Adolf  Butenandt (1960) - From the Biochemistry of the World of the Insects (German presentation)

Ladies and Gentlemen, At earlier conferences here in Lindau, as just mentioned, I spoke several times about problems in the field of insect biochemistry. My decision to choose the same topic to talk to you about today was prompted mainly by a desire to tell you about the progress and achievements that have been made in areas that, for the most part, could only be discussed in earlier lectures in terms of the problems they presented. Unfortunately, in addition to presenting new facts, I cannot avoid covering some ground that may already be familiar to some of you, for which I beg your indulgence. For those of you who have not yet come across these problems, please permit me a preliminary remark. Some of you may question the point of tackling such specific questions as those posed by the insect world. I’d like to counter that opinion with the following observation. You will all be aware that the science of biology has long since abandoned its descriptive efforts and now seeks, with the help of methods borrowed from physics and chemistry, to analyse fundamental life phenomena that apply universally to all organisms. In this way, it is doing its part in pursuing the aim of science to explore the nature of humankind itself and the living world around it. In so doing, it is free to choose its objects and, depending on the question being addressed and the method used, uses a wide range of different organisms in the animal, plant, and microbial realms. And you will also be aware that insects are very often used to solve fundamental biological problems. We should recall, for example, that the laws of classical genetics that apply to all life forms – including humans – were discovered for the most part in insects and that animal behaviour laws were investigated in insects to a large extent. And in particular, the principles discovered in social insects have delighted awestruck researchers over and over again. Also Biochemistry, which aims to analyse the chemical transformations associated with life processes, chooses its objects from among all the organisms on Earth. For over twenty years we at the Max Planck Institute for Biochemistry have been investigating a number of chemical life phenomena that have been made accessible by studying insects. And as so often we have found in pursuing this work that very specific questions that appear meaningful only for the insect world hold the key to explaining generally valid phenomena or yield findings that can be of practical importance to our own social lives. I would like to demonstrate this with the help of several examples. Let’s begin by considering the natural pigments that are characteristic of the insect kingdom. You all know that the numerous pigments that embellish the natural world and delight humans were a major focus of interest for many generations of chemists. Each period, with improvements in analytical methods, introduced new ways to isolate and identify the structure of natural pigments. So for a long time scientists believed that they were well acquainted with all the important and widespread pigments in the natural world, which often served as models for the technical synthesis of organic dyestuffs. Surprisingly, however, they had overlooked the red, brown, yellow and purple pigments of the insect world, including a previously unknown natural pigment type, which we discovered during our research in recent years and which, as we found, figures among the most widely distributed pigments in nature. First, let us see in pictures what these pigments are and where they occur. In the first picture we see a butterfly, the well-known small tortoiseshell, and this butterfly has just shed its pupal case and has secreted what entomologists call pupal secretion. Many butterflies secrete a cleansing liquid like this immediately after pupating. You can see in this case that the secretion, captured here on blotting paper, has a bright red hue. This is a pigment of the red type in the insect world, and the wing markings, insofar as they are red, yellow or brown, also fall into the group of pigments we will be talking about. Wing pigment of our type can also be seen in the next pictures. In the next picture we again see the wings of the small tortoiseshell. Here is the peacock butterfly, here the admiral. All examples of where yellow, red and brown wing pigments occur. In the next picture we see the silver-washed fritillary, such colours, as well as the pretty red markings of this large American moth Cecropia platysamia, belong here. On the epidermis of some insects or larvae are the natural pigments we’re talking about. In the next picture we see the caterpillar of the puss moth, characterised by the fact that it turns deep red immediately before pupating. The pigmentation is just starting here as depicted. Again this red pigment type. In the next picture you see the pretty colour pattern of a grasshopper larva Schistocerca, here we also have the individual pigment patterns, and finally, I would also like to show you the eye of the grasshopper. Many insect eyes are pigmented red, brown or a darker shade. Now, all these pigments that I’ve presented to you, I repeat, as red, brown or even darker shades of pupating secretion, wing pigments, epidermis pigments, and eye pigments in insects are chemically closely related. And based on their universal occurrence in all insect eyes, where they were first discovered, they have been given the collective name ommochrome eye pigments. The occurrence of these substances is not limited to insects. They are also found as eye and skin pigments in all arthropods, for example crabs, as well as in cephalopods and more rarely in other animal classes as well. There is a whole series of ommochromes as chemical entities. As a characteristic and widespread representative of these ommochromes, let us consider the structure of just one substance in the next picture, of so-called xanthommatin. This yellowish brown pigment, xanthommatin, was first obtained in pure crystallised form from the red pupating secretion of around 10,000 small tortoiseshells, which yielded just 100 mg of the pigment. Later, 19 mg was isolated from the eyes of 7,800 blowflies, marking the first time an insect eye pigment was obtained in pure form. Xanthommatin occurs in very many insect eyes. It is one of the pigments found in wings and skin. The structure of this substance was elucidated and definitively confirmed by synthesis. For those of you familiar with the language of chemical formulae, here is the formula of xanthommatin and you can see that it is what is known as a phenoxazone system, that is a tricyclic system with nitrogen, to which a quinoline ring is attached, and here there is also an oxoaminocarbonic acid side chain. This phenoxazone system is found in all ommochromes. We could say that ommochromes are phenoxazone pigments. Typical of xanthommatin and other ommochromes is a characteristic redox behaviour, which is shown here in the picture. This yellowish brown pigment stage is reduced by the addition of hydrogen, resulting in a bright red stage. Here is the structure of hydroxanthommatin with the two attached hydrogen atoms here and the subsequent rearrangement of the double bonds. The red hydroxanthommatin, with the release of hydrogen, is converted back to the yellowish brown product. And this redox behaviour is shown again in the next picture in colour, here the oxidised yellowish brown, here the reduced bright red colour, this behaviour is, firstly, characteristic of the group and, secondly, is unusual for biochemists and dye chemists, because here reduction is accompanied by a deepening of the colour, which is generally not the case. It is interesting, that nature uses both types, the oxidised and the reduced pigment. We know, for example, that the previously mentioned change from the brown colour of the puss moth to the bright red colour before pupation is due to such a reductive process. All ommochromes are phenoxazone pigments, as I said, we regard xanthommatin as the basic substance, which can be converted in various ways into other types of ommochromes. It is interesting to note that the red hydrated pigment stage is not very stable in the presence of oxygen, instead the oxidised pigment is the stable form. What does nature do when it wants to fix the red hydrated pigment stage? It does this by converting xanthommatin into two other pigments of the bright red type, which can be derived from hydrated xanthommatin, and which we have named rhodommatin and ommatin D. In the next picture I would like to suggest how the hydrated red stage is fixed. Here you see again the hydrated form of xanthommatin, but there is only one hydrogen atom here on the nitrogen, down there on the oxygen it is replaced by a residue R. This residue R can be either a sugar residue, in which case it forms a glucoside, or it can be a sulfa residue, a sulphuric acid ester, and whenever such a hydrogen atom is replaced by such groups – through sugar groups, through sulphuric acid – the reduced form cannot be converted as easily, namely only after removal of the residue, into the oxidised form, and in this way nature fixes the hydrated unstable pigments to produce bright red. They are therefore at the same time substances that show the formula types of other ommochromes. Thank you. And the following strikes us as being of general interest. The ommochromes were found to contain a new pigment system which, as I mentioned, had not previously been observed in nature, the phenoxazone system. This system has been known for over 40 years in the field of synthetic dyestuffs, but its much earlier invention by nature has never been copied. Among these phenoxazone-type synthetic dyes, some are used as photosensitisers on photographic plates. Are pigments of this type in the eyes of insects also involved in light absorption, in the visual process, instead of just acting, as assumed, as photoprotection pigments? This is a question for sensory physiologists. The ommochromes of insects were the first phenoxazone pigments to be discovered in nature. Soon after their discovery, other representatives of this pigment type were found in the natural world. Determining the structure of ommochromes provided the key for analysing the pigmentation system of the so-called actinomycins. Antibiotically active metabolic products of ray fungi and also proved to be the key to other representatives of this class in the fungus kingdom. You again see in the top picture the formula of xanthommatin as a class and how this basic substance is converted by substitution in the group of actinomycins, investigated by Brockmann, and in the lower picture you see types of fungal pigments investigated by Gripenberg. According to very recent observations, it is likely that xanthommatin is also a metabolic product of mammals and perhaps even humans. Whether it has any significance in this context is not known. Actinomycins are antibiotics. This means that they are among the modern weapons doctors use against infectious diseases, about which, in the presentation by Herr Domagk yesterday, we heard so many fascinating things. Because the actinomycins include drugs against malignant diseases of the lymphatic system, it is understandable that the ommochromes – initially merely objects of whimsical research – are increasingly attracting the attention of the pharmaceutical industry. The ommochromes however have gained the greatest theoretical importance as traits which are expressed only under the effect of specific genetic factors. That was the topic of my very first lecture in Lindau: “What do we know about the effects of genetic factors?” Entomologists have found that some insect species are unable to produce ommochromes. And genetic analysis of these ommochrome-free species has shown that they differ from ommochrome-containing wild species in that there is a change or mutation in individual genes in the genome. These genes must therefore control the synthesis of ommochromes. This discovery made it possible to analyse the effects of genes for the first time, that is to answer the question of how specific eye traits of an organism are determined by the presence of specific genetic factors located in the cell nucleus. In the next picture I would like to remind you of the classical experiment by Alfred Kühn, who pioneered this development. In this diagram we see the caterpillar and head of the flour moth Ephestia kuehniella, specifically the wild form characterised by dark ommochrome pigmentation. Here is an ommochrome-free mutant, the caterpillar’s skin is colourless, the eyes red, and there is no dark pigment, and these two variants differ only in a single genetic trait. If, as Kühn did, you implant tissue from the wild form into this penultimate instar of the colourless mutant ommochrome, which is otherwise absent, is synthesised in the host under the influence of this tissue, and the colourless insects are transformed into insects that are phenotypically indistinguishable from the wild forms. The implant must transfer a factor that restores the somehow defective process of ommochrome synthesis. The biochemical analysis of this experiment then led to the recognition of a chain of genetic effects, from which the following can be concluded: The ommochromes in our pigments are synthesised from the amino acid tryptophan, a normal product of protein metabolism, by way of stepwise catabolism via kynurenine and hydroxykynurenine. Each of these steps is catalysed by a characteristic enzyme. Those enzymes, however, are present only if certain genes are present in the pool of genetic factors. We therefore conclude the following: the synthesis of the enzymes that catalyse a given reaction step is dependent upon genes. Genes act via enzymes, when genes mutate, the associated enzymes are absent or altered, so that chemical reaction steps, in this case subprocesses of ommochrome synthesis, no longer occur. This experiment showed, for the first time, that genes act via enzymes. Enzymes are the first detectable products