Christian Anfinsen (1980) - Studies on the Structure and Properties of Human Interferon

In 1980, the biochemist Christian Anfinsen participated for the first time in a Lindau meeting. Listening to his introduction, one can hear that he liked the lecturing situation: A Nobel Laureate and a select audience of students and young researchers

Thank you Professor Hoffman. I would like first to take the opportunity to thank Count and Countess Bernadotte and the Oberbürgermeister of Lindau and everyone else who has been so gracious in making us feel so comfortable here in Lindau. It’s a beautiful place. And this afternoon when the sun comes out it will be even nicer I think. Before I begin formally speaking and since it’s still early enough in the morning, so everybody is a little bit sleepy. I thought I could just say two words about some thoughts I was having about the significance of these meetings. It’s a tremendous effort to get 20 wonderful geniuses like myself here. (laughter and applause) Together with all these enthusiastic students and so on. And I was thinking about the true value of this kind of meeting. If we had two months I think we could actually achieve some kind of education back and forth. But as it is the time is very short. And I think perhaps one of the main functions is to make it clear to students who are beginning now in their careers in science, make it clear to them that people who win Nobel Prizes are not very different than other people. They may have had mothers that made them work a little harder in school or they may be a little more aggressive but they’re really quite ordinary - except for a few unusual. Once in a while you get unusual types like Schweitzer or Linus Pauling and so on that comes through. But I think that’s perhaps one of the main messages is to make it clear that we’re all ordinary people together. Some people work perhaps a little more diligently, perhaps are a little luckier. Have better post docs coming into the laboratory and so on. (laughter). So that’s, I think I’m now more awake than I was before. I would like to be able to begin this lecture with a sentence that I’ve often thought would be ideal at the beginning of a lecture. Cancer may be cured as follows, that would be a nice way to begin. And I think if you read Time Magazine and all the newspapers and listen to television, most people have the impression that this interferon molecule, is the cure of everything. As a matter of fact it may very well turn out to be an extremely useful substance in the treatment of some viral diseases. The problem in the case of cancer for example is that we really don’t know that cancers are generally viral diseases. There may be some cancers that are viral and some that are not. We know that interferon is definitely an antiviral substance. It’s very difficult to get enough interferon to test on a large scale. And what I’d like to tell you about today is the current status of our own more chemical approach to the problem. And a few things about the current status of the availability of interferon through genetic engineering and other techniques. It has been tested clinically now, not in a very thorough way but sufficiently, to make it almost certain that it will be useful as a drug against some viral diseases, notably hepatitis B, I think, herpes zoster, which is a very serious neurological disease, juvenile papilloma. There’s been some very nice work done in Sweden on this disease in the throat of juveniles. Possibly in some forms of cancer, osteosarcoma has been under study in Sweden for a number of years by Strander and his colleagues. And in recent, in the past year enough money has become available from a number of governments to buy large quantities of interferon, as much as possible from the group in Finland that is manufacturing interferon from the white cells that are obtained from blood bank contributions. So that perhaps in another year we’ll have some definite information on such serious large scale problems as breast cancer and other forms of cancer that are now being studied systematically. Another problem that I’ll talk more about is the fact that the interferon that is available is generally only about 1 or 2 or 3% pure. So that when we do these tests at the moment, it’s not entirely clear whether it’s only the interferon that’s doing whatever happens, good or bad. But possibly other small proteins that are mixed with the interferon. The substance was discovered by Isaacs and Lindeman in England in 1957. They did some experiments, some biological experiments to examine an old well known phenomenon in medicine know as interference. If you’ve been sick from a viral disease and you recover from this disease, there is a sort of subjective impression that one is somewhat more resistant to other viral diseases. The body has somehow or other developed some resistance. And they showed that if you took chick cells in culture and exposed these cells to kill flu virus, that the cell … and then washed off the kill flu virus after a certain time, that the cells had produced a substance which made them resistant to live flu virus. In other words the viral material had induced the production of an antiviral substance. And they were able to show by indirect methods with these tiny, tiny amounts of material, that it was indeed a protein of fairly small molecular weight. And that it was species specific. That is to say interferon produced in a mouse would not protect a horse or vice versa. But that interferon from, produced say in a human cell culture would protect human cells against many viruses. So it’s species specific but virus non-specific. And the observation was very interesting and attracted some attention. But not on a large scale. Partially because there was not much available. Most of the early work was done with white cell interferon. And as I mentioned before in Finland, Kari Cantell arranged with the Red Cross in Finland to get almost all of the Buffy coat, the white cells from blood contributions. And taking these white cells and adding to it Sendai virus, he was able to stimulate interferon production by these cells, remove the cells and then purify the interferon somewhat and distribute this for clinical trial. And most of that early material and indeed throughout the ‘60’s and partially throughout the ‘70’s most of that was used in clinical trials on a rather small scale. And mainly in Finland although some work was being done in other countries, in England, France, Belgium, United States. So that quantities were limited and there was not that much activity. Suddenly it became clear, I think partially through the press, that here was a possible substance that might be of value in viral diseases including cancer. And immediately a lot of biochemists like myself and a lot of physicians got into the business and began to think about isolation and production and clinical trial. I’m not a physician myself so I don’t want to show any clinical results. I have one slide on a clinical trial which was carried out by my friend Michel Ravel in Israel, together with some physicians in Tel Aviv on a disease known as shipyard disease. It’s an adenovirus, conjunctivitis. Which does cure itself after 35 or 40 days, although it can leave serious permanent damage to the cornea. The first slide please, is a summary of some experiments that Ravel and his colleagues made, where they took, out of a group of patients they took about 17 controls who were given simply some human albumen, eye drops in the eye, five or six times a day. And another 15 who were given interferon as eye drops in the eye. And you will see where it says average length of disease, that the controls cured themselves mainly after about 27, 30 days. Whereas those who received interferon were free of the conjunctivitis after 6 and a half days on the average. And if they selected among the experimental patients those with double, with bilateral conjunctivitis and treated one eye and not the other, so they had an internal control, once again the treated eye is cured in seven days and the untreated eye in 25 days. Lights please. It’s a trivial example but I show it only to indicate to you that interferon does indeed stop the course of a viral disease. And we hope that much more dramatic results will be forthcoming in the next year. So what I want to do now is to tell you something about preparation, characterisation and possibilities for the future. There are three possible ways one can think of, of making enough interferon. One is to grow large amounts of human cells in culture. And then stimulate the cells with virus to make interferon. And then purify the interferon from these cultures. That’s what we have been doing for the last five or six years, it’s a very slow tedious, large scale project. A second way would be to hope that one could get enough interferon to chemically characterise the molecule. And then knowing the structure, knowing the amino acid sequence of the chain of amino acids to be able to do the classical process of organic synthesis to make the molecule from individual amino acids. As you will see it’s not a small molecule. So this becomes a very large task, a very difficult task. But it is a possibility and it’s the one that happens, that my own associates and I have selected. The third became possible only in the last few years and is now beginning to become quite exciting. And this is the possibility of taking the human gene for interferon, putting it into a bacterial cell, an E.coli cell, for example. and allowing the bacterium to make the interferon for us. And then isolating the interferon either from the bacterial cell or from the medium in which the bacterium swims. And as you all undoubtedly know from the press and elsewhere, within some hundred kilometres Charles Weismann at the University of Zurich and his colleagues have already managed to make white cell interferon in E.coli by genetic engineering. And there’s been a group in Japan Taniguchi who have done this with fibroblast interferon. And there are two or three other groups now who have clones of bacterial cells that can make one of several different kinds of interferon. And there seem to me a number of different ... the human chromosome seems to have perhaps as much as ten different interferon genes. So that a number of different interferons are made in different cells. So this is the third possibility for making large amounts. Now I thought I might just tell you something about, to give you some impression of the power, the powerfulness of this drug, of this protein. And also about the minute amounts that one obtains to describe how you assay the interferon, how do you test for interferon. The standard technique is as follows: You take a porcelain plate with eight by 12 holes, 96 depressions. And in each of these depressions you grow fibroblasts, human cells that grow in sheets. You grow about a million cells in each of these 96 wells. And then you expose each of these wells to an interferon solution. First the undiluted and then say one to two, one to four, one to eight, one to 16. And allow it to sit overnight and then you shake out the interferon. And then you put in a virus, standard virus suspension into each hole. And then the next day you would look at the plate under the microscope and determine the dilution at which half the cells have been protected against cell destruction by the interferon. And that point is considered one unit. It’s a very, very crude test, it's accurate only to about 3/10th of a log, about plus or minus 50%. So it’s quite inaccurate and takes two to three days. But at the moment that is the only relatively safe way of assaying for interferon. So namely one unit would be the amount to protect half of a million cells against the standard viral dose. Now