Ada E.  Yonath (2011) - Climbing the Everest Beyond the Everest

The challenges associated with pursuing ribosomal crystallography can be described as a series of Everest climbing. At each step, when reaching the summit, a taller and more difficult one became exposed. Snapshots of this story will be described

After yesterday I think that I really have to show you what I called yesterday the evidence. How this project started and continued. Maybe it is as important as the result. So let’s climb the Everest beyond the Everest. I think that you all know that the Ribosome is the last chain, the last member in the chain of translating the genetic code into proteins. The genetic code is being expressed in messager RNA which is very similar to DNA but can exist as a single strand therefore it can direct the information and it is available for translation. So ribosomes are universal. Each ribosome can translate every messenger, every sequence in a similar fashion. There is a huge number of ribosomes that function in each cell. Mammalian cells can contain millions of ribosomes. This is a piece of information I didn’t know when I started. Even bacteria can reach in the low period they can reach 100,000 ribosomes functioning together. In my opinion, I'm a chemist or at least I studied chemistry, ribosomes are amazing molecular machines. They act continuously, and they can make between 15 to 40 peptide bonds in one second. I needed eight hours in the lab. You can imagine what would happen to your life if (laughing). I also needed 100°C and PH of 2. And the ribosomes can do it in every cell under almost all conditions known to support life. They also hardly make mistakes. The numbers in the literature until recently was 1:1,000,000. Today people speak also about 1:10,000. In my opinion both are admirable. The main constellation is an L-shaped double strand with an anti-codon loop that can make codon, anti-codon interactions here like (inaudible 00:02:25). They carry their amino acid far away from here, it’s about 70 angstrom always in all cells, which is coordinated to this one. So the messenger RNA is attracted and bound to the small ribosomal sub-unit, all ribosomes are made of two sub-units no matter from which cell they come. And they exist like two separated sub-units until they start functioning. So the cell has two different sub-units, two separated sub-units. They associate with each other when they have to function. The functioning is first to attract the messenger then to design the first initial codon to be translated into the translating decoding site which is called the P site tRNA site. tRNA binds to there by codon/anti-codon interactions and the proof reading machinery that everything is fine is also here in the small subunit. This is why we call the small subunit the brain of the ribosome. The hands that make the bond are in the large ribosomal subunit and this is universal and no matter which cell we are looking at. So what I just told you is shown here, the small subunit has a narrow part here. In the past also today people like to call this the head and the body and the neck of the small subunit. Messenger wraps around it. The first site to be populated is called P peptide transfer, this is tRNA. Symbolising the tRNA with the amino acid. There is another side that will be occupied afterwards call the A-site tRNA where the tRNA where amino acid will come, amino acid related tRNA. And there is an exit side from where the tRNA will go out afterwards. So once we have this all made, small subunit, messenger and tRNA and initiation factors which I don’t show here, non-ribosomal initiation factors, the large subunit can come. The surface complementary is very good but not perfect. So in order to have it perfect first of all inter-subunit bridges are being made like those. Bi-conformational changes mainly of the large subunit but not only. There are thirteen of those and I symbolise them in three triangles. When everything is fine the P-site tRNA with the amino acid is positioned so the amino acid is on the entrance of a very long tunnel that spans the large subunit. For which the newly born protein will progress and exit. So now everything is ready for the next journey. It will go now more or less sideways to this position and make a peptide bond here, which is the first bond for the newly born protein like that. So now we have a D peptide beginning of the newly born protein of the nascent chain. The first tRNA is now empty, it can go out and a new one can come in. These things happen more or less the same time but I'm just a human being I couldn't draw them at the same time. So that’s the story and it will continue, the translocation from A to B and to E is mainly in this direction. So many ribosomes act together, you can see it here, I must say that I am amazed by this electron microscope grid. Every time I look at it again it's from the ‘70s, I don’t even know who did it. I found it in the literature without reference. It shows many ribosomes, these black things, black bodies, that are bound to the same messenger RNA act continuously. You can see that each of these black things have two subunits, you can see here small large, small large, small large, small large and so on. You can see that they read the same messenger and the protein comes from the other side. The only thing that is not exactly as it happens in the cell is that the protein comes out flat. Within the cell you surely know it falls immediately when it comes out of the ribosome, either alone or with chaperones, with the aid of chaperones. So that’s the story. When we got the first structures we made a movie according to them. So the movie that you will see now was made by art students, based on our coordinates together with us with interpolation between our structure and others as it was known in 2002. So messenger comes to the small subunit, it waits for it and pay attention, now, now it comes and it took it, it’s a big conformation of change. These ones is our initiative factors, the blue ones, initiation factor three and two. The two brought the first tRNA and now we have an initiation complex, the large subunit can come and make bridges by conformational changes. And we have an active ribosome, that will accommodate the tRNAs that are brought by other factors, elongation factors on one side. And help the empty ones coming out on the other side, ribosome is really working. Peptide bond is being made here, the decoding is there. Now we take away the large subunits and you see something that I want to mention. The motion is more or less sideways. But here on the other side of the tRNA there is a conformational change. I just said I won’t be able to talk about it much today, but at least pay attention. So their proxies continues until there is a stop codon. And then the tRNAs being replaced by factors, either release factors or recycling factors. This gold thing that will come in and separate between the two subunits. The tRNAs can go home, the protein can fold, the two subunits can wait for the next job to do. So what you saw in the movie was not very clear, we know now the position of every atom in the ribosome. Molecular weight of the bacteria ribosomes is 2.5m. What you see here rotating is bacterial small subunit. They are more or less the same in all bacteria. Changes are minute, the sediment with the sedimentation coefficient of 30 so we go 30S. Total molecular weight of the small subunit is 0.85 Mega Dalton. And what you see here rotating is the complex, the RNA, the ribosomal RNA is in grey or silver. And in the small subunit of bacteria it contains about 1,600 nucleotides. The curly things, the coloured curly things mainly on the surface are ribosomal proteins. Each of them is now shown in a different colour. There are up to 21 different proteins in this small subunit, it means between 20 ~ 21. And the task of the small subunit to remind you is decoding of the genetic code. The large subunit its task is to make the peptide bond, to make sure that it’s being elongated, the nascent chain is elongated. It means it’s a polymerase and to protect the newly born protein in the tunnel that I showed earlier. Sedimentation 50 S. Total molecular weight is 1.5 millions in bacteria. Two chains of RNA total 3,000 nucleotides, one of them very long, 2,800 and the other the rest. And up to 34 different proteins. When we look at the surface that will come together in the assembled ribosome like that we see that the decoding here in the small subunit and peptide bond formation here and you can see here how they are connected by the tRNA decoding here and peptide bond here, the amino acid is bond here. We can see that the region where things are happening, the two regions here and here are made of RNA, not proteins. Only silver, which tells us that the ribosome is actually a ribozyme. It’s an RNA machine. And this is in good correlation with the ribosome composition. In all ribosomes except in mitochondria the ratio of RNA to proteins is 2:1 it means twice as much RNA. Even in mitochondria where part of the RNA is changed by proteins the active sites are preserved and they are RNA made. And this was suggested by Francis Crick back in the ‘60s was not easily digested by scientists who thought that making a bone its enzymatic reaction and enzymes are known to be proteins. Well, Francis Crick was right! What does it show us? What does it hint at? It hints that first of all usually RNA machine, ribosomes are lousy proteins, not efficient, lousy enzymes. Not efficient enzymes. There are not many known today and all of them are rather slow and sometimes not very selective. The ribosome as I said earlier is an extremely efficient machine. So nature found a way to improve the ribosomes, to improve the RNA machine and make it efficient. Nature can find ways when it’s needed. Second it shows that RNA existed before proteins. I want to talk about it for a second. We think that within this complex ribosome