of genetic factors. Because enzymes are specific proteins, we also draw the important conclusion from the experimental results that the information required for the synthesis of specific proteins resides in the structure of genetic factors. In this way, a basic problem in biology was discovered and then made accessible by a subsequent experiment. The question as to how genetic factors in a cell convey information for the synthesis of specific proteins and thus for the production of all specific cellular structures is one of the most exciting problems in biochemistry today, the answer to which is probably in the offing. We have insects to thank for teaching us a law that has meanwhile been confirmed on a broad basis in many organisms and that now allows us to analyse control processes in nature that reside primarily in the genetic material. Unfortunately, we cannot continue this thread. We will now turn instead to another control problem in the field of developmental physiology. Most organisms develop from a single cell - the fertilised egg cell – and the question of how this development of the individual is controlled, how each phase of development is causally determined by the preceding phase, defines the complex of problems addressed by developmental physiology. Here, too, insects have taught us many fundamental principles. You will all be aware that the development of many insects proceeds via an interesting metamorphosis. From the egg of a fly or butterfly hatches the larva or caterpillar. As it grows, it passes through stages during which it moults its outer layer, or cuticle. In the process of pupal moulting, the mature larva changes into a pupa. The pupa undergoes further transformation, at the end of which the sexually mature form, the imago, develops. It emerges from the pupa in a process known as imago moulting. It has been found that this sequence of processes, larval moulting, pupal moulting, imago moulting, is triggered and controlled by three specifically acting hormones, and here we are confronted by the second problem, which I’ve already spoken about in Lindau in the past. At the time, it was believed that the three metamorphosis hormones interact according to this scheme, the first hormone, adenotropic hormone, is produced in neurosecretory cells of the brain, under whose effect the prothoracic gland produces a second hormone, prothoracic hormone. Its presence then causes the epidermis, the skin, to moult. The prothoracic hormone triggers moulting. The form of moulting is determined by the presence or absence of the third hormone, which is produced in the corpora allata. When this hormone is present, which is the case during the entire period of larval development, the insect undergoes larval moulting, if the corpora allata ceases to produce this hormone, known as juvenile hormone, pupal moulting occurs, and the same prothoracic hormone is ultimately still required for imago moulting. All three hormones at work here have meanwhile been isolated. And we are able to demonstrate their effects on suitable objects. We will limit our observations today to prothoracic hormone – the actual moulting or pupation hormone. It is the only one of the three to date to have been isolated in crystallised form. From one tonne of fresh silk worm pupae, 75 to 100 mg of the hormone can be obtained, which we have named ecdysone from ecdysis, or moulting. It is a bicyclic system without nitrogen with the formula C18H30O4. Unfortunately, we still do not know the structural details. We now hope to get help from x-ray structural analysis. Nevertheless, in recent years it has been possible, using the pure hormone, to study its physiological effects in detail and in this context I would like to discuss two examples. Here a ligature is being performed on a fly maggot which separates the head end from the rear end. The result of such an intervention, as shown in the next picture, is a partial pupation. Only the anterior end pupates; the posterior end remains a permanent larva. This pattern results because the metamorphosis hormone that induces pupation is produced in the head and cannot travel past the ligature to the abdominal section of the insect. If we inject pure ecdysone into the abdominal section of the permanent larva, it too subsequently undergoes pupation. Here you see how the hormone is injected into the small larva using a microinjection syringe. We inject 0.01 ml of a solution, equivalent to 0.01 grams, or 10^-8 grams of the hormone, to induce pupation. The result of such an injection is statistical in nature, as expected in biological experiments. Here are a number of abdominal sections injected with hormone and you can see that in addition to total pupations, partial pupations have also occurred, while some insects did not respond, as we would expect in a biological experiment. Many of you will recall that this effect forms the basis of the physiological test to detect and isolate ecdysone. The most elegant biological experiment on the effect of ecdysone was conducted by Carrol Williams, and in the next picture, from a paper by Carrol Williams, you can see what he did. Previously we saw the large moth Cecropia platysamia, a beautiful colourful silkmoth, a giant. And here at the top is the isolated abdomen of a pupa of this moth. We see how two pieces of organ are inserted using small needles, namely neurosecretory cells from the brain and prothoracic gland. So the two hormone-secreting glands, under the influence of the other implant, the prothoracic gland, produces prothoracic hormone. This hormone, as I said, also controls the final stage of imago development, and the abdomen of the pupa develops into the abdomen of the moth. The entire morphology changes, the colour changes and the isolated abdomen even lays eggs. It functions. Without the intervention, without a supply of hormone, it would have died. This experiment was repeated with pure crystallised ecdysone instead of the two organ implants. In the next picture we see this isolated abdomen, coloured yellowish brown, placed on a small agar plate, before imago development, before imago moulting. If we did nothing, this isolated abdomen would, of course, die within a short time. After injection of 6 micrograms of ecdysone, the entire developmental process occurs, this is a photo of the same setup. You see the change in the shape of the moth’s abdomen. You see the expression of the colours and the pattern. So the entire developmental process occurs under the influence of a tiny amount of pupating hormone. It would be difficult to demonstrate the causal effect and significance of a hormone in the course of a developmental step more convincingly. Hormones also act as regulators in the developmental stages of mammals, including humans, but nowhere can their effects be studied so easily and in such an isolated setting as here. So how does this hormone actually work? The activity of hormones is, for the most part, not known in detail. We are repeatedly struck by the astonishing fact that such tiny quantities of a substance can trigger such dramatic processes in the organism. I am delighted to tell you that Dr Karlsson, in cooperation with Beermann’s department at the Max Planck Institute for Biology in Tübingen, has recently made an observation with the help of ecdysone which I regard as groundbreaking. For the first time namely it has been shown that the function of gene loci in the nucleus is influenced by this hormone We thank Beermann for demonstrating that those parts of a chromosome in which active gene loci are located undergo a histological change. So-called puffs form, which we interpret biochemically as a loosening of the genetic substance and a transition to its actual function. Geneticists have always claimed that such puffs cannot occur simply from an internal mechanism of the chromosome but that the surrounding milieu must induce the gene loci to carry out specific functions that are required for further development. But it has never been possible to exert an unambiguous influence on puff formation experimentally. Only now has it been possible to demonstrate, using ecdysone and giant chromosomes of dipterans, in which these things can be observed so well, that minute amounts of hormone can induce puffing in highly specific gene loci, thus activating their function. Recalling everything I’ve said before, that in some way the production of specific proteins is initiated from these gene loci, we can imagine that such activation of individual gene loci initiates the production of specific enzymes. That is really just a start. And we also know how we must interpret this effect. And as I said, this is a groundbreaking achievement for which I have the greatest admiration. Ladies and Gentlemen, another example of the control of the development of individual organisms by an active substance is the honey bee, Apis mellifica, in which the expression of various sexual forms will serve as an introduction to the problem of assignment within a social colony. A robust beehive consists of about 50,000 to 80,000 worker bees, 2,000 to 3,000 male bees, the drones, and a single queen. In the next picture we see the morphological differentiation of these types, in the middle the queen, on the left the drones, on the right the workers, you will already be familiar with all this. The drone is nearly as big as the queen but darker. We know that the drones, the male bees, are produced through parthenogenesis. This means from unfertilised eggs. Whereas the queen and workers are produced from fertilised eggs. Whether a fertilised egg gives rise to a worker or a queen is determined solely by how the broods are fed. Here are the various forms of cells, which you are familiar with. A fertilised egg raised in the small cells produces a worker. A fertilised egg raised in a characteristic queen cell becomes a large queen. It has been observed that larvae hatched from the same eggs are fed differently in the various cells. Whereas the worker larvae are fed only a pinhead quantity of worker food, the larva in the large queen cell selected as the queen receives a copious amount of royal jelly, which is produced by glands in the head of nurse bees. In the next picture you see a cross-section through a bee, and here in the head are a number of glands. This one here is the gland that produces royal jelly. Despite much effort - let me reiterate – one gets the impression that whether an egg develops into a queen is determined by royal jelly, that is by the diet. If a bee larva is transferred just after it has hatched in a hive from a normal brood cell, in which it would have developed into a worker, to a queen cell, it is fed royal jelly and becomes a queen. But despite much effort, all attempts were in vain to transform a young larva into a queen outside the hive by feeding it royal jelly. And consequently, even today, many still contend that entirely unknown brood-care factors determine whether a larva becomes a queen. The situation has changed dramatically since Dr Hanser at our institute recently succeeded in identifying the conditions in which just-hatched presumptive worker larvae can be raised in an incubator, outside the hive, into completely normal queen bees solely by feeding them royal jelly, excluding all other brood-care factors. Dr Hanser’s experimental setup is shown in this picture. It is a small wooden board into which, as you can see, small artificial honeycombs are inserted. They consist of small glass vessels, like this one here shown in detail. And you can see here in the vessels the developing larvae floating. They are floating in royal jelly. If one manages to transfer young larvae, within the first two days of hatching, a period during which they are particularly sensitive, living and unharmed to the experimental cells, they will develop in an incubator at a normal hive temperature of 35° and fed with royal jelly, into queens. Larvae, at the end of the second day of life or later, subjected to the same conditions, always develop into workers. However, under the influence of royal jelly, they can develop into giant workers, which rarely occur in normal hives, if at all. The result of the experimental setup is shown here. You see on the left a normal queen from the hive. You see on the far right a normal worker from the hive. This is a queen raised by us in the laboratory, which developed from a small larva that would have produced a worker in the hive. And here is a so-called giant worker, which develops if you introduce the larva to the experimental setup too late, namely when the actual determination has already been made. The queen differs from the workers not only in size, but above all in the development of ovaries and the morphological shape of the mouth parts. Moreover, the queen lacks the tools on her posterior legs required to collect pollen, namely the brushes and baskets, in short: the queen not only differs from the workers in size and the development of ovaries, her entire morphology is different. That’s why it is important to recognize that a queen produced experimentally in an incubator shows all the features of a normal queen, she is even accepted as queen by a colony. In this picture, let me show you the differing morphology of the mouth parts. On the right by the worker with a long proboscis, on the left by the queen. And you can clearly see the morphological differentiation. Now we can therefore draw the following conclusion: It is clear that the decision about the biological fate of a larva is determined in the first 48 hours of its life and indeed solely by the food it is fed. Whether, as we would probably like to assume, royal jelly contains a determinant substance with specific activity or, also a possibility, whether the determination of a larva to develop into a worker is due to poor nutrition during the sensitive period remains uncertain. But the experimental foundation to answer this question has been laid, and we have begun experiments to fractionate royal jelly and test the individual fractions to see if they induce queen development in the incubator. We look forward to next season’s experiments with