when we grow 1,000 litres of human white cells in culture and infect these cells when they have grown up to about 3*10^6 three million cells per millilitre with virus. Out of 1,000 litres of cell culture we are very lucky if we can have a total amount of perhaps 20 milligrams. And after isolation perhaps two milligrams. Generally more like 1/10, like 100 micrograms. So that the amounts one obtains are very disappointingly small. Furthermore it turns out that 1 milligram is equal to about 2*10^8 units. Now if you were treating patients you would like to give, it’s become standard practice to administer not less than a million units per day to a patient. So if you had say one mg of interferon you could give 20 days of treatment to one person. And it works out that if you had one gram of interferon in pure form, you would be able to treat 1,000 patients for perhaps 200 days. Of course what we need is enough to treat ten million patients for 100 days. So obviously the amounts required are much larger than that. I’d like to show some, a few slides of our own studies on the purification of interferon to give you some idea of the difficulties that are involved. The next slide please. What we did, originally, this was seven or eight years ago, we decided that perhaps the most efficient selective purification method would be to use immunological techniques. So we took some of the interferon that we obtained from Finland and purified it on a sephadex gel filtration cone. It’s simply a cone that separates on the basis of size. And if we look at this on the left side. The dark circles represent the peak of activity, of interferon activity coming off this column. The white circles are total protein. So that most of the impurities go out first. And then comes the interferon with only a small amount of protein. It’s still at this point only perhaps half of 1% pure. But it’s good enough to give as an antigen to animals to prepare antibody. So we gave one or two micrograms every two weeks for 16 to 18 weeks to sheep. Now it turns out that interferon is a very good antigen and made rather high titers of anti-interferon in three or four months time. So that we then had an antibody, which would catch interferon quite efficiently. The antibodies produced by the sheep of course are not only against interferon but also all the other protein impurities that are in the material that was injected into the sheep. And we tried then to purify this antibody. The next slide is a slide showing that if you use the following technique you can make much better antibody. We prepared what we called a cocktail column. What we did was to take all of the protein impurities that we could think of that might be in the material that we gave to the sheep, Serum proteins, egg proteins, virus proteins and so on, attached them to a column and then we passed the antibody through that column. All the impurities caught the antibodies against the impurities. And what went through the column in the beginning contained the anti-interferon, the anti-impurities could then be taken off with acid. And the column could be washed and then you could repeat the process many times. And eventually one could get an antibody preparation which was mainly free of antibodies against the impurities. Now this purified antibody could then be attached to another column. Chemically attach the antibody to a Sepharose column. And passing crude interferon through the column, then permits the interferon in that crude substance to be caught by the antibodies. And the impurities go through. And you can wash the impurities off. The next slide. You see that most of the protein goes through the column without losing much interferon. Then you wash and wash and wash and finally you can take the interferon off the column, once again at a low pH, a higher acidity. And you get out some material which has now been purified between 500 and 5,000 times in this one step. So this is a way of getting from very large volumes down to very small volumes fairly quickly. The only way we felt that we could make very large quantities eventually was to obtain some kind of … was to use a human cell which would grow well in tissue culture. And fortunately Strander and his colleagues in Sweden had examined many kinds of B-lymphocytes for their capacity to produce interferon when stimulated with viruses. And one particular kind of lymphocyte, B-lymphocyte, is known as Namalwa, that’s a pet name for this cell. It was originally isolated from Burkitt lymphoma, a virus-produced lymphoma. The next slide I think shows a picture of this cell. It’s not terribly pretty. It grows very well in solution. You grow it in a rich salt solution with vitamins and amino acids and so on. And unfortunately you get the best growth when you add 10% foetal calf serum, which is now becoming extremely expensive. And we have to develop some new techniques for growing on a large scale that will be a lot less expensive. The next slide shows some properties of this lymphoblastoid interferon that we have been working with. This shows you that it’s very stable, both to temperature and to acidity. For example at almost boiling temperature, at 97 degrees centigrade, one can allow the material to sit for ten minutes and still have the same, essentially the same activity. So that it’s extremely stable to heat and low pH. Next slide. It’s however quite heterogeneous in the sense of its electrical properties. It turns out that interferon is a glycoprotein, it’s a protein molecule, globular protein molecule, on which carbohydrate is also attached. And these carbohydrate side chains contain acidic residues, sialic acid residues, which are present in different numbers on different molecules. Sometimes there are three, sometimes four, sometimes two. So that if you do an isoelectric focusing experiment you get quite a large heterogeneity in the isoelectric points. These peaks that you see are different forms of interferon, differing by their charge, due to the difference in sugar. However if you remove the sugar thereby removing the negative charge from all of these side chains of carbohydrate, the material becomes much more homogenous. This shows first of all that the heterogeneity is due to the carbohydrate side chains and secondly that the carbohydrate can be removed without losing activity because it’s still active in tests. The next slide. The next slide indicates the results of treating partially purified lymphoblastoid interferon with a mixture of enzymes which chews off carbohydrate. Which we obtain from the bacterium diplococcus pneumonia. The molecular weight of the interferon molecule shifts to a smaller weight when you take off carbohydrate. And if as shown in the next slide you plot the results on a standard type of figure showing the relationship between weight and behaviour in a column against some standard proteins of known molecular weight. You can see that the interferon after treatment with enzymes has shifted to a lower molecular weight. As a matter of fact one can chop off about 4,000 Daltons of molecular weight and the weight goes from about 22,000 to about 18,500 having taken off most of the carbohydrate. It’s still active and upon injection into let’s say a rat, you can show that it is maintained in the circulation at least as long as the normal untreated interferon. So that it’s not destroyed quickly. Consequently we feel that it is realistic to think of synthesising the protein part in interferon and not having to worry about the carbohydrate part because that would be essentially impossible, there is no organic chemistry at the moment that permits the systematic synthesis of carbohydrate side chains on proteins. But apparently we don’t need that so that’s a very lucky thing. So the problem now is to make large amounts. The next slide is the kinetics of production of interferon by these lymphoblastoid cells. What we do is to grow the cells up in large tanks until they reach about two million per millilitre. And they’re infected with Newcastle disease virus. Which induces the synthesis of interferon by these cells and they secrete the interferon out into the medium that they are growing in. There is a slight lag at the beginning and at the end, about 20 hours you have reached a maximum production of interferon. Then the cells are removed by taking the whole contents of the tank through a large cream separator actually. A cream separator like you use on a farm, turns out to be the most convenient way of removing the cells. The fluid comes out and we precipitate all of the protein, including the interferon. And that’s the starting crude material. The next slide shows that one can actually save a little money. And it is important in these experiments to do that. Foetal calf serum at the moment costs, I think of the order of $200 per litre, it’s extremely expensive. We use 10% foetal calf serum in growing these cells. So in 1,000 litres we have 100 litres at $200 per litre. It’s a little bit rich. However it turns out that the lymphoblastoid cell produces interferon much more efficiently at a lower cell concentration than it does at a higher cell concentration. You see if you infect with Newcastle disease virus at 2*10^6 cells per ml, you get in this case 1,800 units per ml. If you dilute down to 0.4*10^6 we get 7,000. So simply by adding salt solution you increase the ability of, the efficiency of production of interferon. So what we do routinely is grow up, instead of 1,000 we grow up 250 litres and then dilute to 1,000 with salt solution. Next slide shows here the same thing. At the top is the undiluted cells and their efficiency in producing interferon. At the bottom is the efficiency of the cells after diluting with salt solution containing glutamine which is an essential component during the production. So basically we get four times as much interferon as we would otherwise simply by diluting the cells. The next slide. This is a typical kind of slide that you can’t read. Simply summarising all of the steps that we go through. We start as I mentioned before, we take off the cells with a cream separator and then we precipitate all the proteins in that clear fluid with trichloroacetic acid. And then we go through a number of steps. First to remove the trichloroacetic acid, then this antibody column that I spoke of which catches the interferon. And a number of other steps including sizing on columns, ion exchange separations and finally a polyacrylamide gel separation in SDS, sodium dodecyl sulphate, slab gel purification. By this time we’re down to very small amounts. In this particular slide the total recovery was only 6% which is very bad. We now have this up to about 15% and I hope we’ll soon have perhaps 50% with some new tricks that we are beginning to use. But it’s still a very slow and tedious process. As you can see at this point we have on the order of 2/10th of a milligram of protein from, this was from 200 litres of cells. And the specific activity of the pure material, this is the 18.5k, 18.5 thousand molecular weight. Is about 2.2*10^8 units, 2 to 4*10^8 units per milligram - this is the purity of such material. There is one other component, 21.5 which is the same as the 18.5, very likely with carbohydrate still attached, which makes it heavier by that many units. The next slide. This is a polyacrylamide analytical slab gel with the interferon activity plotted as black points at the bottom. And at the top the pattern of the gel stained with Coomassie Blue to indicate the position of the component. You see the dark band corresponding to the main interferon peak. And another smaller band with activity to the left. And if you then cut out this main band and rerun it on another slab. The next slide. You see on the right a pure sample of human lymphoblastoid interferon