Dorothy  Crowfoot Hodgkin (1970) - Structure of Insulin

This is the first talk, but not the last, given by Dorothy Crowfoot Hodgkin at the Lindau meetings. Six years after her Nobel Prize in Chemistry, she is still occupied with the crystal structure of insulin, a project she started in Oxford in 1934, more than 35 years earlier! She had then just spent two years with J.D

Professor Kunitz, ladies and gentlemen. It is a very great pleasure to be here today and I must thank Professor Kunitz for all of his kind words and particularly for his very useful introduction to the subject of my particular talk. Insulin, as no doubt you all know, is a hormone that is responsible for part of the control of the metabolism of sugars. And in its absence the disease diabetes intervenes. It was first isolated in 1921 by a group in Toronto, Macleod, Banting and Best, of whom Best at the time was a graduate student aged 22. And they were able to isolate it following first of all the much earlier evidence that the active hormone occurred in the pancreas and that it was a protein. And so they were able to take effective measures against the protein being digested by the enzymes that occurred in the pancreas. The next stage in the story, as far as this story of mine is concerned, was the crystallisation of insulin in 1926 by Abel. Abel actually was professor at John’s Hopkins, aged 67 and near retirement when Professor Noyes produced a small sum of $10,000 and invited him with this to Pasadena for a year to try to crystallise insulin. And the $10,000 allowed him to collect a small group of graduate students to help him. And in the course of the year they obtained the first crystals of insulin and a picture of these is on the first slide. This first picture is taken from Abel’s notebook and you see he looked up mineralogical texts and was able to describe the crystals as trigonal from Dana rhombohedral class. Later he was able to obtain them looking somewhat more like the form that we usually see, little roms of very characteristic flat shape. There was some difficulty for two or three years over the crystallisation of insulin. Squib insulin crystallised and Lilly insulin didn’t. And this was traced to the occurrence in Squib insulin of a small amount of zinc, which is necessary for the appearance of this particular modification of insulin. The existence of zinc was shown by Scott in Toronto, it does also occur in the pancreas. Scott found that the same kinds of crystals would appear with certain other related metals. Now, once the zinc was found to occur and be necessary in 1934, of course all the different firms making insulin could obtain insulin crystals. And a small sample of insulin crystals was given to Sir Robert Robinson in Oxford by Boots when they first made it. And because he had no real intention of working on this subject himself, he gave them to me. I had then just come over from Cambridge where I had been working with Bernal and had been involved with him in taking x-ray photographs of the crystalline enzyme pepsin. And Robinson thought I might try to do the same, take photographs of insulin. So I studied this back history and tried the different methods that they had used to grow insulin crystals large enough for x-ray work. And I must say that one of the most exciting nights of my life was when I saw the first spots on a photograph produced by passing x-rays through a crystal of insulin. Now, the next picture shows you an x-ray photograph of an insulin crystal, very, very much better than the one that I first saw. But you can see the reflections here have a definite hexagonal pattern of intensities and a definite distance apart. And from the distance apart of this photograph, combined with others that cover the whole diffraction picture of insulin, one can calculate at first just the size of the repeating unit. The size varies a little, according to whether the crystals are wet or dry. And I will put up here the later measured value for the side of the rom of 49 Å and the angle 114½ degrees. The first calculation that one can make ... (laughter) The first calculation that one can make is what is the weight of protein in this particular volume defined by the unit rom, and allowing for some 30% of water of crystallisation, the weight is just round about 36,000. This seemed dramatically close to the weight of the protein molecule in solution found by the first experiments of Svedberg in the ultracentrifuge. He gave a weight of 35,000 as the molecular weight of insulin. I was a little bit concerned, I discussed the problem with Harington, who worked on insulin, that in fact these crystals are trigonal and that this weight should therefore be divided into three equal parts, And this brought an immediate letter from Freudenberg in Heidelberg, saying Svedberg doesn’t really measure a molecular weight, he measures a particle mass. And the amount of chemical change that inactivates insulin is so small as to suggest the molecular weight is much smaller than 36,000, in fact he gave an estimate of perhaps from 9,000 to 18,000, which of course was nearer to the possible 12,000. But, as the years went on, it became clear that the molecule of insulin was smaller still. There was evidence that the particle of 36,000 would break down in solution and gradually the evidence accumulated that the weight might even be not 12,000 but 6,000. Though that this was so was not really clear until, on the next slide, Fred Sanger found in detail the structure of insulin and I’m sorry this is a little bit small to read from a distance, as I realised when I looked at it a moment ago. But essentially Sanger showed that the insulin molecule consisted of two chains and the amino acids of which luckily you were shown larger pictures today, are here given their abbreviated names leucine, valine, tyrosine, alanine. And a definite order along these two chains, one of 21 residues, one of 30 residues, joined by disulphide bridges at particular points. And of course, as soon as this structure was produced, this chemical sequence, it became possible to synthesise insulin. And three different groups set out to synthesise insulin and succeeded, Zahn in Aachen, Katsoyannis in Pittsburgh and a group of Chinese scientists in Shanghai and Peking. And the next slide shows a little bit of what is involved in this process. This is taken from one of their papers, they all synthesised separate peptides, different choices in the different laboratories. And when they had synthesised the A chain and the B chain and the cysteine residues at the right points, they reduced to the SH form and then left them in solution, hopefully together, in the presence of air and some insulin formed. Not a good organic chemists synthesis, just hoping that nature would work and insulin would form out of these separate chains. But it worked to a small degree, the first products got by this reaction had only a few percent activity but out of them, by suitable manipulation as on the next slide, crystals of insulin could be obtained. Again, not perhaps such very good looking crystals, but you can see this very characteristic shape. These are taken from the Chinese paper. Now, so you might say we know the structure of insulin, but of course it’s a problem when one thinks of it, these two separated chains, how are they really disposed in three dimensions. And throughout this long period from the isolation of insulin and our first work, we really hoped to find the actual 3-dimensional arrangement of the insulin molecule in space. We grew very much better crystals than the first ones, these are actually very beautiful crystals taken from a paper by Schlichtkrull in Copenhagen, who had developed crystallisation techniques to a fine art because he used actual crystalline insulin, very finely crystalline insulin as the basis of a method for giving slow acting insulin to diabetic patients, the novo insulins. He also found that in these particular crystals there were in general two atoms of zinc per 36,000 molecular weight. How to find in detail the arrangement of the atoms in space given these crystals was in principle of course known when I started out in 1934. The next slide gives a letter, a little extract from a letter and I think Professor Ruzicka may recognise the writing, although the signature isn’t there. It’s J.D. Bernal. And he was very excited because of the x-ray photographs of insulin and he immediately suggested that one should change the zinc for other, heavier atoms. And the implication of this was that we should be able to calculate the actual electron density in the crystal if we could observe changes in the intensity produced by these substitutions and have an isomorphous series. Now, actually these are the substitutions that Scott had made in Toronto but the cadmium is rather little much heavier than zinc and the actual differences that I could see at that time were far too small to work on. Also the method was untried for very much simpler compounds and it seemed desirable to have some simpler subject from which to try out the calculation of the electron density by isomorphous replacement before we tackled insulin. The next slide just gives you, I think, the background relations involved the actual form of the calculation of the electron density in a crystal, at a particular point, FHKL being derived from our measurements. Both FHKL and the phase angle appropriate alpha depend upon the positions of the atoms in the crystal. And if one can vary amongst these atoms, that each has its appropriate scattering number, and introduce heavier atoms, one can formally solve for the phase angle and this of course was what we hoped to set out to do. And the first substance, I tried this on in a very simplified form because the certain parts of the distribution was centrosymmetrical which simplifies the phase relations was penicillin. And I think the next slide just shows you the look of the electron density in penicillin, set up in a way that we used here for the first time but has become the way that is used in protein crystallography today. We calculate the electron density, a series of figures at points over 3-dimensional space from the measured intensities of the x-ray diffraction effects. We join up, we plotted out on sheets, first of all in two dimensions, join contours of equal electron density to get representation of the atomic positions and so form a picture of actual individual atoms on sheets of transparent Perspex or glass or other material. And here of course you see separate atoms resolved and on the next slide the