Konrad Bloch (1972) - Control Aspects of Lipid Biosynthesis

The world’s best-selling class of drugs, the statins, have been developed based on knowledge independently gained by Konrad Bloch and Feodor Lynen who shared the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1964 for their elucidation of the biosynthesis of cholesterol – an intracellular marathon involving more than 30 steps

Professor Weißschädel, ladies and gentlemen. The preceding speakers have spoken to you on broad subjects of society, physiology and medicine, and in clear and comprehensible terms, in a language understandable to all of you. I am going to depart from this pattern and give a report on a rather technical, highly specialised subject. And for this reason I will have to speak in the language of chemistry and biochemistry. I therefore expect some problems of communication. Unfortunately, this particular language problem cannot yet be handled by simultaneous translation. When I spoke here 3 years ago, I commented, and perhaps lamented, the fact that lipids played a relatively minor role in the concepts and dogmas of modern biology, and molecular biology in particular. At that time, and still today, the nucleic acids and proteins occupy the centre of the stage, and deservedly so, because these macromolecules have taught us so much about heredity and the processes of information transfer. Yet in the few years that have passed, a rather significant change has taken place. Largely because it has been recognised that we cannot understand or describe cellular activities without an intimate knowledge of the structure and function of cell envelopes or the membranes which surround the cell content. And since lipids, along with protein, are essential membrane components, the structure and biosynthesis of lipids and the role which lipids play in modulating membrane properties have attracted wide attention. And it has been said that, perhaps with undue enthusiasm, that membranes may be to the 1970s and 1980s what nucleic acids were to the 1950s and the 1960s. Be that as it may, the field is an unusually active one and pervaded by the feeling that we are on the threshold of major breakthroughs, which may allow us not only to understand how membranes work but also how to synthesise membranes. And if you can synthesise functional membranes, we may well be on the way to synthesising cells themselves. With this rather sanguine introduction, let me turn more soberly to a statement of the lipid problem as it relates to membrane function. According to a currently very attractive membrane model - may I have the first slide please – proposed by Singer in modification of the older Danielli membrane structure, the lipid bilayer structure, into which proteins either penetrate partially or totally. We have then an arrangement of polar portions of the lipid molecule extending to the external cell fluid, and an arrangement of 2 layers of these phospholipid structures, in which the hydrocarbon chains, the fatty acid chains, interact with each other, both laterally and vertically. The one particular point I want to call attention to is that these hydrocarbon or hydrophobic chains are not given as straight linear arrangements; that they vary in length in this scheme; and also that the arrangement of these chains shows either closer or more remote relationships. And this is not an accident; this is deliberately done by the authors of this model. And this particular arrangement of the fatty acid chain will be part of my thesis. According to this type of model then, the lipid bilayer provides a liquid mobile matrix into which other molecules, notably the proteins, can float and move about. The emphasis here is on the liquid or fluid phase properties of the membrane, which apparently only the lipids can provide. We therefore shall have to enquire why lipids are uniquely suited to provide the properly liquid or fluid medium. May I have the next slide please? The phospholipids, and these are the ubiquitous and universal membrane lipids, have the distinctive structural features I alluded to earlier: a so-called polar head group containing glycerol phosphate and a nitrogenous base, and attached to them the long hydrocarbon chains. This polar, non-polar or antipathic character appears to be the secret of the phospholipid molecule. The polar head groups are exposed to the aqueous phase external to the membrane while the non-polar hydrocarbon chains make contact with each other, both within the molecule and between adjacent molecules, by additive van der Waals interactions. It is the strength of these interactions which determines the action between these hydrocarbon chains, which determines the fluidity or lack of fluidity of a particularly membrane. In turn it will be obvious that the strength of these interactions is a function of the number of carbon atoms in the chain and in the way in which these hydrocarbons are aligned, which in turn follows from the van der Waals radii between adjacent chains. Now in a closely packed arrangement, such as shown here, in a phospholipid containing 2 saturated fatty acids, the interactions lead to physical properties which seem to be unsuitable for membranes. And, indeed, one does not find in nature phospholipid molecules which contain 2 saturated fatty acid chains. On the contrary - the next slide please - the predominant pattern in most phospholipids is 1 saturated hydrocarbon chain, and another 1 in which the molecule is bent away, therefore lessening and weakening the interaction, the hydrophobic or non-polar interactions. The question then arises: How is this particular structure, consisting of regions in which there are close contacts and regions in which there is less contact, how this is achieved? Now, in the bacterial membrane, which we know in much greater detail than the eukaryotic membrane, one finds most commonly phospholipids containing pairs of saturated and unsaturated olefinic acids, either 16 carbon atoms long. And characteristically the cis-olefinic bond is present somewhere in the middle of the molecule, at the 9, 10 or 11 position. And the double bond, as I indicated, then introduces a kink in the hydrocarbon chain, weakening the non-polar interaction. And it is clear that the specific location of this disturbing feature, as it were, along the hydrocarbon chain is very important in determining whether the interactions will be strong or weak. And this may well be the reason why we find in nature, in natural phospholipid predominantly, if not exclusively, olefinic double bonds at a particular position along the hydrocarbon chain. There is not much evidence that nature has chosen this structural feature, a centrally located cis-olefinic bond, as a principle device to achieve the appropriate membrane fluidity. However, what apparently matters is not the chemistry of the olefinic bond - the next slide please – but simply some bulky or disturbing group in the same position along the hydrocarbon chain. Here we have the cis-olefin which was indicated in the previous model. This can be replaced, for example, by a cyclopropane group in certain bacterial systems, or one can artificially create the same disturbance in the alignment of hydrocarbon chains by introducing a bromine atom at the 9, 10 position, or by introducing an acetylated hydroxyl function. In some instances, in some bacilli, the same loosening of the membrane phospholipid is achieved by branching of the hydrocarbon chain, either at the end or at the penultimate position. So it is not cis-olefinic bond per se but some disturbing influence, some ... (inaudible) group then, which under certain conditions can replace the naturally occurring cis-olefin structure. One of the currently very interesting questions: how does a cell achieve the proper mixture of saturated and unsaturated fatty acids in a phospholipid molecule and thereby the appropriate physical properties for the membrane? One condition which allows one at least to vary the phospholipid composition of membranes in microorganisms is temperature, environmental temperature. It has long been known that, as a result of changes in environmental temperature, the degree of unsaturation of the fatty acids undergoes very drastic changes. And this response is clearly an adjustment of the cell to preserve membrane fluidity under adverse or abnormal conditions. And we may ask, by what regulatory mechanisms this adjustment is achieved? The next slide please. There are various a priori possible mechanisms for achieving the proper liquid, the nature of the membrane: One, by regulating the relative rates of the saturated and unsaturated acids. The other one would be the relative rates of activation of these saturated and unsaturated fatty acids, that is the conversion into the activated derivative, which are necessary for introducing the molecule into the phospholipid structure. Or rates of transport could be involved. And finally, the rate-determining step could be the selection of saturated or unsaturated fatty acids for introduction into the phospholipid molecule. Doctor Sinensky in my laboratory has addressed himself to this problem by studying control of phospholipid synthesis in Escherichia coli, and has obtained some rather unambiguous answer, that mechanism for the relative rates of eutrophication do determine the composition of the membrane lipids in this microorganism. Sinensky took advantage of the fact that E. coli cells will take up or incorporate from the external medium both saturated and unsaturated fatty acids, when these are provided. And under appropriate conditions the external medium is indeed the principle fatty acid source for the membrane phospholipids. By supplying the bacterial cell with tritium-labelled oleate and C14-palmitate during growth and measuring the ratio of the 2 isotopes in the membrane phospholipids, he showed that one of the steps in the utilisation of fatty acids of phospholipid synthesis is indeed temperature control. The next slide please. This panel here to the left shows the response in terms of the ratio of – if you can move this over a little bit, please, the slide, to the right. The ratio of palmitate to oleate incorporated into cellular phospholipids, as a function of temperature, shows a very marked, about 4- to 5-fold, rise between 20 and 30 degrees. Subsequently the inflection of this curve occurs which can be explained, but which I will not have time to explain here. The more important result is that the same phenomenon, the change in the relative proportion of these 2 types of fatty acids, can be reproduced in vitro with isolated membrane particles by providing them again with labelled palmitate oleate. Again one obtains a temperature- dependent change in the relative amounts of palmitate oleate, which are incorporated into the cellular phospholipids. Independent experiments show that it is the incubation temperature during assay, and not during growth, which determines the relative proportion of these 2 membrane constituents. The effect of temperature is therefore on enzyme activity and not on enzyme synthesis. Induction or derepression are not involved. The esterifying enzymes - the next slide please - what we are concerned with here, introducing fatty acid residues into the 1 and 2 position of the phospholipid precursor. And they can do so in various ways: they can either introduce these residues into the 1 position or the 2 position; they can introduce a subsequent step, an additional saturated or an additional unsaturated fatty acid, resulting in 4 different phospholipid species. And it will be the ratio of these phospholipid species which determines the overall phospholipid composition and the suitability of the membrane lipids under a particular environmental temperature. When the environmental temperature for growth of the microorganism is normal, one will find primarily this type of a species here, in which we have one saturated and one unsaturated molecule. As the growth temperature is lowered this more unsaturated species will increase and conversely, at higher temperature, we will have a relative increase in the proportion of the diunsaturated phospholipid. One final point on this subject which is worth mentioning is, that these variations in lipid compositions in E. coli are continuous with growth temperature rather than a step function. And it is therefore not surprising that the temperature effect is mediated in the enzymatic rather than the genetic level. The second major determinant of phospholipid structure and hence membrane fluidity, as I indicated already, is the length of the hydrocarbon chain. And this brings me to the topic I want to discuss in some detail. Fatty acid synthesis is that the build-up of the hydrocarbon chain has some very intriguing features, which it shares with very few other biosynthetic processes, polyisoprenoid biosynthesis being perhaps the only other comparable case. The next slide please. The process involves the sequential action of a set of 7 enzymes, which activate and condense the precursors. And after completion of each sequence or cycle of reactions the process is repeated 7 or 8 times, until a chain of 16 or 18 carbon atoms has been reached. Each of the enzymes has a remarkably broad specificity in that it can handle intermediates varying in length from 4 to 16 carbon atoms. Surprisingly the chain lengthening process comes to an abrupt or rather abrupt halt at the level of 16 or 18 carbon acid, as shown by some typical fatty acid patterns. The next slide please. Fatty acid synthetases for example from a bacterial... from corynebacterium, or a plant source which we have investigated, show this pattern in which one particular fatty acid predominates and in which one finds small amounts of fatty acid with