Salvador Luria (1981) - Membranes and Transmembrane Channels

It’s a pity that Salvador Luria lectured only once in Lindau. He must have been a brilliant teacher with a talent to inspire young researchers

Ladies and Gentlemen, students and colleagues. It’s very pleasant to be a scientist speaking in a theatre because they give you the flowers before the performance, whereas an actress has to wait until after the performance. Probably the idea is that if they waited until after the performance we wouldn’t deserve the flowers. I think it’s going to be a difficult task. We followed 2 beautiful talks. A little bit like 2 marvellous symphonies which are so beautiful that one forgets that they continue, that the last movement continues 15 or 20 minutes longer than one expected. But I hope I still have enough of the time allotted to me for my own talk. But if the boat is to leave and I continue to talk and the boat is leaving, please feel free to leave and go for the promenade on the 'Bodensee'. Another apology I must make is that I cannot or I do not wish, like many of my colleagues, to talk about the fruit of their meditations and discoveries of many years. Because I feel that as long as I can talk about something that I am actually doing now and which I do not yet understand very well, I keep young. And this is one of the problems that one has in life is to keep as young as possible, or at least to forget that one is getting old. If I wanted to give to this lecture a very impressive title, I would say I want to talk about the molecular biology of transmembrane channels. But it’s really much less impressive than that. The question is that, as most of you know, biological membranes are rather strange things. On the one hand they have a stupid framework consisting of phospholipid molecules which are very impermeable to almost everything except water. And which are really relatively indifferent. Only the specialists really concern themselves about the internal changes with temperature or with other conditions. But in order for substances to go into cell or from one part of the cell into another, if the portions, if the parts of the cells are subdivided by membrane, there has to be some mechanism. And these mechanisms are channels. And these channels are proteins or group of proteins about which the task or people, the very few people fortunately still in the world - nothing like DNA or recombinant DNA. But there are still and already a substantial number of people beginning to understand that there is such a thing as interest in the way things go in and out of membrane. Of course neurophysiologists being the first ones who had to worry about these problems. But what one would like to know about these channels is, of course, first of all the specificity of the conductance for various substances. The rates at which various substances go through and what determines those rates. The dependence of the conductance for various substances on external stimuli, either chemical or electrical. And finally how they are formed and organised within the membrane. And to make clear about the various types of channels that we have, I would like to show you in the first slide a few types of membranes. This being the cytoplasmic membrane, let’s say of something, possibly of a bacterium or of a cell or of nerve fibres. Some are intelligent channels, for example the ones that regulate the transport of substances across the membrane. Either purely because of differences in the concentrations of specific substances, or because of actual coupling with energy from ATP or in other ways, as we’ll see later. Then we have not only the intelligent but the neurotic channels, that is those which are gated by the electrical potential. That is the membrane potential as it determines the permeability of channels for sodium or for potassium and so on. Then we have somewhat less intelligent channels which do not discriminate very much. And an example of that are the gap junctions that form between cells, for example in the very early embryo of most animals. And which can be formed, open or closed, either functionally or also developmentally, so that cells at a certain point stop being tightly coupled by gap junctions. And then finally we have another class which I would call the most stupid ones, but not quite stupid enough for my own taste. And an example of that are the so-called porins or matrix proteins or the outer membrane of bacteria. Bacteria of course like mitochondria have 2 membranes, an inner cytoplasmic membrane with all of the intelligent things. And an outer membrane which, not having any energy available, has to provide holes or channels through which substances up to about the molecular weight of 1,000 can go through and reach the active region. Now all of these membranes, all of this type of membranes on this slide have one unpleasant feature. In the course of the growth or the formation of the cell, the proteins of these channels have to go and insert themselves into the membranes. And therefore in general the biochemist who has tried to work with them finds that they are more or less distasteful, because they generally are poorly soluble in water. And when it comes to things which are poorly soluble in water biochemists prefers to turn the other way and look into the swimming pool. Now for example in the first class we can put the acetylcholine receptor – which is practically the only receptor for a neurotransmitter that has been purified and isolated in a satisfactory way. And that took approximately I’d say 10 to 15 years. In the case of the outer membrane pore of bacteria the matrix protein has been purified in a couple of laboratories after 5 or 6 years of work. So when many years ago I became interested in the idea of how things may go through membrane and so on, I thought, in fact in became interested because I became interested in a class of proteins which are really very remarkable. They are called colicins of the E group or the E1 group. And these colicins are antibiotics that attach themselves to certain bacteria and kill them. And as I will show you in this very brief talk, they kill them by doing exactly what a biochemist would like to do: by inserting themselves in the phospholipid bilayer of the cytoplasmic membrane. And they are creating a hole whose conductance is non-specific, relatively non-specific, and allows substances to pass, which have molecular weights up to about 800 or 900. And so what I am going to do now is to tell you a little bit the history of the battle that myself and my students have carried out against these proteins for a number of years. The next slide shows the effect of some of the proteins of this group. If you mix bacteria with sufficient amount of one of these proteins, you'll find that a whole series of physiological effects occur: The synthesis of protein RNA, the next should be DNA, and glycogens are arrested. Active transports, most of them, are actually blocked. Bacterial motility is blocked. And ATP levels decrease. And the remarkable point that I would like you to keep in mind is that all of these events are the results of a single molecule of colicin, attaching itself to a single bacterium. The kinetics is strictly first order. And as we know now, one molecule is sufficient to produce these effects. And we thought about strange possibilities of how to explain this several years ago, although now we have an explanation which is extremely simple and somewhat less interesting. Now whenever you see that one molecule of a protein interacting with a bacterium can do all of these things, you immediately think that it must act at the level of the energy metabolism. Because that’s the one place where all of these phenomena are going to be bound. Now the next slide shows a very simple way. A scheme of the energy metabolism of a bacterium like Escherichia coli growing with glucose as the only or main carbon