Charles Huggins (1969) - The Corticolytic Hydrocarbons

Charles Huggins received his Nobel Prize in the autumn of 1966 and when the first invitation came to give a lecture at a Lindau Meeting, the 1969 Meeting on Physiology/Medicine, he duly accepted. He then continued to lecture at these meetings, one lecture in the 1970’s, one in the 1980’s and one in the 1990’s

This concludes the feast of reason, and the last speaker is reminiscent of the last man to finish a marathon race. The winner is known. It’s also known to the last speaker, but he’s determined to finish anyway. I’ll try to remember that 'brevity is the soul of wit'. Professor Szent, ladies and gentlemen. The picturesque concept of 'zauberkugel' was introduced by Paul Ehrlich to describe the effect of aromatics bearing trivalent arsenic on parasites. Now we shall attempt a pharmacologic dissection of adrenal cortex. I believe that techniques rule science; that seated at your desk you have no chance. The maturity of any branch of science depends upon the available techniques. Cancer research is not done very well, because the techniques have been rather clumsy. We wanted a rapid and simple method to induce cancer in every experimental animal. We want to do it quickly and without any work. We decided we would devote a few months in search of one: the most potent of the polycyclic aromatic carcinogenic hydrocarbons. Second, we would look for the most susceptible tissue of living creatures. And third, we would combine A and B and determine the maximum amount tolerable by the animal. I realise that the emotional tension is terrible. So I’ll quickly tell what the answers to these questions are. The most potent of the polycyclic aromatic hydrocarbons is 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. In English this is 7,12-dimethylbenzanthracene. Let’s abbreviate this and it's 7,12-DMBA. As you know this has a Chinese meaning, and it is this (writes sign on blackboard). The sinologists in the audience recognise right away that this is 'dian' or fires; this is 'ba' or 8. When you give a dose of DMBA you light 8 fires, namely you elicit 8 cancers. How is this done? One gives a dose to a young adult rat by mouth, 30 milligrammes dissolved in oil, by stomach tube, and cancer is underway. The cancer starts within one hour. And this is fine. It’s slightly clumsy - slightly clumsy to give a feeding. This is cancer induced by a single meal of the rat, but it’s a little clumsy. So what one does now? This is the 1968 model, the 1969 model is this. One dissolves the hydrocarbon in oil. One homogenises the oil in water. And then one injects intravenously. Therefore at a given instant of time, at a precisely known instant of time, the cancer has started. And it’s known that the cancer is underway within 60 minutes. Because if you take the most sensitive tissue and transplant it to another animal, the animal develops cancer. Now the most sensitive tissue known in biology is mammary gland of young adult rats, and this is the most sensitive to 2 things: polycyclic aromatic hydrocarbons and also to radiation. This is still a fourth way that one can represent DMBA by the methods of calculi. Now, science is people. This is Werner Bachmann, 1901 to 1951, a creative chemist who spent his professional life at the University of Michigan, studying one thing, namely free radicals. He synthesised first DMBA. We were busy and happy with the new discovery, producing cancer in every animal. It was what you call instant cancer. It was second do-it-yourself. It was third cancer research without tears, since it was a 'Kinderspiel' and without statisticians, since it was 100%. So this was quite good. But a scientist in the lab is this. All kinds of wonderful things go on in the laboratory that the scientist does not see. I think that scientific man in the laboratory is rather good at devising experiments, and not very good at observing that which is going on around him. This is not Venus de Milo, this is a rat which 50 days ago received a massive intravenous injection of DMBA, a large tolerable dose we call pulse dose, because at a precise second of time it is introduced into the blood. And we studied this. And the thing about cancer is to cure it, right? We were doing that and looking at these things. But one day we found these animals had very large adrenals, which were very hard. And we thought, well this is great, now this is adrenal cancer. But we made a section of the adrenal and found that the animals which had received DMBA, the middle of the adrenal had turned into stone. What was the incidence of that? - 100%. And how long had it been going on? Since the time of the pulse dose. And it had taken us 3 months to observe this. So we thought we better study the invariable effect, the selective destruction, the zauberkugel of DMBA, on middle layer of adrenal cortex. The adrenal gland from a biochemical standpoint consists of 3 layers: the outer layer, glomerulosa; the middle layer, fasciculata/reticularis; and the inner is medulla. Now these are all very long and hard names, and the mind is not a bottomless pit. So we remember these things in the following way: One of the great chemists of the age, Guy Frederic Marrian. We will give him an additional name which he does not have: a Richard. Now he becomes Guy Frederic Richard