Hartmut Michel (2014) - Membrane Proteins: Importance, Functions, Mechanisms

Biological membranes define and compartmentalize the cells of higher organisms. Consisting of membrane proteins and lipids, they are basically impermeable for ions and polar substances, so that electric voltages (“membrane potentials”) and substance gradients across membranes can be generated and maintained

So good morning everybody and thank you very much for the introduction. And I start off showing you a photo of where I work, that’s the Max Planck Institute of Biophysics in Frankfurt, Germany. And there are about 200 people and they all work on membrane proteins. So there must be something of special importance for membrane proteins. Also Frankfurt University which surrounds us has a focus on membrane proteins. And if you have a look at a cell of a higher organism, you see, all you see is membranes. The outer membrane you see here, organelles, that’s the lysosome. You see here the endoplasmatic reticulum, the mitochondria, the Golgi apparatus and you see the nuclear envelope membrane. And what’s special for membrane is that they are electrically tight, they don’t allow it to... They are impermeable for ions and other polar substances. And as a result of that you can’t build up electric voltages across membranes. And membranes are a barrier. Therefore you have to get information across the membrane and you have to get substance across the membrane. So these are wider functions and without membranes there would be no life. And the membrane proteins are the active components of biological membranes. And of course they have to catalyse the transport of substances across the membrane. Maybe proteins, maybe ions or maybe nutrients. And you have to get rid of the catabolites and you have to export proteins. You have to get the information across the membrane and you have centres, normally called signal receptors, that transduce the signal, amplify it across the membrane and in addition you have biological electron transfer. That’s not so straight forward to see. But it’s the case that that’s a very important membrane process for the synthesis and cellular respiration. And some enzymes... Some membrane proteins are enzymes. In particular, when the substrate is hydrophobic. Also a virus... When a virus enters the cells first has to interact with membrane proteins. And it’s of course of particular importance that when you have a drug most likely it will act on a membrane protein. I go further and I say that most diseases are caused by a dysfunction, understimulation or overstimulation of a certain membrane protein. Also the specificity of signalling and interaction comes in at the membrane level. But also at the transcription level because this decides which membrane protein is made in a particular cell. And there are more than 1000 membrane bound signalling receptors. You have heard about the GPCRs, G-protein coupled receptors, by Brian Kobilka. And there are more than 800 of this type in the cell. But the number of signal transduction chains leading from the receptor to the nucleus or somewhere else is very limited. So when you interfere pharmacologically at later stages of signal transduction, you have the danger of undesired side reactions. So the best thing is to interact at the membrane protein level. We want to have the atomic structures. We want to know the position of each atom of a membrane protein in order to understand the mechanism of action as basic scientists. If you are interested in curing diseases, you go for rational drug design. That’s what also pharmaceutical industry does. And the similar technique is virtual screening, where you ask the computer, give him chemical library and the computer tells you which of the compounds might bind to a pocket of the protein. Membrane proteins are important, have been recognised by the Nobel Committees and probably the first Nobel Prize for membrane protein was given to Otto Warburg, Prize of Medicine for the work on the respiratory enzyme. Then Hans Deisenhofer, Robert Huber and myself got the Prize for the first atomic structure determination of a membrane protein. It was a reaction centre of photosynthesis. and you will hear about the work about the ATPases by John Walker later. And 2003 Peter Arge and Roderick McKinnon got the Prize for their work on channels. And 2012 you got Brian Kobilka for his work on G-protein coupled receptors. I think that is not the last Nobel Prize for work on membrane proteins. And when I started off, it was in the most frequently used text book, there was a statement: And I belong to the persons who are challenged if somebody tells them it’s impossible. So I started to think how to get membrane proteins crystal based on extended observation. And in order to tell you this in some detail, I show you here a schematic drawing of a membrane. You have here the membrane proteins. And you have here the lipids. Lipids form this electrically tight layer here and you have the membrane protein incorporated. And what the difficulties causes with the membrane proteins that they have a hydrophobic surface here where they are in contact with a side chain of the lipids whereas they are polar where they are in contact with the phases. And as a result of that you have to use detergents or expensive soaps and you add them in excess and you solubilise the membrane. The membrane... The detergent micelles looking like this. Displace the lipids and then you get a structure like this which is the membrane protein within a detergent micelle. Also the lipids are taken up by detergent micelles. And that’s the situation where you start to purify your membrane protein and you try to get out its function and its mechanism. When you think on how to order a membrane protein with these properties in the form of a crystal you have two solutions. You can try to form 2-dimensional crystals in the plain of the membrane and you can form then ordered stacks. This is what I always considered to be most important. I call this Type 1. The more easily accessible alternative is when you try to crystallise the membrane protein within the detergent micelle. And you will rely on polar contacts between the polar surfaces of the various membrane proteins. So it’s the membrane protein which forms the crystal lattice. And the detergent micelle actually more or less passively still surrounds the membrane protein’s hydrophobic surface. And you have to make sure that you don’t get... that the detergent micelle doesn’t get too big and you get some repulsion so that you cannot form a real crystal lattice. So looking for the right detergent is the most important step in trying to get membrane protein crystals. Most important you have to find a project which suits for your ideas. And after some attempts I ended up with a cell called Rhodopseudomonas viridis. That’s a purple bacterium. And now they changed the name and so it’s no longer called... It’s now called Plastoglogus viridis. And it’s full of membrane stacks and these membrane stacks are full of photosynthetic proteins. So it’s rather easy to get substantial amounts which you need for crystallisation. And it’s also rather easy then to purify them and you get colour changes if your membrane protein doesn’t like the conditions where you work with it. So after rather short time I got this kind of crystals. And looking nice and also surprisingly they diffracted well from the very beginning. And I have to say something about technology development. It took about 20 hours to record that photograph using photographic films. Nowadays you go to the synchroton and the recording of that photograph takes 5 seconds, maybe even shorter. And to collect one data set it took me 3 ~ 4 months. Nowadays it takes less than a minute to collect the data set. That is really a change and speeds everything up. But the bottleneck which we still have is getting the crystals. So we succeeded, you see here. You see here the structure of a photosynthetic reaction centre. That’s the part of the protein complex which is incorporated into the