longer or shorter chains. This was entirely expected. The only exception to this monomodal distribution pattern we have found in fatty acid synthesis by Mycobacterium phlei, which shows a bimodal fatty acid distribution pattern, which was entirely unexpected. And I will deal in some detail with this particular aspect. In order to explain the normal or more usual situation of chain length specificity in the build-up of the hydrocarbon chain and its stoppage, let us say at 16 carbon atoms, Lynen and his collaborators have advanced an elegant mechanism to rationalise chain termination. In terms of the change in the relative rates of 2 of the component enzymes, namely the condensation step by which the carbon chain is lengthened and the termination process in which the end product is discharged from the enzyme. As the hydrocarbon chain grows, and with it the hydrophobic character of the molecule, interactions between substrate or intermediate and enzyme protein favour the termination process at the expense of condensation. A mechanism of this type would not predict absolute fidelity, that is the termination in a single length fatty acid but rather a spectrum with 1 or 2 chain lengths predominating. And this is what we found, as I have said, with one exception so far. Now, before I describe the properties of this rather unusual fatty acid synthetase from Mycobacterium phlei, let me comment first briefly on some general properties of fatty acid synthetases. As I mentioned a moment ago, these biosynthetic pathways consist of enzyme systems that form long-chain fatty acids from acetyl-CoA and malonyl-CoA by the sequential action of at least 7 enzymes. In conformity with the principle of biochemical unity, to which we are so accustomed, the chemical mechanisms of the individual steps appear to be identical for all forms of life: animals, plants and microorganisms. On the other hand the fatty acid synthetase enzymes from different sources exhibit strikingly diverse molecular properties and patterns of organisation. The next slide please. The classical example of fatty acid synthetase system is the multi-enzyme complex from yeast, first described by Lynen, and the comparable fatty acid synthetases from animal tissues described by Wakil and Porter. And there is a second class of fatty acid synthetases which catalyses the same type of reactions but shows entirely different organisational patterns, namely those which are found in bacteria and in certain plant systems. The next slide please. What we like to call type-I fatty acid synthetases, as exemplified by Lynen’s yeast fatty acid synthetase, are highly organised multi-enzyme complexes varying in molecular weight from half a million to about 2 million, depending on the source. All animal tissues contain fatty acid synthetases of roughly the same molecular weight, half a million. And their specific activities are also roughly similar. I have listed here the fact that 2 bacterial sources also contain multi-enzyme complexes with molecular weights in the same range as those found in yeast. And finally, another example of fatty acid synthetase in a plant system in the ethylated form of the algae Euglena gracilis. The point I want to make here that all these enzyme systems then are highly organised structures, in which the individual components are part of the very tight complex in which one cannot study the individual enzymes. Or separate the individual enzymes from the complex which interact in such a way that activity of each individual component is dependent on the presence of others. You find then a remarkable range of molecular weights as well as specific activities, but with one possible exception: It appears that the subunit structure of this multi-enzyme complex is very similar. In all but one case so far one can dissociate these multi-enzyme complexes into subunits which have roughly a molecular weight of 200,000 and which are functionally totally inactive – either with respect to total fatty acid synthesis or catalysis of some of the partial reactions. The next slide shows by contrast fatty acid synthetases from bacterial and plant systems, in which the individual component, the 7 enzymes, can be isolated as separate entities, purified to a high degree; and which are further characterised by the requirement of a molecule known as ACP or acyl-carrier protein, which must be added externally to the system for activity. In contrast to the organised enzyme systems, which I mentioned briefly, in which this ACP or acyl-carrier protein molecule is built into this stable multi-enzyme complex. This rather striking and unparalleled duality of fatty acid synthetase properties, the highly organised and the unorganised systems, interested us for 2 principle reasons. First of all we were curious to know whether the occurrence of type I and type II enzymes – type I being the organised ones and type II the dissociated systems - has evolutionary or phylogenetic significance. And secondly, we hoped to find examples of fatty acid synthetases intermediate in properties between the types I and II. If such intermediate or transitional forms existed, then they might be manipulated to cause them to dissociate and reassociate, and therefore serve as models for studying or reproducing the assembly of individual enzymes into a multi-enzyme complex. We have so far failed in both of these objectives. But searching for a suitable enzyme source among the more advanced prokaryotic organisms, we have found in Mycobacterium phlei a fatty acid synthetase with properties and regulatory features that seem to us quite noteworthy. Now, as I indicated earlier, Mycobacterium phlei does contain a multi-enzyme complex and this was the first example of a type I fatty acid synthetase in a bacterial source. And this then, in fact, established the point that multi-enzyme complexes can occur in prokaryotic as well as in eukaryotic cells. We have since found multi-enzyme complexes of similar character also in corynebacterium species and in streptomyces. But in the absence of a more systematic survey and in view of the uncertain phylogenetic relationships in bacteria, we are reluctant to conclude that the appearance of fatty acid synthetases as multi-enzyme complexes, highly organised multi-enzyme complexes, has evolutionary significance or implications. Among the properties of the mycobacterial fatty acid synthetase the following are unusual and worthy of comment. The next slide please. The majority of the fatty acid synthetases which have been studied have what one might call physiological Km values for substrate concentration, that is for a concentration which one might expect to find in the cell. For acetyl-CoA this is in the range of 2 to 20 micromolar. By contrast, the system for Mycobacterium phlei has an abnormally high Km value for acetyl-CoA, about 800. And it is in fact impossible to saturate the system with this essential substrate, as we were able to demonstrate. There is also a fairly high Km value for malonyl-CoA in the system, but this is less striking. A second abnormality of the M. phlei system was the abnormally high Km value for the reductant TPNH, triphosphopyridine nucleotide. Again this is quite out of line with the TPNH Km values which one finds in other fatty acid synthetase systems. This particular property we have been able to explain by the fact that the 2 reductive steps in fatty acid syntheses in Mycobacterium phlei are supported by 2 pyridine nucleotides, namely TPNH and DPNH respectively, whereas in most other systems study TPNH can serve as a single electron donor for either of the 2 reductive steps. The next slide please. One operational problem in the purification of the fatty acid synthetase for Mycobacterial phlei was its sensitivity to varying ionic strengths. Perhaps for good reasons, Lynen has been so highly successful with the yeast fatty acids synthetase because it is an exceedingly stable molecule, which can be subjected to ionic strength varying from 0 to 1 molar, for example without change in activity or change in physical properties, as indicated here. By contrast, the enzyme system from rat liver when exposed to low ionic strength decays with a half time of about 2 hours. And the system for Mycobacterium phlei decays in low ionic strength to the half time of 4 to 5 minutes. And this has greatly limited the procedures which one can use for purification of the enzyme system. The next slide please. Now this slide illustrates again a point of comparative biochemistry, and perhaps the differences in the cellular environments in different forms of life. Here again we demonstrate the sensitivity of various fatty acid synthetases from various sources as a function of ionic strength. The yeast enzyme is not at all affected in an over 50-fold range of phosphate buffer concentration. The second enzyme from corynebacterium diphtheria: there is no activity whatsoever in 100 molar phosphate and it needs .5 molar phosphate for optimal activity. Similarly, the enzyme from Mycobacterium phlei: there is no activity in low ionic strength. Then it rises rather sharply over a 10-fold range of concentration and slightly drops off. Finally, a fatty acid synthetase from Euglena gracilis shows the opposite behaviour: it has optimal activity in very low ionic strength and is totally inhibited at .5 molar phosphate. To us this simply means that the environment in which these various enzyme systems operate in various cells are totally different. And since these processes are membrane associated it is clear that a membrane environment and membrane structure must vary greatly from one organism to the other. The next slide please. I already indicated the bimodal chain length pattern, which is produced by the mycobacterial fatty acid synthetase, giving 2 peaks, 1 at 18 carbon atoms and the other one at 24 carbon atoms, whether one initiates a chain with acetyl-CoA or with a longer fatty acid, longer chain fatty acid. Now this bimodality is very difficult to explain in terms of a single set of enzymes. We therefore have made an attempt to see whether we were dealing with more than one complex, but perhaps 2 tightly interacting complexes of independent systems. But so far no such evidence has been obtained. May I have the next slide please? Early in the purification of the fatty acid synthetase from M. phlei we found that at assay conditions which are normal for all known - or were normal at the time - for all known fatty acid synthetases, for example in 20-micromolar acetyl-CoA enzyme activity was barely detectable. It could be increased, however, by raising the acetyl-CoA concentration very substantially, as I already indicated further, or one could alternately activate the system by fortifying with a crude boiled extract of Mycobacterium phlei – the same source from which the fatty acid synthetase was isolated. And a combination of the 2 gave optimum results. This simply shows a response of a crude boiled extract of fatty acid synthetase activity from this organism in response to a crude extract measured either in terms of its sugar or protein content. At the early stages we were not sure with what type of a molecule we were dealing. Other logical heat-stable factors which were tested, such as acyl carrier protein or perhaps BSA, bovine serum albumen, had no effect; they are not able to activate the system. You see then that you do get activity, very substantial stimulation of this system, by this heat-stable extract. The next slide please. On purification of this heat-stable material it turned out that it contained 2 active factors, which stimulated synthetase activity in this organism. One was simply flavin nucleotide, and the other one was a complex family of carbohydrates, unexpectedly, which could be further separated into 2 classes of medium molecular weight polysaccharides, the compositions of which are shown in the next slide. The next slide please. Before I show you the chemical composition of these polysaccharides I want to indicate here how one can activate this M. phlei system: Either by increasing the substrate concentration of acetyl-CoA without adding any of the factors. Then, when FMN is added, one obtains a significant but not very striking increase in activity. And then, by adding FMN plus what we call stimulating factor, we got then activity, maximal activity, at very low or physiological substrate concentrations. The next slide please. These polysaccharides, which were separated by various procedures of column chromatography, belong to 2 principle classes: One in which the main sugar is a tri-O-methylmannose component and which was independently isolated by Ballou at the University of California. And the second class of polysaccharides - and their molecular weights range from 2 to 4,000 – consists of roughly equal amounts of glucose and 6-O-methylglucose. And in addition, as Ballou has shown, this type of polysaccharide which he refers to as lipopolysaccharide contains acyl chains esterified to some of the free hydroxyl groups. The next slide please. These are due to Ballou’s publication showing a general structure for one of the polysaccharides, which he referred to as MGLP because of its content of methyl glucose, and which contains a certain proportion of methyl groups or hydrophobic groups, and this may be significant, at the 6th position of the sugar; and, as indicated here, contains varying amounts of short chain fatty acids esterified to hydroxyl groups. Next slide shows the second mannose-based structure, containing primarily 3-O-methylmannose residues. And here again there are structural proposals by Ballou which are based on the fact that this type of molecule does not seem to contain a reducing end. And the circular structures are interesting, because in line of some