source. And of course out of glucose can get phosphate or pyruvate, which is used in bacteria to bring in more glucose and mostly used to produce ATP. ATP is used for all of the syntheses. On the other hand we have electron transport with all of its intermediates. And the electron transport as well as the ATP with the mediation of a calcium magnesium activated ATPase. Both serve to generate what used to be called energised stratum membrane, and which we now call the proton motive force which has been shown now directly to energise bacterial motility and the active transport of a variety of substances. I hope everybody in this audience will forgive me when I say 'energise directly', because I do not want to enter into the question of whether the proton motive force is used directly at the level of certain proteins to transport substances. Or there might be some intermediates which Peter Mitchell would like not to hear about. And I agree with him. Now given this complexity it was quite clear that in some way the colicin had to affect somewhere this general complex. Either at the level of the ATP itself, therefore reducing this. Or at the level of the proton motive force itself. Or at the coupling of the proton motive force with these functions. And we solved this problem by making a second slide. The next slide. I give you about 10 seconds time to see how it differs from the other. (laughter) This is a mutant of course. I have to have bacterial mutants, otherwise I would not be true to my past. And this is a mutant that is blocked in the ITPase, which is the only ATPase functional in the bacterial cell. In such a mutant the proton motive force can be generated only by electron transport, and not from ATP. And therefore the effects of colicin on this mutant should reveal whether we are damaging here or here. And the next slide shows what happens when colicin acts on the ATPase-defective strain of E. coli. And here it turns out of course that respiration continues, which is fortunate, otherwise the experiments could not be done. But the synthesis of micro molecules, RNA, DNA and proteins and glycogen continue. And the ATP levels increase so that - what is happening here? We have created bacteria which are still able to make protein, to make RNA and DNA. They have a higher level of ATP now because the ATP is not wasted in charging the proton motive force, this squiggle. But the motility is still abolished and the accumulation of potassium, rubidium, galactosides, amino acids is still abolished. But now we notice that pre-accumulated substances come out of the cell. So we conclude that the effect of the colicin on the energy metabolism must be on the site of the proton motive force. And that probably some leakage from the cells is being generated by the single molecule protein. Now the next slide simply tells you a little bit more graphically what the proton motive force must be. It can be generated from ATP through the ATPase or from electron transport. It activates motility in the bacterial cells. It activates active transport. And it is involved in chemotaxis, but that’s not to be discussed here. Now what is the proton motive force? Since I had to learn it a few years ago from reading Mitchell and now students fortunately can study it in text books which are beginning to incorporate something about Mitchell’s theory. The next slide. I put something very elementary. The proton motive force is simply an energy charge across the membrane which consists of 2 components: a membrane potential and a difference in pH, that is immense potential for protons. And the 2 together amount to a force, to a potential of 200 millivolts. Now all of these, according to Mitchell’s theory, are generated because the respiratory chain or ATP through the ATPase, separately and more or less independently, can expel protons from the cell, creating a proton gradient. And the proton gradient across the membrane generates these 2 elements. And it's a membrane potential which is of course in existence already in the cell. But it is added on to the membrane potential. And in addition there is a gradience of protons which tends therefore to bring protons back into the cells. And it generates 100 millivolt energy charge at pH6 and that of course is dependent on the external pH. Now the question was at this point, can one measure this? Can one find out how one molecule of colicin affects this proton motive force? If it is true, our hypothesis, that this is where it affects it. And the next slide shows how methods developed in any number of laboratories but not in our own, although we used them passively, is that you can measure separately the delta side, that is the membrane potential in a bacterial cell, in which we cannot introduce a microelectrode because the smallest microelectrode is bigger than the biggest cell of E. coli. Therefore we had to do it chemically. It can be done by taking lipophilic cations, radioactively labelled, and then find that these cations are going to partition themselves in and out of the cells depending on the membrane potential. Because of course they can pass through the lipid bilayer. And if the membrane potential is high or negative inside, then they will accumulate here. And they come out when the membrane potential goes down. As far as measuring the pH inside the bacterium, we cannot put a pH-electrode - they don't make them this small. But we can use a radioactive weak acid for which the cell doesn't either transport or a metabolism. And we use for example for E. coli butyric acid, which has been used by many other people. And butyric acid will partition itself according to the difference in pH. The higher the pH here, the lower the concentration of hydrogen ion. Therefore less of the substance will be in this form inside, because in order to come through it has to be protonated. So these are just the tricks that we learned from the membrane physical chemists. And applying these tricks - the next slide - shows that when you add one of these lipophilic cations to a bacterial cell, it accumulates very rapidly. You add the colicin and it goes out. And the membrane potential decreases from about 110 millivolt to less than 10 millivolt in a matter of minutes. So it’s clear that one result, one consequence of the colicin molecule, is to abolish the membrane potential. The next slide is a little bit more puzzling, but we know the answer. This is actually printed directly from the computer. And the computer has been sort of unkind enough not to leave out the set of points that don’t fit the curve. But you have to live with the computer and you have to be honest. In fact, my secretary who was preparing the slides suggested that I have another side made without these 3 points, but I resisted the temptation. But anyway the curve is good enough to show that colicin added to the cell has practically no effect on the delta pH. But that other substances, which are known to be proton conductors, caused a decrease of the difference in concentration of ions. And this turns out to be a very simple reason. As I’ll tell you in a moment, before ending, is that the cells do in fact lose the membrane potential and they do in fact become also permeable to protons, so that protons do pass through. And the reason we don’t see it is because these cells, the rate of penetration of protons through the channels produced by the colicin is much slower than the rate of production and expulsion of protons through the electron transport system that the bacteria have. So that the bacteria are pumping out protons about 20 times faster than the protons can leak inside the cells. And so that the system is working nicely. Now at this point we have to ask the question. This is all very nice. We know that the colicin abolishes the membrane potential. But the question is what does it do. Does it act on the cytoplasmic membrane? Does it act on the outside? Does it