Dorothy  Crowfoot Hodgkin (1983) - Insulin 1983

According to the Statutes of the Nobel Foundation, each Nobel Laureate has to deliver a lecture describing the work that has been rewarded by the Nobel Prize

Mr. Chairman, ladies and gentlemen. This is a great pleasure again to be here in Lindau. I find it also a pleasure to be talking to this kind of audience about my present subject. Just about a year ago a book was published called the Discovery of Insulin by Michael Bliss, which described what really happened according to the laboratory notebooks of those who took part in the original discovery. Could I have the first slides, please. There was a fantastic two years of late 1921, 1922, during which it became possible to effect this extraordinary transformation. You hardly ever, I imagine, see a child and certainly not in any civilised country in this condition suffering from acute juvenile diabetes. A condition which was observed very anciently and described as one in which the flesh flows over the bones, as you can see here. And yet a short time afterwards through injections of insulin she was transformed back. The flesh grew again. Insulin is an extremely powerful growth promoting hormone. It came about through the operations of those two over there, two young men. One a young doctor of about thirty and Charlie Best who was half way through his medical course aged 22. Banting got an idea which was not correct about how it might be possible to isolate the diabetic hormone from the pancreas, which took him to Toronto, and he managed to persuade Macleod, the Professor there of physiology, to let him try it out. And Macleod gave him this very intelligent student to help with his operations and some very good advice about how he might extract the hormone. It’s clear that Banting and Best, though they were the real workers, wouldn't actually have got anywhere without Macleod’s guidance and assistance. And it’s only that reading their account, one feels they were so terribly ignorant, they hadn’t read the literature. They made all sorts of mistakes. They covered over their mistakes in order to make it clear that they really were getting somewhere. They were rescued essentially by Macleod and Colipp, who finally made the insulin pure enough to be used in the treatment of diabetes. And yet it’s clear that the myth that they were really responsible for the isolation of insulin is correct. It wouldn't have happened without their intervention. The account is one that anyone working on diabetes reads with great fascination and excitement. Now that everyone who took part in the original battle to succeed is finally dead. So we have this extraordinary transformation, which is still incompletely understood. How does insulin act on sugar metabolism to make possible this cure when the supply in the body’s pancreas is insufficient? I find myself thinking that JD Bernal and I were about the same sort of age, he a little older, both of us a little older, 34 and 24 respectively, when we got involved in taking the first protein x-ray photographs. On the next slide I show, just for history, beautiful crystals of pepsin, which came to us from Uppsala. And on the right hand side an x-ray photograph not of pepsin, the first ones which Bernal took in Cambridge, but of an insulin crystal taken very, very much later. I was given the 10mg of microcrystalline insulin by Robert Robinson who’s picture you saw yesterday. He had been given it by Boots in England as a result of advice that he gave them. And he didn’t know what to do with it, so he passed it onto me saying: So I did, I had to grow up the crystals and on the next slide - I also made a lot of mistakes. I let the crystals dry because they were quite biofringent to my eyes, when Bernal had shown it before it was better to have them wet. But I obtained the first x-ray pattern which was totally interpretable in terms of the size of the unit cell. And in this unit cell you could put, if you measure the density, a mass of about 36,000 protein units. I should have a photograph of Bernal but the one I used to show got perished in a large meeting in Canada a year or so ago. And so on the right, I put Bernal’s letter to me from Cambridge on my telling him the news that I had got the photographs of insulin and what the size of the unit cells of the rest of it was. And everybody thinks this is a very funny letter but it’s absolutely interpretable by any x-ray crystallographer. He has looked up the paper which D. A. Scott had written the year before in 1934 on how to crystallise insulin, which I had used, which showed that it was necessary to add zinc. And that Scott had also made a cadmium and a cobalt insulin. He had taken Scott’s figures and worked out what this meant, zinc per protein in the unit cell. And the implication is try to get photographs of cadmium insulin and see if you can’t see changes in the intensities which would guide the determination of the complete structure of insulin. Well, as I say, I was 24 at the time. I hadn’t worked out any crystal structure at all. The cadmium preparation turned out to be rather impure and I couldn't grow large crystals of it at all. All I could do was get a powder pattern which looked only too like the zinc crystal powder pattern. I had grave doubts as to whether the cadmium would be heavy enough to make the changes and I thought I should start on something simpler first before I tried to determine the crystal structure of insulin. At the same time that I got, that this was happening, when I published the mass of protein in the unit cell, 36,000, I got a letter from Freudenberg, which I value greatly, which said And of course the crystal has threefold symmetry, so that the implication there is that the molecular weight is probably 12,000. As everyone knows, insulin, the chemical structure was determined by Fred Sanger and his colleagues and it was found to be even smaller, only under 6,000. The structure two chains is written up here, disulphide bonds joining them and below a scheme for the synthesis of insulin. And this general scheme was followed in three different places and actual synthetic insulin made around about 1965 in Pittsburgh, in Aachen and in Shanghai and Peking a joint operation. And later it has been found that insulin, the two chains, varies according to the creature which produces the insulin, and over the far side I have the insulin sequence grouped in kinds of creatures with the variations that occur in the aminoacids in the long chains. You can see that some regions, the beginning and end of the b-chain, are highly variable. It doesn’t almost seem to matter what is there. Whereas in other regions there’s been no change throughout time from the earliest, from the latest creature, I think man is at the top in these slides. The hagfish cyclostomes are down at the bottom. These invariant residues include the cystine residues, as you might expect, a lot of leucines, about six leucines and phenylalanine, and the aromatic residue is a highly conservative. When they change, they change usually between tyrosine and phenylalanine. Could I have the next slides, please. So we now set out to try to calculate the electron density map of insulin. And before that happened, I tried out the experiment on penicillin and I put the penicillin map up here for those who aren’t familiar with the situation because you can see what's involved. We calculate the electron density using the isomorphous replacement method suggested by Bernal, much more complicated in the protein case and first carried out by Max Perutz and John Kendrew. We calculated over the whole body of the unit cell and then draw it out in sheets and stacked the sheets together, which gives you this 3-dimensional fit. These at least are the kind of atoms you find in proteins, oxygen, carbon, nitrogen, sulphur or potassium iron. In fact the two zinc insulin structures we call it, was solved twice over, once by my group in Oxford and once in Peking and by Liang Dong-Cai and his group. It is being refined three times over, once by us in Oxford and we have stopped at a resolution of 1.5 Å, and once by Nori and Kiwako from Japan, who worked with us and who have taken it furthest to 1.1 Å. And I think Dong-Cai’s measurements end at about 1.2 Å and both of theirs are at low temperatures. This was taken two years ago of the meeting of the representatives of the three groups, comparingtheir maps, as you can see, in Peking, laying one on top of the other at a scale of 1cm = 1 Å. And you can see we were all very pleased with the observations we were making. Nori in the middle, Tom Blundell here, behind me. I have had very, very many other good collaborators of whom the most important historically are Guy Dodson, Eleanor Dodson and Vijayan from India. So I’ll now take you through the crystal structure of insulin very quickly to see the kind of molecule that finally turned up in these crystals. And so in the next slide I show two bits of the electron density map, the first map from China with the zinc in the middle and this is a little overlapping series of sections in which you can see the zinc and a group coming towards it unresolved. The resolution is 2.5 Å, and if you could read Chinese, you would see that that was histidine. And over here our latest map at 1.5 Å with all of the atoms now beginning to show as separate units and the histidine has broken up into the five peaks corresponding to its position. In both cases we are looking down the threefold axis and it’s just that one map is flipped over compared with the other. This is essentially this region here with the leucine residue at that position. On the next two slides the histidine map as seen in Nori and Kiwako’slatest map and now they have cut the electron density slab through the histidine ring and drawn the contours, I must say very close for beauty at about 0.1 of an electron per cubic Å. So you see here the separate atoms looking beautifully resolved attached to the zinc and the zinc also attached to the water and there are three round the threefold axis, making the zinc octahedral. And over here a different map, calculated with all the heavy atoms taken out of the contributions to the terms, so that you can see peaks representing the hydrogen atoms alone. And you can see this hydrogen is proteinated here, that is on the histidine attached to the zinc. Other little strays are