of the interactions which I will describe shortly. Of course, we were mainly interested in finding out what is the role of this unexpected activity of these polysaccharides in stimulating fatty acid synthetase. Very grossly speaking - the next slide please - the effect of these polysaccharides is to lower the Michaelis constant for acetyl-CoA for one of the substrates. And from this data here, which shows the usual line with a work plot, one can calculate that the Km under certain conditions for acetyl-CoA is lowered approximately 50-fold in the presence of these polysaccharides to allow the system to operate under physiological conditions. Yet this is simply another description of a phenomenon rather than a molecular explanation. And we therefore attempted to identify and localise the specific enzyme component in which these polysaccharides may play their role. However, in testing every one of the component enzymes, or partial activities, we were unable to demonstrate effect on an isolated single enzymatic reaction by the polysaccharides. At this point we turned our attention again to the curious and previously mentioned bimodal chain-length pattern, one of the unique features of the M. phlei system, which does not fit into the general patterns of enzyme specificities. On examining whether the fatty acid spectrum was in any way altered by the stimulatory polysaccharides, we did find - the next slide please - we did find that the addition of either the methylmannose- or methylglucose-containing polysaccharides had a very marked effect on the chain-length distribution pattern. The addition of these materials roughly doubled the relative proportion of the shorter chain acid at the expense of the longer chain acid. The pattern was still bimodal but the relative proportion of these 2 families, if you wish, of fatty acids was changed by the addition of the polysaccharides. If we assume that termination of the synthetase process involves a transfer of the enzyme-bound fatty acyl chain, then a stimulation of this enzyme by polysaccharide might account for the increased release of fatty acids in this molecular weight range or chain-length range on addition of polysaccharides. We have so far only preliminary indications that the polysaccharides may act at the level of the palmitoyl transacylase. But in the course of these studies we have observed independently some interesting phenomena which may be relevant to the function of the polysaccharides. The next slide please. which transfer acetyl and malonyl residues from its combinations to coenzyme A to the enzyme complex. And we found that these 2 initiating enzymes are exceedingly sensitive to one of the end products of fatty acid synthetase, namely palmitoyl-CoA. You see here the effects of increasing concentrations of palmitoyl-CoA on the activity of acetyl and malonyl transacylase - the malonyl transacylase being the more sensitive of the 2. At roughly 5 micromolar palmitoyl-CoA, one obtains complete inhibition of this enzyme by one of the end products of the synthetase reaction. Well if one now assays these 2 transacylases in the presence of one of the 2 types of polysaccharides, which I have mentioned, you find that these polysaccharides restore activity to normal at least up to a certain palmitoyl-CoA concentration; that is they counteract the inhibitory effects of palmitoyl-CoA, whether palmitoyl-CoA acts as a feedback inhibitor or not. So a specific and possibly physiologically significant effect of these polysaccharides then is to allow the systems to operate in the presence of a cumulating end product. The same is true - the next slide please - for the overall process of fatty acid synthetase. The normal or controlled system of fatty acid synthesis is over 90% inhibited in the presence of palmitoyl-CoA. Yet on addition of the polysaccharides activity and very small amounts of polysaccharides, activity is restored to normal. Whereas one of the widely used agents to neutralise the inhibitory effects of palmitoyl-CoA, namely bovine serum albumen, has only a very marginal effect, even at very high concentrations. And the same phenomenon, that is inhibition by palmitoyl-CoA and relief of the inhibition by polysaccharide, is true for all fatty acid synthetases which we have tested. And of course 2 questions are raised by these experiments: first, by what mechanism do the polysaccharides protect; and secondly are these effects trivial or do they have regulatory significance? The next slide fairly convincingly answers the first of these 2 issues. When one chromatographs one of these polysaccharides on a bio-gel column, one finds a very distinctive allusion pattern. Whereas similar chromatography of palmitoyl-CoA shows a rather broad allusion pattern, smeared out as it were, and not being alluded in a single sharp peak. If one chromatographs the polysaccharide, or one of the polysaccharides in the presence of palmitoyl-CoA, the 2 emerge from the column in a single sharp peak, suggesting a very strong interaction. The same can be demonstrated if one adds to a column from which palmitoyl-CoA is gradually emerging the polysaccharide then all of a sudden the rest of the palmitoyl-CoA will be discharged from the column, suggesting that these 2 types of molecules are capable of interacting and forming some kind of a complex or sequestered form. Undoubtedly it is the hydrophobic character of the methoxy groups on some of these polysaccharides which may play a role in these interactions. And we have evidence that by removal of these methoxy groups one can negate the binding ability of polysaccharide for palmitoyl-CoA. All workers in the general lipid field had observed that whenever an enzyme is inhibited by palmitoyl-CoA, bovine serum albumen provides some protection or relieves inhibition; simply because of its binding capacity for fatty acids, which is well known and which may be one of the functions of serum albumen in the transport of lipids. However, in the M. phlei system the action of the polysaccharide seems to be more specific. The polysaccharides completely overcome palmitoyl-CoA inhibition under conditions where serum albumen is only marginally effective. Secondly, some the polysaccharide effects cannot at all be duplicated by serum albumen, for example the stimulation of the palmitoyl-CoA transacylase. If we rule out a trivial non-specific effect, what is then the mode of action of these polysaccharides in enhancing fatty acid synthesis in M. phlei? As I mentioned before, these materials markedly enhance the overall activity of the synthetase system in the absence of any added palmitoyl-CoA, and they have similar though much smaller effects on the fatty acid synthetases from other bacterial sources and from yeast. The capacity of the polysaccharides to bind and to interact with palmitoyl-CoA, which is shown in this slide, then raises the possibility that this interaction occurs not only with externally added palmitoyl-CoA, but also with palmitoyl-CoA end product, enzymatically generated by the system itself. If some of the early steps - the next slide please - in the elongation process, namely the initial transacylation reaction which we have seen to be very sensitive to palmitoyl-CoA, unusually sensitive to this end product and subject to feedback inhibition, this system would very soon come to a halt, unless the end product is somehow sequestered or removed in some non-inhibitory form. Our experiment can certainly be interpreted in such a way that the system which generates palmitoyl-CoA and therefore generates its own inhibitor in a typical negative feedback loop, can be operated, can be under a positive control loop by removal of the feedback inhibitor by converting it into an innocuous complexed form. So we may then have both a positive and negative control mechanism for fatty acid synthetase, at least in this special instance. I might add here that the mode of control of fatty acid synthetase in multi-enzyme complex is not at all settled and it may differ from one organism to another. For animal tissue there is strong evidence that the control occurs at a step which precedes the elongation process, namely at the level of the acetyl-CoA-carboxylase which generates malonyl-CoA from acetyl-CoA. That is a reaction which is not associated with a multi-enzyme complex. But there is no evidence for this type of control so far in any other system, including yeast or microbes. Finally I wish to comment on another aspect of the complex control devices that operate in the M. phlei fatty acid synthetase system. As we have seen the chain length pattern of the synthetase produced does not show a single peak, but 2 peaks. And this, of course, has aroused our interest, and we have tried to obtain some insight into the mechanisms which are responsible for this bimodal pattern. I pointed out already that the M. phlei synthetase can be initiated not only with acetyl-CoA, but one can feed also palmitoyl-CoA into the system. However - the next slide please - if one initiates a system with a normal substrate acetyl-CoA – we have seen that this system must be stimulated or supported by factors which we identified as polysaccharides. And these polysaccharides, obtained from crude extracts, are fully capable of replacing the crude boiled factor. Now if one tries to initiate the fatty acid synthetase with palmitoyl-CoA to build it up to 24 carbon atoms, one finds no activity in the absence of any additions. The crude boiled extracts stimulates approximately 100-fold, but in this instance, in contrast to the acetyl-CoA initiation, the polysaccharides will not replace, will not stimulate or allow the system to operate. So clearly it appeared that these crude extracts contained other factors, in addition to the polysaccharides, which were needed for the second phase, if you wish, of this elongation process. The next slide simply tells you that we have been able to separate from these polysaccharides a material which turned out to be a protein, which was essential for the elongation process. And this protein, which we call protein B or elongating factor, has not yet been obtained in pure form; it turns out to be very difficult to purify, although it is heat-stable. But all we know it is a low molecular weight protein with a molecular weight of less than 10,000, and is not identical for example with acyl carrier protein or any other known protein entities. And again we are faced with the problem of finding out, what is the function of this protein – beyond the statement that it is needed in order to allow the elongation process to continue. The next slide shows that this protein, which incidentally is needed in microgram quantities, is effective only with the longer-chain acyl-CoA derivatives; that is it is an elongation factor rather than a factor which is needed for the total fatty acid synthesise starting from acetyl-CoA. The effect becomes significant with 10 carbon atoms and then shows roughly similar activities for medium- and longer-chain fatty acids. The next slide please. In trying to localise the effect of this protein on the elongation pattern, we have had some partial success in showing that the target for this protein appears to be the condensing enzyme that is the enzyme which catalyses the elongation of the carbon chain by 2 carbon atoms. And if you study this condensation process by reversing it and measuring CO2 fixation, you find that this protein has no effect on condensing enzyme and the acyl component is short of a short chain. But if you go up now to C10, C14 and C16, you see very substantial stimulation of the chain lengthening process, as measured by the condensing enzyme by the protein elongation factor. Since we are dealing with a multi-enzyme complex - and we cannot isolate the condensing enzyme from the multi enzyme complex we do not know how many individual reactions are involved in this overall transformation. And therefore - next slide please - we formulate the function of this protein at some stage beyond palmitoyl enzyme. Once the C16 stage has been reached, a new protein enters the picture, which allows the system to carry out the elongation process further and therefore ultimately gives rise to a bimodal chain-length distribution pattern. This appears to be a non-catalytic protein. It may be a regulatory or specifier protein, which may either activate an existing enzyme or change the specificity of a condensing enzyme proper - this remains for further study. I would like to conclude my remarks by posing the question, whether the exceedingly complex mechanism, the mechanism I have described, has a bearing on fatty acid biosynthesis in general; or whether it is confined to mycobacteria with their notoriously complex carbohydrate and lipid chemistry and metabolism. It seems highly probable that the Mycobacterium phlei synthetase serves multiple purposes, providing fatty acids not only for the membrane lipids but also for the lipid components of the mycobacterial cell wall. The next slide please. The phospholipids, the membrane phospholipids in mycobacteria as another bacteria contain fatty acids with 16 or 18 carbons in normal chain length. However, the cell wall of mycobacteria contains very complex lipid structures known as mycolic acids or cord factors, among which C24 acids are major constituents. Therefore, if the bacterial cell operates with a single fatty acid synthetase, it must have some regulatory device which allows it to direct the flow of fatty acids of various chain length, either into the synthetase of phospholipids in the membrane or into the complex lipids and glycolipids of the mycobacteria cell wall. One would therefore expect some very special devices for the control of fatty acid synthetase in this organism. Thank you. Applause.

