Brian Kobilka (2014) - G Protein-Coupled Receptors: Challenges for Drug Discovery

G protein-coupled receptors (GPCRs) conduct the majority of cellular responses to hormones and neurotransmitters, and are therefore the largest group of pharmaceutical targets for a broad spectrum of diseases

I want to thank the Lindau organisation for inviting me. And I'll tell you that even after being in science for as many years as I have I still get nervous speaking in front of a bunch of Nobel laureates as well as students. So what I'd like to do is tell you a little bit about the area of research that we have been most interested in in the past couple of decades: That is understanding how G-protein coupled receptors work. And our major focus has really been on the mechanistic details of signalling across a lipid biolayer as shown here. But what I'd like to do today is tell you a little bit about what we've learnt from these studies that might be relevant to challenges for drug discovery. So first of all, what are G-protein coupled receptors? Well they are integral membrane proteins as shown down here. The cartoon below illustrates the state of the field when I joined the Lefkowitz Lab as a cardiology fellow in 1984. So we knew these were proteins that were in the membrane, we didn't know what they looked like. They activated heterotrimeric G-proteins which then led to the disassociation of the alpha from the beta-gamma subunit. And these became signalling-proteins until the alpha subunit hydrolysed GTP to GDP. We now know they are a large family, they are important for detecting hormones and neurotransmitters. And in fact most of the transmembrane signalling in the body is a result of G-protein coupled receptors. They are also responsible for the synthesis of sight, of action and some taste. There are over 800 members of the family in the human genome. And as a result they are the largest class of pharmaceutical targets for a broad variety of diseases. At the time I joined the Lefkowitz Lab there was just a handful of these receptors and now, as I said, there are approximately 800 members. And one expected that as a result of the advances in molecular biology and genome sequencing that we would have many more drugs that target GPCRs but the progress in drug discovery has been somewhat disappointing. And I'd like to talk a little bit about the challenges. But before I go on I became interested in the field through my interest in intensive care medicine. So I'm trained as a physician and during my training in internal medicine I really enjoyed rotating through intensive care units. And most of the drugs that we were giving patients in intensive care units were targeted at the autonomic nervous system shown here, the sympathetic and the parasympathetic system. So we would give drugs that interact with beta-receptors in the heart and the lung. We would also give drugs to interact with muscarinic acethylcholine receptors in the heart, and often giving pain medications including opioids that interact on opioid receptors. And all of these were G-protein coupled receptors. So when I had the opportunity to do some research, I was very interested in pursuing these and I joined the laboratory of Robert Lefkowitz who I shared the prize with in 2012. So why are G-protein coupled receptors challenging drug discovery targets? I'll go through these in more detail but first they have very complex signalling behaviour. It's much more complex than in this simple diagram shown below. The other is that many targets show high sequence immunology and as a result share common drug binding pockets. And finally there are subtle differences often in agonist and antagonist structures, making it difficult to identify a drug with the right properties. And what I'll do in the remaining part of the talk, I'll provide some insights from structural biology and some possible solutions that these insights provide. So first of all complex signalling behaviour. This was again the simple state of affairs when I joined the field: a single receptor could activate a single G-protein and then initiate downstream signalling events. However, in the 1990s we became aware that GPCRs are often coupled to more than one G-protein. And sometimes, like in the case of the beta-2 receptor, G-proteins seemed to be antagonistic to each other. It was also discovered that G-proteins undergo complex regulation following agonist-dependent phosphorylation by kinases. And interactions with proteins called arrestins which were at that time known to interfere with interactions with G-proteins. It then became known that arrestins were even more complicated proteins, that they were involved in removing the receptor from the plasma membrane into a vesicular compartment. And these internalised receptors have a variety of itineraries. They can be recycled back to the membrane or they can be degraded. And then most recently it turns out that arrestins are also signalling-proteins. In addition to being regulartory proteins they can be involved in activating a variety of kinases. And some of the signalling appears to actually occur from this intracellular compartment. And finally, to make matters even more complicated, receptors respond to drugs in very different ways. So there are drugs that are known as inverse agonists which suppress innate basal activity and there are drugs that are full agonists often the native hormones and neurotransmitters. And there are drugs that form a spectrum of functional behaviours, ranging between these 2 extremes. And what's interesting and probably important for drug discovery is that this profile may differ for the different signalling cascades. So for example a drug that might activate the G-protein pathway may inhibit the arrestin pathway. And this can be important because in some cases one pathway may provide therapeutic effects and another pathway may provide adverse effects. As an example the M-opioid receptor signals through Gi and this pathway is important for alleviating pain. Some of the adverse effects of the opioid receptors, however, are involved in activation of arrestin. So a drug that was selectively activating the Gi pathway and not arrestin pathway would be beneficial. The other problem with drug discovery is that many targets share high sequence and structural homology. To illustrate this point I'll show you the family tree. So these are the minor members of the GPCR family, the major family I'll show in the next slide. But you can see they are clustered into structurally similar families. As shown here, the glutamate receptor and secretin receptor families together with the adhesion and frizzled/tas2 receptor families that are less well understood. But the largest of the subfamilies includes the Rhodopsin subfamily, of which there are about 700 members. The majority are olfactory receptors, which is shown down here; the remaining 240 or so are probably drug targets. We've been most interested in this family, this quadrant, which includes receptors for adrenaline, so the adrenergic receptors, the muscarinic receptors, serotonin receptors. There are 13 serotonin, 5 muscarinic and 9 adrenergic and there are 5 dopamine receptors. What I want to point out is that receptors from the same subfamily often share identical binding pockets. So beta-1 and beta-2 have identical binding pockets. However, they are also very similar to the binding pockets shown here of some serotonin receptors and dopamine receptors. So in some cases an adrenergic receptor is more similar to say a dopamine receptor than it is to some other adrenergic receptor. Consequently, drugs that are targeted at an adrenergic receptor might activate or inhibit a serotonin or dopamine receptor and this is a source of side effects. So what insights can we get from structural biology? Well first of all it's necessary to be able to get protein structural information. And to really understand the process we want to get inactive states, shown in red. We want to get active states, shown in green. And we'd like to get this intermediate state which is agonist-bound but not coupled. And this turns out to be the most challenging, as shown by the wiggly box, because it's very dynamic. And I'll go into that in a few minutes. So how do we get structures? Well there are several ways of getting structures. It's possible to get structures by NMR and electro microscopy but the current state of the art is that for proteins the size of GPCRs the best method is crystallography. So as you've heard one tries to prepare protein so that its highly uniform, you can form crystals and crystals are then placed in an X-ray beam. The diffraction pattern can be used to calculate the structure of the protein. However, as hard as we tried and even though we were able to make a very pure protein, we were not able to grow crystals of the wild-type unmodified receptor. So we had some insights into why this might be from other studies we were doing at the same time in the lab. And these include spectroscopy studies such as fluorescent spectroscopy, EPR and NMR experiments. That told us