still the necessary bits of experimental error that remain in the calculation. I must admit that not all of Nori and Kiwako’s map is as good as that. The atoms are much better well defined near the zinc positions in the crystal than they are at the edges of the molecule, where there is considerable movement certainly of the atoms within the crystal. And this smears and lowers the electron density in the crystal. Now, if from those maps you take all of the atomic positions in the protein and project them down the threefold axis, this is the picture that you get. An old picture, now the positions have been refined since, but it serves to show, the object in the unit cell is this object, which is the projection of the positions of six insulin molecules down the threefold axis. Zinc in the middle represents two zincs, one on top of the other and each connected with three histidines from the upper and lower molecules. You can see the molecules are in contact with one another along this line quite close, here’s an aromatic ring from one molecule. And there’s another one from the other molecule just about here, b-phenylanaline. They are touching across the gap there. And at this position you can see that there’s empty region water flows from one side of the molecule to the other. There are also sort of gullies across the top of the molecule into which water flows across into the region around the threefold axis. So that water is in fact continuous throughout the whole body of the crystal. The slide over here shows approximately the geometry of the hexamer, you can see there’s a roughly twofold axis along these regions. If you break the molecules apart around those axis, then you get a rather closely knit object here which corresponds to a dimer of insulin, and if you break these apart along this line, you get two separate molecules. And in solution ordinary - this in the presence of zinc the molecular weight of insulin was first measured as 12,000 via osmotic pressure measurements. Now, the next two slides show the dimers viewed perpendicular of the threefold axis, and here I have in fact put up three of them. And now this one in the middle is the one we see in two zinc insulin. And the noticeable thing about it is that the two molecules of insulin look very much the same but a little different from one another. We first noticed it at this point where one phenylalanine is across the position which should be a twofold axis between them. The two molecules are very close to one another, in fact they are hydrogen bonds between the long chains. And you can see the long b-chain here going into an alpha-helix and coming out here and the a-chain sitting on top of it. The other two are the dimer as found in the most ancient insulin so far studied, hagfish insulin, a cyclostome. And there you can see the two molecules are the same, related by crystal graphic twofold axis, both phenylalanine rings turned in this direction. And the essential pattern is the same as one of the two molecules here. We now call this molecule 1, we called it molecule 2 for accidental experimental reasons originally. But itseems to be the conserved molecule which stays the same in all the crystal structures we have observed. The third dimer is one that occurs if you have more zinc and sodium chloride in the crystallising solution. And then one molecule changes even more under the pressures of these conditions but the other one stays still the same as molecule 1 in this crystal. The slide over here shows the two separate molecules and you can see that they are very much the same but there are these little differences. The other point we always noticed the difference at is this one here where the lysine at the end of the b-chain goes straight up here and gets really lost about in the solvent on this particular molecule. The next two slides should show here just an idealised representation of the fold in two-zinc insulin, in all of these insulin molecules, with b-chain beginning straight, running into a long helix well defined, out again here. A-chain, two helixes, not so well defined, straight and second one disulphide links between the chains at the ends of the helixes down here and down here. And then this little loop in the a-chain with the other internal disulphide bond here. And over here one of the b-chains showing the general form of the b-chain as observed in this crystal with the lysine going up here and the b5 histidine sticking up on the end, at the beginning of the b-chain. On the next slide, what happens to the a-chain? Now, the a-chain in general form is represented on this side, one of the two molecules with the beginning of the helix straight, second helix, A19 bridging the gap between the top and the bottom halves. It rests on the folds of the b-chain. But over here I’ve got a different view of the a-chain looking down on the ring that contains the disulphide. And you can see that the projection of the beginning helix is quite different in the two examples. In fact they have very much the same arrangement of the side chains and everything, the difference corresponds to just turning about 30° at the beginning a-chain helix from one position to the other. And this produces a difference in the pattern of the hydrogen bonds across the 6/11 disulphide ring. You can see the different projections here and here. We can see that what produces the general fold in the insulin is the pattern of the residues along the chains some of which encourage the formation of helixes and others encourage the more extended form of chain. How they come together is illustrated by the next two slides, these show the centres of the molecule as seen in our latest maps with electron density contours representing the different groups that lie within a 6 Å sphere of the molecular centre. And the molecular centre there and there is empty but it’s packed around by all of the invariant leucines in the molecule. Invariant 6/11 disulphide bond, invariant A19 tyrosine. Invariant A2 isoleucine. But you can also see that the relative positions of these packing groups is different. This is caused by this difference in the a-chain confirmations, and the fact that this leucine is rather weakly defined, really suggests that it is being moved to a rather less favourable position than the original one. This is the molecule 1 confirmation. The next two slides show the packing in the centre of the molecule, in a different and modern view, using all modern conveniences of colour, graphics, you see here a view, a rather odd view looking down the b-chain helixes in the insulin molecule. And the arms of the helix coming out. The a-chain sitting a small compact object within the arms of the helix and all of these leucines, these non-polar residues packing in the centre between the two chains. So the chains, as you may imagine, are brought together by a tendency of like to aggregate to like, this non-polar region and then clipped into position by the disulphide formation of the disulphide bonds in the synthesis that was practiced by chemists. No doubt it’s a little bit different in the natural synthesis which passes through a single long chain precursor. And over here you get a packing view drawn which gives you the impression that this centre of the molecule is really a very tightly packed object in spite of its apparent emptiness over here. So when we look at the insulin molecule in isolation it becomes clear that one face is very flat. It’s studied again with essentially non-polar and aromatic residues. And these two faces of two molecules brought together will give us the dimer. So in the next two slides I show the groups that form the dimer. Aromatic residues bridging the gap between the two molecules and again these four aromatic groups and these two are all in contact with one another, criss-cross as if they were forming a little crystal. These other ones are on the edge of the molecule hanging out. And over here the very close packed views of the dimer presents to the outside world if you draw in slightly less than the van der Vaals radii with these aromatic residues hanging out on the outside here, two different views of the dimer. Having got the dimer, of course we must put it into the hexamer, and so in the next pair of slides I should show the hexamer. And here again you see centre zinc, the outline chain in red, the dimer forming residues are now in blue here and all the yellow ones are the hexamer forming residues. The histidines coming into the zinc and the aromatic residues packing together on the outside, four of them here, other non-polar residues. And on the right hand side a very beautiful slide which I’ve only had in my possession about three days, which came just the morning I was leaving England. A present from Andrew Moorephew who made it, and this shows you the top of the hexamer looking very well packed but with three projecting disulphide bonds on the top. And there is a sort of a groove down these lines through which water flows. So we’ve reached the stage of the hexamer. Now, the next two slides illustrate the point about the hexamer and the way that it packs in the crystal. And this is the hexamer as first we, so to speak, saw it, at low resolution 6 Å. This is a very old slide I'm afraid, we are looking down the zinc here and you see three sort of bulges on the top which actually is the top of the a-chain and three dips, this groove I was talking about here and here. And when you think how to pack the hexamers into crystals then it’s simple. You just stack them one on top of the other and the bulge below, which occurs at this point fits into the groove above and everything looks fine. And it’s only when you get to high resolution you realise that there’s one trouble about this packing. This is represented, or the consequences of it are represented over here. This is a view of three molecules seen on its side and you see the b-8 histidine, b-5 histidine sticking up here and this actually occupies exactly the same space that the b-5 histidine from the one above would occupy if something didn’t happen in order to allow the rest of the molecule to fit nicely into this groove. What happens is the histidine moves aside, the top histidine up here is in a different relative position to this one here. There it is there, it packs quite nicely against it as histidines have been seen, as the rings have been seen to pack in