we identified a little, a little piece. It looks here large because we zoom on it but it’s actually not more than 3 or 4% of the whole RNA, of the ribosome depending if it’s bacteria or higher organisms. This region can make the peptide bond and it is in our opinion a remnant of the prebiotic machinery for bonding. That is still functioning today in the modern ribosome. We are very excited about this finding and we are trying now to understand it better and to prove it. On what do we base our thinking? I cannot go into the whole thing now I just tell you the most important two facts. First of all it can make peptide bonds, the whole machinery is there. Second, it has an incredible conservation. So out evolution 98% conservation. The last is that when we look only at that machine from a chemical point of view it is stable, it can make the bond right here and it has orientation that can support itself. So that’s what we call the pocket. Unfortunately I can’t talk about it today. But, from this we studied something, or we can suggest something. It’s a question that the world is busy, what was first the chicken or the egg? The DNA, the genetic code or the proteins? Or the machines of life. Well in our opinion first was the ribosome, not the genetic code, neither the proteins. Okay ribosome is the target for antibiotics, the natural antibiotics are weapons that bacteria from one type uses for eliminating other types. And because the ribosomes are so important producing the proteins they are target for many antibiotics that are of clinical use. Over 40% of the useful antibiotics target protein biosynthesis. We like to compare between the ribosome and antibiotics to David and Goliath. David this little kid had a very small stone and he had to eliminate this huge Goliath that was mainly covered and protected. So he aimed at the forehead because the forehead was exposed and important. He didn’t aim at the hands for instance. He was successful. Because he touched a function, a very important function of sight. The reason that we compare or we like to discuss it like that is the molecular weights. Antibiotics are less than a 1,000 ribosome, bacterial ribosome which are the ribosomes that we want to hamper, they are 2.5m. How does it happen exactly like the stone of David? The antibiotics hit the ribosome at its functional sites. It disturbs the function. So here are some ribosomal antibiotics that are bound in their binding position to the small subunit where the messenger binds or where the tRNA has to be decoded. All those that allow the motion that is associated with it, and in the large subunit again those that allow the motion, you remember in the movie there were hands going in and out. These disturb the motion or in the active site or at the tunnel for which the proteins go. I want to discuss only a few of them. First what you see rotating is the large subunit RNA in blue and all proteins in green. The three colour things inside, the magenta is Chloramphenical that binds to the A-site. To the lower part of the A-site. In yellow is Clindamycin that disturbs the creation of the peptide bond. And in red is Erythromycin that binds to the tunnel. Erythromycin is the first antibiotic that targeted ribosome that came into use. And I want to show where it binds. So first let’s look at the tunnel. Here is the large subunit, with A and P tRNAs in it, a bond will be made here. And the tunnel is highlighted here but modelled polyaniline. So the tunnel has an uneven shape, and near the constriction the narrowest part is the binding point of erythromycin and the family that came afterwards is called macrolides. You can see here what we mean by blocking the tunnel. So protein will be made here, what you see here is a section for the ribosome like we'd like to do with apples. Peptide bond is being made here, protein will go through the tunnel if it’s not stopped by erythromycin. Looking into the tunnel from top this is the large subunit, entrance to the tunnel a little bit lower, erythromycin blocks most of it so protein cannot go through. Macrolides are made of a ring, the normal macrolide erythromycin 14 members and 2 sugars. Erythromycin was found to be a very, very successful and very useful antibiotic when it came into use in the last century, in the middle. But not very stable in acid solutions which is the stomach. And companies modified it to make the stability higher in two positions. I want to show you want happened. The first is looking at entrance to the tunnel, what you see here is the whole RNA of the large subunit. Because the antibiotic macrolides bind only to RNAs, I can show just RNA. Entrance to the tunnel I zoom it erythromycin binding way. To take several more binding modes but all of them are blocking the tunnel with more or less the same way, it shows that there is flexibility even in binding depending on how the experiment was done. However, the binding, the anchors are the same. Addition of clarithromycin better blocker and more stable, addition of a longer arm is roxithromycin that better blocks and is more stable in the tunnel because it has more anchors. And maybe this provides to my understanding only the first time for antibiotics the structural basis for dosing. So in many cases 150mg of roxithromycin twice daily has the same effect as 500mg of erythromycin four times a day. So it’s 1:6, it’s very impressive. So I already say that all antibiotics bind to ribosomal functional sites. I also say ribosomal functional sites are highly conserved. Mandatory for clinical use is the distinction between the pathogen and the patient, we want to kill the pathogen not the patient. So if we target ribosomes without distinction it’s a problem. How do the antibiotics differentiate between patients and pathogen, by subtle differences, I want to show you one. So here is section through the tunnel, these are the tunnel walls. You cut it like that. And you already saw that it has an uneven shape. So in grey is the tunnel. Inside here are all types of structures of antibiotics from the macrolide family, erythromycin family that block the tunnel perfect, almost perfect but always very good. And only one nucleotide is being highlighted A2058 nomenclature according to e-coli. A2058 is the name of the game, it’s adenine in new bacteria. Adenine, erythromycin very high chemical affinity here. All pathogens are new bacteria. So all pathogen can bind this way. Have a look here, this is us, all higher animals. G instead of A in this position. But when there is a G here, this is the only difference when there is a G here there is rejection based on two short contacts and no binding. That’s all. So I showed you how the differentiation is made, now I have to talk about the problem, which is resistance. And resistance is a very, very acute problem in modern medicine. How do the pathogens acquire resistance? Prominent way is to hit the anchors. Like here, you remember 2058 now you see it from the other side. An erythromycin these are good contacts and this is the basis for selectivity. It’s also the basis for resistance. So the bacteria, the pathogens can change their own genome from A to G, or they can make a post translational modification, ERM modification which is methylation in this position. Most mechanisms are really involving the modification of such anchors but there are some that are mediated by remote changes and I want to show you an example. So again you see here the tunnel. You can see it now in the whole ribosome, it is here. And you can see that the tunnel walls are made mainly of RNA but there are two proteins that their tips are getting into the tunnel wall, here you can see here. Macrolide binding site is more or less here, those are below it. Yet, it was found already in the ‘70s that minute mutations in these two proteins L22 and L4 can acquire resistance to erythromycin although L22 and L4 are not part of the binding site. And although the resistant mutants bind erythromycin. So how does it happen? We really wanted to know it, in collaboration with Dr. Janice we got this mutant in the ribosomes that we can crystallise, we have crystals now for the mutants and what we found is that this minute changes did not really change much in the protein position. But triggered a whole chain of changes in the RNA walls. So that the tunnel can now accommodate erythromycin and the newly born protein. So this is a way that we didn’t know about until recently. What do people, companies do in order to combat resistance? I think that always it will be only partially combat, maybe controlling it. Because bacteria wants to live, but what do we do? Sometimes there are new compounds with additional anchors or synergies that have two compounds together. For instance additional anchors or higher flexibility is shown in azithromycin by the addition of one atom. Just compare this to erythromycin almost the same chemistry. And it’s one of the most successful antibiotics, it also works against resistant strains. But I was worried when I heard about it, that the Croatian group developed it. Because if it binds resistant strains that have G instead of A it will also bind to the patient. So what did we get? Luckily I was wrong, and this you can see by comparing the binding of azithromycin to a model for pathogens, the green, and to a model for patients the H. I cannot talk much about it here and now but you can see the binding happens. But sometimes it’s along and sometimes it’s across. This shows that binding, 2058 is only showing if there is binding but not how. Two compounds, there is one commercially available drug called Synercid, it has two compounds, one in the active side and one in the tunnel. You want to see how it binds, here is the tunnel wall one and second they glue each other and they block the tunnel. Make me a bit happier and we looked for another one. So Synercid is what I showed you, this is another one. Two compounds, pair of compounds produced by one drug that goes