against some known proteins as markers on the left. To give some idea of the molecular weight. The first pure material was produced by Ernest Knight at DuPont about 2 years ago from fibroblast interferon. This is our lymphoblastoid interferon. Both varieties have about the same molecular weight and the same specific activity. That is to say they both, one milligram is approximately 2 or 3*10^8 units. The next slide. Once again protein chemists always show amino acid analysis, not terribly useful but this is simply the amino acid analysis done with the micro method for amino acid analysis. And it’s on pure interferon. It’s perhaps only interesting to point out that there is quite a high amount of hydrophobic amino acids like leucine, phenylalanine, valine and a few others. The next slide is more of the same. But here what we’ve done is to take the amino acid analysis from fibroblast, lymphoblastoid, leukocyte and mouse interferon. Amino acid analysis have been done on pure specimens of all of these and this is simply to show that as you go from a mouse to a leukocyte to a fibroblast to a lymphoblastoid cell, the amino acid composition is about the same. Each type has about as much, same amount of lysine or histidine or arginine and so on. So about last fall in November we felt we had done enough on purification to accumulate material that could be put into the amino acid sequenator, the machine that has been designed over the last years by Edman and his followers that will tell you something about the structure of a protein one by one. And the next slide shows results which were produced actually by Hood and Hunkapillar, two scientists at Caltech in California who have one of these very sensitive machines for determining sequence, and we sent to him together with Pete Knight at DuPont with his fibroblast interferon and Lengyel and his group at Yale who had mouse interferon, samples that these people could degrade. It turned out that the mouse came in two varieties, or three varieties, A, B and C, we show here some results on A and C. Simply to indicate particularly here at the bottom that the mouse’s leukocyte interferon called band C is rather similar to the material that we obtained from lymphoblastoid cells. There is quite a high degree of homology in structure. This is only the first 20 amino acids. But it is a beginning, from the amino terminus it’s the first 20 residues. And there’s quite a high degree of similarity. It does at least tell us that the gene for interferon in the human and in the mouse, those two genes must be quite similar. At least for the first 20 amino acids. It means that this is probably quite an old gene, it may be, it can be found in animals back as far as fish and turtles and frogs. So that the interferon gene has been around for quite a while. So we were very proud of ourselves at this point because after six or seven years we had finally achieved some beginnings of sequence. We really had a protein that was pure and it was characterisable, so we were working along, making more material to have the rest of the sequence finished. When suddenly the genetic revolution occurred in Zurich and elsewhere. Now one of the nice things about genetic engineering and producing material from E.coli cells is that you can obtain the DNA from the chromosome of the E.coli cell. And it’s much easier to determine the structure of a DNA fragment than it is to determine the structure of a protein. So that when Charles Weismann for example obtained a clone of E.coli that produced interferon he was able to very quickly take this material and by some techniques, details which I won’t go into because first of all I’m not terribly familiar with the field, and it’s quite complicated to explain. He was able to work out the total sequence of the gene that determined the interferon that was made by those cells. For RNA messenger, RNA isolated from white cells, he used leukocyte message to prepare the original plasmid, which he put in to the E.coli cell for translation. And the next slide shows, very confusing slide, it’s not as confusing as it looks actually. On this slide what I’ve done is to put down Charles Weismann and his colleagues' sequence for one of the leukocyte interferons as a protein. That is to say that’s the centre of the lines, the one that begins with the CYS in the box at the upper left. It goes along the centre one all the way through is Weismann’s leukocyte interferon. Knowing the DNA strand sequence and knowing the genetic code you can simply read off the amino acid that corresponds to the triplets of nucleotide basis in that DNA sequence. And translate the DNA structure into a protein structure. The top line represents a similar translation of the DNA structure that was determined by Taniguchi and his colleagues. A Japanese group from fibroblast DNA. This is another interferon gene. In their case they selected the gene from fibroblasts. And so that’s on the top line. And on the bottom line is the sequence that we now have from our own material on lymphoblastoid. As you see there are some empty spaces that are not finished but we hope in the next months to complete this. The important thing is that when you go from fibroblast to leukocyte to a specific white cell like lymphoblastoid there is a large amount of similarity. I have enclosed those areas where the same sequence occurs in all three species. And there’s obviously a great deal of homology again from one cell type to another. I’ve also cross hatched the areas which include the cysteine residues, the amino acids that are responsible for making cross links through SS-bridges in the protein when it folds up. And there is one that I forgot to cross hatch down at 140, there is a CYS, ALA, TRP, cysteine, alanine, tryptophan, which occurs both in the fibroblast sequence and the leukocyte sequence. We unfortunately do not have it yet in our structure. Although we know that we have 1 tryptophan in the molecule. And we hope to have that section soon. The fact that that section and the section at the upper right has been so carefully maintained in these three varieties suggests that these may be particularly important cysteines that perhaps form an SS-bridge. But this kind of detailed chemical consideration will have to really await the isolation of larger amounts. So what to do if you have this. For Taniguchi and Weismann the future is very clear. They have to produce E.coli systems, E.coli cells themselves, plasmids to insert into these that are better and better and better and can produce more and more interferon. And then they have to purify the interferon away from the proteins of the bacterium sufficiently that it becomes pure enough to be able to give to human beings. You can’t give human patients impure proteins because one develops antibodies against them and you have to avoid such phenomenon as anaphylaxis and so on. So although it sounds phenomenal in Time Magazine and I think these people have done a marvellous job. And will probably eventually produce the interferon that we need. They still have a way to go in terms of purification. And preparing better vectors for their work. In our own case since we’re not quite finished with our own sequence and since we’re interested in synthesis, we have started to synthesise slowly the sequence from Weismann’s leukocyte interferon structure, the middle line here. And we’re doing this both by the new solid phase synthetic techniques developed by Merrifield and his colleagues. And also by classical peptide synthesis, fragment condensation which is an enormous job. And may take too many years to think about, unless we can think of some tricks. Or perhaps some combination of both techniques. The other thing we would like to do is to grow enough material or to get enough material from Weismann or Taniguchi to do some careful structure function work. That is to say to try to determine whether one can chew away parts of the molecule and still keep the activity. Because if one could cut away half the molecule and make it 80 amino acids instead of 160 then it would become synthetically not so difficult. So that’s our own hope at the moment. And perhaps we can even use the E.coli interferon for our structure function work. It’s interesting, I’m sure, to someone like Dorothy Hodgkin or Bill Lipscomb sitting here to think that if the crystallography, the three dimensional structure of interferon is ever worked out it will probably be on synthetic material because we’ll probably never have enough of the other kind to do it. But perhaps we will. It would be a nice first to try. One final point that might be of some interest to some of you. We’ve known for some time that interferon and cholera toxin compete for the same receptors on the surface of cells. You can add interferon and compete for the recognition by adding cholera toxin simultaneously and vice versa. So I asked the people who put out this dictionary of protein sequences, Margaret Dayhoff and her colleagues who have a computer full of all the known sequences, to compare the leukocyte sequence of Weismann with all other known protein sequences of which there must be 100’s by now. And she called back and said in a very unbelieving voice, that there seemed to be very little similarity, except there was one rather interesting one that there was, next slide please, a rather interesting similarity between the interferon structure and the sequence of cholera toxin. I thought that was very nice, I didn’t tell her in advance, it was out of the computer without any hinting. It turns out that at the very bottom here there’s a number called an alignment score and a score of 4.1 approximately, which is considered rather good. The alignment score for say myoglobin and beta chain of haemoglobin in man is something like nine, so this is really a rather high level of homology in sequence. And you can see that in this section here there’s quite a large number of identical amino acids. Could I go back to the last slide please. The previous slide. So that as a beginning we have started at the bottom right and we are working backwards. And it turns out that this section that resembles cholera toxin runs from about 150 back to about 120. In that region are these similarities. It will be very interesting to see whether this peptide which we now have essentially finished will be competitive with cholera toxin and perhaps may serve for example as an antigenic site that we can use for further purification of our anti interferon antibodies. And it might also give us some approach to the process by which, the understanding of the process by which interferon recognises the cell surface. I mentioned in an abstract that I sent here before we came that I would say something about the mechanism of action. But I’m afraid that’s very difficult to do. All one can say at the moment is that if you give interferon to cells it is recognised by the cell and then induces the cell to make two or three enzymes which either are absent or present in very small amounts before the interferon appears. The enzymes that are produced are all involved in the control of message translation. That is to say in protein synthesis. The translation of RNA message into protein. And interferon appears therefore at the moment from the work of a number of laboratories to be involved in the inhibition of the translation of the viral message that comes into the cell. That’s about all we know about the mechanism of action. Most of the rest is phenomenological. And I hope that we’ll be able to say something specific about not only how it works but against which diseases it is helpful if at all. And I feel quite confident myself that it will be very helpful against certainly some viral diseases. Cancer is still a knock on the wood question. Thank you. (Applause.)