that the receptor was highly dynamic, as illustrated in this long-timescale molecular dynamic simulation. And this dynamic character meant that although the protein was purer, that structurally it was heterogeneous and as a result didn't form good crystals. So we learnt for example that one of these transmembrane, transmembrane 6, undergoes the largest structural changes and is very flexible and dynamic. We also had evidence that the protein didn't simply undergo a two-stage transition from inactive to active, but that there were intermediate states and that different drugs could stabilise different confirmations. Most important for the active state is that we found agonists alone are not capable of stabilising a fully active confirmation. So based on these experiments we came up with the following model. Well actually this, the model I show above was the model that we had perhaps when I started my work in the field: That simply it was a two-stage system; in the inactive state the cytoplasmic region was closed and incapable of interacting with the G-protein; agonist binding would open up the state, the cytoplasmic domain and then G-protein could engage. But the experiments I just told you about pretty much ruled out this model. And we used this cartoon to, we believe, more accurately describe what's going on. That the receptor exists in an ensemble of confirmations, even in the absence of drugs. That rarely it can enter into an active state and this is responsible for basal activity. The receptor when bound to agonist actually becomes structurally even more heterogeneous. This is the most difficult structure to obtain, because there are so many different substates and intermediate states. And to really fully stabilise an active confirmation you need to stabilise it with either a G-protein or some similar protein. So why is the protein behaving like this, why is this flexibility in dynamic character? Well, we think it has to do with the fact that the beta-2 receptor is a fairly versatile signalling-protein. That it cannot only couple the G-proteins, it interacts with kinases in an agonist dependent manner, and it interacts with arrestins. And these are all likely to be subtly different structures that are found in this ensemble. So our first challenge was to get an inactive state structure and again this is challenging because it's dynamic. So very briefly we were able to overcome this challenge with two different approaches. One was to use antibodies that recognised this flexible domain, bound in stabiliser that then provided polar surface for crystal lattice context. The other approach was to use protein engineering, inserting a well-behaved protein T4 lysozyme, in between these 2 dynamic components. And these gave us our first inactive state structures. So the next challenge was to get active states. And again this was the most difficult and we really still haven't succeeded in capturing this state or states. And in fact this is best studied using non-crystallographic methods such as NMR and EPR spectroscopy - and I don't have time to talk about the studies. If you are interested this afternoon we can talk about those. So what we've done is to try to stabilise active states with either G-proteins, other signalling-proteins or momatics. And in doing so we've been able to get a spectrum of states from fully inactive to the active state, a receptor activating a G-protein, including some interesting intermediates including an agonist bound inactive state and a partial agonist state. And some of these states were stabilised not by G-proteins but by a special kind of antibodies that are called nanobodies. And these are obtained from camelids. Camelids, alpakas, llamas unlike you and I where we have heavy and light chains, camelids have single heavy chains. And their variable domain is called an antibody. And these have been extremely useful in this work. Particularly getting this interesting structure, which I'll talk about later, bound to a partial agonist; that is particularly interesting because it is an extremely selective compound. Now we've also used these methods to obtain structures of a number of other families, including muscarinic, opioid and protease activator receptors. And in fact most of the crystal structures that have been obtained today have used this fusion protein strategy with either T4 lysozyme or other proteins. In the remaining part of my talk I'm going to focus on 2 model systems: the beta-2 receptor inactive to active states and the muscarinic receptor also inactive and active states. So briefly what have we learnt about the process of activation? Here is receptor in complex with the G-protein. What I'd like to emphasise is that in the process of activation a very small molecule, adrenaline, interacts with the receptor. The subsequent changes in the protein are extremely small. They are amplified from about 2 angstroms to about 13 angstroms across the membrane and then more dramatically amplified in the G-protein. So here is illustration of the changes that occur in the beta receptor. The grey is the inactive and the green is the active. And as you'll see in more detail, this is a very small structural change in the binding pocket leading to a larger change in the cytoplasmic domains. And to appreciate the structural changes in a bit more detail, we are going to look at the protein sliced through the middle and in a surface view in which you'll see - this is the inactive and the active state. And then we are going to remove the ligand and simply toggle back and forth. Again you'll see, rather modest changes in the binding pocket lead to very large changes that open up the cytoplasmic surface so that it can engage the G-protein. And then finally here's what happens to the G-protein. So this is the receptor docked into what we believe would be the inactive state of Gs, consisting of alpha subunit with 2 domains, RAS-like domain and alpha helical domain, and the beta and gamma subunits. Now if we toggle back and forth between the active and inactive states, you'll see a fairly large change in this alpha5 helix that penetrates into the core of the receptor, so that's... So this summarises the major changes: alpha5 helix and alpha helical domain. And what's really interesting is again it's a very small change: So what kinds of insights have we obtained? First of all just trying to develop different types of drugs for the beta-2 receptor has been challenging because there are very subtle differences between agonist and antagonist binding. So in this slide I show the beta-2 binding pocket in the inactive state, in the active state, and partial agonist bound state. What I'm going to do next is to take away the ligand and rotate this and what you'll see is these are all the amino acids that are important for ligand binding. And if you look at each of these amino acids they are almost in identical positions between fully inactive and fully active states, indicating how subtle the conformational changes are. We can also do this by looking at the ligands. So now we'll remove the receptor and overlay the ligands. So we have 3 ligands here, an inverse agonist, a partial agonist, adrenaline and now we have a super agonist. You can see these ligands which span the spectrum from extremely potent agonists to extremely potent inverse agonists reside in almost the same binding space. So this means for understanding the process of activation you really need detailed structures of both inactive and active states. In the remaining 10 minutes or so I'd like to talk about some insights that we have gained that actually might lead to the more efficient development of selective drugs. So as I mentioned earlier many targets share high sequence and structural homology. Now possible solutions include bitopic drugs and allosteric drugs. So firstly I'm going to talk about bitopic drugs. Before I do that, though, I want to again review why it's difficult to get highly selective drugs. So for example if you are in the intensive care unit, if you are treating patients with lung disease you want to give them a beta-2 receptor agonist. If you are treating patients with heart disease you often want to give them an antagonist for the beta-1. However, it's very difficult to make selective drugs so giving a patient a beta-2 agonist may stimulate beta-1 receptors in the heart and conversely. So as shown the binding pockets for adrenaline are identical. Similar problems occur with muscarinic receptors, targeting the M2 receptor in the heart can lead to adverse effects through M1, 3, 4 and 5 that have identical binding pockets. We had one example of a highly selective ligand. So we really were interested in understanding how this bound and why it was selective. This is a drug called Salmeterol. It's been used to treat asthma. And I'm going to show this drug - so it's a partial agonist - compared with another asthma drug called Salbutamol. These drugs are identical in the basic orthosteric. This is the component that binds to the orthosteric pocket. But you can see they differ in that Salmeterol has a long