in Sri Lanka, this is why it’s called Lankacidin and Lankamycin. We found that both of them bind together, that the interaction between them is very strong and they introduce also conformational change. So we have some hopes about that. Also we found that Lankamycin which is binding to Lankacidin is very similar to erythromycin, yet erythromycin is a competitor whereas Lankamycin is a binder. And this gives us a tool to make the coupling better. So a movie that may work of how some of the antibiotics that we know today work, Edeine doesn’t let messenger binding. The next one will be Tetracycline that doesn’t let a-site tRNA binding by occupying the space, the position here. The third one is erythromycin that we discussed. This is erythromycin, the last one is clindamycin that doesn’t let the bond being made. So a minute about inspiration. We are using crystallography I think that you all know that by using x-ray crystallography we can see details that we cannot see otherwise. The idea is we have crystals, we get diffractions in all directions, we collect it and we make if we know how to collect them together and face them we do it correctly, we merge them correctly we get electron density maps and since x-rays are interacting with the electrons we know from there where the atoms are. And I really don’t go into details just see what I mean by diffraction. So here there is a crystal beam comes in, and is diffracted to all types of directions with all types of intensities. But we need crystals. And crystals are entities that have perfect order on three dimensions or almost perfect order. So in salt, sodium chloride is no problem. In the middle of last century people started to get crystals even of proteins and a 6th grader could repeat it so it’s possible, this is lysozyme. That was crystallised even by a child now. But those ribosomes that are so complicated and you saw that they are very flexible. I didn’t say that they deteriorate fast, there was a big question mark when we started actually the question mark was negative. It cannot be done. And these are the reasons that I told you earlier, the most important one in my idea is the marked tendency to deteriorate. They deteriorate very quickly within one to four days in the test tube or in the body. So why did I being young, almost your age, why did I start it? Because I had a chance to read, even not only scientific, I read about the delegation that went to the North Pole and looked at the metabolism of the sleeping bears. And they found that while they were sleeping the ribosomes are orderly packed inside their membranes. ribosomes can be orderly packed. Every bear every winter, it’s not an accident. Why do they do this? This is what I thought because I thought this is the way to keep a large pool of active ribosomes because when they get up they want to do things they didn’t do when they were sleeping and they need proteins. So that more or less what you can see here. I was not the only one that read it, many other groups read it for instance people used this finding in order to make crystals or mono-layers actually on membranes. You know what they did? They took fertilised eggs they put them in the fridge and in three minutes they had this beautiful order. So people thought that the organisation is because of cold, because of cooling, I thought that it’s general stress and it was shown later that also bad diet does it. But anyway this happens in the cell and all what we wanted to do is to make it in the test tube and use ribosomes from bacteria. Not from bears and not from fertilised eggs. So the solution was to crystallise ribosomes from bacteria that live under harsh conditions. And to use procedure that extend the life a little bit, I was lucky, I found a one like this. I want to show you harsh conditions for instance the Dead Sea, the lowest point in the world. It’s in Israel, you can see it from top, you can see it closer. These are salt crystals that come out of the very saturated sea. But even on them bacteria grow. You see here some colonies that grow on the salt, you can see it even better here. The level of water here is much lower, it’s September. This was the level of water in January about 70cm, they still grow. So we found this could be good ones or these that grow in sewages off atomic virus, deinococcus radiodurans that can grow also on dust in hunger, heat, cold because only quarter of it is functional and the other four are packing their DNA and will come into action when one quarter has to be repaired. They also have all the repair mechanisms of the known today. And to use the procedures as I said earlier. Using these procedures we could see even after a day evidence for organisation. This is an electron micrograph of a drop that we put for crystallisation. You see here order. So even we could do it in the lab. So yesterday we talked about persistance and belief. I say faint but solid evidence were given all the way through. I want to show you also only a few of them. So the curiosity was the reason but the evidence was the driving. We wanted to get this picture, in the beginning we got that, and this was for me good enough because it had some evidence for high resolution. And when we cut it, it was very ordered. We looked at it, you see the benefit of working on very large particles is that you can see them in an electron microscope. So we could see the order inside. We needed twenty-five different conditions but it was not difficult it took only four months. Because we devised a way, a matrix to watch it and when we found the region for instance the pH region where we started to see the difference between solubitiy and sedimentation we transferred it to capillaries and look how large the crystals became. Were not still good but we developed. And look how nice they were ordered inside. So I don’t want to tell you about all the types of crystals that you can see from the inside, I will show you in a minute from the outside. We went from this to this, you remember what we desired, I showed in the beginning. So this was our desire. This is the story. In four years after we started we had a few stops first time, still far but much more than in the first days. And then we got really good crystals, many good crystals that could be exposed. We went to synchrotron to measure, these are facilities where particles are being accelerated and we see it on the tangential in stations and measure. And we found six years after we started we had good crystals, very, very fantastic diffraction. But after 0.1 of a second it disappeared. The decay was very large and then we failed here comes the Everest. We climbed an Everest, we have good crystals, fantastic but only there we found the way still very far, the real Everest is still in front of us. So we could stop then, we did not. We thought why is there damage, I can’t go into detail but the main thing is damage happens by x-rays heating peptide bonds or any bonds and we can only try to minimise the progression. We did it by cryo temperature, look at my face when the experiment started. In Stanford 1986, I was not very hopeful. But this was the breakthrough. And today with informants it became routine in the whole world and today almost all the structures are measured this way. So we have wonderful diffraction and the whole world has many more structures. So this is when we introduced cryo-crystallography together with some other developments for phasing and detectors. Please multiply this by thousand and see how many structures are now in the world. PDB, is protein databank deposition, each of them is a structure. So the thanks and I said yesterday that there were only a few people that could grasp the potential of this work. They didn’t really believe like I, they still doubted but they suggested it to the Weizmann Institute President and they let me work for a long time on a project that was considered maybe or may be not. So Sir John Kendrew, Chris Anfinsen and Alex Rich and the president Michel Sela and Haim Harari. The whole work started as I said before in Max Planck in Berlin together with Dr. Wittmann that was crazy about knowing the structure of the ribosomes. He also helped us to have a work in Hamburg near the synchrotron. He died rather early and was replaced by Franceschi and Fucini. Now because we had two research groups at the same time I am thanking for the young members there for their devotion and determination. In good and in more than this bad times. You can see the Hamburg group, with their angels, our technicians and looking for better bacteria in the Dead Sea. And you can see the Israeli group that is still functioning, it’s run by Dr. Anat Bashan, she is the senior scientist. I can’t tell you what everybody did but everybody contributed, what you see here is the collection of the last three years. But I want you to look at Tamara, Tamara Auerbach she came to us thirteen years ago for ten weeks, she’s still there. She came as a bachelor, she’s still, she now has three kids. But the day I took a picture and this is the important thing, she had her birthday and she baked a cake. And this is her cake which shows that for my group cake ribosomes are considered sweet. I also want to thank my family that supported me for the whole time, it’s the whole family but I want to focus on my granddaughter. And the reason I'm doing it is for you young female that hesitate whether it’s possible to do science and have a family. Have a look, you know what she’s saying, this is a speech she gave without telling me in Paris. As you know she’s very busy, she means me, but she always finds time for me. And at age of five she invited me to her kindergarten to explain what ribosomes are. At the age of ten she gave me the most important prize in my life: The grandma of the year is Ada Yonath. There is no year, and she told me I have to reprove myself every year which means it’s a loving but demanding family. When I fail she will take it off. Thank you.