Professor Weißschädel, sehr geehrte Damen und Herren, die vorherigen Redner haben ein breites Themenspektrum aus den Bereichen Gesellschaft, Physiologie und Medizin angesprochen – in einer für Sie alle deutlichen und verständlichen Sprache. Ich werde von diesem Muster abweichen und zu einem ziemlich fachspezifischen Thema reden. Deshalb muss ich in der Sprache der Chemie und Biochemie reden. Ich erwarte in diesem Zusammenhang einige Kommunikationsprobleme. Leider kann dieses spezielle Sprachproblem bisher nicht in Form einer Simultanübersetzung gelöst werden. Als ich hier vor 3 Jahren einen Vortrag hielt, kommentierte und bedauerte ich die Tatsache, dass Lipide eine relativ geringfügige Rolle in den Konzepten und Dogmen der modernen Biologie und insbesondere der Molekularbiologie spielen. Zum damaligen Zeitpunkt und auch heute noch stehen die Nukleinsäuren und Proteine im Mittelpunkt – und das verdientermaßen, weil diese Makromoleküle uns so viel über die Vererbung und die Prozesse der Informationsübertragung gelehrt haben. Allerdings hat in den letzten Jahren ein ziemlich bedeutsamer Wandel stattgefunden, der größtenteils mit der Erkenntnis zusammenhängt, dass wir zelluläre Aktivitäten ohne tiefgehende Kenntnisse von Struktur und Funktion der Membranzellhüllen, die den Zellinhalt umgeben, weder verstehen noch beschreiben können. Da Lipide neben Protein essentielle Membranbestandteile sind, haben die Struktur und die Biosynthese von Lipiden sowie die Rolle der Lipide in der Modulierung von Membraneigenschaften inzwischen große Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Es wurde bereits – möglicherweise mit übertriebenem Enthusiasmus – behauptet, Membranen seien für die 1970-er und 1980-er Jahre das, was Nukleinsäuren für die 1950-er und 1960-er Jahre waren. Das mag so sein. Das Forschungsfeld gestaltet sich ungewöhnlich aktiv und ist von dem Gefühl durchdrungen, dass wir an der Schwelle bahnbrechender Erfolge stehen, die es uns möglicherweise nicht nur erlauben zu verstehen, wie Membranen funktionieren, sondern auch, wie Membranen synthetisiert werden. Und wenn man Funktionsmembranen synthetisieren kann, sind wir möglicherweise auf gutem Wege zur Synthetisierung von Zellen. Nach dieser ziemlich optimistischen Einführung wende ich mich etwas nüchterner einer Aussage über das Lipidproblem zu, das mit der Membranfunktion zusammenhängt. Nach einem derzeit sehr beliebten Membranmodell – könnte ich bitte das erste Dia haben –, das Singer in Modifikation zum älteren Membranmodell von Danielli vorgeschlagen hat, eine Lipiddoppelschichtstruktur, in die Proteine entweder teilweise oder vollständig eindringen, gibt es eine Anordnung von polaren Teilen des Lipidmoleküls, die sich auf die externe Zellflüssigkeit erstrecken, und eine Anordnung von zwei Schichten dieser Phospholipidstrukturen, in denen die Kohlenwasserstoffketten, die Fettsäureketten, sowohl lateral als auch vertikal miteinander interagieren. Ich möchte auf einen bestimmten Aspekt aufmerksam machen, nämlich dass diese Kohlenwasserstoff- oder hydrophoben Ketten nicht geradlinig angeordnet sind, dass sie in ihrer Struktur unterschiedliche Längen aufweisen und dass die Anordnung dieser Ketten entweder nähere oder entferntere Beziehungen aufweist. Das ist kein Zufall, sondern wurde von den Autoren des Modells absichtlich so gewählt. Und diese spezielle Anordnung der Fettsäurekette ist Teil meiner These. Nach diesem Modell bietet die Lipiddoppelschicht eine flüssige, mobile Matrix, in die andere Moleküle, insbesondere die Proteine, einströmen und in der sie sich bewegen können. Die Betonung liegt hier auf den Membraneigenschaften in der fluiden oder festen Phase, die offensichtlich nur die Lipide liefern können. Wir müssen deshalb untersuchen, warum Lipide speziell geeignet sind, das richtige fluide oder feste Medium bereitzustellen. Das nächste Dia bitte. Die Phospholipide, und dies sind die ubiquitären und universellen Membranlipide, verfügen über die charakteristischen Strukturmerkmale, die ich bereits früher erwähnt habe: eine sogenannte polare Kopfgruppe, die Glycerolphosphat und eine stickstoffhaltige Basis enthält, und damit verbunden die langen Kohlenwasserstoffketten. Dieser polare, nichtpolare oder antipathische Charakter scheint das Geheimnis des Phospholipidmoleküls zu sein. Die polaren Kopfgruppen sind der wässrigen Phase außerhalb der Membran ausgesetzt, während die apolaren Kohlenwasserstoffketten sowohl innerhalb des Moleküls als auch zwischen benachbarten Molekülen durch zusätzliche Van-der-Waals-Interaktionen Kontakt zueinander aufnehmen Die Stärke dieser Interaktionen entscheidet über die Interaktion zwischen diesen Kohlenwasserstoffketten und somit über die Fluidität oder die fehlende Fluidität einer bestimmten Membran. Umgekehrt ist klar, dass die Stärke dieser Interaktionen eine Funktion der Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Kette und der Art und Weise ist, in der diese Kohlenwasserstoffe ausgerichtet sind, was sich wiederum aus dem Van-der-Waals-Radius zwischen benachbarten Ketten ergibt. In einer dicht gedrängten Anordnung, wie hier zu sehen, in einem Phospholipid mit 2 gesättigten Fettsäuren führen die Interaktionen zu physikalischen Eigenschaften, die für Membranen offensichtlich ungeeignet sind. Und tatsächlich findet man in der Natur keine Phospholipidmoleküle, die 2 gesättigte Fettsäureketten enthalten. Im Gegensatz dazu – das nächste Dia bitte – besteht das dominierende Muster in den meisten Phospholipiden aus einer gesättigten Kohlenwasserstoffkette und einer weiteren, in der das Molekül abgewinkelt ist, was die hydrophoben oder apolaren Interaktionen verringert und schwächt. Es stellt sich die Frage: Wie wird diese spezielle Struktur mit Regionen, in denen enge Kontakte bestehen, und Regionen, in denen weniger Kontakte bestehen, erreicht? In der Bakterienmembran, die wir wesentlich genauer kennen als die eukaryotische Membran, findet man am häufigsten Phospholipide, die Paare von gesättigten und ungesättigten olefinischen Säuren enthalten, jeweils 16 Kohlenstoffatome lang. Und charakteristischerweise liegt die cis-olefinische Verbindung irgendwo in der Mitte des Moleküls, an Position 9, 10 oder 11. Und wie ich gesagt habe, sorgt die Doppelbindung dann für einen Knick in der Kohlenwasserstoffkette, was die apolare Interaktion schwächt. Und es ist klar, dass die spezielle Stelle dieser sozusagen störenden Eigenschaft entlang der Kohlenwasserstoffkette eine wichtige Rolle für die Feststellung spielt, ob die Interaktionen stark oder schwach sein werden. Und das kann der Grund dafür sein, dass wir in der Natur, im natürlichen Phospholipid überwiegend, aber nicht ausschließlich olefinische Doppelbindungen an einer speziellen Stelle entlang der Kohlenwasserstoffkette finden. Es deutet nicht viel darauf hin, dass die Natur dieses Strukturmerkmal, eine zentral lokalisierte cis-olefinische Bindung als grundsätzliche Einrichtung gewählt hat, um die geeignete Membranfluidität zu erreichen. Worauf es jedoch offensichtlich ankommt, ist nicht die Chemie der olefinischen Bindung – das nächste Dia bitte –, sondern einfach eine massige oder störende Gruppe an derselben Stelle entlang der Kohlenwasserstoffkette. Hier haben wir das Cis-Olefin, das im vorherigen Modell gezeigt wurde. Es kann beispielsweise durch eine Cyclopropangruppe in bestimmten Bakteriensystemen ersetzt werden, oder man kann dieselbe Störung in der Ausrichtung der Kohlenwasserstoffketten durch Einbringung eines Bromatoms an Position 9, 10 oder durch Einführung einer acetylierten Hydroxyl-Funktion erreichen. In einigen Fällen, bei einigen Bazillen, wird die gleiche Lösung des Membranphospholipids durch Verzweigung der Kohlenwasserstoffkette am Ende oder an vorletzter Stelle erreicht. Es ist also nicht die cis-olefinische Bindung an sich, sondern ein störender Einfluss, eine massige Gruppe, die unter bestimmten Umständen die natürlich vorkommende Cis-Olefin-Struktur ersetzen kann. Eine der derzeit sehr interessanten Fragen lautet: Wie erreicht eine Zelle in einem Phospholipidmolekül die richtige Mischung aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren und dadurch die geeigneten physikalischen Eigenschaften für die Membran? Eine Bedingung, die zumindest eine Variation der Phospholipidzusammensetzung von Membranen in Mikroorganismen zulässt, ist die Temperatur, die Umgebungstemperatur. Seit langem weiß man, dass der Ungesättigkeitsgrad der Fettsäuren infolge veränderter Umgebungstemperaturen starken Veränderungen unterliegt. Und diese Reaktion ist eindeutig eine Anpassung der Zelle zur Erhaltung der Membranfluidität unter nachteiligen oder abnormalen Bedingungen. Und man kann sich die Frage stellen, durch welche regulierenden Mechanismen diese Anpassung erreicht wird. Das nächste Dia bitte. Es gibt mehrere a priori mögliche Mechanismen für das Erreichen der richtigen Flüssigkeit, der richtigen Materialität der Membranen: Einer besteht in der Regulierung der relativen Raten der gesättigten und ungesättigten Säuren. Der andere wären die relativen Aktivierungsraten dieser gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, also die Umwandlung in das aktivierte Derivat, die zur Einbringung des Moleküls in die Phospholipidstruktur erforderlich sind. Oder Verbreitungsgeschwindigkeiten könnten eine Rolle spielen. Und letztendlich könnte der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Auswahl gesättigter oder ungesättigter Fettsäuren zur Einbringung in das Phospholipidmolekül bestehen. Dr. Sinensky hat sich in meinem Labor mit diesem Problem beschäftigt und die Regulierung der Phospholipidsynthese in Escherichia coli untersucht und ist zu der ziemlich unmissverständlichen Antwort gelangt, dass der Mechanismus für die relativen Raten der Esterifizierung über die Zusammensetzung der Membranlipide in diesem Mikroorganismus entscheidet. Sinensky nutzte die Tatsache, dass E. coli-Zellen sowohl gesättigte als auch ungesättigte Fettsäuren aus dem externen Medium aufnehmen oder integrieren, wenn diese bereitgestellt werden. Und unter geeigneten Bedingungen ist das externe Medium in der Tat die grundlegende Fettsäurequelle für die Membranphospholipide. Durch Versorgung der Bakterienzelle mit Tritium-markiertem Oleat und C14-Palmitat während des Wachstums und Messung des Verhältnisses der beiden Isotope in den Membramphospholipiden wies er nach, dass einer der Schritte in der Verwertung der Fettsäuren der Phospholipidsynthese tatsächlich die Temperaturregelung ist. Nächstes Dia bitte. Dieses Feld hier links zeigt die Reaktion als das Verhältnis – können Sie das bitte etwas nach rechts schieben – das Verhältnis von Palmitat zu Oleat, integriert in zelluläre Phospholipide, als Funktion der Temperatur. Zu sehen ist ein sehr markanter Anstieg, um das 4- bis 5-fache zwischen 20 und 30 Grad. Danach gibt es einen Knick in dieser Kurve, der erklärbar ist, aber aus Zeitgründen kann ich hier nicht näher