crystals of histidine peptides. But in doing so it changes the hydrogen bonding pattern. The a-chain swivels around this bond, takes up a slightly different position in the crystal, everything settles down again but with the molecules different from one another, as we’ve seen all the way through. And over the other side, and whether it’s a consequence of the movement of the a-chain through the crystals or separate idea of its own, the lysine b-29 sticks up and makes contact with the b-30 carboxyl group of the molecule stacked on top of the crystal. So now we come to the last stage, we have these pillars of insulin molecules, we can pack them like pencils in the crystal and we only have the possibility of just moving around this pencil how we fit them together. And this is done in order to again bring like to like together between the molecules in the crystal. As I showed earlier, the outline aromatic groups make contact but also so does an enormous number of different ionic residues. In the next slides I show this ionic layer with the b-30 carboxyl group in contact with its own a-1 glycine LH3+ but also with this b-29 lysine from the molecule packed above it in the crystal. And at the same time the arginine from another hexamer over here managed to come into this ionic region. The slight complication of this slide is that the arginine is in two minds. Whether to make a contact over here with the a-21 carboxylic acid or over here with the a-17 carboxylic acid. And there’s also a certain amount of disorder, this other lysine residue. But, as you can see, an extraordinary number of different ionised groups come together within the layer between the hexamers in the crystal. Over here a rather pretty picture illustrating the water over the surface of the hexamer. It’s a slightly misleading drawing because the more diffuse an atom is, the larger it appears on this drawing, illustrating an uncertainty in its position. So the tightly bound protein atoms in red are well defined, the ones on the outside of the molecule are the loose chains on the surface. Now, the next two slides take me over to one of the crystals I mentioned earlier. And this is the four zinc insulin, which occurs just when 6% of sodium chloride is in the crystallising solution. It was grown by Schlichtkrull in Copenhagen, in order to have very regular crystals to administer to patients to produce a slowly absorbed insulin. And to our surprise, although the crystals look just the same and have very similar lattice constance, they turned out to be quite different inside. And the hexamer here is one in which there are four zincs per six insulin molecules. On the next slide I think you can see more clearly the difference, again one molecule stays steady, molecule 1, three histidines come into the zinc. The b-chain is extended, helical extended. But in the other one the b-chain helix is carried further, the b-5 histidine has been carried into quite a different place. It connects with the zinc and the b-10 histidine losing the zinc at the centre just turns around and makes contact with it. So that there are now four groups, two histidines and two water molecules round this zinc atom and four zinc atoms in the crystal to six insulin molecules. Now, some confirmation for our idea that it’s this trouble with the histidine packing that produces the change in position of the a-chain. You can see this is the position in two zinc insulin with the two b-5 histidines having different relative positions but being in fact in contact with one another. And over here there’s no b-5 histidine interfering with the position of the second one. So in the next two slides, when you look at the whole molecule up here are these two different positions of the beginning of the a-chain in two zinc insulin, but in the four zinc insulin this doesn’t have to happen. So the a-chain helix has maintained the same relative position in relation to the ring next door. The isoleucine has the same situation in space, instead of a quite different one as here. Other things have happened of course, owing to the b-chain movement which alters the positions down here. And over here is a rather complicated map taken from Cyrus Chothia’s calculations of how all the movements happen all the way through the molecule, which requires, because at one end there’s a histidine b-5 interfering and having to move. Right at the other end of the molecule a phenyl group has swung around into a different position. Now, very quickly I want to go over to one or two points about the biological activity of insulin. On the next slides this is still one more crystal, a cubic form of pig insulin, which was found first of all in 1926 by Abel when first he crystallised it, and has quite a different arrangement of the molecules in the insulin zinc-free pig insulin two identical molecules, another symmetrical dimer. That will come into the story a shade later. But on the next two slides we go back to the actual sequences of these insulins and the positions of the invariant residues within the molecule which suggested certain ideas about the biological activity to us. That this end of the chain didn’t matter. That the aromatic residues B-24 mattered. This was shown by the Chinese particularly taking off the whole of this chain enzymatically, and then building back down here, if you remove everything almost inactive. When you move back to B-24 activity returns. One of the last crystal structures I want to show a little off is a very interesting molecule in which the whole of this chain, des-pentapeptide, the first groups have been removed which is still biologically active. The other part that seems to be concerned in the activity is this front A-chain region here. The next two slides just illustrate this actual, there’s the A-chain face over here with the invariant residues in it, which stays the same even through these transformations. And over here the part of the chain that can be removed and played with and at the top here just the actual change that occurs in human insulin if you want to transform pig to human insulin, you only have to change the end residue. Now, I would like to show, just before I give the very last few slides, two or three interesting points. If I may, perhaps I should tell this story first, this is for Professor Gilbert,of course. It is possible to take the end of the b-chain off of pig insulin and replace it by threonine, alanine to threonine, and then you have human insulin. But you can also carry out the synthesis through bacterial engineering as was first done I think in Prof. Gilbert’s laboratory, but now can be done and has been done in various different places with various different strategies. This is the human Eli Lilly insulin made by making the two chains separately and then joining them together. So very beautiful crystals, not absolutely the same to our eye, which is an interesting crystallographic phenomenon. The actual habit over of the Eli Lilly insulin is not one I’ve seen naturally though it’s one that is recognisably that of a rhombohedralpolar crystal. And probably implies slightly different impurities in the two preparations which may account for some of the small troubles in comparing them. But essentially they are both human insulin and the last two slides just illustrate this crystal graphically. Two identical x-ray photographs and over there a different map over the two different ends of the b-chains, because of this complication I’ve been talking about, which show that when you leave out the end of the B-chain from the calculation in which you’ve inserted all the other atoms, you see evidence that there is three in the crystal and not pig insulin the coordinates of which were used to obtain the primary solution for the crystal structure. Now, the interesting thing that we have come across, of course, is the way the insulin molecule varies or doesn’t vary, as the case may be the parts that don’t vary, as you change its surroundings, and this matters in relation to the actual sequence of reactions of the activity of insulin. Because the insulin receptor which many groups are working on, the isolation, is now known to be a large molecule, something like the immunoglobulines. Of a molecular weight about 350,000, two different sized subunits, 90,000 and 130,000 and a little object of 6,000, you can see, must occupy a small region in the folds of this sort of molecule. So you might expect that different residues in different parts of the molecule may affect the activity. Now, we have here just got comparisons between how much insulin changes in different conditions. This is the two pig insulins seen one in two zinc insulin and the other in the cubic insulin. This you might see, most of the molecule stays sensibly the same and the only thing that markedly changes its position is the beginning of the b-chain which hangs out from the body of the molecule in the two-zinc insulin molecule. It’s clearly free to pack, it isn’t involved in the activity in any serious way. Now, this one is the hagfish insulin, a- and b-chains. And, as you can see, in spite of very considerable residue variation over a long evolutionary time, the insulin main confirmation is maintained over most of the b-chain and over the a-chain. The last one, I get all these beautiful things from York, where Guy and Eleanor Dodson are now working. This is a very interesting little, des-pentapeptide insulin. And two different crystal structures of this have been solved. One in China with the assistance of David Stewart from our country, one in York with the assistance of Bi from China, two different crystals and you get essentially the same answer again. Part of the insulin structure is wholly conserved although this doesn’t form zinc complexes or anything like that anymore and the whole end of the b-chain is taken off it. It’s still biologically active as a monomer which corresponds to the general view that it is the monomer that is active insulin. I should stop there and thank you very much, I'm sorry if I go on too long. The trouble is this story grows in the telling. I have to make one interesting point in relation to the next lecture, having heard a word. Insulin reacts first with the receptor, and then it seems that they both pass through into the cell and are concerned with phosphorylation and with the sequence of phosphorylation reactions. End of that story, thank you.