membrane. You have here the photosynthetic pigments here. You have here electron supply to the primary electron donor here. And you have here more or less a scaffold protein which may be important for the assembly of the reaction centre. If you look for a space filling model, you see here in white you see carbon atoms. And most of the atoms approaching the surface here are actually carbon, are carbon atoms. You see here a row of blue atoms, nitrogens. And people being used to look at structures they easily can see that actually it is an arginine residue. There is a histidine residue. There’s another lysine residue. And so here we have a nice row of positively charged amino acid residues which can interact with the phosphates of the lipids and position the membrane protein in the vertical direction which is also an important job. The photosynthetic pigments are shown here. You see here the primary electron donor which is constituted of two chlorophylls and then you have an electron transfer from here onto that, onto that, onto that and then parallel to the membrane from here to here. The entire structure is symmetric which was a big surprise, was unexpected. And now people could determine more membrane... more structures of photosystems, that’s the plant photosystem I. And what I showed you in the bacteria reactions is simply that central part. Then you have your many, many light-harvesting complexes made of chlorophylls. These are inner light-harvesting complexes and here you have outer light-harvesting complexes. But the core of the reaction centre, of the core of the photosystem is the same. And this is a comparison of the bacterial reaction centre’s primary electron donor. Chlorophyll, pheophytin and quinone are parallel to the membrane. And the same basic structure is found in the core of the photosystem I. And you see here also primary electron donor and then you have one branch which is used for electron transfer. And this also means that photosynthesis was invented only once during evolution, but this happened more than three billion years ago already. Now I change gears a little bit and I come to method development. And method development is very, very important in research and what we did, we tried to use fragments of monoclonal antibodies for membrane protein crystallisation. The idea behind this that the membrane protein surface can be, a surface which is polar, can be increased by the antibody fragments. And it might be more easy to get crystals. And this idea works out and you have heard Brian Kobilka that he now uses also this trick in getting big crystals, in getting well-ordered crystals. We used this primarily in the respiratory chain that is where we do substantially work on, respiratory chain. You have here complex I. You have here a fumarate reductase which is Complex II. We have here Complex III, cytochrome bc1 complex. We have complex IV which is cytochrome C oxidase and we have ATP synthase. And the field is quite advanced. You see that we now know the basic structures of all the components. And actually these three structures were made by my group in Frankfurt and these structures and these structures are made from Cambridge in the UK. So we have a nice friendly competition between Cambridge and Frankfurt with that respect. These are crystals of cytochrome C oxidase from a soil bacterium and basically that’s the part in the membrane. So most of it is here in the membrane and that is the antibody fragment bound to a polar surface, enlarges the polar surface. And what you also can see when you look at the crystal lattice that actually the antibody fragment here glues together this cytochrome C oxidase. There´s no direct contact between cytochrome C oxidase. All the contacts are mediated by the antibody fragment here. So this trick helps, it`s still tedious but you have a pretty good chance to be successful at the end. So that’s method development. Let me say I'm quite often asked: “How can you get Nobel Prize when the governments are interested in getting Nobel Prizes for their countries?” And I say to them that the most straightforward thing is method development because all major methods for all major method development people have received a Nobel Prize. So we have many examples here. NMR, Electron Microscopy or DNA sequencing, everything got a Nobel Prize. So inventing a novel important method I'm sure you will get a Nobel Prize. Now I come to my favourite subject which is the cytochrome C oxidases. They are part of the super-family of heme-copper terminal oxidases. They perform reduction of molecular oxygen. For that you need an oxygen molecule. You need four protons. They all come from the inside. You need four electrons donated here from cytochrome C formed to water, four oxidised cytochrome Cs. This happens in the cytochrome C oxidase. And what is here in particular is that the electrons come all from the inside, from the outside of the organelle or the bacterium and the protons come from the inside. But in addition nature has invented a trick to pump 2-4 protons across the membrane. So this of course leads to the generation of an electric voltage, so called membrane potential. And also pH creatine, but the pH creatine is less of importance than the electric voltage. So that’s the overall reaction that we’d like to understand in our research. I will not go into details, too complicated. Evolutionary tree of heme-copper oxidase is shown here. We have three families and so we actually work on paracoccus, a soil bacterium which is very close here to mammals, to bovine cytochrome C oxidase. And it’s splitting occurred rather late. I also will show you something about Type C, some kind of structure during the rest of my talk. So these cytochrome C oxidases, terminal oxidases are quite diverse. They are also pretty old in evolution and the question is: Why are there enzymes reducing oxygen to water when there was no oxygen present three billion years ago? And actually we don’t know what the original function of these terminal oxidases was. It was clearly that they had originally some detoxification function when oxygen became available due to the action of the water splitting photosynthesis. So basically we have two copper atoms in A and B families and we have here a heme, here we have copper, another heme group, and here is the site where oxygen is bound and reduced. The protons come straight forward in this kind and the way as protons are pumped come via this case. It’s not true for the other two families where we’ve only one channel which provides direct access to the active site. But nevertheless this ends up now able to pump protons. And that is really an enigma and we don’t understand that or how it works. So this is basically our cytochrome C oxidase. So here we have in the centre the active site where oxygen is bound and reduced. We’ve electron transfer from cytochrome C bound to the oxygen here. And we have proton transfer here and via that pathway to elective site and water is formed and protons are pumped in addition. We also work on the C family, C family cytochrome C oxidases, the so called CBB3 oxidase. And I have to say they are essential for many pathogenic bacteria, for instance helicobacter. And if you delete the genes coding for the cytochrome C oxidase in helicobacter, helicobacter is no longer infectious. So blocking this site of CBB3 oxidase would be a good way to kill the bacteria and cure stomach ulcers and gastritis. So that’s another idea we work with. So here only the central sub-unit I is similar to the A and B families but in the rest then we have cytochrome molecules replacing the copper containing proteins. And here we have a soluble electron donor getting cytochrome C and the electron transfer then is down here towards the active site. The electron transfer here is pretty fast and they are much more efficient in oxygen reduction than the other type of cytochrome C oxidases. A little bit of background how we get the stuff. We isolate that from the native cells. And you see here the various protocols, the various crystals