Steven Chu (2014) - You can see a lot by observing: Optical Microscopy 2.0

Biological research and medicine were transformed by the invention and improvement of the optical microscope. Since the early 1990s, there has been another revolution in optical imaging, and manipulation of individual biological molecules and bio-molecular systems have been demonstrated and applied to a wide variety of systems

So let me just begin and explain first of all the subtitle to Optical Microscopy 2.0. It refers to the greatest American philosopher of the 20th century. In case you are wondering who that is, that’s Yogi Berra; he played catcher for the New York Yankees. And on the right hand side you see him in a philosophical conversation with an umpire. He said a lot of wise things. He said for example, “If you come to a fork in the road, take it”. I advise that of all the students. He also said, “You can observe a lot of by just watching.” So why is a physicist talking in a session on physiology or medicine? And just to remind you: physicists have made some contributions to medicine. Actually the first Nobel Prize awarded to a physicist was Roentgen 1901 for his discovery of X-rays; and certainly X-ray imaging has had a profound influence on medicine. But it's deeper than that. If you look at all the modern medical techniques that we use today in medicine and biology, in addition to X-ray imaging there’s electron microscopy, there’s the Nuclear Magnetic Resonance techniques for structural biology but also Magnetic Resonance Imaging. There’s computer tomography with X-rays, there’s Positron Emission Tomography But also, in addition to those imagining technologies, I should also point out that the labelling of crucial elements, particularly proteins, was a big deal both in poly- and monoclonal antibody labelling, radioactive nucleotides, EM immuno-staining, fluorescent labelling and green fluorescent protein labelling - all of those things were a big deal. What's the colour code here? And then more recently: single molecule manipulation and imaging and sub-wavelength optical resolution. The colour code is simple: All the things in colour have been awarded Nobel Prizes. The things in white have yet to be awarded Nobel Prizes. So let me just talk a little bit about one part of optical microscopy, which has really changed the way we do biological research. It started with the first manipulation of cells, Paramecium E. coli by Art Ashkin at Bell Laboratories. Steve Block picked this up very quickly and pinned E. coli down on a microscope slide, grabbed E. coli with an optical tweezer, twirled it around to study the motors. And I started to manipulate a single molecule of DNA. So that's really the ABC of biotrapping. And when I got to Stanford in the late ‘80s, I wanted to see if I could directly manipulate molecules, in particular DNA. This is a picture of a single molecule DNA stained with some fluorescent dyes. A laser was introduced into the optical microscope, it was connected to a motorised mirror-joystick, and you can wiggle around a single molecule DNA. Needless to say this fascinated the graduate students who were doing this. They would disappear in the lab and would do this for hours on end, just like video games. And finally I had to say, this is all fun but let’s do some experiments. So anyway, let me also say I helped Jim Spudich, Bob Simmons. Bob Simmons was visiting Stanford for a year and he approached me and said, can you help us study some actin-myosin system with Jim Spudich. I said sure. And together we proposed this and worked on... set up the system of holding on to a single actin filament with optical tweezers, lifted off the substrate with a polystyrene sphere and the goal was to actually measure the force when actin hydrolysed ATP. We got close in these things but we couldn't get to the ultimate limit, namely could we see the power stroke of a single actin filament? Because my lab was on the second floor at Varian, Jim and Bob Simmons and with the graduate student Jeff Finer, we moved it down into the basement of Beckman and with that, finally, we were able to actually resolve the pull of a single molecule of actin on myosin. So that was a very nice achievement. Let me also talk about some other revolutions that have been occurring in microscopy. If you think of optical microscopy and think of the diffraction limit, if you will; it's given by the wavelength of light divided by two times the index refraction times sign failure, where sign failure tells you how closely focused the rays are; and for a typical optical microscope that could be 250 to 300nm. But if you ask a different question: you don’t ask, what's the blur circle, the blob of a single florescent molecule as the best resolution, but ask: what's the centre of that resolution? So in principle if the signal to noise were 10/1 then instead of 300nm you would get 30nm. In principle, if it was 100/1 you’d get 3nm. So if you can build up images of independent molecules: first that one, then this one, then this one, normally that would all smear together, you wouldn't have good optical resolution. But Eric Betzig, Harold Hess and independently Xiaowei Zhuang, and in fact there were two other groups in the same period 2006 which came up with this way of enhancing the optical resolution. And so that turned out to have a lot of impact. Also another thing I’ll mention very briefly: stimulated emission depletion microscopy invented by Stefan Hell also was a big deal. So let me give you an example of an application. This was done by my last postdoc in my lab, actually while I was Secretary of Energy, and published recently in Science. And this has to do with studying biofilms. And so if you look at this picture, normally you think of bacteria as free-floating bacteria in the so-called planktonic form. But most of the bacteria you find in nature are not individual cells, but they actually land on surfaces and form communities of bacteria. Are they the same bacteria or different bacteria in what is called the biofilm? So this is a cartoon of a biofilm growing on a surface. In these biofilms most of the mass are not bacteria but proteins and polysaccharides excreted by the bacteria. And here you see an edge-on view of a biofilm growing in our lab. So this is what you might see in an optical microscope with a resolution of about 300 or 400nm. This is what you see in a biofilm using super-resolution techniques. So let's expand that dotted region and here it is. This is a cholera bacteria emitting some proteins that formed the biofilm. And you see that the resolution is better. The good thing about this is that these are pictures, movies if you will, slow motion movies, taken of live growing biofilms. One can get very high resolution because the biofilm structure makes things immobile. And so you can get resolutions in the order of 10/15nm. That’s one example. We are continuing to do this. I should say that once you are able to study biofilms with 10/15nm resolution, the whole world opens up. Because you begin to see how these bacteria communicate with each other through exocytosis of vesicles. You can see the actual structures of the biofilms, the protein and polysaccharide metrical structures - things of that nature. And so that first paper began to probe these things. Let me also briefly mention super-resolution imagining on a signalling pathway, where in the signalling pathway, if molecules are mutated, things go bad and form cancer. This work was done by my second-to-last postdoc Xiaolin Nan, who’s now at the Oregon State Health University, and also in collaboration with Joe Grey, who also moved from Lawrence Berkley National Lab to there, and Frank McCormick at UCSF. So this is a cartoon description of what happens. For those of you who don’t know about this, this is not data. MAT-K signalling is activated through binding of a growth factor to the extra-cellular domain with the Tyrosine kinase receptor. Signalling molecules Grb2 and Sos are next recruited to the internal docking site, resulting in Ras activation at the membrane. The efficiency and duration of signal transmission is regulated by the scaffolding protein kinase supressor of Ras, KSR. Ras triggers a phosphor relation cascade involving Raf, MEK and ERK proteins, leading to ERK activation and translocation to the nucleus. Once in the nucleus, ERK activates several transcription factors that mediate gene expression. Target genes thus act ... Okay, so let me just review that: There’s a receptor molecule on the surface of the cell, TKR. When a ligand lands on it and activates it, the cellular side of it becomes phosphorylated. They then activate a molecule called Ras, it then reaches in and is able to grab another molecule called Raf, then MEK, then ERK. In this chain there’s some amplification of signal but all these molecules, except Ras, are becoming phosphorylated. If Ras or Raf become mutated you don’t need that outside signal in order to have cell replication. And mutations in Raf or Ras account for roughly Ras mutations for example are associated with more than 90% of pancreatic cancer, two thirds of multiple myeloma. So some of the very bad actors are associated with Ras mutation. So in any case it was suspected using electron microscopy, immunoelectron microscopy, that perhaps in these mutated forms of Ras there were clusters that form, and this is data you see on the left hand side. This is an image of an antibody attached to a gold particle that then targets mutant form of Ras. And by doing some analysis of this image, authors were beginning to suspect that perhaps there were clusters of Ras’s forming, up to 5 - 8 Ras molecules. And that cluster actually triggers the cell signalling that leads to cell proliferation and uncontrolled cell division. So that was where we started. What we did to this Ras mutant gene, we added an initiation factor that we can dial up and down with a tetracycline, not a tetracycline