Marrian. Let us kill Frederic and Richard and then Guy Marrian will stay alive. So that’s what we do. This is adrenal cortex of the rat. And blood enters the outer layer of glomerulosa. And then it starts its slow decent down the chromatic graphic columns to the medulla. Middle layer is this great area. This is what is destroyed by DMBA. Middle layer then consists of the chromatographic columns that carry the blood and of hormone sequatory cells. And when you destroy either one or the other - and you can destroy either the chromatographic columns or the hormone sequatory cells - when you destroy one or the other, then both die. And that gives place to adrenal apoplexy. This is a great vivid display of nature reminiscent of red lights in the dark. The chromatographic columns are lined with sinusoidal endothelium which can phagocytise particulate matter. This is a demonstration of the lining of the chromatographic columns. Thorium dioxide has been injected, and it has been ingested. And these are little mirrors which reflect the light and show that this is sinusoidal endothelium which can phagocytise particles. Here is the effect of adrenal apoplexy. And for 24 hours nothing happens. And then at 30 hours the adrenal gland bleeds - here the control. Here we see the 3 layers of adrenal. The outer layer with the anastomosing capillaries, where aldosterone is formed. Here is one of the chromatographic columns which is still open - the others have died. And here is the adrenal apoplexy which is reminiscent of red lights in the dark. Histology. The outer layer is perfect and undamaged. The medulla is perfect and undamaged. Middle layer is killed by zauberkugel, namely (writes on the board). And here on the 9th day you see adrenal medulla; and you see here the adrenal gland has turned into stone. And this is a permanent mark. This stone in the middle of the adrenal calcification of the necrotic tissue - this is the necrotic tissue – these are adrenal glands from 6 rats. Each one received a pulse dose 9 days ago. And this stone means X days ago this animal was exposed to DMBA or one of its congeners. Now, this susceptibility of the adrenal gland is ACTH-dependent. It can be produced by a meal - namely 30 milligrammes of 7,12 - or by injection. The young animal can tolerate more of it than the old animal. The young animal at age 25 days received 30 milligrammes and at 45 days 30 milligrammes: at 25 days no adrenal apoplexy, at 45 days 10 out of 10. But: the hormone that it depends on is corticotrophin. You start at 21 days in one of these animals and give corticotrophin for 4 days, then a single feeding of the corticolytic agent, and then you have adrenal apoplexy. So we’ve been interested in this observation which is... really it's kinderspiel to do. All you need to know is, can you tell the difference between red and white? Here we have the base pairs. This is a wonderful thing. This is steric relationship. This is thymine and adenine. And one makes a little box to surround the base pairs. In this little box fits 7,12-dimethylbenzanthracene. It has the same steric size as the base pairs, guanine-cytosine or adenine-thymine. So this little box is a simple way to judge steric relationships. Here again is the Pandora box, constructed to hold the base pairs. And in this fits well cortisol. So here we see 3 things that fit in this box: the base pairs, the most powerful polycyclic aromatic hydrocarbons, and the active sex hormones and corticotrophic hormones. This is the dimethylbenzanthracene. And Boylan found that it readily undergoes hydroxylation. This very powerful carcinogen differs from most polycyclic aromatic hydrocarbons. They undergo hydroxylation in the ring structure. But 7,12 undergoes hydroxylation in the methyl groups preferentially to form 7-hydroxymethyl-12-methylbenzanthracene or 12-hydroxymethyl-7-methylbenzanthracene or 7,12-dihydroxybenzanthracene. Only this one is corticolytic; these do not destroy the adrenal cortex of the rat. In this region if you want to get ahead sometimes what you do is twist the formula around. And that’s what has been done here. This is 7-hydroxymethyl-12-methylbenzanthracene related to cortisol, and you can see there is a considerable similarity. This is buckled and this is flat. This is not carcinogenic. This is a weak carcinogen. Without hydroxymethyl it is the strongest one that is known. Now we know the molecular structure of the corticolytic hydrocarbon. They are derivatives of benzanthracene. It is obligatory that a methyl group be present at position 12. It is also obligatory that an additional alkyl or hydroxyalkyl group be present at position 7. This is a bifunctional effect of one of the functions, namely that at position 12 being required to be a methyl group - with an ethyl group es geht nicht (it doesn't work). This must be methyl. Here you have a considerable leeway. For example with the following groups we’ve made... these derivatives are synthesised in our laboratory with a methyl group 7,12-DMBA. This is corticolytic. We’ll assume in the next minute that all of the groups are derivatives of 12-methylbenzanthracene: So the corticolytic agent which selectively destroys... massively destroys adrenal cortex consists of derivatives of benzanthracene, 12-methylbenzanthracene with an oxygen… (end of recording).

