Dorothy  Crowfoot Hodgkin (1980) - History and the X-ray analysis of protein crystals

Dorothy Crowfoot Hodgkin lectured at the Lindau meetings five times and repeated her basic story several times. The story is about the development of X-ray diffraction as a method to determine the structure of biologically important organic molecules, such as insulin

Professor Hoppe and friends, I find professors Hoppe's introduction very useful to me, I should be illustrating some of the remarks he has made in the course of this lecture. As you have heard already from other speakers, discoveries often get lost in the literature, well, perhaps Dickinson really showed you how to find them, however far back you had to go. And sometimes observations that should lead on to great developments get made and somehow not used, there are gaps of ten, fifteen, twenty years, before they are really, finally put to good use, that everybody works on the problems revealed, as in the case of interferon yesterday. And these gaps are, in themselves, quite interesting, and they occurred in the course of the story of the x-ray analysis of proteins. Protein crystals were observed in plants and in animal tissues during the course of the 19th century, and there are many nice drawings of them made by botanists and others who examined biological tissues. The first one, on my first slide, was made by Professor Schimper and I think from this part of Germany, pictures of crystals observed in plant cells, and you can see, he was looking at them through microscopes and he, there is one, particularly here - is there a pointer? - which you can see, he has viewed through nickels in different directions, which shows pleochroism. And some of them are protein crystals. I'm meaning this one here where he's obviously got his nickels in different directions. And the, another one on the next slide, also taken from more than a hundred years ago, from Preyer's book on "Die Blutkristalle", a very lovely photograph of haemoglobin crystals, I think they are dog haemoglobin, showing that he was viewing them through the microscope using nickels, turning them round so that the crystals appeared different coloured in different directions. And even at that time it was realized that proteins, that molecules, whatever they were, in these crystals were large. On the next slide there is a little early analysis made, figured in Preyer's book, giving a shot at the molecular weight of haemoglobin. It isn't quite right in any direction because the iron analysis is too high, and, but it gives you see a large figure of 13.000, it should be more like 17.000, and then the actual molecule is four times that. But it was known that there were large molecules in the crystals in the 19th century, and observations were made by both Schimper and Preyer, that showed that to get these beautiful pictures of crystals, you must keep the crystals covered with liquid. And that they dried or shrank when removed from their mother liquor. Now the next discovery was the discovery made in Munich by Von Laue, Friedrich and Knipping, illustrated by the next slide. Oh sorry, this is just another one that shows you a crystal actually growing, a crystal of haemoglobin actually growing in a red blood cell, and you can see that the haemoglobin crystal is occupying almost the whole of one of the blood cells. It's this particular cell, probably the wall was damaged, and so the crystal started to grow, whereas in the next one you can see the normal appearance. And now the photograph which was taken by Von Laue, Friedrich and Knipping in 1912 in Munich by passing x-rays through copper sulphate, and it shows that x-rays have wave lengths of the order of magnitude of diffracting units in the crystal, and that these units must be atoms arranged in a regular arrangement in three dimensions to produce these effects. Von Laue, Friedrich and Knipping didn't go on to work on this crystal, its structure wasn't solved for more than twenty years. It seemed quite complicated in those days, they moved over to a cubic crystal, zinc sulphide, and took very beautiful photographs. But the actually first use made of these x-ray diffraction photographs was made by a very young man, W.L. Bragg, age twenty four, in England, who showed how to use the diffraction effects to find the relative positions of the atoms in space in sodium chloride. He was helped by the structure having been suggested to him by Barlow, who in fact had published a proposed structure in 1885, quite correctly, again a long time before. I illustrate the structure on the next slide by an actual section in the electron density in the crystals of sodium chloride. The electrons scatter the x-rays and because they are grouped into atoms, in a regular arranged three dimensions, the interference is partly destructive, and from the spectra one can form a Fourier series as W.H. Bragg first suggested in 1915. The spectra provide the components, the terms of the Fourier series, they, from the scattering separates the terms, they have to be recombined to give you back the pattern which produced them. And the recombination has to be done, is usually done mathematically by calculating the contribution of every term observed to every position in the crystal by a mathematical formula, and for this you have to know the amplitudes of the waves, which you can easily measure, and also their relative phases, which are lost in the process but can sometimes be easily recovered. The calculation, though suggested in 1915, was not in fact made till 1926 by Habbicurst in America, and Dewan who suggested it, pointed out that the phases were, one, known in sodium chloride from Bragg's work, but two, could have been inferred because the heavier atom would dominate the effects, or alternatively, as Bragg had used to begin with, the differences between sodium chloride and potassium chloride, where one ion varied in density, would give a direct method of finding the phase relations. And then the picture can be combined and the electrons plotted, the electron density plotted at any density intervals you liked, to show the arrangement of the atoms. Now, when the experiments on x-ray diffraction were first made, passing x-rays through crystals, it was natural for different people in different parts of the world to repeat the experiments, W.L. Bragg was one. But they were also repeated in Japan, and in Japan, for the first time in 1913, immediately afterwards, x-rays were put through a protein, silk fibres. And I think the next slide should show you a photograph of silk fibroin. Now, this is a photograph in which the reflections are very fuzzy. Good photographs were obtained first actually in Berlin in 1921/22 by again a very young man, as he was then, Rudolf Brill, who I hope is still alive and living near Munich, as he was a year or two ago, and he took the photographs for his dissertation, helped in the interpretation by Michael Polanyi and Hermann Mark, who were slightly older, in the same laboratory. And the interpretation was that in these fibres there must be long chains of proteins, as indicated by Emil Fischer's experiments, and that these chains were not quite regular, that the amino acids might not repeat quite regularly. So this isn't a perfect crystalline photograph, but one in which the essential intervals shown by these fuzzy spots, are the intervals in the chains. And the next slide shows Professor Mark and Meyer's idea of what the protein chains, amino acid chains should be like to give the actual observed distances between these fuzzy reflections on the silk fibroin photographs. Extended zig-zag chains alternately glycine and alanine in the fibre structure, running