Herr Vorsitzender, sehr geehrte Damen und Herren! Es ist mir erneut eine große Freude hier in Lindau sein zu können. Ich freue mich außerdem, über mein gegenwärtiges Thema zu einer Zuhörerschaft wie dieser sprechen zu können. Vor knapp einem Jahr wurde von Michael Bliss ein Buch mit dem Titel Die Entdeckung des Insulins veröffentlicht. Es beschreibt anhand der Laborprotokolle derjenigen, die an der ursprünglichen Entdeckung beteiligt waren, was tatsächlich geschah. Könnte ich bitte das erste Dia haben? Die beiden Jahre 1921 und 1922 waren zwei fantastische Jahre, in denen es möglich war, diesen außerordentlichen Wandel herbeizuführen. Ich denke, man sieht heute so gut wie nie – gewiss nicht in der zivilisierten Welt – ein Kind mit diesem Befund, d. h. mit akuter Diabetes im Jugendalter. Dieser Befund wurde schon im Altertum beobachtet und als eine Zustand beschrieben, bei dem „das Fleisch über die Knochen fließt“, wie Sie hier sehen können. Dennoch wurde die Gesundheit dieses Mädchens durch eine Insulinspritze wenig später wiederhergestellt. Das Fleisch wuchs wieder. Insulin ist ein hochwirksames Wachstumshormon. Dies wurde durch die Arbeiten dieser beiden jungen Männer hier möglich. Der eine war ein junger Arzt von etwa dreißig Jahren und der andere war Charlie Best, der im Alter von 22 Jahren die Hälfte seines Medizinstudiums absolviert hatte. Banting hatte eine Vorstellung darüber (die sich als falsch erwies), wie es möglich sei, das Diabeteshormon aus der Bauchspeicheldrüse zu isolieren. Sie brachte ihn nach Toronto, wo es ihm gelang, Macleod – den dortigen Professor für Physiologie – dazu zu überreden, ihn die Sache ausprobieren zu lassen. Und Macleod stellte ihm zur Unterstützung diesen sehr intelligenten Studenten an die Seite, der ihm bei seinen Arbeiten helfen sollte, und außerdem auch sehr gute Ratschläge darüber, wie es ihm gelingen könnte das Hormon zu extrahieren. Es ist klar, dass Banting und Best, obwohl sie die beiden eigentlichen Arbeiter waren, ohne die Leitung und Hilfe von Macleod erfolglos geblieben wären. Liest man ihre Aufzeichnungen, spürt man, dass sie furchtbar unwissend waren. Sie hatten die Literatur nicht gelesen. Sie machten alle möglichen Fehler. Sie verschleierten ihre Fehler, um klar zu machen, dass sie tatsächliche Erfolge hatten. Im Wesentlichen kamen Macleod und Colipp ihnen zur Hilfe. Sie machten das Insulin letztlich rein genug, um es zur Behandlung von Diabetes verwendbar zu machen. Und dennoch ist klar, dass der Mythos, dass es die beiden waren, die für die Isolierung von Insulin verantwortlich waren, zutrifft: Ohne ihre Intervention hätte sie nicht geschehen können. Diese Darstellung wird jeder, der über Diabetes arbeitet, mit großer Faszination und Begeisterung lesen, zumal heute, da mittlerweile jeder, der an dem ursprünglichen Ringen um die Wahrheit in dieser Sache beteiligt war, gestorben ist. Wie kam es also zu diesem außerordentlichen Wandel, der bis heute nicht wirklich verstanden ist. Wie wirkt Insulin auf den Zuckerstoffwechsel ein, um diese Heilung zu ermöglichen, wenn die Bauchspeicheldrüse zu wenig Insulin liefert? Ich meine, dass J. D. Bernal und ich etwa ähnlich alt waren, er etwas älter, beide von uns etwas älter, Auf dem nächsten Dia zeige ich Ihnen, nur um der Wissenschaftsgeschichte willen, wunderschöne Pepsinkristalle, die aus Uppsala zu uns kamen. Auf der rechten Seite sehen Sie eine Röntgenaufnahme nicht von Pepsin – der ersten, die Bernal in Cambridge aufnahm –, sondern ein sehr, sehr viel spätere aufgenommenes Bild von einem Insulinkristall. Die 10 Milligramm von mikrokristallinem Insulin erhielt ich von Robert Robinson, dessen Bild Sie gestern gesehen haben. Er hatte sie von Boots in England bekommen, als Dank für einen Rat, den er ihnen erteilte. Und er musste nicht, was er damit machen sollte. Daher gab er die 10 Milligramm mit den folgenden Worten an mich weiter: Könnten Sie nicht versuchen, einige Röntgenaufnahmen von Insulin zu machen?“ Also versuchte ich es. Ich musste dazu die Kristalle wachsen lassen und auf dem nächsten Foto sieht man, dass auch ich zahlreiche Fehler machte. Ich ließ die Kristalle trocknen, da sie in meinen Augen ziemlich doppelbrechend aussahen. Bernal hatte jedoch vorher schon gezeigt, dass es besser sei, sie nass aufzunehmen. Dennoch gelang mir die Aufnahme des ersten Röntgenmusters, das sich bestens in Beziehung zur Größe der Einheitszelle deuten ließ. Und in dieser Einheitszelle konnte man – wenn man die Dichte maß – eine Masse von etwa 36.000 Proteineinheiten unterbringen. Ich sollte eigentlich ein Foto von Bernal haben, doch das einzige, das ich stets zeigte, ging vor einem Jahr bei einem Treffen in Kanada verloren. Daher sehen Sie hier auf der rechten Seite den Brief, den Bernals mir aus Cambridge schrieb, nachdem ich ihm die Neuigkeit mitgeteilt hatte, dass mir die Aufnahmen von Insulin gelungen waren und wie groß die Einheitszellen des Rests des Moleküls waren. Jeder denkt, dies sei ein witziger Brief, doch ist erst für jeden Röntgenkristallographen unmittelbar verständlich. Er konsultierte den von mir verwendeten Aufsatz, den D. A. Scott 1934, im Jahr davor, über die Kristallisierung von Insulin geschrieben hatte, der sagte, dass es erforderlich sei, Zink hinzuzufügen. Und er sagte, dass Scott auch ein Kadmium- und ein Kobalt-Insulin hergestellt hatte. Er hatte Scotts Zahlen genommen und ausgerechnet, was dies bedeutete, Zink pro Protein in der Einheitszelle. Und die Implikation war: Versuche Aufnahmen von Kadmium-Insulin zu bekommen und untersuche, ob sich nicht Änderungen in der Intensität feststellen lassen, die der Ermittlung der Gesamtstruktur von Insulin die Richtung weisen würden. Nun ja, ich war damals, wie ich Ihnen bereits sagte, 24 Jahre alt. Ich hatte noch überhaupt keine Vorstellung von der Kristallstruktur. Es zeigte sich, dass die Kadmiumaufbereitung ziemlich unrein war, und es gelang mir ganz und gar nicht, größere Kristalle davon wachsen zu lassen. Das Einzige, was mir gelang, war die Gewinnung eines Pulvermusters, das dem Muster des Zinkkristallpulvers allzu ähnlich sah. Ich hatte große Zweifel daran, ob das Kadmium schwer genug sein würde, um die Änderungen zu bewirken, und ich dachte, dass ich zunächst mit etwas Einfacherem beginnen sollte, bevor ich versuchte, die Kristallstruktur von Insulin zu ermitteln. Um die gleiche Zeit, zu der dies geschah, als ich meine Arbeit zur Masse des Proteins in der Einheitszelle, 36.000, veröffentlichte, erhielt ich einen Brief von Freudenberg, der sehr wertvoll für mich ist, in dem es heißt: Insulin muss wesentlich kleiner sein, vielleicht 11.000 oder sogar noch weniger.