darauf eingehen. Das wichtigere Ergebnis ist, dass das gleiche Phänomen, die Veränderung im relativen Anteil dieser beiden Arten von Fettsäuren in vitro mit isolierten Membranpartikeln reproduziert werden kann, indem sie erneut mit markiertem Palmitat und Oleat versorgt werden. Wieder erreicht man eine temperaturabhängige Veränderung der relativen Mengen von Palmitat und Oleat, die in die zellulären Phospholipide integriert sind. Unabhängige Experimente zeigen, dass die Inkubationstemperatur während des Assays und nicht während des Wachstums über das relative Verhältnis dieser beiden Membranbestandteile entscheidet. Der Effekt der Temperatur wirkt also auf die Enzymaktivität und nicht auf die Enzymsynthese. Eine Induktion oder eine Derepression sind nicht beteiligt. Die Veresterungsenzyme – das nächste Dia bitte – mit denen wir hier zu tun haben, führen Fettsäurereste in Position 1 und 2 des Phospholipidvorgängers ein. Das kann auf verschiedene Weise geschehen: Entweder können Sie diese Reste in Position 1 oder in Position 2 einbringen. Sie können einen nachfolgenden Schritt, eine zusätzliche gesättigte oder eine zusätzlich ungesättigte Fettsäure einführen, was zu 4 verschiedenen Phospholipidarten führt. Das Verhältnis dieser Phospholipidarten entscheidet über die gesamte Phospholipidzusammensetzung und die Eignung der Membramlipide bei einer speziellen Umgebungstemperatur. Wenn die Umgebungstemperatur für das Wachstum des Mikroorganismus normal ist, findet man überwiegend diese Art mit einem gesättigten und einem ungesättigten Molekül vor. Ist die Wachstumstemperatur reduziert, nimmt diese stärker ungesättigte Art zu. Und umgekehrt sehen wir bei einer höheren Temperatur eine relative Zunahme des Verhältnises des 2-fach ungesättigten Phospholipids. Ein letzter erwähnenswerter Aspekt zu diesem Thema ist, dass diese Variationen bei den Lipidzusammensetzungen in E. coli kontinuierlich zur Wachstumstemperatur und nicht in Stufenform verlaufen. Deshalb überrascht es nicht, dass der Temperatureffekt auf enzymatischer statt auf genetischer Ebene vermittelt wird. Der zweite bestimmende Faktor der Phospholipidstruktur und damit der Membranfluidität, wie ich bereits sagte, ist die Länge der Kohlenwasserstoffkette. Und dies führt mich zu dem Thema, auf das ich näher eingehen möchte. Der Aufbau der Kohlenwasserstoffkette bei der Fettsäuresynthese weist einige sehr interessante Merkmale auf, die mit nur wenigen anderen biosynthetischen Prozessen vergleichbar sind. Die Polyisoprenoid-Biosynthese ist möglicherweise der einzige andere vergleichbare Fall. Das nächste Dia bitte. Der Prozess umfasst die sequentielle Aktion einer Reihe von 7 Enzymen, die die Vorgänger aktivieren und kondensieren. Nach Abschluss jeder Sequenz oder jedes Reaktionszyklus wird der Prozess 7- oder 8-mal wiederholt, bis eine Kette von 16 oder 18 Kohlenstoffatomen erreicht ist. Jedes der Enzyme verfügt über eine bemerkenswert breite Spezifität und kann Zwischenprodukte variierender Länge von 4 bis 16 Kohlenstoffatomen bewältigen. Überraschenderweise kommt der Kettenverlängerungsprozess bei 16- oder 18-Carbonsäure zu einem abrupten oder ziemlich abrupten Ende, wie einige typische Fettsäuremuster zeigen. Das nächste Dia bitte. Zum Beispiel Fettsäuresynthetasen von einem Bakterium, beispielsweise vom Corynebacterium oder einer Pflanzenquelle, die wir untersucht haben, weisen dieses Muster auf, bei dem eine spezielle Fettsäure vorherrscht und geringe Mengen Fettsäure mit längeren oder kürzeren Ketten zu finden sind. Dies war absolut zu erwarten. Die einzige Ausnahme von diesem monomodalen Verteilungsmuster haben wir in der Fettsäuresynthese vom Mycobacterium phlei gefunden, das völlig unerwarteterweise ein bimodales Fettverteilungsmuster zeigt. Und ich möchte näher auf diesen Aspekt eingehen. Um die normale oder üblichere Situation der Kettenlängenspezifität im Aufbau der Kohlenwasserstoffkette und ihre Unterbrechung, sagen wir bei 16 Kohlenstoffatomen, zu erklären, haben Lynen und seine Mitarbeiter einen eleganten Mechanismus weiterentwickelt, um den Kettenabbruch zu rationalisieren, und zwar durch die Änderung der relativen Geschwindigkeiten der beiden Komponentenenzyme, nämlich des Kondensationsschritts, durch den die Carbonkette verlängert wird, und des Abbruchprozesses, mit dem das Endprodukt vom Enzym abgesetzt wird. Wenn die Kohlenwasserstoffkette wächst und mit ihr der hydrophobe Charakter des Moleküls zunimmt, begünstigen die Interaktionen zwischen Substrat oder Zwischenprodukt und Enzymprotein den Beendigungsprozess auf Kosten der Kondensierung. Ein solcher Mechanismus würde nicht die absolute Genauigkeit voraussagen, also den Abbruch der Fettsäure in einer einzigen Länge, sondern stattdessen in einem Bereich mit 1 oder 2 dominierenden Kettenlängen. Wie ich bereits sagte, haben wir das vorgefunden – bisher mit 1 Ausnahme. Bevor ich die Eigenschaften dieser ziemlich ungewöhnlichen Fettsäuresynthetase vom Mycobacterium phlei beschreibe, möchte ich zunächst kurz auf einige grundsätzliche Eigenschaften der Fettsäuresynthetase eingehen. Wie eben gesagt, bestehen diese biosynthetischen Übertragungswege aus Enzymsystemen, die durch die sequentielle Aktion von mindestens 7 Enzymen langkettige Fettsäuren aus Acetyl-CoA und Malonyl-CoA bilden. Übereinstimmend mit dem Grundsatz der uns vertrauten biochemischen Einheitlichkeit scheinen die chemischen Mechanismen der einzelnen Schritte für alle Lebensformen identisch abzulaufen: für Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen. Andererseits zeigen Fettsäuresynthetaseenzyme unterschiedlicher Quellen auffallend unterschiedliche molekulare Eigenschaften und Organisationsmuster. Das nächste Dia bitte. Ein klassisches Beispiel für ein Fettsäuresynthetasesystem ist der Multienzymkomplex von Hefe, der erstmalig von Lynen beschrieben wurde, sowie die vergleichbaren Fettsäuresynthetasen von Tiergewebe, die Wakil und Porter beschrieben haben. Und es gibt eine zweite Kategorie von Fettsäuresynthetasen, die die gleiche Art von Reaktionen katalysiert, aber völlig andere Organisationsmuster ausbildet, nämlich solche, die in Bakterien und bestimmten Pflanzensystemen zu finden sind. Das nächste Dia bitte. Was wir gerne als Fettsäuresynthetasen des Typs I bezeichnen, wie durch die Hefefettsäuresynthetase von Lynen verdeutlicht, sind hochorganisierte Multienzymkomplexe, deren Molekulargewicht, abhängig von der Quelle, zwischen einer halben Million und über 2 Millionen schwankt. Alle Tiergewebe enthalten Fettsäuresynthetasen mit grob dem gleichen Molekulargewicht, nämlich eine halbe Million. Und ihre spezifischen Aktivitäten sind ebenfalls grob vergleichbar. Ich habe hier die Tatsache aufgeführt, dass 2 bakterielle Quellen ebenfalls Multienzymkomplexe mit Molekulargewichten enthalten, die den in Hefe vorgefundenen Bereichen entsprechen. Und schließlich gibt es ein weiteres Beispiel für die Fettsäuresynthetase eines Pflanzensystems in der ethylierten Form der Alge Euglena gracilis. Worauf ich hinaus will, ist, dass es sich bei all diesen Enzymsystemen um hochorganisierte Strukturen handelt, deren einzelne Bestandteile Teil des sehr dichten Komplexes sind, dessen einzelne Enzyme man nicht untersuchen kann oder dessen einzelnen Enzyme man nicht vom Komplex trennen kann, da sie so interagieren, dass die Aktivität jedes einzelnen Bestandteils von der Gegenwart anderer Bestandteile abhängig ist. Man findet ein bemerkenswertes Spektrum von Molekulargewichten sowie spezifischen Aktivitäten vor, jedoch mit einer möglichen Ausnahme: Die Untereinheitsstruktur dieses Multienzymkomplexes scheint sehr ähnlich zu sein. Bis auf einen Fall konnte man bisher diese Multienzymkomplexe in Untereinheiten trennen, die ein Molekulargewicht von ungefähr 200.000 aufweisen und funktionell völlig inaktiv sind – entweder hinsichtlich der gesamten Fettsäuresynthese oder der Katalyse einiger Teilreaktionen. Im Gegensatz dazu zeigt das nächste Dia Fettsäuresynthetasen von Bakterien- und Pflanzensystemen, bei denen die einzelnen Komponenten, die 7 Enzyme, als separate Einheiten isoliert und bis zu einem hohen Maß gereinigt werden können und des Weiteren durch den Bedarf eines Moleküls charakterisiert sind, das als ACP oder Acyl-Carrier-Protein bekannt ist und dem System für die Aktivität extern zugeführt werden muss. Demgegenüber stehen die organisierten Enzymsysteme, die ich kurz erwähnte, bei denen dieses ACP oder Acyl-Carrier-Proteinmolekül in diesen stabilen Multienzymkomplex integriert ist. Diese ziemlich auffällige und einmalige Dualität von Fettsäuresynthetaseeigenschaften, die hochorganisierten und die unorganisierten Systeme, interessierten uns grundsätzlich aus 2 Gründen. Erstens wollten wir wissen, ob das Auftreten von Enzymen des Typs I und des Typs II – Typ I sind die organisierten Systeme und Typ II die dissoziierten Systeme – von evolutionärer oder phylogenetischer Bedeutung ist. Zweitens hoffen wir, Beispiele von Fettsäuresynthetasen mit Eigenschaften zwischen Typ I und Typ II zu finden. Wenn solche Zwischen- oder Übergangsformen existieren, könnten sie manipuliert werden, um ihre Trennung und Neuverbindung zu veranlassen. Somit könnten sie als Modelle für die Untersuchung oder Reproduktion des Aufbaus einzelner Enzyme zu Multienzymkomplexen benutzt werden. Beides ist uns bisher nicht gelungen. Aber bei der Suche nach einer geeigneten Enzymquelle unter den komplexeren prokaryotischen Organismen haben wir im Mycobacterium phlei eine Fettsäuresynthetase mit Eigenschaften und Regulierungsmerkmalen gefunden, die uns bemerkenswert erscheinen. Wie ich bereits sagte, enthält das Mycobacterium phlei einen Multienzymkomplex. Das war das erste Beispiel für eine Typ-I-Fettsäuresynthetase in einer bakteriellen Quelle. Und damit wurde nachgewiesen, dass Multienzymkomplexe sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen vorkommen können. Wir haben seitdem Multienzymkomplexe ähnlicher Art auch in einer Corynebacterium-Art und in Streptomyces gefunden. Aber wegen fehlender systematischerer Untersuchungen und im Hinblick auf die unklaren phylogenetischen Beziehungen in Bakterien sind wir zurückhaltend mit der Schlussfolgerung, dass das Auftreten von Fettsäuresynthetasen als hochorganisierte Multienzymkomplexe eine evolutionäre Bedeutung hat. Unter den Eigenschaften der mykobakteriellen Fettsäuresynthetase sind die folgenden ungewöhnlich und bemerkenswert. Das nächste Dia bitte. Der Großteil der untersuchten Fettsäuresynthetasen hat, wie man es nennen könnte, physiologische Km-Werte für eine Substratkonzentration, also für eine Konzentration, die man in der Zelle erwarten kann. Bei Acytel-CoA liegt diese im Bereich von 2 bis 20 Mikromol. Im Gegensatz dazu weist das System des Mycobacterium phlei einen anormal hohen Km-Wert für Acetyl-CoA auf, nämlich rund 800. Wie wir nachweisen konnten, ist es tatsächlich unmöglich, das System mit diesem essentiellen Substrat zu sättigen. Der