Ich erzähle Ihnen noch etwas mehr über Inspiration. Nach dem gestrigen Tag möchte ich Ihnen unbedingt zeigen, was ich gestern als Evidenz bezeichnet habe, also wie dieses Projekt begann und weiterging. Vielleicht ist das genauso wichtig wie das Ergebnis selbst. Lassen Sie uns also den Mount Everest jenseits des Mount Everest erklimmen. Ich denke, Sie alle wissen, dass das Ribosom die letzte Kette, das letzte Glied in der Kette der Translation des genetischen Codes in Proteine ist. Der genetische Code wird in der Boten-RNA exprimiert, die der DNA sehr ähnlich ist, aber als Einzelstrang existieren kann. Deshalb stehen die Informationen darauf zur Translation zur Verfügung. Ribosomen sind also universell. Jedes Ribosom kann jeden Botenstoff, jede Sequenz in ähnlicher Weise translatieren. In jeder Zelle arbeitet eine Vielzahl von Ribosomen. Säugetierzellen können Millionen von Ribosomen enthalten. Diese Informationen hatte ich anfangs noch nicht. Selbst Bakterien erreichen in der Log-Periode 100.000 Ribosomen, die zusammenarbeiten. Für mich als Chemikerin - zumindest habe ich Chemie studiert - sind Ribosomen erstaunliche molekulare Maschinen. Sie agieren kontinuierlich und sind in der Lage, zwischen 15 und 40 Peptidverbindungen pro Sekunde herzustellen. Im Labor habe ich dazu acht Stunden benötigt. Sie können sich vorstellen, was im tatsächlichen Leben passieren würde, wenn. Ich brauchte zudem 100°C und einen pH-Wert von 2. Die Ribosomen funktionieren aber in jeder Zelle und unter fast allen Bedingungen, die bekanntermaßen Leben unterstützen. Und sie machen kaum Fehler. In der Literatur wurde bis vor kurzem eine Zahl von 1:1.000.000 genannt. Heute spricht man auch von 1:10.000. Aus meiner Sicht sind beide Zahlen erstaunlich. Die Hauptkonstellation ist ein L-förmiger Doppelstrang mit einer Anticodon-Schleife, die Codon-Anticodon-Interaktionen erzeugen kann, hier wie (unverständlich). Von hier transportieren sie ihre Aminosäure über weite Entfernungen - das sind immer rund 70 Angström - in alle Zellen. Diese hier ist genetisch verwandt mit dieser. Die Boten-RNA wird also von der schmalen ribosomalen Untereinheit angezogen und an diese gebunden. Alle Ribosomen bestehen aus zwei Untereinheiten, egal, von welcher Zelle sie stammen. Und sie existieren wie zwei voneinander getrennte Untereinheiten, bis sie zu arbeiten beginnen. Die Zelle hat also zwei verschiedene Untereinheiten, zwei getrennte Untereinheiten. Sie verbinden sich, wenn sie ihre Funktion ausüben. Ihre Funktion besteht darin, zunächst den Botenstoff anzuziehen, dann ein erstes Codon zu entwickeln, das in die translatierende Dekodierstelle translatiert wird, die P-Stellen-tRNA-Stelle genannt wird. tRNA bindet sich dort durch Codon/Anticodon-Interaktionen. Und die Korrekturmaschine, die überprüft, ob alles in Ordnung ist, befindet sich ebenfalls hier in der kleinen Untereinheit. Deshalb bezeichnen wir die kleine Untereinheit als das Gehirn des Ribosoms. Und die "Hände", die die Verbindung herstellen, befinden sich in der großen ribosomalen Untereinheit. Und das ist immer so, egal, welche Zelle wir betrachten. Was ich Ihnen gerade erzählt habe, ist hier zu sehen. Die kleine Untereinheit weist hier eine Verengung auf. Früher und auch heute noch wird dies gerne als der Kopf, der Körper und der Hals der kleinen Untereinheit bezeichnet. Der Botenstoff wickelt sich darum. Die erste zu besetzende Stelle wird als P, Peptid-Transfer, bezeichnet. Das ist das tRNA, es symbolisiert das tRNA mit der Aminosäure. Es gibt eine weitere Stelle, die danach besetzt wird und als A-Stellen-tRNA bezeichnet wird. Sie wird mit der Aminosäure besetzt, der aminosäure-gestützten tRNA. Und dann gibt es eine Austrittsstelle (E), an der die tRNA später austritt. Wenn also das alles vorhanden ist - kleine Untereinheit, Botenstoff und tRNA sowie die Initiierungsfaktoren, die ich hier nicht vorstelle, nicht-ribosomale Initiierungsfaktoren - kann die große Untereinheit dazukommen. Die Oberflächenkomplementarität ist sehr gut, aber nicht perfekt. Zwecks Perfektionierung werden zunächst Brücken zwischen den Untereinheiten gebaut, wie hier zu sehen. Dies geschieht hauptsächlich, aber nicht nur, durch Konformationsveränderungen der großen Untereinheit. Es gibt dreizehn solcher Brücken und ich symbolisiere sie mit den drei Dreiecken. Wenn alles richtig läuft, ist die P-Stellen-tRNA mit der Aminosäure so positioniert, dass sich die Aminosäure am Eingang eines sehr langen Tunnels befindet, der sich auf die gesamte große Untereinheit erstreckt. Über diesen Weg bewegt sich das neu entstandene Protein und tritt aus. Jetzt ist also alles für den nächsten Abschnitt der Reise vorhanden. Diese führt jetzt mehr oder weniger seitwärts zu dieser Position. Und das Protein stellt an dieser Stelle eine Peptidbindung her, die erste Bindung für das neu entstandene Protein. Wir haben jetzt also ein D-Peptid, den Beginn des neu entstandenen Proteins der neu entstehenden Kette. Das erste tRNA ist jetzt leer. Es kann austreten und ein neues eintreten. Diese Vorgänge geschehen mehr oder weniger gleichzeitig. Aber weil ich nur ein Mensch bin, konnte ich das nicht als Gleichzeitigkeit darstellen. Das ist also die Geschichte. Und sie setzt sich fort, die Translokation von A nach B und nach E erfolgt hauptsächlich in dieser Richtung. Viele Ribosomen agieren also gemeinsam, wie hier zu sehen ist. Und ich betrachte dieses Elektronenmikroskopgitter jedes Mal wieder mit Staunen. Es stammt aus den 1970er Jahren. Ich weiß nicht einmal, von wem es stammt. Ich fand es in der Literatur ohne entsprechenden Hinweis. Es zeigt viele Ribosomen, diese schwarzen Dinger hier, diese schwarzen Körper, die an dieselbe Boten-RNA gebunden sind und kontinuierlich agieren. Sie sehen, dass diese schwarzen Dinger alle aus zwei Untereinheiten bestehen, jeweils Klein/Groß, Klein/Groß, Klein/Groß usw. Sie sehen, dass sie denselben Botenstoff codieren, und das Protein kommt von der anderen Seite. Das einzige, was nicht exakt so ist wie in der Zelle, ist, dass das Protein flach austritt. Denn in der Zelle, das ist bekannt, fällt es direkt in sich zusammen, wenn es aus dem Ribosom, entweder allein oder mit Chaperonen, mit der Hilfe von Chaperonen austritt. Das also passiert. Als wir die ersten Strukturen kannten, haben wir einen Film darüber gedreht. Der Film, den Sie jetzt sehen werden, wurde gemeinsam mit Kunststudenten auf der Grundlage unserer Koordinaten und unter Berücksichtigung einer Interpolation zwischen unserer Struktur und anderen, 2002 bekannten Strukturen hergestellt. Der Bote nähert sich also der kleinen Untereinheit (schauen Sie genau hin, jetzt), hier kommt er ... und er hat's geschafft. Das ist eine enorme Konformationsveränderung. Das hier sind unsere vier Initierungsfaktoren, die Blauen, Initiierungsfaktoren 3 und 2. Die beiden brachten das erste tRNA. Und jetzt entsteht ein Initiierungskomplex, die große Untereinheit kann dazukommen und durch Konformationsveränderungen Brücken herstellen. Und wir haben ein aktives Ribosom, das die tRNAs unterbringen wird, die durch andere Faktoren, Elongationsfaktoren an einer Seite, eingebracht werden, und den leeren tRNAs auf der anderen Seite beim Austritt hilft. Ribosomen sind wirklich fleißig. Die Peptidbindung wird hier hergestellt, die Dekodierung erfolgt hier. Jetzt nehmen wir die großen Untereinheiten weg und hier sehen Sie etwas, auf das ich Sie aufmerksam machen möchte. Die Bewegung erfolgt mehr oder weniger seitwärts. Aber weiter unten hier auf der anderen Seite der tRNA erfolgt ein Konformationswechsel. Ich habe eben erwähnt, dass ich hier heute nicht viel dazu sagen kann, aber ich wollte Sie wenigstens