Vielen Dank, Professor Hoffman. Als erstes möchte ich die Gelegenheit ergreifen, Graf und Gräfin Bernadotte und dem Oberbürgermeister von Lindau und allen anderen zu danken, die so liebenswürdig waren und dafür gesorgt haben, dass wir uns hier in Lindau so wohl fühlen. Es ist ein wunderschöner Ort, und ich glaube, er wird an diesem Nachmittag, wenn die Sonne hervorkommt, noch schöner sein. Bevor ich nun mit dem formellen Teil des Vortrags beginne, könnte ich, da es noch früh genug am Morgen ist und daher alle noch ein bisschen verschlafen sind, ein paar Worte zu einigen Überlegungen sagen, die ich mir zur Bedeutung dieser Treffen gemacht habe. Es stellt eine gewaltige Anstrengung dar, 20 so wunderbare Genies wie mich hierher zu bekommen. Zusammen mit all diesen begeisterten Studenten und so weiter. Und ich dachte über den wahren Wert dieser Art von Treffen nach. Wenn wir zwei Monate hätten, dann könnten wir tatsächlich eine Art wechselseitige Erziehung erreichen. Aber so, wie die Dinge liegen, ist die Zeit sehr knapp. Ich glaube, dass eine der wichtigsten Funktionen darin besteht, den Studenten, die sich nun am Anfang ihrer wissenschaftlichen Karriere befinden, klar zu machen, dass Leute, die Nobelpreise gewinnen, sich nicht sehr von anderen Leuten unterscheiden. Sie mögen Mütter gehabt haben, die dafür sorgten, dass sie in der Schule ein bisschen härter arbeiteten, oder sie mögen etwas aggressiver sein, aber sie sind wirklich ziemlich normal – mit Ausnahme einiger weniger, die sehr ungewöhnlich sind. Von Zeit zu Zeit hat man ungewöhnliche Typen wie Schweitzer oder Linus Pauling und so weiter. Aber ich glaube, es ist eine der wichtigsten Botschaften, klarzustellen, dass wir alle zusammen normale Leute sind. Manche arbeiten vielleicht ein wenig sorgfältiger, vielleicht mit ein wenig mehr Glück. Und haben bessere Postdocs, die in ihr Labor kommen, und so weiter. Ich denke, ich bin nun wacher als zuvor. Gerne würde ich diesen Vortrag mit einem Satz beginnen, der sich, wie ich oft dachte, ideal als Einstieg in einen Vortrag eignen würde. Und ich denke, wenn man das Time Magazine und all die Zeitungen liest und dem Fernsehen Glauben schenkt, dann haben die meisten Leute den Eindruck, dass dieses Interferon-Molekül das Allheilmittel ist. Tatsächlich kann es sich durchaus als eine sehr nützliche Substanz für die Behandlung einiger Viruserkrankungen erweisen. Das Problem im Fall von Krebs besteht darin, dass wir zum Beispiel nicht wirklich wissen, ob Krebserkrankungen generell Viruserkrankungen sind. Möglicherweise gibt es einige Krebserkrankungen, die durch Viren verursacht sind, und andere, die es nicht sind. Wir wissen, dass Interferon definitiv eine antivirale Substanz ist. Es ist sehr schwierig, genug Interferon zu bekommen, um es in größerem Rahmen zu testen. Ich möchte Ihnen heute etwas über den aktuellen Stand unserer eigenen, eher chemisch orientierten Herangehensweise an dieses Problem berichten. Und ich möchte Ihnen ein paar Dinge zum aktuellen Stand der Verfügbarkeit von Interferon mit Hilfe der Gentechnik und anderer Methoden erzählen. Es ist mittlerweile klinisch getestet worden – nicht auf eine sehr gründliche Art und Weise, aber ausreichend, um fast sicher sein zu können, dass es wirksam als Medikament gegen eine Viruserkrankungen sein wird, zum Beispiel bei Hepatitis B, bei Herpes Zoster, einer sehr ernsten neurologischen Erkrankung, dem juvenilen Papillom. In Schweden wurde sehr gute Forschungsarbeit hinsichtlich dieser Krankheit, die den Hals von Jugendlichen befällt, geleistet. Möglicherweise bei einigen Formen von Krebs – das Osteosarkom wird seit mehreren Jahren in Schweden von Strander und seinen Kollegen untersucht. Im vergangenen Jahr stellten mehrere Regierungen genug Geld zur Verfügung, um große Mengen an Interferon zu kaufen, so viel wie möglich von der Gruppe in Finnland, die Interferon aus den Leukozyten herstellt, die aus den Spenden von Blutbanken gewonnen werden. Somit werden wir vielleicht in einem Jahr gesicherte Daten zu solchen gravierenden und großen Problemen wie Brustkrebs und anderen Krebsarten haben, die zur Zeit systematisch untersucht werden. Ein anderes Problem, zu dem ich noch mehr sagen werde, ist, dass das zur Verfügung stehende Interferon meist nur zu 1 oder 2 oder 3 % rein ist. Wenn wir also im Augenblick diese Tests durchführen, ist nicht völlig klar, ob es nur das Interferon ist, das dazu führt, das irgendetwas – ob gut oder schlecht – passiert. Vielleicht sind es andere kleine Proteine, die mit dem Interferon vermischt sind. Die Substanz wurde 1957 von Isaacs und Lindenmann in England entdeckt. Sie führten einige biologische Experimente durch, um ein altes und wohlbekanntes Phänomen in der Medizin, das als Interferenz bezeichnet wird, zu untersuchen. Wenn Sie an einer Viruserkrankung gelitten haben und sich von dieser Erkrankung erholen, gibt es eine Art von subjektivem Empfinden, dass man etwas widerstandsfähiger gegenüber anderen Viruserkrankungen ist. Der Körper hat auf die eine oder andere Weise eine gewisse Widerstandsfähigkeit entwickelt. Und sie wiesen nach, dass, wenn man eine Kultur von Kükenzellen einem abgetöteten Grippevirus aussetzte und dann nach einer bestimmten Zeit das abgetötete Grippevirus wieder abwusch, die Zellen eine Substanz produziert hatten, die sie widerstandsfähig gegenüber einem lebenden Grippevirus machte. In anderen Worten: Das virale Material hatte die Produktion einer antiviralen Substanz induziert. Mit Hilfe indirekter Methoden mit diesen winzigen, winzigen Mengen an Material konnten sie nachweisen, dass es sich tatsächlich um ein Protein mit einem ziemlich geringen Molekulargewicht handelte. Es ist artspezifisch. Das bedeutet, dass Interferon, das in einer Maus produziert wurde, ein Pferd nicht schützen würde, und umgekehrt, dass aber Interferon, das in einer menschlichen Zelle produziert wurde, menschliche Zellen vor vielen Viren schützen würde. Es ist also artspezifisch, aber nicht virus-spezifisch. Die Beobachtung war sehr interessant und erweckte einiges Interesse, allerdings nicht in größerem Rahmen. Dies lag zum Teil daran, dass nicht viel zur Verfügung stand. Der größte Teil der frühen Forschungsarbeit wurde mit Interferon von Leukozyten durchgeführt. Wie ich zuvor erwähnte, arrangierte Kari Cantell mit dem Roten Kreuz in Finnland, dass er fast alles von dem Leukozytenfilm („Buffy Coat“) erhalten würde, den Leukozyten aus Blutspenden. Indem er diesen Leukozyten Sendai-Viren hinzufügte, gelang es ihm, die Interferon-Produktion dieser Zellen zu stimulieren, die Zellen zu entfernen und das Interferon in etwas reinerer Form zu gewinnen und dies dann für klinische Tests zu verteilen. Der Großteil dieses frühen Materials wurde, vor allem im Laufe der 60er und teilweise auch im Laufe der 70er Jahre, in klinischen Tests von ziemlich geringem Umfang eingesetzt, und zwar vor allem in Finnland, obwohl auch in anderen Ländern, in England, Frankreich, Belgien und den USA, daran gearbeitet wurde. Die Mengen waren also begrenzt, und es gab nicht so viel Aktivität. Auf einmal wurde – zum Teil durch die Presse – klar, dass es eine mögliche Substanz gab, die bei Viruserkrankungen einschließlich Krebs von Wert sein könnte. Sofort stiegen viele Biochemiker, wie ich, und viele Ärzte in das Geschäft ein und begannen, über Isolierung und Produktion und klinische Versuche nachzudenken. Ich bin selbst kein Arzt, daher möchte ich Ihnen keine klinischen Ergebnisse zeigen. Ich habe ein Dia zu einem klinischen Test, der von meinem Freund Michael Ravel in Israel zusammen mit einigen Ärzten in Tel Aviv durchgeführt wurde. Es geht um eine Krankheit, die als Keratoconjunctivitis epidemica bezeichnet wird. Dabei handelt es sich um ein Adenovirus. Die Keratoconjunctivitis heilt nach 35 bis 40 Tagen von selbst aus, kann allerdings zu bleibenden ernsten Schädigungen der Hornhaut führen. Das erste Dia, bitte. Dies ist eine Zusammenfassung von ein paar Experimenten, die Ravel und seine Kollegen durchführten. Aus einer Gruppe von Patienten nahmen sie ungefähr 17 Kontrollpersonen heraus, die einfach fünf oder sechs Mal täglich Augentropfen mit menschlichem Albumin ins Auge bekamen. Und hier, wo es „durchschnittliche Dauer der Erkrankung“ heißt, werden Sie sehen, dass bei den Kontrollpersonen die Erkrankung in den meisten Fällen nach ungefähr 27 bis 30 Tagen ausgeheilt war, wohingegen