Martin Chalfie (2009) - GFP and After

Since its introduction as a biological marker, the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein (GFP) has had a strong impact in biology, being used in an ever-increasing variety of ways

I think this is quite nice. In any case my inspiration came on April 25th 1989 when I went to a seminar given by Paul Brehm and Paul described the work that Osamu just talked about, about the jelly fish and described both the fact that the Aequorea if it had calcium would give blue light, something I had heard of previously and then something I had never heard of before which was that Aequorea plus calcium plus this wonderful protein called green fluorescent protein gave off green light. And that you could shine a UV light on GFP and you would get green light. Now all the time in the previous 10 years, I had been telling people that the really wonderful thing about working on this small worm that I had been working on was the fact that it was transparent. Now after you say this for 10 years straight you begin to believe it, that the animal is transparent. And I told you how much trouble we had looking at how genes were expressed. So when I heard this I was astonished, I ignored the whole rest of the seminar, I probably just day dreamed the whole time through about what we were going to do. The next day I, these are the scribblings from the next day of trying to call up and find out who was actually doing the work and I found that Douglas Prasher was cloning the CDNA. We had a little bit of trouble because we got out of touch with each other for several years. But in 1992 we got back together and Douglas sent us the clone for the CDNA and this was because I had a very nice graduate student who had just started Ghia Euskirchen and we were off to try to find out if this would work. Now I should give you a little background, people knew by this time that the fluorescent protein didn’t need any other added component. And that was good because we didn’t want to have to permeabilise the cells or anything to get stuff in. But the problem was that, I guess its out of order here, I’ve lost the slide, it must be somewhere else in here. So let me just describe the situation. The problem is that that primary amino acid backbone had to form a 5 membered ring to it and no one knew how many enzymes it was going to take to make that. So there was a gamble and most people bet that it was going to require something else, that it could not work on its own. Well Ghia got the clone and we talked about how to do it, here’s a picture of Ghia and within one month of getting the clone this new graduate student had green fluorescing bacteria as it shows here in her lab notebook. So we were extremely excited. But there’s another important point about this, so this seems to say the experiments are pretty easy, you know just do the experiment, we were very lucky. And one of the reasons we were lucky is actually up here, it says that use the scope, she used the scope from 368 engineering terrace and the reason that’s an important note is she had just gotten her masters in chemical engineering and knew, at Columbia, knew that there was a really good florescent microscope in her lab, the old lab. She also knew that the florescence microscope in my lab was a piece of junk. And that it would not work. And had we looked down our microscope at her samples, we would have said the experiment didn’t work, that would have been horrible. But she had the good sense to realise that our microscope was not very good, it was a rather old microscope. And so she went off to her old lab, used their microscope and got this wonderful result. This lead to a problem of sort of how to do science now that we know that we have something exciting to look at but also know that our equipment is absolutely no good. I solved this problem first by trying to borrow a departmental microscope until I got kicked off of that. And then called up the representatives of various companies saying that I wanted to buy a microscope and would they bring a loner, so I could try it out and wouldn't it be nice if they could leave the loner for a month or so. And they did and so if you look in our paper you’ll see that there’s a footnote, it’s a rather strange footnote because it says you can see the florescence on this microscope, that microscope, that one and that one, I’m thanking all the people that gave, let me use their microscope, in the paper. In any case we express this in worms, we did a couple of other experiments and then we went off to try to publish this. And as you know it was published in Science but there were a number of problems, the first problem was the title, we submitted the paper as "Green florescent protein, a new marker for gene expression", we were very excited about this as a nice title. And as you may know the people at Science, the editors look at the papers first and decide whether they’re worthy enough to go to reviewers. And so I got a call back saying no it wasn’t worthy enough, because of the title. And I said what's wrong with the title, they said well every article in Science magazine is new and novel so you cannot use those words, you have to take the word out of the title. I don’t like to be told what to do, so the title that the reviewers got was a little bit different from this, it was "The Aequorea Victoria green florescent protein needs no exogenously added component to produce a florescent product in prokaryotic and eukaryotic cells." In other words this is the whole paper. They then, they accepted it and then the copy editor said to me, you know that title, it’s a little bit too long, could you change it and so I did back to almost the original title which was probably what they wanted in the beginning. The other thing has to do with the picture here which I was very proud of, you can actually see this nerve cell growing out with its growth cone, this is in a living animal, I was very excited about this. And the art editor, cover editor called me and said you know it’s a very nice picture except there’s one colour that we really try never to use on the cover because it’s very hard to reproduce and that’s green, can we change it to another colour, and I said no you can’t. And then the final problem, so these are all the problems you have in trying to publish your work, its really, the final thing is that we had already given out samples of the C DNA to quite a number of people and they were already reporting their successes to us. And we asked people for permission to use their unpublished work in our article and most people readily gave it. Except for one person who wrote this letter. provided you meet the following conditions. You make coffee each Saturday morning for the next 2 months, ready by 8.30 AM, you prepare a special French dinner at the time of the choosing and you empty the garbage nightly for the next month. This is my wife. But it was very important because what she did was really the next step in the evolution of GFP, she was the first person to make a fusion protein, adding GFP to a protein she was interested in. It was a protein that she was interested in the developing egg, which is this large bit on the right