Km-Wert für Malonyl-CoA im System ist ebenfalls ziemlich hoch, aber weniger auffällig. Eine 2. Anomalität des M. phlei-Systems war der ungewöhnlich hohe Km-Wert für das Reduktionsmittel TPNH, Triphosphopyridin-Nukleotid. Auch das weicht ziemlich von den TPNH-Km-Werten ab, die man in anderen Fettsäuresynthetasesystemen findet. Diese spezielle Eigenschaft konnten wir mit der Tatsache erklären, dass die beiden reduktiven Schritte in Fettsäuresynthesen in Mycobacterium phlei durch zwei Pyridin-Nukleotide unterstützt werden, nämlich TPNH bzw. DPNH, während in vielen anderen untersuchten Systemen TPNH als einzelner Elektronendonor für einen der beiden reduktiven Schritte dienen kann. Das nächste Dia bitte. Ein operatives Problem bei der Reinigung der Fettsäuresynthetase für Mycobacterium phlei war die Anfälligkeit gegenüber schwankenden Ionenstärken. Vielleicht war Lynen mit den Hefefettsäuresynthetasen aus gutem Grund so erfolgreich, weil es sich dabei um ein außerordentlich stabiles Molekül handelt, das Ionenstärken zwischen 0 und 1 Mol unterliegen kann, ohne etwa seine Aktivität oder seine physikalischen Eigenschaften zu ändern, wie hier zu sehen. Im Gegensatz dazu zerfällt das Enzymsystem einer Rattenleber, wenn es einer geringen Ionenstärke ausgesetzt ist, mit einer Halbwertzeit von rund 2 Stunden. Und das System von Mycobacterium phlei zerfällt bei geringer Ionenstärke mit einer Halbwertzeit von 4 bis 5 Minuten. Das hat die Verfahren, die man zur Reinigung des Enzymsystems verwenden kann, enorm eingeschränkt. Das nächste Dia bitte. Dieses Dia verdeutlicht wiederum einen Aspekt der vergleichenden Biochemie und möglicherweise die Unterschiede in den zellulären Umgebungen verschiedener Lebensformen. Hier sehen wir wieder die Empfindlichkeit verschiedener Fettsäuresynthetasen aus unterschiedlichen Quellen als Funktion der Ionenstärke. Das Hefeenzym ist in einem über 50-fachen Bereich der Phosphatpufferkonzentration überhaupt nicht betroffen. Das zweite Enzym von Corynebacterium diphtheria zeigt absolut keine Aktivität beim 100 Mol Phosphat und benötigt für eine optimale Aktivität 0,5 Mol Phosphat. Ähnlich zeigt das Enzym des Mycobacterium phlei keine Aktivität bei geringer Ionenstärke. Dann steigt sie bei über einem Zehnfachen der Konzentration steil an und fällt wieder leicht ab. Und schließlich zeigt die Fettsäuresynthetase von Euglena gracilis das gegenteilige Verhalten: Sie erreicht ihre optimale Aktivität bei sehr geringer Ionenstärke und ist bei 0,5 Mol Phosphat völlig blockiert. Für uns bedeutet das einfach, dass das Umfeld dieser verschiedenen Enzymsysteme in verschiedenen Zellen völlig unterschiedlich ist. Und weil es sich bei diesen Prozessen um membranassoziierte Prozesse handelt, ist klar, dass sich Membranumgebung und Membranstruktur verschiedener Organismen enorm voneinander unterscheiden müssen. Das nächste Dia bitte. Ich erwähnte bereits das bimodale Kettenlängenmuster, das von der mykobakteriellen Fettsäuresynthetase produziert wird, mit 2 Peaks, einem bei 18 Kohlenstoffatomen und dem anderen bei 24 Kohlenstoffatomen, abhängig davon, ob man eine Kette mit Acetyl-CoA oder mit einer längerkettigen Fettsäure initiiert. Diese Bimodalität lässt sich nur sehr schwer mit einer einzigen Enzymreihe erklären. Wir haben deshalb versucht festzustellen, ob wir es mit mehr als einem Komplex zu tun haben, vielleicht mit 2 eng interagierenden Komplexen unabhängiger Systeme. Aber bisher konnte das nicht nachgewiesen werden. Bitte das nächste Dia. Bei der Reinigung der Fettsäuresynthetase von M. phlei fanden wir bereits früh heraus, dass unter Assay-Bedingungen, die damals für alle bekannten Fettsäuresynthetasen normal waren, beispielsweise in 20 Mikromol Acetyl-CoA, die Enzymaktivität kaum feststellbar war. Wie bereits gesagt, konnte sie jedoch durch Erhöhung der Acetyl-CoA-Konzentration sehr stark gesteigert werden. Als Alternative konnte man das System durch Anreicherung mit einem rohen/gekochten Extrakt von Mycobacterium phlei aktivieren – derselben Quelle, aus der die Fettsäuresynthetase isoliert wurde. Eine Kombination aus beiden ergab optimale Ergebnisse. Hier sieht man einfach eine Reaktion eines rohen/gekochten Extraktes einer Fettsäuresynthetaseaktivität von diesem Organismus als Reaktion auf einen Rohextrakt, entweder anhand seines Zucker- oder seines Proteingehalts gemessen. In den Frühphasen waren wir nicht sicher, mit welchem Molekültyp wir es zu tun haben. Andere logische hitzebeständige Faktoren, die wir ausprobierten, etwa Acyl-Carrier-Protein oder BSA, Rinderserumalbumin, zeigten keine Wirkung. Sie konnten das System nicht aktivieren. Sie sehen, dass durch diesen hitzebeständigen Extrakt eine erhebliche Stimulierung und Aktivierung dieses Systems erfolgt. Das nächste Dia bitte. Bei der Reinigung dieses hitzebeständigen Materials stellte sich heraus, dass es 2 aktive Faktoren enthält, die die Synthetaseaktivität in diesem Organismus stimulieren. Einer war einfach Flavinnukleotid und der andere unerwarteterweise eine komplexe Familie von Kohlenwasserstoffen, die weiter in 2 Kategorien von Polysacchariden mit mittlerem Molekulargewicht unterteilt werden konnten. Deren Zusammensetzungen sind im nächsten Dia zu sehen. Das nächste Dia bitte. Bevor ich Ihnen die chemische Zusammensetzung dieser Polysaccharide präsentiere, möchte ich aufzeigen, wie man dieses M. phlei-System aktivieren kann: entweder durch Erhöhung der Substratkonzentration von Acytel-CoA ohne Zugabe von Faktoren. Dann erhält man nach Zugabe von FMN eine signifikante, wenn auch nicht sehr markante Aktivitätssteigerung. Und durch Zugabe von FMN plus dem, was wir als stimulierenden Faktor bezeichnen, erhielten wir eine maximale Aktivität bei sehr geringen oder physiologischen Substratkonzentrationen. Das nächste Dia bitte. Diese Polysaccharide, die über verschiedene Verfahren der Säulenchromatographie getrennt wurden, gehören zu 2 Grundklassen: Eine, in der der Hauptzucker eine Tri-O-Methylmannose-Komponente ist, die von Ballou an der University of California unabhängig isoliert wurde. Und die zweite Klasse von Polysacchariden – ihre Molekulargewichte reichen von 2 bis 4.000 – besteht aus ungefähr gleichen Mengen von Glucose und 6-O-Methylglucose. Und wie Ballou nachgewiesen hat, enthält diese Polysaccharid-Art, die er als Lipopolysaccharid bezeichnet, zusätzlich Acyl-Ketten, die mit einigen der freien Hydroxylgruppen verestert sind. Das nächste Dia bitte. Diese stammen aus Ballous Veröffentlichung und zeigen eine grundsätzliche Struktur für eines der Polysaccharide, das er aufgrund seines Gehalts an Methylglucose als MGLP bezeichnete und das einen bestimmten Anteil Methylgruppen oder hydrophobische Gruppen enthält, und an Position 6 des Zuckers – und das könnte bedeutsam sein und ist hier zu sehen – schwankende Mengen kurzkettiger Fettsäuren enthält, die mit Hydroxylgruppen verestert sind. Das nächste Dia zeigt die zweite mannose-basierte Struktur, die überwiegend 3-O-Methylmannose-Reste enthält. Und hier sind wieder Strukturmodelle von Ballou zu sehen, die auf der Tatsache basieren, dass diese Molekülart kein reduzierendes Ende zu enthalten scheint. Die Rundstrukturen sind interessant, weil sie einigen der Interaktionen entsprechen, die ich kurz beschreiben will. Natürlich wollten wir hauptsächlich herausfinden, welche Rolle die unerwartete Aktivität dieser Polysaccharide bei der Stimulierung der Fettsäuresynthetase spielt. Sehr grob gesagt – das nächste Dia bitte – besteht die Wirkung dieser Polysaccharide darin, die Michaelis-Konstante für Acetyl-CoA für eines der Substrate zu verringern. Und aus diesen Daten hier, die die gewöhnliche Linie darstellen, kann man errechnen, dass der Km unter bestimmten Bedingungen für Acetyl-CoA bei Vorhandensein dieser Polysaccharide ca. 50-fach herabgesetzt ist, damit das System unter physiologischen Bedingungen funktionieren kann. Dies ist einfach eine weitere Beschreibung eines Phänomens statt einer molekularen Erklärung. Deshalb versuchten wir den speziellen Enzymbestandteil, in dem diese Polysaccharide ihre Rolle spielen könnten, zu identifizieren und zu lokalisieren. Bei der Untersuchung der einzelnen Enzymkomponenten oder von Teilaktivitäten ist es uns jedoch nicht gelungen, Auswirkungen der Polysaccharide auf eine isolierte enzymatische Reaktion nachzuweisen. An dieser Stelle richteten wir unsere Aufmerksamkeit erneut auf das merkwürdige und schon erwähnte bimodale Kettenlängenmuster, eines der einzigartigen Merkmale des M. phlei-Systems, das nicht zu den generellen Mustern von Enzymspezifitäten passt. Als wir untersuchten, ob das Fettsäurespektrum in irgendeiner Weise durch die stimulierenden Polysaccharide verändert wurde, stellten wir fest – das nächste Dia bitte -, dass die Zugabe von Methylmannose oder Methylglucose enthaltenden Polysacchariden einen sehr markanten Effekt auf das Muster der Kettenlängenverteilung hatte. Bei Zugabe dieser Materialien verdoppelte sich der relative Anteil der kürzerkettigen Säure zu Lasten der längerkettigen Säure. Das Muster war nach wie vor bimodal, aber der relative Anteil dieser beiden, wenn man so will, Familien von Fettsäuren veränderte sich durch Zugabe der Polysaccharide. Wenn wir annehmen, dass die Beendigung des Synthetaseprozesses mit einer Übertragung der enzymgebundenen Fettacylkette, könnte eine Stimulierung dieses Enzyms durch Polysaccharid zu der erhöhten Fettsäurefreisetzung in diesem Molekulargewichtsbereich oder Kettenlängenbereich bei Zugabe von Polysacchariden beitragen. Wir haben bisher nur vorläufige Hinweise darauf, dass die Polysaccharide auf der Ebene der Palmitoyl-Transacylase wirken könnten. Aber im Verlauf dieser Studien haben wir unabhängig voneinander mehrere interessante Phänomene beobachtet, die für die Funktion der Polysaccharide interessant sein könnten. Das nächste Dia bitte. die Acetyl- und Malonylreste aus ihren Kombinationen mit Koenzym A auf den Enzymkomplex übertragen. Und wir stellten fest, dass diese beiden initiierenden Enzyme übermäßig empfindlich auf eines der Endprodukte der Fettsäuresynthetase, nämlich Palmitoyl-CoA, reagieren. Sie sehen hier die Effekte zunehmender Palmitoyl-CoA-Konzentrationen auf die Aktivität von Acetyl und Malonyl-Transacylase – wobei die Malonyl-Transacylase die empfindlichere der beiden ist. Bei rund 5 Mikromol Palmitoyl-CoA ist eine vollständige Hemmung dieses Enzyms durch eines der Endprodukte der Synthetasereaktion erreicht. Wenn man jetzt diese beiden Transacylasen in Gegenwart einer der beiden von mir erwähnten Polysaccharidarten untersucht, stellt man fest, dass diese Polysaccharide ihre Aktivität auf normalem Niveau wieder herstellen, bis mindestens eine bestimmte Palmitoyl-CoA-Konzentration erreicht ist. Sie wirken also den hemmenden Effekten von Palmitoyl-CoA unabhängig davon entgegen, ob Palmitoyl-CoA als Reaktionshemmer agiert oder nicht. Ein spezieller und möglicherweise physiologisch signifikanter Effekt dieser