which were obtained, which were disordered. And I have to tell you that getting the purer stuff was not very good because the pure stuff doesn’t get well ordered crystals. You would probably remove too many of the lipids and finding this out took one person, Sabina Buschman, ten years. So still doing this kind of research sometimes you needs patience not only of the researcher but also of the funding agency. Which you have to tell the funding agency that you really need... that they have to be generous in giving you time and money. So with respect to the lipids I mentioned that we determined the lipid contents and they’re all generally with about 50 lipid molecules per oxidase complex after an ion exchange chromatography. That’s reduced to 12 lipids during the purification. And further on by an isoelectric focusing reduced that to 6-9 lipids. But the problem is this gives bad crystals whereas this preparation gives good crystals. So the last purification step had to be removed in order to get the well diffracting crystals. Now I change gears and I come to the sulphide quinone reductase. And of course sulphide is toxic. So you need in samples sulphide detoxification because sulphide binds to the prophyrins of cytochromes and haemoglobin and it’s very, very toxic. And also you have in higher animals, in mammals you have sulphide signalling. And sulphide was proposed and actually is a gasotransmitter. Very much it’s evolved from smooth muscle relaxation, very much like nitric oxide. And you will hear more about that in the talk, which is going to be presented by Ferid Murad. So we work on that enzyme and we got the structure in this case from a hyperthermophilic bacterium. You see it’s a trimeric enzyme, it’s rather flat and it lies flat on the membrane, dives into the membrane. And the membrane interaction you can see from the structure. Down here we have some detergent molecules, some lipid molecules. And we have tryptophan side chains which normally lead to the interaction with the membrane. What we also have discovered quite astonishingly that the enzyme binds the enzyme binds the flavin coenzyme in a very unprecedented way not seen before. So here we have a disulphide bridge, two bridges connect and bind in covalently the flavin moiety to the protein. And what we also found to our surprise was that you find a sulphur S8 ring in the protein. The product of the reaction when you reduce the sulphide is sulphur and actually it forms a ring and there’s one time when the sulphur binds to the cystine residue. Was completely unexpected and not observed before. We also could identify the quinone reduction site by adding quinones. So quinones actually are the electron acceptor getting the electrons from the sulphide and so that reduced quinone is the second product. And so the overall mechanism of action can be seen here. That is the enzyme lying flat on the membrane, diving into the membrane by about 12 angstrom. And then you have access for H2S or HS- via nicely observed channels. And from here... You can here form the S8 ring. You have channels for the excess for ubiquinone, the second substrate, and the release of the product ubiquinonol which can be then used in the respiratory chain and be oxidised. And the S8 ring can be or will be displaced through the membrane inside to the bacteria and the bacterial world or into the mitochondrian mammals because this enzyme is located on the outside of mitochondria in humans and of course also then in other mammals. Of course we have to ask then the question: How is H2S... is hydrogen sulphide generated in mammals? And there are two enzymes doing that. One is cystathionine beta-synthase and the other one is mercaptopyruvate sulphur transferase in combination with a cysteine amino transferase. But the regulation of the production of hydrogen sulphide is unknown. Then you ask what is the product in mammals because nobody has observed so far. Sulphur globules in humans but actually it’s a thiosulphate. So your body produces the inorganic compound thiosulphate. And this happens by the sequential action of a sulphur dioxygenase and then the first product there is sulphite. And then you have a sulphur transferase which adds a sulphur atom to the sulphide and you have thiosulphate. And both these enzymes actually are located in the mitochondrian matrix. But then further on how the thiosulphate is exported, how you get rid of thiosulphate is unknown, what’s the further metabolism of that product. So there are still some basic challenges in order to become known. Let me say a few general words now about membrane protein structures. And at present there are 484 membrane proteins where the structure is known. That’s about 1,500 coordinate files. And you see here in 1986 we had the first structures and it started off pretty slow. And it was two structures only 5 years later. But then people actually learned how to crystallise membrane proteins. But I have to say it’s not primarily a question of improving the techniques. Primarily it has been a question of selecting the more crystallisable... the better crystallisable membrane proteins. Still when you work on your own membrane protein, selected membrane protein it can take you ten or twenty years in order to get it. But people nowadays they look for most stable variants and they sometimes get crystals within a few months. This is why we have to progress. But still progress with human membrane proteins is slow and there are for the moment about 40 human membrane proteins known. Your body contains about 6,000 to 7,000 membrane proteins. So there is still a lot to do before you actually can do at the end drug design in order to cure diseases for the membrane proteins from the human body. The methods for membrane protein structure determination are listed here. Nuclear magnetic resonance can be used for some small proteins, for more or less one or two transmembrane helices or some small beta-stranded membrane proteins. Solution NMR 40 structures, solid state NMR 2 also made its way into membrane proteins. There are two structures, then we have crystallography and it is x-ray crystallography where most of the structures have been determined. Electron crystallography is 7 structures. But actually 5 of the 7 have also been determined by x-ray crystallography and the quality of the structures determined by x-ray has been better than that by electron crystallography. So x-ray crystallography has been the winner. So where will be the future? I still think it will be x-ray crystallography. You may have heard that there are big machines now, free electron lasers. There’s one operating at Stanford and another one is under construction in Hamburg. There’s one going into operation soon in Japan. And the idea is that you may be able to do diffraction with individual molecules at the end. So you wouldn't need to crystallise that. But this is still a dream. And the idea behind it is that you can record a diffraction pattern of an individual molecule before it explodes. So you have a very, very short x-ray pulse and the electrons of course interact with the x-rays. They are blown away. But the diffraction is there. But the molecule has been gone and you have a free plasma. And so this is maybe the future, so we wouldn't get crystals. But I fear that will be a dream. Still the open question which I didn’t cover was that for mechanism. I discovered that in the case of sulphide quinone reductase without going into the atomic details. But diffraction methods provide static pictures. In order to get the mechanisms of action you have to get structures of catalytic intermediates. You have to analyse variants and you have to use various kinds of spectroscopy, maybe photon transformation infrared spectroscopy, maybe EPR, maybe NMR. But this depends on your protein. And I'm satisfied when I find out the mechanism of a protein going really into the depths. As I said there are still lots and lots to do and I hope you will be interested to work on these interesting questions. With that I want to end and thank you for your attention.