Dies beschließt das Fest der Vernunft, und der letzte Sprecher erinnert an den letzten Läufer bei einem Marathonrennen. Vor 2 Stunden war der Lauf beendet. Der Sieger steht fest. Er ist auch dem letzten Vortragenden bekannt, aber er ist entschlossen, das Rennen dennoch zu beenden. Ich werde mich versuchen daran zu erinnern, dass die Würze in der Kürze liegt. Professor Szent, meine Damen und Herren. Der pittoreske Begriff einer Zauberkugel wurde von Paul Ehrlich eingeführt, um den Affekt einer aromatischen Verbindung mit einem dreiwertigen Arsen auf Parasiten zu beschreiben. Nun werden wir eine pharmakologische Sektion der Nebennierenrinde versuchen. Ich bin davon überzeugt, dass Methoden die Wissenschaft regieren. Dass man allein an seinem Schreibtisch keine Chance hat. Die Reife eines Wissenschaftszweiges hängt von den ihm zur Verfügung stehenden Methoden ab. Der Krebsforschung geht es nicht gut, denn ihre Methoden sind ziemlich unbeholfen gewesen. Wir suchten nach einer schnellen und einfachen Methode, um Krebs in jedem Versuchstier auszulösen. Wir wollten dies schnell und mühelos tun. Wir entschlossen uns, einige Monate lang danach zu suchen: nach den wirksamsten polyzyklischen, aromatischen, karzinogenen Kohlenwasserstoffen. Zweites würden wir nach dem empfindlichsten Gewebe von Lebewesen suchen. Und drittens würden wir A und B kombinieren und festzustellen, welche Maximalmenge des Karzinogens ein Tier tolerieren würde. Mir ist klar, dass die emotionale Spannung furchtbar ist - ich werde Ihnen die Antwort auf diese Fragen also schnell mitteilen. Der wirksamste polyzyklische, aromatische karzinogene Kohlenwasserstoffe ist 7,12-Dimethylbenzanthrazen. Im Englischen heißt er 7,12-dimethylbenzanthracene. Lassen Sie uns dies abkürzen zu 7,12-DMBA. Wie Sie wissen, hat dies im Chinesischen eine Bedeutung, und zwar folgende: (schreibt an die Tafel) Die Sinologen unter den Zuhörern erkennen sofort, dass dies ‚dian‘ oder Feuer bedeutet, dies ist ‚ba‘ oder 8. Wenn man eine Dosis DMBA verabreicht, zündet man 8 Feuer an, denn man löst 8 Krebsarten aus. Wie macht man dies? Man verabreicht einer erwachsenen, jungen Ratte 30 mg in Fett gelöst oral, durch einen Magenschlauch, und schon beginnt der Krebs zu wachsen. Der Krebs beginnt sein Wachstum innerhalb einer Stunde. Und das ist ok. Es ist ein wenig unbeholfen – etwas ungeschickt, eine Fütterung durchführen zu müssen. Dies ist ein durch eine einzige Fütterung der Ratte induzierter Krebs, aber es ist etwas unbeholfen. Also, was machte man anschließend? Dies ist das 1968-Modell; das Modell von 1969 ist dies: Man löst den Kohlenwasserstoff in Öl. Man homogenisiert das Öl in Wasser. Und dann injiziert man es intravenös. Daher hat der Krebs zu einem exakten Zeitpunkt, zu einem genau bekannten Zeitpunkt, sein Wachstum begonnen. Und wir wissen, dass der Krebs innerhalb von 60 Minuten zu wachsen beginnt. Denn, wenn man das empfindlichste Gewebe nimmt und es in ein anderes Tier transplantiert, dann entwickelt das Tier Krebs. Nun, das empfindlichste Gewebe, das Biologen bekannt ist, sind die Milchdrüsen einer jungen erwachsenen Ratte. Zwei Einflüssen gegenüber ist es am empfindlichsten: polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen und Strahlung. Dies ist noch ein vierter Weg, durch den man DMBA durch Rechenmethoden darstellen kann. Nun, die Wissenschaft: das sind die Menschen, die sie betreiben. Dies ist Werner Bachmann. Er lebte von 1901 bis 1951. Ein kreative Chemiker, der sein Berufsleben an der Universität von Michigan verbrachte, indem