but a tetracycline derivative that can defuse into the cell. So when this Dox lands on the promoter site you can actually dial up the expression of the mutant protein. And this is what we see in this mutant so-called KRas protein where the mutation has been identified on the 12th site, you substitute glycine and you put in aspartic acid. So here is a cell, a cancerous cell. And if I zoom in on this little white square you see with 200nm, well with the scale bar being 200nm, you see these little red dots; those are individual molecules of the mutant Ras. And so what did we do? We simply began to look statistically at how many of these mutant Ras’s there are and are they forming clusters? In a very low dosage of Dox, 1 ng/mL, what we find... this is a statistical test that tells of clustering, but indeed you don’t need that old traditional statistical so-called Ripley’s test, you can actually count pairs, doubles, triples, singles. And in this when we have 1 ng/mL of Dox what we find is virtually all of them are isolated single molecules, a very small fraction are doubles, triples. When we increase the concentration of Dox, so that there’s roughly a 7 times higher concentration of individual molecules, what we find predominantly there’s still singles, that’s the one in green. But if we look at the number of doubles we find that roughly 18% of the molecules are now formed as doublets. The beauty of this super-resolution is you just see dumbbells, okay. And the signal to noise as you note isn't very good. So when you start... and then we did this for various doses. So what we found... this is in a gel where we over here increased the concentration of the tetracycline. This is the wild-type Ras as we increased the mutant form. As this dials up remarkably this dials down, so actually in the cell there seems to be a regulation that says I only want a certain amount of Ras in this cell. This was seen in 2 cell lines, so that’s a little by-product. But here’s the interesting point. Going from 1-2 ng/mL of Dox, what happens is the ERK becomes phosphorylated. So that ERK becomes phosphorylated is a signature we take that there’s downstream signalling activity and the cell will divide. So that would be our assay for the mutant... the molecule has reached a high enough concentration that it's turned on the cell division signal. Alright. The next thing we did is the following. In this cartoon we took our Ras molecule and this is our florescent dye, it's an mCherry, it's a derivative of the green-fluorescent-protein-type dyes. And then we had a little amino acid chain on the end, which when coupled with what we call a dimerising agent shown in this cartoon with these little orange dots. And what we do is, we put this into the cell and what we found is in Dox concentrations when there’s no Dox, that means there’s no mutant form of Ras being expressed, what we find is there’s no phosphorylation of ERK. In the concentration of Dox where there was no phosphorylation of ERK before, we again find there’s no phosphorylation of ERK, but when we put in the dimerising agent - voila! So what this tells us is that you need dimer formation - it's at a low concentration, at roughly 18%. And if you go even lower than that but force it to form dimers, you also get downstream signalling. So it apparently appears to us as though dimer formation is both necessary and sufficient to signal the cell to proliferate. And you don’t need higher order clusters. Again this is because the single molecule fluorescence is very, very sensitive. It also immediately suggests a target. Because what we also did - and I'm not going to show this data – we looked at this mutant form of Ras with and without the GTP as part of the molecule. So all you actually have is the linker site that is embedded in the protein and we found that the linkers actually formed dimers with the same rate as the full mutant form of the protein. So the suggested drug would be, this is the mutant GD12 site, so you would want to have this drug attached to this part, but also have it interfere with this linker arm shown in red to prevent dimerisation. So with this work you say ah! We think we have a rational design for a way to target the drug. So again it's an application of super-resolution imaging. Alright. So let me go back and tell you a little bit about some of the limitations of fluorescence. Here in this cartoon what you have is, you have this single fluorescent dot that is now imaged onto a CCD array. It is typically 3 to 4 or 5 pixels wide. And what you do is, you find the centre of this image and it's usually to 120th/150th of a pixel. But suppose the pixels are not responding to the light uniformally, that they could vary by 1, 2 or 3%. And for example one of the pixels instead of showing this, it actually responds and gives you a slightly higher charge. When you fit this pattern you actually shift the image. So we began to suspect in 2006, when this first came out, we started playing with it that is it possible that the variation from pixel to pixel of a CCD camera was actually limiting the resolution. And so what we did was a very simple experiment. We took a little pinhole and put a white light behind it. And this little pinhole was then imaged both in red and green spaces onto the CCD array. And then we moved the pinhole, as is shown here, with a precision translation stage, that’s encoded, we know exactly how far we move it. And as we move it of course the red and green spots move. But we fit where the centre of those red and green spots are, and if the camera was okay they would be marching across uniformally, as the translation stage marches across uniformally. And what we found is, it didn’t march across uniformally. As we went across - and you can move the translation stage a very small fraction of a pixel on the camera and this gives you a contour map of the difference – as you are moving the microscope stage across the other thing is giggling around and giggling around by 6 to 10nm. It's baked into the CCD array which means you can correct that after you’ve taken the image. And when we do that, what we find is lo and behold we can improve the resolution, the super-resolution. In a Nature paper in 2010 when we had a multiple system, it's DNA 2 dyes, but we stretched a dozen systems so it's an identical system exactly the same way. What we found is we had about a half a nanometre resolution of the spacing of these dyes in water, so 5 angstroms. So that told us, at least to a 5 angstrom precision, if you had enough photons you can get exquisite resolution. But with a single dye we did hit the shot noise limit; about in fact... this is a log curve, this solid line is the shot noise limit, this is the earlier work. And what we found is you can improve things by 2 or 3 but you are still in this 5nm range, because of the fact that the dyes actually are unstable. So here I picked some data of how unstable the dyes are. These are the green fluorescent protein dyes, typical organic dyes and quantum dots. This is out of Wikipedia so it must be right. In any case it is a general ballpark of how many fluorescent photons you can get from these probes. And for dyes, you typically collect about 10^4 photons before it photo-bleaches, and it has to be collected in something like 1 to 10 seconds. If you want a faster time resolution you can't simply turn your laser up because if you did you’d go to doubly excited states of the dye molecule and they would simply blow apart. So you are really limited in time resolution. And if you have excitation in PALM or STORM, then it takes roughly a minute to form a reasonable image. And also invisible light excitation, one is always worried about photodamage. So I just want to point out that these very high resolution pictures that are out there in the literature, the ones I’ve shown, you are actually taken in dead cells, in dead tissue. And there’s where you get the highest resolution. But can you get this similar high resolution in live cells? And the answer is maybe. And so what we are looking at now are a few nanoprobes, 1 is a diamond NV centre, N is nitrogen, V is vacancy. The lifetimes are about 20 nanoseconds. And we are trying to optimise the NV centre concentrations. There’s also a silicone vacancy centre being looked at. But we think that perhaps, if we are lucky, we can get about a billion photons/second, if we fail we’ll get 100 million photons/second. So you are at least in the order of one magnitude or 2, abided in a quantum dot, And one other thing they don’t photobleach at all, so they are very stable. The size is comparable to GFP. This is a GFP protein that lights up, this is a 5nm quantum dot or 5nm particle, and these are other familiar proteins that you’ve heard about. We are also looking at rare earth ions. This is out of a website for lasing materials. This is Neodymium YAG, a very industrial important laser. And so if you excite from the ground state manifold up to 808nm, it quickly relaxes down into this state, the 4F3/2 state. And from there you get fluorescence back down the ground state and you get all these other fluorescent lines. This line here 1064 is the very famous YAG laser line that has been used for a dozen... decades, 3 or 4 decades actually, as a very important laser. The mission rate is brighter than a quantum dot and it has several other important properties. Both the nanodiamonds and the rare particles allow you to do STED. So let me briefly remind you what that is. This is in a dye molecule if you go from the ground state to the upper row vibrational band excited state of a dye, that excitation quickly relaxes down to the bottom of the singlet state. You get a fluorescent photon to another set of states down below and it quickly empties out. And so Stefan Hell proposed and showed a while ago that first you use a single laser point to excite the volume. Then you come in with another laser beam with a donut hole in the middle