particular excitement. Ladies and Gentlemen, I would also like to conclude this problem of determination here. The time is already advanced, and in the final part of my lecture I would like to return to a problem that has already been broached here in earlier lectures. The problem regarding communication between insects through chemical substances. We call substances that are produced in an individual, from these transferred to others, and received by those individuals as communication signals pheromones. Pheromones are therefore chemical messengers conveyed from individual to individual. There are many of them and we can regard them as substances of social cohesion, because they are produced in greater numbers in social insects so that individuals can communicate with each other. Pheromones include species- and gender-specific scents produced by insects which are released by the male or female in order to attract a partner and advertise the presence of individuals of the same sex. We have worked with one such gender- and species-specific sexual attractant in the silkmoth. And last year, after 20 years of effort, we were successful for the first time in isolating such a pheromone, such a gender-specific sexual attractant, and determining its chemical structure. In many insects, finding a sexual partner is facilitated by such species-specific attractants. Detailed knowledge about their activity has been gained mainly from butterflies and moths, whose extraordinary olfactory performance was noted very early on. Insect lovers and entomologists have shown through numerous observations that the female of many butterfly and moth species are able to attract mates from afar. I would like to describe an elegant experiment from the recent literature which was carried out on Chinese silkmoths. Males of this moth species were marked individually and released from a moving train at various distances from the home location, at which a female of the species was kept in a gauze cage. From a distance of 4.1 kilometres, 40% of the released males, and from a distance of 11 kilometres 26% returned to the female. By means of a series of easily performed experiments it can be reliably shown that the female in special scent glands produces gender- and species-specific substances which can be extracted from the glands with lipoid solvents and are perceived by the males through sensory fronds on their antennae. We now know that perception of this scent prompts males to fly against the air current, against the direction of the wind, and thus get underway on their quest for a sexual mate. This behaviour explains why males are frequently attracted from large distances. They do not measure for instance the concentration of the molecules, but instead a scent molecule is interpreted to mean “fly off against the direction of the wind”, and we can easily see that in most cases the attractant must have been carried by the wind so that the male’s chances of finding the female are not bad. Many experiments have been carried out to isolate such scents in order to determine their chemical makeup. Usually insect pests such as the nun moth, grapevine moth and gypsy moth are used. And using extracts from the female scent glands of these species, researchers have tried to attract males in the outdoors. The number of males captured served as a measure of the potency of each extract. The knowledge thus gained about the nature of such sexual scents in 40 years of work was extraordinarily poor. In 1939 we undertook the biochemical identification, as I mentioned, of the sexual attractant of the silkmoth Bombyx mori. It had, until then, never been used in such experiments and yet it had the great advantage for the laboratory that it is a domesticated insect which can be easily bred and which is procured in large quantities in the silk industry. The moths no longer consume food, they can be kept in open trays because they do not fly, and in the presence of a female silkworm or under the influence of an extract from the abdominal glands of the female, the practically stationary males become highly excited, beating their wings rapidly and rotating in searching movements. And that forms the basis for the required chemical identification test. We have been, since 1939, in the summer and autumn months, conducting experiments with the aim of identifying this attractant biochemically. For opening up this interesting field, my coworkers and I are indebted to the suggestion and advice of Walter Schoeller, the former head of the main laboratory of Schering AG in Berlin, who, I believe, is also among our friends here today. The choice of the experimental object, this simple experimental object, was made on the advice of the entomologist Görnitz, who, after orientating experiments conducted jointly with Schotte at Schoeller’s Laboratory in Berlin, recognized the possibility of learning about the general character of the sexual attractant of lepidopterans by using the silkmoth as a laboratory model. Here you see a silkmoth and when sexually excited, the female extends two glands from the posteriormost abdominal segment, the lateral sacculi. They are pigmented yellow, and the attractant can be extracted from them with lipoid solvents. The males sit there very calmly after hatching. They can be identified by their large antennae. They maintain their idle state. For the attractant test they can be kept in open trays, where they sit calmly and are used as follows for the test. We first insert a clean glass rod into the glass vessel, position it in front of the males’ antennae and expect no change in the insects’ idle state. When we then dip the tip of the glass rod into an attractant, the insects begin to intensively whirr immediately. For us it is the clearest sign that the insect is still alive at all. These insects live for around eight days without eating, as I mentioned. When you believe that they are outwardly no longer alive, you can determine with this attractant whether they will attempt the very last movements of this kind. You can therefore gauge a reaction to the test in this way. You can define an attractant unit, for example, by saying that one attractant unit of 1 microgram means that the substance, when present in a concentration of 1 microgram per cubic centimetre, elicits this excited dancing in 50% of the experimental insects after we dip the tip of the glass rod, the magic wand, into the solution. We know from the first experiments in 1939 and 1940, which aimed to concentrate and chemically identify the attractant, that the attractant must be a lipoid-soluble, neutral and nonsaponifiable alcohol that is resistant to dilute acids and bases, but sensitive to oxidants. From 7,000 female butterflies we were able at the time to isolate 100 mg of a waxlike fraction that contained one attractant unit in 0.01 micrograms, i.e. 10^-2 micrograms. We believed at the time that we were already pretty close to the goal, but the following years showed that those products would have to be concentrated by several orders of magnitude to obtain the pure attractant. After we, on the basis of many years of gradually improving experimentation, again processed the extract from 500,000 glands the year before last, we finally achieved the goal of purification. As I said, just about 20 years after the work was commenced. We succeeded in obtaining pure attractant in the form of 12 mg from those 500,000 glands and 12 mg of a crystallised coloured ester, from which the colourless attractant itself can be generated. With this small quantity it was possible to carry out an analysis of the chemical structure. The formula of this first gender- and species-specific attractant is given here below. It is a hexadecadienol. That means that we have a straight chain of 16 carbon atoms. Hexadeca is the basic substance. At the end of this chain we have a primary alcohol group-ol, attached to carbon atom 16. We have two double bonds between carbon atoms 4 and 5 and between 6 and 7. Hence, a hexadecadienol. Our picture shows how the essential structural elements were found. The free alcohol was reduced to a known substance, cetyl alcohol, which was unambiguously identified. In this way we showed that a straight chain of 16 carbon atoms was present. The coloured ester was then oxidised using a micromethod specifically developed for this purpose. And all 16 carbon atoms were detected in the form of hydroxycapric acid, in the form of butyric acid and in the form of oxalic acid. Thus, the formula was unequivocally identified. Now, chemists know that the spatial arrangement around a double bond can always give rise to two isomers, resulting from the configuration of the atoms in space. We can have a cis or a trans configuration at the double bonds that carry substituents. This means that a compound with this formula exists in four isomeric forms. A cis can occur at both double bonds, and a trans can occur at both. A cis configuration here, a trans there, or a trans here, a cis there. Spectroscopic analyses have shown that one of the double bonds has a trans configuration, the other probably a cis configuration. Thus, the number of 4 possible isomers has been reduced to 2. In the past year we have attempted to prepare these 4 isomers of hexadecadienol synthetically and have been successful in doing so. These isomers are extraordinarily similar to each other, as you might expect. But the hope of reporting to you today about the physiological testing of the 4 isomers has not been realized, because we still have no silkmoths. This conference was scheduled about 14 days too early. We plan to test these 4 isomers. We are convinced that we have successfully synthesised the attractant itself, and which of the isomers is the actual attractant and how greatly the isomers differ quantitatively in their physiological effect is a question that we are keen to study in the coming weeks. Remarkable is the extremely potent physiological effect of the attractant. The solution used to test the efficacy limit contains, according to the definition of the attractant unit, 10^-10 micrograms per cubic centimetre. The tip of the glass rod, when wetted with the test solution, has around 10^-2 cubic centimetres of test solution adhering to it, corresponding to around 1,000 molecules on the tip. The magic wand carrying this small number of molecules causes 50 of 100 individual silkmoths to beat their wings. When you consider that the vapour pressure of hexadecadienols is not very high and that the vaporised molecules also have to cross the air space between the glass rod and the insects’ antennae, probably very few individual molecules actually reach the sensitive elements of the antennae. Biochemists are astonished by the relatively simple structure of a substance with such specific action, as this substance is perceived as an attractant only by male silkmoths, not by others. And this attractant contains no branches of carbon atoms, no asymmetric carbon atom. Evidently, part of its specificity lies in the configuration of the conjugated double-bond system. Studying the relationship between structure and activity in this example therefore has particularly interesting prospects. Of course, knowledge of the structure of the sexual attractant of the silkmoth is only of theoretical interest. We expect, however, from the outset that the specific sexual attractants of butterflies and moths all belong to the same substance class, so that the Bombyx attractant holds the key to unlocking the secrets of other sexual attractants. This could prove of practical importance in fighting those moths that are feared as plant pests. We know that the insecticides in use today, we will hear more about them tomorrow, are by no means toxic only to insects, they also harm other animal species and plants treated with insecticides can also be detrimental to humans. Unfortunately, along with insect pests, useful insects are also destroyed, and the lack of selectivity in today’s pesticides can lead to major disruptions in the biological equilibrium of the treated biotope. In addition, the use of insecticides leads to the development of resistant strains that are immune to the effects of the agent being used. The notion of using specific sexual attractants to combat insect pests is old and compelling. We could conceivably use a synthetically manufactured sexual attractant of an insect pest to attract only the males out of a district, capture these, and thus interrupt the propagation of the species. The development of resistance to the attractive scent of the coveted females is, I believe, nothing to fear. Ladies and Gentlemen, I’m happy to tell you that a first step in this direction has been made in the chemical field. A working group headed by Haller in Washington, using the methods we developed on the silkmoth, recently isolated the sexual attractant of the gypsy moth, prepared it in pure form, and analysed it. The gypsy moth ranks among those insects that cause untold damage. And here’s the gratifying news for us. What is the chemical nature of this substance? It also contains 16 carbon atoms in a straight chain. It is also a primary alcohol, like our substance. But it contains not two double bonds but just one, and in place of the other double bond, it contains an oxygen function, an acetylated hydroxyl group. The positions of the double bond and the acetoxy group are still unknown. But what is known shows that our idea was correct, that the silkmoth holds the key to the secrets of attractants of insect pests. With the attractant of the gypsy moth experiments conducted outdoors have been successful insofar as it is now possible, with the help of this substance, to determine in a biotope whether gypsy moths are present or not, which is important. And even that would represent a gain if our hope of mounting a real campaign with the attractant is not realized. Ladies and Gentlemen, I would like to stop here. and Thank you for your attention and that I hope I have been able to show you that old problems, which we talked about in the past, are still exciting, and that progress, though unfortunately slow, is being made.