through the unit cells. In this period of the 1920s, there were a number of experiments in which crystals were actually prepared in the laboratory from newly isolated enzymes and hormones, urease, Sumner, Northrop, pepsin, insulin by J.J. Abel in America, and it was natural for young crystallographers in the 1920s to try to put x-rays through these crystals too. So in the laboratory of W.H. Bragg at the Royal Institution, several attempts were made to get x-ray photographs of insulin, haemoglobin, one of the enzymes, edistin, a plant hormone, and they all got nothing but somewhat vague blurs. Two of the young men present were Asbury and J.D. Bernal, and when they left the laboratory of the Royal institution, Bernal for Cambridge and Asbury for Leeds, to work on wool fibres at York, they were both very anxious to work on proteins. And they corresponded with one another, and their correspondence exists in the Cambridge University Library where I found it. And Asbury described how he wrote to Northrop for pepsin crystals and Northrop sent him ones and he got absolutely nothing on the photographs, except a sort of, he got two rather diffuse reflections, rather like some of the silk fibroin ones. And he took fibre photographs as well; in fact that particular silk fibroin photograph is taken by Asbury and not by Brill or anyone of the earlier workers. He found that protein fibres in general tended to give two patterns, one hair when it was un-stretched with two reflections which he called the alpha pattern, and then if you pulled it out, it gave the pattern that suggested stretched chains, the beta pattern. But he was really anxious to work on crystals and to collaborate with Bernal, the only thing he complained of in his letters was he would like to start a serious collaboration, if only you were not such a soft-hearted chap, and taking on problems for all sorts of other people. And the problem of course that J.D. Bernal was taking on at that particular moment was the structure of the sterols. He had just put x-ray photographs, x-rays through calciferol crystals and shown from his results that the Wieland-Windaus formula couldn't be correct, and so opened the way for a whole new passage in sterol chemistry. But Asbury wrote, why not ask for haemoglobin crystals, a dare is the bloke, and Bernal, I think, hesitated a little, but suddenly the crystals were brought to him in his hand. They were brought from Uppsala, where they had been grown by a young man called John Philpot, who was a biochemist, learning how to purify proteins with Tiselius. And John Philpot enjoyed skiing. He went off skiing in the mountains for a fortnight, leaving his crystals growing in the fridge, and when he came back, he found his tubes of purified pepsin full of the most marvellous large crystals, about two millimetres long. And as good fortune for the advance of science would have it, they are passed through the laboratory, Glen Millikan, the son of R.A. Electron Millikan, who was working in Cambridge on fast reactions, and he was shown the crystals and he said, I know a man in Cambridge who would give his eyes for those crystals. And Philpot happened to know the same man, John Desmond Bernal, because he had earlier been involved in the isolation of vitamin D at the medical research institute in our country, and so he, very willingly, handed him a tube of the crystals, which Millikan stuck in his coat pocket right way up, crystals still in their mother liquor, and took them back to Cambridge. The year was then 1933, and when Bernal saw the crystals, of course he immediately did, he looked at them first within the tube under the microscope, and saw they were brightly shining, brightly birefringent, and he took one out of it, being in a hurry to see what was happening, just with a needle out of the tube, and took an x-ray photograph of it, and got exactly what Asbury had got, only perhaps rather less because he was a less skilful in general experimenter, hardly anything on the photograph. And he thought, this must be wrong, went back and looked at the crystals, bright in their mother liquor, and it suddenly struck him that they needed their mother liquor round them to keep their actual form. And he was lucky in another way because he was working at that time also on the problem of ice and water, and he had in the laboratory a student, Helen Megaw, taking x-ray photographs of ice crystals which she grew in little fine Lindemann glass tubes and kept at low temperatures. So Bernal took just one of her little fine walled tubes, about half a millimetre across, and fished out a pepsin crystal within its mother liquor, sealed the tube at two ends and put x-rays through it and immediately got an x-ray photograph with reflections, ever so many reflections all over the photograph. Now, the next slide should, if I am remembering right, well, first we have the people, so here is J.D. Bernal much later on in life, and talking to Kathi Dornberger, a student who was working at that time with V. M. Goldschmidt in Göttingen, but came to work with him and came to work on some of the protein problems later, and myself, and I must say, this photograph was taken in relatively old age, when Kathi had just become the director of a small institute for x-ray diffraction studies in Berlin East. Now, the next slide shows another character in the story whom I will mention, A.L. Patterson, in his laboratory with two students. And the next slide shows the photographs, this isn't the original pepsin photograph, here are some pepsin crystals swimming about in their mother liquor, and above is a photograph taken of them by Professor Tom Blundell in Birkbeck College, London, showing very, very many reflections along these parallel lines on an x-ray photograph. The original photographs we think must have perished at Birkbeck since the laboratory, part of the laboratory was destroyed during bombing during the war, but it, this at least illustrates the character of the picture, quite different from silk fibroin, a definite crystal repeat, you can very easily measure one that is constant, 67 angstroms from the separation of the lines, and the other one, in fact, we got it wrong when first we measured it, we got it about half the size it really is, it's really nearly 300 angstroms, corresponding to the long dimension of the pepsin crystals. I was at that time working with Bernal, and it was only a sort of bit of bad luck, but perhaps it was good luck for science, that I was not in the laboratory the day the first crystals came in, I was having a bad cold or something, and Bernal made all of the first observations himself. I'm always a little afraid I might have got more on the first photograph since it was possible to get more reflections from the dried crystals than Bernal actually did, and so delayed the observation that it was absolutely necessary to keep these crystals in their mother liquor. But I went on to take most of the rest of the photographs, but I do some of the calculations which we didn't carry very far because our first measurements indicated that we had a very large unit cell, that it could correspond to there being 12 pepsin molecules in this cell, each of weight about 40.000, several thousand atoms each you see within each molecule, and that this was, it was beyond our possible means at that time to think that we could work out the structures of such molecules. And the, yet the reflections extended to about 1 1/2 angstroms, it was clear that they were sufficient to show us atoms if ever we could form an electron-density pattern from them and look at it. At that time I was under pressure to return to Oxford to a college teaching appointment that