Polysaccharide ist also, das Funktionieren der Systeme in Gegenwart eines sich aufbauenden Endprodukts zu ermöglichen. Das Gleiche gilt – das nächste Dia bitte – für den Gesamtprozess der Fettsäuresynthetase. Das normale oder geregelte System der Fettsäuresynthese wird in Gegenwart von Palmitoyl-CoA zu über 90% gehemmt. Bei Zugabe der Polysaccharidaktivität und sehr geringen Polysaccharidmengen wird die Aktivität jedoch wieder normalisiert. Dagegen hat einer der häufig zur Neutralisierung der hemmenden Effekte von Palmitoyl-CoA eingesetzten Wirkstoffe, nämlich Rinderserumalbumin, auch in sehr hohen Konzentrationen nur einen sehr marginalen Effekt. Dasselbe Phänomen, nämlich die Hemmung durch Palitoyl-CoA und die nachlassende Hemmung durch Polysaccharid, gilt für alle Fettsäuresynthetasen, die wir getestet haben. Diese Experimente werfen natürlich zwei Fragen auf: Das nächste Dia beantwortet die erste dieser beiden Fragen ziemlich überzeugend. Wenn man eines dieser Polysaccharide in einer Bio-Gel-Säure chromatographiert, erhält man ein sehr deutliches Hinweismuster, während eine vergleichbare Chromatographie von Palmitoyl-CoA ein Muster mit relativ breiter Absorption zeigt, das verwischt erscheint und keinen einzelnen scharfen Peak anzeigt. Wenn man das Polysaccharid oder eines der Polysaccharide in Gegenwart von Palmitoyl-CoA chromatographiert, kommen die beiden in einem einzigen scharfen Peak aus der Säule. Das lässt eine sehr starke Interaktion vermuten. Dasselbe ist nachweisbar, wenn man zu einer Säule, aus der allmählich Palmitoyl-CoA kommt, das Polysaccharid zugibt. Dann wird plötzlich der Rest des Palmitoyl-CoA aus der Säule abgegeben, was vermuten lässt, dass diese beiden Molekülarten interagieren können und eine Art Komplex oder sequestrierte Form bilden können. Zweifelsohne ist es der hydrophobe Effekt der Methoxy-Gruppen auf einige dieser Polysaccharide, der bei diesen Interaktionen eine Rolle spielen könnte. Und wir haben Hinweise darauf, dass man durch Eliminierung dieser Methoxy-Gruppen die Bindefähigkeit von Polysaccharid für Palmitoyl-CoA negieren kann. Alle auf dem allgemeinen Gebiet von Lipiden tätigen Forscher haben beobachtet, dass immer dann, wenn ein Enzym durch Palmitoyl-CoA gehemmt wird, Rinderserumalbumin Schutz bietet oder die Hemmung herabsetzt. Das hängt ganz einfach mit seiner Bindefähigkeit für Fettsäuren zusammen, die bekannt ist und eine der Funktionen von Serumalbumin im Lipidtransport sein kann. Im M. phlei-System scheint jedoch die Aktion des Polysaccharids spezieller zu sein. Unter Bedingungen, bei denen Serumalbumin nur marginal wirksam ist, überwinden die Polysaccharide die Palmitoyl-CoA-Hemmung komplett. Zudem können einige der Polysaccharideffekte nicht mit Serumalbumin wiederholt werden, beispielsweise die Stimulation der Palmitoyl-CoA-Transacylase. Wenn wir einen unbedeutenden, unspezifischen Effekt ausschließen: Welche Funktion übernehmen dann diese Polysaccharide in der Verbesserung der Fettsäurensynthese in M. phlei? Wie ich bereits sagte, verbessern diese Materialien in markanter Weise die Gesamtaktivität des Synthetasesystems bei Abwesenheit von zusätzlichem Palmitoyl-CoA. Sie zeigen ähnliche, wenn auch wesentlich geringere Effekte auf Fettsäuresynthetasen aus anderen bakteriellen Quellen und aus Hefe. Die Fähigkeit der Polysaccharide, sich an Palmitoyl-CoA zu binden und damit zu interagieren, wie auf diesem Dia zu sehen, bringt die Möglichkeit ins Spiel, dass diese Interaktion nicht nur mit von außen zugesetztem Palmitoyl-CoA funktioniert, sondern auch mit einem Palmitoyl-CoA-Endprodukt, das enzymatisch vom System selbst produziert wird. Wenn einige der ersten Schritte - bitte das nächste Dia - im Elongationsprozess, vor allem in der anfängliche Transacylierungsreaktion, die, wie wir gesehen haben, sehr empfindlich auf Palmitoyl-CoA reagiert, ungewöhnlich empfindlich auf dieses Endprodukt reagiert und einer Feedback-Inhibition unterliegt, würde dieses System bald zum Stillstand kommen, wenn das Endprodukt nicht in irgendeiner Form zu einer nicht-hemmenden Form sequestriert oder entfernt wird. Unser Experiment kann sicherlich so interpretiert werden, dass das System, das Palmitoyl-CoA und damit seinen eigenen Hemmer in einer typischen, negativen Feedbackschleife erzeugt, durch eine positive Regelungsschleife gesteuert werden könnte, indem der Feedback-Hemmer entfernt und in eine unschädliche komplexe Form verwandelt wird. Wir haben dann also, zumindest in diesem speziellen Fall, sowohl einen positiven als auch einen negativen Regulierungsmechanismus für die Fettsäuresynthetase. Ich möchte hier ergänzen, dass der Regulierungsmodus für die Fettsäuresynthetase im Multienzymkomplex überhaupt nicht feststeht und von einem zum anderen Organismus variieren kann. Bei tierischem Gewebe gibt es aussagekräftige Hinweise darauf, dass die Regulierung in einem Schritt erfolgt, der dem Elongationsprozess vorausgeht, nämlich auf der Ebene der Acetyl-CoA-Carboxylase, die Malonyl-CoA aus Acetyl-CoA produziert. Diese Reaktion ist nicht mit einem Multienzymkomplex verbunden. Aber bisher gibt es für eine derartige Regulierung keine Nachweise in einem anderen System, wie in Hefe oder Mikroben. Abschließend möchte ich auf einen weiteren Aspekt der komplexen Regulierungsmechanismen eingehen, die im M. phlei-Fettsäuren-Synthetasesystem wirksam sind. Wie wir gesehen haben, weist das Kettenlängenmuster der erzeugten Synthetase keinen einzelnen Peak, sondern 2 Peaks auf. Das hat natürlich unser Interesse geweckt und wir haben versucht, die Mechanismen zu verstehen, die für dieses bimodale Muster verantwortlich sind. Ich habe darauf hingewiesen, dass die M. phlei-Synthetase nicht nur mit Acetyl-CoA initiiert werden kann, sondern dass man auch Palmitoyl-CoA in das System eingeben kann. Wenn man jedoch – bitte das nächste Dia – ein System mit einem normalen Substrat Acetyl-CoA initiiert, muss man dieses System durch Faktoren stimulieren oder unterstützen, die wir als Polysaccharide identifiziert haben. Und diese Polysaccharide aus Rohextrakten können den rohen/gekochten Faktor in vollem Umfang ersetzen. Wenn man versucht, die Fettsäuresynthetase mit Palmitoyl-CoA zu initiieren, um sie auf 24 Kohlenstoffatome aufzubauen, stellt man keinerlei Aktivität fest, sofern keine Zusätze hinzukommen. Die rohen/gekochten Extrakte sorgen für eine Stimulierung um das rund 100-fache. Aber in diesem Fall ersetzen, stimulieren oder ermöglichen die Polysaccharide im Gegensatz zur Acetyl-CoA-Initiierung nicht die Systemfunktion. Deshalb war offensichtlich, dass diese Rohextrakte neben den Polysacchariden andere Faktoren enthielten, die für die zweite Phase dieses, wenn Sie so wollen, Elongationsprozesses benötigt werden. Das nächste Dia zeigt einfach, dass wir in der Lage waren, ein Material von diesen Polysacchariden zu trennen, das sich als ein für den Elongationsprozess wesentliches Protein herausstellte. Dieses Protein, das wir als Protein B oder den Elongationsfaktor bezeichnen, wurde bisher noch nicht in Reinform gewonnen. Obwohl es hitzebeständig ist, gestaltete sich die Reinigung ziemlich schwierig. Alles, was wir wissen, ist, dass es sich um ein Protein mit geringem Molekulargewicht handelt, nämlich mit einem Molekulargewicht unter 10.000, und dass es beispielsweise nicht mit dem Acyl-Carrier-Protein oder anderen bekannten Proteineinheiten identisch ist. Und erneut müssen wir herausfinden, welche Funktion dieses Protein hat – über die Aussage hinausgehend, dass es zur Fortsetzung des Elongationsprozesses benötigt wird. Das nächste Dia zeigt, dass dieses Protein, das übrigens in Mikrogrammmengen benötigt wird, nur mit den längerkettigen Acyl-CoA-Derivaten wirksam ist. Es geht also eher um einen Elongationsfaktor als um einen Faktor, der für die gesamte Fettsäuresynthese, angefangen bei Acetyl-CoA nötig ist. Der Effekt wird bei 10 Kohlenstoffatomen signifikant und zeigt dann ungefähr die gleichen Aktivitäten für mittel- und längerkettige Fettsäuren. Das nächste Dia bitte. In dem Versuch, die Auswirkungen dieses Proteins auf das Elongationsmuster zu lokalisieren, hatten wir einen Teilerfolg. Das Ziel dieses Proteins scheint das kondensierende Enzym zu sein, das Enzym also, das die Elongation der Kohlenstoffkette durch zwei Kohlenstoffatome katalysiert. Wenn man diesen Kondensierungsprozess durch Umkehr und Messung der Co2-Fixierung analysiert, stellt man fest, dass dieses Protein keine Wirkung auf das kondensierende Enzym hat und die Acyl-Komponente keine kurze Kette aufweist. Wenn man jetzt zu C10, C14 und C16 hinaufgeht, erkennt man eine sehr umfangreiche Stimulierung des Kettenlängungsprozesses, gemessen anhand des kondensierenden Enzyms durch den Protein-Elongationsfaktor. Da wir es mit einem Multienzymkomplex zu tun haben und wir das kondensierende Enzym nicht vom Multienzymkomplex isolieren können, wissen wir nicht, wie viele individuelle Reaktionen mit dieser Gesamttransformation verbunden sind. Und deshalb – bitte das nächste Dia – formulieren wir die Funktion dieses Proteins in einer Phase jenseits des Palmitoyl-Enzyms. Sobald die C16-Phase erreicht ist, tritt ein neues Protein ins Bild, das dem System die Fortsetzung des Elongationsprozesses ermöglicht und deshalb letztendlich ein bimodales Kettenlängenverteilungsmuster verursacht. Dies scheint ein nicht-katalytisches Protein zu sein. Es kann ein Regulationsprotein oder ein Spezifikationsprotein sein, das entweder ein bestehendes Enzym aktiviert oder die Spezifität eines kondensierenden Enzyms korrekt verändert – das muss weiter untersucht werden. Ich möchte meine Ausführungen mit der Frage beenden, ob der überaus komplexe Mechanismus, den ich beschrieben habe, einen grundsätzlichen Einfluss auf die Fettsäure-Biosynthese hat oder ob er auf die Mykobakterien mit ihrer notorisch komplexen Kohlenhydrat- und Lipidchemie und -stoffwechsel begrenzt ist. Es scheint sehr wahrscheinlich, dass die Mycobacterium phlei-Synthetase mehreren Zwecken dient und nicht nur Fettsäuren für die Membranlipide, sondern auch für die Lipidbestandteile der mykobakteriellen Zellenwand liefert. Nächstes Dia bitte. Die Phospholipide, die Membranphospholipide in Mykobakterien sowie in weiteren Bakterien enthalten Fettsäuren mit 16 oder 18 Kohlenstoffen in normaler Kettenlänge. Allerdings enthält die Zellwand von Mykobakterien sehr komplexe Lipidstrukturen, die als Mykolsäuren oder Kettenfaktoren bekannt sind, worunter die C24-Säuren die wichtigsten Bestandteile sind. Wenn also die Bakterienzelle mit einer einzelnen Fettsäuresynthetase arbeitet, muss es einen Regulierungsmechanismus geben, der die Lenkung des Stroms von Fettsäuren unterschiedlicher Kettenlänge entweder zur Synthetase von Phospholipiden in der Membran oder zu den komplexen Lipiden und Glycolipiden der mykobakteriellen Zellwand ermöglicht. Man darf also sehr spezielle Mechanismen zur Regelung der Fettsäuresynthetase in diesem Organismus erwarten. Danke.