Meine Damen und Herren, auf früheren Tagungen hier in Lindau habe ich, es wurde eben schon gesagt, schon mehrfach über Probleme der Insektenbiochemie gesprochen. Wenn ich mich entschlossen habe, heute das gleiche Thema noch einmal zu wählen, so war der Wunsch maßgebend, Ihnen erzählen zu können über Fortschritte, über Erreichtes auf Arbeitsgebieten, die in früheren Vorträgen im Wesentlichen nur in ihrer Problematik dargestellt werden konnten. Dabei wird es leider nicht ausbleiben, dass ich manchen von Ihnen Altbekanntes neben Neuem erzählen muss, dafür bitte ich von Vornherein um Entschuldigung. Für diejenigen unter Ihnen, die dieser Problematik noch nicht begegnet sind, darf ich vielleicht eine Vorbemerkung machen. Es wird sich vielleicht der eine oder andere fragen, was es für einen Sinn hat, so spezielle Fragen anzugehen, wie sie die Insektenwelt uns stellen. Nun eine solche Meinung möchte ich vielleicht mit folgendem Hinweis entkräften. Sie wissen alle, dass die wissenschaftliche Biologie seit Langem das Stadium ihrer deskriptiven Bemühungen verließ und unter Anwendung der Methoden der Physik und Chemie Grundphänomene des Lebens zu analysieren versucht, die für alle Organismen gelten. Damit erfüllt sie zu ihrem Teil den Auftrag der Wissenschaft, das Wesen des Menschen selbst und der ihn umgebenden und auf ihn bezogenen Natur zu erkunden. Dabei ist sie frei in der Wahl ihrer Objekte und benutzt je nach Fragestellung und verwendeter Methodik die verschiedensten Organismen des Tier-, Pflanzen oder Mikrobenreiches. Und Sie wissen, dass Insekten sehr häufig zur Lösung biologischer Grundprobleme verwendet worden sind. Wir erinnern uns nur daran, dass die für alle Lebewesen - auch für den Menschen - geltenden Gesetze der sogenannten klassischen Vererbungsforschung zu einem ganz großen Teil an Insekten erkannt wurden, und dass auch Gesetze der tierischen Verhaltensweisen zu einem guten Teil an Insekten analysiert werden konnten. Und vor allem die an staatenbildenden Insekten aufgefundenen Prinzipien beglücken ja den ehrfürchtig beobachtenden Forscher immer wieder aufs Neue. Auch die Biochemie, deren Aufgabe es ist, alle mit dem Ablauf von Lebensprozessen verbundenen chemischen Umsetzungen zu analysieren, wählt ihre Objekte aus allen Organismen unserer Erde. Seit über 20 Jahren haben wir am Max-Planck-Institut für Biochemie eine Reihe von chemischen Phänomenen des Lebens studiert, zu denen uns eben die Insekten den Zugang öffneten. Und wie so oft hat es sich auch bei diesen Arbeiten gezeigt, dass sehr spezielle Fragestellungen, die zunächst nur für das Insekt bedeutungsvoll erscheinen, den Zugang zur Lösung allgemeingültiger Phänomene öffnen oder für unser eigenes Gemeinschaftsleben praktisch verwertbare Ergebnisse liefern können. Das möchte ich im Folgenden an einigen Beispielen zeigen. Beginnen möchte ich mit der Betrachtung typischer, für das Insektenreich charakteristischer Naturfarbstoffe. Sie wissen alle, dass die zahlreichen Farbstoffe, mit der die Natur sich schmückt und den Menschen erfreut, für viele Generationen von Chemikern bevorzugte Objekte ihres Interesses gewesen sind. Jede Zeit hat mit dem Fortschritt der analytischen Methodik neue Wege zur Reindarstellung und zur Konstitutionsermittlung von Naturfarbstoffen eröffnet. Und man durfte lange davon überzeugt sein, alle wichtigen und verbreiteten Naturfarbstoffe, die oft auch für die technische Synthese organischer Farbstoffe Modell standen, gut zu kennen. Überraschenderweise aber wurden dabei die Farben des Insektenreiches von rotem, braunem, gelbem und violettem Farbton übersehen, denen nach unseren Arbeiten der letzten Jahre ein bisher in der Natur noch unbekannt gewesener Bautypus zukommt und die, wie wir fanden, zu den am weitesten verbreiteten Naturfarbstoffen gehören. Sehen wir uns zunächst einmal in Bildern an, um was für Farbstoffe es sich handelt und wo wir sie finden. Sie sehen hier im ersten Bild einen Schmetterling, den bekannten Kleinen Fuchs und zwar hat dieser Schmetterling gerade die Puppenhülle verlassen und hat ausgespritzt das, was der Entomologe das Schlupfsekret nennt. Viele Schmetterlinge spritzen unmittelbar nach dem Schlüpfen ein solches Reinigungssekret aus. Sie sehen in diesem Fall, dass dieses Sekret hier auf Fließpapier aufgefangen, eine leuchtend rote Farbe zeigt. Das ist solch ein Farbstoff vom roten Typ im Insektenreich und auch die Flügelzeichen, soweit sie rot, gelb, braun ist, gehört in das Gebiet, was wir besprechen wollen. Flügelfarbstoff unseres Typs sehen Sie auch in den nächsten Bildern. Im nächsten Bild erkennen Sie hier wiederum die Flügel des Kleinen Fuchses. Hier ist das Tagpfauenauge, hier ist der Admiral. Beispiele dafür, wo sich solche gelbe, rote, braune Flügelfarbstoffe finden. Im nächsten Bild sehen Sie Kaisermantel, solche Farben und auch die schöne rote Zeichnung dieses großen amerikanischen Schmetterlings Cecropia platysamia gehört hierher. Auch die Epidermis mancher Insekten oder Larven enthält die Naturfarbstoffe, von denen wir sprechen. Im nächsten Bild sehen wir die Raupe des sogenannten Gabelschwanzes, dadurch gekennzeichnet, dass sie sich unmittelbar vor der Verpuppung intensiv rot verfärbt. Die beginnende Verfärbung ist gerade hier dargestellt. Wieder dieser rote Farbstofftyp. Im nächsten Bild sehen Sie die schöne Farbzeichnung einer Heuschreckenlarve Schistocerca auch hier haben wir die einzelnen Farbstoffmuster, und zum Schluss zeige ich Ihnen noch ebenfalls von der Heuschrecke das Auge der Insekten. Viele Insektenaugen sind rot, braun oder dunkler gefärbt. Nun alle diese Farbstoffe, die ich Ihnen, ich wiederhole, als rote, braune oder noch dunklere Töne von Schlupfsekreten, Flügelfarbstoffen, Epidermisfarbstoffen und Augenfarbstoffen von Insekten vorführte, sind chemisch eng verwandt. Und nach dem universellen Vorkommen in allen Augen der Insekten, wo sie zuerst entdeckt worden sind, haben sie die Gruppenbezeichnung ommochrome Augenfarbstoffe erhalten. Das Vorkommen dieser Stoffe ist nicht auf Insekten beschränkt. Sie finden sich bei allen Gliederfüßlern, zum Beispiel bei Krebsen, auch bei Tintenfischen als Augen- und Hautfarbstoffe und seltener auch in anderen Tierklassen. Es gibt eine ganze Reihe von Ommochromen als chemische Individuen. Als charakteristischen und weit verbreiteten Vertreter dieser Ommochrome wollen wir im nächsten Bild die Struktur nur eines Stoffes betrachten, des sogenannten Xanthommatins. Dieser gelb-braune Farbstoff Xanthommatin wurde zuerst aus dem roten Schlupfsekret von etwa 10.000 Faltern des Kleinen Fuchses in einer Ausbeute von 100 mg rein und kristallisiert gewonnen. Später konnten 19 mg aus den Augen von 7.800 Schmeißfliegen isoliert werden und damit war erstmalig ein Augenfarbstoff der Insekten in reiner Form gewonnen. Xanthommatin findet sich in sehr vielen Insektenaugen. Er findet sich unter den Flügelfarbstoffen und Hautfarbstoffen. Die Konstitution dieses Stoffes wurde aufgeklärt und durch die Synthese eindeutig gesichert. Für diejenigen unter Ihnen, die der chemischen Formelsprache mächtig sind, steht hier die Formel des Xanthommatins und man erkennt, dass es sich handelt um ein sogenanntes Phenoxazonsystem, das ist dieses dreikörnige System mit Stickstoff, dem ein Chinolinring angegliedert ist und hier ist eine Oxo-Aminocarbonsäure-Seitenkette noch vorhanden. Dieses Phenoxazonsystem finden wir in allen Ommochromen. Wir können sagen, Ommochrome sind Phenoxazon-Farbstoffe. Charakteristisch für Xanthommatin und andere Ommochrome ist das charakteristische Redoxverhalten, was auch hier im Bild wiedergegeben ist. Es heißt, diese gelb-braune Farbstufe kann durch Aufnahme von Wasserstoff reduziert werden und geht dann über in eine leuchtend rote Stufe. Hier ist die Konstitution des Hydroxanthommatins mit den beiden hier angelagerten Wasserstoffatomen und der daraus folgenden anderen Verteilung der Doppelbindungen. Das rote Hydroxanthommatin geht unter Abgabe von Wasserstoff wieder in das gelb-braune Produkt über. Und dieses Redoxverhalten im nächsten Bild auch nochmal farbig dargestellt, hier die oxidierte gelb-braune, hier die reduzierte leuchtend rote Farbe ist erstens charakteristisch für die Gruppe, zweitens für den Biochemiker seltsam oder für den Farbstoffchemiker, weil hier bei Reduktion eine Farbvertiefung stattfindet, was im Allgemeinen nicht der Fall ist. Es ist interessant, dass die Natur die beiden Typen oxidierten und reduzierten Farbstoff verwendet. Wir wissen zum Beispiel, dass der vorhin angedeutete Übergang der braunen Farbe der Gabelschwanzraupe in die leuchtend rote Farbe vor der Verpuppung auf einen solchen Reduktionsvorgang zurückzuführen ist. Alle Ommochrome sind Phenoxazonfarbstoffe, sagte ich, das Xanthommatin betrachten wir als Stofftypus, der [nicht] nun in mannigfacher Weise in die Vertreter anderer Ommochrome abgewandelt werden kann. Interessant ist, dass die rote hydrierte Farbstoffstufe in Gegenwart von Sauerstoff nicht sehr stabil ist, sondern der oxidierte Farbstoff ist der stabile. Was tut die Natur, wenn sie die rote hydrierte Farbstoffstufe fixieren will. Sie tut das durch Umwandlung des Xanthommatins in zwei andere Farbstoffe von leuchtend rotem Typ, die sich von dem hydrierten Xanthommatin ableiten lassen und die wir als Rhodommatin und Ommatin D bezeichnet haben. Im nächsten Bild möchte ich Ihnen andeuten, wie die Fixierung auf der hydrierten roten Stufe erfolgt. Sie erkennen hier wieder die hydrierte Form des Xanthommatins, nur ist ein Wasserstoffatom hier am Stickstoff, dort unten am Sauerstoff durch einen Rest R substituiert. Dieser Rest R kann sein entweder ein Zuckerrest, dann bildet sich ein Glucosid, der Rest R kann ein Sulfatrest sein, ein Schwefelsäureester sein, und immer wenn ein solches Wasserstoffatom substituiert ist durch solche Gruppen dann kann die reduzierte Form nicht so leicht, das heißt erst nach Abspaltung des Restes in die oxidierte Form übergehen und so fixiert die Natur die hydrierten instabilen Farbstoffe in leuchtendem Rot. Es sind damit zugleich Stoffe, die Formeltypen weiterer Ommochrome Ihnen gezeigt. Dankeschön. Und das Folgende erscheint uns von allgemeinem Interesse. In dem Ommochromen wurde ein neues, ich sagte es schon, bisher in der Natur nicht beobachtetes Farbstoffsystem, eben das Phenoxazonsystem aufgefunden. In der Technik synthetischer Farben ist dieses System schon seit über 40 Jahren bekannt, ohne dass man seine viel früher schon gemachte Erfindung durch die Natur ahnte. Unter diesen technischen Farbstoffen vom Phenoxazontyp gibt es Vertreter, die als sogenannte Photosensibilisatoren der fotografischen Platte verwendet werden. Sollten die Augenpigmente der Insekten von diesem Typ auch etwas mit der Lichtaufnahme, mit dem Sehvorgang zu tun haben und nicht nur, wie angenommen wird, als Lichtschutzpigmente dienen. Hier ist eine Frage an die Sinnesphysiologie gestellt. Die Ommochrome der Insekten waren die ersten in der Natur aufgefundenen Phenoxazon-Farbstoffe. Bald nach ihrer Entdeckung hat man weitere Vertreter dieses Farbstofftypus in der Natur gefunden. Die Konstitutionsermittlung der Ommochrome lieferte den Schlüssel für die Analyse des farbgebenden Systems der sogenannten Actinomycine. Antibiotisch wirksamer Stoffwechselprodukte von Strahlenpilzen und zugleich den Zugang zu anderen Vertretern dieser Klasse im Reich der Pilze. Sie sehen auf dem Bild oben noch einmal die Formel des Xanthommatins als Typus und sehen, wie diese Grundsubstanz abgewandelt wird durch Substitution in der Farbgruppe der Actinomycine, die von Brockmann untersucht worden sind, und unten sehen Sie Typen von Pilzfarbstoffen, wie sie Gripenberg analysiert hat. Nach ganz neuen