should lead to a permanent appointment. I was most unwilling to go but everyone in Cambridge said, difficult to get university jobs in this time, of course you must take it, so reluctantly I went back to Oxford. Bernal had got a small grant to support me, of 200 a year, which he gave to another young person and I think who had come over with W.L. Bragg and was working with W.L. Bragg at Manchester, and heard about the work at Cambridge and wanted to join in. And he came in to take the next protein crystal, Chymotrypsin from Northrop, and then passed over to work on virus crystals that played a very important part in the development of the subject, and particularly later in America. And the next year there came another young person to work with Bernal in Cambridge and I think he's shown the next slide, again much older than he was, Max Perutz, and Max Perutz came from Vienna wanting to work with Hopkins, but Mark had forgotten to ask Hopkins to have Max Perutz as a research student when he visited Cambridge in 1935, because he was so excited by the work that Bernal was doing and sent him instead to work with Bernal, saying there's someone who really needs you, and Max said, but I don't know any crystallography, and Mark said, you will learn, my boy, which he did, in the hard way, for many years to come. The other one in the picture is John Kendrew, who Professor Hoppe mentioned, and he doesn't come into the story for very much longer. Now, what happened to me in Oxford, working, going back to begin work all on my own, was that Sir Robert Robinson who was then Professor of organic chemistry, was given a small present of the first insulin crystals obtained by the firm brutes in our country following a prescription for growing insulin crystals given by D.A. Scott in America, that it was necessary to add zinc to the preparation. They gave Robinson 10 milligrams in a little tube, and he hadn't any use for them, and knew the work that we had done in Cambridge taking x-ray photographs of pepsin crystals, so he said, why don't you try to photograph these? And they were microcrystalline but very bright and birefringent, and so I looked up all the preparations and grew the crystals finally, not very well, by Scott's method, large enough to take x-ray photographs of, and I made a horrible mistake, I decided that it didn't matter whether they were wet or dry and it was easier to handle them dry. I dried them like good organic chemists did, pouring methyl alcohol over them and then took x-ray photographs of them. And these very dry looking crystals, as you can see, are the crystals, not looking very good single crystals but they are, and up at the top is the little x-ray photograph they gave. Well, they gave an x-ray photograph, spots on the film, and I developed the first x-ray photograph about ten o' clock at night, and waited in the lab while I fixed it and washed it, and then walked out absolutely dazed, very excited, little spots on this photograph, down through the centre of Oxford, away from my lodgings and about midnight I was accosted by a policeman who said: "Where are you going?" So I said, not very truthfully: "Back to college", and turned round and went back. But I woke up in the morning, next morning, about six, and I was suddenly extremely worried, and I went to the - I thought, perhaps those spots, perhaps those crystals aren't really protein crystals at all, but something else, some impurity, some breakdown product in the preparation. And I went down very quickly before breakfast to the laboratory and picked one out of the tube and tried protein tests on it, and I tried the xanthoproteic reaction, which consisted of dropping first a drop of concentrated nitric acid and it turns yellow, and then a drop of ammonia and it turns brown, which it did, to my great relief, and I went back, happily, to breakfast. Now I perhaps should tell all those who are young here: Why I knew that reaction so well was because I was rather young and still at school I had a laboratory and did experiments on my own, and I was doing experiments suggested by Parson's Fundamentals of Biochemistry, and completing something one Sunday in a nice new silk frock, and of course one should never do this kind of thing, and I accidently dropped a spot of nitric acid on the front of my dress, and seized the nearest alkali which was ammonia and put it on it, well, of course it was much worse, and I was dreadfully upset, my mother comforted me and said she could cover it all with a frill, which she did, and so this particular reaction is indelibly engraved in my mind and I was very pleased when I could test it once again with the insulin crystals. Now, what happened after that? I didn't really remember until I was back reading the Bernal files at Cambridge, but it's obvious that directly after breakfast, I rang up the Cambridge Lab to tell them that I had taken these insulin photographs and got the very sad news that Bernal was at home with a temperature of 104. So then I wrote a little letter to his wife saying, please tell him when he's well enough that I have these insulin photographs, and I gave the rough dimensions of the crystal unit cell, and they are on the next slide. A rhomb is the real form of the crystals, 74.8 across 30.9 high, and within the crystals, there's roughly 36.000 molecular weight of protein, and it should formally be divided into three, which by the crystal symmetry to give you 12.000 molecular weight for the insulin molecules in the unit cell. Bernal recovered and wrote me a letter which begins "Dear Dorothy, ZN 0.52%, CO 0.49%, CD 0.74%. This gives rather less than three in each case. I am going back to Cambridge on, I forget when, I will send you some cadmium stuff" and any crystallographer can see what he was saying in this letter. This zinc, according to D.A. Scott's observations, is replaceable by other elements, of which cadmium is the heaviest so far observed, you should try and see if the cadmium crystals show changes in the intensity of the x-ray reflections and then you might be able to use the method of isomorphous replacement to determine phase constants for the different reflections and really see the atoms in your crystal. Terribly premature, I'm afraid, again I didn't remember all the details, I found the letter in which I said, I'm having a terrible time with scholarship examining for the college", and I did make one or two abortive efforts. But I had a feeling that cadmium wasn't really heavy enough to do what was wanted and that anyway, if I did a little calculation on the number of atoms, that there were in insulin. It was too large a problem for myself to set out to work on at the age of 24, and that I must try to solve some simpler structure first. I tried out the idea of the isomorphous replacement, again actually in little calculations at the Royal Institution in a notebook on cholesterol, chloride and bromide, while I was taking the insulin photograph which is shown on the previous slide, because it's a very, I took that particular photograph for show, for publication in the Royal Society, using the very big x-ray tube at the Royal Institution for the purpose. So, I didn't go on with insulin, but Max Perutz went on with haemoglobin. Could I have the next slide please? I went on, as I said, with sterols, and with the sterols I explored the possible use of both heavy atoms and isomorphous replacement for showing electron densities, and this is one of the experiments we did. And I show it because I have to introduce another character in the story, and this is A.L. Patterson. A.L. Patterson, I showed on that earlier slide, was one of the young men, A.L. Patterson, Asbury and Bernal ...