disrupt something that we don’t know? Or something of that kind. At this point what we did, obviously, is we went to a simple system. And the simple system is to use liposomes. The next slide please. Liposomes, vesicles of phospholipid which are produced by a variety of ways, sonication, drying, sonication and so on. And they form vesicles that have a single bilayer of phospholipid around them. And these were produced using phospholipid directly from the cell, from the bacteria Escherichia coli, and in approximately the same proportions in which they are present in the cell, about phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol and cardiolipin in appropriate proportions. The interesting thing is the reason, why are they so uniform? The reason they are all so uniform is because my colleague Doctor Kayalar, who did this work with the liposomes, was asked at the meeting whether his liposomes were really all nice and uniform and large. And he didn’t have a slide. So when he came back he made many slides. And we chose the one that shows them all approximately like the same and all very large. If you looked at some other slides, you would find that there are some somewhat smaller. But these are approximately an average of about 600, 700 millimicron in diameter. And the smallest one was probably about 400. So they are really nice. There is a reason for telling you that. And the reason will come when I talk with the last slide. But anyway these are nice liposomes. If you make liposomes in a solution that contains one or more radioactive substances, and then you pass these liposomes through a column or you dialyse them through a medium, you can get rid of the external radioactive substance and you have liposome loaded with radioactive substances suspended in a medium without. So by measuring the radioactivity outside the liposome it’s very easy to see if anything comes out. It’s a little bit more complicated but we have done it to see if anything goes in. And the next slide now shows what happens if you take liposomes that have been made with radioactive rubidium and radioactive sucrose, both of them in the same solution, and you add the colicin. You see that rubidium comes out almost completely, because when you disrupt the liposome very little remains. I don't know how to point here, I'm not tall enough. Sucrose comes out at first more slowly and then even more slowly for quite a while. Now the exit is not simply disruption or a formation of a rapid channel. If there is a control you take the same kind of things but you add here valinomycin. Valinomycin makes an immediate channel for rubidium or for potassium, and they immediately equilibrate. Whereas if you add colicin K, you get again the same kind of slow exit. And what is most interesting, if we think in terms of the natural channels, is that for each substance we study we find that the channel produced by colicin has a specific rate of exit. Which means that this channel produced by a single molecule of colicin has a conductivity which is different for rubidium. It turns out that it’s about ½ if you measure it for sulphate ion. It’s similar for hydrogen ions, and similar to that for sulphate ion. About ¼ for sucrose and much shorter, much lower but still definite for substances like glucose-6-phosphate. And we can measure up to a polymer, a sugar polymer of approximately molecular weight of 750, and it comes out very slowly. Whereas inulin, a molecule of about 4,000 molecular weight, does not come out at all. And I may add that in the case of several other substances that we have studied, they seem to fall into, what I will say approximately, certain classes of conductances. Now the question is, is this really due to one molecule of colicin? Well, that was done - unfortunately I don't have a slide. But it was done in the case of rubidium by taking this initial part of this curve for various concentrations of rubidium and measuring very accurately. And Doctor Celik Kayalar, who is now at Berkeley, has found that the dependence of this initial slope on the concentration of colicin is exactly let’s say between 0.9 and 1.2. Definitely first order reaction. So a single molecule forms the channel. Now the question is, how does it form the channel? How does it go in? And here we have a puzzle which I think will be of interest to other people in membrane biology – if there are some present besides the neurophysiologists, who deal with much higher forms. Some time ago a group under Albert Einstein, Doctor Finkelstein and his co-workers, got some colicin K from us. And they placed it in a system in which you have an artificial membrane, one of the Montal-type, in which 2 monolayers of phospholipid are brought up against one another. And these are connected let’s say in 2 cuvettes into which you can put electrodes. And you can connect them through a voltage CRM system. And you can find out whether the channel, what is the conductance for sodium or potassium ions of the channels, if any. And whether the channel is open or closed immediately when you add the colicin or whether they require an electrical gating. The next slide which is the last shows these 2 systems. Here are the liposomes in water. And here is the type of artificial membrane produced by having 2 monolayers of phospholipid trapped in this little hole. And you have a system here which you can change the polarity and you have a voltage CRM that you can measure recurringly. Now the remarkable thing is that on this system they found that the conductors for potassium and sodium through this thing, produced by adding the colicin on one side or on the other, is definitely gated. That is in order for the sodium or potassium to start going through, you need to apply a potential difference of the order between 10 and 20 millivolt – about 20 millivolt you have open channels - and they close back and forth. So we said we have here the sodium channel, the potassium channel, marvellous. Except that when we went to do the same experiment with liposomes, it turns out that the channels produced by colicin are not gated at all. How do we know? Well any of you who are membranologist would know. All you have to do is to have different potassium concentration, add some valinomycin, and you change the membrane potential. And we changed the membrane potential between minus 100 inside to plus 100 inside in steps. And at each step the additional colicin made no difference at all. The additional colicin continued to make the same kind of channel conductances as it did at any of the other voltages. Now here we have a peculiar situation in membranology. This is not the first case. For example the outer membrane of the bacterial cell, the matrix protein, the channel, has been purified, as I said, by 2 laboratories. The laboratories of Nakae and Nikaido in Japan and in Berkeley find that when they put in artificial membranes that the channel's conductance is completely non-gated, independent of electrical potential. Whereas Schindler and Rosenbusch in Basel find that the same protein put in the same membrane, but in this form rather than in liposome, in this kind of set up, you find the gated situation. And this is also true for the outer membrane channel protein from mitochondria, although that has been done in a very partial way. So here we have a situation in which the simplest arrangement gives us a very simple answer. A more complicated arrangement gives an answer which in my opinion is probably completely wrong. And I mean, apart from the fact that in a more strictly professional audience I would say be careful before you use that kind of membrane. This reinforced my own conviction ever since I started doing experiments in the middle of the 1930s. If you can do something in a simple way without any instrument, do it that way. And you are likely to be more right than people who have big powerful apparatuses. Thank you very much. Applause.