Beobachtungen ist es sogar wahrscheinlich, dass das Xanthommatin auch zu den Stoffwechselprodukten des Säugers und vielleicht auch des Menschen gehört. Ob es hier irgendeine Bedeutung besitzt, weiß man nicht. Die Actinomycine sind Antibiotika. Das heißt, sie gehören zu den modernen Waffen des Arztes gegen Infektionskrankheiten, über die wir ja gestern in dem Vortrag von Herrn Domagk so viel Eindrucksvolles hörten. Da sich unter den Actinomycin Arzneimittel gegen bösartige Erkrankungen des Lymphsystems befinden, wird verständlich, dass die Ommochrome - zunächst nur Objekte des wissenschaftlich-spielenden Forschers - die steigende Aufmerksamkeit der pharmazeutischen Industrie gewinnen. Die theoretisch größte Bedeutung aber haben die Ommochrome gewonnen als Merkmale, die nur unter der Wirkung bestimmter Erbfaktoren ausgeprägt werden. Das war das Thema meines allerersten Vortrages in Lindau "Was wissen wir über die Wirkung von Erbfaktoren?". Die Entomologen haben gefunden, dass es Insektenrassen gibt, die keine Ommochrome bilden können. Und die genetische Analyse dieser ommochromfreien Rassen lehrt, dass sie sich von den ommochromhaltigen Wildrassen durch die Veränderung zur Mutation nur einzelner Gene des Erbgutes unterscheiden. Diese Gene müssen somit die Synthese der Ommochrome steuern. Diese Entdeckung ermöglichte erstmalig die Analyse der Genwirkung, das heißt die Beantwortung der gestellten Frage, wie werden bestimmte Außenmerkmale eines Organismus durch die Anwesenheit bestimmter, im Zellkern lokalisierter Erbfaktoren ausgeprägt. Ich darf Sie im nächsten Bild erinnern, an den klassischen Versuch von Alfred Kühn, der diese Entwicklung eingeleitet hat. Wir sehen in diesem Schema die Raupe und Kopf der Mehlmotte Ephestia kuehniella und zwar der Wildform ausgezeichnet durch dunkle Pigmentierung durch Ommochrome. Hier ist eine solche ommochromfreie Mutante, die Raupenhaut ist farblos, die Augen nur rot, der dunkle Farbstoff fehlt und diese beiden Rassen unterscheiden sich nur durch ein einziges Erbmerkmal. Wenn man nun nach Kühn in dieses vorletzte Raupenstadium der farblosen Mutante Gewebe aus der Wildform implantiert, so wird unter dem Einfluss des Gewebes die fehlende Ommochromsynthese nun im Wirt durchgeführt und entstehen aus den farblosen Tieren solche, die sich phänotypisch von den Wildformen nicht unterscheiden. Es muss also hier durch das Implantat die Bedingung übertragen sein, unter denen die irgendwie gestörte Ommochromsynthese ermöglicht wird. Die biochemische Analyse dieses Experimentes hat dann zur Aufstellung dieser Genwirkkette geführt, aus denen Folgendes hervorgeht: Die Ommochrome unserer Farbstoffe entstehen aus der Aminosäure Tryptophan, einem normalen Produkt des Eiweißstoffwechsels durch schrittweisen Abbau über Kynurenin und Hydroxykynurenin. Jeder dieser Schritte wird durch ein charakteristisches Ferment ermöglicht. Diese Fermente sind aber nur vorhanden, wenn bestimmte Gene im Erbfaktorenbestand vorliegen. So kommen wir zum folgenden Schluss: Die Fermente, die bei einem bestimmten Reaktionsschritt katalysieren, werden in Abhängigkeit von Genen gebildet. Gene wirken über Fermente, wenn Gene mutieren, werden die zugehörigen Fermente ausfallen oder verändert und infolge dessen werden chemische Reaktionsschritte hier Teilprozesse der Ommochromsynthese nicht mehr vollzogen. Durch diese Experimente ist gezeigt, und zwar erstmalig gezeigt, dass Gene über Fermente wirken. Die Fermente sind die ersten fassbaren Produkte der Erbfaktoren. Da Fermente spezifische Eiweißstoffe sind, entnehmen wir den Versuchsergebnissen zugleich die wichtige Erkenntnis, dass im Bau der Erbfaktoren die Information liegt für die Synthese spezifischer Eiweißstoffe. Damit wurde ein Grundproblem der Biologie aufgedeckt und im weiteren Experiment zugänglich gemacht. In der Frage, wie die Erbfaktoren einer Zelle die Information für die Synthese spezifischer Eiweißstoffe und damit für die Herstellung aller spezifischen Strukturen der Zelle übermitteln, liegt eines der aufregendsten Probleme der heutigen Biochemie, dessen Lösung aber wohl bevorstehen dürfte. Wir danken es den Insekten, uns ein Gesetz gelehrt zu haben, das inzwischen an vielen anderen Organismen auf breiter Basis bestätigt heute die Analyse der primären im Erbgut gelegenen Steuerungsvorgänge in der belebten Natur erlaubt. Leider können wir den hier gesponnenen Faden nicht weiter spinnen. Wir wenden uns einem anderen Steuerungsproblem aus dem Gebiet der Entwicklungsphysiologie zu. Die meisten Lebewesen entwickeln sich aus einer einzigen Zelle - der befruchteten Eizelle - und die Frage, wie diese Individualentwicklung gesteuert, wie jede Phase der Entwicklung kausal durch die vorhergehende Phase bestimmt wird, umschließt den Problemkreis der Entwicklungsphysiologie. Auch hierzu lehren uns die Insekten mancherlei Grundsätzliches. Ihnen allen ist bekannt, dass die Entwicklung vieler Insekten sich auf dem Wege einer interessanten Metamorphose vollzieht. Aus dem Ei einer Fliege oder eines Schmetterlings schlüpft die sogenannte Larve oder Raupe. Sie wächst heran unter wiederholten Häutungen, den sogenannten Larvenhäutungen. Die ausgewachsene Larve wandelt sich im Vorgang der Puppenhäutung, der sogenannten Verpuppung in eine Puppe um. In der Puppe vollzieht sich die Imaginalentwicklung, an deren Ende die geschlechtsreife Form, die Imago, steht. Sie entschlüpft der Puppe in der sogenannten Imaginalhäutung. Man hat festgestellt, dass diese Folge an Vorgängen Larvenhäutung, Puppenhäutung, Imaginalhäutung durch drei spezifisch wirkende Hormone ausgelöst und gesteuert werden und hier haben wir das zweite Problem vor uns, über das ich in Lindau früher schon einmal gesprochen habe. Damals ist ausgeführt worden, dass die drei Metamorphosehormone nach diesem Schema zusammenwirken in neurosekretorischen Zellen des Gehirns wird das erste Hormon, das adenotrope Hormon gebildet, unter dessen Wirkung produziert die Prothoraxdrüse ein zweites Hormon, das Prothorakalhormon. Seine Gegenwart veranlasst die Epidermis, die Haut, zu einer Häutung. Das Prothorakalhormon befiehlt eine Häutung. Die Form der Häutung wird bestimmt durch die Anwesenheit oder Abwesenheit des dritten Hormons, das in den Corpora allata gebildet wird. Wenn dieses Hormon zugegen ist, und das ist während der ganzen Larvenentwicklung der Fall, erfolgt die Häutung als Larvenhäutung, stellen die Corpora allata die Produktion dieses sogenannten Juvenilhormons auch ein, dann erfolgt eine Puppenhäutung und dasselbe Prothorakalhormon ist schließlich noch für die Imaginalhäutung nötig. Alle drei Hormone, die hier mitspielen, sind inzwischen in Substanz gefasst. Und man kann ihre Wirkung an geeigneten Objekten jederzeit demonstrieren. Wir beschränken unsere Betrachtung heute auf das Prothoraxhormon - das eigentliche Häutungs- oder Verpuppungshormon. Es ist bisher als einziges von den dreien in kristallisierter Form dargestellt worden. Aus einer Tonne frischer Seidenspinnerpuppen lassen sich etwa 75 bis 100 mg des Hormons gewinnen, das wir Ecdyson von Ecdysishäutung genannt haben. Es ist ein bizyklisches System ohne Stickstoff der Formel C18H30O4. Leider kennen wir die Einzelheiten des Baus auch heute immer noch nicht. Wir erhoffen jetzt eine wirksame Hilfe von der Röntgenstrukturanalyse. Aber es konnten in den letzten Jahren mit dem reinen Hormon die physiologischen Wirkungen im Einzelnen studiert werden und von diesen möchte ich Ihnen zwei Beispiele vorführen. Hier wird an einer Fliegenmade eine Ligatur durchgeführt, die das Kopfende vom Hinterende trennt. Das Ergebnis eines solchen Eingriffes ist, wie im nächsten Bild gezeigt, eine Teilverpuppung. Nur das Vorderende verpuppt sich, das Hinterende bleibt Dauerlarve. Dieses Bild erscheint, weil die Metamorphosehormone, die zur Verpuppung führen, im Kopf gebildet werden, und nicht durch die Ligatur in dem hinteren Teil des Tieres gelangen. Wenn man reines Ecdyson in den hinteren Teil in die Dauerlarve hineinspritzt, so vollzieht sie nachträglich noch die Verpuppung. Hier ist gezeigt, wie man mit einer Mikroinjektionsspritze hier in die kleine Larve injiziert und wir injizieren 0,01 ml einer Lösung und zwar eine Menge von 0,01 Gamma also 10^-8 g des Hormons, um eine Verpuppung zu erzielen. Das Ergebnis einer solchen Injektion fällt nach biologischen Versuchen in statistischer Weise aus. Hier sind eine Reihe solcher mit Hormon injizierter Hinterleiber gezeigt und Sie sehen, dass neben Totalverpuppungen, die sich hier vollzogen haben, auch Teilverpuppungen zu beobachten sind und dass auch einige Tiere nicht reagiert haben, wie wir es von einem biologischen Experiment erwarten. Viele von Ihnen werde sich erinnern, dass diese Wirkung Grundlage des physiologischen Testes zum Nachweis und zur Anreicherung des Ecdysons gewesen ist. Das schönste biologische Experiment über die Wirkung des Ecdysons hat Carrol Williams vollzogen und im nächsten Bild sehen Sie aus einer Arbeit von Carrol Williams, was er gemacht hat. Wir haben vorhin den großen Schmetterling, Cecropia platysamia, diesen wunderschönen bunten Spinner gesehen, ein Riesenschmetterling. Und hier oben ist abgebildet das isolierte Hinterstück einer Puppe dieses Schmetterlings. Es ist gezeigt, wie mit kleinen Kanülchen hier zwei Organstückchen hineingebracht werden nämlich neurosekretorische Zellen des Gehirns und Prothoraxdrüse. Also die beiden hormonspendenden Drüsen aus der Prothoraxdrüse wird unter der Wirkung des anderen Implantats das Prothoraxhormon gebildet. Unter der Wirkung dieses Hormons, das wie ich sagte, auch die letzte Phase der Imaginalentwicklung steuert, verwandelt sich nun das isolierte Hinterstück der Puppe in ein Hinterteil des Schmetterlings. Die ganze Form wird verändert, die Farbe wird verändert und das isolierte Hinterstück legt auch Eier ab. Es funktioniert. Es wäre ohne den Eingriff, ohne Zufuhr von Hormon zugrunde gegangen. Das ist nun mit reinem kristallisierten Ecdyson anstelle der zwei Organimplantate wiederholt worden. Im nächsten Bild zeige ich Ihnen dieses einfarbig gelbbraun gezeichnete isolierte Hinterstück auf einer kleinen Agarplatte aufgesetzte Hinterstück einer Puppe, also vor der Imaginalentwicklung, vor der Imaginalhäutung. Würden wir nichts tun, würde dieses isolierte Hinterstück natürlich in kurzer Zeit sterben. Durch Injektion von 6-Gamma Ecdyson ist auch hier die ganze Entwicklung vollzogen, das ist eine Aufnahme des gleichen Präparates. Sie sehen die Veränderung der Form im Sinne des Hinterleibs des Schmetterlings. Sie sehen die Ausprägung der Farben und des Musters. Es wird also hier die ganze Entwicklung unter der Wirkung einer ganz kleinen Menge des Verpuppungshormons nachgeholt. Man kann die kausale Wirkung und Bedeutung eines Hormons im Ablauf eines Entwicklungsschrittes kaum überzeugender dartun. Auch für die Entwicklungsstadien der Säuger und des Menschen wirken Hormone als Regulatoren, doch nirgends vermag man ihre Wirkung so leicht und isoliert zu demonstrieren und zu studieren wie hier. Wie greift nun eigentlich dieses Hormon an. Die Wirkung von Hormonen ist im Einzelnen zumeist noch unbekannt. Wir stehen immer wieder vor der überraschenden Tatsache, dass so winzige Mengen eines Stoffes so revolutionierende Prozesse im Organismus auszulösen vermögen. Ich freue mich, Ihnen sagen zu können, dass Dr. Karlsson in Zusammenarbeit mit dem Max-Planck-Institut für Biologie in Tübingen, Abteilung Beermann, kürzlich mithilfe des Ecdysons eine Beobachtung gemacht hat, die ich für einen ganz entscheidenden Fortschritt halte. Es ist nämlich erstmalig gezeigt worden an diesem Stoff, dass die Funktion der im Kern gelegenen Genorte durch das Hormon