Sir Martin J.  Evans  (2014) - Inheritance from Teratomas

I'm going to talk to you about the work that has arisen from our studies with teratocarcinomas. Teratocarcinomas are rather peculiar tumours, we’ve just been hearing about tumours but they are very special. Most tumours are a sort of caricature of the tissue they came from. Teratocarcinomas have got lots of different mixed tissues in them, and actually are a caricature of embryonic development. So there, basically there is a developmental system going on in the tumour. So my title embraces three topics, it's really the actual inheritance we can get from them, but really the way that the ideas that came out have provided us with an inheritance. First of all isolation of cell differentiating systems into tissue culture. Embryonal carcinoma cells, the cells directly from the tumour. These cells as I’ll show you will differentiate very nicely and really set everything up for the second discovery which was the embryonic stem cells. Really effectively the same cells but of a much purer origin and therefore usually kariotypically and genomically normal. These cells can after growth in culture go through a chimeric mouse to the germline and breed from them and we can therefore use them as a route to genomic modification in the mouse, experimental mammalian genetics And then finally I want to go on to talk about ideas that are still emerging but emerging very strongly, that because we have new understandings of developmental cells biology we can start to apply this to therapeutic effects. Start to use cells as a means of therapy in human patients. Now I usually rate science by its contributions to our understanding of our world. Actually I was just introduced as from Cardiff. I think I should have dodged that question and said I'm from the biosphere, from that exceedingly thin part of the world which is our home. We are understanding it more and more and it is also more and more threatened. Anyhow, I think that science should be understanding this world. I don’t rate the commercial applications nearly as highly. But last week I had in my inbox an unsolicited email pointing out that there is a huge market in mice models now. Now I think that this is largely arisen from the work with teratocarcinomas. Because when I started out, really, mice were not the preferred model for physiology, for pharmacy. They were too small, rats were the preferred model. Mice had the better genetics but only by a whisker or two, not very good genetics. And the other part of this slide I put up is a second similar promotion that’s going on, suggesting that the global stem cell therapy market is getting up to 330 million. I was actually surprised that that’s quite a bit less than the predicted mouse market at the moment. But you know these things obviously come through and of course these may be completely false predictions, I don’t know. When I started in the late ‘60s, I wanted to do work on developmental biology and experimental embryology. At that time we knew about embryonic induction, the famous Spemann experiments. We had a strong idea that most of the development was a series of interactions. And we knew that after those interactions there was a fairly stable state of cell commitment which we called determination. We distinguished this to some extent from differentiation, you know, over muscle cells and things like that. Because we thought that maybe there was a specific pre-differentiation state but it was still this fixed pathway. Now we knew from the famous experiments of John Gurdon with his cloning of frogs from the nuclei of fully differentiated cells that the nuclei themselves, the nucleic content, was not altered as you got this differential readout. So it was differential readout of m-RNA. m-RNA when I started had been shown in bacterial systems but actually had not yet been isolated or shown in vertebrate cells. And if you like to cast your mind back to an impossible situation: there was no DNA cloning, no sequence, very little genetics, just a few. Mouse was the best, as I said, but there were just a few low sites scattered around the genome that had been put together by careful linkage. And there was of course somatics, L-genetics where you could look at the chromosomes in cell culture. The mouse started to be a good model for developmental biology really from the efforts of these people, particular Andrzej Tarkowski who first of all showed that you could get a whole mouse out of half an embryo, same thing as you can do in frogs. He then showed that, he proposed that the fate of blastomeres, the way that they were able to go into different lineages, was to do with their positional condition in the early embryo, so called inside-outside hypothesis. Beatrix Mintz who’s down on the bottom right here also was working on this and she called it a micro-environmental. And of course they both went on to produce chimaeric mice, mice that were formed from putting together two different embryos. Richard Gardner who we’ll come onto later was at that time very importantly showing that there were numbers of cells in the early mouse embryo that could have complete developmental potential. So the cells, we thought of it like this and there are places where there were clearly dividing. Now that would suggest that there must be populations at some stage in development where the cells still have the capability of going in any direction. But it's not self-evident that those cells will be a proliferating population or indeed a population that we could get into tissue culture. And the way this came about, the way the ideas came, is that this man Leroy Stevens, who was a mouse geneticist dealing with inbred lines of mice, found a particular inbred line where teratocarcinomas, the tumour I mentioned just now, formed spontaneously in the testis. And he did a lot of work showing that these came from germ cells. But they could also come from ectopically transplanted embryos. And he went on to say, in one of his papers following repeated serial transplantations, these tumours have retained their pleomorphic character. Pluripotent embryonic stem cells appear to give rise to both rapidly differentiating cells and others which, like themselves, remain undifferentiated. In other words he said there was a stem cell population that was responsible for all the tissues in the tumour. Here is a section of a teratocarcinoma. Those of you who have ever looked at sections could see this is cartilage, this is bone, that’s a bit of skin, when looked at carefully there’s a bit of virtually everything there. Possibly a few exceptions. Here’s a bit of muscle you can see. But there was also these cells. These cells are recognisable really by analogy with the human teratocarcinomas and the human pathologists had noted that these cells, when seen, was a good index that this was a highly malignant tumour. These are the growing cells and these were called embryonal carcinoma from the human pathologists. Here is Barry Pierce who was the outstanding human pathologist looking at the system. And he did with a student of his a particularly important experiment. He showed that you could clone these tumours from single cells, thus completely proving that there was a pluripotential cell population in them. Now that’s about when I came in, Leroy Stevens kindly sent me stocks of mice bearing tumours which would produce the tumours. And I in