Sehr geehrte Damen und Herren, Studenten und Kollegen. Es ist sehr angenehm, als Wissenschaftler in einem Theater zu sprechen, da man die Blumen vor der Vorstellung erhält, während die Schauspielerinnen bis nach der Aufführung warten müssen. Wahrscheinlich will man nicht bis nach der Rede warten, da wir womöglich keine Blumen verdienen würden. Ich glaube, meine Rede wird eine schwierige Aufgabe sein. Wir haben 2 schöne Reden gehört. Ein bisschen wie 2 herrliche Symphonien, die so schön sind, dass man darüber die Zeit vergisst und bei denen der letzte Satz 15 oder 20 Minuten länger als erwartet dauert. Ich hoffe jedoch, dass von der mir zugeteilten Zeit noch genug für meine eigene Rede übrig bleibt. Wenn jedoch das Boot abfährt und ich noch immer jede, dann zögern Sie nicht, einfach zu gehen, um an der Bodensee-Schifffahrt teilzunehmen. Ich muss mich auch dafür entschuldigen, dass ich im Gegensatz zu vielen Kollegen nicht über das Ergebnis der Überlegungen und Entdeckungen vieler Jahre sprechen werde. Solange ich über etwas spreche, womit ich mich derzeit beschäftige und was ich noch nicht besonders gut verstehe, fühle ich mich jung. Und das ist eben eines der Probleme im Leben, dass man so jung wie möglich bleiben will oder zumindest vergessen will, dass man älter wird. Wollte ich dieser Rede einen sehr beeindruckenden Titel geben, würde ich sagen, dass ich über die Molekularbiologie von Transmembrankanälen sprechen möchte. Es ist aber wirklich nicht so beeindruckend. Wie die meisten von Ihnen wissen, sind biologische Membranen recht seltsame Dinge. Sie verfügen über einen dämlichen Aufbau aus Phospholipidmolekülen, die für fast alles außer Wasser recht undurchlässig sind. Und die auch wirklich ziemlich gleichgültig sind. Nur die Spezialisten beschäftigen sich mit den internen Veränderungen mit der Temperatur oder anderen Bedingungen. Damit jedoch Substanzen in die Zelle oder von einem Teil der Zelle in einen anderen gelangen, wenn die Abschnitte, die Teile der Zellen durch Membranen unterteilt werden, muss es einen Mechanismus geben. Diese Mechanismen sind Kanäle. Und diese Kanäle sind Proteine oder Proteingruppen. Es gibt Personen, von denen viele glücklicherweise noch am Leben sind, nicht so wie bei der DNA oder rekombinanten DNA, also es gibt noch immer und bereits eine große Anzahl von Personen, die zu verstehen beginnen, dass es von Interesse ist, wie Dinge in und aus der Membran dringen. Natürlich mussten sich die Neurophysiologen als erste mit diesen Problemen beschäftigen. Was man vor allem über diese Kanäle wissen möchte, ist natürlich: an erster Stelle, die Spezifität der Leitfähigkeit für verschiedene Substanzen. die Geschwindigkeit, mit der verschiedene Substanzen durchgehen und wodurch diese Geschwindigkeiten bestimmt werden. die Abhängigkeit der Leitfähigkeit für bestimmte Substanzen von externen Reizen, entweder chemischer oder elektrischer Art. und schließlich, wie sie innerhalb der Membran geformt und organisiert werden. Um zu verdeutlichen, welche verschiedenen Kanalarten wir haben, möchte ich Ihnen als erstes Dia ein paar Membranarten zeigen. Das ist die Zytoplasmamembran von etwas, wahrscheinlich von einem Bakterium oder einer Zelle oder von Nervenfasern. Einige sind intelligente Kanäle, wie z. B. jene, die den Transport von Substanzen durch die Membran regeln. Entweder nur aufgrund von Unterschieden in der Konzentration spezifischer Substanzen, oder aufgrund einer tatsächlichen Kopplung mit Energie vom ATP oder auf andere Weise, wie wir später sehen werden. Zusätzlich zu den intelligenten Kanälen gibt es auch neurotische Kanäle, die durch das elektrische Potenzial gesteuert werden. Dies ist das Membranpotenzial, das die Durchlässigkeit der Kanäle für Natrium oder Kalium, etc. bestimmt. Dann haben wir noch etwas weniger intelligente Kanäle, die nicht viele Unterschiede machen. Ein Beispiel sind Gap Junctions, die sich zwischen Zellen bilden, zum Beispiel in den frühen Embryonen der meisten Tiere. Sie können gebildet, geöffnet und geschlossen werden, entweder nach Funktion oder Entwicklung, sodass Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt aufhören, eng durch Gap Junctions gekoppelt zu sein. Und schließlich haben wir noch eine andere Kategorie, die ich als die dümmste bezeichnen würde, ohne dass sie jedoch für meinen Geschmack dumm genug ist. Ein Beispiel hierfür sind die sog. Porine oder Matrixproteine oder die Außenmembran von Bakterien. Bakterien wie Mitochondrien haben natürlich 2 Membranen: eine zytoplasmische Innenmembran mit allen intelligenten Dingen und eine Außenmembran. Da dieser keine Energie zur Verfügung steht, muss sie Löcher und Kanäle bereitstellen, durch die Substanzen mit einem Molekulargewicht von 1,000 dringen und die aktive Region erreichen können. Alle diese Membranen, alle diese Membranarten auf dem Dia haben eine unliebsame Eigenschaft. Im Laufe des Wachstums oder der Bildung der Zelle, müssen die Proteine dieser Kanäle wandern und sich in die Membranen einfügen. Und deshalb findet sie der Biochemiker, der sich mit ihnen beschäftigen will, schrecklich, da sie meist schlecht wasserlöslich sind. Und wenn etwas schlecht wasserlöslich ist, wenden sich Biochemiker am liebsten ab und schauen in das Schwimmbecken. In die erste Gruppe können wir z. B den Acetylcholinrezeptor einordnen, der praktisch der einzige Rezeptor für einen Neurotransmitter ist, der auf zufriedenstellende Weise gereinigt und isoliert wurde. Und das hat ca. 10 bis 15 Jahre lang gedauert. Im Falle der Außenmembranpore von Bakterien wurde das Matrixprotein nach 5 oder 6 Jahren Arbeit in einigen Labors gereinigt. Als ich vor vielen Jahren begann, mich dafür zu interessieren, wie Dinge durch die Membran dringen, interessierte ich mich für eine Kategorie von Proteinen, die wirklich bemerkenswert sind. Sie werden Colicine der Gruppe E oder E1 genannt. Und diese Colicine sind Antibiotika, die sich an bestimmte Bakterien binden und diese töten. Und wie ich Ihnen in dieser kurzen Rede vorführen werde, töten sie sie, indem sie genau das tun, was die Biochemiker tun möchten: Sie schleusen sich selbst in die Phospholipid-Doppelschicht