and this laser beam in this region over here depletes this excited state going from position L2 to L3. So what you are left with is a tiny dot of excitation up here in this excited state because you’ve depleted this entire region. The higher up intensity you go with this beam the smaller and smaller this dot becomes. So in fact your intensity should be 100s of times higher than the intensity that would make the spontaneous rate equal to the stimulated rate. And so that way you get better spatial resolution. Alright. In an organic dye the lifetime of the dye molecules is a few nanoseconds and typical saturation intensities And what you have to use is about 500MW of intensity in order to get a very high-resolution spot. The good thing about a rare earths system is the lifetime is much longer. The bad thing is the lifetime is much longer but you compensate by putting in many more emitters, say 500; but the point here is that the saturation intensity has decreased by roughly 4 orders of magnitude. And because of that this makes it much more powerful to do STED with a rare earth. And if you work out what the STED would be - that’s just a repeat, so I'm not going to go into it. Now since you have higher intensities what you can do is you can use multiple interference. If you introduce 3 laser beams into a microscope objective, let the objectives come to a focal point; the pattern you form is - it's not exactly this pattern, but it's a pattern of nodes and anti-nodes in a triangular shape. And again you saturate everything except little dots, and what you find now is, you can get maybe with just an off-the-shelf YAG laser you should be able to get about 30nm spatial resolution. Now how is this different than STORM or PALM? What this, is you’re exciting the probe and then you are waiting for the natural lifetime to deplete itself. So it's no longer a small fraction of the excitation. You are looking, collecting all the fluorescence. So instead of only exciting say 1 or 2% or 3% or 5% of the area, you excite that whole area, it just happens to be much smaller. And so the data-taking rate to get a full image is at least 2 orders of magnitude faster. And so we think we can maybe at least recalculate, take a full image in something like half a second at 30nm resolution. So that’s another advantage. Here’s another application. Now, the reason I'm not telling you this and we haven’t done it makes me a little bit vulnerable. In fact I'm just getting lab space starting in 2 weeks from today, and my postdocs are coming starting in 1 week from today. So we are eager to get this going. Now there’s another group of us who have come together in neuroscience, informal neuroscience group And we’ve been talking a lot about what we can use in neuroscience; how we can apply these new methods in neuroscience. And there are exciting possibilities. I don’t think I'm going to go through most of those possibilities, but suffice it to say it turns out that in this small department I'm in, in Molecular and Cellular Physiology, Tom Sudhof is also there, Axel Brunger is also there and Brian Kolbilka is also there. And so out of a department of 12, we have a good start. Anyway, let me skip, what we're... let me just say what we are trying to do is, we were trying to see with millisecond resolution when neurons get... when there’s a voltage spike and releases a vesicle, on average 1 vesicle per voltage spike, in a synapse. Can we capture the synapse release with millisecond resolution? When the neurotransmitters get released they go onto receptors on the other side, they undergo a complex set of events, chemical events, that lead to the phosphorylation of molecules on the other side. Can we see that phosphorylation? So I'm going to skip this. And just say that we are also developing a probe to see phosphorylation or other chemical changes in the cell in the molecular footprint region - that would be very nice to do this . We did a toy experiment, and published this in 2012, where we took light from a synchrotron radiation. We put it through a micro-interferometer, put it onto a sample, looked at the back scattered light. And the idea here was when you take for example a cell and you stimulate it with a ligand - in this case it was a PC12 cell, and nerve growth factor was the stimulating ligand - it causes the PC12 cell to differentiate. And if you look at the infrared spectra over a couple of days, what you find is there are several lines that actually change. We did some microscopy, it was very crude microscopy - the scale bar is 50 microns. And here the wave number changes and you can see chemical changes in the cell. Well this is fundamentally uninteresting because the spatial resolution is terrible. And so the question is, can you get better spatial resolution? Super-resolution spatial resolution? And the answer is, yes we can - we think we can. This is a picture of a microscope objective, a high-resolution visible objective. But if you look at the very bottom of this objective what you see is that... more than a hemispherical shaped surface. And that’s the final focussing of these high numerical objectives. So the idea is we take an infrared objective, either reflective or transmittive, that has a numerical aperture at - about .7 is the highest one can buy commercially. And you design a final element but you make it out of germanium. Why germanium? I’ll tell you in a second, it's because the index refraction of germanium is 4, it's not 1.5. And if you have a field of view 50 microns on its side, you don’t care that much about chromatic aberration. One should be able to get an NA of about 1.4, if it were a visible microscope with initial fraction 1.5. So that means it gives you a ballpark of where your sin(Theta) should be, it should be about 0.93. If you have sin(Theta) at 0.93 that means using 10 micron light, which is in the region for the phosphorylation infrared signal. You have a very high numerical objective and we think we can get maybe 1.3/1.4 micron resolution even though it's 10 micron light. And since this light doesn’t travel well through water, the skin depth is a little over 10 microns. This is actually an immersion, it's dipping into water and it’s a little microlens, now dumped right on the cell surface, and that gives you white field illumination. So that’s the beginning. But we are not going to stop there. We want actually... this is the end part. Back in some paper I wrote with Michael Fee, who is now a neurobiologist, when he was my graduate student, and also with Ted Hänsch. And what we did is we took microwave radiation, we put it down a miniature coaxial cable, maybe a 1.5mm in diameter. That little central conductor we sharpened with a file. And if you think about this, the electric magnetic radiation that’s going down this coaxial cable is still propagating white light. It actually travels at the speed of light as modified by the dielectric material. And it's irrelevant what the wave length is, okay. It all gets cramped into this small coaxial cable because you can have a wavelength of 10m and it still travels at the speed of light. It's localised by the conductor. And so what we did in this toy experiment is we put down electromagnetic radiation, it reflects back. We look at the interference between the light that gets reflected back and a reference beam, the cross term. It's a very, very sensitive way of detecting any phase shift, any change. And what we see is as we pass it over a 100 micron grid that we could see phase shift changes. And so in this toy experiment where we were using microwave radiation on a scale of a couple of centimetres, we got land over 4,000 resolution. In that same paper we suggested - oh, by the way you can do this in infrared, because the skin depth of the metals and everything else allows you to do this. So in this two and a half page paper we said, oh yeah you can do near-field in the infrared and get very good spatial resolution. Then it was 1989 I went back to trapping atoms and cooling and atom interferometry. Ted went back to hydrogen. And so we could have been famous, but... In any case after my 4 1/2 years sabbatical with the government, I came back and I said well I want to do infrared spectroscopy. And I'd learnt while I was giving a talk at Lawrence Berkeley Lab that indeed it had been rediscovered. This is a piece of silicon, anisotropic, and the edges etched into a pyramid and they coated not all sides but only 2 sides with metal. And if it's all sides with metal it’s a waveguide. If it's 2 sides of metal it becomes a transmission line. And because it’s a transmission line you can squeeze the electromagnetic radiation into a smaller volume. This is the calculation of this, in here it's tip 40nm across, you see the enhanced electromagnetic field. And so this is what we intend to do. We intend to use tips like this in conjunction with super-resolution visible and near-infrared radiation, again poised directly over the cell. We think hopefully we will get tens of nanometre resolution, chemical resolution, with this technique. So that’s what's on the drawing board, stay tuned and maybe within 6 months or a year I could share some experimental results. But in any case this is why I called it microscopy 2.0; one can really achieve land over a hundred or better spatial resolution, not only in the visible and the near-infrared but also in live cells. Once we get millisecond imaging the motion in live cells doesn’t become relevant anymore. And so it's that motion average over a second or tenths of a second that actually prevents you from getting a really super-resolution. And so I close with this image of the Leeuwenhoek microscope, and I just want to remind you that this was a single lens microscope but the centre of that lens is a small glass sphere. And it's the final focusing element of our infrared lens. So it goes round back to 1700 that things don’t really change, optics are still optics. Thank you.