darauf aufmerksam machen. Dieser Vorgang setzt sich solange fort, bis ein Stopp-Codon auftritt. Und dann werden die tRNAs durch Faktoren, entweder Freisetzungsfaktoren oder Recyclingfaktoren, ersetzt - dieses goldene Element, das hinzukommt und die Trennung zwischen diesen beiden Untereinheiten vornimmt. Die tRNAs haben ihre Funktion erfüllt, das Protein kann sich falten und die beiden Untereinheiten warten auf ihre nächste Aufgabe. Was Sie in dem Film, den Sie gerade gesehen haben, nicht ganz deutlich wurde: Wir kennen jetzt die Position jedes Atoms im Ribosom. Die Molekularmasse der bakteriellen Ribosomen beträgt 2,5 Millionen. Was sich hier dreht, ist die bakterielle, kleine Untereinheit. Die sind in allen Bakterien mehr oder weniger gleich. Die Veränderungen sind sehr gering, das Sediment verändert sich mit einem Sedimentationskoeffizienten von 30, also 30S. Die Gesamt-Molekularmasse der kleinen Untereinheit beträgt 0,85 Megadalton. Und was sich hier dreht, ist die komplexe RNA, die ribosomale RNA in Grau oder Silber. Und in der kleinen Untereinheit von Bakterien enthält sie rund 1.600 Nukleotide. Die gekräuselten Elemente, die farbigen gekräuselten Elemente, hauptsächlich auf der Oberfläche, sind ribosomale Proteine. Jedes wird jetzt in einer anderen Farbe dargestellt. In dieser kleinen Untereinheit gibt es bis zu 21 verschiedene Proteine, das heißt 20 ( 21. Und die Aufgabe der kleinen Untereinheit, Sie erinnern sich, ist die Dekodierung des genetischen Codes. Die Aufgabe der großen Untereinheit besteht darin, die Peptidbindung herzustellen, sicherzustellen, dass die entstehende Kette verlängert wird - es erfolgt also eine Polymerase - und darin, das neu entstandene Protein im Tunnel, den ich bereits gezeigt habe, zu schützen. Sedimentationskoeffizient ist 50 S. Gesamt-Molekularmasse in Bakterien ist 1,5 Megadalton. Zwei RNA-Ketten ergeben 3.000 Nukleotide, eine davon sehr lang, 2.800, der Rest entfällt auf die andere. Und bis zu 34 verschiedene Proteine. Und wenn wir uns die Oberfläche anschauen, die in dem zusammengebauten Ribosom, wie hier zu sehen, entstanden ist, dann haben wir hier die Dekodierung in der kleinen Untereinheit und die Peptidbindung hier. Und hier sehen Sie, wie sie durch die tRNA-Dekodierung hier und die Peptidbindung hier verbunden sind. Die Aminosäure ist hier gebunden. Wir können erkennen, dass die Region, in der die Dinge geschehen, die beiden Regionen hier und hier, aus RNA bestehen, nicht aus Proteinen. Nur Silber, was darauf hinweist, dass das Ribosom tatsächlich ein Ribozym ist. Das ist eine RNA-Maschine. Und das korreliert gut mit der Zusammensetzung des Ribosoms. In allen Ribosomen, außer in Mitochondrien, ist das Verhältnis RNA zu Proteinen 2:1, also doppelt so viele RNAs. Selbst in Mitochondrien, in denen ein Teil der RNA durch Proteine ersetzt wird, werden die aktiven Stellen erhalten und die bestehen aus RNA. Das wurde bereits in den 1960er Jahren von Francis Crick vermutet und war für Wissenschaftler, die dachten, dass die Entstehung eines Knochen eine enzymatische Reaktion ist und Enzyme bekanntermaßen Proteine sind, schwer verdauliche Kost. Nun, Francis Crick hatte Recht! Was zeigt uns das? Worauf weist es uns hin? Zunächst darauf, dass die übliche RNA-Maschine, dass also die Ribosomen gemeine Proteine sind, keine effizienten, gemeinen Enzyme. Bis heute sind nicht viele bekannt. Und viele davon sind ziemlich langsam und zum Teil auch nicht sehr selektiv. Das Ribosom ist, wie ich bereits erwähnte, ist eine extrem effiziente Maschine. Die Natur hat also einen Weg gefunden, die Ribosomen zu verbessern, die RNA-Maschine zu verbessern und sie effizient zu gestalten. Die Natur findet also Lösungen, wenn es nötig ist. Zum Zweiten zeigt es, dass die RNA vor den Proteinen existierte. Darüber möchte ich einen Moment reden. Wir glauben, dass wir aus diesem komplexen Ribosom ein kleines, ganz kleines Stück identifiziert haben. Es sieht hier groß aus, weil wir es vergrößert haben. Aber in Wirklichkeit macht es nicht mehr als 3 bis 4% der gesamten ribosomalen RNA aus, und zwar abhängig davon, ob es sich um Bakterien oder um höhere Organismen handelt. Diese Region kann die Peptidbindung herstellen und es ist nach unserer Einschätzung ein Überbleibsel des präbiotischen Bindungsmechanismus, der heute noch im modernen Ribosom funktioniert. Diese Entdeckung hat uns sehr fasziniert. Jetzt versuchen wir, diesen Mechanismus noch besser zu verstehen und nachzuweisen. Was liegt unserer Vorstellung zugrunde? Ich kann jetzt nicht auf alles eingehen. Ich nenne Ihnen aber die beiden wichtigsten Fakten. Zum einen kann er Peptidbindungen herstellen. Die gesamte Maschinerie dafür ist vorhanden. Und zum Zweiten hat er eine unglaubliche Erhaltungsrate. Und der letzte Punkt ist, dass der Mechanismus unter rein chemischen Gesichtspunkten stabil ist. Er kann die Bindung genau hier herstellen und hat eine Ausrichtung, die sich selbst stützt. Wir bezeichnen das als Bindungstasche. Leider kann ich darauf heute nicht näher eingehen. Aber ausgehend hiervon können wir weitere Untersuchungen und Vermutungen anstellen. Es geht um eine Frage, die die Welt immer wieder beschäftigt. Was war zuerst, die Henne oder das Ei? Die DNA, der genetische Code oder die Proteine? Oder die Lebensmechanismen? Nun, nach unserer Erkenntnis kam das Ribosom zuerst, nicht der genetische Code, nicht die Proteine. Okay, das Ribosom ist das Target für Antibiotika. Natürliche Antibiotika sind Waffen, die Bakterien eines Typs zur Beseitigung von Bakterien eines anderen Typs benutzen. Und weil die Ribosomen so wichtig bei der Erzeugung von Proteinen sind, sind sie in der klinischen Anwendung das Target für viele Antibiotika. Über 40% der nützlichen Antibiotika zielen auf die Protein-Biosynthese ab. Wir vergleichen das Verhältnis zwischen Ribosom und Antibiotika gerne mit David und Goliath. David, dieser kleine Junge, hatte nur einen sehr kleinen Stein, um diesen riesigen Goliath zu bekämpfen, dessen Körper fast vollständig mit Schutzschildern bedeckt war. Deshalb zielte David auf die Stirn ab, weil sie frei lag und wichtig war, und nicht etwa auf die Hände. Und er war erfolgreich, weil er eine Funktion, die sehr wichtige Funktion der Sehkraft außer Kraft setzen konnte. Der Grund, warum wir diesen Vergleich lieben, sind die Molekularmassen. Antibiotika haben eine Molekularmasse von unter 1.000. Die Ribosomen, die bakteriellen Ribosomen, die wir bekämpfen wollen, haben eine Molekularmasse von 2,5 Millionen. Wie funktioniert dies nun genau? Exakt wie mit dem Stein von David. Die Antibiotika treffen das Ribosom an seiner funktionellen Stelle. Sie zerstören die Funktion. Hier sind einige ribosomale Antibiotika zu sehen, die in ihrer Bindungsposition an die schmale Untereinheit angedockt haben, wo der Botenstoff bindet oder wo das tRNA dekodiert werden muss. Und hier sind alle zu sehen, die die damit verbundene Bewegung ermöglichen, und auch hier in der großen Untereinheit wieder die, die die Bewegung ermöglichen. Sie erinnern sich vielleicht daran, wie sich in dem Film "Hände" herein und heraus bewegten. Diese stören die Bewegung an der aktiven Stelle oder am Tunnel, zu dem sich die Proteine hinbewegen. Ich möchte nur auf einige von ihnen näher eingehen. Zunächst: Was sich hier dreht, ist die große Untereinheit RNA, in blau, und alle Proteine, in grün. Die drei farbigen Elemente innen sind in Magenta das Chloramphelicol, das an die A-Stelle bindet, an den unteren Teil der A-Stelle; in Gelb das Clindamycin, das die Entstehung der Peptidbindung verhindert; und in Rot das Erythromycin, das an den Tunnel bindet. Erythromycin ist das erste auf Ribosom