er eine Sache studierte: und zwar freie Radikale. Er war der erste, der DMBA synthetisierte. Wir waren viel beschäftigt und glücklich über die neue Entdeckung, wir lösten Krebs in jedem Tier aus. Es war, was man als „sofortigen Krebs“ bezeichnen würde. Es war zweitens do-it-yourself, und drittens war es Krebsforschung ohne Tränen, da es ein Kinderspiel war, ohne dass Statistik eine Rolle spielte, denn sie hatte eine Erfolgsquote von 100 %. Dies war also sehr gut. Doch einem Wissenschaftler im Labor geht es folgendermaßen. Alle möglichen wundervollen Dinge passieren im Labor, von denen der Wissenschaftler nichts sieht. Ich denke, dass Wissenschaftler im Labor sehr gut darin sind, Experimente auszudenken, und nicht gut darin, das zu beobachten, was um sie herum geschieht. Dies ist nicht die Venus von Milo. Dies ist eine Ratte, die vor 50 Tagen eine massive intravenöse Injektion mit DMBA erhalten hat. Eine große tolerable Dosis nennen wir eine Pulsdosis, da sie zu einer bestimmten Sekunde in das Blut eingeführt wird. Vor 50 Tagen wurde dieses Tier injiziert, und hier sieht man 4 der 8 Feuer, die ausgelöst wurden. Wir haben dies untersucht. Und die Sache mit dem Krebs, das ist ihn zu heilen, nicht wahr? Wir taten dies, und schauten uns diese Dinge an. Doch eines Tage stellten wir fest, dass diese Tiere sehr große Nebennieren hatten, die sehr hart waren. Und wir dachte uns: nun ja, das ist ja großartig - ein Krebs der Nebenniere. Doch wir nahmen eine Sektion der Nebenniere vor und stellten fest, dass das Innere der Nebennieren dieser Tiere, die DMBA bekommen hatten, sich versteinert hatte. Und wie häufig kam das vor? Mit einer Häufigkeit von 100 %. Und seit wann war dies schon so? Seit der Zeit der Pulsdosis. Es hatte 3 Monate gedauert, bis wir dies bemerkten. Also dachten wir uns, dass wir besser die invariable Wirkung, die selektive Zerstörung, die Zauberkugel des DMBA studieren, und zwar der mittleren Schicht der Nebennierenrinde. Biochemisch betrachtet, besteht die Nebenniere aus 3 Schichten: der äußeren Schicht, der Glomerulosa, der mittleren Schicht, der Fasciculata oder Reticularis, und der inneren Schicht, der Medulla. Nun, dies alles sind sehr lange und komplizierte Namen, und der Verstand ist kein Fass ohne Boden. Wir prägen uns diese Namen auf folgende Weise ein: einer der größten Chemiker unserer Zeit ist Guy Frederic Marrian. Wir geben ihm einen zusätzlichen Namen, den er nicht hat: Richard. Dadurch wird er zu Guy Frederic Richard Marrian. Töten wir Frederic und Richard, dann bleibt Guy Marrian am Leben. So machen wir das. Dies ist die Nebennierenrinde der Ratte. Und das Blut tritt in die äußere Schicht der Glomerulosa ein. Und dann tritt es seinen langsamen Abstieg die chromatografischen Säulen hinunter zur Medulla an. Die mittlere Schicht ist dieser große Bereich. Sie ist das, was durch DMBA zerstört wird. Die mittlere Schicht besteht dann aus den chromatografischen Säulen, die das Blut tragen, und aus Hormon absondernden Zellen. Und wenn man entweder das eine oder das andere zerstört – man kann entweder die chromatografischen Säulen oder die Hormone absondernden Zellen zerstören – wenn man das eine oder andere zerstört, dann sterben beide. Und das führt zur Apoplexie der Nebenniere. Dies ist ein großartiges, lebhaftes Schauspiel der Natur, das an rote Lichter im Dunkeln erinnert. Die chromatografischen Säulen sind mit sinusförmigem Epithel ausgekleidet, das bestimmte Materialien phagozytieren kann. Dies ist eine Darstellung der Auskleidung der chromatografischen