chain, this affords roughly a hundredfold increase in selectivity for beta-2 over beta-1, and about a thousandfold increase in affinity. Now this is the binding pocket for adrenaline. And now we compare that with the binding of Salmeterol. So if we overlay them you'll see this would be the orthosteric pocket and then Salmeterol extends outside of the orthosteric pocket and we believe this is the reason for the selectivity. And to illustrate this: in this slide what we show is the beta receptor when viewed from on top and on the side. And it's colour-coded to show where beta-1 and beta-2 are identical, their colour is blue; where they differ the colour is yellow, and the red is the nonselective antagonist. So you can see there's a lot of differences between beta-1 and beta-2 on the outside. This would be the region that interacts with the membrane. However, if we split the receptor open and look at the inside the region extending from the binding pocket to the G-protein interface is identical. There are no differences. And for this region the binding environment for the 2 are almost identical. So again this summarises the binding for a non-selective drug, Carazolol, and for Salmeterol, this highly selective drug. What happens is it's bitopic, it extends from one site, the orthosteric pocket, out into this extra cellular vestibule and it samples the structural diversity. So this explains why Salmeterol is very selective. Now what about muscarinic receptors? In the case of the beta-2 receptor we can make bitopic drugs, because the orthosteric pocket is fairly open and one can add chemistry to extend a variety of different positions of this orthosteric ligand into the more diverse extracellular vestibule. And that's also true for the active state. In contrast, muscarinic receptors have more limited access from the binding pocket to the extracellular vestibule which is also more diverse. So there's only a small acquiesced pour from the vestibule to the antagonist binding pocket. And you can see in the active state the orthosteric pocket is completely closed over. And there is no acquiesce channel. So these aren't...it's more difficult to develop bitopic drugs for a muscarinic receptor. However, the muscarinic receptor has been a very good model system for drugs we call allosteric ligands - another solution to high sequence homology. So what are allosteric ligands? Here's a cartoon which illustrates how allosteric ligands may work. So the orthosteric binding pocket is shown here. Allosteric drugs can literally bind any place other than this pocket. And in doing so they may have several effects: They could affect the affinity of the orthosteric compound; they could affect the ability of the orthosteric compound to signal through the receptor; or they could be agonist or antagonist on their own, independently. And these produce a number of different responses as shown in this dose response curve. So we wanted to see what allosteric drugs...how they worked and what they might look like. This is an example of comparison between M2 and M3, again both muscarinic receptors. In the orthosteric pocket they are identical. The yellow indicates where they differ in the extracellular vestibule and also known as the allosteric pocket for the muscarinic receptor. We obtained a highly selective activating allosteric modulator or positive allosteric modulator for the M2 receptor. And these studies just show that it enhances the binding affinity for agonist and enhances the ability of agonist to activate the G-protein. So where does it bind? Well first here's the inactive state, again with this very closed binding pocket. And this is the extracellular vestibule or allosteric pocket. In the active state you can see the pocket dramatically changes and closes over. And now in the presence of the modulator there are small additional changes and the modulator sits right on top of the agonist preventing it from disassociating. And in doing so this modulator shown in green prevents the agonist from disassociating and also stabilises the active confirmation. So this is a great solution for muscarinic receptors, and a number of very selective allosteric modulators have been identified. However, there are currently no allosteric modulators for the beta-2 adrenergic receptor. And we are interested in understanding whether this principle could be applied to other GPCRs including the beta-2 receptor. So again we showed the binding pocket of the inactive state, the active state bound to adrenaline and a partially active state bound to this highly selective drug. And we wanted to define this extracellular site as the potential allosteric site. So can we develop allosteric drugs to beta-2 receptor? So here's the way the experiment went. And I should say that this is a work in progress. So I'm going to provide some potentially positive early results that we hope will continue to be positive. So here's the receptor as it appears from the outside. And we are going to remove transmembranes 6 and 7 so that we can better see the binding pocket. So this is the Salmeterol binding pocket and if we now remove Salmeterol and add Epinephrin, you can see this would be the orthosteric pocket. So this is the adrenaline binding to the orthosteric pocket. And we define the allosteric docking site as the difference, that part of Salmeterol that extends past the orthosteric pocket. Okay, now using this as a defined pocket our colleagues, Brian Shoichet and his group used computational screening to go through roughly five million compounds to try to find things that might fit this pocket. From roughly several hundred compounds they selected 26 by visual inspection and then we did some binding experiments and found some interesting compounds. Ultimately we were able to get a preliminary structure that I'll show you in a minute. And our goal is to next optimise the chemistry. So of these 26 I show you results from roughly 12 of these. And this experiment is designed to identify both positive modulators and negative modulators. So we start with giving the cells, sorry giving this assay which is a receptor G-protein activation assay and this measures G-protein activation, a half maximal dose of noradrenaline. And then on top of that we add saturating amounts of these compounds. And you can see most of the compounds have no affect but there's one compound that is an inhibitor and one compound that's a potentiator. And we call these BRAC 1 and BRAC 11. Using binding studies we can show that the binding to the orthosteric pocket, this is an antagonist that binds to the orthosteric pocket, is not affected; either the off-rate or the equilibrium binding affinity is not altered by the presence of these compounds, meaning that they are not competing for the orthosteric pocket. So they are clearly allosteric. And we can even show that for BRAC. BRAC1 has no effect on agonist affinity. So this is again a competition curve to compare the effect of these allosteric modulators on the affinity of Norepinephrin. There's no effect of this BRAC11, however, BRAC1 which is a negative modulator shifts the affinity to the right, reducing it by about fourfold. So what kind of modulator have we identified in BRAC1? It appears to be a compound that reduces affinity for the orthosteric agonist, and by itself has some direct affects; so it's a complex allosteric modulator. Now the next question is, did we actually get the drug targeted that we thought we would? So here is the allosteric pocket. And recently Xiangyu Liu in our lab in Tshinghua was able to get a structure of a receptor bound to this BRAC1. So here's the pocket. And in fact BRAC1 does bind in the pocket and in fact it's possible to show that the binding pocket for BRAC1 here, this very small molecule, does not overlap the binding pocket for adrenaline. And we've also learnt from this structure some subtle details of why it might in fact be a negative modulator for adrenaline. So I'm going to conclude here with this slide to illustrate that we are just beginning to understand how these proteins work. We have been focusing a lot on receptor G-protein interactions but we need to also understand how receptors interact with other G-proteins, other signalling-proteins such as arrestins and kinases. As interesting as detailed crystal structures are, the protein is a highly dynamic protein and its character, this dynamic character, which I think is responsible for its interesting signalling behaviour. So in addition to crystallography it will be important for us to continue to explore other methods such as NMR, nEPR and fluorescent spectroscopy to understand the dynamic character. So I thank you for your attention and I will just acknowledge fantastic group of colleagues. My wife Tong Sun has been working with me for many years and shown here, I just want to point out Xiangyu Liu who got this recent structure. These individuals all contributed to the work I presented and I also want to acknowledge Bill Weis who is a long-standing colleague and collaborator in crystallography. So thank you for your attention.