abzielende Antibiotikum, das jemals eingesetzt wurde. Ich möchte Ihnen zeigen, wo es bindet. Lassen Sie uns zunächst den Tunnel anschauen. Hier ist die große Untereinheit mit A- und P-tRNAs im Innern. Eine Bindung erfolgt hier. Und der Tunnel ist hier durch modelliertes Polyanilin hervorgehoben. Der Tunnel hat also eine ungleichmäßige Form. Neben der Verengung, der engsten Stelle, befindet sich der Bindungspunkt von Erythromycin und aller Familien, die danach kamen und die wir als Makrolide bezeichnen. Hier sehen Sie, was wir mit einer Tunnelsperre meinen. Das Protein entsteht also hier, und was Sie hier sehen, ist ein Querschnitt des Ribosoms, wie durch einen Apfel. Die Peptidbindung wird hier hergestellt, das Protein passiert den Tunnel, wenn es nicht vom Erythromycin daran gehindert wird. Ein Blick in den Tunnel von oben: Dies ist die große Untereinheit, der Eingang zum Tunnel ein bisschen tiefer, Erythromycin blockiert den größten Teil, sodass das Protein nicht passieren kann. Makrolide bestehen aus einem Ring. Das normale Makrolid Erythromycin besteht aus 14 Ringgliedern und zwei Zuckern. Erythromycin hat sich seit seiner ersten Verwendung Mitte des letzten Jahrhunderts als ein sehr, sehr erfolgreiches und sehr nützliches Antibiotikum erwiesen. Allerdings verliert es in Säurelösungen, also im Magen, an Stabilität. Deshalb haben die Hersteller das Erythromycin an zwei Positionen so modifiziert, dass die Stabilität erhöht wird. Ich möchte Ihnen zeigen, wie man das gemacht hat. Zunächst ein Blick auf den Eingang des Tunnels. Sie sehen hier die gesamte RNA der großen Untereinheit. Weil die antibiotischen Makrolide sich nur mit RNAs binden, zeige ich nur RNA. Also der Eingang zum Tunnel (ich vergrößere das), der Erythromycin-Bindungspfad. Heute gibt es weitere Bindungsvarianten, aber alle blockieren den Tunnel mehr oder weniger in der gleichen Weise. Es hat sich herausgestellt, dass es in der Bindung selbst eine Flexibilität gibt, abhängig davon, wie man das Experiment durchgeführt wurde. Dennoch war die Bindung, waren die Verankerungen immer gleich. Durch Zugabe eines Methyls entsteht Clarithromycin, ein besserer Blockierer und stabiler. Durch Zugabe eines längeren Arms entsteht Roxithromycin, das den Tunnel besser blockiert und stabiler ist, weil es über eine größere Zahl von Ankern verfügt. Und dies liefert nach meinem Verständnis erstmals die strukturelle Grundlage für eine gezielte Dosierung von Antibiotika. In vielen Fällen hat eine zwei Mal täglich erfolgende Verabreichung von 150 mg Roxithromycin den gleichen Effekt wie 500 mg Erythromycin vier Mal täglich. Also ein Effekt von 1:6, das ist sehr beeindruckend. Wie ich bereits sagte, binden sich alle Antibiotika an ribosomale Funktionsstellen. Ich erwähnte auch, dass ribosomale Funktionsstellen hochkonserviert sind. Entscheidend für den klinischen Einsatz ist die Unterscheidung zwischen Krankheitserreger und Patient. Wir wollen den Krankheitserreger, nicht den Patienten vernichten. Wenn wir also unterscheidungslos auf Ribosomen abzielen, ist das ein Problem. Wie unterscheiden die Antibiotika zwischen Patient und Krankheitserreger? Durch subtile Unterscheidungen, ich möchte Ihnen eine vorstellen. Dies hier ist ein Querschnitt durch den Tunnel, das hier sind die Tunnelwände. Der Schnitt erfolgt so. Und Sie haben bereits gesehen, dass der Tunnel ungleichmäßig geformt ist. Das Graue also ist der Tunnel. Und hier im Innern befinden sich alle Arten von Strukturen von Antibiotika aus der Makroliden-Familie, der Erythromycin-Familie, die den Tunnel perfekt blockieren, fast perfekt, aber immer sehr gut. Aber nur ein Nukleotid ist hervorgehoben, genannt das A2058 nach dem e-Coli. A2058 ist das neue Losungswort. Es ist Adenin in neuen Bakterien. Hier Adenin, Erythromycin mit sehr hoher chemischer Affinität. Alle Krankheitserreger sind neue Bakterien. Deshalb können alle Krankheitserreger in dieser Weise binden. Schauen Sie hier: Das sind wir oder höhere Tiere. G statt A in dieser Position. Aber wenn hier ein G ist, und das ist der einzige Unterschied, wenn hier ein G ist, erfolgt eine Abstoßung, die auf zwei kurzen Kontakten basiert, und keine Bindung. Das ist alles. Ich habe Ihnen gezeigt, wie die Unterscheidung funktioniert. Jetzt muss ich über das Problem reden, nämlich Resistenz. Und Resistenz ist ein sehr, sehr akutes Problem in der modernen Medizin. Wie werden Krankheitserreger resistent? Ein bekannter Weg ist der, es auf die Anker abzusehen. Wie hier, Sie erinnern sich an 2058. Jetzt sehen Sie das von der Seite. Ein Erythromycin, das hier sind die guten Kontakte und das ist die Grundlage für Selektivität. Es ist gleichzeitig die Grundlage für Resistenz. Die Bakterien, die Krankheitserreger können also ihr eigenes Genom von A auf G ändern oder sie können eine post-translationale Modifizierung vornehmen, eine ERM-Modifizierung, bei der es sich in dieser Position um eine Methylierung handelt. Die meisten Mechanismen haben tatsächlich mit der Modifizierung solcher Anker zu tun. Aber einige Mechanismen werden auch über entfernte Veränderungen vermittelt. Ich möchte Ihnen ein Beispiel dafür zeigen. Sehen Sie hier wieder den Tunnel. Sie können ihn jetzt im ganzen Ribosom sehen. Das ist hier. Und Sie sehen, dass die Tunnelwände hauptsächlich aus RNA bestehen, dass aber zwei Proteine vorhanden sind, deren Spitzen in die Tunnelwand reichen. Das sehen Sie hier. Die Bindungsstelle der Makrolide ist mehr oder weniger hier, die Spitzen liegen darunter. Aber man hat bereits in den 70er Jahren herausgefunden, dass winzige Mutationen in diesen beiden Proteinen L22 und L4 eine Resistenz gegenüber Erythromycin aufbauen können, obwohl L22 und L4 nicht Teil der Bindungsstelle sind. Und obwohl die resistenten Mutanten Erythromycin binden. Wie ist das möglich? Wir wollten das wirklich genau wissen. Und in Zusammenarbeit mit Dr. Janice fanden wir diesen Mutanten in den Ribosomen, den wir kristallisieren konnten. Wir hatten also jetzt Kristalle für die Mutanten und fanden heraus, dass diese winzigen Veränderungen nicht wirklich viel in der Proteinposition verändert haben, aber eine ganze Kette von Veränderungen in den RNA-Wänden ausgelöst haben, sodass der Tunnel jetzt Erythromycin und das neu entstandene Protein aufnehmen kann. Das ist eine Möglichkeit, von der wir bis vor kurzem nichts wussten. Was tun Menschen, Hersteller, um die Resistenz zu bekämpfen? Ich denke, es wird immer nur teilweise um Kampf, eher um Beherrschung gehen, weil Bakterien leben möchten. Aber was können wir tun? Manchmal entstehen neue Verbindungen mit zusätzlichen Ankern oder Synergien, die zwei Inhaltsstoffe in Kombination anbieten. Zusätzliche Anker oder höhere Flexibilität gibt es beispielsweise in Azithromycin durch Zugabe eines Atoms. Wenn man das mit Erythromycin vergleicht, hat es fast dieselbe Chemie. Und es ist eines der erfolgreichsten Antibiotika. Es funktioniert also auch gegen resistente Stämme. Aber ich war beunruhigt, als ich hörte, dass die kroatische Gruppe das entwickelt hat. Denn wenn es resistente Stämme bindet, die G statt A haben, wird es sich auch an den Patienten binden. Was würde also passieren? Glücklicherweise hatte ich mich geirrt und das sieht man hier im Vergleich der Bindung des Azithromycins an ein Modell für Krankheitserreger, in Grün, und an ein Modell für Patienten, das H. Ich habe hier nicht viel Zeit darauf einzugehen, aber Sie sehen, dass es zu einer Bindung kommt. Allerdings verläuft sie zum Teil längs und zum Teil quer. Zwei Wirkstoffe ... Es ist ein Arzneimittel mit der Bezeichnung Synercid auf dem Markt, das zwei Wirkstoffe enthält, eines wirkt auf die aktiven Stelle und eines im