Professor Hoppe und Freunde, ich finde Professor Hoppes Einleitung sehr nützlich für mich - ich sollte einige der Bemerkungen veranschaulichen, die er im Verlauf seines Vortrags gemacht hat. Wie Sie bereits von anderen Rednern gehört haben, gehen Entdeckungen oft in der Literatur verloren - nun, vielleicht hat Dickinson Ihnen wirklich gezeigt, wie man sie finden kann, wie weit man auch immer zurückgehen muss. Und manchmal werden Beobachtungen, die zu großen Entwicklungen führen sollten, gemacht und irgendwie nicht genutzt. Es gibt Lücken von zehn, 15, 20 Jahren, bevor sie wirklich, endlich gut verwendet werden und jeder an den aufgezeigten Fragestellungen arbeitet, wie bei dem Beispiel von Interferon gestern. Diese Lücken sind, für sich genommen, sehr interessant, und sie traten im Laufe der Geschichte der Röntgenanalyse von Proteinen auf. Protein-Kristalle wurden in Pflanzen und tierischem Gewebe im Verlauf des 19. Jahrhunderts beobachtet, und es existieren viele gute Zeichnungen, die Botaniker und andere, die biologisches Gewebe untersuchten, von ihnen angefertigt haben. Die erste Zeichnung, auf meinem ersten Dia wurde von Prof. Schimper angefertigt und zeigt Bilder von Kristallen, die in Pflanzenzellen aus - wie ich glaube - diesem Teil von Deutschland beobachtet wurden. Sie können sehen, dass er sie durch Mikroskope betrachtete, und hier ist insbesondere eines (gibt es hier einen Pointer?), bei dem Sie sehen können, dass er Nickel-Kristalle in verschiedenen Ausrichtungen betrachtet, wobei sich Pleochroismus zeigt. Einige von ihnen sind Protein-Kristalle. Ich meine dieses eine hier, wo er offensichtlich seine Nickel-Kristalle in verschiedenen Ausrichtungen betrachtet. Auf dem nächsten Dia haben wir ein weiteres Bild, ebenfalls über 100 Jahre alt, aus Preyers Buch über "Die Blutkristalle", eine wunderschöne Aufnahme von Hämoglobin-Kristallen. Ich glaube, es handelte sich um Hunde-Hämoglobin, und die Aufnahme zeigt, dass er sie durch das Mikroskop betrachtete und "Nickels" verwendete, die er herumdrehte, so dass die Kristalle unterschiedlich gefärbt in unterschiedlichen Richtungen erschienen. Und selbst zu dieser Zeit erkannte man, dass die Proteine, die Moleküle, was auch immer das in diesen Kristallen war, groß waren. Auf dem nächsten Dia findet sich eine kleine frühe Analyse, die in Preyers Buch aufgestellt wurde und sich am Molekulargewicht von Hämoglobin versuchte. Sie ist in keiner Hinsicht wirklich richtig, denn die Analyse von Eisen ist zu hoch, und sie gibt eine große Zahl von 13.000 an, wobei es eher 17.000 sein sollte, und dann ist das eigentliche Molekül das Vierfache davon. Aber im 19. Jahrhundert wusste man, dass sich in den Kristallen große Moleküle befanden, und sowohl Schimper als auch Preyer stellten fest, dass man, um diese schönen Kristallbilder zu bekommen, die Kristalle mit Flüssigkeit bedeckt lassen musste und dass sie vertrockneten oder schrumpften, wenn man sie aus ihrer Mutterlauge entfernte. Die nächste Entdeckung war jene, die in München von Von Laue, Friedrich und Knipping gemacht wurde und auf dem nächsten Dia dargestellt ist. Oh, Entschuldigung - dies ist nur noch ein Dia, das Ihnen einen Kristall zeigt, wie er tatsächlich wächst, einen Hämoglobin-Kristall, der gerade in einem roten Blutkörperchen wächst, und Sie können sehen, dass der Hämoglobin-Kristall eine der Blutzellen fast vollständig ausfüllt. Es ist diese bestimmte Zelle, vielleicht war die Wand beschädigt, und so begann der Kristall zu wachsen, wohingegen man auf dem nächsten Bild das normale Aussehen erkennen kann. Und hier ist nun eine Aufnahme, die 1912 von Von Laue, Friedrich und Knipping in München gemacht wurde, indem sie Röntgenstrahlen durch Kupfersulfat schickten. Sie zeigt, dass Röntgenstrahlen Wellenlängen von der Größenordnung der Beugung der Einheiten in dem Kristall haben und dass diese Einheiten Atome sein müssen, die in einer regelmäßigen Anordnung in drei Dimensionen angeordnet sein müssen, um diese Effekte hervorzurufen. Von Laue, Friedrich und Knipping setzten ihre Arbeit an diesem Kristall nicht fort, und seine Struktur wurde für mehr als 20 Jahre nicht aufgeklärt. Damals schien er ziemlich kompliziert, sie gingen zu einem kubischen Kristall über, zu Zinksulfid, und machten wunderschöne Aufnahmen. Tatsächlich aber erfolgte die erste Verwendung dieser Röntgenbeugungsaufnahmen durch einen sehr jungen Mann, W. L. Bragg, 24 Jahre, in England, der zeigte, wie man die Beugungseffekte nutzen konnte, um bei Natriumchlorid die relativen räumlichen Positionen der Atome zu finden. Ihm kam dabei der Umstand zu Hilfe, dass ihm die Struktur von Barlow vorgeschlagen worden war, der in der Tat 1855 den Vorschlag einer Struktur veröffentlicht hatte, ziemlich korrekt und wiederum eine lange Zeit zuvor. Auf dem nächsten Dia illustriere ich die Struktur anhand eines tatsächlichen Bereichs in der Elektronendichte in den Kristallen von Natriumchlorid. Die Elektronen zerstreuen die Röntgenstrahlen, und da sie in einer regelmäßigen Anordnung in drei Dimensionen zu Atomen gruppiert sind, ist die Interferenz teilweise destruktiv, und aus den Spektren kann man eine Fourierreihe bilden, wie W. H. Bragg erstmals 1915 vorschlug. Die Spektren stellen die Komponenten, die Terme der Fourierreihe, bereit, und da die Zerstreuung die Terme trennt, müssen sie rekombiniert werden, um ihnen das Muster zurückzugeben, das sie hervorbrachte. Die Rekombination wird üblicherweise mathematisch vorgenommen, indem der Beitrag eines jeden Terms, der zu jeder Position in dem Kristall beobachtet wird, anhand einer mathematischen Formel berechnet wird. Um dies zu tun, muss man die Amplitude