Ich möchte der Lindau-Organisation danken, dass sie mich eingeladen hat. Obwohl ich so viele Jahre in der Wissenschaft verbracht habe, werde ich immer noch nervös, wenn ich vor einer Versammlung von Nobelpreisträgern und auch Studenten spreche. Ich möchte Ihnen gern ein bisschen über das Forschungsgebiet erzählen, das uns in den letzten paar Jahrzehnten am meisten interessiert hat: zu verstehen, wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren funktionieren. Unser Forschungsschwerpunkt lag tatsächlich auf den mechanistischen Details der Signaltransduktion über eine Doppellipidschicht hinweg, wie hier gezeigt. Heute möchte ich Ihnen jedoch etwas darüber erzählen, was wir aus diesen Studien gelernt haben und was von Bedeutung für die Herausforderungen bei der Entdeckung von Arzneimittelwirkstoffen sein könnte. Erstens: Was sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren? Nun, wie hier dargestellt, handelt es sich bei ihnen um in eine Membran integrierte Proteine. Der Cartoon unten veranschaulicht den Zustand des Forschungsgebiets, als ich 1984 als Kardiologie-Fellow in das Lefkowitz-Labor kam. Wir wussten also, dass es sich um Proteine handelte, die sich in der Membran befinden, aber wir wussten nicht, wie sie aussahen. Sie aktivierten heterotrimere G-Proteine, was dann zur Trennung der Alpha- von der Beta-Gamma-Untereinheit führte. Und diese wurden zu Signalproteinen, bis die Alpha-Untereinheit GTP zu GDP hydrolysierte. Wir wissen jetzt, dass sie eine große Familie darstellen und eine wichtige Rolle bei der Erkennung von Hormonen und Neurotransmittern spielen. Tatsächlich ist ein Großteil der transmembranen Signaltransduktion im Körper das Ergebnis von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Außerdem sind sie für die Synthese von Sehen, Handeln und zum Teil auch Schmecken verantwortlich. Im menschlichen Genom gibt es mehr als 800 Mitglieder der Familie. Daher sind sie die zahlenmäßig größte Klasse pharmazeutischer Targets bei einer Vielzahl verschiedener Krankheiten. Als ich in das Lefkowitz-Labor kam, gab es nur eine Handvoll dieser Rezeptoren, und nun sind es, wie ich sagte, ungefähr 800 Mitglieder. Und man erwartete, dass wir infolge der Fortschritte auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der Genomsequenzierung sehr viel mehr Arzneimittelwirkstoffe haben würden, welche auf GPCRs als Targets abzielen, doch der Fortschritt bei der Entdeckung von Arzneimittelwirkstoffen war eher enttäuschend. Und ich möchte gerne ein bisschen über die Herausforderungen berichten. Bevor ich jedoch fortfahre: Ich begann, mich aufgrund meines Interesses für Intensivmedizin für dieses Gebiet zu interessieren. Ich absolvierte eine Ausbildung als Arzt und während meiner Ausbildung in der Inneren Medizin gefiel es mir sehr, zwischen den verschiedenen Intensivstationen zu wechseln. Die meisten Medikamente, die wir Patienten auf Intensivstationen gaben, zielten auf das hier dargestellte autonome Nervensystem ab, das sympathische und das parasympathische System. Wir verabreichten also Medikamente, die mit den Beta-Rezeptoren in Herz und Lunge interagieren. Wir gaben ihnen auch Medikamente, die mit den muskarinischen Acetylcholinrezeptoren im Herz interagieren, und oft Schmerzmittel, einschließlich Opioide, die mit Opioid-Rezeptoren interagieren. All diese waren G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Als ich die Gelegenheit hatte, Forschung zu betreiben, war ich sehr daran interessiert, diese Fragestellungen zu verfolgen, und ich kam in das Labor von Robert Lefkowitz, mit dem ich mir 2012 den Preis teilte. Warum also sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren herausfordernde Targets bei der Entdeckung von Arzneimittelwirkstoffen? Ich werde darauf noch detaillierter eingehen, aber zunächst haben sie ein sehr komplexes Signaltransduktionsverhalten. Es ist sehr viel komplexer als in diesem einfachen Schaubild hier unten dargestellt. Das andere ist, dass viele Targets eine hohe Sequenzhomologie aufweisen und folglich über gemeinsame Bindungstaschen für Arzneimittelwirkstoffe verfügen. Und schließlich gibt es oft subtile Unterschiede bei den Agonisten- und Antagonisten-Strukturen. Dies erschwert die Identifikation eines Arzneimittelwirkstoffs mit den richtigen Eigenschaften. Im verbleibenden Teil des Vortrags werde ich einige Erkenntnisse aus der Strukturbiologie sowie einige mögliche Lösungen darstellen, welche diese Erkenntnisse bieten. Zunächst also - komplexes Signaltransduktionsverhalten. Dies wiederum war der einfache Stand der Dinge, als ich mich auf dieses Forschungsgebiet begab: Ein einzelner Rezeptor konnte ein einzelnes G-Protein aktivieren und dann nachgelagerte Signaltransduktions-Ereignisse initiieren. Allerdings stellten wir in den 1990er Jahren fest, das GPCRs häufig an mehr als ein G-Protein gekoppelt sind. Und manchmal, zum Beispiel im Fall des Beta-2-Rezeptors, schienen die G-Proteine antagonistisch zueinander zu sein. Man fand zudem heraus, dass G-Proteine eine komplexe Regulierung durchmachen, die auf die Agonisten-abhängige Phosphorylierung durch Kinasen folgt. Und Interaktionen mit Proteinen, welche als Arrestine bezeichnet werden und von denen man zu der Zeit wusste, dass sie in die Interaktionen mit den G-Proteinen eingreifen. Dann stellte sich heraus, dass Arrestine sogar noch komplexere Proteine waren und dass sie daran beteiligt waren, den Rezeptor von der Plasmamembran zu entfernen und in ein vesikuläres Kompartment zu bringen. Diese internalisierten Rezeptoren haben eine Vielzahl von Routen. Sie können wieder in die Membran recycelt oder abgebaut werden. Zuletzt stellt sich heraus, dass Arrestine ebenfalls Signalproteine sind. Sie sind Regulatorproteine und können darüber hinaus an der Aktivierung verschiedener Kinasen beteiligt sein. Tatsächlich scheint sich die Signaltransduktion teilweise von diesem intrazellulären Kompartment aus zu ereignen. Um die Dinge noch komplizierter zu machen, reagieren Rezeptoren auf sehr unterschiedliche Art und Weise auf Arzneimittelwirkstoffe. Es gibt Arzneimittelwirkstoffe, die als inverse Agonisten bezeichnet werden, die die angeborene Grundaktivität unterdrücken, und Arzneimittelwirkstoffe, die vollständige Agonisten sind - häufig die natürlichen Hormone und Neurotransmitter. Und es gibt Arzneimittelwirkstoffe, die ein Spektrum funktionaler Verhaltensweisen belegen, das sich zwischen diesen beiden Extremen bewegt. Was nun interessant und wahrscheinlich für die Entdeckung von Arzneimittelwirkstoffen von Bedeutung ist, ist die Tatsache, dass sich dieses Profil für die verschiedenen Signalkaskaden unterscheiden kann. Beispielsweise könnte ein Arzneimittelwirkstoff, der den