Säulen. Thoriumdioxid wurde injiziert, und es wurde aufgenommen. Und dies sind kleine Spiegel, die das Licht reflektieren und die zeigen, dass diese ein sinusförmiges Epithel ist, das Partikel phagozytieren kann. Dies ist die Wirkung einer Nebennierenapoplexie. Vor drei Tagen wurde DMBA injiziert. Und 24 Stunden lang ist nichts passiert. Und dann blutet die Nebenniere nach 30 Stunden – hier die Kontrolle. Hier sehen wir die drei Schichten der Nebenniere. Die äußere Schicht mit den anastomisierenden Kapillaren, in denen das Aldosteron gebildet wird. Hier ist eine der chromatografischen Säulen, die noch offen ist – die anderen sind abgestorben. Und hier ist die Nebennierenapoplexie, die an rote Lichter im Dunkel erinnert. Histologie. Die Außenschicht ist perfekt und unbeschädigt. Die Medulla ist perfekt und unbeschädigt. Die mittlere Schicht wurde von der Zauberkugel zerstört, das heißt (schreibt an die Tafel). Und hier am 9. Tag sehen Sie die Nebennieren-Medulla. Und sie sehen hier, dass sich die Nebennierendrüse in Stein verwandelt hat. Dies ist ein dauerhaftes Merkmal. Der Stein in der Mitte der Nebennierenkalzifikation ist nekrotisches Gewebe – dies ist das nekrotische Gewebe. Dies sind Nebennieren von 6 Ratten. Jede von ihnen erhielt vor 9 Tagen eine Pulsdosis. Und dieser Stein bedeutet, dass dieses Tier vor x Tagen DMBA oder einer verwandten Substanz ausgesetzt wurden. Diese Anfälligkeit der Nebennierendrüse ist ACTH-abhängig. Sie kann durch eine Mahlzeit verursacht werden – nämlich durch 30 mg 7,12-DMBA – oder durch eine Injektion. Jungtiere tolerieren mehr davon als ältere Tiere. Das Jungtier erhielt im Alter von 25 Tagen 30 mg und mit 45 Tagen 30 mg: nach 24 Tagen kam es zu keiner Nebennierenapoplexie, nach 45 Tagen zu 10 von 10. Aber: das Hormon, wovon dies abhängt, ist Kortikotropin. Man beginnt nach 21 Tagen bei einem dieser Tiere und gibt vier Tage lang Kortikotropin. Dann eine einzelne Fütterung mit dem kortikolytischen Wirkstoff, und dann kommt es zu einer Nebennierenapoplexie. Wir waren also an diesen Beobachtungen interessiert, die wirklich kinderleicht waren. Alles, was man wissen muss ist: kann man den Unterschied zwischen Rot und Weiß feststellen? Hier haben wir die beiden Paare. Dies ist eine wunderbare Sache. Dies ist eine räumliche Beziehung. Dies sind Thymin und Adenin. Und eins macht eine kleine Box, um diese Basenpaare zu umgeben. In diese kleine Box passt 7,12-Dimethylbenzanthrazen. Es hat dieselbe räumliche Größe wie die Basenpaare Guanin-Cytosin oder Adenin-Thymin. Diese kleine Box ist also eine einfache Methode, um räumliche Beziehungen zu beurteilen. Hier ist die Box der Pandora noch einmal, die konstruiert ist, diese Basenpaare aufzunehmen. Und hier hinein passt Kortisol sehr gut. Hier sehen wir also 3 Dinge, die in diese Box passen: die Basenpaare, die wirksamsten polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe und die aktiven Sexualhormone und kortikotrophen Hormone. Dies ist das Dimethylbenzanthrazen. Und Boylan fand heraus, dass es sehr leicht eine Hydroxylierung durchmacht. Dieser höchst wirksame, krebserregende Stoff unterscheidet sich von den meisten polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen. Sie durchlaufen die Hydroxylierung in der Ringstruktur. Doch 7,12 durchläuft die Hydroxylierung vorzugsweise in den Methylgruppen. um 7-Hydroxymethyl-12-Methylbenzanthrazen oder 12-Hydroxymethyl-7-Methylbenzanthrazen oder 7,12-Dihydroxybenzanthrazen zu bilden. Nur dies zerstört die Nebennierenrinde; diese zerstören die Nebennierenrinde der