Guten Morgen allerseits und vielen Dank für die einleitenden Worte. Ich beginne mit einem Foto meines Arbeitsplatzes. Das ist das Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt, Deutschland. Dort arbeiten mehr als 200 Mitarbeiter und sie alle beschäftigen sich mit dem Thema Membranproteine. Membranproteine müssen also eine spezielle Bedeutung haben. Auch an der Universität Frankfurt, in deren Nähe wir uns befinden, gibt es einen Forschungsschwerpunkt Membranproteine. Wenn man eine Zelle eines höheren Organismus betrachtet, sieht man nur Membranen. Die äußere Membran sehen Sie hier, Organellen, das ist das Lysosom. Hier sehen Sie das endoplasmatische Retikulum, die Mitochondrien, den Golgi-Apparat und die Kernhüllenmembran. Eine Besonderheit von Membranen ist, dass sie elektrisch dicht sind, also nicht zulassen, dass … sie sind für Ionen und andere polare Substanzen undurchlässig. Infolgedessen ist es unmöglich, elektrische Spannungen über Membranen hinweg aufzubauen. Membranen sind eine Barriere. Deshalb muss man Informationen und Substanzen durch die Membran schleusen. Das sind im Groben die Funktionen. Ohne Membranen würde kein Leben funktionieren. Membranproteine sind die aktiven Bestandteile biologischer Membranen. Und natürlich müssen sie den Transport von Substanzen durch die Membran katalysieren. Dabei kann es sich um Proteine, Ionen oder Nährstoffe handeln. Außerdem müssen Kataboliten entsorgt und Proteine exportiert werden. Die Informationen müssen durch die Membran transportiert werden. Es gibt Zentren - normalerweise werden sie als Signalrezeptoren bezeichnet -, die das Signal übertragen, es durch die Mem¬bran hindurch verstärken. Und zusätzlich erfolgt ein biologischer Elektronentransport. Das ist nicht so wörtlich zu nehmen. Aber es handelt sich um einen sehr wichtigen Membranenprozess für die Synthese und die Zellatmung. Und einige Enzyme ... einige Membranenproteine sind Enzyme. Insbesondere, wenn das Trägermaterial hydrophob ist. Auch ein Virus … wenn ein Virus in die Zelle eindringt, muss er zunächst mit Membranproteinen interagieren. Und es ist natürlich von besonderer Bedeutung, dass ein Arzneimittel am ehesten auf ein Membranprotein einwirkt. Und ich gehe noch weiter und sage, dass die meisten Krankheiten durch eine Dysfunktion, eine Unter- oder Überstimulierung eines bestimmten Membranproteins verursacht werden. Auch die Spezifität der Signalübertragung und der Interaktion spielt eine Rolle auf Membranebene, aber auch auf der Ebene der Transkription, weil das maßgeblich dafür ist, welches Membranprotein in einer speziellen Zelle erzeugt wird. Und es gibt mehr als 1.000 membrangebundene Signalrezeptoren. Im Vortrag von Brian Kobilka haben Sie von den GPCRs, den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, gehört. Und davon sind in der Zelle mehr als 800 vorhanden. Aber die Anzahl der Signalübertragungsketten, die vom Rezeptor zum Kern oder an eine andere Stelle führen, ist sehr begrenzt. Wenn man in spätere Phasen der Signalübertragung pharmakologisch eingreift, besteht die Gefahr unerwünschter Nebenreaktionen. Deshalb ist es am besten, auf Membranproteinebene zu interagieren. Als Grundlagenwissenschaftler wollen wir die atomaren Strukturen verstehen. Wir wollen die Position eines jeden Atoms eines Membranproteins kennen, um den Funktionsmechanismus zu verstehen. Wer daran interessiert ist, Krankheiten zu heilen, widmet sich der rationalen Wirkstoffentwicklung. Das macht auch die pharmazeutische Industrie. Und eine ähnliche Technik ist das virtuelle Screening. Dabei wird der Computer befragt, indem man ihm eine chemische Bibliothek zur Verfügung stellt, und er meldet zurück, welche Verbindungen an eine Bindetasche des Proteins binden könnten. Die Bedeutung der Membranproteine wurde vom Nobelpreiskomitee anerkannt. Der erste Nobelpreis für Membranprotein wurde wohl Otto Warburg in Form des Medizin-Nobelpreises für seine Arbeit über das Atmungsferment verliehen. Danach erhielten Hans Deisenhofer, Robert Huber und ich den Preis für die erste Atomstrukturbestimmung eines Membranproteins. Es war ein Reaktionszentrum der Photosynthese. Über diese Arbeit werden Sie später auch etwas von John Walker hören. Und 2012 wurde Brian Kobilka für seine Arbeit über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ausgezeichnet. Und ich denke, dass das nicht der letzte Nobelpreis für eine Arbeit über Membranproteine gewesen sein wird. Zu meinen Anfangszeiten war in dem damals am häufigsten verwendeten Lehrbuch die Aussage zu lesen: Ich gehöre zu den Menschen, die es als Herausforderung begreifen, wenn jemand ihnen sagt, dass etwas unmöglich ist. Deshalb begann ich darüber nachzudenken, wie man Membranproteinkristalle herstellen könnte und widmete mich eingehend diesem Thema. Und um Ihnen das konkreter zu erläutern, zeige ich Ihnen hier die Grafik einer Membran. Hier sind die Membranproteine. Und das hier sind die Lipide. Lipide bilden hier diese elektrisch dichte Schicht und das Membranprotein ist eingebettet. Und was die Schwierigkeiten bei den Membranproteinen verursacht, ist eine hydrophobe Oberfläche hier, wo sie mit einer Seitenkette der Lipide in Kontakt sind, während sie an den Stellen, an denen sie in Kontakt mit den Phasen sind, polar sind. Und deshalb muss man in übermäßigen Mengen Detergenzien oder teure Seifen zugeben, um die Membran aufzulösen. Die Membran ... die Detergens-Mizellen sehen so aus. Wenn man die Lipide entfernt, erhält man eine Struktur wie diese hier, die das Membranprotein ohne eine Detergens-Mizelle darstellt. Auch die Lipide werden von den Detergens-Mizellen aufgenommen. Und das ist dann die Situation, in der man mit