Tunnel. Ah, Sie möchten sehen, wie die Bindung erfolgt. Hier ist die Tunnelwand, eins und zwei, sie kleben aneinander und blockieren den Tunnel. Das hat mich ein bisschen glücklicher gemacht und wir suchten ein weiteres. Synercid also ist, wie ich Ihnen zeigte, das zweite. Zwei Wirkstoffe, ein Wirkstoffpaar, produziert aus einer einzigen Kultur, in Sri Lanka, darum heißen sie Lankacidin und Lankamycin. Wir fanden heraus, dass sich die Beiden aneinander binden, die Interaktion zwischen ihnen sehr stark ist und sie zudem einen Konformationswechsel initiieren. Wir machten uns also Hoffnung. Wir fanden zudem heraus, dass Lankamycin, das sich an Lankacidin bindet, dem Erythromycin sehr ähnlich ist, obwohl Erythromycin ein kompetitiver Hemmer ist, während Lankamycin ein Bindungshemmer ist. Und das gibt uns ein Instrument an die Hand, mit dem wir die Kopplung verbessern können. Hier ein Kurzfilm darüber, wie einige der uns heute bekannten Antibiotika funktionieren könnten. Edein lässt den Botenstoff nicht andocken. Das nächste ist Tetracyclin, das durch Besetzen der Stelle, der Position hier, ein Andocken am A-Stellen-tRNA verhindert. Das dritte ist Erythromycin, das wir besprochen haben. Dies ist Erythromycin, das letzte ist Clindamycin, das eine Bindung verhindert. Zwischendurch eine Minute zum Thema Inspiration. Wir arbeiten mit der Kristallographie. Dabei - das werden Sie alle kennen - können wir durch Einsatz der Röntgen-Kristallographie Details sehen, die uns ansonsten verborgen blieben. Das Konzept: Mit Kristallen erhalten wir Beugungen in alle Richtungen, die werden erfasst. Und wenn wir sie richtig erfassen und korrekt zusammenführen, erhalten wir Elektronendichtekarten. Und da Röntgenstrahlen mit Elektronen interagieren, wissen wir dann, wo sich die Atome befinden. Und ich möchte hier wirklich nicht ins Detail gehen, sondern Ihnen nur zeigen, was ich mit Beugung meine. Hier ist ein Kristall, auf den ein Strahl auftrifft, der in unterschiedlichen Intensitäten in alle Richtungen gebeugt wird. Aber zunächst brauchen wir Kristalle. Kristalle sind Einheiten von perfekter, dreidimensionaler Ordnung oder zumindest fast perfekter Ordnung. Das ist bei Salz, Natriumchlorid, kein Problem. Mitte des letzten Jahrhunderts haben die Menschen damit begonnen, sogar aus Proteinen Kristalle zu erzeugen. Heute könnte das jeder Sechstklässler wiederholen. Das ist also möglich. Das ist Lysozym. Der wurde tatsächlich von einem Kind kristallisiert. Aber diese Ribosomen sind so kompliziert und, wie Sie gesehen haben, sehr flexibel. Ich habe noch nicht erzählt, dass sie schnell zerfallen. Das war ein großes Fragezeichen, als wir anfingen. Ehrlich gesagt, waren die Vorzeichen negativ. Das wird nicht funktionieren. Und die Gründe dafür habe ich Ihnen bereits erklärt. Der wichtigste Grund ist meines Erachtens die offensichtliche Tendenz zu zerfallen. Sie zerfallen im Reagenzglas ebenso wie im Körper sehr schnell, nämlich innerhalb von einem bis vier Tagen. Warum habe ich das dann in jungen Jahren (ich war ungefähr in Ihrem Alter), warum habe ich das überhaupt versucht? Weil ich die Möglichkeit hatte zu lesen, nicht nur wissenschaftliche Texte, und so las ich etwas über die Delegation, die zum Nordpol aufbrach und sich mit dem Stoffwechsel von Bären im Winterschlaf beschäftigte. Und diese Wissenschaftler fanden heraus, dass die Ribosomen während des Schlafs ordentlich innerhalb ihrer Membranen verpackt sind. Ribosomen können ordentlich verpackt sein. Bei jedem Bär, in jedem Winter, es ist kein Zufall. Aber warum ist das so? Das ist, dachte ich, eine Möglichkeit für die Bären, einen großen Bestand an aktiven Ribosomen vorzuhalten, weil sie nach dem Erwachen aus dem Winterschlaf Dinge tun möchten, die sie während des Schlafes nicht tun, und dafür benötigen sie Proteine. Und das ist mehr oder weniger das, was hier zu sehen ist. Ich war nicht die Einzige, die das damals gelesen hat. Viele andere Gruppen lasen das ebenfalls. So wurden diese Erkenntnisse beispielsweise von Forschern genutzt, um Kristalle oder sogar Monoschichten auf Membranen herzustellen. Sie möchten wissen, wie? Sie nahmen befruchtete Eizellen, legten sie in den Kühlschrank und nach drei Minuten hatten sie diese wunderbare Ordnung. Deshalb dachten die Menschen, dass diese Organisation aufgrund der Kälte entsteht. Und ich dachte mir, dass genereller Stress die Ursache ist. Und später wurde nachgewiesen, dass auch eine schlechte Ernährung zu diesem Ergebnis führt. Aber egal, es passiert in der Zelle, und alles, was wir wollten, war, es im Reagenzglas zu wiederholen und Ribosomen von Bakterien zu verwenden. Nicht von Bären und nicht von befruchteten Eizellen. Die Lösung bestand also darin, Ribosomen aus Bakterien zu kristallisieren, die unter rauen Bedingungen leben, und ein Verfahren anzuwenden, das ihr Leben ein bisschen verlängert. Glücklicherweise konnte ich ein solches Verfahren am Weizman Institute entwickeln. Ich möchte Ihnen raue Bedingungen zeigen, hier beispielsweise das Tote Meer am tiefsten Punkt der Erde. Es befindet sich in Israel. Hier sehen Sie es von oben und hier aus der Nähe. Das hier sind Salzkristalle, die aus dem sehr gesättigten Meer stammen. Aber selbst darauf wachsen Bakterien. Hier sehen Sie einige Kolonien, die auf dem Salz wachsen. Hier sind sie sogar noch besser zu sehen. Der Wasserstand ist hier wesentlich geringer, es ist September. Dies war der Wasserstand im Januar, ungefähr 70 cm. Und sie wachsen weiter. Deshalb dachten wir, diese wären gut, oder solche, die in Abwässern mit atomaren Viren wachsen. Der Deinococcus radiodurans, der auch auf Staub, bei Hunger, in Hitze und in Kälte gedeiht, weil nur ein Viertel von ihm funktional ist, während die anderen Vier ihre DNA verpacken und erst aktiv werden, wenn ein Viertel repariert werden muss. Sie verfügen zudem über all die Reparaturmechanismen, die heute bekannt sind. Und wir wollten die Verfahren verwenden, die ich bereits beschrieben habe. Mit Hilfe dieser Verfahren fanden wir bereits nach einem Tag Hinweise auf ein Organisationsprogramm. Dies ist das Elektronenmikroskopbild eines Tropfens, den wir zur Kristallisation genommen haben. Hier sehen Sie die Ordnung. Es war also sogar im Labor möglich. Gestern sprachen wir über Ausdauer und Glauben. Während der gesamten Zeit gab es schwache, aber immerhin handfeste Beweise. Ich möchte Ihnen auch in diesem Fall nur einige zeigen. Die Neugier war also der Grund, aber die Evidenz der Antrieb. Wir wollten dieses Bild erhalten. Anfänglich erhielten wir dieses Bild. Und mir hat es gereicht, weil es konkrete Anzeichen für eine hohe Auflösung enthielt. Und als wir es durchschnitten, ergab sich ein sehr geordnetes Bild. Wir schauten uns das an. Das ist der Vorteil der Arbeit mit sehr großen Teilchen, weil man sie in einem Elektronenmikroskop sehen kann. Also konnten wir die Ordnung im Innern sehen. Wir brauchten 25 verschiedene Bedingungen, aber es war nicht so schwierig. Es dauerte nur vier Monate, weil wir einen Weg, eine Beobachtungsmatrix gefunden hatten. Und als wir die Region, beispielsweise die pH-Region, fanden, in der wir den Unterschied zwischen Löslichkeit und Sedimentierung zu sehen begannen, übertrugen wir das auf Kapillare. Und sehen Sie, wie groß die Kristalle wurden. Das war immer noch nicht gut, aber wir arbeiteten weiter daran. Und schauen Sie, wie schön sie im Innern geordnet waren. Nun, ich möchte Ihnen nicht alles über all die Kristalltypen erzählen, die von innen zu sehen sind. Ich zeige Ihnen gleich noch, wie es von außen aussieht. Wir gingen also diese Schritte. Sie erinnern sich, was wir vorhatten. Ich zeigte es Ihnen zu Beginn. Vier Jahre nach