my, now I want to point out that I was early post-doc, just like I imagine most of you are. And here I was going for this ambitious project. I in my innocence said, "Well these are tumours, you can grow tumour cells in culture no problem. So I ought to be able to grow them in tissue culture." And indeed I did. Here they are. That’s the paper and here is a little colony of such cells and that’s a teratoma that you can form, that's the test of course, put them back in the mouse and there they are. However, about the same time two very famous scientists were known to have embarked on the same project. This is one of the points I want to make to you: don’t be scared of famous old scientists! This is Boris Ephrussi and Gordon Sato. Also, a little later, two other rather famous scientists both of these Nobel Prize winners, Salvador Luria and François Jacob came into the field. In particular François Jacob came in and set up a huge project using teratocarcinoma cells very much in direct competition with what our little lab was trying to do. Don’t be frightened of Nobel laureates! Now these cells I had in culture, what could they do? They are meant to be developmental, they are going to differentiate, aren’t they. Well how do they differentiate? Well first of all in a tumour we inject them in a mouse, you get a teratocarcinoma, lots of different tissues. No problem. Okay, the other really interesting experiment was done together with Richard Gardner and Julie Papaioannou here. We injected cells from the cultures I was making into the blastocyst of a mouse. This is Richard’s experiment. And when we did that we got chimaeric mice. In other words mice that are made up of cells which are the progeny both of the early embryo and of the tissue culture cells we put in. And here you can see very simply there’s a black coat colour there that’s come from the cells in culture, there are other markers you can see visually in the eye and there’s a number of different coat colour markers you can see, but basically you can’t see very much in the living mouse. But what we did was we used glucose phosphate isomerase enzyme which is present in a number of electrophoretic variants and we could take the mouse, dissect it, or take the mouse embryo, dissect it, run Gpi starch gels and find which variant was there. And that would show us whether it came from our tissue culture cells or whether it came from the mouse. Now we wanted a tissue culture differentiation system. So really the thing to do was to put it, get it working in culture, not in a tumour or in a mouse. And first of all that was a bit resistant but then we discovered, this was with Gail Martin, that either a mass culture allowed to grow up and then plate out onto a solid tissue culture surface, as a plastic plate, would differentiate marvellously. So too if we looked at the individual colonies that would grow with feeder cells, grow them for a long time, the feeder cells, these are inactivated, radiation inactivated, they would die off. And then this little colony would start to differentiate because it was the feeder cells that were preventing it, which were inhibiting the differentiation and indeed allowing the growth. This was really quite a surprise to us. Because up until then we thought that these were tumour cells. Okay they are behaving like embryo cells but they were tumour cells, a bit abnormal, when they went into a teratocarcinoma there were sort of environmental affects to popping off into a cartilage or something else, stochastic odd effects. But suddenly we realised that these cells were behaving just as though they were cells from an early embryo. If you take in my rather bad drawing here this is the edge of a mouse blastocyst. If you cut out the inner cell mass you get a thing like this which is called an embryonic body with cells in the middle and differentiated, I should say undifferentiated cells on the middle, differentiated cells on the outside. And of course that’s exactly what's happening with our tissue culture. Undifferentiated going to a clump and then work like that. They think they are embryo cells. They are of course embryo cells. And here’s actually the section showing it. This is the edge of one of those colonies which is now differentiated, floating embryoid body. On the outside that’s staining for alphafoetoprotein. Here’s an EM, those are the cells with the staining here. So we then knew we could get tumours by transplanting an embryo into a mouse. From those teratocarcinomas we could get cultures. The cells in those cultures would differentiate just like a mouse embryo. They could be put into a mouse embryo, become part of a mouse. The one bit that was missing was, well if these are mouse embryo cells and if we can grow these cells in culture then surely we ought to be able to just grow them from an embryo. That red line was the missing link. It was a missing link for about five years. And numbers of people were trying to get it to work. I wrote a paper saying why doesn’t it work? I won’t go through that in detail now. But the real things that were worrying us - Was there a very short time window? No. Would they differentiate much too fast if we got them? Probably yes. Are they very small in number, have we got to get very good cloning efficiencies? Yes. But it wasn’t until I met Matt Kaufman that we were able to do it. He was very interested in haploid embryos. There were genetic tricks, you can get a mouse embryo to grow for the first four days or so, four or five days, in a haploid condition, in other words only one set of chromosomes. I mentioned earlier that the genetics of the mouse, although coming on was really, it wasn’t there. And one of the ways of going was somatic cell genetics. If we could have cells in culture with only one copy of the chromosomes they would immediately become like yeast, we could just mutate them and see what was happening. So it would have been a lovely thing to do. Now I had been trying to grow cells from these embryos for some time and I couldn't grow the propotent cells or hadn’t until that time. But I was growing other cell types. So I said to Matt, "Yes of course we can do that. You make me the haploid embryo and I’ll grow you some cells from it and we’ll see if we can get haploid cells out." But he didn’t trust me. He was a cautious man and it took him some time. Quite a bit of manipulation to get these embryos growing. And he thought, "Well I’ll give Martin normal diploid embryos to start with as a control. Make sure he really can grow these cells before I entrust my very valuable haploid embryos." So he gave me diploid embryos. He had a technique that he was using in order to get the haploids to grow, to last longer and that was to make large delayed blastocysts, bigger than normal therefore more source cells in them. And lo and behold, it worked. We got cells out almost immediately that were quite recognisable. And remember there had been years and years of growing these embryonic carcinoma cells. I knew exactly what they should look like. I knew exactly what I could stain them with. I knew what cell surface markers they should have etc, etc. It was very clear, once we got them we'd got them. So, I hope this works, this is a complex slide I’ve used often and I’ve been practicing for you and it wasn’t working so well. What about injection into mice? They produced teratomas? Yes. What about the teratomas, they were