Lassen Sie mich zu Beginn den Untertitel "Optische Mikroskopie 2.0" erklären. Er bezieht sich auf den größten amerikanischen Philosophen des 20. Jahrhunderts. Falls Sie sich fragen, wer das ist - es handelt sich um Yogi Berra; er war Fänger bei den New York Yankees. Rechts sehen Sie ihn in einem philosophischen Gespräch mit einem Schiedsrichter. Er sagte eine Menge kluger Dinge. Zum Beispiel sagte er: "Wenn du an eine Weggabelung kommst, nimm sie." Ich rate das jedem Studenten. Außerdem sagte er: "Man kann viel wahrnehmen, indem man einfach beobachtet." Warum spricht ein Physiker bei einer Tagung über Physiologie bzw. Medizin? Nun, Sie dürfen nicht vergessen: Physiker haben einige Beiträge zur Medizin geleistet. Der erste Physiker, der einen Nobelpreis erhielt, war Roentgen; er bekam ihn im Jahr 1901 für die Entdeckung der Röntgenstrahlen. Und Röntgengeräte hatten natürlich einen nachhaltigen Einfluss auf die Medizin. Aber es steckt noch mehr dahinter. Sehen Sie sich nur die modernen Techniken an, die wir heutzutage in der Medizin und in der Biologie anwenden - neben den Röntgengeräten gibt es die Elektronenmikroskope, es gibt die Kernspinresonanz für die strukturelle Biologie und die Kernspintomographie. Es gibt die Computertomographie mit Röntgenstrahlen, die Positronenemissionstomographie - sie alle wurden im Wesentlichen durch Physiker eingeführt. Doch abgesehen von diesen bildgebenden Techniken ist auch darauf hinzuweisen, dass das Markieren wichtiger Elemente, vor allem von Proteinen, für das Markieren poly- und monoklonaler Antikörper große Bedeutung hatte. Radioaktive Nukleotide, EM-Immunfärbung, Fluoreszenzmarkierung, das Markieren grün fluoreszierender Proteine - all diese Dinge waren von großer Bedeutung. Was ist der Farbcode? Und dann, erst vor kurzem: Einzelmolekülmanipulation und -bildgebung, optische Auflösung im Sub-Wellenlängenbereich. Das Farbcode-Symbol - alles, was farbig ist, hat Nobelpreise gewonnen. Die weißen Dinge warten noch auf ihren ersten Nobelpreis. Lassen Sie mich über einen Teil der optischen Mikroskopie sprechen, der die Art und Weise, in der wir biologische Forschung betreiben, von Grund auf verändert hat. Es begann mit der ersten Manipulation von Zellen, Paramecium E. coli, durch Art Ashkin bei den Bell Laboratories. Steve Block griff das rasch auf und befestigte E. coli auf dem Objektträger eines Mikroskops, schnappte sich E. coli mit einer optischen Pinzette, drehte es herum, um die Antriebe zu untersuchen. Und ich begann damit, ein einzelnes Molekül der DNA zu manipulieren. Das ist wirklich das ABC des Biotrapping. Als ich in den späten Achtzigern nach Stanford ging, wollte ich wissen, ob ich Moleküle, insbesondere DNA, unmittelbar manipulieren konnte. Auf diesem Bild sehen Sie eine mit fluoreszierenden Farbstoffen gefärbte Einzelmolekül-DNA. In das optische Mikroskop wurde ein Laser eingeführt, es wurde an einen motorisierten Spiegel-Joystick angeschlossen, und schon kann man eine Einzelmolekül-DNA herumschwänzeln lassen. Die Studenten, die damit befasst waren, waren selbstverständlich begeistert. Sie verschwanden in den Laboren und beschäftigten sich stundenlang damit, wie mit Videospielen. Schließlich musste ich ihnen sagen: Das macht natürlich Spaß, aber führen wir ein paar Experimente durch. Wie auch immer. Ich habe Jim Spudich unterstützt, Bob Simmons... Bob Simmons war ein Jahr lang in Stanford. Er kam zu mir und sagte: Können Sie uns bitte dabei helfen, zusammen mit Jim Spudich ein Aktin-Myosin-System zu untersuchen. Klar, sagte ich. Zusammen haben wir dann das vorgeschlagen... wir erstellten das System, mit optischen Pinzetten ein einzelnes Aktinfilament zu halten, lösten das Substrat mit einer Styroporkugel - unser Ziel war es, die Kraft zu messen, die entstand, wenn Aktin ATP hydrolysierte. Wir kamen dem Ziel sehr nahe, erreichten aber noch nicht die äußerste Grenze - würden wir den Arbeitstakt eines einzelnen Aktinfilaments sehen? Mein Labor war im zweiten Stock bei Varian. Mit Jim, Bob und dem Studenten Jeff Finer verlegten wir es in das Erdgeschoß von Beckman, und damit waren wir endlich in der Lage, die Anziehungskraft eines einzelnen Aktinmoleküls auf Myosin zu klären. Das war ein sehr schöner Erfolg. Lassen Sie mich noch über einige andere Revolutionen sprechen, die sich in der Mikroskopie ereignet haben. Wenn man an die optische Mikroskopie den, an die Beugungsgrenze, wenn Sie so wollen - sie ist vorgegeben durch die Wellenlänge des Lichts, geteilt durch den Brechungsindex mal zwei mal Signal-Fader, wobei Signal-Fader angibt, wie eng die Strahlen fokussiert sind. Bei einem typischen optischen Mikroskop könnten das 250 bis 300 nm sein. Wenn man aber eine andere Frage stellt - wenn man nicht fragt: Was ist der Zerstreuungskreis, der Klecks eines einzelnen fluoreszierenden Moleküls bei bester Auflösung, sondern wenn man fragt: Was ist das Zentrum dieser Auflösung? Das ist die optische Auflösung geteilt durch das Signal-Rauschverhältnis. Wäre das Signal-Rauschverhältnis 10/1, dann würde man grundsätzlich statt 300 nm 30 nm erhalten. Wäre es 100/1, würde man grundsätzlich 3 nm erhalten. Wenn man Bilder von unabhängigen Molekülen erzeugt - zuerst von diesem, dann von jenem, dann von diesem - dann würde das normalerweise alles verschmieren, man hätte keine gute optische Auflösung. Doch Eric Betzig, Harold Hess und unabhängig davon Xiaowei Zhuang... tatsächlich gab es noch zwei weitere Forschungsgruppen im selben Zeitraum des Jahres 2006, die sich diese Methode einer Verbesserung der optischen Auflösung einfallen ließen. Wie sich zeigte, hatte das große Auswirkungen. Noch etwas will ich kurz erwähnen: Die stimulierte Emissionsdepletion-Mikroskopie, erfunden von Stefan Hell, war auch von großer Bedeutung. Ich zeige Ihnen jetzt das Beispiel einer Anwendung. Während ich Energieminister war, kümmerte sich der letzte Postdoktorand in meinem Labor darum; es wurde vor kurzem in Science veröffentlicht. Es geht um die Untersuchung von Biofilmen. Sehen Sie sich dieses Bild an - normalerweise stellt man sich Bakterien als freischwebend vor, in der so genannten planktonischen Form. Doch die meisten Bakterien, die man in der Natur findet, sind keine einzelnen Zellen; sie landen vielmehr auf Oberflächen und bilden Bakteriengemeinschaften. Bilden sie jetzt alle ein und dasselbe Bakterium oder handelt es sich um verschiedene Bakterien einem so genannten Biofilm? Das ist die Grafik eines Biofilms, der auf einer Oberfläche wächst. In diesen Biofilmen besteht der Großteil der Masse nicht aus Bakterien, sondern aus Proteinen und Polysacchariden, die von den Bakterien ausgeschieden werden. Und hier sehen Sie die Kantenansicht eines in unserem Labor wachsenden Biofilms. Das hier sieht man durch ein optisches Mikroskop mit einer Auflösung von etwa 300 oder 400 nm. Und das sieht man mithilfe superauflösender Techniken in einem Biofilm. Erweitern wir diesen gesprenkelten Bereich - hier haben wir's. Das ist ein Cholerabakterium; es gibt Proteine ab, die den Biofilm bilden. Und Sie sehen, dass die Auflösung besser ist. Das Gute daran ist, das es sich hier um Bilder