G-Protein-Signalweg aktivieren könnte, den Arrestin-Signalweg hemmen. Dies kann von Bedeutung sein, weil in manchen Fällen der eine Signalweg therapeutische Effekte und ein anderer Signalweg nachteilige Auswirkungen liefern kann. Beispielsweise überträgt der M-Opioid-Rezeptor Signale durch Gi und dieser Signalweg ist wichtig für die Linderung von Schmerzen. Jedoch sind einige der nachteiligen Auswirkungen der Opioid-Rezeptoren mit der Aktivierung von Arrestin verbunden. Ein Arzneimittelwirkstoff, der selektiv den Gi-Signalweg und nicht den Arrestin-Signalweg aktiviert, wäre also hilfreich. Das andere Problem bei der Entdeckung von Arzneimittelwirkstoffen besteht darin, dass viele Targets eine hohe Sequenz- und Strukturhomologie teilen. Um dies zu veranschaulichen, werde ich Ihnen den Stammbaum zeigen. Diese sind die weniger wichtigen Mitglieder der GPCR-Familie - die Hauptfamilie werde ich Ihnen auf der nächsten Folie zeigen. Sie können erkennen, dass sie zu strukturell ähnlichen Familien gruppiert sind - wie hier dargestellt: die Glutamat-Rezeptor- und die Sekretin-Rezeptor-Familien zusammen mit den Adhäsions- und den Frizzled-/TAS2-Rezeptor-Familien, die man weniger gut versteht. Die größte der Unterfamilien umfasst die Rhodopsin-Unterfamilie, die ungefähr 700 Mitglieder hat. Die Mehrheit besteht, wie hier unten dargestellt, aus olfaktorischen Rezeptoren. Die übrigen 240 oder so sind möglicherweise Targets für Arzneimittelwirkstoffe. Wir interessieren uns für diese Familie, diesen Quadranten. Dazu gehören die Rezeptoren für Adrenalin, Adrenorezeptoren, Muskarin-Rezeptoren, Serotonin-Rezeptoren. Es gibt 13 Serotonin-, 5 Muskarin- und 9 Adrenorezeptoren und es gibt 5 Dopamin-Rezeptoren. Ich möchte darauf hinweisen, dass Rezeptoren aus derselben Unterfamilie häufig identische Bindungstaschen haben. Beta-1 und Beta-2 haben identische Bindungstaschen. Jedoch sind sie auch den hier dargestellten Bindungstaschen einiger Serotonin- und Dopamin-Rezeptoren sehr ähnlich. In manchen Fällen ist ein Adrenorezeptor einem, sagen wir, Dopamin-Rezeptor ähnlicher ist als einem anderen Adrenorezeptor. Somit könnten Arzneimittelwirkstoffe, die auf einen Adrenorezeptor abzielen, einen Serotonin- oder Dopamin-Rezeptor aktivieren oder hemmen, und dies ist eine Quelle von Nebenwirkungen. Welche Erkenntnisse kann uns also der Strukturbiologie liefern? Als erstes ist es wichtig, Proteinstruktur-Informationen zu bekommen. Um den Prozess wirklich zu verstehen, möchten wir inaktive Zustände bekommen, dargestellt in Rot. Wir möchten aktive Zustände bekommen, dargestellt in Grün. Und wir möchten gern diesen Zwischenzustand bekommen, der Agonisten-gebunden, aber nicht -gekoppelt ist. Dies erweist sich als die größte Herausforderung, wie anhand des verwackelten Kastens dargestellt, denn er ist sehr dynamisch. Darauf werde ich in ein paar Minuten eingehen. Wie kommen wir also an die Strukturen? Nun, es gibt verschiedene Möglichkeiten, Strukturen aufzuklären. Es ist möglich, mithilfe von Kernspinresonanzspektroskopie und Elektronenmikroskopie Strukturen aufzudecken, aber der aktuelle Stand der Technik besagt, dass für Proteine von der Größe von GPCRs die Kristallographie die beste Methode ist. Wie Sie gehört haben, versucht man, das Protein so zu präparieren, dass es in hohem Maße gleichförmig ist. Dann kann man Kristalle formen und diese Kristalle werden dann in einen Röntgenstrahl platziert. Das Beugungsmuster kann dazu verwendet werden, um die Struktur des Proteins zu berechnen. Jedoch gelang es uns nicht - egal, wie hartnäckig wir es versuchten und obwohl wir ein sehr reines Protein herstellen konnten -, Kristalle dieses unmodifizierten Wildtyp-Rezeptors zu gewinnen. Und wir gewannen wir einige Erkenntnisse, warum dies so sein könnte von anderen Untersuchungen, die wir zur selben Zeit im Labor durchführten. Zu diesen Untersuchungen gehörten spektroskopische Untersuchungen wie Fluoreszenzspektroskopie-, Elektronenspinresonanz- und Kernspinresonanzspektroskopie-Experimente. Sie sagten uns, dass der Rezeptor höchst dynamisch war, wie diese molekular-dynamische Langzeit-Simulation veranschaulicht. Und dieser dynamische Charakter bedeutete, dass das Protein, obwohl reiner, strukturell heterogen war und infolgedessen keine guten Kristalle bildete. Wir erfuhren zum Beispiel, dass eine dieser Transmembranen, die Transmembran 6, die größten strukturellen Veränderungen durchmacht und sehr flexibel und dynamisch ist. Außerdem hatten wir Hinweise darauf, dass das Protein nicht einfach einen zweistufigen Übergang von inaktiv zu aktiv durchläuft, sondern dass es Zwischenzustände gab und dass unterschiedliche Arzneimittelwirkstoffe unterschiedliche Konformationen stabilisieren. In Hinblick auf den aktiven Zustand ist am wichtigsten, dass wir feststellten, dass Agonisten alleine nicht in der Lage sind, eine voll aktive Konformation zu stabilisieren. Auf der Grundlage dieser Experimente entwickelten wir das folgende Modell. Nun, tatsächlich dieses Modell, das Modell, das ich oben zeige, war das Modell, das wir vielleicht hatten, als ich meine Forschungsarbeit auf diesem Gebiet begann: dass es sich einfach um ein zweistufiges System handelte; dass die zytoplasmatische Region im inaktiven Zustand geschlossen war und nicht mit dem G-Protein interagieren konnte; dass die Bindung an den Agonisten den Zustand, die zytoplasmatische Domäne, öffnete und dass das G-Protein dann eingreifen konnte. Die Experimente, von denen ich Ihnen soeben berichtet habe, schlossen dieses Modell jedoch ziemlich eindeutig aus. Und wir verwendeten diesen Cartoon, um, wie wir glauben, präziser zu beschreiben, was passiert: dass der Rezeptor in einer Gesamtheit von Konformationen existiert, selbst dann, wenn keine Arzneimittelwirkstoffe einwirken; dass er nur sehr selten in einen aktiven Zustand übergehen kann und dass dies für die Grundaktivität verantwortlich ist. Wenn der Rezeptor an den Agonisten gebunden ist, wird er strukturell sogar noch heterogener. Diese Struktur aufzuklären, ist am schwierigsten, denn es gibt so viele verschiedene untergeordnete Zustände und Zwischenzustände. Und um eine aktive Konformation wirklich vollständig zu stabilisieren, müssen Sie diese entweder mit einem G-Protein oder einem ähnlichen Protein stabilisieren. Warum also verhält sich das Protein auf diese Art und Weise, warum gibt es diese Flexibilität von dynamischem Charakter? Wir denken, dass es mit dem Umstand zu tun hat, dass der Beta-2-Rezeptor ein ziemlich wandlungsfähiges Signalprotein ist und dass er nicht nur die G-Proteine koppeln, sondern auf eine Agonisten-abhängige Art und Weise auch mit Kinasen interagieren kann, und dass er mit Arrestinen interagiert. Und dies