multiply differentiated? Yes. What about the karyotype, are these now normal? Yes they were. And that’s must better than the embryonic carcinoma cells. Could we single cell clone them? That’s no problem. Did they differentiate in-vitro? Yes they did, very well and very fast. What about trying to make chimaeras? That’s doing it not only with Richard Gardner originally, but now with Liz Robertson and Allan Bradley. Here they are these cells being injected into an early mouse embryo, a blastocyst. And you make a mouse out of it. And the mouse in that case you can see has got quite a few markers. He’s got his eyes, he’s got brown hair which shows the agouti locus, you’ve got the black hair and of course internally, using Gpi markers, it's everywhere. So not only, now those should also be animated, oh hallo, come on then, it should be the same videos, I think it doesn’t like that! These mice, hello mate! These mice, when the males, you can breed from them and here’s an example of a proud father with his litter, all of which have come from sperm that arose from the cells in culture. So we can go through the germline. Now that makes a huge difference. We can now not only have a dozen or so cells in the embryo that could go through into the germ line, but we can grow probably 10^7 in a culture dish quite easily. Any one of which we can clone out and which can go through and go into the germline. That means that we now have the opportunity for mutagenesis, gene targeting whatever. And for genetic selection and selecting out the particular variant that we want. So this then has introduced us to a real genetics, what happens if you change it? I'm running short of time, I notice, I guess, okay, possibly the best method is gene targeting. And I'm hoping that Oliver Smithies here is going to tell you more about that technique. But it's he and Mario Capecchi who, we all share the Nobel prize, and they were the two people who perfected the method of being able to target genes by matching pieces of DNA. And of course I produced the cells. Here’s a bit of genetic code, it actually is brca2. What does it do? We don’t know but if we knock it out it makes mutant mice. Now I want to spend, sorry I'm running short of time I know, but I want to just show you somebody else’s experiment, which really shows that this is genetics, it's not just gene jockeying. Fascinating example, there’s a locus called CD22 which is involved in modulating the effect, inhibiting binding to the B-cell receptor. And therefore it was thought to prevent immune attack on the red cells. And therefore cause, prevent haemolysis. So therefore if it was knocked out you’d expect haemolysis. Here the cells were labelled and this is the life time of their survival in the blood. Those are the wild type, these are the knock out ones. And there’s a positive control. Yes, they are produced. However, the immune system didn’t seem to be up-regulated at all. And, moreover, if you put this back into mice with no B cells or no immunoglobulins exactly the same loss occurred. So it's not immune mediated. How is it mediated? Well if you put the red blood cells and transplant them you can find that here they are, exactly the same - more rapid loss. But that occurs both in a wild type host or in a CD22 mutant host, it's identical. Now, it might suggest that it's cell autonomous and maybe nothing to do with the immune system. And the authors looked at another mutation, another knock-out mouse, and found that that didn’t seem to show the same spleen anomalies, suggesting there’s a more rapid turnover. So they looked at the genetics. Now these mice had been backcrossed onto C57. And so they were now looking, the mutation had been made in the 129 background, so they looked to find the 129 DNA which they thought there would probably be some adventitious mutation in there. There’s the bit of the 129 DNA, but then as they looked at it there was an unknown piece of DNA, neither C57 nor 129. It turns out that this is the bit of DNA which comes from the wild type mouse that’s carrying the Gpi1C locus. I’ve mentioned Gpi to you as our universal marker. The 1C is one which has got more rapid electrotactic mobility and is a very nice general marker because none of our mice or other cells have it in. And so that must be of course the trouble. And in fact Gpi is here and Cd22 is here, only 5 Mbp apart. What they did then was to sequence this unknown piece of DNA, and they found locus, they found there was indeed a point mutation leading to a glycine to arginine change. That of course nicely explains the electrotactic change at the charge. And they also showed that it was only, it was a hypermorph, it's only about 25% active. That’s the reason for their red cell problem. Now, I have just about four minutes left. What about the possibility of gene therapy? We can now, these cells will make any cell you like in culture. Can they be used for regenerative medicine? Can we deliver it? If you have a patient and they need something, can we put it in? Now first thing to think of, what sort of cells would you like stuck into you? Well, you’d want cells that would work, but you’d also want cells that wouldn't have adverse effects, wouldn't be bringing in other infection, and, preferably, that wouldn't be rejected. So you want autologous cells from your own body preferably. Now, that a few years ago looked like a dream scenario. But the advances in cell biology mean that it is absolutely a possible scenario, because we can control cell fates. Yamanaka has shown that he can make IPS cells. Other people have shown that indeed you don’t have to consider just going from an adult cell right back to the embryonic cell. You can actually do trans-differentiation across lineages. So this stability of the differentiated state is now shown, as we always knew it was, to be really a metastable stability. And it can be modulated, so for instance you can also make, that’s another interesting paper, you can make cardiomyosites, beating heart muscle cells from fibroblasts. So it’s a cellular therapeutics, it’s a transplantation. You have to watch the immune rejection and I think that what I call here 'ad hominem' but autologous is our best way forward. Does this now provide us with a fountain of eternal youth? ES cells, human ES cells, made from human embryos have been contentious however IPS cells made from adult less contentious. But both probably allogeneic for any individual patient. But it would be possible to have a whole panel of possible cells prepared, pretested etc, specific precursors. You could equally well go autologous or indeed directly trans-differentiate adult cells. Is it going to be logistically and economically practical? I think it is. I think if you look at the likely cost which is high at the moment, it will still fall within the sort of range of extremely expensive drug treatments. And it will probably be a one-off treatment as opposed to a lifelong treatment. Once again as Barry Marshall said "not liked by drug companies". So we have seen two spin-offs from teratomas at least if not three. I think what the harvest of this is the fundamental knowledge and biological understanding and that the practical applications at the moment are probably early day naive. But we are getting the knowledge which is going to take us forward. It’s up to you people here to do the next generation, please. Good. Thank you very much.