formula that you could write as a result of this vision of the individual atomic positions in space. And we were lucky that penicillin is at least a little bit connected, derived from a peptide kind of skeleton. In the case of insulin as with other proteins, although the diffraction pattern that you see may look marvellous to your eyes, it doesn’t really extend sufficiently far in space to resolve individual atoms. The next picture shows you the consequences of this, illustrated by a very simple molecule. Could I have the next one, please. If the space, in penicillin the actual pattern extended to about .8 of an Å resolution. This shows diketopiperazine seen at gradually reducing degrees of resolution. This being the stage at which most proteins reach. And at least a little bit better than the case of the insulin maps we were to calculate. You can see that some atoms almost appear individually, but in general there is a lack of resolution and one has to infer the positions of the atoms from the very characteristic shapes of the electron density peaks that one can calculate in a protein electron density map. Now, our real trouble with insulin turned out to be twofold. I must say I was trying to introduce heavy atoms into insulin crystals parallel with John Kendrew and Max Perutz at Cambridge in haemoglobin and myoglobin. And we had no single chemical point at which we could attach a heavy atom, as in the case of haemoglobin, but we thought, perhaps therefore we should follow the line found by Kendrew and try to get just heavy atoms to pass into the crystals by other means. And actually it was Carlyle working with Bernal who first produced the idea of floating them into the crystal by just soaking them into solution. So we tried a very great many experiments and we found it very difficult to find where the heavy atoms were. And here I have to start to go back a stage with my formulae. The first thing one can calculate is not of course the electron density, one can only begin to calculate the Patterson, taking the F2 values and obtaining a derived function of the electron density. Well, the next slide, I think, should show you a Patterson map for insulin, this is just a bit of the 3-dimensional Patterson function. And actually it’s quite interesting, we started by thinking we could know nothing at all from it, but you can see something from it. This is just part of the function and in this pattern you do see in fact very roughly plains of symmetry which don’t extend the whole way through the crystal. But a very complicated pattern. The implication of those plains of symmetry is shown in the next slide. It is that in insulin, in the unit cell we have in this 36,000 mass six molecules. These six molecules, of course three are arranged around the 3-fold axis, but the other triplet is arranged so that there’s a twofold axis relation approximately between them. And so over here the Patterson function, derived from this, shows plains of symmetry. The Patterson function is got by imagining you stand at each atom and put each atom in turn at the origin and plot the whole function round it, so it’s derived from it but much more complicated. At this point two things became obvious. First was that if there were only two zinc atoms in the crystal, as Schlichtkrull had found, they must lie on the 3-fold axis and that was one great help. And secondly that we would expect that other heavy atoms introduced into the crystal should have this characteristic pattern. And so if we did a difference map, taking, measuring the intensities of the crystal and the heavy atom, we should see this sort of pattern in the difference map. Now, the first point was quite alright, two zinc atoms on the 3-fold axis. The second turned out to be a small hair, they seldom if ever showed anything like the correct symmetry for reasons that are now obvious. The next slide I think just shows one of the difference Patterson’s of the heavy atoms, a very complicated looking one but the little peaks near the origin do imply that the heavy atom in this crystal has gone in near the 3-fold axis. Now, the heavy atom in this particular case was a very interesting one. It was got by taking zinc insulin crystals, leaving them over night in EDTA solution, this removed the zinc from the crystals and left us with crystals standing looking rather sorry for themselves but still giving x-ray diffraction effects. And if we then left them in lead over night, the lead went into the positions occupied by the zinc and also into positions represented by this map and into some others on the outside of the molecule. And I will now cut a very long story short of how the different heavy atom positions were found and take you essentially to the answer. So on the next slide I have first of all the positions found for four different, five different heavy atom containing crystals, plotted along the 3-fold axis over a unit of volume which covers a whole insulin hexamer. And you can see a lot of them come around the 3-fold axis. The pattern doesn’t have twofold symmetry, there seem to be two general sorts of positions, one near the 3-fold axis and one out on the edge of the molecule as we later found it. And our difficulty was the sorting out of this very complicated pattern of heavy atoms before we could calculate the phase relations and the 3-dimensional structure of insulin. But now we pass to the actual electron density map. So the actual calculation came through the middle of July last year and we plotted it out and drew it up. And I won’t show you the original map because we have drawn it all much better since then, but the next slides are taken from a little model, very like the penicillin model but representing the electron density as we calculated it over the insulin hexamer. And because it’s a large molecule and this hexamer, this is 30 Å deep and 46 Å across, the actual little blocks are broken up into 5 or 6. And I will just run the slides through so that you can imagine yourself looking at the molecule from top to bottom and thinking what you could see. The next, ... this is the top of it, looking a little bit empty, rather complicated set of chains, these are half a dozen sheets projected together. Now, on the next, could we pass on to the next one. Now you see we’re thickening up tremendously in one particular region, a lot of peaks coming together. And in this part there’s the beginning of the zinc atom and these three peaks are three peaks that are above it. And the next slide, it’s becoming a bit more understandable. Here’s the zinc here and now these three peaks are three peaks that are underneath it. And they seem to run into a very definite chain structure here with peaks coming off it at certain intervals. And at this point we began to be looking at Sanger’s sequence and thinking what we might be seeing. Because we knew that there was chemical evidence that the histidine groups of insulin interacted with the zinc. And so we looked at what would be near the two histidine residues and in one case, histidine 10, if we take this as the histidine and come on, on one side of it it goes to a serine coming back towards the zinc and on the other side it goes out to a leucine and here is a peak with a kind of umbrella end that could be a leucine. And from this point we started tracing through the chain. Now I’ll just show you the next two, this is passing below that particular point and here we come to a highly empty region in the middle of the crystal with chains coming in towards the central cavity. And this is the central cavity into which so many of the heavy atoms went in a somewhat random way in our substitution. And the next one passing down below this central point, we begin to see another similar chain, the histidine on the other side coming in, the leucine on the other side, the serine on the other side. And they don’t look absolutely the same but they’re sensibly the same sort of object. And then, down below that, the zinc with the other three little groups above it and the beginnings of the bottom of the molecule, the other side. So now you’ve passed through it all and in about a week we had traced very rapidly where we thought everything was in the insulin molecule. Then we’ve taken a year going through everything, not quite a year actually, it isn’t, it’s only about eight months, isn’t it, going through everything much more carefully. Comparing the electron density map directly with a much more accurately built model, a model 2 cm to the Å, which we could project directly into a map of the electron density at the same scale by a mirror device produced in Oxford by Professor Fred Richards from Yale when he was visiting there for which we call in Oxford Fred’s Folly, which doesn’t mean a folly in a foolish sense but because a folly is a special kind of little home or house, a delight you see for all of us who work with it. So on the next slide, I think I have a little bit showing you how closely you can in fact fit the appearance of the residues to the shape of the peaks, as they have come out in this 3-dimensional electron density map. And at the present moment we have passed the whole way over the molecule and recorded the positions in three dimensions to a first approximation for every atom in the molecule. So the next few slides, if I might have them, just show you the look of each chain in turn, all the time projected in the same direction along the 3-fold axis. And now this is one of the B chains of Sanger’s molecule and it starts up at that end, B1, which is a phenylalanine group and it runs in an extended form as far as this V10 histidine which comes into the zinc. And then it turns through three turns of a very good alpha helix. And then it runs right down and right up in another extended chain. It’s better that afterwards you look at the model because then you can see what's happening. You come along the back, you go into this alpha helix, straight down underneath and then you come up in a long chain right up here to the top again. And now the A chain, on the next slide, just sort of nestles in to the B chain, it just forms a little closed loop. You see starting here and going down there, just lying on the face of the B chain. And the disulphide links that link the two chains together, link them, one at this end to the alpha helix below and the other one at the other end to the other end of the alpha helix. So that the alpha helix, helical part of the B chain forms a kind of rigid skeleton on which the A chain lies. And now, over the other side, I’ll show you the other two molecules. This is the