“ Und das Kristall hat natürlich eine dreifache Symmetrie, sodass die Implikation ist, dass das molekulare Gewicht wahrscheinlich 12.000 ist. Wie jeder weiß, wurde die chemische Struktur des Insulins von Fred Sanger und seinen Mitarbeitern ermittelt, und man stellte fest, dass es sogar noch kleiner war, nicht mehr als 6.000. Die Struktur aus zwei Ketten ist hier dargestellt. Sie werden von Disulphatbindungen zusammengehalten. Darunter sehen Sie ein Schema für die Synthese von Insulin. Diesem allgemeinen Schema folgte man an drei verschiedenen Orten. Das erste künstliche Insulin wurde um 1965 in Pittsburgh, Aachen sowie in Shanghai und Peking synthetisiert. Es war eine gemeinsame Anstrengung. Später fand man heraus, dass Insulin, die zwei Ketten, je nach dem Organismus, der es produziert, variiert. Und auf der anderen Seite sehen Sie die Insulinsequenz, gruppiert nach Arten von Organismen mit den Variationen, die in den Aminosäuren in den langen Ketten auftreten. Sie können erkennen, dass einige Bereiche, der Anfang und das Ende der B-Kette, sehr stark variieren. Es scheint fast unerheblich, was sich dort befindet, während sich in den anderen Bereichen von den ältesten bis zu den jüngsten Organismen keine Änderung ergeben hat. Ich glaube, der Mensch steht in diesen Übersichten ganz oben. Die Rundmäuler (Cyclostomata) befinden sich hier unten. Zu diesen invarianten Resten gehören die Cystinreste, wie man erwarten würde, zahlreiche Leucine, etwa sechs Leucine, und Phenylalanine. Der aromatische Rest ist höchst konservativ. Wenn sich die Reste ändern, ändern sie sich normalerweise zwischen Tyrosin und Phenylalanine. Könnte ich bitte das nächste Dia haben? Als Nächstes versuchten wir nun die Karte der Elektronendichte von Insulin zu berechnen. Bevor es dazu kam, stellte ich das Experiment mit Penizillin an. Ich habe die Penizillinkarte hier oben dargestellt: für diejenigen, die mit der Sache nicht vertraut sind, da man sehen kann, worum es geht. Wir berechneten die Elektronendichte mit Hilfe der von Bernal vorgeschlagenen isomorphen Substitutionsmethode. Sie ist im Falle von Proteinen wesentlich komplizierter und wurde erstmals von Max Perutz und John Kendrew durchgeführt. Wir führten die Berechnung für den gesamten Körper der Einheitszelle durch und stellten sie auf Einzelblättern dar, die wir übereinanderstapelten, wodurch man diese dreidimensionale Passung erhält. Dies sind die Atome, die man in jedem Fall in Proteinen findet: Sauerstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel oder Kalium. Die 2-Zink-Insulinstruktur, wie wir sie nennen, wurde zweimal entschlüsselt: einmal von meiner Arbeitsgruppe in Oxford und einmal in Peking von Liang Dong-Cai und seiner Gruppe. Sie wurde dreimal verbessert: einmal von uns in Oxford (wir hörten bei einer Auflösung von 1,5 Angström auf) und einmal von Nori und Kiwako aus Japan, die mit uns zusammenarbeiteten und die die Auflösung bis 1,1 Angström vorantrieben. Ich glaube Dong-Cais Messungen endeten bei etwa 1,2 Angström, und beide ihrer Messungen wurden bei geringen Temperaturen durchgeführt. Dieses Foto wurde vor zwei Jahren bei einem Treffen der Vertreter der drei Arbeitsgruppen in Peking aufgenommen. Wie Sie sehen, vergleichen sie ihre Karten. Sie legen Sie bei einem Maßstab von 1 cm = 1 A übereinander. Und Sie sehen ebenfalls, dass wir alle mit unseren Beobachtungen sehr zufrieden waren. Nori befindet sich in der Mitte, Tom Blundell hier hinter mir. Ich hatte sehr, sehr viele andere gute Mitarbeiter, deren wichtigste – historisch gesehen - Guy Dodson, Eleanor Dodson und Vijayan aus Indien waren. Ich werde Ihnen nun im Schnelldurchgang die Kristallstruktur von Insulin vorstellen, um Ihnen zu zeigen, welche Art von Molekül in diesen Kristallen schließlich zum Vorschein kam. Im nächsten Dia sehen Sie zwei Teile der Elektronendichtekarte: die erste Karte aus China mit dem Zinkatom in der Mitte, und dies ist eine kleine überlappende Serie von Abschnitten, in denen Sie das Zink und eine darauf zugehende Gruppe sehen, die nicht aufgelöst ist. Die Auflösung beträgt 2,5 Angström, und wenn Sie Chinesisch lesen könnten, würden Sie sehen, dass dies Histidin ist. Und hier drüben sehen Sie unsere neueste Karte mit einer Auflösung von 1,5 Angstrom. Alle Atome beginnen nun als einzelne Einheiten klar hervorzutreten. Das Histidin ist nun in die fünf Spitzen unterteilt, die seiner Position entsprechen. In beiden Fällen schauen wir die dreiteilige Achse hinunter. Es ist so, dass eine Karte im Vergleich mit der anderen lediglich umgedreht wurde. Dies ist im Wesentlichen der Bereich hier, wo sich der Leucinrest in dieser Position befindet. Auf den nächsten beiden Dias sehen Sie die Karte des Histidins, wie sie sich in Noris‘ und Kiwakos neuester Karte darstellt. In diesem Fall haben sie die Elektronendichtescheibe durch den Histidinring geschnitten und die Konturen gezogen. Ich muss sagen: der Schönheit halber sehr genau bei einem Maßstab von 0,1 eines Elektrons pro Kubik-Angström. Sie sehen hier also die separaten Atome in wunderschöner Auflösung, verbunden mit dem Zink, und das Zink ist außerdem mit Wasser verbunden. Um die dreiteilige Achse befinden sich jeweils drei. Dadurch wird das Zink oktagonal. Hier drüben sehen Sie eine andere Karte. Bei ihrer Berechnung wurden sämtliche schweren Atome mit ihren Beiträgen aus den Ausdrücken genommen, sodass Sie die Spitzen allein den Wasserstoffatomen entsprechen. Wie Sie sehen, ist der Wasserstoff hier proteiniert. Dies ist an dem mit dem Zink verbundenen Histamin der Fall. Andere geringe Abweichungen sind die notwendigen kleinen experimentellen Fehler, die noch immer in der Berechnung vorkommen. Ich muss gestehen, dass nicht jeder Teil der Karte von Nori und Kiwako ebenso gut ist. Die Atome sind in der Nähe der Zinkpositionen in den Kristallen wesentlich besser definiert als an den Rändern des Moleküls, wo es beträchtliche Bewegung gibt, sicherlich der Atome innerhalb des Kristalls. Und dies verschmiert und verringert die Elektronendichte im Kristall. Wenn Sie nun diesen Karten alle Atompositionen in dem Protein entnehmen und sie auf diese dreiteilige Achse projizieren, erhalten Sie folgendes Bild. Es ist zwar ein altes Bild – die Positionen wurden mittlerweile präzisiert –, aber es dient dazu zu zeigen, dass das Objekt in der Einheitszelle dieses Objekt ist, bei dem es sich um die Projektion der Positionen von sechs Insulinmolekülen um die dreiteilige Achse handelt. Das Zink in der Mitte stellt zwei Zinkatome dar: eines über dem anderen, und jedes ist mit drei Histidinen aus den oberen und unteren Molekülen verbunden. Wie Sie sehen, befinden sich die Moleküle entlang dieser Linie in ziemlich nahem Kontakt. Hier ist ein aromatischer Ring eines Moleküls. Und hier ist ein weiterer von dem anderen Molekül, in etwa hier: b-Phenylalanin. Sie berühren sich über diesen Spalt hinweg. Und in dieser Position sehen Sie einen leeren Bereich. Hier fließt Wasser von einer Seite des Moleküls auf die andere. An der Oberseite des Moleküls befinden sich alle möglichen Rinnen, durch die Wasser in den Bereich um die dreiteilige Achse fließt. Dieses Wasser setzt sich daher kontinuierlich durch den gesamten Kristallkörper fort. Das Dia hier drüben zeigt in etwa die Geometrie des Hexamers. Wie Sie sehen, gibt es entlang dieser Bereiche eine etwa zweiteilige Achse. Wenn man die Moleküle entlang jener Achsen auseinanderbricht, erhält man ein recht kompaktes Objekt, das einem Dimer von Insulin entspricht, und wenn man diese entlang dieser Linie zerlegt, erhält man zwei separate Moleküle. Und in einer normalen Lösung – in Gegenwart von Zink – wurde als Molekulargewicht von Insulin anhand der Messung osmotischen Drucks erstmals ein Wert von 12.000 ermittelt. Die nächsten beiden Dias zeigen nun die Dimer in einem rechten Winkel zur dreiteiligen Achse, und hier habe ich drei von ihnen dargestellt. Und dieses in der Mitte ist dasjenige, das wir im 2-Zink-Insulin finden. Was hieran auffällt, ist, dass die beiden Insulinmoleküle sich zwar sehr ähnlich sehen, aber dennoch etwas verschieden voneinander. Wir bemerken es zunächst an dieser Stelle, wo ein Phenylalanin die Position einnimmt, in der sich eine zweiteilige Achse zwischen ihnen befinden sollte. Die beiden Moleküle liegen dicht beieinander. Zwischen den langen Ketten befinden sich Wasserstoffbindungen. Hier sehen Sie, wie die lange b-Kette in eine Alpha-Helix eintaucht und hier wieder herauskommt, und die a-Kette sitzt darüber. Die anderen beiden sind die Dimer, die man im ältesten der bisher untersuchten