handelt - um Filme, wenn Sie so wollen, Zeitlupenfilme -, die von echten, wachsenden Biofilmen gemacht wurden. Man erhält eine sehr hohe Auflösung, da die Biofilmstruktur dafür sorgt, dass sich die Dinge nicht bewegen. Damit erhält man Auflösungen in der Größenordnung von 10/15 nm. Das ist ein Beispiel; wir arbeiten weiter daran. Ich muss sagen, wenn man erst einmal in der Lage ist, Biofilme mit einer Auflösung von 10/15 nm zu untersuchen, dann öffnet sich eine ganze Welt. Man sieht, wie diese Bakterien durch die Exozytose von Vesikeln miteinander kommunizieren. Man sieht die tatsächliche Struktur der Biofilme, das Protein und metrische Polysaccharidstrukturen - Dinge dieser Art. In dieser ersten Studie wurde das getestet. Lassen Sie mich noch kurz auf die superauflösende Bildgebung in einem Signalpfad eingehen, wobei sich in dem Signalpfad, wenn Moleküle mutieren, die Dinge zum Schlechten wenden und Krebs bilden. Diese Arbeit geht auf meinen vorletzten Postdoktoranden zurück, Xiaolin Nan, der jetzt an der Oregon State Health University ist. Es gab eine Zusammenarbeit mit Joe Grey, der ebenfalls vom Lawrence Berkley National dorthin übersiedelt ist; außerdem mit Frank McCormick von der UCSF. Das ist eine zeichnerische Darstellung dessen, was geschieht. Für diejenigen unter Ihnen, die darüber nichts wissen - das sind keine Daten. und ERK, auch bekannt als MAP-K. Die MAP-K-Signalisierung wird aktiviert, indem mit dem Tyrosinkinaserezeptor ein Wachstumsfaktor an die extrazelluläre Domäne gebunden wird. Als Nächstes werden die Signalmoleküle Grb2 und Sos an die interne Andockstelle rekrutiert, was die Ras-Aktivierung an der Membran zur Folge hat. Effizienz und Dauer der Signalübertragung werden durch das Gerüstprotein Kinase-Suppressor von Ras, KSR, reguliert. Ras löst eine Phosphor-Relationskaskade unter Einbeziehung der Proteine Raf, MEK und ERK aus, was zur ERK-Aktivierung und Translokation in den Zellkern führt. Im Nukleus angekommen, aktiviert ERK mehrere Transkriptionsfaktoren, welche die Genexpression vermitteln. Die Zielgene handeln daher... Lassen Sie mich das wiederholen: Auf der Oberfläche der Zelle befindet sich ein Rezeptormolekül, TRK. Wenn ein Ligand darauf landet und es aktiviert, wird die zelluläre Seite phosphoryliert. Zwei weitere Moleküle, Grb2 und Sos, werden phosphoryliert. Sie aktivieren daraufhin ein Molekül namens Ras, das in der Lage ist, ein weiteres Molekül namens Raf zu ergreifen, dann MEK, dann ERK. In dieser Kette tritt eine Signalverstärkung auf, doch all diese Moleküle außer Ras werden phosphoryliert. Wenn Ras oder Raf mutieren, benötigt man für die Vermehrung der Zelle kein Signal von außen. Und Mutationen von Raf oder Ras sind verantwortlich für ungefähr hängen mit ungefähr der Hälfte bis zu zwei Dritteln aller menschlicher Krebserkrankungen zusammen. Ras-Mutationen hängen mit mehr als 90 % der Fälle von Bauchspeicheldrüsenkrebs zusammen und mit zwei Dritteln der multiplen Myelome. Einige der schwersten Erkrankungen hängen mit Ras-Mutationen zusammen. Jedenfalls hatte man bei der Verwendung der Elektronenmikroskopie, der Immunoelektronenmikroskopie den Verdacht, dass es in diesen mutierten Formen von Ras vielleicht Cluster gibt, die...das, was sie hier links sehen, sind Daten. Es handelt sich um das Bild eines an einem Goldteilchen haftenden Antikörpers, der auf mutierte Formen von Ras zielt. Die Analyse dieses Bildes brachte einige Autoren zu der Vermutung, dass sich vielleicht Cluster von Ras bilden, fünf bis acht Ras-Moleküle. Und dieser Cluster löst dann die Zell-Signalübertragung aus, die zur Zellproliferation und zur unkontrollierten Zellteilung führt. Das war unser Ausgangspunkt. Was machten wir mit diesem mutanten Ras-Gen? Wir fügten einen Initiationsfaktor hinzu, den wir mit einem Tetrazyklin nach oben und unten regeln können... nicht mit einem Tetrazyklin, sondern mit einem Tetrazyklin-Derivat, das in die Zelle eindiffundieren kann. Wenn dieses Dox auf dem Katalysatorzentrum landet, kann man die Expression des mutanten Proteins tatsächlich nach oben regeln. Und das sehen wir in diesem mutanten so genannten KRas-Protein, wo die Mutation am Kodon 12 festgestellt wurde. Man ersetzt Glyzin durch Asparaginsäure. Hier haben wir eine Zelle, eine Krebszelle. Wenn ich in dieses kleine weiße Rechteck hineinzoome, das man bei 200 nm sieht - der Maßstabsbalken liegt bei 200 nm -, dann sieht man diese kleinen roten Punkte; das sind einzelne Moleküle des mutanten Ras. Was haben wir gemacht? Wir haben einfach statistisch überprüft, wie viele dieser mutanten Ras es gibt und ob sie Cluster bilden. In einer sehr niedrigen Dosis von Dox, 1 ng/ml, stellen wir fest... das ist ein statistischer Test, der Aussagen über die Bildung von Clustern trifft, aber man benötigt nicht diesen alten, herkömmlichen statistischen Test, den so genannten Ripley-Test; man kann Paare zählen, Doppel- Tripel- und Einzelmoleküle. Bei 1 ng/ml Dox stellen wir fest, dass praktisch alle von ihnen isolierte Einzelmoleküle sind; nur ein sehr kleiner Teil sind Doppel- und Tripelmoleküle. Wenn wir die Dosierung von Dox erhöhen, so dass die Konzentration von Einzelmolekülen ungefähr siebenmal höher ist, finden wir in der Hauptsache immer noch Einzelmoleküle - das ist der grüne Balken - doch wenn wir uns die Zahl der Doppelmoleküle ansehen, stellen wir fest, dass nunmehr ungefähr 18 % der Moleküle als Doppelmoleküle ausgebildet sind. Das Schöne an dieser Superauflösung ist, dass man nur Hanteln sieht. Und wie Sie sehen, ist das Signal-Rauschverhältnis sehr gut. Wenn man also...wir haben das dann mit verschiedenen Dosen gemacht. Wir haben festgestellt...das ist ein Gel, in dem wir hier die Konzentration von Tetrazyklin erhöht haben. Das ist das Wildtyp-Ras; wir haben die Konzentration in der mutanten Form erhöht. Wenn man das nach oben regelt, geht dies bemerkenswerterweise nach unten - in der Zelle scheint es also eine Regel zu geben, die besagt: In dieser Zelle ist nur eine bestimmte Menge Ras erwünscht. Das wurde in zwei Zelllinien beobachtet; es handelt sich also um ein kleines Nebenprodukt. Aber jetzt kommt das Interessante. Ab 1-2 ng/ml Dox wird das ERK phosphoryliert. Die Phosphorylierung des ERK nehmen wir Zeichen dafür, dass es nachgeschaltete Signalübertragungsaktivität gibt und dass sich die Zelle teilen wird. Das wäre unsere Probe für den mutanten...die Konzentration im mutanten Molekül ist so hoch, dass das Zellteilungssignal ausgelöst wurde. Als Nächstes machten wir Folgendes: In dieser Grafik nahmen wir unser Ras-Molekül... das ist unser fluoreszierender Farbstoff; es handelt sich um mCherry, ein Derivat des grün fluoreszierenden Proteinfarbstoffs. Am Ende hatten wir eine kleine Aminosäurekette, die, gekoppelt mit einem von uns so genannten dimerisierenden Wirkstoff, in dieser Grafik durch die kleinen orangefarbenen Flecken dargestellt... wir setzten das in die Zelle ein und stellten bei Dox-Konzentrationen von null, wenn also keine mutante Form von Ras vorhanden ist... wir stellen fest, dass das ERK nicht phosphoryliert wird. In der Dox-Konzentration, bei der es zuvor keine Phosphorylierung