second molecule in the asymmetric unit. Again the B chain starting out a long stretch of extended chain, the alpha helix coming down here and then we’re seeing this long end of the B chain coming up on end. And on the next slide, the second A chain, again forming this small, very compact loop within the, over the surface of the B chain. And now you put these two together and in the next slide you have the same projection of the insulin dimer with the two molecules together. And I think you can begin to see that whereas this line is an approximate twofold axis, it isn’t by any means an exact twofold axis, that there are slight differences in the relative positions of the groups on either side of it. Now, the actual shape of this dimer, and I’m sorry that I haven’t got it here in bodily presence before you, is a rather elongated oval. The next slide shows you a view along the side of the dimer as seen in this more accurate model that we have in Oxford which the boys won’t let move away from Oxford, even to be shown at the Royal Society at the present, because they regard it as such a delicate object that has to be preserved in the exact form in which they have built it. But anyway here is one molecule and the second molecule packed together with the two zinc atoms along the 3-fold axis, each of which has directed at it a histidine residue. This is viewed from the direction of the zinc atoms and the next slide shows you the view from the outside of the molecule. Now, if you could, perhaps we might have a little dimming and the rest of it at this stage. This shows you that these two molecules are fitted together in a very intricate way. The main groups that pack together are non-polar residues but there is a very long region here where hydrogen bonds form between the extended ends of the B chain. This is the extended end from one molecule going up in this direction and this is the extended end of the other one coming down in this direction. And the hydrogen bonds form across here, you can see them in red so that this is part of an antiparallel pleated sheet. And it’s between the two insulin molecules. Now, the next slide shows this just drawn out so that you can see the way that it goes with the hydrogen bonds forming on either side of the twofold axis in this generally antiparallel pleated sheet form. But now, if we look onto the twofold axis, that is to say the way we’ve been looking most of the time, we can see that while these groups are quite nicely related, the individual residues are not. Could we have the next slide. This is looking onto it and now the residues that project are ones like here are the phenylalanines and really these phenylalanines to be related by the twofold axis, one should turn away in one direction and the other one the other direction. But in fact the second one turns across it in order to pack side by side nicely as phenyl groups like to do, disregarding this twofold symmetry. And up here again the valine groups don’t seem to have the same orientation and again it looks as if they just turn to fit nicely into one another, there’s a non-polar interaction at that point. And at the end we have the B13 glutamate ions going in to the centre and they are the ones which attract these heavy atoms into the central pool of the insulin molecule. Now, the next slide I think shows you, just to give you an impression, to go on from the dimer to the hexamer. This is a projection of all of the atoms in the unit cell of insulin as so far placed by us, that is to say the atoms belonging to the molecule. And you can see that these six insulin molecules have formed a very good spheroidal object. And these spheroidal objects pack together, in the next slide, in a way that just is clearly quite good close packing of, it’s actually cubic body centred close packing, but you can see the way these spherical objects, the insulin hexamers fit together in the crystal structure. So now we should think in more detail about the complications of this molecule and what it is doing in nature. And this is still a very great mystery. We have this very complicated arrangement of chains within the molecule which yet ends up you see producing a very remarkable smoothly spheroidal object. And this smoothly spheroidal object, it seems, does exist in the living body. Of course the processes by which the body makes insulin are certainly quite different from those used in the test tube. And to start with, evidence has been acquired very recently, that insulin is not synthesised in the body as two separate chains but by a single chain, proinsulin, as discovered by Steiner in Chicago. Could I have the next slide. This is the way that the body synthesises insulin. A single chain governed by the usual processes of no doubt genetic processes that lead to a single chain. And then at a point in the pancreas, when it is transferred from the site at which it is synthesised to the storage cells, the islet cells of Langerhans. A proteolytic enzyme chips off this very long peptide fragment that connects the two chains. There is a sort of curios point about this if one looks at the molecule because one might think that this connecting peptide had to bring certain parts of the molecule near together, actually these parts are very close together, the actual beginning of the A chain and the end of the B chain in space. The beginning of the A chain is just down about here and the end of the B chain here in the molecule, only about two residues apart. So that one feels that the whole of this long peptide isn’t necessary only for bringing the chain structure, for encouraging the particular folding of the chain that we have in the insulin molecule. There are very interesting points about proinsulin. It does seem that if you break the disulphide bridges in proinsulin, the chains form again much better than in insulin and perhaps the long chain provides some kind of a template on which the molecule lies, which encourages the correct form of the insulin molecule. Or it provides some kind of protection for the molecule in its transport to the storage site. Now, the next slide shows a picture of the actual storage of insulin in the islet cells and now this is taken actually from rat islet cells by Dr. Howell in Sussex. And I think that you can see that the little insulin granules look sensibly as if they were crystalline. They look like little crystals and indeed in some animals you can see quite large crystals. But here they have the form, very much the same form as the crystals that we have been working on. If slices of these little crystals viewed in higher power in the electron microscope, in the next slide, you can see a repeat distance across them. In some views you get a view of lines of molecules. And if you look at the size of the molecule and the distance across of these lines, the distance is about 50 Å, which is sensibly the side of the rhombohedral unit, the distance apart of repeating hexamers. So it seems almost certain that in the actual insulin, the islet cells, the insulin is stored in the zinc containing hexamers. But now the problem is what is it doing. And here I have to throw this open really to the audience. The next slide just shows some of the different kinds of biological processes in which insulin has been implicated by a large number of experiments. And of these, of course the original ones that seemed most important were ones involving the metabolism of glucose, and particularly possibly the transport of glucose through membranes. We invite observations on this molecule at this point. But I might just add one more piece of evidence to it. We thought it would be interesting to look into the actual position at which the insulin molecule appeared to be able to change in different species without losing its effect. That is to say to map the species differences in insulin following the same kinds of ideas that Dr. Synge was talking about earlier. So in the next slide I have, not all but quite a number, you can see that many of the residues are allowed to change. And when you look at the ones that don’t change they’re generally - well, here the cysteine hasn’t changed, the leucine hasn’t changed, A19 tyrosine, A21 asparagine hasn’t changed. But a tremendous lot of changes have been observed. In the next slide we have just got a little map showing where the invariant residues are in the molecule as we see it, this is a single molecule. And they’re very largely ones that seem to be involved in pulling the molecule into its actual confirmation. The cysteine residues of course, but also two or three leucines that are involved in, as you might say, the heart of the molecule. And then this leaves us with just one or two on the outside, and A19 tyrosine is one particularly, and the asparagine which are also invariant so far. The last slide just gives you a picture of the molecule, this molecule, as you look at it here, but drawn from the actual electron density map, the actual positions taken out of the electron density map. And it’s really to give you an impression of what an approaching reagent would be seeing, you see this face full of detail and one asks oneself what parts of it are important for the actual biological reaction. Is it a particular region on this face or is it the whole organisation and is it the monomer, a single insulin molecule, as Sanger believes, or the dimer, as they believe in York, or the hexamer, as we sometimes believe ourselves, when we see the very beautifully organised object that it is, with pockets in it that might carry things about, you know. But this is still to be found out. And before I leave this subject, I should say two things. There are other crystalline modifications of insulin, very interesting ones, which are being worked on at the moment. The orthorhombic form, which contains no zinc in Columbia, by Dr. Barbara Low. The monoclinic form, which contains hexamers as its asymmetric unit by Michael Rossmann in Purdue. And at the end I should also say that in this particular research the sum total of the co-workers, the part played by the co-workers, the sum total was much greater than the part played by the Professor, to take your words from you, Professor Ruzicka, and that I should mention particularly those who carried through the last stages of the analysis, it had rather a long history. Margaret Adam and Tom Blundell from Oxford, Guy Dodson from New Zealand, Eleanor Dodson from Australia – they met and married in Oxford – and Vijayan from Bangalore - and I must say, we partly chose him because his name meant ‘victory’. Thank you.