sind wahrscheinliche alle Strukturen mit leichten Unterschieden, die in dieser Gesamtheit vorzufinden sind. Unsere erste Herausforderung bestand also darin, die Struktur eines inaktiven Zustands aufzuklären, und dies ist wiederum deshalb herausfordernd, weil er dynamisch ist. Sehr kurz gesagt, gelang es uns, diese Herausforderung mithilfe zweier verschiedener Ansätze zu bewältigen. Zum einen verwendeten wir Antikörper, die diese flexible Domäne erkannten, sich an sie banden und sie stabilisierten und dann eine polare Oberfläche für einen Kristallgitter-Kontext bereitstellten. Zum anderen bedienten wir uns des Protein-Engineerings und fügten ein wohlerzogenes T4-Lysozym zwischen diesen beiden dynamischen Komponenten ein. Und dies verhalf uns zu unseren ersten Strukturen des inaktiven Zustands. Die nächste Herausforderung lag darin, aktive Zustände zu bekommen. Dies wiederum war das Schwierigste, und es ist uns noch nicht wirklich gelungen, diesen Zustand oder diese Zustände zu erfassen. In der Tat untersucht man dies am besten mithilfe nicht-kristallographischer Methoden, wie der Kernspinresonanzspektroskopie und der Elektronenspinresonanzspektroskopie, - und ich habe nicht die Zeit, über diese Untersuchungen zu sprechen. Wenn es Sie interessiert, können wir uns heute Nachmittag darüber unterhalten. Was wir taten, war also, dass wir versuchten, aktive Zustände entweder mit G-Proteinen, anderen Signalproteinen oder aromatischen Verbindungen zu stabilisieren. Und damit gelang es uns, ein Spektrum von Zuständen vom vollständig inaktiven bis zum aktiven Zustand zu bekommen, bei dem ein Rezeptor ein G-Protein aktiviert, einschließlich einiger interessanter Zwischenzustände, darunter ein Agonisten-gebundener inaktiver Zustand und ein partiell agonistischer Zustand. Einige von diesen Zuständen wurden nicht von G-Proteinen stabilisiert, sondern von einer bestimmten Art von Antikörpern, die als Nanokörper bezeichnet werden. Diese werden aus kamelartigen Tieren gewonnen. Kamele, Alpakas, Lamas. Im Gegensatz zu Ihnen und mir, besitzen kamelartige Tiere einzelne schwere Ketten, wo wir schwere und leichte Ketten haben. Und ihre variable Domäne wird als Nanokörper bezeichnet. Diese waren für unsere Arbeit ausgesprochen hilfreich. Insbesondere dabei, diese interessante Struktur zu bekommen, zu der ich Ihnen später etwas sagen werde, die an einen partiellen Agonisten gebunden ist; das ist besonders interessant, weil es sich um eine äußerst selektive Verbindung handelt. Wir haben diese Methoden auch verwendet, um Strukturen einer Reihe anderer Familien zu bekommen, einschließlich der Muskarin-, Opioid- und Protease-Aktivator-Rezeptoren. Tatsächlich wurde für die meisten Kristallstrukturen, die heute gewonnen wurden, diese Fusions-Protein-Strategie mit entweder T4-Lysozymen oder anderen Proteinen verwendet. Während des verbleibenden Teil meines Vortrags werde ich mich auf zwei Modell-Systeme konzentrieren: auf den Beta-2-Rezeptor und die inaktiven bis aktiven Zustände und auf den Muskarin-Rezeptor und hier ebenfalls auf die inaktiven bis aktiven Zustände. Was also haben wir, kurz zusammengefasst, über den Prozess der Aktivierung gelernt? Hier haben wir einen Rezeptor in einem Komplex mit dem G-Protein. Worauf ich hinweisen möchte: Während des Prozesses der Aktivierung interagiert ein sehr kleines Molekül, Adrenalin, mit dem Rezeptor. Die darauf folgenden Veränderungen in dem Protein sind äußerst klein. Sie werden von ungefähr 2 Angström zu ungefähr 13 Angström über die Membran hinaus vergrößert und dann in dem G-Protein sehr viel stärker vergrößert. Hier ist eine bildliche Darstellung der Veränderungen, die in dem Beta-Rezeptor stattfinden. Das Graue ist der inaktive und das Grüne ist der aktive Zustand. Und wie Sie noch genauer sehen werden, ist dies eine sehr kleine strukturelle Veränderung in der Bindungstasche, die zu einer größeren Veränderung in den zytoplasmatischen Domänen führt. Um die strukturellen Veränderungen etwas detaillierter einschätzen zu können, werden wir uns das Protein mittig aufgespalten und in einer Oberflächenansicht ansehen, bei der Sie erkennen werden, dass dies der inaktive und dies der aktive Zustand ist. Und dann werden wir den Liganden entfernen und einfach hin und her wechseln. Wieder werden Sie sehen, dass recht bescheidene Änderungen in der Bindungstasche zu sehr großen Veränderungen führen, welche die zytoplasmatische Oberfläche öffnen, sodass es mit dem G-Protein interagieren kann. Hier ist nun schließlich das, was mit dem G-Protein passiert. Dies ist der Rezeptor, der an das angedockt ist, was wir für den inaktiven Zustand von Gs halten und was aus einer Alpha-Untereinheit mit zwei Domänen, einer RAS-ähnlichen Domäne und einer Alpha-Helix-Domäne, und den Beta- und Gamma-Untereinheiten besteht. Wenn wir zwischen den aktiven und den inaktiven Zuständen hin und her wechseln, werden Sie eine ziemlich große Veränderung in dieser Alpha-5-Helix sehen, die in den Kern des Rezeptors eindringt, sodass ... Damit sind die hauptsächlichen Veränderungen zusammengefasst: Alpha-5-Helix und Alpha-Helix-Domäne. Wirklich interessant ist, dass es wieder eine sehr kleine Veränderung ist: Welche Erkenntnisse haben wir gewonnen? Als erstes war es herausfordernd, einfach zu versuchen, verschiedene Arten von Arzneimittelwirkstoffen für den Beta-2-Rezeptor zu entwickeln, denn es gibt sehr subtile Unterschiede zwischen agonistischer und antagonistischer Bindung. Auf dieser Folie zeige ich die Beta-2-Bindungstasche im inaktiven Zustand, im aktiven Zustand und im partiell Agonisten-gebundenen Zustand. Als nächstes werde ich den Liganden wegnehmen und dies rotieren, und was Sie sehen werden, ist, dass diese all die Aminosäuren sind, die für die Ligandenbindung wichtig sind. Und wenn Sie sich jede einzelne dieser Aminosäuren anschauen, befinden sie sich in nahezu identischen Positionen zwischen vollständig inaktiven und vollständig aktiven Zuständen, was darauf hinweist, wie subtil die konformationalen Veränderungen sind. Wir können dies auch tun, indem wir uns die Liganden ansehen. Wir werden also jetzt den Rezeptor entfernen und die Liganden darüberlegen. Wir haben 3 Liganden hier, einen inversen Agonisten, einen partiellen Agonisten, Adrenalin, und einen Super-Agonisten. Sie können sehen, dass diese Liganden, die das Spektrum von äußerst mächtigen Agonisten bis zu äußerst mächtigen inversen Agonisten abdecken, sich in nahezu demselben Bindungsraum befinden. Das bedeutet, dass Sie für das Verständnis des Prozesses der Aktivierung wirklich detaillierte Strukturen sowohl der inaktiven als auch der aktiven Zustände benötigen. In den verbleibenden zehn Minuten möchte ich gerne von einigen