des ERK gegeben hat, stellen wir wieder fest, dass das ERK nicht phosphoryliert ist, doch als wir den dimerisierenden Wirkstoff einsetzten - voila! - wurde ein nachgeschaltetes Signalprotein ausgesandt. Das sagt uns, dass man die Bildung von Dimeren benötigt - bei einer niedrigen Konzentration von ungefähr 18 %. Wenn man die Konzentration noch weiter erniedrigt, aber die Bildung von Dimeren erzwingt, erhält man ebenfalls eine nachgeschaltete Signalübertragung. Anscheinend ist also die Bildung von Dimeren sowohl nötig als auch ausreichend, um der Zelle das Signal zur Vermehrung zu geben. Und man benötigt keine Cluster höherer Ordnung. Das liegt wiederum daran, dass die Einzelmolekülfluoreszenz äußerst empfindlich ist. Dabei bietet sich auch sofort ein Ziel an, denn was wir ebenfalls taten - diese Daten zeige ich nicht - wir untersuchten diese mutante Form von Ras mit und ohne das GTP als Teil des Moleküls. Alle, was man hat, ist das im Protein eingebettete Linker-Zentrum, und wir stellten fest, dass die Linker Dimere mit derselben Frequenz bildeten wie die vollständige mutante Form des Proteins. Das vorgeschlagene Medikament wäre also...das ist das mutante GD12-Zentrum; man würde also wollen, dass sich das Medikament an diesen Teil anheftet, aber auch auf diesen rot dargestellten Linker-Arm einwirkt, um die Dimerisation zu verhindern. Angesichts dieser Arbeit sagt man sich also: Aha! Wir glauben zu wissen, wie man es vernünftigerweise anstellt, das Medikament auf sein Ziel zu richten. Das also eine weitere Anwendung der superauflösenden Bildgebung. Nun gut. Gestatten Sie mir ein paar Ausführungen über die Grenzen der Fluoreszenz. In dieser Grafik sehen Sie einen einzelnen fluoreszierenden Punkt, jetzt auf einem CCD-Array-Sensor abgebildet. Er ist typischerweise drei bis vier Pixel breit. Nun findet man das Zentrum dieses Bildes, das üblicherweise ein Zwanzigstel/ein Fünfzigstel eines Pixels ausmacht. Aber nehmen wir einmal an, dass die Pixel nicht einheitlich auf das Licht reagieren, dass sie um 1, 2 oder 3 % schwanken können. Und ein Pixel zum Beispiel, anstatt das anzuzeigen, reagiert und zeigt eine geringfügig höhere Ladung an. Wenn man dieses Muster anpasst, verschiebt man das Bild. Im Jahr 2006, als das zum ersten auftauchte, kam uns der Verdacht...wir spielten damit herum - ist es möglich, dass die Schwankung einer CCD-Kamera von Pixel zu Pixel die Auflösung begrenzt? Wir führten ein ganz einfaches Experiment durch. Wir nahmen eine kleine Lochblende und stellten weißes Licht dahinter. Und diese kleine Lochblende wurde sodann in roten und grünen Bereichen auf dem CCD-Sensor abgebildet. Dann bewegten wir die Lochblende, wie hier gezeigt, mit einem kodierten Präzisions-Verschiebetisch; wir wissen genau, wie weit wir sie bewegen. Und in dem Maß, in dem wir sie bewegen, bewegt sich natürlich auch der rote bzw. der grüne Punkt. Doch wir passen den Standort des Zentrums dieses roten bzw. grünen Punkts an, und wenn die Kamera in Ordnung ist, wandern sie genauso einheitlich herum wie der Verschiebetisch einheitlich herumwandert. Und wir stellten fest, dass sie tatsächlich einheitlich wandern. Als wir die Verschiebung durchführten - man kann den Verschiebetisch um einen sehr kleinen Bruchteil eines Pixels auf der Kamera bewegen, wodurch man eine Höhenlinienkarte der Differenz erhält - wenn man den Mikroskop-Verschiebetisch bewegt, wackelt das andere Ding herum, und zwar um 6 bis 10 nm. Es ist in den CCD-Sensor eingebrannt, was bedeutet, dass man Korrekturen vornehmen kann, nachdem das Bild aufgenommen wurde. Und wenn wir das tun, dann stellen wir fest - siehe da, wir können die Auflösung, die Superauflösung verbessern. In einer Nature-Studie aus dem Jahr 2010, als wir ein multiples System hatten - DNA, zwei Farbstoffe - aber wir dehnten ein Dutzend Systeme, also ein identisches System, auf genau die gleiche Art. Wir stellten fest, dass die Auflösung des Zeichenabstands dieser Farbstoffe in Wasser etwa einen halben Nanometer betrug, also 5 Angström. Das verriet uns also, jedenfalls mit einer Genauigkeit von 5 Angström, dass wir mit genügend Photonen eine hervorragende Auflösung erreichen würden. Mit einem einzelnen Farbstoff jedoch erreichten wir die Grenze des Schrotrauschens; ungefähr...das ist eine logarithmische Kurve, die durchgezogene Linie ist die Grenze des Schrotrauschens, das ist die frühere Arbeit. Und wir stellten fest, dass Verbesserungen um den Faktor 2 oder 3 möglich sind, doch aufgrund der Tatsache, dass die Farbstoffe unstabil sind, befindet man sich immer noch in diesem 5 nm-Bereich. Hier habe ich ein paar Daten darüber zusammengestellt, wie unstabil die Farbstoffe sind. Das sind die grün fluoreszierenden Protein-Farbstoffe, typische organische Farbstoffe und Quantenpunkte. Das ist aus Wikipedia, es muss also richtig sein. Jedenfalls ist das eine allgemeine Schätzung darüber, wie viele fluoreszente Photonen man aus diesen Proben erhält. Für Farbstoffe sammelt man normalerweise ungefähr 10^4 Photonen, bevor sie ausbleichen, und sie müssen in etwa einer bis zehn Sekunden gesammelt werden. Wenn man eine größere zeitliche Auflösung wünscht, kann man nicht einfach den Laser hochdrehen, denn wenn man das tut, erhält man doppelt angeregte Zustände der Farbstoffmoleküle, und sie würden einfach zerbersten. In der zeitlichen Auflösung ist man also wirklich eingeschränkt. Und wenn in PALM oder STORM Anregungen auftreten, dann dauert es ungefähr eine Minute, bis ein vernünftiges Bild entsteht. Auch unsichtbare Lichtanregung; man macht sich immer Sorgen um Lichtschädigungen. Ich weise darauf hin, dass diese sehr hoch aufgelösten Bilder, die in der Literatur zu finden sind, jene, die ich gezeigt habe, in toten Zellen aufgenommen wurden, in totem Gewebe. Dort erhält man die größte Auflösung. Doch kann man eine ähnlich hohe Auflösung in lebenden Zellen erreichen? Die Antwort lautet: vielleicht. Hier sehen wir ein paar Nanoproben; eine davon ist ein Diamant-Stickstoff-Fehlstellen-Zentrum. Die Lebenszeit beträgt ungefähr 20 Nanosekunden. Und wir versuchen, den Gehalt an NV-Zentren zu optimieren. Auch ein Silikon-Fehlstellen-Zentrum wird untersucht. Wir glauben, dass wir, wenn wir Glück haben, ungefähr eine Milliarde Photonen pro Sekunde bekommen; geht es schief, erhalten wir 100 Millionen Photonen pro Sekunde. Man bewegt sich also in einer Größenordnung von mindestens eins oder zwei in einem Quantenpunkt; drei und mehr Größenordnungen heller als eine fluoreszierender Farbstoff. Und noch etwas: Sie bleichen überhaupt nicht aus, sind also sehr stabil. Die Größe gleicht einem GFP. Das ist ein aufleuchtendes GFP-Protein, das ist ein Quantenpunkt von 5 nm bzw. ein 5 nm-Teilchen, und das sind andere bekannte Proteine, von denen Sie schon einmal etwas gehört haben. Wir untersuchen außerdem Seltene-Erdionen. Das stammt aus einer Website für Lasermaterialien. Das ist Neodymium YAG, ein sehr wichtiger industrieller Laser. Wenn man ihn vom Grundzustand aus mehrfach bis zu 808 nm anregt, kehrt er schnell wieder in diesen Zustand zurück, in den 4F3/2-Zustand. Von dort aus erhält man Fluoreszenz bis