der zytoplasmischen Membran ein. Und sie erzeugen ein Loch, dessen Leitfähigkeit unspezifisch, relativ unspezifisch, ist, und es Substanzen mit Molekulargewichten bis zu 800 oder 900 möglich macht, durchzudringen. Jetzt werde ich Ihnen ein bisschen von dem Kampf erzählen, den meine Studenten und ich über mehrere Jahre gegen diese Proteine geführt haben. Das nächste Dia zeigt die Auswirkung einiger der Proteine dieser Gruppe. Wenn Sie Bakterien mit einer genügenden Menge eines dieser Proteine mischen, werden Sie feststellen, dass eine ganze Reihe von physiologischen Wirkungen auftritt: Die Synthese von Protein-RNA, die nächste sollte DNA sein, und Glykogenen wird gestoppt. Die meisten aktiven Transporte werden blockiert. Die bakterielle Motilität wird blockiert. Die ATP-Werte nehmen ab. Und das Bemerkenswerte, das Sie nicht vergessen sollen, ist der Umstand, dass all diese Ereignisse das Ergebnis eines einzigen Colicin-Moleküls sind, das sich an ein einziges Bakterium bindet. Die Kinetik ist streng erster Ordnung. Und wir wissen jetzt, dass ein Molekül ausreicht, um diese Wirkungen zu erzielen. Vor ein paar Jahren suchten wir nach seltsamen Möglichkeiten, um dies zu erklären, während wir jetzt eine extrem einfache und irgendwie weniger interessante Erklärung haben. Wenn Sie sehen, dass ein Proteinmolekül, das mit einem Bakterium interagiert, all diese Dinge tun kann, denken Sie sofort, dass es auf Ebene des Energiemetabolismus agieren muss. Denn das ist der Ort, an dem all diese Phänomene beheimatet sind. Das nächste Dia zeigt eine sehr einfache Art. Ein Schema des Energiemetabolismus eines Bakteriums wie Escherichia coli, das mit Glukose als einziger oder hauptsächlicher Kohlenstoffquelle wächst. Und natürlich kann aus Glukose Phosphat oder Pyruvat entstehen, was in Bakterien verwendet wird, mehr Glukose reinzubringen und vor allem um ATP zu produzieren. ATP wird für alle Synthesen verwendet. Auf der anderen Seite haben wir einen Elektronentransport mit all seinen Zwischenprodukten. Und den Elektronentransport sowie das ATP mit der Mediation einer Kalzium-Magnesium-ATPase. Beide dienen der Erzeugung dessen, was früher als energetisierte Schichtmembran und jetzt als Protonengradient bezeichnet wird, und von dem gezeigt wurde, dass er die bakterielle Motilität und den aktiven Transport einer Reihe von Substanzen direkt energetisiert. Ich hoffe, dass Sie mir alle im Publikum verzeihen, wenn ich „direkt energetisiert“ sage, da ich nicht auf die Frage eingehen will, ob der Protonengradient direkt auf dem Niveau bestimmter Proteine verwendet wird, um Substanzen zu transportieren. Es kann auch sein, dass es Zwischenprodukte gibt, von denen Peter Mitchell nichts hören möchte. Und ich stimme ihm zu. Bei dieser Komplexität war es klar, dass das Colicin auf irgendeine Weise diesen allgemeinen Komplex beeinträchtigen musste. Entweder auf dem ATP-Niveau selbst, und dieses deshalb reduzierend. Oder auf dem Niveau des Protonengradienten selbst. Oder an der Kopplung des Protonengradienten mit diesen Funktionen. Wir haben dieses Problem gelöst und ein zweites Dia gemacht. Das nächste Dia. Ich gebe Ihnen ca. 10 Sekunden Zeit, um den Unterschied zum anderen Dia zu erkennen. (Gelächter) Dies ist natürlich ein Mutant. Ich brauche bakterielle Mutanten, sonst wäre ich mir selber nicht treu. Und das ist ein Mutant, der in der ITPase blockiert wird, die die einzige ATPase ist, die in der Bakterienzelle funktionstüchtig ist. In einem solchen Mutanten kann der Protonengradient nur durch Elektronentransport und nicht aus ATP erzeugt werden. Deshalb sollten die Auswirkungen von Colicin auf diesen Mutanten zeigen, ob wir hier oder hier Schaden anrichten. Das nächste Dia zeigt, was passiert, wenn Colicin auf den Stamm von E. coli mit defekter ATPase einwirkt. Und hier stellt sich natürlich heraus, dass die Atmung fortfährt, was ein Glück ist, da sonst die Experimente nicht durchgeführt werden könnten. Aber die Synthese von Mikromolekülen, RNA, DNA und Proteinen und Glykogen besteht weiter. Und die ATP-Niveaus steigen weiter – was passiert hier? Wir haben Bakterien erzeugt, die noch immer Protein, RNA und DNA herstellen können. Sie haben nun ein höheres ATP-Niveau, da das ATP nicht vergeudet wird, den Protonengradienten zu laden. Aber die Motilität ist noch immer abgeschafft und die Anreicherung von Kalium, Rubidium, Galactosiden und Aminosäuren ist noch immer abgeschafft. Aber wir stellen jetzt fest, dass zuvor angereicherte Substanzen aus der Zelle dringen. Daraus schließen wir, dass die Auswirkung von Colicin auf den Energiemetabolismus an der Stelle des Protonengradienten erfolgen muss. Und dass wahrscheinlich durch das Einzelmolekül-Protein ein Austritt aus den Zellen erzeugt wird. Das nächste Dia zeigt Ihnen grafisch, wie der Protonengradient aussehen muss. Er kann durch das ATP über die ATPase oder durch Elektronentransport erzeugt werden. Er aktiviert die Motilität in den Bakterienzellen. Er aktiviert den aktiven Transport. Und er ist an der Chemotaxis beteiligt, worüber wir aber heute nicht sprechen werden. Was ist nun der Protonengradient? Ich musste es vor ein paar Jahren lernen, indem ich Mitchell las, und heute können es die Studenten glücklicherweise in Lehrbüchern nachlesen, die beginnen, die Theorie von Mitchell zu integrieren. Das nächste Dia. Ich verwendete etwas sehr Einfaches. Der Protonengradient ist einfach eine Energieladung über eine Membran hinweg, die aus 2 Komponenten besteht: einem Membranpotenzial und einer pH-Differenz, die ein enormes Potenzial für Protonen darstellt. Die 2 gemeinsam bilden eine Kraft, ein Potenzial von 200 Millivolt. All dies wird nach der Theorie von Mitchell erzeugt, weil die Atmungskette oder ATP durch die ATPase separat und mehr oder weniger selbständig Protonen aus der Zelle ausstoßen kann, und somit einen Protonengradienten erzeugt. Und der Protonengradient über die Membran hinweg erzeugt diese 2 Elemente. Es handelt sich um ein Membranpotenzial, das natürlich bereits in der Zelle existiert. Aber es wird zum Membranpotenzial hinzugefügt. Und zusätzlich gibt es einen Protonengradienten, was meist