der Wellen kennen, die einfach gemessen werden kann, und auch ihre relativen Phasen, die in dem Prozess verloren gehen, aber manchmal einfach wiedergewonnen werden können. Tatsächlich wurde die Berechnung, obwohl sie 1915 vorgeschlagen wurde, erst 1926 von Habbicurst in Amerika durchgeführt. Dewan, der sie vorgeschlagen hatte, wies darauf hin, dass die Phasen in Natriumchlorid 1.) aufgrund von Braggs Arbeit bekannt waren, aber 2.) hätten abgeleitet werden können, da das schwerere Atom die Wirkungen dominieren würde, oder aber (wie sich dies Bragg zu Anfang zunutze gemacht hatte), dass die Unterschiede zwischen Natriumchlorid und Kaliumchlorid, wobei ein Ion in der Dichte variierte, einen direkten Weg angeben würden, um die Phasenbeziehungen zu finden. Dann kann das Bild zusammengesetzt und die Elektronen können geplottet werden, die Elektronendichte kann bei jedem gewünschten Dichte-Intervall geplottet werden, um die Anordnung der Atome deutlich zu machen. Als die ersten Experimente zur Röntgenbeugung durchgeführt wurden und man Röntgenstrahlen durch Kristalle schickte, war es natürlich, dass verschiedene Leute an verschiedenen Orten auf der Welt die Experimente wiederholten. W. L. Bragg war einer von ihnen. Aber sie wurden auch in Japan wiederholt, und unmittelbar danach wurden in Japan zum ersten Mal Röntgenstrahlen durch ein Protein, durch Seidenfasern geschickt. Und ich denke, das nächste Dia sollte Ihnen eine Aufnahme von Seiden-Fibroin zeigen. Dies ist eine Aufnahme, auf der die Reflexionen sehr verschwommen sind. Tatsächlich wurden die ersten guten Aufnahmen 1921/1922 in Berlin von einem damals ebenfalls sehr jungen Mann gemacht, von Rudolf Brill, der hoffentlich noch immer lebt und, wie vor einem oder zwei Jahren, in der Nähe von München wohnt. Er verwendete die Aufnahmen für seine Dissertation, und bei der Interpretation halfen ihm Michael Polanyi und Hermann Mark, die etwas älter waren und im selben Labor arbeiteten. Diese Interpretation besagte, dass in diesen Fasern lange Proteinketten enthalten sein mussten, worauf die Experimente von Emil Fischer hindeuteten, und dass diese Ketten nicht ganz regelmäßig waren, dass sich die Aminosäuren nicht ganz regelmäßig wiederholten. Somit ist dies keine perfekte kristalline Aufnahme, sondern eine, in der die wesentlichen Abstände, die von diesen verschwommenen Stellen dargestellt werden, die Abstände in den Ketten sind. Das nächste Dia zeigt, wie nach Vorstellung von Professor Mark und Meyer die Proteinketten, die Aminosäureketten, beschaffen sein müssten, um die tatsächlich beobachteten Entfernungen zwischen diesen verschwommenen Reflexionen auf den Seidenfibroin-Aufnahmen zu ergeben: längere Zick-Zack-Ketten, abwechselnd Glycin und Alanin in der Faserstruktur, die durch die Elementarzellen hindurchlaufen. Während dieser Zeit in den 1920er Jahren gab es mehrere Experimente, in denen Kristalle im Labor aus kürzlich isolierten Enzymen und Hormonen hergestellt wurden, Urease von Sumner, Pepsin von Northrop, Insulin von J. J. Abel in Amerika, und es war für junge Kristallografen in den 1920er Jahren normal, außerdem zu versuchen, Röntgenstrahlen durch diese Kristalle zu schicken. Im Labor von W. H. Bragg an der Royal Institution wurden also mehrere Versuche unternommen, Röntgenaufnahmen von Insulin, Hämoglobin, von einem der Enzyme, Edestin, einem Pflanzenhormon zu machen, und sie alle erhielten nur verschwommene Flecken. Zwei der dabei anwesenden jungen Männer waren Asbury und J. D. Bernal, und als sie das Labor der Royal Institution verließen - Bernal Richtung Cambridge, Asbury Richtung Leeds, um in York an Wollfasern zu forschen - waren sie beide sehr begierig, an Proteinen zu forschen. Sie korrespondierten miteinander, und ihre Korrespondenz liegt in der Bibliothek der Universität von Cambridge, wo ich sie gefunden habe. Asbury beschreibt, dass er Northrop anschrieb und ihn um Pepsin-Kristalle bat, dass Northrop ihm diese sandte und dass er auf den Aufnahmen überhaupt nichts zu sehen bekam, mit Ausnahme von zwei sehr unscharfen Reflexionen, die jenen auf den Aufnahmen des Seidenfibroins ziemlich ähnlich sind. Er machte auch Faser-Aufnahmen, und in der Tat stammt diese besondere Seidenfibroin-Aufnahme von Asbury und nicht von Brill oder einem der anderen früheren Forscher. Er fand heraus, dass Proteinfasern im Allgemeinen dazu neigen, zwei Muster zu ergeben, eines in ungedehntem Zustand mit zwei Reflexionen, das er das Alpha-Muster nannte, und wenn man es dann streckte, ergab sich ein Muster, das auf gedehnte Ketten hinwies, das Beta-Muster. Aber er wollte wirklich unbedingt an Kristallen forschen und mit Bernal zusammenarbeiten. Das Einzige, was er in seinen Briefen beklagte, war, dass er gerne eine ernsthafte Zusammenarbeit mit ihm beginnen würde, wenn dieser doch nur nicht ein solch weichherziger Kerl wäre und sich die Probleme aller möglichen anderen Leute aufladen würde. Das Problem, das sich J. D. Bernal zu dieser bestimmten Zeit auflud, war natürlich die Struktur der Sterole. Er hatte gerade Röntgenstrahlen durch Calciferol-Kristalle geschickt und anhand seiner Ergebnisse nachgewiesen, dass die Wieland-Windaus-Formel nicht richtig sein konnte und damit den Weg für einen ganz neuen Abschnitt in der Sterol-Chemie geöffnet. Aber Asbury schrieb, warum nicht um Hämoglobin-Kristalle bitten: Wer nichts wage, gewinne auch nichts. Ich glaube, Bernal zögerte ein wenig, aber plötzlich wurden sie ihm in die Hände gelegt. Sie wurden aus Uppsala geliefert, wo sie von einem jungen Mann namens John Philpot gezüchtet worden waren, einem Biochemiker, der bei Tiselius lernte, wie man Proteine purifiziert. Und John