespielt haben, und natürlich dem Baylor College of Medicine mit Gang Ren, Wah Chiu, Steve Ludtke und Henry Pownall. Vielen Dank.

Johann Deisenhofer (2014)

Structural Studies on Cholesterol Transport

Johann Deisenhofer (2014)

Structural Studies on Cholesterol Transport

Abstract

Cholesterol has two essential functions in our bodies: It is an important component of cell membranes and it serves as the starting material for the synthesis of bile acids, steroid hormones, and other compounds. The human body obtains necessary cholesterol by intracellular synthesis and by dietary uptake. Cholesterol is packaged in the liver and transported in the bloodstream primarily in the form of low density lipoprotein (LDL), a complex of phospholipids, cholesterol, cholesteryl esters, and apolipoprotein B.

The LDL receptor, a membrane anchored protein of 839 amino acids, mediates the uptake of LDL into the cellular interior. This receptor binds LDL at neutral pH with high affinity, and releases it when the pH drops below ~6, as happens in endosomes during endocytosis. A crystallographic study of the extracellular portion of the receptor (amino acids 1-699) in its low-pH form shows the protein in a conformation that disables binding of LDL.

The protein PCSK9 (Proprotein Convertase Subtilisin Kexin 9), discovered in 2003, lowers the efficiency of the LDL uptake system by accelerating the degradation of LDL receptors. PCSK9 has therefore become a target for newly developed drugs that can disrupt its interaction with the receptor and thus complement the statins in lowering the blood LDL level.

In my talk I will describe structures of LDL and the LDL receptor, as well as details of the
interaction between PCSK9 and the LDL receptor.

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