der Reinigung des Membranproteins beginnt und versucht, etwas über seine Funktion und seinen Mechanismus in Erfahrung zu bringen. Wenn man darüber nachdenkt, wie man ein Membranprotein mit diesen Eigenschaften in der Form eines Kristalls anordnen könnte, gibt es zwei Lösungen. Man kann versuchen, zweidimensionale Kristalle in der Membranebene zu formen und man kann dann geordnete Stapel bilden. Das habe ich immer für das Wichtigste gehalten. Ich nenne dies den Typ 1. Die leichter zugängliche Alternative ist der Versuch, das Membranprotein innerhalb der Detergens-Mizelle zu kristallisieren. Dabei stützt man sich auf die polaren Kontakte zwischen den polaren Oberflächen der verschiedenen Membranproteine. Es ist also das Membranprotein, das das Kristallgitter bildet. Und die Detergens-Mizelle umschließt die hydrophobe Oberfläche des Membranproteins immer noch mehr oder weniger passiv. Und man muss darauf achten, dass die Detergens-Mizelle nicht zu groß wird und eine Abstoßung entsteht, sodass sich kein echtes Kristallgitter bilden kann. Deshalb ist die Wahl des richtigen Detergens der wichtigste Schritt in dem Versuch, Membranproteinkristalle zu erzeugen. Am Wichtigsten ist es dabei, ein Projekt zu finden, das zu den eigenen Vorstellungen passt. Nach einigen Versuchen landete ich bei einer Zelle mit der Bezeichnung Rhodopseudomonas viridis. Das ist ein Purpurbakterium. Inzwischen hat man die Bezeichnung geändert und es heißt nicht mehr … es heißt jetzt Plastoglogus viridis. Es ist voller Membranstapel und diese Membranstapel sind voller photosynthetischer Proteine. Es ist also relativ einfach, erhebliche Mengen zu gewinnen, wie man sie für die Kristallisierung benötigt. Und es ist auch ziemlich einfach, sie dann zu reinigen. Und man erhält Farbänderungen, wenn dem Membranprotein die Bedingungen, unter denen man mit ihm arbeitet, nicht gefallen. Nach ziemlich kurzer Zeit habe ich diese Art von Kristallen erhalten. Sie sehen gut aus und sie haben erstaunlicherweise von Anfang an gute Brechungswerte. Und an dieser Stelle möchte ich gerne etwas zur technologischen Entwicklung anmerken. Es hat ungefähr 20 Stunden gedauert, um diese Fotografie mit Hilfe von Filmen aufzunehmen. Heutzutage nutzt man ein Synchroton und dieses Foto entstand innerhalb von nur 5 Sekunden oder sogar in noch kürzerer Zeit. Für die Erfassung eines Datensatzes habe ich 3 bis 4 Monate benötigt. Heute dauert es nicht einmal eine Minute, um den Datensatz zu erfassen. Das ist wirklich eine enorme Entwicklung, die alles beschleunigt. Aber der Engpass ist nach wie vor, die Kristalle zu bilden. Das ist uns gelungen, wie Sie hier sehen. Hier sehen Sie die Struktur eines photosynthetischen Reaktionszentrums. Das ist der Teil des Proteinkomplexes, der in die Membran integriert ist. Hier sehen Sie die Photosynthese-Pigmente. Hier werden die Elektronen für den primären Elektronendonor bereitgestellt. Und hier sehen Sie ein mehr oder weniger ausgebildetes Gerüstprotein, das wichtig für den Bau des Reaktionszentrums sein kann. Sie sehen hier ein raumfüllendes Modell. Das Weiße hier sind Kohlenstoffatome. Bei den meisten Atomen, die sich hier der Oberfläche nähern, handelt es sich tatsächlich um Kohlenstoffatome. Dann sehen Sie noch eine Reihe von blauen Atomen, Stickstoffe. Und jeder, der es gewohnt ist, sich solche Strukturen anzuschauen, wird leicht erkennen, dass es einen Arginin-Rückstand gibt, einen Histidin-Rückstand und noch einen Lysin-Rückstand. So haben wir hier also eine schöne Reihe von positiv geladenen Aminosäurerückständen, die mit den Phosphaten der Lipide interagieren und das Membranprotein in vertikaler Ausrichtung positionieren können Das hier ist eine Darstellung der Photosynthese-Pigmente. Sie sehen hier den primären Elektronendonor, der aus zwei Chlorophyllen besteht. Und dann erfolgt ein Elektronentransport von hier nach da, nach da, nach da und dann parallel zur Membran von hier nach hier. Die gesamte Struktur ist symmetrisch. Das war eine Riesenüberraschung und völlig unerwartet. Und jetzt konnte man weitere Membranen bestimmen … weitere Photosystemstrukturen. Das ist das pflanzliche Photosystem I. Und was ich Ihnen bei den Bakterienreaktionen gezeigt habe, ist einfach dieser zentrale Teil. Und dann gibt es hier enorm viele lichtsammelnde Komplexe, die aus Chlorophyllen bestehen. Das hier sind innere lichtsammelnde Komplexe und das hier äußere lichtsammelnde Komplexe. Aber der Kern des Reaktionszentrums, der Kern des Photosystems, ist der gleiche. Und das hier ist ein Vergleich des primären Elektronendonors des bakteriellen Reaktionszentrums. Chlorophyll, Pheophytin und Quinon sind parallel zur Membran angeordnet. Und dieselbe Grundstruktur findet sich im Kern von Photosystem I. Und hier sehen Sie auch den primären Elektronendonor und dann gibt es hier einen Zweig, der für den Elektronentransport benutzt wird. Und das bedeutet auch, dass die Photosynthese nur einmal in der Evolution erfunden wurde, aber das geschah bereits vor mehr als 300 Milliarden Jahren. Und jetzt komme ich auf ein etwas anderes Thema zu sprechen – die Methodenentwicklung. Die Methodenentwicklung hat in der Forschung einen hohen Stellenwert. Wir haben versucht, Fragmente von monoklonalen Antikörpern für die Membranproteinkristallisierung zu nutzen. Dahinter steckt die Idee, dass die Membranproteinoberfläche, die polar ist, durch Antikörperfragmente vergrößert werden kann. Und dann könnte es wesentlich einfacher sein, Kristalle zu erzeugen. Diese Idee hat tatsächlich funktioniert und Sie haben von Brian Kobilka gehört, dass auch er diesen Trick zur Erzeugung großer Kristalle einsetzt, um gut geordnete Kristalle zu erhalten. Wir