Insuline gefunden hat, dem Insulin des Schleimaals, der zu den Cyclostomen gehört. Und dort können Sie erkennen, dass die beiden Moleküle identisch sind. Sie sind durch eine kristallgraphisch zweiteilige Achse verbunden, wobei beide Phenylalaninringe in diese Richtung gedreht sind. Und das wesentliche Muster ist dasselbe wie bei einem der beiden Moleküle hier. Wir nennen es jetzt Molekül 1. Ursprünglich nannten wir es – aus rein zufälligen experimentellen Gründen – Molekül 2. Es scheint allerdings dasjenige Molekül zu sein, das in allen Kristallstrukturen, die wir untersucht haben, bewahrt bleibt. Der dritte Dimer entsteht, wenn sich in der kristallisierenden Lösung mehr Zink als Natriumchlorid befindet. Und dann verändert sich eines der Moleküle noch mehr unter dem Druck dieser Bedingungen, doch das andere bleibt weiterhin dasselbe wie Molekül 1 in diesem Kristall. Das Dia hier drüben zeigt die beiden separaten Moleküle, und man sieht, dass sie bis auf diese kleinen Unterschiede identisch sind. Das andere Merkmal, an dem wir stets den Unterschied bemerkten, ist diese Stelle hier, an der das Lysin am Ende der b-Kette hier direkt nach oben geht und sich im Lösungsmittel dieses besonderen Moleküls verliert. Die nächsten beiden Dias sollten einfach eine idealisierte Darstellung der Falte im 2-Zink-Insulin zeigen, in allen diesen Insulinmolekülen: mit einer gerade beginnenden b-Kette, die in eine wohldefinierte lange Helix weiterläuft und hier wieder herauskommt. Eine a-Kette, zwei Helices, nicht so deutlich ausgeprägt, gerade und zweitens eine Disulphidbindung zwischen den Ketten an den Enden der Helices, jeweils hier unten. Und dann diese kleine Schleife in der a-Kette mit der anderen internen Disulphidbindung hier. Hier drüben ist eine der b-Ketten, die die allgemeine Form der b-Kette zeigt, wie man sie in diesem Kristall findet, wobei das Lysin sich hier oben befindet und das b5-Histidin am Ende hochsteht, am Anfang der b-Kette. Was geschieht mit der a-Kette auf dem nächsten Dia? Nun, die a-Kette in ihrer allgemeinen Form ist auf dieser Seite dargestellt: eines der beiden Moleküle mit einem geraden Beginn der Helix, die zweite Helix, A19 überbrückt die Lücke zwischen den oberen und unteren Hälften. Sie ruht auf den Falten der b-Kette. Hier drüben habe ich eine andere Ansicht der a-Kette, in einer Sicht von oben auf den Ring, der das Disulphid enthält. Sie können sehen, dass sich die Projektion des Anfangs der Helix in beiden Beispielen deutlich voneinander unterscheidet. Tatsächlich sind in beiden Fällen die Seitenketten und alles auf gleiche Weise angeordnet. Der Unterschied besteht allein in einer Drehung um 30° zu Beginn der a-Ketten-Helix von einer Position zur anderen. Und dies führt zu einem Unterschied im Muster der Wasserstoffbindungen quer über den 6/11-Disulphidring. Sie können die verschiedenen Projektionen hier und hier sehen. Wir sehen, dass dasjenige, was zu der allgemeinen Falte im Insulin führt, das Muster der Reste entlang der Ketten ist, von denen einige die Bildung von Helices begünstigen und die anderen eher die längere Kettenform. Wie sie zusammenkommen, ist auf den nächsten beiden Dias veranschaulicht. Sie zeigen die Zentren der Moleküle, wie sie auf unseren neuesten Karten mit denjenigen Elektronendichtekonturen zu erkennen sind, die die verschiedenen Gruppen darstellen, welche innerhalb eines Radius von 6 Angstrom um das Zentrum des Moleküls liegen. Die Molekülzentren hier und dort sind leer. Sie sind jedoch von all den invarianten Leucinen des Moleküls dicht umgeben. Die invariante 6/11-Disulphid-Bindung, invariantes A19-Tyrosin. Invariantes A2-Isoleucin. Sie können jedoch auch erkennen, dass die relative Position dieser umgebenden Gruppen variiert. Dies wird durch diesen Unterschied in den A-Ketten-Konfirmationen verursacht, und die Tatsache, dass dieses Leucine eher schwach definiert ist, legt die Vermutung nahe, dass es in eine weniger günstige Position als die ursprüngliche verschoben wird. Dies ist die Molekül-1-Konfirmation. Die nächsten beiden Dias zeigen die Verdichtung im Zentrum des Moleküls in einer anderen, modernen Sichtweise, die sämtliche modernen Techniken der farbigen und graphischen Darstellung einsetzt. Sie sehen hier eine Ansicht, eine eher merkwürdige Ansicht in Richtung der b-Ketten-Helices des Insulinmoleküls. Die Arme der Helix ragen hier hervor. Die a-Kette sitzt als kleines, kompaktes Objekt in den Armen der Helix und all dieser Leucine, dieser nichtpolaren Reste, die im Zentrum der beiden Ketten verdichtet sind. Diese Ketten werden also, wie man sich denken kann, durch die Tendenz, dass Gleiches sich mit Gleichem zusammenschließt, zusammengebracht, dieser nichtpolare Bereich. Dann werden sie durch die Disulphidformation, durch die Disulphidbindungen in der von Chemikern praktizierten Synthese ihrer Position befestigt. Zweifellos geht es bei der natürlichen Synthese, die über einen einzigen langen Kettenvorläufer erfolgt, etwas anders zu. Und hier drüben haben Sie eine Verdichtungsansicht, die den Eindruck erweckt, dass dieses Zentrum des Moleküls wirklich ein sehr dicht gepacktes Objekt ist, trotz seiner scheinbaren Leere hier drüben. Schauen wir uns also das Insulinmolekül für sich an, so wird klar, dass eine seiner Seiten sehr flach ist. Auch sie wird im Wesentlichen wieder anhand von nichtpolaren und aromatischen Resten untersucht. Und diese beiden Seiten von zwei zusammengebrachten Molekülen ergeben den Dimer. In den nächsten beiden Dias zeige ich daher die Gruppen, die den Dimer ergeben. Aromatische Reste überbrücken den Spalt zwischen den beiden Molekülen, und wieder sind diese alle vier aromatischen Gruppen und diese beiden in Kontakt miteinander: überkreuzt als ob sie ein kleines Kristall bildeten. Diese anderen hängen am Rand des Moleküls heraus. Und hier drüben zeigen die dicht gepackten Ansichten des Dimers die hier an der Außenseite heraushängen, einzeichnet – der Außenwelt zwei verschiedene Ansichten des Dimers. Da wir den Dimer erhalten haben, müssen wir ihn natürlich in den Hexamer einfügen, und auf dem nächstem Diapaar sollte ich Ihnen den Hexamer zeigen. Und auch hier sehen Sie wieder Zink in der Mitte, die Umrisskette in Rot. Die den Dimer bildenden Reste sind jetzt hier in Blau, und alle gelben sind die Hexamere bildenden Reste. Die Histidine kommen in das Zink und die aromatischen Reste verdichten sich auf der Außenseite, vier von ihnen hier, andere nichtpolare Reste. Und auf der rechten Seite sehen Sie ein wunderschönes Dia, das ich erst seit drei Tagen besitze, das ich erst am Morgen erhielt, an dem ich England verließ. Es ist ein Geschenk von Andrew Moorephew, der es aufgenommen hat. Dies zeigt Ihnen die Oberseite es Hexamers, der sehr stark verdichtete aussieht, an dessen Oberseite jedoch drei Disulphidbindungen herausragen. Und entlang dieser Linien befindet sich eine Art von Rinne, durch die Wasser fließt. Wir haben also das Stadium des Hexamers erreicht. Auf den nächsten beiden Dias ist das Prinzip des Hexamers erläutert, und wie er sich im Kristall zusammenfügt. Und dies ist der Hexamer, wie wir ihn bei einer geringen Auflösung von 6 Angström sozusagen zum ersten Mal zu Gesicht bekamen. Dies ist leider ein sehr altes Dia. Wir schauen hier auf das Zink herab, und Sie sehen drei Arten von Vorwölbungen am oberen Rand, wobei es sich tatsächlich um das obere Ende der a-Kette handelt, und Sie sehen drei Vertiefungen, diese Rinne, von der ich sprach, hier und hier. Und wenn man sich vorzustellen versucht, wie die Hexamere zu Kristallen zusammengepackt werden können, so stellt es sich als einfach