beeinflusst wird - in ganz charakteristischer Weise. Wir verdanken Beermann die Erkenntnis, dass jene Teile eines Chromosoms in dem gerade funktionierende Genloci sich befinden, histologisch sich verändern. Es bilden sich hier sogenannte Puffs - Aufblähungen, die wir biochemisch als Auflockerung der Erbsubstanz und Übergang in ihre eigentliche Funktion interpretieren. Die Genetiker haben immer gefordert, dass solche Puffs nicht nur aus einer inneren Gesetzmäßigkeit des Chromosoms entstehen können, sondern dass das umgebende Milieu das Chromosom, die Genloci auffordern müsste, bestimmte Funktionen zu erfüllen, die nun für die weitere Entwicklung nötig sind. Aber man hat niemals die Puffbildung experimentell eindeutig beeinflussen können. Es ist erst jetzt mit Ecdyson gelungen unter Benutzung der Riesenchromosomen der Dipteren an denen man diese Dinge hat so gut verfolgen kann und man hat zeigen können, dass durch geringste Hormonmengen ganz bestimmte Genloci zur Puffbildung, das heißt für uns zur Funktion geführt werden. Wenn wir nun uns an all das erinnern, was vorhin geschildert wurde, dass hier von diesen Genloci aus nun in irgendeiner Weise die Bildung spezifischer Eiweißstoffe eingeleitet wird, dann können wir uns vorstellen, dass durch solche Anforderungen an einzelnen Genloci der Prozess der Bildung spezifischer Enzyme beginnt. Das ist wirklich nur ein Beginn. Und wir wissen noch nicht, wie wir diese Wirkung zu deuten haben, aber ein Fortschritt, den, wie ich sagte, ich außerordentlich hoch veranschlage. Meine Damen und Herren, ein weiteres Beispiel für die Steuerung der Individualentwicklung durch Wirkstoffe liefert uns die Honigbiene Apis mellifica, bei der die Ausprägung verschiedener Geschlechtsformen in das Problem der Ordnung in einem Zellenstaat führt. Ein starker Bienenstock besteht aus etwa 50.000 bis 80.000 sogenannten Arbeiterinnen, und einer einzigen Königin. Im nächsten Bild zeige ich Ihnen die morphologische Differenzierung dieser Typen, in der Mitte die Königin, links die Drohne, rechts die Arbeiterin, das sind Ihnen bekannte Erscheinungen. Die Drohne ist fast so groß, die Königin dunkler als diese. Man weiß, dass die Drohnen, die männlichen Tiere, durch Partenogenese entstehen. Das heißt also aus unbefruchteten Eiern. Während Königin und Arbeiterinnen aus befruchteten Eiern entstehen. Die Entscheidung, ob aus einem befruchteten Ei eine Arbeiterin oder eine Königin wird, fällt allein durch die Brutpflege. Hier sind die Ihnen bekannten verschiedenen Formen der Zellen. Ein befruchtetes Ei, aufgezogen in den kleinen Zellen führt zur Arbeiterin. Ein befruchtetes Ei aufgezogen in den charakteristischen Weiselzellen führt zu der großen Königin. Man beobachtet, dass die den gleichen Eiern entschlüpfenden Larven unterschiedlich in den verschiedenen Zellen ernährt werden. Während die Arbeiterinnenmade nur mit einem stecknadelgroßen Quantum Arbeiterinnenfutter versorgt wird, erhält die als Königin ausersehene Larve in der großen Weiselzelle ein reiches Angebot an sogenanntem Weiselfuttersaft oder Gelee Royal, das in der Futtersaftdrüse der Ammenbienen bereitet wird. Im nächsten Bild sehen Sie einen schematischen Schnitt durch die Biene und hier im vorderen Teil liegen eine Reihe von Drüsen, die hier gezeichnete ist die Futtersaftdrüse, die das Gelee Royal produziert. Trotz vieler Mühe - ich möchte noch einmal wiederholen - man gewinnt den Eindruck, dass die Determination des Eies zu einer Königin durch dieses Weiselfutter erfolgt, also durch die Fütterungsart. Bringt man nämlich eine Bienenmade unmittelbar nach dem Schlüpfen im Stock aus einer normalen Brutzelle, in der sie sich zu einer Arbeiterin entwickelt hätte, in eine Weiselzelle, so wird sie dort mit Gelee Royal gefüttert und wird zur Königin. Aber trotz vieler Mühe hat man bisher vergeblich versucht, eine junge Larve außerhalb des Bienenstocks zu einer Königin heranwachsen zu lassen durch Fütterung mit Gelee Royal. Und es hat deshalb bis in unsere Tage hinein nicht an Stimmen gefehlt, die ganz unbekannten Faktoren der Brutpflege, die Determination der Larve zur Königin zusprechen wollten. Die Verhältnisse haben sich grundlegend gewandelt. Nachdem es Fräulein Dr. Hanser in unserem Institut kürzlich gelungen ist, die Bedingungen zu finden, unter denen man im Brutschrank aus dem Bienenstock unmittelbar nach dem Schlüpfen entnommene präsumtive Arbeiterinnenlarven allein durch Verfütterung von Weiselfutter, das heißt also unter Ausschaltung aller anderen Faktoren der Brutpflege aus ihnen völlig normale Königinnen zu züchten. Die Versuchsanordnung von Fräulein Dr. Hanser ist in diesem Bild gezeigt. Es ist ein kleines Holzbrett und Sie sehen, es sind darin gestellt die kleinen künstlichen Waben. Sie bestehen aus kleinen Glasgefäßen, wie hier eins besonders abgebildet ist. Und Sie erkennen vielleicht in diesen Gefäßen hier schwimmend die sich entwickelnden Larven. Sie schwimmen in Weiselfutter. Wenn es gelingt, junge Larven vor dem Ablauf ihrer ersten zwei Lebenstage in einer Zeit, in der sie besonders empfindlich sind, lebend und ungeschädigt in das Versuchsgefäß zu bringen, entwickeln sie sich im Brutschrank bei einer normalen Stocktemperatur von 35° beim Füttern mit Gelee Royal zu Königinnen. Larven, die am Ende des zweiten Lebenstages oder später den Bedingungen desselben Versuches unterworfen werden, entwickeln sich stets zu Arbeiterinnen. Allerdings können sie unter dem Einfluss des herrschaftlichen Futters zu Riesenarbeiterinnen heranwachsen, wie sie im normalen Bienenstock selten oder gar nicht vorkommen. Das Ergebnis der Versuchsanordnung sehen Sie hier. Sie sehen links eine normale Königin aus dem Stock. Sie sehen ganz rechts eine normale Arbeiterin aus dem Stock. Das ist eine von uns im Laboratorium gezüchtete Königin aus einer kleinen Larve, die im Stock eine Arbeiterin ergeben hätte. Und hier ist eine sogenannte Riesenarbeiterin, die also entsteht, wenn man die Larve zu spät in den Versuch nimmt, das heißt also, wenn die eigentliche Determination schon vollzogen ist. Die Königin unterscheidet sich von der Arbeiterin nicht nur in der Größe, sondern vor allem in der Entwicklung der Eierstöcke und außerdem an einer anderen morphologischen Gestaltung der Mundwerkzeuge. Es fehlen der Königin außerdem an den Hinterbeinen die zum Pollensammeln dienenden Werkzeuge, die Bürsten und Körbchen, kurz: Es ist nicht etwa so, dass eine Königin lediglich sich von der Arbeiterin in der Größe und in der Ausbildung der Eierstöcke unterscheidet, sondern die ganze morphologische Gestalt ist eine andere. Darum ist es wichtig zu sehen, dass die im Brutschrank experimentell erzeugten Königinnen sämtliche Merkmale einer normalen Königin zeigen, sie werden auch von einem Bienenvolk als Weisel angenommen. In einem Bild darf ich Ihnen die unterschiedliche morphologische Ausprägung der Mundwerkzeuge zeigen. Rechts bei der Arbeiterin mit dem langen Rüssel, links bei der Königin. Und Sie sehen hier ganz deutlich die verschiedene morphologische Differenzierung. Nun es ist damit folgendes Ergebnis zu verzeichnen: Es zeigt sich eindeutig, dass die Entscheidung über das biologische Schicksal einer Larve in den ersten 48 Stunden ihres Lebens erfolgt und zwar ausschließlich durch die Art der Fütterung. Ob, wie wir als wahrscheinlich annehmen möchten, im Gelee Royal ein determinierender Stoff spezifischer Wirkung vorkommt oder was auch möglich bleibt, die Determination der Larve zur Arbeiterin durch eine Mangelernährung während der sensiblen Periode erfolgt, ist offen. Aber nun ist die experimentelle Grundlage gelegt, um diese Frage zu entscheiden und wir haben mit Versuchen begonnen, Gelee Royal zu fraktionieren und nun einzelne Fraktionen in den Test der Königinnenentwicklung im Brutschrank zu prüfen. Wir erwarten die Versuche der nächsten Saison wiederum mit besonderer Spannung. Meine Damen und Herren, ich möchte hier dieses Problem der Determination auch abschließen. Die Zeit ist schon fortgeschritten und ich möchte im letzten Teil auch auf ein Problem zurückkommen, das in früheren Vorträgen hier schon einmal angeklungen ist. Auf das Problem der Verständigung der Insekten untereinander durch chemische Stoffe. Wir nennen Stoffe, die in einem Individuum gebildet werden, von diesem auf das andere übertragen und von diesem als Nachrichtenübermittlung empfunden werden Pheromone. Pheromone sind also Sendboten chemischer Stoffe von Individuum zu Individuum. Es gibt deren viele und wir können sie auch als Wirkstoffe der sozialen Korrelation bezeichnen, weil gerade in den staatenbildenden Insekten diese Pheromone in größerer Zahl gebildet werden, damit die Individuen sich verständigen. Zu den Pheromonen gehören die art- und geschlechtsspezifischen Duftstoffe der Insekten, die von Männchen oder Weibchen erzeugt werden, um den anderen Partner anzulocken oder von der Gegenwart des Geschlechtsgenossen zu verständigen. Wir haben uns mit einem solchen geschlechtsspezifischen und artspezifischen Sexuallockstoff beschäftigt, und zwar beim Seidenspinner. Und im letzten Jahr wurde der seit 20 Jahren angestrebte Erfolg erreicht, hier erstmalig ein solches Pheromon einen solchen geschlechtsspezifischen Sexuallockstoff zu isolieren und in der chemischen Konstitution aufzuklären. Bei vielen Insekten wird das sich Finden der Geschlechtspartner durch so artspezifische Lockdüfte ermöglicht. Nähere Kenntnisse über ihre Wirkung sind vornehmlich an Schmetterlingen gewonnen worden, deren außergewöhnliche Geruchsleistungen schon früh auffielen. Insektenliebhaber und Entomologen haben durch zahlreiche Beobachtungen gezeigt, dass die Weibchen vieler Schmetterlingsarten ihre Männchen aus weiter Entfernung anlocken. Ich möchte einen schönen Versuch aus der neueren Literatur erwähnen, der an chinesischen Seidenspinnern gemacht wurde. Männliche Falter dieses Schmetterlings wurden einzeln markiert und aus einem fahrenden Eisenbahnzug in verschiedene Entfernungen vom Ausgangsort freigelassen, an dem sich unter einer Gazeglocke ein Weibchen der Art verbarg. Aus 4,1 km Entfernung fanden noch 40 %, aus 11 km Entfernung noch 26 % der ausgesetzten Männchen zu ihrem Weibchen zurück. Durch eine Reihe leicht durchführbarer Experimente kann man sicher zeigen, dass die Weibchen in besonderen Duftdrüsen geschlechts- und artspezifische Stoffe produzieren, die man aus diesen Drüsen mit Lipoid-Lösungsmitteln extrahieren kann und die vom Männchen mithilfe von Sensillen auf ihren Fühlern wahrgenommen werden. Wir wissen heute, dass die Wahrnehmung dieses Duftes das Männchen veranlasst, gegen die Luftströmung, gegen die Windrichtung zu fliegen und sich so auf die Suche nach dem Geschlechtspartner zu begeben. Dieses Verhalten erklärt, warum die Männchen oft aus so weiter Entfernung angelockt werden. Sie zählen nicht etwa die Konzentration der Moleküle, sondern ein Duftmolekül bedeutet "Fliege auf gegen die Windrichtung" und wir können leicht erkennen, dass in den meisten Fällen ja dieser Lockstoff mit dem Wind gekommen sein muss und dass man deshalb die Wahrscheinlichkeit nicht gering schätzen muss, dass das Männchen nun das Weibchen findet. Es sind viele Ortsversuche angestellt worden solche Duftstoffe zu isolieren, um ihre chemische Konstitution kennenzulernen. Zumeist dienten dabei Schadinsekten, wie Nonne, Traubenwickler, Schwammspinner. Und mit den Extrakten aus den weiblichen Duftdrüsen dieser Arten versuchte man im Freiland deren Männchen anzulocken. Die Zahl der eingefangenen Männchen diente als Maß für die Wirksamkeit des jeweiligen Extraktes. Die Kenntnisse, die man auf diese Weise in 40-jähriger Erfahrung über die Natur solcher Sexualduftstoffe gesammelt hat, waren ganz außerordentlich