jene, die Interferon erhielten, im Durchschnitt nach sechseinhalb Tagen frei von der Konjunktivitis waren. Und als sie bei den Versuchspatienten jene auswählten, die an einer beidseitigen Konjunktivitis litten und nur eines der beiden Augen behandelten und somit eine interne Kontrolle hatten, waren wiederum das behandelte Auge in sieben Tagen und das unbehandelte Auge in 25 Tagen geheilt. Licht, bitte. Es ist ein triviales Beispiel, aber ich zeige es nur, um Sie darauf hinzuweisen, dass Interferon tatsächlich den Verlauf einer Viruserkrankung stoppt. Und wir hoffen, dass wir im nächsten Jahr mit sehr viel dramatischeren Ergebnissen rechnen können. Nun möchte ich Ihnen etwas über Herstellung, Charakterisierung und Möglichkeiten für die Zukunft erzählen. Drei mögliche Methoden sind denkbar, um genug Interferon herzustellen. Die eine besteht darin, große Mengen menschlicher Zellen in Kultur herzustellen. Dann stimuliert man die Zellen mit einem Virus zur Produktion von Interferon und gewinnt das Interferon in reiner Form aus diesen Kulturen. Das ist es, was wir während der letzten fünf oder sechs Jahre getan haben. Es ist ein sehr langsames und mühsames, groß angelegtes Projekt. Eine zweite Methode wäre, darauf zu hoffen, dass man genug Interferon bekommt, um das Molekül chemisch zu charakterisieren. Und um dann mit dem Wissen um die Struktur, um die Aminosäuresequenz der Kette von Aminosäuren in der Lage zu sein, den klassischen Prozess der organischen Synthese durchzuführen und das Molekül aus einzelnen Aminosäuren herzustellen. Wie Sie sehen werden, ist es kein kleines Molekül. Dies wird also eine sehr umfangreiche Aufgabe, eine sehr schwierige Aufgabe. Aber es ist eine Möglichkeit, und zwar jene, die meine Kollegen und ich ausgewählt haben. Die dritte Methode wurde erst in den letzten Jahren möglich und beginnt nun, ziemlich aufregend zu werden. Sie besteht in der Möglichkeit, das menschliche Gen für Interferon in eine Bakterienzelle, zum Beispiel eine E. coli-Zelle, einzufügen, und das Bakterium das Interferon für uns herstellen zu lassen. Dann isoliert man das Interferon entweder aus der Bakterienzelle oder aus dem Medium, in dem das Bakterium schwimmt. Wie Sie zweifellos aus der Presse und anderen Quellen wissen, ist es, ein paar hundert Kilometer entfernt, Charles Weismann an der Universität Zürich und seinen Kollegen bereits gelungen, mittels Gentechnik Leukozyten-Interferon in E. coli herzustellen. Eine Gruppe um Professor Taniguchi in Japan hat dies mit Fibroblasten-Interferon gemacht. Und es gibt nun weitere zwei oder drei Gruppen, die Klone von Bakterienzellen haben, die jeweils eine von verschiedenen Arten von Interferon herstellen können. Und es scheint mir, dass das menschliche Chromosom über vielleicht bis zu zehn verschiedene Interferon-Gene verfügt, so dass eine Reihe verschiedener Interferone in verschiedenen Zellen hergestellt werden. Dies ist also die dritte Möglichkeit, große Mengen herzustellen. Ich dachte mir, ich könnte Ihnen nun einfach etwas erzählen, das Ihnen einen Eindruck von der Macht und Wirksamkeit dieses Medikaments, dieses Proteins vermittelt. Und etwas über die winzigen Mengen, die man gewinnt, um zu beschreiben, wie man auf Interferon prüft und wie man auf Interferon testet. Die Standard-Methode ist folgende. Man nimmt einen Porzellanteller mit acht mal zwölf Löchern, also 96 Vertiefungen. In jeder dieser Vertiefungen züchtet man Fibroblasten heran, menschliche Zellen, die in Platten wachsen. Man züchtet in jeder dieser 96 Mulden ungefähr eine Million Zellen heran. Dann setzt man jede dieser Mulden einer Interferon-Lösung aus, zunächst einer unverdünnten Lösung und dann einer Lösung im Verhältnis von, sagen wir, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, und lässt diese über Nacht stehen und schüttelt dann das Interferon heraus. Dann gibt man in jede Vertiefung eine Standard-Virus-Suspension. Am nächsten Tag schaut man sich den Teller unter dem Mikroskop an und bestimmt die Verdünnung, bei der die Hälfte der Zellen durch das Interferon gegen Zellzerstörung geschützt wurde. Dieser Punkt wird als eine Einheit angesehen. Dies ist ein sehr, sehr primitiver Test, der nur zu ungefähr 3/10 eines Logarithmus genau ist, plus/minus ungefähr 50 %. Er ist also ziemlich ungenau und benötigt zwei bis drei Tage Zeit. Im Augenblick ist er jedoch die einzige relativ sichere Methode, um auf Interferon zu prüfen. Eine Einheit ist also die Menge, mit der eine halbe Million Zellen gegen die Standard-Viren-Dosis geschützt wird. Wenn wir nun 1.000 Liter menschlicher Leukozyten in einer Kultur heranzüchten und diese Zellen infizieren, wenn sie zu ungefähr 3 x 10^6, zu drei Millionen Zellen pro Milliliter herangewachsen sind, dann bekommen wir aus 1.000 Litern Zellkultur mit sehr viel Glück eine Gesamtmenge von vielleicht 20 Milligramm, nach der Isolierung vielleicht 2 Milligramm. Im Allgemeinen ist es eher ein 1/10, also 100 Mikrogramm. Die Mengen, die man gewinnt, sind also enttäuschenderweise sehr gering. Außerdem stellt sich heraus, dass ein Milligramm gleich ungefähr 2 x 10^8 Einheiten sind. Wenn man nun Patienten behandelt, ist es zum Standardverfahren geworden, pro Patient und Tag nicht weniger als eine Million Einheiten zu verabreichen. Wenn Sie also ein Milligramm Interferon zur Verfügung hätten, könnten Sie eine Person 20 Tage damit behandeln. Wenn Sie ein Gramm Interferon in reiner Form zur Verfügung hätten, dann könnten Sie damit 1.000 Patienten über möglicherweise 200 Tage behandeln. Natürlich brauchen wir eigentlich genug, um zehn Millionen Patienten 100 Tage zu behandeln. Die benötigten Mengen sind also offensichtlich sehr viel größer als das hier. Ich möchte Ihnen gerne einige Dias unserer eigenen Untersuchungen zeigen, um Ihnen einen Eindruck von den damit verbundenen Schwierigkeiten zu vermitteln. Das nächste Dia, bitte. Ursprünglich entschieden wir vor sieben oder acht Jahren, dass die vielleicht effizienteste selektive Methode zur Gewinnung von Interferon in reiner Form darin bestehen würde, immunologische Techniken einzusetzen. Wir reinigten also etwas von dem Interferon, das wir aus Finnland bekamen, auf einem Sephadex-Gel-Filtrations-Kegel. Dies ist einfach ein Kegel, der auf der Grundlage der Größe separiert. Schauen wir uns das hier auf der linken Seite an. Die dunklen Kreise stellen den höchsten Punkt der Aktivität dar, der Aktivität des Interferons, das sich von dieser Säule ablöst. Die weißen Kreise bestehen vollständig aus Protein. Die meisten Verunreinigungen gehen als erstes hinaus. Dann kommt das Interferon mit nur einer geringen Menge an Protein. An diesem Punkt ist das Material immer noch nur zu vielleicht einem halben Prozent rein, aber es ist gut genug, um es Tieren als Antigen zur Herstellung von Antikörpern zu geben. Wir verabreichten Schafen über einen Zeitraum von 16 bis 18 Wochen jede zweite Woche ein bis zwei Mikrogramm. Es stellte sich nun heraus, dass Interferon ein sehr gutes Antigen ist und innerhalb von drei bis vier Monaten zu ziemlichen hohen Anti-Interferon-Titern führte. Somit hatten wir dann einen Antikörper, der das Interferon ziemlich effizient einfangen würde. Die von den Schafen gebildeten Antikörper sind natürlich nicht nur Antikörper gegen Interferon, sondern auch gegen all die anderen Protein-Verunreinigungen, die sich in dem Material befanden, das den Schafen injiziert wurde. Wir versuchten dann, diesen Antikörper in reiner Form zu gewinnen. Auf dem nächsten Dia ist dargestellt, dass man sehr viel bessere Antikörper herstellen kann, wenn man sich der folgenden Technik bedient. Wir stellten eine von uns so genannte Cocktail-Säule her. Dafür nahmen wir alle denkbaren Protein-Verunreinigungen, die in dem Material sein mochten, das wir den Schafen gaben – Serumproteine, Eiproteine, Virusproteine usw.