Konrad Bloch (1972)

Control Aspects of Lipid Biosynthesis

Konrad Bloch (1972)

Control Aspects of Lipid Biosynthesis

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The world’s best-selling class of drugs, the statins, have been developed based on knowledge independently gained by Konrad Bloch and Feodor Lynen who shared the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1964 for their elucidation of the biosynthesis of cholesterol – an intracellular marathon involving more than 30 steps. While the launch of the first drug of this class, atorvastatin, lay still 32 years ahead when Bloch held his Nobel lecture, and the medical rationale for the application of statins still had to be established[1], he rightly anticipated their molecular target: „If the principle of negative feedback operates in sterol biosynthesis as it does in so many pathways, then the first specific step of the sequence should be rate limiting and it should be sensitive to cholesterol, the end product of the biosynthetic sequence. With these considerations in mind, attention has been focused on the reduction of hydroxymethylglutaryl-CoA to mevalonic acid as a likely control site.“[2] In the early 1970s, the Japanese biochemist Akira Endo succeeded in extracting the prototype of HMG-CoA inhibitors[3], which became known as statins. While these drugs globally have generated cumulative sales of between one third and half a trillion dollars as of today, Endo did not receive any royalty for his groundbreaking work.

Bloch is well aware of current applied research activities to control the biosynthesis of cholesterol when he lectures in Lindau in 1972, yet his basic research interest now primarily aims at understanding the function of cellular membranes, including the role cholesterol plays in their composition. „It has been recognized that we cannot understand or describe cellular activities without an intimate knowledge of the structure and function of cell envelopes or the membranes, which surround the cell content, and since lipids along with proteins are essential membrane components, lipids have attracted wide attention“ he says and explains to his audience the Fluid-Mosaic-Model of the cell membrane, which Singer and Nicholson had proposed just four months before[4]: Proteins are embedded in a fluid bilayer, partly integrated, partly peripherally attached, with sugar moieties anchored on many proteins of the outer surface, and in this fluid mosaic, both lipids and proteins diffuse laterally in the plane of the membrane.

Drawing on this brand-new model, Bloch briefly recalls why lipids are uniquely suited to provide the fluid medium of membranes: „The amphiphilic character appears to be the secret of the lipid molecule.“ He then discusses environmental temperature and the length of the hydrocarbon chain as major determinants of the phospholipid structure and hence the fluidity of the membrane and goes on to describe the fatty acid synthesis with its sequential action of a set of seven enzymes, a chain lengthening process with „some very intriguing features“, which „surprisingly comes to a rather abrupt halt at a length of 16 or 18 acids“. To explain and illustrate the complex mechanism of lipid biosynthesis, Bloch subsequently devotes most of the time of his talk to discuss his current research on the properties of the fatty acid synthetase from mycobacterium phlei, the results of which he would submit for publication a few weeks later[5]. Notwithstanding the substantial increase of our knowledge about the function of membranes and the physiological role of lipids since the 1970s, Bloch’s state-of-the-art-introduction about his research on a highly organized multi-enzyme complex allows a fascinating insight into the workshop of an eminent scientist.

Joachim Pietzsch

[1] The discovery of the LDL-receptor by Brown and Goldstein in 1973, for which they shared the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1985, was a milestone on this way.

[2] Konrad Bloch: The biological synthesis of cholesterol, p.97 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1964/bloch-lecture.html

[3] Endo A, Kuroda M, Tsujita Y (December 1976). "ML-236A, ML-236B, and ML-236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Penicillium citrinium". Journal of Antibiotics (Tokyo) 29 (12): 1346–8.

[4] Singer SJ and Nicolson GL (Feb. 18, 1972). The Fluid Mosaic Model of the structure of cell membranes. Science 175: 720-731.

[5] Vance DE, Mitshuhashi O and Bloch K. Purification and properties of the fatty acid synthetase from Mycobacterium phlei. J. Biol. Chem. 1973, 248:2303-2309.

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