gering. Wir begannen 1939 uns mit der biochemischen Kennzeichnung, wie ich schon sagte, des Sexuallockstoffes des Seidenspinners Bombyx mori zu beschäftigen. Er war bis dahin für diese Versuche nicht verwendet und hatte doch große Vorteile fürs Laboratorium, es handelt sich um ein Haustier, das man leicht züchten kann, das in der Seidenindustrie in größerer Menge zu beschaffen ist. Die Falter nehmen keine Nahrung mehr auf, man kann sie in offenen Schalen halten, weil sie nicht fliegen und die normalerweise fast unbeweglich verharrenden Männchen geraten in Gegenwart eines weiblichen Seidenspinners oder unter dem Einfluss eines Extraktes aus den Hinterleibspitzen des Weibchens in starke Erregung, die sich bis zum schnellen Flügelschlag und rotierend suchender Bewegung steigert. Und darin liegt die Grundlage für den zur chemischen Aufarbeitung benötigten Test. Wir haben seit 1939 jeweils in den Sommer- und Herbstmonaten Versuche zur biochemischen Kennzeichnung dieses Lockstoffes durchgeführt. Den Zugang zu diesem interessanten Arbeitsgebiet verdanken meine Mitarbeiter und ich dem Vorschlag und Rat von Walter Schoeller, dem damaligen Leiter des Hauptlaboratoriums der Schering AG in Berlin, der, wie ich glaube, zu unserer Freude auch heute unter uns weilt. Die Wahl des Versuchsobjektes dieses einfachen Versuchsobjektes erfolgt auf Anraten des Entomologen Görnitz, der nach orientierenden, gemeinsam mit Schotte im Schoellerschen Laboratorium in Berlin durchgeführten Versuchen die Möglichkeit erkannte, dem allgemeinen Charakter des Sexuallockstoffe der Lepidopteren unter Verwendung des Seidenspinners als Laboratoriumsbeispiel näher zu kommen. Sie sehen hier einen Seidenspinner und bei sexueller Erregung stülpt das Weibchen aus dem letzten Hinterleibssegment zwei Drüsen aus, die Sacculi laterales. Sie sind gelb gefärbt und man kann aus diesen Drüsen mit Lipoid-Lösungsmitteln den Lockstoff extrahieren. Die Männchen sitzen sehr ruhig nach dem Schlüpfen dort. Sie sind gekennzeichnet durch die großen Antennen. Sie behalten fast ihre Ruhelage. Zum Testversuch auf Lockstoff kann man sie in offenen Schalen halten, wo sie einzeln sitzen und in folgender Weise zum Test verwendet werden. Wir führen zunächst einen reinen Glasstab in das Glasgefäß hinein, bringen ihn vor die Antennen und verlangen, dass sich die ruhige Haltung des Tieres nicht ändert. Wenn wir nunmehr die Spitze dieses Glasstabes in einen Lockstoff enthaltenen Extrakt hineinstecken, dann findet sofort dieses intensive Schwirren statt. Es ist für uns das deutlichste Kennzeichen geworden, dass überhaupt noch Leben in dem Tier ist. Diese Tiere leben etwa acht Tage ohne Futteraufnahme, wie ich schon sagte. Wenn man glaubt äußerlich, sie seien nicht mehr am Leben, kann man mit diesem Lockstoff noch feststellen, ob sie die allerletzten Bewegungen dieser Art noch versuchen. Man kann also diese Reaktion zum Test ausbilden. Man kann eine Lockstoffeinheit definieren etwa in der Weise, dass man sagt, eine Lockstoffeinheit von 1 Gamma soll bedeuten, dass die Substanz in einer Konzentration von 1 Gamma pro Kubikzentimeter bei 50 % der Versuchstiere noch diesen Erregungstanz hervorruft, wenn wir in die Lösung die Spitze des Glasstabes - des Zauberstabes stecken. Aus ersten Versuchen des Jahres 39 und 40 über die Anreicherung chemischer Kennzeichnung des Lockstoffes war zu entnehmen, dass es sich um einen lipoidlöslichen neutralen und unverseifbaren Alkohol handeln müsse, der beständig ist gegen verdünnte Säuren und Alkali, aber empfindlich gegen Oxidationsmittel. Aus 7.000 weiblichen Schmetterlingen konnten damals 100 mg einer wachsartigen Fraktion gewonnen werden, welche die Lockstoffeinheit in 0,01 Gamma, also 10^-2 Gamma enthielt. Wir glaubten damals schon dem Ziel ziemlich nah zu sein, aber die folgenden Jahre haben gezeigt, dass jene Präparate noch um mehrere Zehnerpotenzen bis zum reinen Lockstoff anzureichern waren. Nachdem wir aufgrund der langjährigen und alljährlich verbesserten Erfahrung erneut den Extrakt aus 500.000 Drüsen im vorletzten Jahr aufarbeiten konnten, wurde das Ziel der Reindarstellung erreicht. Wie ich sagte, gerade 20 Jahre nach Beginn der Arbeiten. Es gelang, reinen Lockstoff in Gestalt von 12 mg aus diesen 500.000 Drüsen und 12 mg eines kristallisierten farbigen Esters darzustellen, aus dem dann der farblose Lockstoff selbst zu generieren ist. Mit der kleinen Menge konnte eine chemische Konstitutionsermittlung durchgeführt werden. Die Formel dieses ersten geschlechts- und artspezifischen Lockstoffes ist hier unten angegeben. Es ist ein Hexadecadien-ol. Das heißt, wir haben eine gerade Kette von 16 Kohlenstoffatomen. Hexadeca ist Grundsubstanz. Wir haben am Ende dieser Kette eine primäre Alkoholgruppe-ol an Kohlenstoffatom 16. Wir haben zwei Doppelbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen 4 und 5 und 6 und 7. Daher ein Hexadecadien-ol. Unser Bild zeigt, wie die wesentlichen Konstitutionselemente gefunden wurden. Der freie Alkohol wurde reduziert zum bekannten Cetylalkohol, der eindeutig identifiziert wurde. Damit war gezeigt, dass eine gerade Kette von 16 Kohlenstoffatomen vorhanden ist. Es ist dann ein farbiger Ester oxidiert worden nach einer Mikromethodik, die eigens zu diesem Zweck entwickelt wurde. Und es sind alle 16 Kohlenstoffatome gefasst in Gestalt der Hydroxycaprinsäure, in Gestalt der Buttersäure und in Gestalt der Oxalsäure. Damit war diese Formel eindeutig ermittelt. Nun weiß der Chemiker, dass in räumlicher Beziehung an einer solchen Doppelbindung immer zwei Isomere möglich sind, die sich nur durch die Lagerung der Atome im Raum ergeben. Wir können sogenannte Cis- und Translagerung an der Doppelbindung, der Substituenten an der Doppelbindung haben. Das bedeutet, eine Verbindung dieser Formel existiert in 4 Isomeren. An beiden Doppelbindungen kann Cis, an beiden kann Trans sein. An dieser Cis, an jener Trans oder an dieser Trans an jener Cis Konfiguration. Spektroskopische Untersuchungen zeigen, dass eine der Doppelbindungen eine Trans-, die andere wahrscheinlich eine Cis-Konfiguration hat. Darauf würde die Zahl der 4 Isomere auf 2 zurückgehen. Wir haben im letzten Jahr uns bemüht, diese 4 Isomere Hexadecadien-ole darzustellen und es ist auch gelungen synthetisch. Diese Isomeren sind einander außerordentlich ähnlich, wie man erwarten muss. Und die Hoffnung, meine Damen und Herren, Ihnen nun heute über die physiologische Testung der 4 Isomeren berichten zu können, hat sich nicht erfüllt, weil wir noch keine Seidenspinner haben. Diese Tagung ist etwa 14 Tage zu früh einberufen worden. Wir werden diese 4 Isomeren austesten. Wir sind überzeugt, dass die Synthese des Lockstoffs selbst gelungen ist, welche der Isomeren nun der eigentliche Lockstoff ist, und wie stark sich die verschiedenen Isomeren quantitativ in der physiologischen Wirkung unterscheiden werden, ist eine Frage, die wir mit Spannung in den nächsten Wochen studieren können. Bemerkenswert ist die extrem hohe physiologische Wirkung des Lockstoffes. In der Testlösung, mit der man nach der Definition der Lockstoffeinheit die Wirksamkeitsgrenze prüft, befinden sich 10^-10 Gamma in einem Kubikzentimeter. An der Glasstabspitze, die mit der die Testlösung benetzt wird, bleiben etwa 10^-2 Kubikzentimeter Lösung haften, das sind rund 1.000 Moleküle an der Glasstabspitze. Der mit dieser geringen Molekülzahl behaftete Zauberstab bringt 50 von 100 einzeln gehaltenen Seidenspinnermännchen zum Flügelschlag. Berücksichtigt man, dass der Dampfdruck des Hexadecadien-ole nicht hoch ist und die verdampfenden Moleküle ja den Luftraum zwischen Glasstab und Antenne zu überbrücken haben, so dürften nur einzelne oder sehr wenige Moleküle die sensiblen Elemente der Antenne erreichen. Den Biochemiker überrascht der relativ einfache Bau eines Stoffes mit so spezifischer Wirkung, denn dieser Stoff wird ja nur vom Seidenspinnermännchen, nicht von anderen als Lockstoff wahrgenommen. Und dieser Lockstoff enthält keine Verzweigung der Kohlenstoffatome, kein asymmetrisches Kohlenstoffatom. Offenbar liegt ein Teil der Spezifität in der Konfiguration des konjugierten Doppelbindungssystems. Das Studium der Beziehung zwischen Konstitution und Wirkung dürfte daher an diesem Beispiel besonders interessante Ausblicke bieten. Nun, die Kenntnis vom Bau des Sexuallockstoffes des Seidenspinners hat für sich natürlich nur theoretisches Interesse. Wir erwarteten jedoch von vornherein, dass die spezifischen Sexuallockstoffe der Schmetterlinge alle dem gleichen Stofftypus angehören, und uns somit im Bombyx-Lockstoff der Schlüssel zur Verfügung steht, der den Zugang zu den übrigen Sexuallockstoffen öffnen wird. Dem könnte ja möglicherweise praktische Bedeutung zukommen zur Bekämpfung jener Schmetterlinge, die als Pflanzenschädlinge gefürchtet sind. Bekanntlich sind die heute gebräuchlichen Insektizide, wir hören ja noch morgen von ihnen, keineswegs nur für Insekten wirksame Gifte, auch andere Tierarten werden geschädigt und auch für den Menschen können die mit Insektiziden behandelten Pflanzen gefährlich werden. Leider werden gemeinsam mit den Schadinsekten auch nützliche Insekten vernichtet und die mangelnde Selektivität der heute verwendeten Schädlingsbekämpfungsmittel kann zu starken Störungen des biologischen Gleichgewichtes in dem behandelten Biotop führen. Außerdem führt der Einsatz der Insektizide zur Entwicklung resistenter Stämme, die sich der Wirkung des verwendeten Mittels entziehen. Der Gedanke, spezifische Sexuallockstoffe zur Bekämpfung der Schadinsekten einzusetzen, ist alt und bestechend. Man könnte möglicherweise mit einem technisch herstellbaren Sexuallockstoff eines Schadinsektes ausschließlich dessen Männchen aus einem Distrikt herauslocken, diese fangen und damit die weitere Vermehrung der Art unterbrechen. Die Ausbildung einer Resistenz gegen den lockenden Duft der begehrten Weibchen ist, wie ich glaube, nicht zu befürchten. Meine Damen und Herren, ich freue mich, Ihnen sagen zu können, dass ein erster Schritt im chemischen Gebiet nach dieser Richtung inzwischen gemacht wurde. In einer Arbeitsgruppe unter Führung von Haller in Washington ist vor Kurzem unter Verwendung der von uns entwickelten Methodik, am Seidenspinner entwickelten Methodik, der Sexuallockstoff des Schwammspinners, der Gypsy Moths, isoliert und in reiner Form dargestellt und analysiert worden. Die Gypsy Moth gehört zu jenen Insekten, die ganz außerordentlichen Schaden anrichten. Und nun kommt das für uns Erfreuliche. Was ist dieser Stoff chemisch? Er enthält auch 16 Kohlenstoffatome in gerader Kette. Er ist auch ein primärer Alkohol wie unser Stoff. Aber er enthält nicht zwei Doppelbindungen, sondern eine und anstelle der anderen Doppelbindung eine Sauerstofffunktion, eine acetylierte Hydroxylgruppe. Die Lage der Doppelbindung und der Acetoxygruppe sind noch nicht bekannt. Aber das was bekannt ist, zeigt schon, dass unsere Idee richtig war, dass der Seidenspinner uns den Schlüssel liefern würde für die Lockstoffe von Schadinsekten. Mit dem Lockstoff der Gypsy Moth sind Versuche im Freiland gemacht worden, die insofern erfolgreich waren, weil man mithilfe dieses Stoffes in einem Biotop feststellen konnte, ob überhaupt Schwammspinner vorhanden sind oder nicht, was ja schon wesentlich ist. Und auch das wäre ein Gewinn, wenn sich die Hoffnung zerschlagen sollte, nun eine wirkliche Bekämpfungsaktion mit dem Lockstoff zu machen. Meine Damen und Herren, ich möchte hier abbrechen, ihnen für Ihre Aufmerksamkeit danken und ich hoffe, dass ich Ihnen zeigen konnte, dass alte Probleme, die wir früher hier diskutiert haben, immer wieder reizvoll sind und langsam leider vorangehen, aber doch vorangehen.