Professor Kunitz, sehr geehrte Damen und Herren. Es ist mir eine große Freude, heute hiersein zu können, und ich möchte mich bei Professor Kunitz für all seine freundlichen Worte bedanken, besonders für seine sehr nützliche Einleitung in das besondere Thema meines Vortrags. Insulin, wie Sie zweifellos alle wissen, ist ein Hormon, das für einen Teil der Steuerung des Stoffwechsels der Zucker verantwortlich ist. Wenn Insulin fehlt, kommt es zum Krankheitsbild des Diabetes. Best war damals erst ein 22 Jahre alter Doktorand. Es gelang ihnen, das Hormon zu isolieren, indem sie vor allem den viel früheren Hinweisen darauf folgten, dass das aktive Hormon in der Bauchspeicheldrüse vorkommt und dass es sich dabei um ein Protein handelt. Und so gelang es ihnen, effektive Messungen im Vergleich zu demjenigen Protein durchzuführen, das von den in der Bauchspeicheldrüse vorkommenden Enzymen verdaut wird. Das nächste Stadium in der Geschichte, sofern meine eigene Geschichte damit zusammenhängt, war die Kristallisation von Insulin im Jahre 1926 durch Abel. Abel war damals Professor an der John Hopkins Universität und 67 Jahre alt, kurz vor seiner Emeritierung. Professor Noyes brachte eine kleine Summe von $10,000 auf und lud ihn damit ein, für ein Jahr nach Pasadena zu kommen und zu versuchen, Insulin zu kristallisieren. Die $10,000 ermöglichten es ihm, eine kleine Gruppe von Doktoranden zusammenzustellen, die ihm dabei helfen sollten. Im Laufe dieses Jahres gelang ihnen die Gewinnung der ersten Insulinkristalle. Ein Bild dieser Kristalle sehen Sie auf dem ersten Dia. Dieses erste Dia ist eine Aufnahme von Abels Notizbuch. Wie Sie sehen, schlug er mineralogische Texte nach und konnte die Kristalle nach der Klassifikation von Dana als trigonal und rhomboedrisch beschreiben. Später gelang es ihm, Kristalle zu gewinnen, die derjenigen Form ähnlicher waren, die wir normalerweise sehen: kleine Rhomben von charakteristisch flacher Gestalt. Die Kristallisation von Insulin bereitete zwei oder drei Jahre lang Probleme. Squib-Insulin bildete Kristalle, und für Lilly-Insulin galt dies nicht. Dies wurde darauf zurückgeführt, dass in Squib-Insulin eine kleine Menge Zink vorhanden ist, was für das Auftreten dieser besonderen Modifikation von Insulin erforderlich ist. Das Vorhandensein von Zink wurde von Scott in Toronto bewiesen. Es kommt ebenfalls in der Pankreas vor. Scott stellte fest, dass sich dieselbe Art von Kristallen ergab, wenn man bestimmte verwandte Metalle verwendete. Nachdem man 1934 festgestellt hatte, dass Zink in Insulin vorkommt und zur Kristallbildung notwendig ist, gelang es natürlich all den verschiedenen Unternehmen, die Insulin produzierten, Insulinkristalle herzustellen. Eine kleine Probe mit Insulinkristallen wurde Sir Robert Robinson in Oxford von Boots gegeben, als sie mit ihrer Herstellung begannen. Und da er nicht wirklich die Absicht hatte, selbst über dieses Thema zu arbeiten, gab er die Probe mir. Ich war damals soeben erst von Cambridge gekommen, wo ich mit Bernal gearbeitet hatte. Ich hatte mit ihm Röntgenaufnahmen von Kristallen des Enzyms Pepsin erstellt, und Robinson dachte, ich könnte versuchen, dasselbe mit Insulin durchzuführen: Bilder seiner Kristalle aufnehmen. Also studierte ich die Vorgeschichte und erprobte die verschiedenen Methoden, die sie verwendet hatten, um Insulinkristalle wachsen zu lassen, die groß genug für Röntgenaufnahmen waren. Ich muss gestehen, dass es eine der aufregendsten Nächte meines Lebens war, als ich die ersten Konturen eines Bildes sah, das dadurch entstanden war, dass Röntgenstrahlen durch ein Insulinkristall passierten. Nun, auf dem nächsten Dia sehen Sie eine Röntgenaufnahme eines Insulinkristalls, die sehr, sehr viel besser ist als diejenige, die ich zuerst sah. Doch Sie können erkennen, dass diese Spiegelungen hier ein klar definiertes, hexagonales Intensitätsmuster und feste Abstände haben, und aus den Abständen auf diesem Foto kann man mit Hilfe von anderen Aufnahmen, die das gesamte Brechungsmuster von Insulin abdecken, zunächst lediglich Größe der sich wiederholen Untereinheit des Kristalls berechnen. Die Größe variiert ein wenig, je nachdem, ob die Kristalle feucht oder trocken sind. Ich werde hier oben den zuletzt gemessenen Wert von 49 Angström für die Seite des Rhombus angeben und den Winkel als 114,5 Grad. Die erste Berechnung, die man anstellen kann, versucht die Frage zu beantworten, wie schwer das Proteins in diesem besonderen, durch den Einheitsrhombus definierten Volumen ist. Wenn man von einem Wassergehalt von 30 % im Kristall ausgeht, entspricht das Gewicht in etwa 36.000. Dies schien sehr, sehr nahe an dem Wert für das Gewicht des Proteinmoleküls in Lösung zu liegen, der in den ersten Experimenten von Svedberg in der Ultrazentrifuge gefunden wurde. Er gab als Molekulargewicht von Insulin einen Wert von 35.000 an. Ich diskutierte die Sache mit Harington, der über Insulin arbeitete. Was mir Sorgen machte, war die Tatsache, dass diese Kristalle trigonal waren und dass dieses Gewicht daher durch drei geteilt werden sollte (12.000). Doch ich veröffentlichte das Molekulargewicht als 35.000, was möglicherweise durch drei zu teilen sei. Hierauf erhielt ich sogleich einen Brief von Freudenberg in Heidelberg, der behauptete, dass Svedberg in Wirklichkeit kein Molekulargewicht messe, sondern die Masse eines Partikels. Und das Maß der chemischen Veränderung, durch das Insulin deaktiviert wird, ist so gering, dass dies ein wesentlich geringeres Molekulargewicht als 36.000 nahelegt. Tatsächlich gab er einen geschätzten Wert von 9.000 bis 18.000 an, der natürlich näher bei dem möglichen Wert von 12.000 lag. Im Laufe der Jahre wurde jedoch klar, dass das Insulinmolekül noch kleiner war. Es gab Hinweise darauf, dass das Teilchen mit dem Gewicht von 36.000 in Lösung zerfällt, und nach und nach sammelte sich immer mehr Material an, das darauf hinwies, dass das Gewicht nicht 12.000, sondern möglicherweise nur 6.000 betrug. Dass sich dies jedoch so verhielt, wurde allerdings erst klar, als Fred Sanger – auf dem nächsten Dia – die Detailstruktur des Insulins aufklärte. Bitte entschuldigen Sie, dass dies etwas zu klein ist, um aus größerer Entfernung lesbar zu sein, wie mir klar wurde, als ich es mir vor Kurzem ansah. Im Wesentlichen bewies Sanger, dass das Insulinmolekül aus zwei Ketten besteht. Die Aminosäuren, von denen Sie heute glücklicherweise bereits größere Bilder gesehen haben, sind hier nur mit ihren abgekürzten Namen angegeben: Leucin, Valin, Tyrosin und Alanin. Er fand auch eine feste Ordnung entlang dieser beiden Ketten, von denen eine aus 21 und die andere aus 30 Resten besteht. Sie sind an bestimmten Stellen durch Disulfidbrücken miteinander verbunden. Sobald diese Struktur, diese chemische Sequenz, aufgeklärt war, wurde es natürlich möglich, Insulin auch künstlich herzustellen. Drei verschiedene Arbeitsgruppen stellten sich die Synthese von Insulin zur Aufgabe und hatten damit Erfolg: Zahn in Aachen, Katsoyannis in Pittsburgh und eine Gruppe chinesischer Wissenschaftler in Shanghai und Peking. Auf dem nächsten Dia sehen Sie einiges, um das es bei diesem Prozess geht. Dies stammt aus einem ihrer Aufsätze. Sie alle synthetisieren separate Peptide. In verschiedenen Labors traf man jeweils eine unterschiedliche Auswahl. Und nachdem sie die A- und die B-Kette und die Cysteinreste an den richtigen Stellen synthetisiert hatten, reduzierten Sie sie zur SH-Form und ließen sie dann, in Gegenwart von Luft und etwas gebildetem Insulin, in Lösung zusammen. In der organischen Chemie entspricht dies keiner guten Synthesemethode: Sie hoffen einfach, dass die Natur ihren Weg gehen und dass aus diesen separaten Ketten Insulin entstehen würde. Doch