haben das hauptsächlich in der Atmungskette eingesetzt. Das ist der Bereich, in dem wir hauptsächlich arbeiten: die Atmungskette. Hier sehen Sie Komplex I. Hier sehen Sie eine Fumaratreduktase, die Komplex II ausmacht. Hier haben wir Komplex III, den Cytochrom-bc1-Komplex. Hier ist der Komplex IV, die Cytochrom-C-Oxidase und eine ATP-Synthase. Und die Forschung ist hier weit fortgeschritten. Inzwischen kennen wir die Grundstrukturen aller Komponenten. Diese 3 Strukturen wurden tatsächlich von meinem Team in Frankfurt hergestellt und diese und diese Strukturen in Cambridge in Großbritannien. Auf diesem Gebiet gibt es einen netten, freundschaftlichen Wettbewerb zwischen Cambridge und Frankfurt. Das hier sind Kristalle der Cytochrom-C-Oxidase aus einem Bodenbakterium, und im Wesentlichen ist das der Teil in der Membran. Der Großteil befindet sich hier in der Membran und das ist das Antikörperfragment, das an eine polare Oberfläche gebunden ist und die polare Oberfläche vergrößert. Und wenn man sich das Kristallgitter anschaut, sieht man auch, dass das Antikörperfragment hier tatsächlich diese Cytochrom-C-Oxidasen hat zusammenkleben lassen. Es gibt keinen direkten Kontakt zwischen den Cytochrom-C-Oxidasen. Alle Kontakte werden durch das Antikörperfragment hier vermittelt. Dieser Trick hilft also. Das ist zwar ziemlich mühsam, aber man hat eine gute Chance, letztendlich erfolgreich zu sein. So, das war also die Methodenentwicklung. Ich werde sehr oft gefragt: „Wie kriegt man einen Nobelpreis, wenn Regierungen daran interessiert sind, Nobelpreise für ihr Land zu erhalten?" Und dann sage ich immer, dass die direkteste Möglichkeit darin besteht, Methodenentwicklung zu betreiben, weil alle wesentlichen Methoden, alle Leute, die wesentliche Methoden entwickelt haben, einen Nobelpreis erhalten haben. Dafür gibt es hier viele Beispiele. NMR, Elektronenmikroskopie oder DNA-Sequenzierung, alles das wurde mit einem Nobelpreis ausgezeichnet. Wenn man also eine neuartige wichtige Methode erfindet kriegt man einen Nobelpreis, da bin ich ganz sicher. Jetzt komme ich zu meinem Lieblingsthema, es sind die Cytochrom-C-Oxidasen. Sie gehören zur Superfamilie der Häm-Kupfer-Terminaloxidasen. Sie bauen molekularen Sauerstoff ab. Dazu braucht man 1 Sauerstoffmolekül und 4 Protonen. Sie alle kommen von innen. Man braucht 4 Elektronen, die vom Cytochrom-C stammen. Die werden zu Wasser geformt, 4 oxidierte Cytochrom-Cs. Das passiert in der Cytochrom-C-Oxidase. Und speziell ist hier, dass die Elektronen alle von außerhalb der Organelle oder des Bakteriums kommen und die Protonen von innen. Aber zusätzlich hat die Natur einen Trick erfunden, um 2 bis 4 Protonen durch die Membran zu pumpen. Das führt natürlich zur Erzeugung von elektrischer Spannung, dem sogenannten Membranpotenzial, und von pH-Kreatin, aber das pH-Kreatin ist nicht so wichtig wie die elektrische Spannung. Das ist also die Gesamtreaktion, die wir in unserer Forschung verstehen möchten. Ich will aber nicht ins Detail gehen - zu kompliziert. Hier ist der Stammbaum der Häm-Kupfer-Oxidase dargestellt. Wir haben 3 Familien und deshalb arbeiten wir tatsächlich mit dem Bodenbakterium Paracoccus, das den Säugetieren, der Bovin-Cytochrom-C-Oxidase sehr nahe ist. Und seine Spaltung trat relativ spät auf. Ich möchte Ihnen während des restlichen Vortrags auch etwas über Typ C, eine Art von Struktur zeigen. Diese Cytochrom-C-Oxidasen, Terminaloxidasen,sind von sehr unterschiedlicher Art. Evolutionär betrachtet sind sie auch ziemlich alt. Und da stellt sich die Frage: Warum reduzieren diese Enzyme Sauerstoff zu Wasser, wenn es doch vor 3 Milliarden Jahren keinen Sauerstoff gab? Und tatsächlich wissen wir nicht, was die ursprüngliche Funktion dieser Terminaloxidasen war. Es war klar, dass sie ursprünglich eine Detoxifikationsfunktion hatten, als aufgrund der wasserspaltenden Photosynthese Sauerstoff verfügbar wurde. Grundsätzlich haben wir also 2 Kupferatome in A- und B-Familien und hier haben wir ein Häm, wir haben Kupfer, eine andere Häm-Gruppe und hier ist die Stelle, wo Sauerstoff gebunden ist und reduziert wird. Die Protonen kommen in dieser Art und Weise zügig voran und der Weg, auf dem die Protonen durchgeschleust werden, verläuft über diese Hülle. Das gilt nicht für die anderen beiden Familien, wo es nur einen Kanal gibt, der einen direkten Zugang zu aktiven Stelle bereithält. Aber dennoch führt dies zu der Fähigkeit, Protonen zu pumpen. Und das ist tatsächlich ein Rätsel und wir verstehen nicht, dass oder wie es funktioniert. Das hier ist also im Wesentlichen unsere Cytochrom-C-Oxidase. Hier im Zentrum ist die aktive Stelle, wo Sauerstoff gebunden ist und reduziert wird. Es gibt einen Elektronentransport vom Cytochrom-C, das hier am Sauerstoff gebunden ist. Wir haben hier und über diesen Weg einen Protonentransport zur gewählten Stelle. Wasser bildet sich und zusätzlich werden Protonen gepumpt. Wir erforschen auch die C-Familie, Cytochrom-C-Oxidasen der C-Familie, die so genannte CBB3-Oxidase. Und ich möchte darauf hinweisen, dass sie für viele pathogene Bakterien, beispielsweise Helicobacter, wesentlich sind. Wenn man die Gene entfernt, die für die Cytochrom-C-Oxidase in Helicobacter kodieren, ist der Helicobacter nicht mehr infektiös. Die Blockade dieser Stelle der CBB3-Oxidase wäre also eine gute Möglichkeit, das Bakterium zu töten und Magengeschwüre und Gastritis zu behandeln. Das ist eine weitere Idee, an der wir arbeiten. Hier ähnelt also nur die zentrale Untereinheit I den A- und B-Familien. Aber im Rest ersetzen Cytochrom-Moleküle die Kupfer enthaltenden Proteine. Und hier haben wir einen löslichen Elektronendonor, der Cytochrom-C