Protonen zurück in die Zellen bringt. Und es wird eine Energieladung von 100 Millivolt bei pH6 erzeugt, die natürlich vom äußeren pH abhängig ist. Die Frage an dieser Stelle war: Kann man das messen? Kann man herausfinden, wie ein Colicin-Molekül diesen Protonengradienten beeinflusst? Wenn unsere Hypothese stimmt, dass der Einfluss hier stattfindet. Und das nächste Dia zeigt, wie in mehreren Labors Methoden entwickelt wurden, aber nicht in unserem eigenen, obwohl wir sie passiv verwendeten. Mit diesen Methoden können separate Messungen der Delta-Seite, d. h. des Membranpotenzials in einer Bakterienzelle, gemacht werden, in die wir keine Mikroelektrode einführen können, da die kleinste Mikroelektrode größer ist als die größte Zelle von E. coli. Deshalb mussten wir chemisch vorgehen. Das ist möglich, indem man radioaktiv markierte, lipophile Kationen nimmt, und dann herausfindet, dass diese Kationen sich selbst in und außerhalb der Zellen teilen, je nach Membranpotenzial. Da sie natürlich die Lipid-Doppelschicht durchdringen können. Und wenn das Membranpotenzial innen hoch oder negativ ist, sammeln sie sich hier an. Und sie kommen heraus, wenn das Membranpotenzial sinkt. Was die Messung des pH im Inneren des Bakteriums anbelangt, können wir keine pH-Elektrode verwenden – so kleine gibt es nicht. Wir können jedoch eine radioaktive schwache Säure verwenden, für die die Zelle weder einen Transport noch einen Metabolismus ausführt. Und wir verwenden z. B. für E. coli Buttersäure, die von vielen anderen Personen auch verwendet wurde. Und die Buttersäure spaltet sich entsprechend der pH-Differenz. Je höher hier der pH ist, umso niedriger ist die Konzentration des Wasserstoffions. Deshalb wird es in dieser Form weniger von dieser Substanz im Inneren geben, da sie für die Überquerung protoniert werden muss. Das sind die Tricks, die wir von den Membran-Physikochemikern gelernt haben. Wenn wir diese Tricks anwenden, sehen wir am nächsten Dia, dass sich beim Hinzufügen eines dieser lipophilen Kationen zu einer Bakterienzelle dieses sehr schnell anreichert. Sie fügen das Colicin hinzu und es geht nach außen. Und das Membranpotenzial sinkt von ca. 110 Millivolt auf weniger als 10 Millivolt binnen weniger Minuten. Eine Auswirkung des Colicin-Moleküls ist also, dass das Membranpotenzial zerstört wird. Das nächste Dia ist etwas mehr erstaunlich, aber wir kennen die Antwort. Es handelt sich direkt um einen Computerausdruck. Und der Computer hat uns nicht den Gefallen getan, jene Punkte auszulassen, die nicht zur Kurve passen. Aber Sie müssen mit dem Computer leben und ehrlich sein. Meine Sekretärin, die die Dias vorbereitete, schlug vor, ein Dia ohne diese 3 Punkte zu machen, aber ich widerstand der Versuchung. Wie auch immer, die Kurve ist gut genug, um zu zeigen, dass das Hinzufügen von Colicin zu einer Zelle praktisch keine Auswirkung auf die pH-Differenz hat. Dass jedoch andere Substanzen, die als Protonenleiter bekannt sind, eine Reduzierung der Ionenkonzentrations-Differenz bewirkt haben. Und dies hat letztendlich einen sehr einfachen Grund. Wie ich Ihnen in Kürze abschließend mitteilen werde, verlieren die Zellen ihr Membranpotenzial und werden für Protonen durchlässig, sodass sie von Protonen durchdrungen werden. Der Grund, warum wir das nicht sehen, ist die Tatsache, dass bei diesen Zellen das Eindringen der Protonen durch die Kanäle, die durch das Colicin erzeugt wurden, viel langsamer ist als die Geschwindigkeit der Erzeugung und des Ausstoßes von Protonen durch das Elektronentransportsystem der Bakterien. So pumpen die Bakterien ca. 20-mal schneller Protonen heraus, als diese in die Zellen dringen können. Somit funktioniert das System prächtig. An dieser Stelle müssen wir eine Frage stellen. Es ist ja alles recht und gut. Wir wissen, dass das Colicin das Membranpotenzial abschafft. Die Frage ist jedoch, wie es das macht. Wirkt es auf die Zytoplasmamembran? Wirkt es auf das Äußere? Unterbricht es etwas, was wir nicht kennen? Oder macht es sonst etwas? An dieser Stelle wandten wir uns natürlich einem einfachen System zu. Und das bedeutet, dass wir Liposome verwendeten. Das nächste Dia, bitte. Liposome sind Phospholipid-Bläschen, die auf verschiedene Arten erzeugt werden: durch Beschallung, Trocknen, etc. Die geformten Bläschen sind von einer einzigen Doppelschicht aus Phospholipid umhüllt. Zur Erzeugung wird direkt das Phospholipid aus der Zelle, von der Bakterie Escherichia coli, verwendet, in ungefähr demselben Verhältnis, in dem sie in der Zelle vorhanden sind, also Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerol und Cardiolipin im richtigen Verhältnis. Interessant ist, warum sie so gleichmäßig sind. Der Grund ist folgender: Mein Kollege Dr. Kayalar, der diese Arbeit mit den Liposomen ausführte, wurde bei einem Treffen gefragt, ob seine Liposome wirklich alle so schön, gleichmäßig und groß seien. Und er hatte kein Dia. Als er zurückkam, machte er viele Dias. Und wir haben jenes ausgewählt, auf dem alle recht gleich und sehr groß aussehen. Auf anderen Dias sieht man einige kleinere Liposome. Diese haben jedoch durchschnittlich einen Durchmesser von 600, 700 Millimikron. Und das kleinste hatte wahrscheinlich einen Durchmesser von 400. Sie sind also wirklich schön. Es gibt einen Grund, warum ich Ihnen das erzähle. Und diesen Grund werden wir sehen, wenn ich das letzte Dia kommentiere. Wie auch immer, es handelt sich um schöne Liposome. Wenn Sie Liposome in einer Lösung machen, die eine oder mehrere radioaktive Substanzen enthält, und dann diese Liposome durch eine Säule leiten oder durch ein Medium dialysieren, können sie die externe, radioaktive Substanz loswerden und Sie verfügen über Liposom, das mit radioaktiven Substanzen geladen ist, in einem Medium ohne solche Substanzen. Durch das Messen der Radioaktivität außerhalb des Liposoms ist es einfach, zu sehen, ob etwas herausdringt. Es ist ein bisschen schwieriger, zu sehen, ob etwas hineindringt, aber wir haben es gemacht. Auf dem nächsten Dia sehen Sie, was passiert, wenn Sie Liposome nehmen, die mit radioaktivem Rubidium oder radioaktiver Saccharose gemacht wurden, beide