Philpot liebte das Skifahren. Er unternahm eine Skitour in die Bergen und blieb zwei Wochen weg. Seine Kristalle ließ er im Kühlschrank weiterwachsen, und als er zurückkam, stellte er fest, dass seine Röhrchen mit purifiziertem Pepsin voll mit den wunderbarsten großen Kristallen waren, ungefähr zwei Millimeter lang. Und wie es eine glückliche Fügung für den Fortschritt der Wissenschaft wollte, wurden sie im Labor herumgereicht und Glenn Millikan gezeigt, dem Sohn von R. A. "Elektron"-Millikan, der in Cambridge an schnellen Reaktionen forschte. Er sagte: "Ich kenne jemanden in Cambridge, der sein Augenlicht für diese Kristalle geben würde." Zufällig kannte Philpot denselben Mann, John Desmond Bernal, denn er war zuvor an der Isolierung von Vitamin D am medizinischen Forschungsinstitut unseres Landes beteiligt gewesen, und händigte ihm daher sehr bereitwillig ein Röhrchen der Kristalle aus, welches Millikan direkt in seine Jackentasche stopfte, mit den Kristallen noch immer in ihrer Mutterlauge, und es nach Cambridge brachte. Dies war 1933, und Bernal sah sich die Kristalle an, natürlich tat er dies sofort, zuerst schaute er sie sich in dem Röhrchen unter dem Mikroskop an und sah, dass sie hell leuchteten, strahlend und doppelbrechend, und er nahm einen davon einfach mit einer Nadel heraus, da er in Eile war und sehen wollte, was passierte. Er machte eine Röntgenaufnahme davon und bekam genau das, was Asbury bekommen hatte, nur vielleicht etwas weniger, denn er war im Allgemeinen ein weniger geschickter Experimentator: Es war so gut wie nichts auf der Aufnahme. Und er dachte, das muss falsch sein, ging zurück und sah sich die Kristalle an, leuchtend in ihrer Mutterlauge, und plötzlich kam ihm der Gedanke, dass sie ihre Mutterlauge um sich herum brauchten, um ihre gegenwärtige Gestalt zu bewahren. Und er hatte noch in anderer Hinsicht Glück, denn er arbeitete zu jener Zeit an dem Problem von Eis und Wasser und hatte in seinem Labor eine Studentin, Helen Megaw, die Röntgenaufnahmen von Eiskristallen machte, die sie in hübschen kleinen Lindemann-Glasröhrchen züchtete und bei niedrigen Temperaturen aufbewahrte. Bernal nahm also nur eines ihrer kleinen dünnwandigen Röhrchen von ungefähr einem halben Millimeter Durchmesser und fischte ein Pepsin-Kristall in seiner Mutterlauge heraus, verschloss das Röhrchen an beiden Enden und bekam sofort eine Röntgenaufnahme mit Reflexionen, so vielen Reflexionen, überall auf der Aufnahme. Das nächste Dia sollte nun, wenn ich mich richtig erinnere ... zu einem sehr viel späteren Zeitpunkt seines Lebens, im Gespräch mit Kathi Dornberger, einer Studentin, die zu jener Zeit mit V. M. Goldschmidt in Göttingen zusammenarbeitete, aber dann zu ihm kam und mit ihm und mir zusammenarbeitete und später auch an einigen der Protein-Fragestellungen arbeitete, und ich muss sagen, dass dieses Foto in ziemlich hohem Alter aufgenommen wurde, als Kathi gerade Direktorin eines kleinen Instituts für Studien zur Röntgenbeugung in Ostberlin geworden war. Das nächste Dia zeigt eine weitere Figur in der Geschichte, die ich erwähnen möchte, A. L. Patterson, in seinem Labor, mit zwei Studenten. Und das nächste Dia zeigt die Aufnahmen. Dies ist nicht die ursprüngliche Pepsin-Aufnahme, hier haben wir einige Pepsin-Kristalle, die in ihrer Mutterlauge herumschwimmen, und oben haben wir eine Aufnahme, die Professor Tom Blundell am Birkbeck College in London von ihnen gemacht hat und die sehr, sehr viele Reflexionen entlang dieser parallelen Linien auf einer Röntgenaufnahme aufweist. Ich denke, die Original-Aufnahmen am Birkbeck College müssen zerstört worden sein, da ein Teil des Labors während der Bombenangriffe im Krieg getroffen wurde, aber dies hier veranschaulicht zumindest den Charakter des Bildes, der sich sehr von Seidenfibroin unterscheidet. Ein fest umrissener Kristall - Sie können sehr einfach einen [Kristall] messen, der konstant ist, 67 Å ab der Trennung der Linien. Und der andere - tatsächlich machten wir einen Fehler, als wir ihn zum ersten Mal maßen, wir bekamen ungefähr die Hälfte der Größe heraus, die er wirklich hat und die fast 300 Å beträgt und mit der Längsseite der Pepsin-Kristalle korrespondiert. Zu jener Zeit arbeitete ich mit Bernal zusammen, und es war nur ein bisschen Pech - aber vielleicht auch Glück für die Wissenschaft -, dass ich an dem Tag, als die ersten Kristalle eintrafen, nicht im Labor war. Ich hatte eine schlimme Erkältung oder etwas Ähnliches, und Bernal machte alle ersten Beobachtungen selbst. Ich habe immer ein bisschen Angst, dass ich auf der ersten Aufnahme etwas mehr eingefangen hätte, da es möglich war, mehr Reflexionen der getrockneten Kristalle zu bekommen, als es Bernal gelang, und dass ich auf diese Weise die Beobachtung verzögert hätte, dass es absolut erforderlich ist, diese Kristalle in ihrer Mutterlauge aufzubewahren. Aber ich fuhr damit fort, den Großteil der restlichen Aufnahmen zu machen, und stellte einige der Berechnungen an, die wir nicht sehr weit führten, da unsere ersten Messungen darauf hindeuteten, dass wir eine sehr große Elementarzelle hatten und dass es entsprechend möglich war, dass zwölf Pepsin-Moleküle in dieser Zelle enthalten waren, jedes mit einem Gewicht von ungefähr 40.000. Innerhalb eines jeden Moleküls sah man mehrere Tausend Atome, und es lag zu jener Zeit außerhalb unserer Möglichkeiten, anzunehmen, dass wir die Struktur solcher Moleküle herausfinden könnten. Dennoch reichten die Reflexionen bis ungefähr 11/2 Å, und es war klar, dass sie ausreichten, um uns Atome zu zeigen, wenn es uns jemals gelänge, aus ihnen ein Muster der Elektronendichte zu bilden und sie zu betrachten. Zu