Ich möchte Ihnen heute etwas über die Ergebnisse unserer Teratokarzinom-Studien erzählen. Teratokarzinome sind ziemlich ungewöhnliche Tumore; wir haben vorhin schon etwas über Tumore erfahren, doch diese hier sind sehr speziell. Die meisten Tumore sind eine Art Zerrbild des Gewebes, aus dem sie stammen. Teratokarzinome dagegen bestehen aus vielen unterschiedlichen Geweben und spiegeln damit in gewisser Weise die embryonale Entwicklung wider. Der Tumor beinhaltet also im Grund genommen ein Entwicklungssystem. Der Titel meines Vortrags bezieht sich auf 3 Themenbereiche. Es geht darum, was uns diese Tumore selbst lehren, ab auch welche Schlüsse wir aus unseren Erkenntnissen ziehen können. Da ist zunächst einmal die Isolierung von Zelldifferenzierungssystemen in Gewebekulturen. Embryonale Karzinomzellen, d. h. direkt aus dem Tumor stammende Zellen. Wie Sie nachher sehen werden, differenzieren sich diese Zellen sehr schön und ebneten den Weg für die zweite Entdeckung – embryonale Stammzellen. Hierbei handelt es sich im Prinzip um dieselben Zellen, die jedoch reineren Ursprungs und daher für gewöhnlich karyotypisch und genomisch normal sind. Diese Zellen können nach Züchtung in Kultur in die Keimbahn einer chimären Maus eingebracht werden, die sich dann fortpflanzt. Auf diese Weise lässt sich das Genom der Maus verändern; experimentelle Säugetiergenetik. Schließlich möchte ich Ihnen von unseren sich immer stärker herauskristallisierenden Ideen berichten. Jetzt, wo wir über ein neues Verständnis für die Entwicklungsbiologie der Zellen verfügen, können wir dieses für therapeutische Zwecke nutzen und Zellen als eine Form der Therapie beim Menschen anwenden. Ich bewerte Wissenschaft normalerweise nach dem, was sie zum Verständnis unserer Welt beiträgt. Als ich eben vorgestellt wurde, haben Sie gehört, dass ich aus Cardiff stamme. Ich hätte die Frage besser anders beantwortet und gesagt, dass meine Heimat die Biosphäre ist, diese unglaublich dünne Schicht, in der Leben gedeiht. Wir entwickeln ein stets wachsendes Verständnis für sie, sie ist aber auch immer stärker gefährdet. Jedenfalls bin ich der Ansicht, dass die Wissenschaft zum Verständnis der Welt beitragen sollte. Die kommerzielle Anwendbarkeit halte ich für weitaus weniger wichtig. Letzte Woche fand ich jedoch in meinem Posteingang eine E-Mail, in der mich jemand unaufgefordert darauf hinwies, dass es inzwischen einen riesigen Markt für Mausmodelle gäbe. Dies ist meiner Meinung nach in erster Linie die Folge der Teratokarzinom-Studien, denn zu Beginn meiner Arbeit stellten Mäuse keineswegs das bevorzugte Modell für die Physiologie bzw. Pharmazie dar. Sie waren zu klein, daher wurden Ratten bevorzugt. Die Genetik der Mäuse war zwar ein wenig besser, jedoch nur marginal. Weiter unten auf der Folie sehen Sie, wie ein zweites ähnliches Feld expandiert, nämlich der Markt der globalen Stammzelltherapie, der voraussichtlich auf 330 Millionen wächst. Ich war allerdings überrascht, dass er doch um einiges kleiner ist als der aktuell erwartete Mausmarkt. Aber diese Dinge entwickeln sich offensichtlich so, und natürlich können sich auch die Vorhersagen als völlig falsch erweisen. Als ich Ende der 60er Jahren mit meiner Arbeit begann, wollte ich mich mit Entwicklungsbiologie und experimenteller Embryologie beschäftigen. Damals kannten wir die embryonale Induktion, die berühmten Spemann-Experimente. Wir waren uns ziemlich sicher, dass es sich bei den meisten dieser Entwicklungsprozesse um Wechselwirkungen handelt, und wir wussten, dass die Zelle nach diesen Interaktionen einen relativ stabilen Zustand erreicht, den wir als Determination bezeichneten. Wir unterschieden bis zu einem gewissen Grad zwischen Determination und Differenzierung in Muskelzellen etc., da wir dachten, es könnte noch ein spezieller Vordifferenzierungszustand existieren; der Ablauf war jedenfalls festgelegt. Wir wissen aus den berühmten Experimenten von John Gurdon, der Frösche aus den Zellkernen ausdifferenzierter Zellen klonierte, dass die Zellkerne selbst, ihr Inhalt, durch das differentielle Auslesen nicht verändert werden. Das bedeutet, dass die mRNA ausgelesen wird. Zu Beginn meiner Arbeit war mRNA zwar in Bakteriensystemen bereits identifiziert, in Wirbeltierzellen jedoch noch nicht isoliert bzw. nachgewiesen worden. Stellen Sie sich die unmögliche Situation damals vor: Es existierte keine DNA-Klonierung, keine Sequenz, es gab nur sehr wenig Erkenntnisse bezüglich der Genetik – wie gesagt, die Maus war die beste Möglichkeit – und nur wenige kleine, im Genom verstreute mRNA-Abschnitte waren durch sorgfältige Verknüpfung zusammengefügt worden. Allerdings gab es natürlich die somatische Zellgenetik, mit deren Hilfe man die Chromosomen in einer Zellkultur untersuchen konnte. Die Maus erwies sich, ausgehend von den Bemühungen dieser Leute, insbesondere Andrzej Tarkowski, der