hinunter zum Grundzustand, und man erhält all diese anderen fluoreszierenden Linien. Diese Linie hier, 1064, ist die berühmte YAG-Laserlinie, die seit einem Dutzend...seit Jahrzehnten, seit drei oder vier Jahrzehnten als äußerst wichtiger Laser verwendet wird. Die Emissionsrate ist heller als bei einem Quantenpunkt, und sie hat noch weitere wichtige Eigenschaften. Sowohl die Nanodiamanten als auch die Seltenen Erden Teilchen ermöglichen die Durchführung von STED. Lassen Sie mich kurz darauf eingehen, was das ist. Wenn man in einem Farbstoffmolekül vom Grundzustand in den bis zum oberen Vibrationsband angeregten Zustand eines Farbstoffs übergeht, kehrt die Anregung schnell zum unteren Ende dieses Singulett-Zustands zurück. Man erhält ein fluoreszierendes Photon für weitere, darunter liegende Zustände, und es entleert sich schnell. Vor einiger Zeit schlug Stefan Hell vor, zuerst eine einzelne Laserspitze zur Anregung des Volumens zu verwenden. Dann sendet man einen weiteren Laserstrahl mit einem Donut-Loch in der Mitte aus, und dieser Laserstrahl entleert den angereicherten Zustand in diesem Bereich hier, indem er ihn von der Position L2 in die Position L3 bringt. Übrig bleibt ein winziger Fleck von Anregung hier oben in diesem angeregten Zustand; diese ganze Region hat man entleert. Je mehr man die Intensität dieses Strahles erhöht, umso kleiner wird dieser Fleck. In der Tat sollte die Intensität hunderte Male höher sein als diejenige Intensität, welche die spontane Rate der stimulierten Rate angleicht. Auf diese Weise erhält man eine bessere räumliche Auflösung. In einem organischen Farbstoff beträgt die Lebensdauer der Farbstoffmoleküle einige wenige Nanosekunden, und die Sättigungsintensität - also die Intensität, die von S1 bis hier stimuliert - beträgt entsprechend der natürlichen Lebensdauer etwa 15 MW. Um einen sehr hoch aufgelösten Fleck zu erhalten, benötigt man eine Intensität von etwa 500 MW. Das Gute an einem seltenen System ist: Die Lebensdauer ist viel länger. Das Schlechte daran ist: Die Lebensdauer ist viel länger, was man aber dadurch ausgleicht, dass man viel mehr Emissionsquellen einsetzt, sagen wir 500. Aber entscheidend hierbei ist, dass die Sättigungsintensität um etwa vier Größenordnungen abgenommen hat. Deshalb ist die Anwendung der STED-Technik mit Seltenen Erden viel leistungsstärker. Wenn Sie herausfinden wollen, was die STED-Technik - das ist eine Wiederholung; ich gehe jetzt nicht darauf ein. Nun - da die Intensitäten höher sind, kann man multiple Interferenzen nutzen. Wenn man in das Objektiv eines Mikroskops drei Laserstrahlen einfallen lässt und das Objektiv auf einen Punkt scharfstellt, bildet sich ein Muster - es ist nicht genau dieses Muster, aber ein Muster von Knoten und Bäuchen in einer Dreiecksform. Und wieder sättigt man alles außer kleinen Flecken, und man stellt fest, dass man schon mit einem handelsüblichen YAG-Laser in der Lage sein sollte, eine räumliche Auflösung von etwa 30 nm zu erreichen. Nun, wo liegt der Unterschied zu STORM oder PALM? Man regt die Probe an und wartet darauf, dass die natürliche Lebensdauer abläuft. Es ist also nicht mehr nur ein kleiner Bruchteil der Anregung. Man sieht, man sammelt die gesamte Fluoreszenz. Anstatt also nur, sagen wir, ein, zwei, drei oder fünf Prozent des Bereichs anzuregen, regt man diesen gesamten Bereich an, nur dass er viel kleiner ist. Die Datenerfassungsrate zur Aufnahme eines vollständigen Bildes ist also mindestens um zwei Größenordnungen schneller. Deshalb glauben wir, dass wir zumindest nachberechnen können - dass wir ungefähr einer halben Sekunde ein vollständiges Bild mit einer Auflösung von 30 nm aufnehmen können. Das ist ein weiterer Vorteil. Hier haben wir noch eine Anwendung. Ich kann Ihnen allerdings nichts davon erzählen, und wir haben noch nichts gemacht. Ich bekomme nämlich erst in zwei Wochen ein Labor, und meine Postdoktoranden kommen in einer Woche. Wir können es also kaum erwarten, dass wir damit anfangen können. Wir haben noch eine Gruppe gebildet, eine für Neurowissenschaften - eine informelle Gruppe für Neurowissenschaften. Das ist Lang Lang; ich bin ein Groupie von Lang Lang. Wir haben viel darüber gesprochen, was wir in der Neurowissenschaft verwenden können; wie wir diese neuen Methoden in der Neurowissenschaft anwenden können. Es gibt faszinierende Möglichkeiten. Ich glaube nicht, dass ich den Großteil dieser Möglichkeiten erschöpfend behandeln kann. Jedenfalls aber hat sich gezeigt, dass in dieser kleinen Abteilung, der ich angehöre, molekulare und zelluläre Physiologie... Tom Sudhof ist dabei, Axel Brunger auch, ebenso Brian Kobilka. In einer Fakultät mit zwölf Abteilungen haben wir einen guten Start hingelegt. Wie auch immer. Das überspringe ich...was wir versuchen... wir haben versucht, mit einer Auflösung von einer Millisekunde zuzusehen, wenn Neuronen... wenn es in einer Synapse eine Spannungsspitze gibt, die ein Vesikel, durchschnittlich ein Vesikel pro Spannungsspitze freisetzt. Können wir die Synapsen-Freisetzung mit einer Auflösung von einer Millisekunde erfassen? Wenn die Neurotransmitter freigesetzt werden, wandern sie zu Rezeptoren auf der anderen Seite, sie machen eine Reihe komplexer Vorgänge mit, chemischer Vorgänge, die zur Phosphorylierung von Molekülen auf der anderen Seite führen. Können wir diese Phosphorylierung sehen? Das überspringe ich. Ich sage nur Eines dazu: Wir entwickeln auch ein Verfahren zur Sichtbarmachung der Phosporylierung oder anderer chemischer Veränderungen im Bereich des molekularen Fußabdrucks in der Zelle - es wäre sehr schön, das zu können. Wir führten ein Toy-Experiment durch, das wir im Jahr 2012 publizierten; dabei entnahmen wir einer Synchrotronstrahlung Licht. Wir sandten es durch einen Mikrointerferometer, gaben es auf eine Probe und untersuchten das zurückgestreute Licht. Dahinter steckte folgende Idee: Wenn man zum Beispiel eine Zelle mit einem Liganden stimuliert dann hat das die Differenzierung der PC12-Zelle zur Folge. Und wenn man zwei Tage lang das Infrarotspektrum untersucht, findet man verschiedene Linien, die sich tatsächlich verändern. Wir beschäftigten uns ein bisschen mit Mikroskopie; es war sehr grobe Mikroskopie - die Maßstableiste zeigt 50 Mikron an. Hier ändert sich die Wellenzahl, und man sieht chemische Veränderungen in der Zelle. Nun, das ist absolut uninteressant, weil die räumliche Auflösung schrecklich ist. Die Frage lautet also: Kann man eine bessere räumliche Auflösung erreichen? Räumliche Superauflösung? Die Antwort lautet: Jan, wir können - wir glauben, dass wir das können. Das ist die Darstellung eines Mikroskopobjektivs, eines hoch auflösenden visuellen Objektivs. Doch wenn man sich das untere Ende dieses Objektivs ansieht, dann sieht man...mehr als eine halbkugelförmig geformte Oberfläche. Das ist die abschließende Stelle, an der diese Objekte mit hoher numerischer Apertur scharfstellen. Die Idee ist jetzt: Wir nehmen ein Infrarotobjektiv, entweder reflektiv oder lichtdurchlässig, mit einer numerischen Apertur von etwa 0,7; das ist die größte Öffnung, die man käuflich erwerben kann. Und man