Erkenntnissen berichten, die wir gewonnen haben und die tatsächlich zur effizienteren Entwicklung selektiver Arzneimittelwirkstoffe führen könnten. Wie ich vorher erwähnte, teilen viele Targets eine hohe Sequenz- und Strukturhomologie. Zu den möglichen Lösungen gehören bitopische Arzneimittelwirkstoffe und allosterische Arzneimittelwirkstoffe. Als erstes werde ich über bitopische Arzneimittelwirkstoffe sprechen. Bevor ich das tue, möchte ich jedoch noch einmal darüber nachdenken, warum es schwierig ist, hoch selektive Arzneimittelwirkstoffe zu bekommen. Wenn Sie auf der Intensivstation Patienten mit Lungenerkrankungen behandeln, sollten Sie ihnen einen Beta-2-Rezeptor-Agonisten geben. Wenn Sie Patienten mit Herzerkrankungen behandeln, sollten Sie ihnen in vielen Fällen einen Antagonisten für den Beta-1-Rezeptor geben. Allerdings ist es sehr schwierig, selektive Arzneimittelwirkstoffe zu entwickeln. Wenn man daher einem Patienten einen Beta-2-Rezeptor-Agonisten gibt, kann dieser die Beta-1-Rezeptoren im Herzen stimulieren und umgekehrt. Wie dargestellt, sind die Bindungstaschen für Adrenalin identisch. Ähnliche Probleme ergeben sich bei Muskarin-Rezeptoren. Wenn man auf den M2-Rezeptor im Herzen als Target abzielt, kann dies zu nachteiligen Auswirkungen über M1, M3, M4 und M5 führen, die identische Bindungstaschen haben. Wir hatten ein Beispiel eines hoch selektiven Liganden und interessierten uns daher sehr dafür zu verstehen, wie dieser band und warum er selektiv war. Es handelt sich dabei um einen Arzneimittelwirkstoff namens Salmeterol. Er findet Anwendung bei der Behandlung von Asthma. Ich werde Ihnen diesen Arzneimittelwirkstoff - er ist ein partieller Agonist - im Vergleich mit einem anderen Asthma-Arzneimittelwirkstoff namens Salbutamol zeigen. Diese Arzneimittelwirkstoffe sind in identisch, im Grunde orthosterisch. Das ist die Komponente, die an die orthosterische Tasche bindet. Sie können jedoch erkennen, dass sie sich insofern unterscheiden, als Salmeterol eine lange Kette hat. Das ermöglicht, grob geschätzt, eine hundertfache Steigerung der Selektivität hinsichtlich Beta-2 gegenüber Beta-1 und ungefähr eine tausendfache Steigerung der Affinität. Dies ist die Bindungstasche für Adrenalin. Vergleichen wir das nun mit der Bindung von Salmeterol. Wenn wir sie übereinander legen, sehen Sie - dies wäre die orthosterische Tasche und Salmeterol ragt über die orthosterische Tasche hinaus. Wir glauben, dass dies die Ursache für die Selektivität ist. Um dies zu illustrieren: Auf dieser Folie ist der Beta-Rezeptor dargestellt - in der Ansicht von oben und von der Seite. Die Darstellung ist farbcodiert: Um anzuzeigen, wo Beta-1 und Beta-2 identisch sind, wird Blau verwendet; wo sie sich unterscheiden, ist die Farbe Gelb, und mit Rot ist der nicht-selektive Antagonist dargestellt. Sie können sehen, dass es auf der Außenseite viele Unterschiede zwischen Beta-1 und Beta-2 gibt. Das ist die Region, die mit der Membran interagiert. Wenn wir jedoch den Rezeptor öffnen und uns das Innere anschauen, ist die Region, die sich von der Bindungstasche zur G-Protein-Schnittstelle erstreckt, identisch. Es gibt keine Unterschiede. Und für diese Region ist die Bindungsumgebung der beiden nahezu identisch. Das fasst wiederum zusammen, wie die Bindung für einen nicht-selektiven Arzneimittelwirkstoff, Carazolol, und für Salmeterol, einen hoch selektiven Arzneimittelwirkstoff, funktioniert. Was passiert, ist, dass es bitopisch ist - es erstreckt sich von einer Stelle, der orthosterischen Tasche, bis zu einem zusätzlichen zellulären Vorraum und tastet die strukturelle Diversität ab. Dies erklärt folglich, warum Salmeterol sehr selektiv ist. Wie verhält es sich nun mit den Muskarin-Rezeptoren? Im Fall des Beta-2-Rezeptors können wir bitopische Arzneimittelwirkstoffe herstellen, denn die orthosterische Tasche ist ziemlich offen und man kann Chemie hinzufügen, um eine Vielzahl verschiedener Positionen dieses orthosterischen Liganden in den vielfältigeren extrazellulären Vorraum zu verlängern. Das gilt auch für den aktiven Zustand. Im Gegensatz dazu verfügen die Muskarin-Rezeptoren über einen begrenzteren Zugang von der Bindungstasche zum extrazellulären Vorraum, der auch vielfältiger ist. Daher findet sich nur eine kleine wasserdurchlässige Pore vom Vorraum in die antagonistische Bindungstasche. Und Sie können sehen, dass im aktiven Zustand die orthosterische Tasche komplett geschlossen ist. Und es gibt keinen wasserdurchlässigen Kanal. Es ist also schwieriger, bitopische Arzneimittelwirkstoffe für einen Muskarin-Rezeptor zu entwickeln. Trotzdem war der Muskarin-Rezeptor ein sehr gutes Modellsystem für Arzneimittelwirkstoffe, die wir als allosterische Liganden bezeichnen - eine andere Lösung für hohe Sequenzhomologie. Was sind allosterische Liganden? Hier ist ein Cartoon, der veranschaulicht, wie allosterische Liganden möglicherweise funktionieren. Die orthosterische Bindungstasche ist hier dargestellt. Allosterische Liganden können buchstäblich an jeder Stelle mit Ausnahme dieser Tasche binden. Dabei können sie folgende Auswirkungen haben: Sie könnten die Affinität der orthosterischen Verbindung beeinflussen, sie könnten die Fähigkeit der orthosterischen Verbindung beeinflussen, über den Rezeptor Signale weiterzuleiten, oder sie könnten selbst und unabhängig Agonist oder Antagonist sein. Diese Auswirkungen rufen eine Anzahl verschiedener Wirkungen hervor, wie in dieser Dosis-Wirkungs-Kurve dargestellt. Wir wollten also sehen, wie allosterische Arzneimittelwirkstoffe funktionieren und wie sie aussehen könnten. Das ist ein Beispiel für den Vergleich zwischen M2 und M3, beide wiederum Muskarin-Rezeptoren. In der orthosterischen Tasche sind sie identisch. Gelb zeigt an, wo sie sich im extrazellulären Vorraum voneinander unterscheiden - auch bekannt als die allosterische Tasche für den Muskarin-Rezeptor. Wir erhielten einen hoch selektiven aktivierenden allosterischen Modulator oder positiven allosterischen Modulator für den M2-Rezeptor. Diese Studien zeigen, dass er die Bindungsaffinität für den Agonisten und die Fähigkeit des Agonisten erhöht, das G-Protein zu aktivieren. Wo bindet er? Hier haben wir zunächst den inaktiven Zustand, wieder mit dieser sehr geschlossenen Bindungstasche. Und dies ist der extrazelluläre Vorraum oder die allosterische Tasche. Sie können sehen, dass im aktiven Zustand sich die Tasche sehr stark verändert und sich schließt. In Anwesenheit des Modulators gibt es nun kleine zusätzliche Veränderungen. Der Modulator sitzt genau oben auf dem Agonisten und verhindert seine Trennung. Dadurch sorgt dieser Modulator - in Grün dargestellt - dafür, dass der Agonist nicht disassoziiert, und stabilisiert