heraus: Man stapelt sie einfach übereinander, und die Vorwölbung, zu der es an dieser Stelle kommt, passt in die Rinne darüber und alles sieht unproblematisch aus. Erst bei einer sehr hohen Auflösung erkennt man, dass diese dichte Komprimierung ein Problem aufwirft. Diese Komprimierung, bzw. ihre Konsequenzen, sind hier drüben dargestellt. Dies ist eine Seitenansicht von drei Molekülen, und man sieht das b-8-Histidin und das b-5-Histidin vom Molekül darüber hier nach oben ragen. Tatsächlich nimmt es genau denselben Platz ein, den das b-5-Histidin des Moleküls darüber einnehmen würde, wenn nichts geschähe, um es dem Rest des Moleküls zu erlauben, problemlos in diese Rinne zu passen. Was passiert ist Folgendes: Das Histidin bewegt sich zur Seite. Das Histidin hier oben befindet sich in einer relativ verschiedenen Position von diesem hier. Hier ist es. Es passt sehr gut. Es passt sehr gut, im Vergleich zu anderen Histidinen, da man beobachtet hat, dass die Ringe sich in Kristallen von Histidinpeptiden verdichten. Doch hierdurch verändert sich das Muster der Wasserstoffbindungen. Die a-Kette dreht sich um diese Bindung. Sie nimmt im Kristall eine etwas andere Position ein. Alles beruhigt sich schließlich wieder, doch die Moleküle unterscheiden sich voneinander, wie wir die ganze Zeit gesehen haben. Und auf der anderen Seite – sei es eine Folge der Bewegung der a-Kette durch die Kristalle oder eine separate, unabhängige Tatsache – steht das Lysin b-29 nach oben und berührt die b-30-Carboxylgruppe des Moleküls, das oben auf dem Kristall aufliegt. Damit kommen wir nunmehr zum letzten Stadium. Wir haben hier diese Säulen von Insulinmolekülen. Wir können sie wie Bleistifte in einem Kristall verdichten. Wir haben für ihre Anordnung lediglich die Möglichkeit, sie um diesen Bleistift zu drehen. Und dies geschieht wiederum, um zwischen den Molekülen des Kristalls Gleiches mit Gleichem zusammenzubringen. Wie ich bereits früher gezeigt habe, berühren sich die äußeren aromatischen Gruppen, doch dasselbe gilt für eine sehr große Anzahl anderer ionischer Reste. Auf den nächsten Dias zeige ich diese Ionenschicht mit der b-30-Carboxyl-Gruppe in Kontakt mit ihrem eigenen a-1-Glycin LH3+, doch ebenso mit diesem b-29-Lycin des Moleküls, das im Kristall darüber angeordnet ist. Und gleichzeitig gelang es dem Arginin eines anderen Hexamers hier drüben in diesen ionischen Bereich zu gelangen. Die leichte Komplikation dieses Dias besteht darin, dass das Arginin „unentschieden“ ist: Darüber, ob es einen Kontakt hier drüben mit der a-21-Karboxylsäure eingehen soll, oder hier drüben mit der a-17-Karboxylsäure. Und außerdem besteht hier ein bestimmter Grad an Unordnung, dieser andere Lycinrest. Wie Sie jedoch erkennen können, kam eine ungeheuer große Anzahl verschiedener ionischer Gruppen in der Schicht zwischen den Hexameren im Kristall zusammen. Hier sehen Sie ein recht schönes Bild, das das Wasser auf der Oberfläche des Hexamers veranschaulicht. Es ist eine etwas irreführende Zeichnung, da ein Atom in der Zeichnung umso größer erscheint, je diffuser es ist, was eine Ungewissheit bezüglich seiner Position bedeutet. Die Position der dicht gepackten Proteinatome in rot ist also wohl definiert, die Atome auf der Außenseite des Moleküls sind die losen Ketten auf der Oberfläche. Die nächsten beiden Dias bringen mich nun zu einem der Kristalle, die ich früher erwähnte. Und dies ist das 4-Zink-Insulin, das genau dann aufritt, wenn sich 6 % Natriumchlorid in der kristallisierenden Lösung befinden. Es wurde von Schlichtkrull in Kopenhagen hergestellt, um über sehr regelmäßige Kristalle zu bekommen, die man Patienten verabreichen konnte, die ein langsam absorbiertes Insulin benötigten. Und zu unserer Überraschung zeigte sich, dass die Kristalle, obwohl sie genauso aussehen und eine sehr ähnliche Gitterkonstante haben, in ihrem Inneren sehr verschieden aussehen. Und dieser hier ist ein Hexamer, bei dem man bei sechs Insulinmolekülen je vier Zinkatome findet. Auf dem nächsten Dia kann man, glaube ich, den Unterschied noch deutlicher sehen. Auch hier bleibt ein Molekül, Molekül 1, konstant, drei Histidine kommen in das Zink. Die b-Kette ist verlängert, spiralförmig verlängert. In dem anderen wird die b-Ketten-Helix weitergetragen, das b-5-Histidin wurde an eine völlig andere Stelle gebracht. Es verbindet sich mit dem Zink, und das b-10-Histidin, das im Zentrum sein Zink verliert, dreht sich einfach herum, und tritt damit in Kontakt, sodass sich um dieses Zinkatom jetzt vier Gruppen, zwei Histidine und zwei Wassermoleküle befinden, und auf vier Zinkatome kommen im Kristall sechs Insulinmoleküle. Nun komme ich zu einer Bestätigung meiner Annahme, dass es diese Schwierigkeit mit der Verdichtung des Histidins ist, was zur Änderung in der Position der a-Kette führt. Sie können erkennen, dass dies die Position im 2-Zink-Insulin ist, wobei die beiden b-5-Histidine unterschiedliche relative Positionen haben, sich jedoch berühren. Hier drüben gibt es kein b-5-Histidine, das die Position des zweiten behindert. Auf den nächsten beiden Dias sehen Sie, wenn Sie sich das ganze Molekül ansehen, dass es hier oben diese beiden verschiedenen Positionen des Anfangs der a-Kette im 2-Zink-Insulin gibt, doch im 4-Zink-Insulin muss dies nicht der Fall sein. Die a-Ketten-Helix hat demnach dieselbe relative Position zum Ring nebenan bewahrt. Das Isoleucin hat dieselbe räumliche Lage, statt einer ziemlich anderen, wie es hier der Fall ist. Natürlich haben sich auch andere Dinge ereignet, aufgrund der Bewegung der b-Kette, die die Positionen hier unten ändert. Und hier drüben sehen Sie eine eher komplizierte Karte, die auf den Berechnungen von Cyrus Chothia beruht, die ergeben, wie alle diese Bewegungen sich durch das ganze Molekül fortpflanzen, was – weil sich an einem Ende ein Histidin B-5 befindet – zu einer Behinderung und der Notwendigkeit führt, die Position zu ändern. Am anderen Ende des Moleküls hat sich eine Phenylgruppe in eine andere Position gedreht. Nun möchte ich noch kurz auf ein oder zwei Aspekte der biologischen Aktivität von Insulin eingehen. Auf den anderen Dias sehen Sie hier noch ein weiteres Kristall, die Würfelform von Schweine-Insulin, die 1926 erstmals von Abel gefunden wurde, als er es zum ersten Mal kristallisierte. In diesem Würfel sind die Moleküle in dem zinkfreien Schweine-Insulin deutlich anders angeordnet: zwei identische Moleküle, ein anderer symmetrischer Dimer. Wir werden wenig später noch darauf zurückkommen. Auf den nächsten beiden Dias gehen wir zu der tatsächlichen Sequenz dieser Insuline zurück sowie zu den Positionen der invarianten Reste innerhalb des Moleküls, die uns bestimmte Vorstellungen bezüglich der biologischen Aktivität nahelegten: dass dieses Ende der Kette keine Rolle spielt; dass es auf den aromatischen Rest B-24 ankam. Dies wurde von den Chinesen gezeigt, besonders die enzymatische Entfernung dieser gesamten Kette, und dann ihr Anbau hier unten. Wenn man alles entfernt, fast inaktiv. Wenn Sie die Kette zu B-24 zurückbewegen, kehrt die Aktivität zurück. Eine der letzten Kristallstrukturen, die ich Ihnen vorstellen möchte, ist ein sehr interessantes Molekül, bei dem diese gesamte Kette, Des-Pentapeptide, die ersten Gruppen entfernt wurden, das aber dennoch biologisch aktiv ist. Der andere Teil, der an seiner biologischen Aktivität beteiligt zu sein scheint, ist dieser vordere a-Ketten-Bereich hier. Die nächsten beiden Dias veranschaulichen dies: Es gibt hier die Seite der a-Kette, die die invarianten Reste enthält. Sie bleibt trotz dieser Transformationen identisch. Und hier drüben