in derselben Lösung, und Sie Colicin hinzufügen. Sie sehen, dass das Rubidium beinahe vollständig herauskommt, denn wenn Sie das Liposom zerstören, bleibt wenig übrig. Ich kann nicht hinzeigen, ich bin nicht groß genug. Saccharose kommt zunächst langsamer heraus und dann eine Weile lang sogar noch langsamer. Der Austritt ist nicht ein einfacher Bruch oder das Bilden eines schnellen Kanals. Wenn es eine Überwachung gibt, nehmen Sie dieselben Dinge, fügen hier jedoch Valinomycin hinzu. Valinomycin schafft einen sofortigen Kanal für Rubidium oder für Kalium, die sich sofort ausgleichen. Wenn Sie jedoch K-Colicin hinzufügen, erzielen Sie dieselbe Art des langsamen Austritts. Was äußerst interessant ist, wenn wir über die natürlichen Kanäle nachdenken, ist, dass wir für jede untersuchte Substanz herausfinden, dass der durch das Colicin erzeugte Kanal eine spezifische Austrittgeschwindigkeit hat. Das bedeutet, dass der Kanal, der durch ein einziges Colicin-Molekül erzeugt wird, eine andere Leitfähigkeit hat als für Rubidium. Es stellt sich heraus, dass sie ca. halb so groß ist, wenn Sie sie für Sulfationen messen. Sie ist ähnlich für Wasserstoffionen und ähnlich der Leitfähigkeit für Sulfationen. Ungefähr ¼ für Saccharose und viel kürzer, viel niedriger, aber immer noch eindeutig für Substanzen wie Glukose-6-phosphat. Und wir können bis zu einem Polymer messen, einem Zuckerpolymer mit einem Molekulargewicht von ca. 750, und es kommt sehr langsam heraus. Wohingegen Inulin, ein Molekül mit einem Molekulargewicht von 4000 überhaupt nicht herauskommt. Und ich kann hinzufügen, dass einige der Substanzen, die wir untersucht haben, anscheinend in bestimmte Kategorien der Leitfähigkeit fallen. Die Frage ist nun, ob dies wirklich durch ein Colicin-Molekül bewirkt wird. Leider habe ich hierzu kein Dia. Wir haben uns aber bei Rubidium diese Frage gestellt, indem wir diesen Anfangsteil der Kurve für verschiedene Rubidium-Konzentrationen genommen und sehr genau gemessen haben. Dr. Celik Kayalar, der sich nun in Berkeley befindet, hat herausgefunden, dass die Abhängigkeit dieser anfänglichen Steigung von der Colicin-Konzentration genau zwischen 0,9 und 1,2 beträgt. Mit Sicherheit eine Reaktion erster Ordnung. Ein einziges Molekül formt also den Kanal. Die Frage ist, wie es den Kanal formt. Wie kommt es hinein? Hier haben wir eine Problemstellung, die sicher andere Personen in der Membranbiologie interessieren wird. Vielleicht sind einige zugegen neben den Neurophysiologen, die sich mit viel höheren Formen beschäftigen. Vor einiger Zeit hat eine Gruppe unter Albert Einstein, Dr. Finkelstein und seinen Mitarbeitern von uns etwas K-Colicin bekommen. Sie haben es in ein System mit einer künstlichen Membran der Montal-Art gebracht, in der 2 Einzelschichten aus Phospholipid aufeinander stoßen. Sie werden in 2 Becken miteinander verbunden, in die Sie Elektroden geben können. Und Sie können sie über ein Spannungs-CRM-System verbinden. Sie können die Leitfähigkeit für die Natrium- oder Kaliumionen der Kanäle, falls vorhanden, herausfinden. Und ob der Kanal sofort geöffnet oder geschlossen wird, wenn Sie Colicin hinzufügen, oder ob eine elektrische Steuerung (Gating) erforderlich ist. Das nächste Dia, das das letzte ist, zeigt diese 2 Systeme. Die Liposome befinden sich hier in Wasser. Und hier wird die künstliche Membran dadurch erzeugt, indem 2 Einzelschichten aus Phospholipid in diesem kleinen Loch gefangen werden. Und Sie haben hier ein System, dessen Polarität Sie ändern können, und einen Spannungs-CRM, den sie wiederholt messen können. Bemerkenswert ist, dass bei diesem System herausgefunden wurde, dass die Leiter für Kalium und Natrium durch dieses Ding, das durch das Hinzufügen von Colicin auf der einen oder anderen Seite geschaffen wird, bestimmt gesteuert werden. Damit das Natrium oder Kalium beginnen, durchzudringen, müssen Sie eine Potenzialdifferenz von 10 bis 20 Millivolt anlegen. Bei ca. 20 Millivolt haben Sie offene Kanäle, die zu- und wieder aufgehen. Wir haben hier also den Natriumkanal und hier den Kaliumkanal, das ist wunderbar. Als wir jedoch dasselbe Experiment mit Liposomen durchführten, stellte sich heraus, dass die durch das Colicin erstellten Kanäle überhaupt nicht gesteuert waren. Wie wir das wissen? Nun, alle Membranbiologen unter Ihnen würden das wissen. Sie brauchen nur verschiedene Kaliumkonzentrationen, etwas Valinomycin hinzufügen und Sie ändern das Membranpotenzial. So haben wir nach und nach das Membranpotenzial von minus 100 innen auf plus 100 innen geändert. Bei jedem Schritt hat das zusätzliche Colicin überhaupt keine Rolle gespielt. Das zusätzliche Colicin erzeugte weiterhin dieselben Kanal-Leitfähigkeiten wie bei allen anderen Spannungen. Hier stehen wir vor einer eigenwilligen Situation der Membranbiologie. Das ist nicht zum ersten Mal so. Die Außenmembran der Bakterienzelle, das Matrixprotein, der Kanal, wurde z. B., wie ich sagte, von 2 Labors gereinigt. Die Labors von Nakae und Nikkaido in Japan und Berkeley haben herausgefunden, dass bei Verwendung von künstlichen Membranen die Leitfähigkeit des Kanals völlig ungesteuert ist, unabhängig vom elektrischen Potenzial. Schindler und Rosenbusch in Basel haben hingegen herausgefunden, das dasselbe Protein in derselben Membran, aber in dieser Form eher als in Liposom, in dieser Lage zu einer gesteuerten Situation führt. Und dies trifft auch auf das Protein des Kanals der Außenmembran von Mitochondrien zu, obwohl dies sehr ansatzweise gemacht wurde. Hier haben wir eine Situation, in der uns die einfachste Anordnung eine sehr einfache Antwort liefert. Eine kompliziertere Anordnung liefert uns eine Antwort, die meiner Meinung nach völlig falsch ist. Bei einem ausschließlichen Fachpublikum würde ich sagen: Seien Sie vorsichtig, bevor Sie so eine Membran verwenden. Meine eigene Überzeugung wurde gestärkt, seit ich in der Mitte der 1930er Jahre mit den Experimenten begonnen habe. Wenn Sie etwas auf einfache Weise ohne Instrument erledigen können, so tun Sie das. Sie haben mehr Chancen, richtig zu liegen, als Personen mit großen, leistungsstarken Apparaten. Vielen Dank. Applaus.