–, gaben sie in eine Säule und leiteten dann die Antikörper durch diese Säule. Alle Verunreinigungen fingen die Antikörper gegen die Verunreinigungen ein. Was anfangs die Säule passierte, enthielt das Anti-Interferon, die Anti-Verunreinigungen konnten dann mit Säure entfernt werden. Dann konnte die Säule gewaschen werden und man konnte das Verfahren mehrmals wiederholen. Schließlich konnte man ein Antikörper-Präparat erhalten, das größtenteils frei von Antikörpern gegen die Verunreinigungen war. Nun konnte dieser gereinigte Antikörper in eine andere Säule gegeben werden. Der Antikörper wurde chemisch zu einer Sepharose-Säule hinzugefügt. Rohes Interferon wird durch die Säule geleitet, und dann kann das Interferon in dieser rohen Substanz von den Antikörpern eingefangen werden. Die Verunreinigungen gehen hindurch, und Sie können die Verunreinigungen abwaschen. Das nächste Dia. Sie sehen, dass der Großteil des Proteins die Säule passiert, ohne viel Interferon zu verlieren. Dann waschen und waschen und waschen Sie und schließlich nehmen Sie das Interferon von der Säule, wiederum bei einem niedrigen pH-Wert, einem höheren Säuregehalt. Sie bekommen Material heraus, das nun in diesem einen Schritt zwischen 500 und 5.000 Mal gereinigt wurde. Dies ist also eine Methode, um ziemlich schnell von sehr großen Mengen zu sehr kleinen Mengen zu kommen. Wir kamen zu der Auffassung, dass die einzige Methode, mit der wir letztendlich sehr große Mengen herstellen konnten, darin bestand, eine menschliche Zelle zu verwenden, die in einer Gewebekultur gut wachsen würde. Glücklicherweise hatten Strander und seine Kollegen in Schweden viele Arten von B-Lymphozyten auf ihre Fähigkeit untersucht, bei Stimulierung durch Viren Interferon zu produzieren. Eine bestimmte Art von Lymphozyten, B-Lymphozyten, ist als Namalva bekannt, das ist ein Kosename für diese Zelle. Ursprünglich wurde sie aus dem Burkitt-Lymphom, einem durch ein Virus verursachten Lymphom, isoliert. Das nächste Dia zeigt, glaube ich, ein Bild dieser Zelle. Sie ist nicht wahnsinnig hübsch. Sie wächst sehr gut in Lösung. Man züchtet sie in einer reichen Salzlösung mit Vitaminen und Aminosäuren und so weiter. Unglücklicherweise erhält man das beste Wachstum, wenn man 10 % fetales Kälberserum hinzufügt, das zur Zeit gerade sehr teuer wird. Wir müssen neue und deutlich günstigere Techniken entwickeln, um im großen Stil Zellen zu züchten. Das nächste Dia stellt einige der Eigenschaften dieses Lymphoblasten-Interferons dar, mit dem wir gearbeitet haben. Es zeigt Ihnen, dass es sehr stabil ist, sowohl in Bezug auf Temperatur als auch auf Säure. Man kann das Material beispielsweise nahezu bei Siedetemperatur, bei 97 ° C, zehn Minuten stehen lassen und hat im Wesentlichen noch dieselbe Aktivität. Es ist also sehr stabil bei Hitze und niedrigem pH-Wert. Nächstes Dia. Allerdings ist es hinsichtlich seiner elektrischen Eigenschaften ziemlich heterogen. Es stellt sich heraus, dass Interferon ein Glykoprotein ist. Es ist ein Protein-Molekül, ein globuläres Protein-Molekül, an dem auch Kohlenhydrat befestigt ist. Diese Kohlenhydrat-Seitenketten enthalten Säurereste, Sialsäurereste, die in verschiedenen Mengen bei verschiedenen Molekülen vorliegen. Manchmal sind es drei, manchmal vier, manchmal zwei. Daher erhält man, wenn man ein isoelektrisches Fokussierungs-Experiment durchführt, eine ziemlich große Heterogenität bei den isoelektrischen Punkten. Die Spitzen, die Sie sehen, sind verschiedene Arten von Interferon, die sich aufgrund der Unterschiede hinsichtlich des Zuckers in ihrer Ladung unterscheiden. Wenn man allerdings den Zucker und damit die negative Ladung aller dieser Kohlenhydrat-Seitenketten entfernt, wird das Material sehr viel homogener. Das zeigt erstens, dass die Heterogenität durch die Kohlenhydrat-Seitenketten bedingt ist, und zweitens, dass die Kohlenhydrate ohne Verlust der Aktivität entfernt werden können, denn das Material ist in Tests weiterhin aktiv. Das nächste Dia. Das nächste Dia zeigt die Ergebnisse der Behandlung teilweise purifizierten Lymphoblasten-Interferons mit einer Mischung aus Enzymen, die die Kohlenhydrate abtrennt. Diese Enzyme gewinnen wir aus dem Bakterium diplococcus pneumoniae. Das Molekulargewicht des Interferon-Moleküls verschiebt sich in Richtung eines niedrigeren Gewichts, wenn man Kohlenhydrat entfernt. Und wenn man, wie im nächsten Dia gezeigt, die Ergebnisse in einem Standard-Schaubild plottet, in dem das Verhältnis zwischen Gewicht und Verhalten in einer Säule im Vergleich zu einigen Standard-Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht dargestellt wird, kann man sehen, dass sich das Interferon nach der Behandlung mit Enzymen in Richtung eines niedrigeren Molekulargewichts verschiebt. Tatsächlich kann man ungefähr 4.000 Dalton an Molekulargewicht abtrennen, und das Gewicht reduziert sich von ungefähr 22.000 Dalton auf ungefähr 18.5000 Dalton, nachdem der Großteil des Kohlenhydrats entfernt wurde. Es ist immer noch aktiv, und wenn man es zum Beispiel einer Ratte injiziert, kann man nachweisen, dass es sich im Kreislauf mindestens ebenso lange hält wie das normale unbehandelte Interferon. Es wird also nicht schnell zerstört. Folglich denken wir, dass es realistisch ist, darüber nachzudenken, den Protein-Teil des Interferons zu synthetisieren, ohne sich um den Kohlenhydrat-Teil zu sorgen, denn dies wäre im Grunde unmöglich. Es gibt im Augenblick keine organische Chemie, die die systematische Synthese von Kohlenhydrat-Seitenketten an Proteinen erlaubt. Aber anscheinend brauchen wir das nicht, und das ist ein Glücksfall. Das Problem besteht jetzt darin, große Mengen herzustellen. Das nächste Dia zeigt die Kinetik der Interferon-Produktion durch die Lymphoblasten-Zellen. Wir züchten die Zellen in großen Behältern, bis wir pro Milliliter ungefähr zwei Millionen haben. Sie werden mit dem Virus, das die Newcastle-Krankheit auslöst, infiziert, welches die Zellen zur Produktion von Interferon anregt. Sie geben das Interferon in das Medium ab, in dem sie wachsen. Zu Beginn gibt es eine leichte Verzögerung, und nach ungefähr 20 Stunden ist die maximale Produktion von Interferon erreicht. Die Zellen werden entfernt, indem man den gesamten Inhalt des Behälters tatsächlich in eine große Milchzentrifuge gibt. Eine Milchzentrifuge, wie man sie auf einem Bauernhof verwendet, erwies sich als die geeignetste Methode, um die Zellen zu entfernen. Die Flüssigkeit kommt heraus, und wir fällen das gesamte Protein aus, einschließlich des Interferons. Und das ist das Start-Material im Rohzustand. Das nächste Dia zeigt, dass man tatsächlich ein wenig Geld sparen kann. Und bei diesen Experimenten ist es wichtig, das zu tun. Fetales Kälberserum kostet zur Zeit etwa $ 200 pro Liter. Es ist äußerst teuer. Wir verwenden 10 % fetales Kälberserum, um diese Zellen zu züchten. Somit haben wir bei 1.000 Litern 100 Liter zu $ 200 pro Liter. Das ist schon ein bisschen heftig. Jedoch stellt sich heraus, dass die Lymphoblasten-Zelle Interferon sehr viel effizienter bei niedrigerer Zellkonzentration als bei höherer Zellkonzentration produziert. Wenn Sie mit dem Virus der Newcastle-Krankheit bei 2 x 10^6 Zellen pro Milliliter infizieren, bekommen Sie in diesem Fall 1.800 Einheiten pro Milliliter. Wenn Sie bis auf 0,4 x 10^6 verdünnen, dann erhalten wir 7.000. Somit erhöht man durch die einfache Zugabe von Salzlösung die Fähigkeit, die Effizienz der Produktion von Interferon. Routinemäßig züchten wir 250 Liter anstelle von 1000 Litern heran und verdünnen dann mit Salzlösung auf 1000 Liter. Das nächste Dia hier zeigt dasselbe. Oben sind die unverdünnten Zellen und ihre Effizienz hinsichtlich der Interferonproduktion dargestellt, unten die Effizienz der Zellen nach der Verdünnung mit Salzlösung, die Glutamin enthält, eine essenzielle Komponente während der Produktion. Im Grunde bekommen wir vier Mal so viel Interferon, wie wir andernfalls bekämen, und das nur dadurch, dass wir die Zellen verdünnen. Das nächste Dia. Das ist eine typische Art von Dia, das man nicht lesen kann. Es fasst einfach alle Schritte zusammen, die wir durchlaufen. Wir beginnen so, wie zuvor beschrieben, wir nehmen die Zellen mit einer Milchzentrifuge ab und dann fällen wir alle Proteine aus dieser klaren Flüssigkeit mit Trichlorethansäure aus. Dann durchlaufen wir mehrere Schritte. Als erstes die Entfernung der Trichlorethansäure, dann diese Antikörper-Säule, von der ich sprach und die das Interferon einfängt. Und mehrere Schritte einschließlich Größenbestimmung auf Säulen, Ionenaustausch-Separationen und schließlich der Polyacrylamidgel-Separation in Natriumdodecylsulfat, der Gel-Purifizierung. An diesem Punkt sind wir schon bei sehr kleinen Mengen. Bei diesem Dia hier betrug die gesamte Ausbeute nur 6 %, was sehr schlecht ist. Mittlerweile sind wir hier bei 15 %, und ich hoffe, dass wir bald vielleicht 50 % haben werden, mit Hilfe einiger Tricks, die wir einzusetzen beginnen. Allerdings