Ratte nicht. In diesem Bereich muss man manchmal die Formel umdrehen, wenn man Fortschritte machen will. Und das ist es, was hier geschehen ist. Dies ist das mit Kortisol verwandte 7-Hydroxymethyl-12-Methylbenzanthrazen, und wie Sie sehen, besteht hier eine beträchtliche Ähnlichkeit. Dies ist krumm und dies ist flach. Dies ist nicht krebserregend. Dies ist ein schwaches Karzinogen. Mit Ausnahme von Hydroxymethyl ist es der stärkste bekannte Krebserreger. Nun kennen wir die Molekülstruktur des kortikolytischen Kohlenwasserstoffs. Es sind Derivate von Benzanthrazen. Es ist vorgeschrieben, dass sich in Position 12 eine Methylgruppe befindet. Es ist ebenfalls vorgeschrieben, dass sich in Position 7 ein zusätzliches Alkyl oder eine Hydroxyalkyl-Gruppe befindet. Dies ist ein bifunktionaler Effekt einer der Funktionen, nämlich dass sich in der Position 12 eine Methylgruppe befinden muss, mit einer Äthylgruppe geht es nicht. Es muss Methyl sein. Wir haben hier einen beträchtlichen Spielraum. Beispielsweise haben wir mit den folgenden Gruppen ... Diese Derivate werden in unserem Labor mit einem Methylgruppen-7,12-DMBA synthetisiert. Dieses ist kortikolytisch. Wir werden in der nächsten Minute annehmen, dass alle diese Gruppen Derivate von 12-Methylbenzanthrazen sind: Die kortikolytischen Wirkstoffe, die selektiv ... die die Nebennierenrinde massiv zerstören, bestehen aus Derivaten von Benzanthrazen.

Charles Huggins (1969)

The Corticolytic Hydrocarbons

Charles Huggins (1969)

The Corticolytic Hydrocarbons

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Charles Huggins received his Nobel Prize in the autumn of 1966 and when the first invitation came to give a lecture at a Lindau Meeting, the 1969 Meeting on Physiology/Medicine, he duly accepted. He then continued to lecture at these meetings, one lecture in the 1970’s, one in the 1980’s and one in the 1990’s. His last lecture was given the same year that he turned 89, which makes him one of the oldest speakers at a Lindau Meeting. The first lecture describes his development of techniques to study the behaviour of animal cancer cells in the laboratory. If you want to study cancer cells from test animals, you can either try to find test animals that already have cancer or you can try to find a way to induce cancer in the animals. Huggins chose the second way and also wanted to find the most rapid way to induce cancer, thereby getting access to as many tumours as possible to study. Already in the 1930’s, some chemists had synthesized a molecule with the name 7,12-Dimethylbenz(a)anthracene (with the more convenient designation DMBA) and shown that it was strongly carcinogenic. The way they showed this was by feeding rats with food containing DMBA, finding that a single meal was enough to start a cancer growth. But Huggins felt that the process of feeding the rats was clumsy and too imprecise and instead made a solution containing DMBA which was injected into the blood of the rats. He could then show that this method provokes “instant cancer”, within one hour the cancer starts. As for the part of the animal that is most susceptible, this turned out to be the mammary glands. So, at the time of the Lindau lecture, instead of studying prostate cancer in man, Huggins was studying breast cancer in rats. He has written down a short version of his lecture, which then has been translated into German and published in the journal Naturwissenschaftliche Rundschau, vol. 23, p. 351 (1970).Anders Bárány

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