als Erster zeigte, dass – genau wie beim Frosch – aus einem halben Embryo eine ganze Maus entstehen kann, als gutes Modell für die Entwicklungsbiologie. Tarkowski war der Ansicht, dass das Schicksal der Blastomere, die Art, wie sie verschiedene Zelllinien ausbilden können, etwas mit ihrer Position im frühen Embryo zu tun hat – die sogenannte Innen-Außen-Hypothese. Beatrix Mintz, die Sie hier unten sehen, arbeitete ebenfalls an diesem Thema; von ihr stammt die Bezeichnung 'Mikroumgebung'. Natürlich erzeugten die beiden auch chimäre Mäuse, d. h. Mäuse aus zwei verschiedenen Embryos. Richard Gardner, auf den ich später noch zurückkommen werde, hatte damals gezeigt, dass das frühe Mausembryo viele Zellen enthält, die das Entwicklungspotential vervollständigen könnten – eine Entdeckung von großer Bedeutung. Die Zellen teilten sich ganz eindeutig an bestimmten Stellen. Das bedeutete, dass es in einem gewissen Entwicklungsstadium Populationen geben muss, in denen die Zellen nach wie vor in der Lage sind, jede erdenkliche Richtung einzuschlagen. Nicht selbstverständlich ist, dass sich diese Zellpopulation vermehrt oder tatsächlich in einer Gewebekultur gezüchtet werden kann. Zu dieser Erkenntnis gelangte man, als dieser Mann, Leroy Stevens, der als Mausgenetiker mit Mäusen aus Inzuchtlinien arbeitete, eine bestimmte Inzuchtlinie entdeckte, bei der sich in den Hoden spontan die zuvor erwähnten Teratokarzinome bildeten. Er wies in aufwendigen Studien nach, dass diese Tumore aus Keimzellen entstehen, aber auch aus ektopisch transplantierten Embryos stammen können. Zudem vertrat er nach wiederholter Durchführung von Transplantationen in einem seiner Artikel die Auffassung, dass diese Tumore ihren pleomorphen Charakter behalten hätten. Aus pluripotenten embryonalen Stammzellen entwickelten sich anscheinend Zellen, die sich rasch differenzierten, und solche, die wie sie selbst undifferenziert blieben. Mit anderen Worten, es existierte nach seiner Aussage eine Stammzellenpopulation, die für all die verschiedenen Gewebe in dem Tumor verantwortlich war. Das hier ist ein Schnitt durch ein Teratokarzinom. Wer von Ihnen schon einmal einen Gewebeschnitt gesehen hat, kann hier Knorpel, hier Knochen und hier ein wenig Haut erkennen. Bei genauem Hinschauen erkennt man, bis auf einige wenige Ausnahmen, von allem etwas. Hier haben wir ein Stück Muskel. Doch da waren auch diese Zellen. Man erkennt sie analog zu den Teratokarzinomen beim Menschen, und die Humanpathologen hatten festgestellt, dass das Vorliegen dieser Zellen ein guter Indikator für einen hochmalignen Tumor ist. Das hier sind die wachsenden Zellen; die Humanpathologen bezeichneten sie als Embryonalkarzinom. Hier sehen Sie Barry Pierce, den herausragenden Humanpathologen, der sich mit dem System beschäftigte. Gemeinsam mit einem seiner Studenten führte er ein besonders bedeutsames Experiment durch. Er zeigte, dass sich diese Tumore aus einzelnen Zellen klonieren lassen, und bewies damit endgültig, dass sie eine pluripotente Zellpopulation enthielten. Jetzt komme ich ins Spiel. Leroy Stevens schickte mir freundlicherweise tumorproduzierende Mäusestämme. Ich war damals erst seit kurzem Postdoc, wie wahrscheinlich die meisten von Ihnen, und sollte nun dieses ambitionierte Projekt verfolgen. In meiner Unschuld sagte ich: "Das sind Tumorzellen, die lassen sich problemlos in Kulturen züchten. Ich sollte in der Lage sein, sie in einer Gewebekultur zu züchten." Und genau das tat ich. Hier sind sie. Das ist das Paper. Sie erkennen eine kleine Kolonie dieser Zellen und das Teratom, das man erzeugen kann. Das hier ist der Test, die Zellen gehen zurück in die Maus, und da sind sie. Es war bekannt, dass sich etwa zur gleichen Zeit zwei sehr renommierte Wissenschaftler anfingen, sich mit demselben Projekt zu befassen. Ich möchte Ihnen eines nahelegen: Haben Sie keine Angst vor berühmten alten Wissenschaftlern! Das hier sind Boris Ephrussi und Gordon Sato. Ein wenig später begannen zwei weitere ziemlich berühmte Wissenschaftler Insbesondere François Jacob startete im direkten Wettbewerb zu dem, was unser kleines Labor zu erreichen versuchte, ein großangelegtes Projekt mit Teratokarzinomzellen. Haben Sie also keine Angst vor Nobelpreisgewinnern! Was konnten nun diese Zellen, die ich in Kultur hatte? Sie sollten sich entwickeln, differenzieren, nicht wahr? Doch wie sieht diese Differenzierung aus? Um einen Tumor zu erzeugen, injizierten wir die Zellen zunächst in eine Maus, so dass ein Teratokarzinom aus vielen verschiedenen Geweben entstand. Kein Problem. Das andere wirklich interessante Experiment führten wir gemeinsam mit Richard Gardner und Julie Papaioannou durch. Wir injizierten Zellen aus den Kulturen, die ich gezüchtet hatte, in die Blastozysten einer Maus. Hier sehen Sie Richards Experiment. Dabei entstanden chimäre Mäuse, d. h. Mäuse, deren Zellen