der Zeit stand ich unter Druck, für einen Lehrauftrag am College, der zu einer festen Anstellung führen sollte, nach Oxford zurückzukehren. Ich war absolut nicht gewillt zu gehen, aber jeder in Cambridge sagte, dass es derzeit schwierig sei, Jobs im universitären Bereich zu finden und dass ich daher selbstverständlich diesen Auftrag annehmen müsse. So ging ich widerwillig zurück nach Oxford. Bernal hatte ein kleines Stipendium in Höhe von 200 pro Jahr zur Verfügung gestellt bekommen, um mich damit zu unterstützen, und gab dies einem anderen jungen Wissenschaftler. der damals zu Besuch aus Amerika kam und mit W. L. Bragg herübergekommen war und mit ihm in Manchester arbeitete. Er hörte von der Forschungsarbeit in Cambridge und wollte sich ihr anschließen. Er stieß dazu und nahm das nächste Protein-Kristall, Chymotrypsin, von Northrop in Empfang. Danach wandte er sich der Arbeit an Virus-Kristallen zu, die eine sehr wichtige Rolle bei der Entwicklung des Themas spielten, insbesondere später in Amerika. Im nächsten Jahr kam wieder ein junger Wissenschaftler dazu, um mit Bernal in Cambridge zu arbeiten. Er ist, wie ich glaube, auf dem nächsten Dia dargestellt, wiederum sehr viel älter, als er damals war - Max Perutz. Max Perutz kam aus Wien und wollte mit Hopkins arbeiten, aber Mark hatte vergessen, Hopkins zu bitten, Max Perutz als Forschungsstudent zu beschäftigen, als er 1935 Cambridge besuchte, da er so begeistert von Bernals Arbeit war. Stattdessen schickte er ihn zu Bernal, um mit ihm zusammenzuarbeiten, und sagte: "Dort ist jemand, der dich wirklich braucht." Max erwiderte: "Aber ich habe überhaupt keine Ahnung von Kristallografie," und Mark antwortete: "Du wirst es lernen, mein Junge," - und das tat er und ging in eine mehrjährige, harte Lehre. Der Andere auf dem Foto ist John Kendrew, von dem Professor Hoppe sprach, und er spielt erst zu einem sehr viel späteren Zeitpunkt eine Rolle in der Geschichte. Was mir nun in Oxford widerfuhr, wo ich arbeitete und wieder anfing, allein zu forschen, war Folgendes: Sir Robert Robinson, der damals Professor für organische Chemie war, erhielt ein kleines Geschenk, das aus den ersten Insulin-Kristallen bestand, die die Firma Boots in unserem Land gewonnen hatte, indem sie sich an ein Rezept zur Züchtung von Insulin-Kristallen gehalten hatte, das D. A. Scott in Amerika herausgegeben hatte. Es besagte, dass es erforderlich war, dem Ansatz für die Kristalle Zink hinzuzufügen. Sie gaben Robinson 10 Milligramm in einem kleinen Röhrchen, und da er dafür keine Verwendung hatte und wusste, welche Art von Arbeit wir in Cambridge durchgeführt hatten und dass wir Röntgenaufnahmen von Pepsin-Kristallen gemacht hatten, fragte er: Sie waren mikrokristallin, aber sehr hell und doppelbrechend. Ich sah also die ganzen Zubereitungen nach und züchtete schließlich die Kristalle nach Scotts Methode, nicht besonders gut, aber groß genug, um Röntgenaufnahmen von ihnen machen zu können. Und ich beging einen schrecklichen Fehler - ich entschied, dass es keine Rolle spielte, ob sie nass oder trocken waren und dass es einfacher war, sie in trockenem Zustand zu verwenden. Ich trocknete sie, wie es gute organische Chemiker taten, goss Methylalkohol auf sie und machte dann Röntgenaufnahmen von ihnen. Wie Sie sehen können, sind diese sehr trocken aussehenden Kristalle jene Kristalle. Sie sehen nicht sehr gut aus, es sind einzelne Kristalle, und ganz oben ist die kleine Röntgenaufnahme, die ich von ihnen bekam. Sie ergaben also eine Röntgenaufnahme, Flecken auf dem Film, und ich entwickelte die erste Röntgenaufnahme nachts um zehn Uhr und wartete im Labor, während ich sie fixierte und abwusch. Dann wanderte ich, völlig verwirrt und sehr aufgeregt - wegen den kleinen Flecken auf der Aufnahme - in das Stadtzentrum von Oxford hinunter, weg von meiner Wohnung, und gegen Mitternacht wurde ich von einem Polizisten angesprochen, der mich fragte, wohin ich ginge. Ich antwortete, nicht wirklich wahrheitsgemäß, dass ich zurück zum College ginge, drehte mich um und ging zurück. Aber am nächsten Morgen erwachte ich gegen sechs Uhr und war auf einmal zutiefst besorgt. Ich dachte, dass jene Flecken, jene Kristalle vielleicht gar keine Protein-Kristalle waren, sondern etwas anderes, eine Verunreinigung, ein Abbauprodukt in der Zubereitung. Daher begab ich mich vor dem Frühstück sehr schnell ins Labor und nahm einen der Kristalle aus dem Röhrchen und führte damit einige Protein-Tests durch. Ich probierte die Xanthoprotein-Reaktion, die darin besteht, dass man zunächst einen Tropfen Salpetersäure auf die Probe gibt, die dann gelb wird, und dann einen Tropfen Ammoniak, woraufhin die Probe sich braun verfärbt. Zu meiner großen Erleichterung geschah genau dies, und ich kehrte sehr glücklich zurück, um zu frühstücken. Vielleicht sollte ich nun all den jungen Menschen hier erzählen, warum ich diese Reaktion so gut kannte. Dies lag daran, dass ich, als ich ziemlich jung war und noch zur Schule ging, ein Labor hatte und auf eigene Faust Experimente durchführte. Ich beschäftigte mich also mit Experimenten, die in Parsons' Fundamentals of Biochemistry vorgeschlagen wurden, und eines Sonntags brachte ich das eine oder andere Experiment zum Abschluss. Ich trug dabei ein hübsches neues Seidenkleid - natürlich sollte man so etwas niemals tun -, und versehentlich ließ ich einen Tropfen Salpetersäure vorne auf mein Kleid fallen. Ich griff nach dem nächstliegenden Alkali, welches Ammoniak war, und gab es auf den Fleck. Natürlich machte es das noch viel schlimmer. Ich war furchtbar bestürzt. Meine Mutter tröstete mich und sagte, sie könne das alles mit einer Rüsche verdecken, was