Salvador Luria (1981)

Membranes and Transmembrane Channels

Salvador Luria (1981)

Membranes and Transmembrane Channels

Comment

It’s a pity that Salvador Luria lectured only once in Lindau. He must have been a brilliant teacher with a talent to inspire young researchers. His first graduate student at Indiana University where he taught between 1943 and 1950 was James Watson, and the Center of Cancer Research at MIT, which he was asked to set up in 1972 and directed until his retirement in 1985, generated four Nobel laureates, namely David Baltimore, Susuma Tonegawa, Philipp Sharp and Robert Horvitz. “Salva was a visionary who protected his young faculty from unnecessary interruptions, thus allowing their research programs to flourish in an ideal scientific environment. He was also a role model for how a scientist could shape and lead a community“, his early MIT recruit Philipp Sharp later recalled Luria’s excellence.[1]

In cooperation with Max Delbrück and Alfred D. Hershey with whom he shared the Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969, Luria “set the solid foundations on which modern molecular biology rests“, according to the Karolinska Institute[2]. Working with bacteriophages - viruses that infect bacteria – Delbrück and Luria had demonstrated in a famous experiment that “resistant bacteria arise by mutations of sensitive cells independently of the action of virus“[3], i.e. that bacteria are affected by natural selection. This knowledge laid the foundation for both explaining the development of antibiotic resistance and for discovering restriction enzymes, the major tools of genetic engineering. When molecular biology began to flourish at the end of the 1950s, genetic analyses bored Luria however. Rather than being involved “in putting together little pieces of a large puzzle whose overall features were already evident", he wanted to dig in “unplowed fields“. He decided to work on cell membranes.[4] He investigated the effect of certain bacteriocins and discovered that these colicins exert their lethal effect by opening ion channels in the cell membranes of bacteria. These findings took already center stage in his Nobel lecture and still are in the focus of his interest in this lecture in Lindau.

Luria distinguishes between intelligent, neurotic, less intelligent and stupid membrane channels, and complains that they all share one unpleasant feature: “The proteins of these channels have to insert themselves into the membranes, and the biochemist who works with them finds them more or less distasteful, because they generally are poorly soluble in water”. In this regard, colicins are a remarkable class of proteins, he says: “They attach themselves to certain bacteria and kill them – by exactly what a biochemist would like to do, by inserting themselves in the phospholipid bilayer and creating a hole whose conductance is relatively non-specific and allows substances to pass with a molecular weight of up to 800 or 900”. Amazingly, one single molecule of colicin can trigger in one bacterium a whole series of physiological effects from arresting the synthesis of macromolecules to blocking active transport mechanisms and decreasing ATP levels. Referring to Peter Mitchell’s (Nobel Prize in Chemistry 1978) chemiosmotic theory, Luria suggests that colicin influences the proton motive force across the bacterial membrane. But can one measure how one molecule of colicin affects the proton motive force? What does colicin do to abolish the membrane potential? And what are the best experimental systems to explore that? These are the questions Luria discusses in the second half of his talk, which he concludes with an advice from his personal experience: “If you can do something in a simple way without any instruments, do it that way and you are likely to be more right than people who have a big powerful apparatus.”

Joachim Pietzsch

[1] Cf. The Salvador Luria Papers (National Library of Medicine: Profiles in Science. http://profiles.nlm.nih.gov/ps/retrieve/Narrative/QL/p-nid/164)

[2] http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1969/press.html

[3] Luria, SE and Delbruck M. Mutations of Bacteria from Virus Sensitivity to Virus Resistance. Genetics 28, (November 1943): 491-511, 510.

[4] Cf. The Salvador Luria Papers

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