es gelang ihnen innerhalb enger Grenzen. Die ersten durch diese Reaktion hergestellten Produkte wiesen nur eine Aktivität von wenigen Prozent auf, doch ließen sich aus ihnen mit Hilfe geeigneter Manipulation – wie auf dem nächsten Dia dargestellt – Insulinkristalle gewinnen. Auch dies waren vielleicht nicht die schönsten Kristalle, doch Sie können diese charakteristische Form erkennen. Diese Aufnahmen stammen aus dem von den Chinesen veröffentlichten Aufsatz. Nun könnten Sie vielleicht meinen, dass wir die Struktur von Insulin kennen. Sie stellt jedoch ein Problem dar, wenn man über die Frage nachdenkt: Wie sind diese beiden separaten Ketten nun tatsächlich räumlich angeordnet? Und während dieser ganzen langen Zeit seit der Isolierung von Insulin und unseren anfänglichen Arbeiten hofften wir darauf, dass es uns gelingen würde, die räumliche Struktur des Insulinmoleküls aufzuklären. Es gelang uns, wesentlich bessere Kristalle als die ersten wachsen zu lassen. Dies sind wirklich sehr schöne Kristalle aus einem Aufsatz von Schlichtkrull in Kopenhagen. Er hatte die Kristallisationsmethode zu einer hohen Kunst entwickelt, da er kristallines Insulin als Grundlage einer Methode verwendete, mit der man Diabetikern langsam wirkende Insuline, sogenannte Novo-Insuline, verabreichen konnte. Er stellte außerdem fest, dass sich in diesen besonderen Kristallen im Allgemeinen je zwei Atome Zink für ein Molekulargewicht von 36.000 fanden. Als ich 1934 mit meiner Arbeit begann, war im Prinzip bekannt, wie man die Einzelheiten der räumlichen Anordnung der Atome in diesen Kristallen ermittelt. Auf dem nächsten Dia sehen Sie einen kurzen Ausschnitt aus einem Brief, und ich glaube, Professor Ruzicka wird die Handschrift möglicherweise erkennen, obwohl die Unterschrift fehlt. Er stammt aus einem Brief von Bernal. Er war sehr enthusiastisch, was die Röntgenaufnahmen von Insulin betraf. Er schlug sogleich vor, man solle das Zink gegen andere, schwerere Atome austauschen. Dies sollte es ermöglichen – wenn man die Änderungen der Intensität beobachten könnte, die sich durch diese Substitutionen ergeben würden und eine isomorphe Reihe hätte – die tatsächliche Elektronendichte in dem Kristall zu berechnen. Nun, dies sind die Substitutionen, die Scott in Toronto vorgenommen hatte, doch Kadmium ist nur wenig schwerer als Zink, und die tatsächlichen Unterschiede, die ich damals beobachten konnte, waren zu klein, um damit arbeiten zu können. Außerdem war die Methode für wesentlich einfachere Verbindungen noch unerprobt, und es schien wünschenswert, eine einfachere Verbindung zugrunde zu legen, an der man die Berechnung der Elektronendichte durch isomorphe Substitution ausprobieren konnte, ehe wir sie auf Insulin anwendete. Auf dem nächsten Dia sehen Sie, glaube ich, die Hintergrundbeziehungen, die in die tatsächliche Form der Berechnung der Elektronendichte in einem Kristall, an einer bestimmten Stelle, eingehen, wobei FHKL aus unseren Messungen abgeleitet wird. Sowohl FHKL als auch der passende Phasenwinkel Alpha hängen von den Positionen der Atome im Kristall ab. Und wenn man diese Atome variieren kann, sodass jedes seine entsprechende Streuungszahl hat, und schwerere Atome einfügt, kann man den Phasenwinkel formal berechnen. Dies war es natürlich, von dem wir hofften, es würde uns gelingen. Die erste Substanz, für die ich dies in einer vereinfachten Form versuchte Auf dem nächsten Dia sehen Sie, glaube ich, einfach eine Darstellung der Elektronendichte von Penizillin. Sie ist hier auf eine Weise wiedergegeben, die von uns erstmals verwendet wurde, später aber zu der Darstellungsweise wurde, die heute in der Proteinkristallographie eingesetzt wird. Wir berechnen die Elektronendichte, eine Reihe von Werten an Punkten des dreidimensionalen Raumes, aus den gemessenen Intensitäten der Röntgenstrahlungseffekte. Wir verbanden die Werte, trugen sie auf Papierbögen auf, zunächst zweidimensional, verbanden Konturen gleicher Elektronendichte, um Darstellungen der Atompositionen zu erhalten, und ließen auf diese Weise auf Schichten aus transparentem Plastik, Glas oder einem anderen Material ein Bild der realen Einzelatome entstehen. Hier sehen Sie natürlich die Auflösung einzelner, separater Atome und auf dem nächsten Dia die Formel, die wir als Ergebnis dieser Ansicht der räumlichen Position einzelner Atome niederschrieben. Wir hatten Glück, da Penizillin zumindest ein wenig ähnlich ist, abgeleitet von einer Art von Peptidskelett. Im Falle von Insulin – wie bei anderen Proteinen – reicht das Beugungsmuster, obwohl es wunderschön aussieht, im Raum nicht weit genug, um einzelne Atome erkennbar zu machen. Auf den nächsten Bildern sehen Sie anhand eines sehr einfachen Moleküls die Konsequenzen, die sich hieraus ergeben. Könnte ich bitte das nächste Dia haben? Die räumliche Ausdehnung des Musters betrug für Penizillin etwa 0,8 Angström. Dieses Dia zeigt Di-Keto-Piperazin in einer Reihe allmählich abnehmender Auflösungsgrade, wobei dies das Stadium ist, das von den meisten Proteinen erreicht wird. Zumindest ist es ein wenig besser als im Fall der Insulinkarten, die von uns ausgerechnet werden sollten. Sie können erkennen, dass fast sogar Einzelatome sichtbar werden, doch im Allgemeinen ist die Auflösung unzureichend, und man muss die Position der Atome aus den sehr charakteristischen Gestalten der Spitzen der Elektronendichte erschließen, die man in einer Karte der Proteinelektronendichte errechnen kann. Nun, unsere tatsächlichen Probleme mit Insulin waren zweifach. Ich muss erwähnen, dass ich versuchte – parallel zu John Kendrew und Max Perutz in Cambridge, die dies für Hämoglobin und Myoglobin versuchten – Schwermetalle in die Insulinkristalle einzufügen. Und wir hatten, anders als im Falle von Hämoglobin, keinen einzelnen chemischen Ort, an dem wir ein schweres Atom anfügen konnten. Doch wir dachten, dass wir daher vielleicht der Vorgehensweise folgen sollten, die von Kendrew gefunden worden war, und dass wir versuchen sollten, Schwermetalle mit anderen Mitteln in die Kristalle zu bekommen. Tatsächlich war es Carlyle, der zusammen mit Bernal arbeitete, der zuerst die Idee vorbrachte, sie dadurch in die Kristalle zu bekommen, dass man einfach eine Lösung mit ihnen durchtränkt. Wir führten also sehr viele Experimente durch, und es fiel uns sehr schwer, herauszufinden, wo sich die Schwermetalle befanden. An dieser Stelle muss ich mit meiner Formel einen Schritt zurückgehen. Das erste, was man berechnen kann, ist natürlich nicht die Elektronendichte: Man kann nur die Patterson-Karte berechnen, indem man anhand der F2–Werte eine abgeleitete Funktion für die Elektronendichte erhält. Das nächste Dia sollte Ihnen, denke ich, eine Patterson-Karte für Insulin zeigen. Dies ist lediglich ein Teil der dreidimensionalen Patterson-Funktion. Recht interessant ist Folgendes: Wir dachten anfänglich, wir könnten der Karte keinerlei Hinweise entnehmen, in Wirklichkeit kann man ihr jedoch allerdings einiges entnehmen. Dies ist nur ein Teil der Funktion, und in diesem Muster sehen Sie tatsächlich in sehr groben Umrissen Symmetrieebenen, die sich nicht durch das ganze Kristall erstrecken. Es ist jedoch ein sehr kompliziertes Muster. Die Konsequenz dieser Symmetrieebenen ist auf dem nächsten Dia zu sehen. Sie besteht darin, dass wir bei Insulin in der Einheitszelle in dieser Masse von 36.000 sechs Moleküle haben. Von diesen sechs Molekülen sind natürlich jeweils drei um eine dreiteilige Achse angeordnet und diese beiden Dreiergruppen sind so angeordnet, dass sie zu beiden Seiten einer Achse liegen. Daher zeigt die Patterson-Funktion, die hiervon abgeleitet ist, Symmetrieebenen. Man erhält die Patterson-Funktion, indem man sich vorstellt, man