auch die aktive Konformation. Das ist also eine großartige Lösung für Muskarin-Rezeptoren, und man hat eine Reihe sehr selektiver allosterische Modulatoren identifiziert. Allerdings gibt es zur Zeit keine allosterischen Modulatoren für den Beta-2-Adrenorezeptor. Wir interessieren uns dafür zu verstehen, ob dieses Prinzip auch auf andere GPCRs, einschließlich des Beta-2-Rezeptors, angewendet werden könnte. Wir zeigten also wieder die Bindungstasche des inaktiven Zustands, den aktiven Zustand mit der Bindung an Adrenalin und eine partiell aktive Stelle, die an diesen hoch selektiven Arzneimittelwirkstoff bindet. Und wir wollten diese extrazelluläre Stelle als die potenzielle allosterische Stelle definieren. Können wir also allosterische Arzneimittelwirkstoffe für den Beta-2-Rezeptor entwickeln? Hier ist der Verlauf des Experiments. Und ich sollte erwähnen, dass es sich um noch in Arbeit befindliche Forschung handelt. Ich werde daher einige potenziell positive, frühe Ergebnisse liefern, von denen wir hoffen, dass sie weiterhin positiv bleiben werden. Hier ist der Rezeptor, so, wie er von außen erscheint. Wir werden die Transmembranen 6 und 7 entfernen, damit wir die Bindungstasche besser sehen können. Das ist die Salmeterol-Bindungstasche, und wenn wir nun Salmeterol wegnehmen und Epinephrin hinzufügen, wäre dies, wie Sie sehen können, die orthosterische Tasche. Das ist das Adrenalin, das an die orthosterische Tasche bindet. Und wir definieren die allosterische Andockstelle als den Unterschied, der Teil von Salmeterol, der sich über die orthosterische Tasche hinaus erstreckt. Unsere Kollegen, Brian Shoichet und sein Team, verwendeten dies als eine definierte Tasche und bedienten sich computer-gestützter Screenings, um rund fünf Millionen Verbindungen durchzugehen und Dinge zu finden, die in diese Tasche passen könnten. Aus mehreren hundert Verbindungen selektierten sie mithilfe von Sichtprüfungen 26. Dann führten wir einige Bindungs-Experimente durch und entdeckten einige interessante Verbindungen. Letztendlich konnten wir eine vorläufige Struktur gewinnen, die ich Ihnen in einer Minute zeigen werde. Unser nächstes Ziel ist es, die Chemie zu optimieren. Von diesen 26 zeige ich Ihnen die Ergebnisse für ungefähr 12. Dieses Experiment ist darauf ausgelegt, sowohl positive als auch negative Modulatoren zu identifizieren. Wir beginnen, indem wir zu diesen Zellen - entschuldigen Sie bitte - zu diesem Assay, bei dem es sich um ein Rezeptor-G-Protein-Aktivierungs-Assay handelt, das die Aktivierung des G-Proteins misst, die Hälfte der Maximaldosis Noradrenalin geben. Dann fügen wir sättigende Mengen dieser Verbindungen hinzu. Und Sie können sehen, dass die meisten Verbindungen keine Wirkung haben, aber es gibt eine Verbindung, die ein Inhibitor ist, und eine Verbindung, die ein Potentiator ist. Diese bezeichnen wir als BRAC 1 und BRAC 11. Mithilfe von Bindungs-Experimenten können wir zeigen, dass die Bindung an die orthosterische Tasche weder die Off-Rate noch das Gleichgewicht der Bindungsaffinität wird durch die Anwesenheit dieser Verbindungen verändert, was bedeutet, dass sie nicht um die orthosterische Tasche konkurrieren. Folglich sind sie eindeutig allosterisch. Das können wir sogar für BRAC zeigen. BRAC 1 hat keine Wirkung auf die Agonistenaffinität. Dies ist wieder eine Konkurrenzkurve, um die Wirkung dieser allosterischen Modulatoren auf die Affinität von Norepinephrin zu vergleichen. BRAC 11 hat keine Wirkung, aber BRAC 1, das ein negativer Modulator ist, verschiebt die Affinität nach rechts und reduziert sie ungefähr um das Vierfache. Was für eine Art von Modulator haben wir mit BRAC 1 identifiziert? Es scheint eine Verbindung zu sein, welche die Affinität für den orthosterischen Agonisten reduziert und selbst einige direkte Wirkungen hat; folglich ist es ein komplexer allosterischer Modulator. Die nächste Frage ist: Haben wir tatsächlich auf den Arzneimittelwirkstoff abgezielt, von dem wir es dachten? Hier ist die allosterische Tasche. Kürzlich konnte Xiangyu Liu in unserem Labor in Tsinghua eine Struktur eines an dieses BRAC 1 gebundenen Rezeptors gewinnen. Hier ist die Tasche. Und tatsächlich bindet BRAC 1 in der Tasche und tatsächlich ist es möglich nachzuweisen, dass die Bindungstasche für BRAC 1 hier, dieses sehr kleine Molekül, sich nicht mit der Bindungstasche für Adrenalin überschneidet. Und wir haben aus dieser Struktur auch einige subtile Details erfahren, warum es in der Tat ein negativer Modulator für Adrenalin sein könnte. Ich werde hier mit dieser Folie schließen, um zu veranschaulichen, dass wir gerade erst anfangen zu verstehen, wie diese Proteine wirken. Wir haben uns sehr auf Rezeptor-G-Protein-Interaktionen konzentriert, aber wir müssen auch verstehen, wie Rezeptoren mit anderen G-Proteinen, anderen Signalproteinen wie Arrestinen und Kinasen interagieren. So interessant detaillierte Kristallstrukturen auch sind - das Protein ist ein hoch dynamisches Protein, und sein Charakter, sein dynamischer Charakter ist meiner Meinung nach für sein interessantes Signaltransduktionsverhalten verantwortlich. Zusätzlich zur Kristallographie wird es daher für uns wichtig sein, weiterhin andere Methoden wie Kernspinresonanzspektroskopie, Elektronenspinresonanz- und Fluoreszenzspektroskopie zu erforschen, um den dynamischen Charakter zu verstehen. Ich danke Ihnen für Ihre Aufmerksamkeit und möchte eine fantastische Gruppe von Kollegen würdigen. Meine Frau Tong Sun arbeitet seit vielen Jahren mit mir zusammen. Ich möchte Xiangyu Liu hervorheben, der diese neue Struktur fand. Diese Personen haben alle zu der Arbeit beigetragen, die ich vorgestellt habe, und ich möchte auch Bill Weis würdigen, einen langjährigen Kollegen und Mitarbeiter in der Kristallographie. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.

Brian Kobilka (2014)

G Protein-Coupled Receptors: Challenges for Drug Discovery

Brian Kobilka (2014)

G Protein-Coupled Receptors: Challenges for Drug Discovery

Abstract

G protein-coupled receptors (GPCRs) conduct the majority of cellular responses to hormones and neurotransmitters, and are therefore the largest group of pharmaceutical targets for a broad spectrum of diseases. Identification of genes for GPCRs, initially through cloning and subsequently through database mining, raised hopes for the rapid discovery of new therapeutics. However, the number of new approved drugs for GPCR targets over the past two decades has fallen short of expectations. I will discuss challenges in GPCR drug discovery and the potential impact of structural biology and other scientific advances on future drug discovery efforts.

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