sie dann tat. Daher hat sich diese spezielle Reaktion unauslöschlich meinem Geist eingeprägt, und ich war hoch erfreut, als ich sie erneut mit den Insulin-Kristallen testen konnte. Was geschah danach? Ich erinnerte mich nicht wirklich, bis ich zurück in Cambridge war und Bernals Akten las, aber offensichtlich rief ich direkt nach dem Frühstück bei dem Labor in Cambridge an, um mitzuteilen, dass ich diese Insulin-Aufnahmen gemacht hatte, und bekam die sehr traurige Neuigkeit zu hören, dass Bernal mit einer Temperatur von 104 ° zu Hause war. Ich schrieb also seiner Frau einen kurzen Brief und bat sie, ihm, sobald es ihm gut genug ging, zu erzählen, dass ich die Insulin-Aufnahmen hatte, und ich teilte die ungefähren Abmessungen der Kristall-Elementarzelle mit, die auf dem nächsten Dia angegeben sind. Die eigentliche Form der Kristalle ist eine Raute, 74,8 quer, 30,9 hoch, und innerhalb der Kristalle hat man Protein mit ungefähr einem Molekulargewicht von 36.000. Dies sollte formal auf drei aufgeteilt werden, so dass man aufgrund der Kristallsymmetrie ein Molekulargewicht von 12.000 für die Insulin-Moleküle in der Elementarzelle erhält. Bernal erholte sich und schrieb mir einen Brief, der mit den folgenden Worten beginnt: Das ergibt eher weniger als drei in jedem Fall. Ich gehe nach Cambridge zurück - wann, habe ich vergessen; ich werde dir etwas von dem Cadmium-Zeug schicken." Jeder Kristallograf versteht, was er in diesem Brief sagte. Zink kann, laut D. A. Scott, durch andere Elemente ersetzt werden, von denen Cadmium nach derzeitigem Wissensstand das schwerste ist. Man sollte herausfinden, ob die Cadmium-Kristalle Veränderungen in der Intensität der Röntgen-Reflexionen zeigen, und dann könnte man die Methode des isomorphen Austauschs anwenden, um Phasenkonstanten für die verschiedenen Reflexionen zu bestimmen und tatsächlich die Atome in dem Kristall zu sehen. Ich fürchte, ich war entsetzlich vorschnell. Ich erinnerte mich nicht an alle Details, aber ich fand den Brief, in dem ich schrieb: Ich habe fürchterlich viel Arbeit der Stipendiumsprüfung für das College,", und ich unternahm einige nutzlose Versuche. Aber ich hatte das Gefühl, dass Cadmium nicht wirklich schwer genug war, um das zu tun, was gewünscht war, und dass, selbst wenn ich eine kleine Berechnung zu der Anzahl der Atome im Insulin anstellte, dieses Problem zu groß war, als dass ich es im Alter von 24 angehen konnte und dass ich versuchen musste, zunächst eine einfachere Struktur zu lösen. Ich testete die Idee des isomorphen Austauschs, in kleinen Berechnungen zu Cholesterol, Chlorid und Bromid, die ich an der Royal Institution in ein Notizbuch schrieb, während ich die Insulin-Aufnahme, die auf dem vorherigen Dia dargestellt ist, für eine Publikation bei der Royal Society verwendete und mich zu diesem Zweck der großen Röntgenröhre an der Royal Institution bediente. Mit dem Insulin machte ich also nicht weiter, aber Max Perutz machte mit dem Hämoglobin weiter. Ich machte, wie gesagt, mit Sterolen weiter und erkundete dabei den möglichen Einsatz sowohl von schweren Atomen als auch des isomorphen Austauschs, um die Elektronendichte darzustellen, und dies ist eines der von uns durchgeführten Experimente. Ich zeige es, denn ich muss einen weiteren Charakter in der Geschichte vorstellen, und zwar A. L. Patterson. A. L. Patterson war, auf einem vorangegangenen Dia, einer der jungen Männer, A. L. Patterson, Asbury und Bernal ...

Dorothy Crowfoot Hodgkin (1980)

History and the X-ray analysis of protein crystals

Dorothy Crowfoot Hodgkin (1980)

History and the X-ray analysis of protein crystals

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Dorothy Crowfoot Hodgkin lectured at the Lindau meetings five times and repeated her basic story several times. The story is about the development of X-ray diffraction as a method to determine the structure of biologically important organic molecules, such as insulin. This time she tells a very personal version of the story, with a lot of photographs that, sadly enough, are not in the archive of the Lindau meetings. Some photographs are of beautiful organic crystals, the growing of which is an art in itself. Other photographs are of her mentors and colleagues. Her foremost mentor, John D. Bernal, plays a large role in her lecture and she has even gone through his correspondence that is kept in an archive in Cambridge. Bernal, who was born in Ireland 1901, was the first to show clearly that even organic molecules can give rise to well defined X-ray diffraction diagrams. This discovery was made in Cambridge in 1934, using crystals of pepsin. According to Dorothy Crowfoot Hodgkin, his important discovery was that the crystals had to be kept in their mother liquid. This is because they contain water and may become deformed if dried. Bernal put the only millimetre large crystals in a small glass tube that had been sealed at the ends. I was particularly interested in hearing that the crystals for this groundbreaking experiment had been grown where I was born and went to school and university, in Uppsala, Sweden. The pepsin crystals were grown by a visitor to the laboratory of The Svedberg, the Swedish Nobel Laureate in Chemistry 1926. Svedberg’s invention, the ultracentrifuge, evidently was a strong attractor for scientists from all over the world interested in sorting large organic molecules. So one of Bernal’s friends happened to pass by and saw the crystals and brought them back to him. This kind of story is by no means unique and shows the importance of scientific exchange and travel.

Anders Bárány

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