stehe in der Position der einzelnen Atome und stelle jedes Atom der Reihe nach ins Zentrum und trage die gesamte Funktion darum ab. Sie ist also davon abgeleitet, jedoch sehr viel komplizierter. An dieser Stelle werden zwei Dinge offensichtlich. Erstens: Wenn es nur zwei Zinkatome in dem Kristall gibt, wie Schlichtkrull herausgefunden hatte, so müssen sie auf der dreiteiligen Achse liegen, und dies war eine sehr große Hilfe. Und zweitens: Wir sollten erwarten, dass andere in dieses Kristall eingefügte schwere Atome ebenfalls dieses charakteristische Muster ergeben sollten. Wenn wir also eine Differenzkarte erstellen würden, und die Intensitäten des Kristalls und des schweren Atoms messen würden, sollten wir diese Art von Muster in der Differenzkarte beobachten können. Nun, der erste Punkt ging in Ordnung: zwei Zinkatome auf einer dreiteiligen Achse. Der zweite erwies sich als schwierig: Aus Gründen, die mittlerweile offensichtlich sind, zeigten sie nur selten die richtige Symmetrie. Das nächste Dia zeigt, glaube ich, einfach einen der Unterschiede der Patterson-Funktionen der schweren Atome. Es sieht sehr kompliziert aus, aber die kleinen Spitzen in der Nähe des Ursprungs geben zu erkennen, dass das schwere Atom in diesem Kristall in der Nähe der dreiteiligen Achse in das Kristall gelangt ist. Nun, das schwere Atom war in diesem Fall ein sehr interessantes. Wir erhielten dieses Bild, indem wir Zinkinsulinkristalle nahmen und sie über Nacht in EDTA-Lösung ließen. Hierdurch wurde das Zink aus den Kristallen entfernt. Wir erhielten auf diese Weise recht traurig aussehende Kristalle, die jedoch immer noch Beugungseffekte von Röntgenstrahlen zeigten. Wenn wir sie dann über Nacht in Blei stehen ließen, trat das Blei an die Stellen, die vorher das Zink besetzt hatte, und außerdem an Stellen, die diese Karte zeigt, sowie an weitere auf der Außenseite des Moleküls. Um die lange Geschichte darüber, wie die Positionen der verschiedenen schweren Atome gefunden wurden, abzukürzen, gebe ich Ihnen im Wesentlichen sogleich die Antwort auf diese Frage. Auf dem nächsten Dia sehen Sie zunächst die Positionen, die wir für vier verschiedene, fünf verschiedene schwere Atome in Kristallen gefunden haben. Sie sind entlang der dreiteiligen Achse über eine Volumeneinheit abgetragen, die ein ganzes Insulin-Hexamer abdeckt. Und wie Sie sehen, legen sich viele von ihnen um die dreiteilige Achse. Das Muster weist keine zweiteilige Symmetrie auf. Es scheint zwei generelle Arten von Positionen zu geben: eine in der Nähe der dreiteiligen Achse und eine weitere am Rande des Moleküls, wie wir später herausfanden. Unsere Schwierigkeit bestand darin, diese sehr komplizierten Muster schwerer Atome zu verstehen, bevor wir die Phasenbeziehungen und die dreidimensionale Struktur von Insulin berechnen konnten. Doch nun wenden wir uns der eigentlichen Elektronendichtekarte zu. Die Ergebnisse der tatsächlichen Berechnungen erhielten wir im Juli letzten Jahres. Wir druckten sie aus und erstellten eine bildliche Darstellung von ihnen. Die ursprüngliche Karte werde ich Ihnen nicht zeigen, weil wir zwischenzeitlich eine wesentlich bessere erstellt haben. Die nächsten Dias wurden von einem kleinen Modell aufgenommen, das dem Penizillin-Modell zwar sehr ähnlich sah, die Elektronendichte jedoch so darstellte, wie wir sie für den Insulin-Hexamer errechnet hatten. Und da es sich um ein großes Modell dieses Hexamers handelt sind die kleinen Blöcke in fünf oder sechs Teile zerlegt. Ich werde die Dias einfach durchlaufen lassen, damit sie sich vorstellen können, sie schauten sich das Molekül von oben nach unten an und was sie dabei sehen könnten. Das nächste Dia … Dies ist der obere Rand, der ein wenig leer aussieht. Es zeigt einen recht komplizierten Satz von Ketten. Es handelt sich hierbei um die kombinierte Projektion von einem halben Dutzend Einzeldarstellungen. Auf dem nächsten Dia … könnten wir zum nächsten Dia weitergehen? Wir erkennen jetzt, dass sich in einem bestimmten Bereich eine extreme Verdickung ergibt. An dieser Stelle kommen sehr viele Spitzen zusammen, und in diesem Teil befindet sich der Beginn des Zinkatoms, und bei diesen drei Spitzen handelt es sich um Spitzen, die höher liegen. Auf dem nächsten Dia wird die Sache etwas verständlicher. Hier befindet sich das Zinkatom, und diese drei Spitzen sind jetzt Spitzen, die sich darunter befinden. Und sie scheinen hier in eine sehr wohldefinierte Kettenstruktur auszulaufen, aus der in bestimmten Intervallen Spitzen hervortreten. An diesem Punkt begannen wir uns die Sequenz von Sanger anzuschauen und zu entschlüsseln, was wir uns da wohl anschauen mochten, denn wir wussten, dass es chemische Hinweise darauf gibt, dass die Histidingruppen des Insulins mit Zink in Wechselwirkung traten. Also schauten wir nach, was sich in der Nähe der beiden Histidinreste befinden würde, und in einem Fall – bei Histidin 10 –, wenn wir dies als das Histidin ansehen, geht es auf einer Seite zu einem Serin weiter, das wieder auf das Zink zurückkehrt, und auf der anderen Seite geht es zu einem Leucin weiter. Und hier befindet sich eine Spitze mit einem schirmartigen Ende, bei dem es sich um ein Leucin handeln könnte. Ab diesem Punkt begannen wir die Kette zu verfolgen. Ich zeige Ihnen jetzt einfach die nächsten beiden Dias: diese bewegt sich unter diesem besonderen Punkt hindurch und hier kommen wir an einen sehr leeren Bereich in der Mitte des Kristall, in dem Ketten auf den zentralen Hohlraum zukommen. Hierbei handelt es sich um den zentralen Hohlraum, in den während unserer Substitution auf eher zufällige Weise so viele der schweren Atome gelangten. Und die nächste bewegt sich unterhalb dieses Mittelpunkts nach unten. Wir sehen eine andere ähnliche Kette. Das Histidin kommt auf der einen Seite herein, dass Leucin auf der anderen und das Serin wieder auf einer anderen. Sie sehen zwar nicht absolut gleich aus, sind sinnvollerweise jedoch als dieselbe Art von Objekt anzusehen. Und dann, unterhalb davon, sehen wirdas Zink mit den anderen drei kleinen Gruppen darüber und den Beginn des unteren Randes des Moleküls, der anderen Seite. Nun untersuchten wir das gesamte Molekül, und nur etwa einer Woche hatten wir uns in großer Eile ein Bild davon verschafft, wo sich nach unserer Meinung die einzelnen Teile des Insulinmoleküls befanden. Dann nahmen wir uns ein Jahr Zeit, alles noch einmal durchzugehen - in Wirklichkeit nicht ganz ein Jahr, sondern nur acht Monate. Wir gingen alles noch einmal sehr viel sorgfältiger durch. Wir verglichen die Elektronendichtekarte mit einem wesentlich exakter gebauten Modell, einem Modell mit einem Maßstab von 2 Zentimeter zu 1 Angstöm, das wir direkt auf eine Karte der Elektronendichte im selben Maßstab projizieren konnten, und zwar mithilfe eines Spiegelgeräts, das in Oxford von Professor Fred Richards aus Yale bei einem Besuch gebaut worden war. Wir nannten es deshalb in Oxford “Fred’s Folly”, wobei wir mit “Folly” nicht Unsinn meinten, sondern ein Folly ist eine besondere Art von kleinem Haus. Es ist, wie Sie sehen, eine große Freude für alle von uns, die damit arbeiten. Gehen wir also weiter zum nächsten Dia. Ich glaube ich habe hier eine kleine Darstellung, die zeigt, wie genau man das Erscheinungsbild der Reste mit den Formen der Spitzen abgleichen kann, wie sie sich in dieser dreidimensionalen Elektronendichtekarte darstellen. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt haben wir das gesamte Molekül untersucht und die räumlichen Positionen jedes Atoms des Moleküls in einer ersten Näherung bestimmt. Die nächsten beiden Dias, wenn ich sie bitte haben könnte, zeigen Ihnen das Aussehen der einzelnen Ketten, in jedem Fall in dieselbe Richtung entlang der dreiteiligen Achse projiziert. Dies ist eine der B-Ketten von Sangers Molekül. Sie beginnt an diesem Ende, B1, bei dem es sich um eine Phenylalaningruppe handelt. Sie erstreckt sich in einer erweiterten Form bis zu diesem V10-Histidin, das auf das Zink zuläuft. Anschließend windet sie sich in drei Umdrehungen einer sehr exakten Alpha-Helix, und dann verläuft sie direkt nach unten und in einer anderen erweiterten Kette wieder nach oben. Es ist besser, wenn Sie sich später das Modell ansehen, weil man dann erkennt, was geschieht. Die Kette kommt die Rückseite entlang, geht in diese Alpha-Helix über, direkt nach unten, und kommt dann in einer langen Kette hier wieder nach oben. Und die A-Kette, auf dem anderen Dia, schmiegt sich sozusagen an die B-Kette an: Sie bildet einfach eine kleine geschlossene Schleife. Wie Sie sehen, beginnt sie hier, geht nach dort unten und liegt einfach auf der Oberfläche der B-Kette auf. Und die Disulphidverbindungen, die die beiden Ketten miteinander verbinden, verbinden sie einmal an diesem Ende mit der Alpha-Helix darunter und die andere am anderen Ende mit dem anderen Ende der Alpha-Helix, sodass die Alpha-Helix und der helikale Teil der B-Kette eine Art starres Gerüst bilden, auf dem die A-Kette liegt. Und nun, auf der anderen Seite, werde ich Ihnen die beiden anderen Moleküle zeigen. Dies ist das zweite Molekül in der asymmetrischen Einheit. Wieder beginnt die B-Kette als langes Stück einer erweiterten Kette. Die Alpha-Helix kommt hier nach unten, und dann sehen wir dieses lange Ende der B-Kette am Ende hier nach oben kommen. Und auf dem nächsten Dia sehen Sie die zweite A-Kette. Auch sie bildet wieder diese kleine, sehr kompakte Schleife auf der Oberfläche der B-Kette. Und jetzt setzen wir die beiden Ketten zusammen, und im nächsten Dia haben Sie dieselbe Projektion des Insulin-Dimers, in dem beide Moleküle verbunden sind. Ich glaube, man beginnt zu erkennen, dass – während diese Linie in etwa eine zweiteilige Achse darstellt – es keineswegs eine exakt zweiteilige Achse ist, dass es geringfügige Unterschiede in den relativen Positionen der Gruppen zu beiden Seite der Linie gibt. Nun, die tatsächliche Form dieses Dimers – und ich bedauere, dass ich Ihnen kein konkretes Modell zeigen kann – ist ein längliches Oval. Auf dem nächsten Dia sehen Sie eine Ansicht entlang der Seite des Dimers, wie man es in diesem exakteren Modell sehen kann, das wir in Oxford haben. Die Jungs erlauben es mir nicht, es aus Oxford irgendwohin mitzunehmen, noch nicht einmal zur Aufstellung in der zur Zeit stattfindenden Ausstellung in der Royal Society, da sie es für ein so empfindliches Objekt halten, das genau in der Form erhalten bleiben muss, in der sie es gebaut haben. Hier jedenfalls ist ein Molekül und das zweite Molekül mit zwei Zinkatomen entlang der dreiteiligen Achse, von denen jedes einen Histidinrest auf die Achse gerichtet hat. Dies ist die Ansicht aus der Richtung der Zinkatome, und das nächste Dia zeigt Ihnen die Außenansicht des Moleküls. Könnten wir, wenn möglich, den Raum vielleicht ein wenig verdunkeln und jetzt die restlichen Dias zeigen? Dies zeigt Ihnen, dass diese beiden Moleküle auf sehr komplizierte Weise zusammengesetzt sind. Die Hauptgruppen, die dicht beieinanderliegen, sind nicht-polare Reste, doch es gibt hier einen sehr langen Bereich, in dem sich Wasserstoffbrücken zwischen den erweiterten Enden dieser B-Kette bilden. Dies ist das erweiterte Ende eines Moleküls, das in diese Richtung nach oben verläuft, und dies das erweiterte Ende eines Moleküls, das aus dieser Richtung von oben kommt. Und die Wasserstoffbrücken bilden sich hier aus. Sie können sie in rot erkennen, sodass dies Teil eines anti-parallel gefalteten Blattes ist. Und es befindet sich zwischen den beiden Insulinmolekülen. Nun, auf dem nächsten Dia sehen Sie dies auseinandergezogen. So können Sie erkennen, auf welche Weise sich die Wasserstoffbrücken in dieser allgemein anti-parallel gefalteten Form auf beiden Seiten der zweiteiligen Achse ausbilden. Schauen wir nun jedoch in die zweiteilige Achse, d.h. in die Richtung, in die wir größtenteils geschaut haben, so können wir erkennen, dass – obwohl diese Gruppen sehr schön zueinander in Beziehung stehen – dies für die einzelnen Reste nicht gilt. Könnten wir bitte das nächste Dia haben? Dies zeigt eine Sicht von oben, und nun sind die herausragenden Reste diesen hier ähnlich. Es sind Phenylalanine und es sind diese Phenylalanine, die durch die zweiteilige Achse zueinander in Beziehung gesetzt werden: Eines sollte sich in eine Richtung wegdrehen und das andere in die andere Richtung. Tatsächlich dreht sich das zweite jedoch über die Achse, um sich dicht neben das andere zu legen, wie es Phenylgruppen gerne tun, und es ignoriert die zweiteilige Symmetrie. Und auch hier oben scheinen die Valin-Gruppen nicht dieselbe Ausrichtung zu haben und es sieht wieder so aus, als drehten sie sich einfach, um gut ineinander zu passen. An dieser Stelle kommt es zu einer nicht-polaren Wechselwirkung. Und am Ende haben wir die B13-Glutamationen, die in das Zentrum reichen. Es sind diese Ionen, die die schweren Atome in den zentralen Hohlraum des Insulinmoleküls ziehen. Nun, das nächste Dia zeigt Ihnen, glaube ich – um Ihnen einen Eindruck davon zu geben – wie man vom Dimer zum Hexamer gelangt. Dies ist eine Projektion aller Atome in der Einheitszelle von Insulin, d.h. der zu dem Molekül gehörenden Atome, sofern sie von uns lokalisiert werden konnten. Sie können erkennen, dass diese sechs Insulinmoleküle ein sehr gleichförmiges, kugeliges Objekt gebildet haben. Und diese kugeligen Objekte schließen sich dicht zusammen. Auf dem nächsten Dia sehen Sie, dass dies auf eine Weise geschieht, die einen ziemlich engen Zusammenschluss darstellt. Tatsächlich handelt es sich um eine kubische, raumzentrierte Zusammenballung, aber Sie können erkennen, wie diese sphärischen Objekte, die Insulin-Hexamere, in der Kristallstruktur zusammenpassen. Nun sollten wir detaillierter über die Komplikationen diese Moleküls nachdenken und darüber, wie seine natürliche Funktionsweise aussieht. Diese ist nach wie vor ein sehr großes Rätsel. Wir haben diese höchst komplizierte Anordnung von Ketten innerhalb des Moleküls, aus denen – wie Sie sehen – dennoch ein sehr bemerkenswert glattes, kugeliges Objekt entsteht. Und es scheint, dass dieses glatte, kugelige Objekt im lebenden Organismus vorkommt. Natürlich sind die Prozesse, mit denen der Körper Insulin herstellt, mit Sicherheit sehr verschieden von denjenigen, die im Reagenzglas verwendet werden. Zunächst haben sich in allerjüngster Zeit Hinweise darauf ergeben, dass Insulin im Körper nicht in Form von zwei separaten Ketten synthetisiert wird, sondern als einzelne Kette, als Proinsulin, wie Steiner in Chicago herausfand. Könnte ich bitte das nächste Dia haben? Dies ist der Weg, auf dem der Körper Insulin synthetisiert: eine einzelne Kette, die durch die üblichen Prozesse von zweifellos genetischer Art gesteuert wird, die in einer Einzelkette resultieren. Dann spaltet ein proteolytisches Enzym an einer Stelle in der Bauchspeicheldrüse dieses sehr lange Peptidfragment ab, das die beiden Ketten verbindet. Hiermit hat es eine merkwürdige Bewandtnis, wenn man das Molekül anschaut. Denn man könnte meinen, dass dieses verbindende Peptid bestimmte Teile des Moleküls nahe zusammenbringen musste. Tatsächlich befinden sich diese Teile räumlich sehr nahe beieinander: der Anfang der A-Kette und das Ende der B-Kette. Der Beginn der A-Kette befindet sich in etwa hier unten und das Ende der B-Kette hier im Molekül, nur etwa zwei Reste entfernt. Man hat also den Eindruck, dass dieses ganze lange Peptid nicht dazu erforderlich ist, die Kettenstruktur