ist es immer noch ein langsames und mühsames Verfahren. Wie Sie sehen können, haben wir an diesem Punkt Protein in der Größenordnung von zwei Zehntel Milligramm aus 200 Litern Zellen gewonnen. Die spezifische Aktivität dieses reinen Materials – dies ist 18,5 k, 18,5 Tausendstel Molekulargewicht – beträgt ungefähr 2,2 x 10^8 Einheiten. Das ist die Reinheit solchen Materials. Es gibt einen anderen Bestandteil mit 21,5, welcher derselbe ist wie der mit 18,5, sehr wahrscheinlich mit noch angehängtem Kohlenhydrat, das ihn um diese Zahl schwerer macht. Das nächste Dia. Dies ist ein Polyacrylamid-Analyse-Gel, bei dem unten die Interferon-Aktivität als schwarze Punkte geplottet ist und oben das Muster des Gels mit Coomassie-Blau angefärbt wurde, um die Position des Bestandteils zu markieren. Sie sehen, dass das dunkle Band mit der wichtigsten Interferon-Spitze korrespondiert, und links ein anderes, schmaleres Band mit Aktivität. Wenn Sie nun das Hauptband herausschneiden und auf einem anderen Analyse-Gel reinigen.... im Vergleich zu einigen bekannten Proteinen als Marker links, damit Sie eine Vorstellung von dem Molekulargewicht bekommen. Das erste reine Material wurde vor etwa zwei Jahren von Ernest Knight bei DuPont aus Fibroblasten-Interferon hergestellt. Dies ist unser Lymphoblasten-Interferon. Beide Varianten haben ungefähr dasselbe Gewicht und dieselbe spezifische Aktivität. Das heißt, dass bei beiden gilt, dass ein Milligramm etwa 2 oder 3 x 10^8 Einheiten enthält. Das nächste Dia. Nochmals: Protein-Chemiker zeigen immer Aminosäuren-Analysen. Das ist nicht wahnsinnig nützlich, aber dies ist eine einfache Aminosäuren-Analyse, die mit der Mikromethode für Aminosäuren-Analysen durchgeführt wird, und zwar bei reinem Interferon. Möglicherweise ist sie nur interessant, um darauf hinzuweisen, dass eine ziemlich große Menge hydrophober Aminosäuren vorliegt, wie Leucin, Phenylalanin, Valin und einige andere. Auf dem nächsten Dia geht es um dasselbe. Hier haben wir die Aminosäure-Analysen von Fibroblasten-, Lymphoblasten-, Leukozyten- und Mäuse-Interferon. Für alle von ihnen wurden Aminosäure-Analysen für reine Proben durchgeführt, und dies zeigt Ihnen, dass die Zusammenstellung der Aminosäuren bei Mäuse-, Leukozyten-, Fibroblasten- und Lymphoblasten-Interferon ungefähr dieselbe ist. Jede Art besitzt ungefähr dieselbe Menge an Lysin, Histidin, Arginin und so weiter. Im letzten Herbst, im November, waren wir der Meinung, wir hätten genug Reinigungen durchgeführt und damit genügend Material angesammelt, das wir in den Aminosäuren-Sequenator geben konnten, die von Edman und seinen Schülern im Laufe der letzten Jahre entworfene Maschine, die einem, Stück für Stück, etwas über die Struktur eines Proteins sagen kann. Das nächste Dia stellt Ergebnisse dar, die von Hood und Hunkapillar gewonnen wurden, zwei Wissenschaftlern am Caltech in Kalifornien, die über eine dieser sehr empfindlichen Maschinen für die Sequenzbestimmung verfügen. Zusammen mit Pete Knight bei DuPont mit seinem Fibroblasten-Interferon und Lengyel und seiner Gruppe in Yale, die Mäuse-Interferon hatten, schickten wir ihnen Proben, die sie abbauen konnten. Es stellte sich heraus, dass das Mäuse-Interferon in zwei oder drei Varianten – A, B und C – vorkam. Wir zeigen hier einige Ergebnisse zu A und C, um insbesondere hier unten darauf hinzuweisen, dass das Interferon der Mäuse-Leukozyten, das als Band C bezeichnet wird, dem Material ähnlich ist, dass wir aus Lymphoblasten-Zellen gewonnen haben. Es besteht eine ziemlich weitgehende Strukturhomologie. Dies sind nur die ersten 20 Aminosäuren. Aber es ist ein Anfang, von dem Amino-Terminus sind es die ersten 20 Reste. Und es gibt ein ziemlich hohes Maß an Ähnlichkeit. Zumindest sagt uns das, dass diese beiden Gene – das Gen für Interferon beim Menschen und das bei der Maus – ziemlich ähnlich sein müssen, wenigstens für die ersten 20 Aminosäuren. Das bedeutet, dass es sich wahrscheinlich um ein ziemlich altes Gen handelt, das man bei so alten Arten wie Fischen, Schildkröten und Fröschen findet. Das Interferon-Gen existiert also schon seit einiger Zeit. An diesem Punkt waren wir sehr stolz auf uns, denn nach sechs oder sieben Jahren war es uns endlich gelungen, die Anfänge einer Sequenz zu bestimmen. Wir hatten tatsächlich ein Protein, das rein vorlag und charakterisiert werden konnte. Wir arbeiteten also weiter daran und stellten mehr Material her, um den Rest der Sequenz fertig stellen zu können, als sich plötzlich in Zürich und anderswo die genetische Revolution ereignete. Einer der Vorteile der Gentechnik und der Produktion von Material durch E. coli-Zellen ist, dass man die DNA aus dem Chromosom der E. coli-Zelle bekommen kann. Es ist viel einfacher, die Struktur eines DNA-Fragments zu bestimmen, als die Struktur eines Proteins zu bestimmen. Als Charles Weismann zum Beispiel einen E. coli-Klon erhielt, der Interferon produzierte, konnte er dieses Material sehr schnell verwenden. Auf die Details der von ihm verwendeten Techniken werde ich nicht eingehen, weil ich mich in diesem Forschungsfeld erstens nicht wahnsinnig gut auskenne und weil es ziemlich kompliziert zu erklären ist. Es gelang ihm, die vollständige Sequenz des Gens zu erarbeiten, welches das Interferon bestimmte, das von jenen Zellen produziert wurde. Als Boten-RNA, aus Leukozyten isolierte RNA, verwendete er Leukozyten-Boten-RNA, um das ursprüngliche Plasmid herzustellen, das er für die Translation in die E. coli-Zelle einsetzte. Das nächste Dia ist sehr verwirrend, aber tatsächlich nicht so verwirrend, wie es den Anschein hat. Auf diesem Dia habe ich die von Charles Weismann und seinen Kollegen für das Leukozyten-Interferon bestimmte Sequenz als Protein dargestellt. Das ist das Zentrum der Linien. Diejenige, die mit dem CYS (Cystein) in dem Kasten oben links beginnt, geht entlang der Linien im Zentrum, den ganzen Weg hindurch, das ist Weismanns Leukozyten-Interferon. Wenn man die Sequenz des DNA-Strangs und den genetischen Code kennt, dann kann man einfach die Aminosäure ablesen, die den Tripletts der Nukleotid-Basen in dieser DNA-Sequenz entspricht, und die DNA-Struktur in eine Protein-Struktur übersetzen. Die Linie oben stellt eine ähnliche Übersetzung der DNA-Struktur dar, die von Taniguchi und seinen Kollegen, einer japanischen Arbeitsgruppe, aus Fibroblasten-DNA bestimmt wurde. Dies ist ein weiteres Interferon-Gen. Sie selektierten das Gen aus Fibroblasten. Das sehen Sie in der obersten Zeile. Auf der Linie unten sehen Sie die Sequenz, die wir aus unserem eigenen Lymphoblasten-Material bekommen haben. Wie Sie hier sehen können, gibt es einige Leerräume, die noch nicht komplett analysiert sind, aber wir hoffen, dass wir dies in den nächsten Monaten vervollständigen können. Wichtig ist, dass man, wenn man von einem Fibroblasten zu einem Leukozyten, zu einem spezifischen Leukozyten wie etwa einem Lymphoblasten weitergeht, zahlreiche Ähnlichkeiten vorfindet. Ich habe jene Bereiche eingekreist, bei denen in allen drei Arten dieselbe Sequenz vorliegt. Offensichtlich besteht wiederum eine ziemlich große Homologie zwischen einem Zelltyp und einem anderem. Ich habe auch die Bereiche schraffiert, die die Cystein-Reste einschließen, die Aminosäuren, die dafür verantwortlich sind, im sich faltenden Protein Querverbindungen durch die Disulfid-Brücken zu bilden. Und dort ist ein Abschnitt, den ich vergessen habe zu schraffieren, unten bei 140, da ist eine CYS, ALA, TRP-, eine Cystein, Alanin, Tryptophan-Abfolge, die sowohl in der Fibroblasten-Sequenz als auch in der Leukozyten-Sequenz vorliegt. Leider haben wir sie noch nicht in unserer Struktur, obwohl wir wissen, dass ein Tryptophan im Molekül vorhanden ist. Wir hoffen, dass wir diesen Abschnitt bald analysiert haben. Die Tatsache, dass jener Abschnitt und der Abschnitt oben rechts in diesen drei Varianten so sorgfältig erhalten wurde, deutet darauf hin, dass es sich dabei um besonders wichtige Cysteine handelt, die vielleicht eine Disulfid-Brücke bilden. Allerdings werden wir mit derart detaillierten chemischen Überlegungen wirklich warten müssen, bis wir größere Mengen isoliert haben. Was ist also zu tun, wenn uns dies gelungen ist? Für Taniguchi und Weismann ist die Zukunft sehr klar. Sie müssen E. coli-Systeme herstellen, die E. coli-Zellen selbst und immer bessere und bessere und bessere Plasmide, die man in die Zellen