sowohl vom frühen Embryo und als auch den injizierten Gewebekulturzellen abstammen. Hier sehen Sie die schwarze Fellfarbe, die von den Kulturzellen stammt; es existieren noch weitere visuelle Marker in den Augen sowie verschiedene Fellfarbenmarker, doch im Grunde genommen weist die lebende Maus nur wenige Auffälligkeiten auf. Wir arbeiteten mit dem Enzym Glucosephosphatisomerase (GPI), das in einer Reihe elektrophoretischer Varianten vorkommt. Wir sezierten das Mausembryo, führten eine GPI-Stärkegelelektrophorese durch und bestimmten, welche Variante vorlag. Auf diese Weise wussten wir, ob sie von den Gewebekulturzellen oder der Maus stammte. Da unser Ziel ein Differenzierungssystem für Gewebekulturzellen war, mussten wir dafür sorgen, dass dieses System in der Kultur funktionierte, nicht im Tumor oder der Maus. Zunächst erwies sich das Vorhaben als etwas sperrig, doch dann stellten wir – gemeinsam mit Gail Martin – fest, dass man die Zellen einerseits in einer Massenkultur züchten und sie anschließend auf eine feste Gewebekulturunterlage, z. B. eine Kunststoffplatte übertragen kann, wo sie sich wunderbar differenzieren. Man kann aber auch mittels Fütterzellen über längere Zeit einzelne Kulturen züchten und die Fütterzellen dann durch Strahlung inaktivieren, so dass sie absterben. Da es die Fütterzellen sind, die die Differenzierung inhibieren und de facto das Wachstum ermöglichen, kann diese kleine Kolonie erst nach deren Absterben mit der Differenzierung beginnen. Das war eine ziemliche Überraschung für uns, da wir bis zu diesem Zeitpunkt dachten, dass es sich um Tumorzellen handelt. Okay, sie verhalten sich wie Embryonalzellen, doch es waren Tumorzellen, wenn auch ein bisschen ungewöhnliche. Ihre Entwicklung zum Teratokarzinom hatte stochastische Effekte auf die Umgebung, es entstand Knorpel oder anderes Gewebe. Doch plötzlich wurde uns klar, dass sich diese Zellen wie die Zellen eines frühen Embryos verhielten. In dieser etwas simplen Zeichnung von mir sehen Sie hier den Rand eines Mausblastozysten. Schneidet man die innere Zellmasse heraus, erhält man den sogenannten Embryonalkörper mit undifferenzierten Zellen in der Mitte und differenzierten Zellen an der Außenseite. Und genau das geschieht natürlich in unserer Gewebekultur. Undifferenzierte Zellen verklumpen und zeigen dann diese Reaktion. Sie halten sich für Embryozellen. Und sie sind natürlich Embryozellen. Dieser Schnitt zeigt das. Sie sehen hier den Rand einer dieser Kolonien, die zu einem differenzierten, fließenden Embryonalkörper geworden ist. An der Außenseite ist das Alpha-Fetoprotein angefärbt. Das ist eine elektronenmikroskopische Darstellung, Sie sehen hier die Zellen mit der Anfärbung. Wir wussten nun also, dass wir durch Transplantation eines Embryos in eine Maus Tumore erzeugen und aus den Teratokarzinomen Kulturen züchten können. Die Zellen in diesen Kulturen würden sich wie das Mausembryo differenzieren. Sie könnten in ein Mausembryo eingeschleust und so Teil der Maus werden. Eine Kleinigkeit fehlte jedoch noch. Wenn es sich um Mausembryozellen handelt und wir diese Zellen in Kultur züchten können, sollten wir eigentlich in der Lage sein, sie auch direkt aus einem Embryo zu züchten. Die rote Linie war das fehlende Glied. Sie war seit ca. 5 Jahren das fehlende Glied, und zahlreiche Leute versuchten sich daran. Warum scheitern wir an diesem Problem? Ich habe zu diesem Thema ein Paper verfasst, auf das ich an dieser Stelle aber nicht näher eingehen möchte. Uns beschäftigten ganz andere Fragen. Gibt es nur ein sehr kurzes Zeitfenster? Nein. Würden die Zellen nach ihrer Generierung zu rasch differenzieren? Vermutlich ja. Liegen sie nur in einer geringen Anzahl vor, müssen wir daher sehr gute Klonierungseffizienzen erreichen? Ja. Mir gelang die Züchtung der Zellen erst, nachdem ich Matt Kaufman getroffen hatte. Er interessierte sich sehr für haploide Embryos. Es gibt genetische Tricks; man kann ein Mausembryo die ersten 4 oder 5 Tage im haploiden Zustand, d. h. mit nur einem Chromosomensatz züchten. Ich habe vorhin bereits erwähnt, dass man die genetischen Eigenschaften der Maus damals zwar allmählich zu entschlüsseln begann, sie jedoch noch weitgehend unbekannt waren. Eine Möglichkeit war die somatische Zellgenetik. Wenn wir Kulturzellen mit nur einem Chromosomensatz hätten, würden sie umgehend zu Hefezellen werden, und wir könnten sie mutieren und sehen, was passiert. Das wäre eine feine Sache gewesen. Ich hatte seit einer geraumen Weile versucht, Zellen aus diesen Embryos zu züchten, jedoch bis zu diesem Zeitpunkt noch keine präpotenten Zellen gewonnen. Ich züchtete jedoch andere Zelltypen. Also sagte ich zu Matt: "Natürlich können wir das machen. Du lieferst mir das haploide Embryo und ich züchte daraus Zellen. Dann schauen wir, ob sich auf diesem Wege haploide Zellen gewinnen lassen." Doch er traute mir nicht. Er