zustandezubringen, die besondere Faltung der Kette zu begünstigen, die wir im Insulinmolekül antreffen. Über Proinsulin gibt es einige interessante Dinge zu erwähnen. Es scheint, dass sich Ketten – wenn man die Disulphidbrücken in Proinsulin bricht – wesentlich besser als in Insulin neu bilden, und vielleicht stellt die lange Kette eine Art von Schablone dar, auf der das Molekül liegt, die die korrekte Form des Insulinmoleküls begünstigt. Oder sie bietet eine Art von Schutz für das Molekül bei seinem Transport zu dem Ort, an dem es gelagert wird. Das nächste Dia zeigt nun ein Bild des Lagerorts von Insulin in den Zellen der Langerhans’schen Inseln. Dieses Bild wurde von Dr. Howell in Sussex von den Inselzellen einer Ratte aufgenommen. Und ich nehme an, Sie können sehen, dass die kleinen Insulingranulate so aussehen, als seien sie kristallin. Sie sehen wie kleine Kristalle aus, und bei einigen Tieren kann man tatsächlich ziemlich große Kristalle sehen. Doch hier haben sie ziemlich genau die Form wie diejenigen Kristalle, mit denen wir gearbeitet haben. In Scheiben dieser kleinen Kristalle, die im Elektronenmikroskop bei höherer Auflösung dargestellt sind, erkennen Sie einen wiederkehrenden Abstand. In einigen Aufnahmen findet man eine Ansicht von Molekülreihen, und wenn man sich die Größe des Moleküls und den Abstand entlang dieser Reihen – er beträgt etwa 50 Angström – anschaut, bei dem es sich wahrscheinlich um die Seite der rhomboedrischen Einheit handelt, den Abstand zwischen den sich wiederholenden Hexameren, so scheint es fast sicher, dass das Insulin in den Inselzellen in Form der Zink enthaltenden Hexamere gespeichert ist. Doch nun stehen wir vor dem Problem, wie Insulin wirkt, und an diesem Punkt muss ich diese Frage an meine Zuhörer weitergeben. Das nächste Dia zeigt einige der verschiedenen Arten biologischer Prozesse, an denen Insulin aufgrund einer großen Anzahl von Experimenten beteiligt sein soll. Am wichtigsten von diesen ursprünglichen Experimenten erschienen natürlich diejenigen, bei denen es um den Stoffwechsel von Glukose ging, möglicherweise insbesondere die Experimente zum Transport von Glukose durch Membranen. An dieser Stelle lade ich Sie ein, eigene Bemerkungen zu diesem Molekül zu machen. Eine einzige weitere Beobachtung möchte ich selbst noch hinzufügen. Wir meinten, dass es interessant wäre, den tatsächlichen Punkt zu erforschen, an dem das Insulinmolekül sich in verschiedenen Tierarten scheinbar ändern konnte, ohne seine Wirksamkeit zu verlieren, d. h. die artspezifischen Unterschiede von Insulin auf die Weise zu verfolgen, die den Ideen entspricht, über die Dr. Synge vorhin gesprochen hat. Auf dem nächsten Dia habe ich nicht alle diese Unterschiede dargestellt, aber eine große Zahl von ihnen. Wie Sie sehen, können viele Reste sich ändern, und wenn Sie sich diejenigen anschauen, die sich nicht ändern, handelt es sich im Allgemeinen um – nun, hier hat sich das Cystein nicht geändert, das Leucin hat sich nicht geändert, Aa19-Tyrosin, A21-Asparagin hat sich nicht geändert. Es wurden jedoch eine äußerst große Anzahl von Änderungen beobachtet. Auf dem nächsten Dia sehen Sie eine kleine Karte, die zeigt, wo sich die invarianten Reste in dem Molekül befinden, wie wir es sehen. Dies ist ein einzelnes Molekül. Es sind sehr große Reste darunter, die daran beteiligt zu sein scheinen, dass das Molekül in seine tatsächliche Konfirmation gezogen wird. Dazu gehören natürlich die Cysteinreste, jedoch auch zwei oder drei Leucine, die – wie man sagen könnte – am Herzstück des Moleküls beteiligt sind. Und dann gibt es da nur noch ein oder zwei auf der Außenseite. Einer ist insbesondere A19-Tyrosine, und dann gibt es noch Asparagin, die auch bislang als invariant gelten. Auf dem letzten Dia sehen Sie einfach eine Darstellung des Moleküls, dieses Moleküls, wenn sie es sich von hier aus anschauen. Allerdings ist es nach der Elektronendichtekarte gezeichnet, die tatsächlichen Positionen sind der Elektronendichtekarte entnommen. Es soll Ihnen einen Eindruck davon geben, was ein sich näherndes Reagens “sehen” würde. Man sieht diese Oberfläche voller Einzelheiten und fragt sich, welche Teile davon für die eigentliche biologische Reaktion wichtig sind. Ist es ein bestimmter Bereich auf dieser Oberfläche oder ist es die Gesamtorganisation? Ist es der Monomer, ein einzelnes Insulinmolekül, wie Sanger annimmt, oder der Dimer, wie man in York meint? Oder der Hexamer, wie wir selbst manchmal meinen, wenn wir dieses wunderbar organisierte Objekt sehen, das “Taschen” enthält, in denen Dinge herumgetragen werden könnten? Doch dies ist Gegenstand weiterer Forschungen. Bevor ich dieses Thema abschließe, sollte ich noch zwei Dinge erwähnen. Es gibt noch andere kristalline Modifikationen von Insulin, sehr interessante, die gegenwärtig untersucht werden: die orthorhombische Form, die kein Zink enthält, in Columbia von Dr.Barbara Low, und die monoklinische Form, die als asymmetrische Einheit Hexamere enthält, von Michael Rossmann in Purdue. Zum Schluss sollte ich auch noch sagen, dass in diesem besonderen Forschungsprojekt die Summe der Mitarbeiter, die Summe der Beiträge, die von den Mitarbeitern geleistet wurden, wesentlich größer war als der Beitrag des Professors, um Ihre Worte, Professor Ruzicka, zu verwenden. Insbesondere sollte ich diejenigen nennen, die die letzten Stadien der Analyse durchgeführt haben. Sie hatte eine sehr lange Geschichte. Margaret Adam und Tom Blundell aus Oxford, Guy Dodson aus Neuseeland, Eleanor Dodson aus Australien und ich muss zugeben, dass wir ihn zum Teil deshalb gewählt haben, weil Sein Name “Sieg” bedeutet. Ich danke Ihnen.

Dorothy Crowfoot Hodgkin (1970)

Structure of Insulin

Dorothy Crowfoot Hodgkin (1970)

Structure of Insulin

Comment

This is the first talk, but not the last, given by Dorothy Crowfoot Hodgkin at the Lindau meetings. Six years after her Nobel Prize in Chemistry, she is still occupied with the crystal structure of insulin, a project she started in Oxford in 1934, more than 35 years earlier! She had then just spent two years with J.D. Bernal in Cambridge, learning the basics of crystallography of biological molecules. The choice of the special protein insulin was made because it plays such an important role in the body. In the story Hodgkin tells here, there are also many remarks as to the appearance and function of insulin in the body. But mostly, the story unravels some of the difficult technical steps involved in understanding the crystal structure of insulin. Since the lecture was given with many slides, this is not the right place to learn all the details, but the general story clearly comes through. One question treated is the molecular weight of the insulin molecule. Chemistry Nobel laureate The Svedberg had used his invention the ultracentrifuge and answered 36 000 units, but it turned out that he had measured particles of insulin, not molecules. Frederick Sanger, another chemist who also received the chemistry Nobel Prize, managed to determine the chemical structure of insulin by cracking it into its pieces. (He told his story at Lindau in 1960.) Insulin turned out to have molecular weight around 6 000 units, much smaller than Svedberg believed, but still big enough to give rise to many difficulties. One such was the need to insert heavy atoms in the crystals, a general method employed to get more information out of the thousands of X-ray diffraction pictures taken and inspected. At the National Portrait Gallery in London there is a wonderful painting of Dorothy Crowfoot Hodgkin working with her tables of crystallographic data using no less than four (!) hands.

Anders Bárány

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