produziert. Der Elektronentransport erfolgt dann hier in Richtung aktiver Stelle. Der Elektronentransport vollzieht sich hier relativ rasch. Und sie sind wesentlich effizienter in der Sauerstoffreduzierung als die anderen Arten von Cytochrom-C-Oxidase. Ein bisschen Hintergrundinformationen dazu, wie wir an das Material kommen. Wir isolieren das aus nativen Zellen. Hier sehen Sie die verschiedenen Protokolle und die unterschiedlichen Kristalle, die wir erhielten und die ungeordnet waren. Ich muss gestehen, dass die Erzeugung des reineren Materials keine sehr gute Idee war, weil das reinere Material keine gut geordneten Kristalle ergab. Wahrscheinlich haben wir zu viele Lipide entfernt. Das herauszufinden, hat eine Person, nämlich Sabine Buschmann, 10 Jahre gekostet. Um solche Forschungsprojekte durchzuführen, braucht man also manchmal Geduld, nicht nur der Forscher selbst, sondern auch seine Finanziers. Und das muss man der finanzierenden Instanz vermitteln, dass man wirklich … dass sie großzügig in Bezug auf Zeit und Geld sein müssen. Hinsichtlich der Lipide habe ich bereits erwähnt, dass wir den Lipid-Inhalt festgestellt haben, der nach einer Ionenaustauschchromatographie generell bei rund 50 Lipid-Molekülen pro Oxidase-Komplex liegt. Das wird während der Reinigung auf 12 Lipide reduziert. Und durch eine isoelektrische Fokussierung wird das weiter auf 6 bis 9 Lipide reduziert. Das Problem dabei ist aber, dass das schlechte Kristalle ergeben hat, während diese Präparierung gute Kristalle ergibt. Deshalb musste der letzte Reinigungsschritt eliminiert werden, um gut beugende Kristalle zu erhalten. Ich wechsele noch einmal das Thema und komme zur Sulfid-Quinon-Reduktase. Natürlich ist Sulfid toxisch. Deshalb braucht man bei den Proben eine Sulfiddetoxifikation, weil Sulfid an die Prophyrine der Cytochrome und an Hämoglobin bindet. Und das ist sehr, sehr giftig. Und bei höheren Tieren, Säugetieren, gibt es Sulfid-Signalsysteme. Sulfid wurde als Gasotransmitter vorgeschlagen und ist tatsächlich ein Gasotransmitter. Es hat sich sehr stark aus der Entspannung der glatten Muskulatur entwickelt, sehr ähnlich dem Stickoxid. Und über dieses Thema werden Sie in dem Vortrag von Ferid Murad noch mehr hören. Wir haben also an diesem Enzym gearbeitet und in diesem Fall die Struktur aus einem hyperthermophilen Bakterium gewonnen. Es ist ein trimeres Enzym, das ziemlich flach ist und flach auf der Membran liegt, in die Membran eingebettet ist. Und anhand der Struktur erkannte man die Mem¬bran-Interaktion. Hier haben wir Detergens-Moleküle, einige Lipid-Moleküle. Und wir haben Tryptophan-Seitenketten, die normalerweise zur Interaktion mit der Membran führen. Ziemlich erstaunt haben wir festgestellt, dass das Enzym das Flavin-Coenzym in einer beispiellosen Art bindet, die noch nie vorher beobachtet wurde. Wir haben also eine Disulfid-Brücke, 2 Brücken verbinden und binden die Flavinhälfte kovalent an das Protein. Und zu unserer Überraschung fanden wir auch einen Sulfur-S8-Ring im Protein. Das Produkt aus der Reaktion einer Sulfid-Reduzierung ist Schwefel. Tatsächlich bildet es einen Ring und es gibt einen Zeitpunkt, an dem der Schwefel an den Cystin-Rückstand bindet. Dies war völlig unerwartet und niemals vorher beobachtet worden. Wir konnten auch durch Zugabe von Quinonen die Quinon-Reduktionsstelle identifizieren. Quinonen sind tatsächlich die Elektronenakzeptoren, die die Elektronen aus dem Sulfid beziehen. Und dieses reduzierte Quinon ist also das zweite Produkt. Der gesamte Mechanismus der Aktion ist hier zu sehen. Das ist das Enzym, das flach auf der Mem¬bran aufliegt und mit rund 12 Angström in die Membran eindringt. Und dann gibt es einen Zugang für H2S oder HS- über gut zu sehende Kanäle und von hier … Und hier kann man den S8 Ring bilden. Umd man hat Kanäle für den Ubiquinon-Überschuss, das zweite Substrat, und die Freisetzung des Produkts Ubiquinonol, das dann in der Atmungskette verwendet und oxidiert werden kann. Und der S8-Ring kann oder wird durch die Membran ins Innere der Bakterien oder der bakteriellen Welt oder in die Mitochondrien von Säugetieren gedrängt werden, weil sich dieses Enzym an der Außenseite von Mitochondrien im Menschen und deshalb natürlich auch anderen Säugetieren befindet. Dann stellt sich natürlich die Frage, wie H2S ... wie Schwefelwasserstoff in Säugetieren erzeugt wird? Diese Arbeit übernehmen 2 Enzyme. Das eine ist Cystathionin-Beta-Synthase und das andere Mercaptopyruvat-Sulfur-Transferase in Kombination mit einer Cystein-Aminotransferase. Aber wie die Erzeugung von Schwefelwasserstoff reguliert wird, ist unbekannt. Dann stellt man sich die Frage, was das Produkt in Säugetieren ist, weil das bisher von niemandem beobachtet wurde. Es sind Schwefelkügelchen im Menschen, aber tatsächlich handelt es sich dabei um Thiosulfat. Unser Körper erzeugt also die anorganische Verbindung Thiosulfat. Und das geschieht durch die sequenzielle Aktion einer Schwefeldioxygenase. Das erste daraus entstehende Produkt ist Sulfid. Dann erfolgt eine Schwefeltransferase, die das Sulfid um ein Schwefelatom ergänzt und das Ergebnis ist Thiosulfat. Und diese beiden Enzyme befinden sich tatsächlich in der Mitochondrienmatrix. Aber wie das Thiosulfat dann exportiert wird, wie das Thiosulfat entsorgt wird, ist unbekannt. Der weitere Stoffwechsel dieses Produktes ist unbekannt. Es gibt also noch einiges zu tun. Ich möchte noch einige allgemeine Worte zu Membranproteinstrukturen sagen. Heute ist die Struktur von 484 Membranproteinen bekannt. Das sind ungefähr 1.500 Koordinatendateien. Sie sehen hier, dass wir 1986 die ersten Strukturen ermittelt haben, und das ist dann sehr langsam