konzipiert ein abschließendes Element, das aus Germanium besteht. Warum Germanium? Das will ich Ihnen sagen - es liegt daran, dass der Brechungsindex von Germanium 4 ist, nicht 1,5. Und wenn man ein Blickfeld von 50 Mikron auf einer Seite hat, macht man sich um chromatische Aberration keine großen Sorgen. Man sollte in der Lage sein, eine numerische Apertur von etwa 1,4 zu erhalten, wenn es ein visuelles Mikroskop mit einer Anfangsbrechung von 1,5 wäre. Das gibt uns eine Vorstellung davon, wo unser sin(Theta) liegen sollte, nämlich bei etwa 0,93. Wenn sin(Theta) bei 0,93 liegt, dann bedeutet das, man nutzt Licht von zehn Mikron, was im Bereich des Infrarotsignals der Phosphorylierung liegt. Man hat ein Objektiv mit sehr großer numerischer Apertur, und wir glauben, wir können eine Auflösung von vielleicht 1,3/1,4 Mikron erreichen, auch wenn das Licht bei nur zehn Mikron liegt. Und da sich dieses Licht nur schwer durch das Wasser fortpflanzt, liegt die Eindringtiefe bei etwas über zehn Mikron. Es handelt sich um eine Immersion, es wird ins Wasser getaucht; das ist eine kleine Mikrolinse, die sich jetzt direkt auf der Zellenoberfläche befindet, und das führt zu einer Weißfeldfbeleuchtung. Das ist aber erst der Anfang; wir machen hier nicht Halt. Wir wollen...das ist der abschließende Teil einer Abhandlung, die ich zusammen mit Michael Fee, jetzt Neurobiologe, geschrieben habe, als er bei mir studierte; außerdem mit Ted Hänsch. Wir sandten Mikrowellenstrahlung durch eine Miniatur-Koaxialkabel mit einem Durchmesser von vielleicht 1,5 mm. Diese kleine zentrale Ader schärften wir mit einer Feile. Wenn man darüber nachdenkt...die elektromagnetische Strahlung, die durch dieses Koaxialkabel strömt, gibt immer noch weißes Licht ab. Sie pflanzt sich mit Lichtgeschwindigkeit fort, modifiziert durch das dielektrische Material. Die Wellenlänge ist irrelevant. Das kann man alles in dieses kleine Koaxialkabel packen, denn auch bei einer Wellenlänge von zehn Metern pflanzt sich die Strahlung mit Lichtgeschwindigkeit fort. Sie wird durch die Ader lokalisiert. In diesem Toy-Experiment sandten wir elektromagnetische Strahlung aus, und sie wurde reflektiert. Wir untersuchten die Interferenz zwischen dem reflektierten Licht und einem Referenzstrahl, den Kreuzterm - das ist eine sehr empfindliche Art und Weise, eine Phasenverschiebung zu entdecken, irgendeine Änderung. Und wenn wir es über ein 100-Mikron-Netz senden, dann können wir Änderungen der Phasenverschiebung sehen. In diesem Toy-Experiment verwendeten wir Mikrowellenstrahlung in einem Maßstab von ein paar Zentimetern, und wir erhielten eine Auflösung von weit über 4.000. In derselben Abhandlung schlugen wir Folgendes vor: Übrigens kann man das auch im Infrarotbereich machen, da die Eindringtiefe der Metalle und alles andere das zulassen. In dieser Abhandlung von zweieinhalb Seiten wiesen wir also darauf hin - ja, Nahfeld im Infrarotbereich ist möglich, mit einer sehr guten räumlichen Auflösung. Das war 1989. Ich wandte mich wieder dem Einfangen und Kühlen von Atomen und der Atominterferometrie zu. Ted ging zurück zum Wasserstoff. Wir hätten berühmt werden können, aber... Wie auch immer. Nach meiner viereinhalbjährigen Auszeit in der Regierung kam ich zurück und sagte: Ich möchte mich mit Infrarotspektroskopie befassen. Als ich einen Vortrag am Lawrence Berkeley Lab hielt, erfuhr ich, dass sie tatsächlich wiederentdeckt worden war. Das ist ein Stück Silikon, anisotrop, die Kanten zu einer Pyramide geformt. Nicht alle Seiten, sondern nur zwei Seiten wurden mit Metall beschichtet. Wenn alle Seiten mit Metall beschichtet sind, wird es zu einem Wellenleiter. Mit zwei Metallseiten ist es eine Übertragungsleitung. Und da es eine Übertragungsleitung ist, kann man die elektromagnetische Strahlung in ein kleineres Volumen quetschen. Das ist die Berechnung davon. Hier auf der Spitze mit einer Breite von 40 nm sieht man das erweiterte elektromagnetische Feld. Das ist es, was wir vorhaben. Wir wollen Spitzen wie diese in Verbindung mit superauflösender sichtbarer Strahlung und Nahinfrarotstrahlung verwenden, wiederum direkt über der Zelle schwebend. Wir hoffen, mit dieser Technik eine Auflösung, eine chemische Auflösung im Bereich von zehn Nanometern zu erhalten. Das steht also auf dem Plan. Bleiben Sie dran; vielleicht kann ich in sechs Monaten oder in einem Jahr einige experimentelle Ergebnisse vorlegen. Jedenfalls aber ist das der Grund dafür, warum ich es Mikroskopie 2.0 nenne; man kann wirklich eine räumliche Auflösung von weit über 100 oder besser erhalten, nicht nur im sichtbaren Bereich und im Nahinfrarot, sondern auch in lebenden Zellen. Haben wir erst einmal eine Bildgebung von Millisekunden, ist die Bewegung in lebenden Zellen nicht mehr relevant. Diese Bewegung, durchschnittlich eine Sekunde oder Zehntelsekunden, verhindert eine echte Superauflösung. Ich schließe mit diesem Bild des Leeuwenhoek-Mikroskops. Ich darf Sie daran erinnern, dass das ein Mikroskop mit einem Objektiv war, doch das Zentrum dieses Objektivs ist eine kleine Glaskugel. Das ist das abschließende Fokuselement unseres Infrarotobjektivs. Es geht also zurück bis ins Jahr 1700; die Dinge ändern sich nicht wirklich. Optik ist immer noch Optik. Vielen Dank.

Steven Chu (2014)

You can see a lot by observing: Optical Microscopy 2.0

Steven Chu (2014)

You can see a lot by observing: Optical Microscopy 2.0

Abstract

Biological research and medicine were transformed by the invention and improvement of the optical microscope. Since the early 1990s, there has been another revolution in optical imaging, and manipulation of individual biological molecules and bio-molecular systems have been demonstrated and applied to a wide variety of systems. Most recently, innovations in “super-resolution” optical imaging, such as STORM and PALM have been used to construct biological images with ~ 10 nm resolution. With bright optical probes and corrections to the slight differences in sensitivity to the CCD or CMOS camera, < 1 nm resolution is possible in biological samples in water.[1] Recent applications of super-resolution imaging to cancer signaling[2], and bio-films[3] will be discussed.

Finally, the development of sub-wavelength micro-spectroscopy in the fingerprint region of the infrared spectra (wavelength = 4 – 12 µm) to observe changes in biological states with 20 nm spatial resolution will be outlined.

[1] Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements, Alexandros Pertsinidis, Yunxiang Zhang, Steven Chu, Nature 466 , 647–651 (2010).
[2] Ras-GTP Dimers Activate the Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) Pathway, Xiaolin Nan, Tanja Meyer-Tamgüney, Eric A. Collisson, Li-Jung Lin, Cameron Pitt, Jacqueline Galeas, Sophia Lewis, Joe W. Gray, Frank McCormick, Steven Chu, submitted (2014)
[3] Molecular Architecture and Assembly Principles of Vibrio cholerae Biofilms, Veysel Berk, Jiunn C. N. Fong, Graham T. Dempsey, Omer N. Develioglu, Xiaowei Zhuang, Jan Liphardt, Fitnat H. Yildiz, Steven Chu, Science 337, pp. 236-239 (2012)

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