unserem Start hatten wir zum ersten Mal einige Flecken, immer noch weit entfernt vom Ziel, aber wesentlich mehr als in den ersten Tagen. Und dann haben wir wirklich gute Kristalle erhalten, viele gute Kristalle, die exponiert werden konnten. Wir führten Messungen im Synchrotron, also einer Einrichtung durch, in der Teilchen beschleunigt werden. Und wir sahen es auf der Tangentialen in einzelnen Stationen und Maßstäben. Und sechs Jahre nach unserem Beginn hatten wir gute Kristalle, eine sehr, sehr phantastische Diffraktion, die aber nach 0,1 Sekunde verschwand. Der Zerfall war enorm. Wir hatten also unser Ziel nicht erreicht. Und hier kommt der Mount Everest wieder ins Spiel. Wir hatten den Mount Everest erklommen. Wir hatten gute Kristalle, phantastische Kristalle. Aber dann stellten wir fest, dass der echte Mount Everest immer noch vor uns lag. Wir hätten an dieser Stelle aufhören können, aber wir haben nicht aufgegeben. Wir machten uns Gedanken darüber, warum dieser Schaden auftritt. Ich kann das hier nicht im Detail beleuchten. Wesentlich ist, dass der Schaden durch Röntgenstrahlen verursacht wird, die Peptid-Bindungen oder andere Bindungen erhitzen. Und wir konnten nur versuchen, die Progression auf ein Minimum zu reduzieren. Wir haben das Problem mit Kryotemperatur gelöst. Hier sehen Sie meinen Gesichtsausdruck, als wir das Experiment 1986 in Stanford begannen. Ich hatte keine große Hoffnung. Aber das war der Durchbruch. Und heute ist dies, so hört man, weltweit zur Routine geworden. Heute werden fast alle Strukturen in dieser Weise gemessen. So haben wir also jetzt eine wunderbare Diffraktion. Und die ganze Welt ist um noch wesentlich mehr Strukturen bereichert. Das war also der Punkt, an dem wir die Kryokristallographie zusammen mit anderen Entwicklungen zur Phasierung und für Detektoren einsetzten. Multiplizieren Sie das bitte mit 1.000 und sehen Sie, wie viele Strukturen heute in der Welt bekannt sind: Die PDB, die Protein-Datenbank-Deposition, jedes davon ist eine Struktur. Vielen Dank also. Und ich sagte gestern bereits, dass es nur wenige Menschen gab, die das Potenzial dieser Arbeit damals erfassen konnten. Und die waren lange nicht so überzeugt von der Idee, wie ich selbst. Sie hatten Zweifel, aber dennoch schlugen sie es dem Präsidenten des Weizman Institute vor und ließen mich lange Zeit an einem Projekt arbeiten, das sowohl für möglich als auch für unmöglich gehalten wurde. Hier sind Sir John Kendrew, Chris Anfinsen und Alex Rich sowie die Präsidenten Michel Sela und Haim Harari zu sehen. Das ganze Projekt nahm seinen Anfang, wie ich bereits erwähnte, am Max-Planck-Institut in Berlin - zusammen mit Dr. Wittmann, der die Struktur der Ribosomen unbedingt enträtseln wollte. Er half uns auch dabei, in Hamburg in der Nähe des Synchrotrons arbeiten zu können. Er starb sehr früh und seine Nachfolger waren Franceschi und Fucini. Wir hatten zwei Forschungsgruppen gleichzeitig und ich danke den jungen Mitgliedern dieser Gruppen für ihr Engagement und ihre Entschlussfreudigkeit - in guten wie in (viel öfter) schlechten Zeiten. Und hier sehen Sie die Hamburger Gruppe mit den Engeln, unseren Technikern und auf der Suche nach besseren Bakterien im Toten Meer. Und hier sehen Sie die israelische Gruppe, die unter Leitung von Dr. Anat Bashan, der leitenden Wissenschaftlerin, immer noch besteht. Ich kann Ihnen hier nicht im Einzelnen erklären, was jeder getan hat, aber jeder hat seinen Beitrag geleistet. Was Sie hier sehen, ist eine Zusammenstellung aus den letzten drei Jahren. Ich möchte, dass Sie sich Tamara anschauen, Tamara Auerbach. Sie kam vor dreizehn Jahren für zehn Wochen zu uns, ist aber geblieben. Sie kam als Bachelor. Sie ist immer noch da. Sie hat jetzt drei Kinder. Aber an dem Tag, als ich diese Aufnahme machte, und das ist wichtig, war ihr Geburtstag und sie hatte einen Kuchen gebacken. Und das hier ist ihr Kuchen, der zeigt, dass für meine Gruppe Ribosomen wie Süßigkeiten sind. Ich möchte auch meiner Familie danken, die mich die ganze Zeit unterstützt hat, der ganzen Familie. Aber ich möchte mich hier auf meine Enkeltochter konzentrieren. Und das tue ich wegen all der jungen Frauen, die sich nicht sicher sind, ob es möglich ist, Wissenschaft zu betreiben und eine Familie zu haben. Schauen Sie hier, das ist eine Rede, die sie in Paris hielt, ohne mir vorher davon zu erzählen. Wie Sie wissen, ist sie sehr beschäftigt. Aber dennoch findet sie Zeit für mich. Und als sie fünf war, lud sie mich zu sich in ihren Kindergarten ein, weil ich dort erklären sollte, was Ribosomen sind. Im Alter von zehn verlieh sie mir den wichtigsten Preis meines Lebens: "Großmutter des Jahres ist: Ada Yonath" - ohne dabei eine Jahreszahl zu nennen. Und das begründete sie damit, dass ich mich jedes Jahr aufs Neue zu bewähren hätte. Ich habe also eine liebende, aber auch fordernde Familie. Wenn ich nicht mehr kann, wird sie übernehmen. Vielen Dank.

Ada E. Yonath (2011)

Climbing the Everest Beyond the Everest

Ada E. Yonath (2011)

Climbing the Everest Beyond the Everest

Abstract

The challenges associated with pursuing ribosomal crystallography can be described as a series of Everest climbing. At each step, when reaching the summit, a taller and more difficult one became exposed. Snapshots of this story will be described.

Ribosomes are the universal cellular machines that act as very efficient polymerases that translate the genetic code into proteins. They posses spectacular architecture accompanied by inherent mobility, which facilitate their smooth performance as RNA enzymes. The peptide bond formation site is located within a universal internal symmetrical region connecting all of the remote ribosomal features involved in its functions. The elaborate architecture of this region positions ribosomal substrates in appropriates stereochemistry for peptide bond formation, for substrate-mediated catalysis, and for substrate translocation. The high conservation of this symmetrical region implies its existence irrespective of environmental conditions and indicates that it may be a remnant of a prebiotic RNA machine that is still functioning in the contemporary ribosomes.

Adjacent to the peptide bond formation site is an elongated tunnel, along which nascent chains progress until they emerge out of the ribosome. This tunnel is involved in signaling and gating functions, provides the binding site of the first cellular chaperone that encounters the emerging nascent chain, and hosts a major family of antibiotics that target the ribosome.
A decade of structural studies on antibiotics targeting ribosomes yielded several imperative take-home lessons. Among them are the structural bases for the antibiotics modes of function, including induced fit and remote intersections; the basis for antibiotics synergism; the differentiation between ribosomes of pathogens vs. those of higher organism; the mechanisms of resistance to antibiotics, including secondary conformational rearrangements caused by remote mutations; cross-resistance to ribosomal antibiotics. Within this frame, parameters allowing for clinical usage of antibiotics targeting fully conserved regions, such is the peptidyl transferase center, have been identified; common and specific pathways of cross resistance have been proposed; and minute chemical differences that can turn competition into synergism, have been characterized. Based on those insights, the feasibility of design of advanced efficient antibiotics and/or of the improvement of the existing compounds could be assessed, thus paving the way to exciting developments in this area.

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