einfügen kann, damit diese mehr und mehr Interferon produzieren. Dann müssen sie das Interferon in reiner Form gewinnen und von den Proteinen des Bakteriums so weit reinigen, dass es rein genug wird, um es Menschen geben zu können. Menschlichen Patienten kann man keine unreinen Proteine verabreichen, da sie Antikörper gegen diese entwickeln und man solche Phänomene wie einen anaphylaktischen Schock etc. vermeiden muss. Obwohl es im Time Magazine phänomenal klingt und ich der Ansicht bin, dass diese Leute hervorragende Arbeit geleistet haben und wahrscheinlich irgendwann das Interferon herstellen werden, das wir benötigen, haben sie noch einen langen Weg vor sich, was die Gewinnung in Reinform und die Erstellung besserer Trägersubstanzen für ihre Arbeit angeht. In unserem Fall haben wir, da wir unsere eigene Sequenz noch nicht vollständig fertig gestellt haben und uns für die Synthese interessieren, damit begonnen, langsam die Sequenz der Struktur von Weismanns Leukozyten-Interferon zu synthetisieren, die mittlere Linie hier. Hierfür bedienen wir uns sowohl der neuen Festphasen-Synthese-Techniken, die von Merrifield und seinen Kollegen entwickelt wurden, als auch der klassischen Peptidsynthese, Fragment-Kondensation, die eine enorme Arbeit bedeutet und möglicherweise zu viele Jahre braucht, als dass man sie in Betracht ziehen könnte, es sei denn, wir lassen uns irgendwelche Tricks einfallen – oder irgendeine Kombination beider Techniken. Außerdem möchten genug Material gewinnen oder genug Material von Weismann oder Taniguchi bekommen, um gründlich an der Struktur und Funktion arbeiten zu können – das heißt, wir möchten versuchen herauszufinden, ob man Teile des Moleküls abtrennen kann und dabei dennoch die Aktivität behält. Wenn man nämlich die Hälfte des Moleküls wegschneiden und daraus 80 Aminosäuren anstelle von 160 machen könnte, dann würde die Synthese nicht mehr so schwierig sein. Das ist also zur Zeit unsere Hoffnung. Vielleicht können wir sogar das E. coli-Interferon für unsere Arbeit an Struktur und Funktion verwenden. Ich bin mir sicher, dass für jemanden wie Dorothy Hodgkin oder Bill Lipscomb, die hier sitzen, der Gedanke interessant ist, dass, falls die Kristallografie, die dreidimensionale Struktur des Interferons jemals erarbeitet wird, dies wahrscheinlich anhand von synthetischem Material geschehen wird, da wir wahrscheinlich niemals genug von der anderen Art zur Verfügung haben werden, um dies tun zu können. Aber vielleicht werden wir das doch haben. Es wäre ein schöner erster Versuch. Ein letzter Punkt, der für einige von Ihnen von einigem Interesse sein könnte. Wir wissen seit einiger Zeit, dass Interferon und das Choleratoxin um dieselben Rezeptoren auf der Oberfläche der Zelle konkurrieren. Man kann Interferon hinzufügen und um die Erkennung konkurrieren, indem man gleichzeitig Choleratoxin hinzugibt, und umgekehrt. Ich bat also die Leute, die dieses Verzeichnis von Proteinsequenzen herausgegeben hatten, Margaret Dayhoff und ihre Kollegen, deren Computer alle bekannten Sequenzen enthält, die Leukozyten-Sequenz von Weismann mit allen anderen bekannten Proteinsequenzen zu vergleichen, von denen es mittlerweile Hunderte geben muss. Und sie rief zurück und sagte mit sehr ungläubiger Stimme, dass es sehr wenig Ähnlichkeit zu geben schien, abgesehen davon, dass es – nächstes Dia, bitte – da eine sehr interessante Ähnlichkeit zwischen der Interferon-Struktur und der Sequenz des Choleratoxins gab. Ich sagte, dies sei sehr schön. Ich hatte ihr vorab nichts gesagt, es kam ohne irgendeinen Hinweis aus dem Computer. Es stellt sich heraus, dass wir hier, ganz unten, eine Zahl haben, die als Übereinstimmungswert (alignment score) bezeichnet wird, eine Punktzahl von ungefähr 4,1, was als ziemlich gut gilt. Der Übereinstimmungswert für, sagen wir, Myoglobin und eine Beta-Kette von Hämoglobin beim Menschen beträgt etwa 9, und somit ist dies wirklich ein ziemlich hoher Grad von Sequenzhomologie. Und Sie können sehen, dass sich in diesem Abschnitt hier eine ziemlich große Anzahl identischer Aminosäuren befindet. Könnte ich bitte zum letzten Dia zurückgehen, dem vorherigen Dia. Wir haben rechts unten angefangen und arbeiten rückwärts. Und es stellt sich heraus, dass dieser Abschnitt, der dem Choleratoxin ähnelt, von ungefähr 150 bis zurück zu ungefähr 120 verläuft. In jener Region befinden sich diese Ähnlichkeiten. Es wird sehr interessant sein herauszufinden, ob dieses Peptid, mit dem wir nun im Wesentlichen fertig sind, mit dem Choleratoxin konkurrieren und vielleicht zum Beispiel als antigener Bereich dienen kann, den wir einsetzen können, um unsere Anti-Interferon-Antikörper in reinerer Form zu gewinnen. Und es könnte uns zu einem Zugang, zu einem Verständnis des Prozesses, durch den das Interferon die Zelloberfläche erkennt, verhelfen. In einem Abstract, den ich vor meiner Anreise vorausschickte, erwähnte ich, dass ich etwas über den Wirkungsmechanismus sagen würde. Doch leider ist das sehr schwierig. Alles, was man zur Zeit sagen kann, ist: Wenn man einer Zelle Interferon gibt, so wird das Interferon von der Zelle erkannt und die Zelle wird angeregt, zwei oder drei Enzyme herzustellen, die vor dem Auftreten von Interferon entweder nicht oder nur in sehr kleinen Mengen vorlagen. Alle Enzyme, die produziert werden, sind an der Steuerung der Übersetzung von Botschaften beteiligt – das bedeutet, an der Proteinsynthese, der Übersetzung einer RNA-Botschaft in Protein. Im Augenblick scheint es, angesichts der Forschungsarbeit mehrerer Labore, dass Interferon an der Hemmung der Übersetzung der viralen Botschaft, die in die Zelle hineingelangt, beteiligt ist. Das ist so ziemlich alles, was wir über den Mechanismus des Prozesses wissen. Der Rest ist größtenteils phänomenologisch. Und ich hoffe, dass es uns gelingen wird, etwas Genaueres nicht nur zu seiner Funktionsweise, sondern auch dazu zu sagen, gegen welche Krankheiten es, wenn überhaupt, hilfreich ist. Ich selbst bin ziemlich zuversichtlich, dass es mit Sicherheit gegen einige Viruserkrankungen sehr hilfreich sein wird. Krebs ist nach wie vor ein Problem, bei dem man auf Holz klopfen muss. Ich danke Ihnen. Applaus.

Christian Anfinsen (1980)

Studies on the Structure and Properties of Human Interferon

Christian Anfinsen (1980)

Studies on the Structure and Properties of Human Interferon

Comment

In 1980, the biochemist Christian Anfinsen participated for the first time in a Lindau meeting. Listening to his introduction, one can hear that he liked the lecturing situation: A Nobel Laureate and a select audience of students and young researchers. As Anfinsen puts it, the main function could be to make it clear that people who win the Nobel Prize are not really different from other people (except, in his view, certain exceptions such as Albert Schweitzer, Linus Pauling and a few others!). Many Nobel Laureates coming to Lindau for the first time repeat (more or less) their Nobel lectures that, according to the Statutes of the Nobel Foundation, should be “on a subject relevant to the work for which the prize has been awarded”. But Anfinsen choose to talk on his work on the human interferon and what medical applications it could have. The idea was that interferon could be important in curing viral diseases (maybe even cancer) and the problem was to get enough interferon to be able to make large-scale medical studies. Anfinsen discusses two approaches, first the traditional one of a biochemist (with a lot of money): Use 1000 litres of human white blood cells, infect them with a virus, use biochemistry to produce about 100 micrograms of interferon (which only amounts to a limited amount of doses for a patient). The second approach discussed was the modern one: Produce the interferon protein molecule using genetic engineering, since it is probably easier to find the structure of the interferon gene than that of the protein it produces. He may not have known it, but at the same time as Anfinsen gave his talk, the Nobel Committee for Chemistry discussed the 1980 Nobel Prize. In the early autumn it was decided that one of the fathers of genetic engineering, Paul Berg, should receive one of the two prizes. Today his technique is in fact, as Anfinsen discussed, used to produce several kinds of interferon for medical purposes!Anders Bárány

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