war ein vorsichtiger Mann, und ich brauchte eine Weile, um ihn dazu zu bewegen, diese Embryos zu züchten. Er dachte wohl: "Ich gebe Martin erst einmal normale diploide Embryos als Kontrollen, um sicherzugehen, dass er diese Zellen auch wirklich züchten kann, bevor ich ihm meine wertvollen haploiden Embryos anvertraue." Ich erhielt also diploide Embryos von ihm. Er verfügte über eine bestimmte Technik für ihre Züchtung und die Verlängerung ihrer Lebensdauer; er stellte große zweilagige Blastozysten her, die größer waren als normale Blastozysten und daher mehr Quellzellen beinhalteten. Und siehe da, es funktionierte. Wir erhielten praktisch sofort gut erkennbare Zellen. Vergessen Sie nicht, es hatte Jahre um Jahre gedauert, diese embryonalen Karzinomzellen zu züchten. Ich wusste genau, wie sie aussehen sollten. Ich wusste genau, wie ich sie anfärben konnte. Ich wusste, welche Zellmarker sie aufweisen würden usw. Es war ganz klar: sobald wir sie hatten, hatten wir sie. Ich hoffe, das klappt jetzt. Die Folie ist ziemlich komplex, ich habe sie schon häufiger verwendet. Ich habe sozusagen für Sie geübt, aber sie funktioniert nicht so richtig. Wie steht es mit der Injektion in Mäuse? Entstanden Teratome? Ja. Erfolgte eine Differenzierung in verschiedene Gewebe? Ja. War der Karyotyp jetzt normal? Ja, sogar viel besser als die embryonalen Karzinomzellen. Konnten wir einzelne Zellen klonieren? Kein Problem. Differenzierten sie sich in vitro? Ja, sehr gut und sehr schnell. Wie sieht es mit der Erzeugung von Chimären aus? Ursprünglich hatten wir das mit Richard Gardner gemacht, jetzt stellten wir sie mit Liz Robertson und Allan Bradley her. Hier sehen Sie die in einen frühen Mausembryo, einen Blastozysten injizierten Zellen, aus denen eine Maus entsteht. In diesem Fall weist die Maus einige Marker auf; die Augen, braunes Fell, das auf den Agouti-Locus deutet, schwarzes Fell, und natürlich Merkmale im Körperinneren aufgrund der GPI-Marker. Die hier sollten eigentlich auch animiert sein – hey, los! Das ist eigentlich dasselbe Video…ich glaube, das mag er nicht! Diese Mäuse….hallo Jungs! Züchtet man mit diesen männlichen Mäusen – hier sehen Sie einen stolzen Vater mit seinem Wurf – stammen alle Jungen vom Sperma aus den Kulturzellen ab. Wir durchlaufen also die Keimbahn. Das macht einen großen Unterschied. Heute haben wir nicht nur ein Dutzend Zellen im Embryo, die in die Keimbahn übergehen, sondern können problemlos 10^7 Zellen in einer Petrischale züchten und klonieren, so dass sie in die Keimbahn gelangen. Das bedeutet, dass heute Mutagenese, gezielte Genmodifikation, genetische Selektion usw. möglich sind und wir genau die gewünschte Variante auswählen können. Damit wurden wir also in die echte Genetik eingeführt. Was geschieht, wenn man hier Veränderungen vornimmt? Ich stelle gerade fest, dass die Zeit knapp wird. Also die beste Methode ist das Gene Targeting. Ich hoffe, dass Oliver Smithies Ihnen noch mehr darüber erzählen wird. Er und Mario Capecchi, die mit mir zusammen den Nobelpreis erhalten haben, haben das Verfahren, bei dem Gene anhand passender DNA-Stücke gezielt modifiziert werden können, perfektioniert. Ich habe die Zellen hergestellt. Hier sehen Sie ein Stück vom genetischen Code, brca2. Was ist seine Aufgabe? Wir wissen es nicht; schalten wir das Gen jedoch aus, entstehen Mutantenmäuse. Ich weiß, mir rennt die Zeit davon, aber ich möchte Ihnen noch ein Experiment eines anderen Wissenschaftlers zeigen, das belegt, dass es sich tatsächlich um Genetik und nicht um „Gene Jockeying“ handelt. Ein faszinierendes Beispiel ist ein Genort namens CD22, der den Effekt moduliert, d. h. die Bindung an den B-Zell-Rezeptor inhibiert und auf diese Weise, so die Annahme, einen Immunangriff auf die roten Blutkörperchen und damit eine Hämolyse verhindert. Nach Ausschalten des Gens sollte es zu einer Hämolyse kommen. Die Zellen wurden also markiert; hier sehen Sie die Überlebensdauer im Blut. Das hier ist der Wildtyp, das der Knock-out-Typ, das die Positivkontrolle. Ja, sie werden erzeugt. Das Immunsystem schien jedoch überhaupt nicht heraufgeregelt zu sein. Nach erneutem Einschleusen der Zellen in Mäuse ohne B-Zellen bzw. Immunglobuline trat genau derselbe Verlust auf; er ist also nicht immunvermittelt. Wodurch wird er aber dann vermittelt? Transplantiert man die roten Blutkörperchen – hier sind sie – war der Verlust auch hier beschleunigt; dies ist allerdings sowohl beim Wildtyp-Wirt als auch beim CD22-Mutantenwirt der Fall. Das könnte darauf hindeuten, dass der Vorgang zellautonom ist und unter Umständen nichts mit dem Immunsystem zu tun hat. Die Autoren untersuchten noch eine weitere Knock-out-Maus und stellten fest, dass diese anscheinend nicht dieselben Milzanomalitäten aufwies, was einen schnelleren Turnover nahelegt. Daraufhin wurde die Genetik untersucht. Diese Mäuse waren auf c57 