in Gang gekommen. Aber dann lernte man tatsächlich, wie Membranproteine kristallisiert werden. Aber ich muss sagen, dass das nicht in erster Linie eine Frage der besseren Techniken ist. Es ist in erster Linie eine Frage der Auswahl der besser kristallisierbaren Membranproteine. Selbst wenn man am eigenen Membranprotein arbeitet, an einem ausgewählten Membranprotein, kann das 10 oder 20 Jahre dauern, bis man das Ergebnis hat. Heute achtet man auf die stabilsten Varianten und dann gelingt es manchmal, die Kristalle innerhalb von wenigen Monaten zu erzeugen. Deshalb müssen wir weitermachen. Aber mit den Fortschritten bei den humanen Membranproteinen geht es nach wie vor nur langsam voran. Bis heute sind rund 40 humane Membranproteine bekannt. Unser Körper enthält 6.000 bis 7.000 Membranproteine. Es bleibt also noch eine Menge zu tun, bevor man tatsächlich Arzneimittel zur Heilung von Krankheiten für die Membranproteine des menschlichen Körpers entwickeln kann. Hier sind die Methoden zur Ermittlung der Membranproteinstruktur aufgelistet: für einige kleine Proteine, für mehr oder weniger 1 oder 2 transmembrane Helices oder einige kleine Membranproteine mit Beta-Strängen. Lösungs-NMR mit 40 Strukturen und Festkörper-NMR mit 2 Strukturen haben ebenfalls ihren Weg zu den Membranproteinen gefunden. Und wir haben die Kristallographie, die Röntgenkristallographie, mit der die meisten Strukturen ermittelt wurden. Die Elektronenkristallographie hat 7 Strukturen ermittelt. Aber 5 von den 7 Strukturen wurden ebenfalls durch Röntgenkristallografie ermittelt. Und die Qualität der mit Röntgen ermittelten Strukturen war besser als die der mit Elektronenkristallographie ermittelten Strukturen. Die Röntgenkristallographie ist also der Sieger. Wie sieht die Zukunft aus? Ich glaube nach wie vor, dass die Röntgenkristallographie die Zukunft ist. Vielleicht haben Sie gehört, dass es heute große Maschinen gibt, Freie-Elektronen-Laser. Einer befindet sich in Stanford. Ein anderer wird derzeit in Hamburg gebaut. Und auch in Japan wird bald einer in Betrieb genommen. Ziel ist es letztendlich, die Beugung mit einzelnen Molekülen durchführen zu können. Dann könnte man sich eine Kristallisierung ersparen. Aber das ist nach wie vor ein Traum. Dahinter steckt die Vorstellung, dass man ein Diffraktionsmuster eines einzelnen Moleküls erfassen kann, bevor es explodiert. Man hat einen sehr, sehr kurzen Röntgenblitz und die Elektronen interagieren natürlich mit den Röntgenstrahlen. Sie werden weggeblasen. Aber die Diffraktion ist da. Das Molekül ist verschwunden und man hat ein freies Plasma. Das könnte die Zukunft sein, dann bräuchten wir keine Kristalle mehr. Aber ich fürchte, dass das ein Traum bleibt. Die offene Frage, die ich nicht beleuchtet habe, ist nach wie vor die nach dem Mechanismus. Ich habe den im Fall der Sulfid-Quinon-Reduktase entdeckt, ohne auf die atomaren Details einzugehen. Aber Diffraktionsmethoden liefern statische Bilder. Wenn man Aktionsmechanismen erforschen will, braucht man Strukturen von katalytischen Intermediaten. Man muss Varianten analysieren und verschiedene Spektroskopiearten einsetzen, vielleicht Photonentransformations-Infrarotspektroskopie, vielleicht EPR, vielleicht NMR. Das hängt vom Protein ab. Und ich bin zufrieden, wenn ich den Mechanismus eines Proteins herausfinde und dabei wirklich in die Tiefe gehen kann. Wie ich bereits sagte, bleibt noch eine Menge zu tun und so hoffe ich, dass Sie sich für diese interessanten Fragen interessieren. Und damit möchte ich enden und Ihnen für Ihre Aufmerksamkeit danken.

Hartmut Michel (2014)

Membrane Proteins: Importance, Functions, Mechanisms

Hartmut Michel (2014)

Membrane Proteins: Importance, Functions, Mechanisms

Abstract

Biological membranes define and compartmentalize the cells of higher organisms. Consisting of membrane proteins and lipids, they are basically impermeable for ions and polar substances, so that electric voltages (“membrane potentials”) and substance gradients across membranes can be generated and maintained. Thus membranes form barriers, and information and substances have to be transferred across these membranes.
Compared to membrane lipids, membrane proteins are more active players in biological membranes. They catalyze:
(i) transmembrane transport, for example, specific uptake of nutrients and substrates, exchange of ions, and excretion of waste products and extracellular proteins across biological membranes;
(ii) biological electron transfer and energy conservation in photosynthesis and respiration;
(iii) signal reception, signal transduction across the membrane and amplification;
(iv) enzymatic reactions with preferentially hydrophobic substrates.
It is our aim to understand the function of membrane proteins and their mechanism of action. In addition, most drugs available to treat diseases act by inhibiting or activating a certain membrane protein. Therefore determining structure of membrane proteins is extremely interesting for drug design and virtual screening. However, membrane proteins are difficult to study because of material limitations caused by insufficient availability of membrane proteins and their instability. At present, the atomic structures of approximately 440 membrane proteins are known compared to tens of thousands of water soluble proteins. Moreover, the structures of only 30 human membrane proteins (of about 6000 to 8000) have been determined.
Methods of membrane protein structure determination as well as several recent successes of the author’s lab with membrane proteins of potential medical interest, will be presented.

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