sehen Sie den Teil der Kette, der entfernt und mit dem experimentiert werden kann, und hier oben die tatsächliche Änderung, die am Insulin des Menschen vorkommt. Wenn Sie Schweine-Insulin in menschliches Insulin umwandeln wollen, müssen Sie lediglich den Endrest ändern. Nun möchte ich noch, bevor ich Ihnen die letzten Dias zeige, zwei oder drei interessante Aspekte vorstellen. Wenn ich darf, sollte ich diese Geschichte zuerst erzählen. Sie ist natürlich für Professor Gilbert. Man kann das Ende der b-Kette von Schweine-Insulin entfernen und es durch Threonin ersetzen, Alanin gegen Threonin austauschen, und dann erhält man das Insulin des Menschen. Man kann diese Synthese jedoch auch von genetisch veränderten Bakterien durchführen lassen, was meines Wissens zuerst im Labor von Prof. Gilbert durchgeführt wurde. Seither wurde es mit verschiedenen Techniken an verschiedenen Orten durchgeführt. Dies ist das menschliche Eli-Lilly-Insulin, das dadurch hergestellt wird, dass man die beiden Ketten separat herstellt und sie dann miteinander verbindet. Solche schönen Kristalle. Für unser Auge sehen sie nicht absolut identisch aus, wobei es sich um ein interessantes kristallographisches Phänomen handelt. Den exakten Kristallhabitus des Eli-Lilly-Insulins habe ich in der Natur zwar noch nicht gesehen, obwohl es sich um einen Habitus handelt, der als ein rhomboedrisches, polares Kristall erkennbar ist. Dies ist wahrscheinlich ein Zeichen für leicht verschiedene Unreinheiten in den beiden Präparationen, die möglicherweise einige der Schwierigkeiten erklären, die sich bei einem Vergleich ergeben. Doch im Wesentlichen handelt es sich in beiden Fällen um menschliches Insulin, und die letzten beiden Dias zeigen eine graphische Darstellung dieses Kristalls. Zwei identische Röntgenbilder und hier drüben eine andere Karte der beiden unterschiedlichen Enden der b-Ketten, aufgrund der Komplikation, über die ich sprach, welche Folgendes zeigen: Wenn man das Ende der b-Kette aus der Berechnung weglässt, in der man alle anderen Atome berücksichtigt, sieht man Hinweise darauf, dass es drei in dem Kristall gibt und nicht Schweine-Insulin, dessen Koordinaten verwendet wurden, um die primäre Lösung für die Kristallstruktur zu erhalten. Nun, die interessanten Entdeckungen, die wir gemacht haben betreffen natürlich die Art und Weise, auf die sich das Insulin-Molekül verändert bzw. gegebenenfalls nicht ändert und die Teile, die sich – wenn man die Umgebung ändert – nicht ändern. Dies wirkt sich auf die Reihenfolge der Reaktionen des aktiven Insulin aus. Denn vom Insulinrezeptor, über den viele Forschungsgruppen vereinzelt arbeiten, weiß man mittlerweile, dass er ein sehr großes Molekül ist, ein Molekül, das den Immunoglobulinen ähnlich ist. Es hat ein Molekulargewicht von etwa 350.000, zwei Untereinheiten verschiedener Größe, 90.000 und 130.000, und ein kleines Objekt von 6000, muss – wie Sie sehen können – einen kleinen Bereich in den Falten dieser Art von Molekül besetzen. Man könnte daher erwarten, dass verschiedene Reste in verschiedenen Teilen des Moleküls seine Aktivität beeinflussen. Nun, wir haben hier einfach Vergleiche der unterschiedlich starken Veränderung von Insulin unter verschiedenen Bedingungen. Dies sind die beiden Insuline des Schweins: eines in der Form von 2-Zink-Insulin und ein anderes in der Würfelform. Wie Sie vielleicht erkennen können, bleibt der größte Teil des Moleküls sichtbar identisch, und das Einzige, was seine Position deutlich ändert, ist der Anfang der B-Kette, der im 2-Zink-Insulin aus dem Molekülkörper heraushängt. Er steht der Verdichtung offensichtlich frei zur Verfügung. Es ist an der Aktivität von Insulin nicht wesentlich beteiligt. Nun, dies hier ist das Insulin des Schleimaals: die a- und b-Ketten. Und wie Sie sehen können, ist trotz einer erheblichen Änderung der Reste die Hauptkonfiguration des Insulins im größten Teil der b-Kette und über die a-Kette im Laufe der Zeit der Evolution erhalten geblieben. Das letzte Bild – ich bekomme alle diese schönen Bilder aus York, wo Guy und Eleanor Dodson heute arbeiten. Dies ist ein sehr interessantes, kleines Des-Pentapeptide-Insulin. Zwei unterschiedliche Kristallstrukturen dieses Moleküls wurden berechnet: eine in China mit Hilfe von David Stewart aus England, und eine in York mit Unterstützung von Bi aus China. Zwei verschiedene Kristalle und man erhält im Wesentlichen wieder dieselbe Antwort: Ein Teil der Insulinstruktur ist vollkommen erhalten, obwohl dieses Insulin keine Zinkkomplexe oder etwas Ähnliches mehr bildet, und das gesamte Ende der b-Kette ist weggenommen. Es ist jedoch als Monomer dennoch biologisch aktiv, was der allgemeinen Ansicht entspricht, dass der aktive Teil des Insulinmoleküls das Monomer ist. Hier sollte ich abbrechen. Haben Sie vielen Dank. Es tut mir leid, wenn ich überzogen haben sollte. Das Problem mit dieser Geschichte ist, dass sie länger wird, wenn man sie erzählt. Einen interessanten Hinweis auf den nächsten Vortrag muss ich noch mitteilen, nachdem ich dazu etwas gehört habe. Insulin reagiert zuerst mit dem Rezeptor, und es scheint, dass sie dann gemeinsam in die Zelle passieren und beide mit der Phosporylierung zu tun bekommen und mit der Reihenfolge der Phosporylierungsreaktionen. Das ist das Ende dieser Geschichte. Ich danke Ihnen.

Dorothy Crowfoot Hodgkin (1983)

Insulin 1983

Dorothy Crowfoot Hodgkin (1983)

Insulin 1983

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According to the Statutes of the Nobel Foundation, each Nobel Laureate has to deliver a lecture describing the work that has been rewarded by the Nobel Prize. The published texts of these Nobel Lectures constitute a valuable document for historians of science, culture and politics, since it often happens that this is the only time the Laureates officially tell the stories behind the rewarded discoveries, inventions, etc. But since the start of the Lindau Meetings in 1951, many Nobel Laureates have adapted their Nobel Lectures to a somewhat younger audience and told their stories over and over again. This is so for Dorothy Crowfoot Hodgkin, who first came to Lindau in 1970 to give a talk on “Structure of Insulin” and now in 1983 for the third time gave very much the same talk under the heading “Insulin 1983”. Since the major part of the audience in 1983 was not present in 1970 (probably being still in school), this repetition of the story of the structure of insulin mainly reached new ears and minds. But through the discovery of these historic Lindau tape recordings, we can now hear the story again and we can follow the changes that have been made, the stress put on different parts of it and also the change in the speaker, who in 1983 became 73 years of age. My own impression is that the speaker has realized the composition of the audience better than in 1970 and now gives a talk which is easier to follow and therefore more enjoyable. We know that Dorothy Crowfoot Hodgkin was still active in trying to understand not only the structure of insulin, but also the way it functions in the living organism, and some of the new realizations are also pointed out in the lecture. Finally, I was interested to hear her strong support of the much disputed 1923 Nobel Prize in Physiology or Medicine to John Mcleod, who shared it with Frederick Banting for the discovery of insulin, while Banting’s younger coworker Charles Best was left out. As Dorothy Crowfoot Hodgkin explains, without Mcleod guidance, the other two would never have discovered insulin at all!

Anders Bárány

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