zurückgekreuzt worden, die Mutation befand sich im 129-Hintergrund. Die Autoren versuchten, die 129-DNA zu bestimmen, in der sie eine Zufallsmutation vermuteten. Hier sehen Sie dieses DNA-Stück. Bei der Untersuchung wurde jedoch ein unbekannter DNA-Abschnitt entdeckt, bei dem es sich weder um c57 noch um 129 handelte. Wie sich herausstellte, stammte er von der Wildtyp-Maus mit dem Gpi1C-Locus. Bei GPI handelt es sich ja bekanntermaßen um unseren universellen Marker. da er weder in unseren Mäusen noch in anderen Zellen vorliegt. Hier muss die Ursache des Problems liegen. GPI und CD22 sind lediglich 5 Megabasenpaare voneinander entfernt. Die Autoren sequenzierten das unbekannte DNA-Stück und stellten fest, dass tatsächlich eine Punktmutation Die Autoren zeigten außerdem, dass es sich um ein nur zu etwa 25% aktives hypomorphes Allel handelt. Hierin lag das Problem mit den roten Blutkörperchen begründet. Mir bleiben nur noch rund 4 Minuten. Welche Möglichkeiten bietet die Gentherapie? Mit Hilfe dieser Zellen lassen sich heute alle nur denkbaren Zellen in Kultur erzeugen. Können sie in der regenerativen Medizin eingesetzt werden? Können wir sie zur Verfügung stellen? Können wir Patienten, die eine Behandlung benötigen, solche Zellen transplantieren? Zunächst einmal müssen wir uns überlegen, wie Zellen beschaffen sein sollten, die uns verabreicht werden. Wir möchten natürlich Zellen, die funktionieren, aber auch Zellen, die keine Nebenwirkungen haben oder andere Infektionen auslösen. Da sie vorzugsweise auch nicht abgestoßen werden sollten, sind autologe körpereigene Zellen die beste Wahl. Vor ein paar Jahren wäre das noch ein Traum gewesen, doch aufgrund der Fortschritte in der Zellbiologie, die uns die Kontrolle des Zellschicksals ermöglichen, ist dieses Szenario heute absolut real. Yamanaka gelang es, iPS-Zellen zu erzeugen. Andere Leute haben gezeigt, dass der Weg nicht immer direkt von der adulten zurück zur embryonalen Zelle führen muss, sondern eine Transdifferenzierung über verschiedene Zelllinien hinweg erfolgen kann. Heute ist belegt, was wir immer schon wussten, dass nämlich der differenzierte Zustand tatsächlich metastabil ist und moduliert werden kann. Aus Fibroblasten lassen sich beispielsweise Kardiomyozyten, d. h. aktive Herzmuskelzellen herstellen; das ist ein weiteres interessantes Paper. Es handelt sich also um eine Zelltherapie, eine Transplantation; man muss die Immunabstoßung beobachten. Die autologe Behandlung – 'ad hominem', wie ich zu sagen pflege – ist aber der beste Ansatz. Haben wir damit die Quelle der ewigen Jugend gefunden? Humane ES-Zellen aus menschlichen Embryos sind umstritten, iPS-Zellen aus adulten Zellen dagegen weniger. Die transplantierten Stammzellen sind jedoch in beiden Fällen wahrscheinlich allogen. Dennoch würde man damit über eine ganze Palette an bereits hergestellten bzw. getesteten Zellen, d. h. spezifischen Vorläuferzellen verfügen. Man könnte auch autologe Zellen verwenden oder adulte Zellen direkt transdifferenzieren. Ist das logistisch und ökonomisch machbar? Ich denke schon. Die voraussichtlichen Kosten bewegen sich im Bereich äußerst kostspieliger medikamentöser Behandlungen; im Gegensatz zu einer lebenslangen Therapie handelt es sich dabei jedoch um einen einmaligen Eingriff, was laut Barry Marshall natürlich den Pharmaunternehmen nicht gefällt. Wir haben 2 oder sogar 3 Teratom-Varianten untersucht und dadurch fundamentale Erkenntnisse erlangt und unser biologisches Verständnis vertieft. Wir wissen auch, dass die praktische Anwendung dieses Wissens aktuell noch in den Kinderschuhen steckt. Dennoch erfahren wir immer mehr, was uns vorwärts bringt. Jetzt liegt es an Ihnen, an der nächsten Generation. Vielen Dank.

Sir Martin J. Evans (2014)

Inheritance from Teratomas

Sir Martin J. Evans (2014)

Inheritance from Teratomas

Abstract

The techniques and concepts that have resulted in the identification and isolation of embryonic stem cells have come from studies with mouse teratocarcinomas. Embryonic stem cells isolated from normal mouse embryos may be grown in tissue culture and new genetic modifications introduced into them. They may then be used to form chimeric mice, which are able to transmit the new mutations in their germ line. This has resulted in fully experimental mammalian genetics.
In addition to this genetic inheritance we might also consider the huge impacts of these ideas. Developmental cell biology now informs us about the plasticity as well as stability of the differentiated state, and stem cell biology is becoming a powerful new paradigm for clinical advances. The future of stem cell therapies will be discussed.

Content User Level

Beginner  Intermediate  Advanced 

Cite


Specify width: px

Share

COPYRIGHT

Content User Level

Beginner  Intermediate  Advanced 

Cite


Specify width: px

Share

COPYRIGHT


Related Content