Adolf Butenandt (1960)

From the Biochemistry of the World of the Insects (German presentation)

Adolf Butenandt (1960)

From the Biochemistry of the World of the Insects (German presentation)

Comment

At the age of 36, Adolf Butenandt was awarded one of the 1939 Nobel Prizes in Chemistry for his work on sex hormones. He had isolated and structurally characterized the mammalian sex hormones oestrone, androsterone and progesterone, which all play important roles in sexual development and reproduction. In the year of his award, however, he embarked upon a new endeavour: the first-ever isolation of a sex pheromone (a sexual attractant) from an insect.This proved to be a serious challenge. It took some 20 years, before he and his team were finally successful and he could report the isolation and characterization of what he called bombykol to the Lindau audience. Bombykol is a relatively simple molecule that is released by the female silk moth (Bombyx mori) to attract mates. Despite its simplicity, the molecule is amazingly potent. Butenandt reports, that even if released in 11 kilometres distance to a female, 26 % of male silk moths would still find their way back. Furthermore, if as little as 1,000 bombykol molecules were introduced to containers holding 100 male silk moths, half of the moths would start moving their wings excitedly, Butenandt says, implying that only a few molecules are sufficient to trigger a reaction. Even today (2013), this stunning sensitivity is unmatched by any form of modern analytical instrumentation at our disposal. Our own olfactory system is equally outclassed by the silk moth: the lowest concentration of an odorant detectable by the human nose is about 0.01 nanomol [1], which corresponds to around six trillion molecules in a litre of air. The 20 years it took Butenandt and his team to isolate bombykol from female silk moths shows, that obtaining sufficiently large quantities of such natural products can be a cumbersome task. In the case of bombykol, 500,000 female silk moths were processed to obtain merely 15 milligram of substance. Notably, this minute quantity was sufficient for a complete structural elucidation. For the pigment xanthommathin, things looked slightly better. Here, 100 milligram could be isolated from the wings of 10,000 moths and another 19 milligram from the eyes of 7,800 blowflies. In any case, a lot of patience is required for this kind of work. One of Butenandt’s motivations for studying insect pheromones was the idea, that they might be used as a way of controlling insect pests. Luring the males away from agricultural areas using pheromones and killing them could be a way to avoid a further spread of the insect plague, Butenandt suggests. And indeed, he should be proven right. Today, hundreds of pheromones have been isolated from various insects. Several of these compounds are used for pest control, covering areas of at least 10 million hectares [2]. Contrary to classical pesticides, pheromones are usually non-toxic, can be used in very small quantities and are highly species specific. The pheromone-based pest control envisioned by Butenandt is hence considered a very “elegant” technique, despite some of its drawbacks (it usually only affects males and does not kill the insects instantly) [2]. The present lecture is the second-last Butenandt ever gave in Lindau. In 1961, he should talk about insect pheromones once more. In the years to come, until 1992, three years before his death, Butenandt participated without speaking himself. With 31 visits to Lindau, he holds the record of most participations amongst all Nobel Laureates. David Siegel[1] D Purves, GJ Augustine, D Fitzpatrick, et al., Neuroscience, 2nd edition, Sunderland (MA, USA), 2001.[2] P. Witzgall, P. Kirsch, A. Cork, Journal of Chemical Ecology 36 (2010) 80.

Cite


Specify width: px

Share

COPYRIGHT

Cite


Specify width: px

Share

COPYRIGHT