here in this picture, of drosophila and she wanted to know where that protein went. And you can see that it is, it’s made in the cells on the left hand side, it’s transported into the developing egg on the right and you can see that it’s being deposited at the pole, it’s actually at both poles its being deposited. And she could actually put this into a mutant that didn’t have the normal gene and this would replace it. So she knew it was doing the right thing. And she was able to watch where it was going in the living ovocytes. So this was a profoundly important thing. So I think I did all those requirements but she claims I didn’t, so we’re still debating about this, nonetheless it was published. So what made GFP and what makes GFP very useful, first it can be genetically encoded, we can put it in an organism and the next line, progeny and all so on all have this as well, we don’t have to do the prep every time. It’s non invasive, all we have to do is shine blue light on it and we get green light back. We’re not fixing the animals, we’re not permeabilising them, we can simply shine light on them, which is fairly innocuous. The molecule is small and monomeric and the advantage there is that it actually can diffuse throughout the cell if it’s not attached to anything and so you can outline an entire nerve cell and I’ll show you that in a second. And finally as I’ve said several times now it can be used in living organisms, so really for the first time we have a dynamic view of life, rather than a static one. All of this was helped enormously by all the work that Roger Tsien did and I don’t know if he’s going to talk about any of this at all but just to say quickly that he changed the emission properties and the excitation properties, he’s also known for having created all these wonderful colours and for producing these wonderful molecular machines based on fret. With all these improvements, people started using GFP enormously, there are at least 30,000 papers listed in pub med that use florescent proteins and I suspect that may be half of what is really there, because most people don’t use GFP or florescence in the title or the abstract or the key words at all now. So I’m sure there’s many, many more. To give you an idea about what this is, some of the people, there’s sort of a gallery, worms, flies, canola plant up at the top, mice, zebra fish in the middle at the bottom, on the left here is Elba, the GFP bunny that was produced for Eduardo Kac, the artist who had this as a family pet but also displayed it to promote discussions about technology and science and the arts and so on. And you can see on the right hand side a variety of different types of cells expressing GFP. But as I said the really important thing about GFP is that you can see this in living cells and I want to give you a couple of demonstrations. One is this wonderful picture of the dividing drosophila fruit fly embryo in which what is marked is tubulen so you can see the spindles on all the dividing cells. And so let me roll the movie and you can see cell division. You see how wonderfully synchronise it is as more and more nuclei are produced in the cell. Now this person, Rosalind Silverman Gavrila, is an amazing artist, now she’s not exactly this artist, but she does have something also called starry night that I want to show you. And what she’s done is she’s taken GFP and she’s fused it to a peptide that is a nuclear localisation signal. So whenever there’s a nucleus around GFP gets sucked up into the nucleus. But when the nuclei break down during the cell divisions in these same embryos, then it diffuses throughout the cell. And so by changing, doing false colour to have, to show intensity, she came up with this wonderful film. You can see the nuclei forming and all the GFP going into the nuclei. And then they all go away in a wave. Whole embryo fills up and then the next round of nuclei appear. And then they go away as well. So obviously there’s been a lot of things that Jeff Lichtman and Josh Sanes have produced this wonderful way of individually labelling cells with different amounts of coloured, different colour fluorescent proteins and being able to distinguish a wide variety of cells within the brain. So there’s been lots of wonderful things that people have done. One thing, Osamu didn’t really give the story of how difficult it was for him to isolate GFP Aequorean and then find GFP and I would direct you to his Nobel speech to hear the true story but it was not an easy job which is why when this film came out with this different way of isolating GFP, it was quite surprising. So you just take a jelly fish, stick a hypothermic in it and suck out the GFP. Somehow you then have to do something with chromosomes but it does say green bioluminescence in aequorea which is what he calls the organism. And a very rapid response. And this is the lead in to the movie that proclaims sort of the first human transgenic with GFP and that’s the Hulk, the movie by Ang Lee, as far as I know nothing like this actually has really occurred. What I want to do now is talk a little bit about what we’ve done in the lab and what the problems are that we’re starting to face. So we’ve used GFP in a variety of ways in my lab to study touch sensitivity, we’ve looked to see as shown in the top panel, if a gene is expressed in the 6 touch sensing cells and this is an example of one that is in which GFP has diffused all the way through the nerve cells. The middle panels show by using 2 different colours that we can look at co-localisation and show that 2 genes are expressed in the same cells. And finally at the bottom we can show that GFP by being fused to a protein is not localised or does not diffuse throughout the cell but actually localises to discrete areas within the cell and this has actually led us to find these mechanosensitive centres that are in the cells. We have also used this as the basis of a mutagenesis, if you can see a cell you can then take the animal and mutate it and look for variance. Things that don’t have the right number of cells in which the nerve cells grow out inappropriately, maybe in the wrong direction or branch in appropriately. Or what's really shown here at the bottom is actually having a GFP fusion with a protein that only goes to the synapses and then asking for mutants that don’t have synapses. So you can actually look for genes that are important for the connections being made between nerve cells, there’s lots of different ways depending on basically people’s ingenuity. The other thing that one can do by labelling cells with GFP is you can separate them out and the panel in the upper right hand corner shows cells that we’ve taken out of an embryo and grown in culture and only the touch sensing cells express GFP and they grow out in culture and we can put them through a cell sorter, isolate them from all the other cells and then ask what RNA’s are over expressed in those cells. And I’ll mention that in a little bit. We’ve also used this as a way of labelling cells so that we can electrically record from them and that’s what's diagrammed in the bottom right hand corner and that's led us to actually produce the first real proof that we had an animal mechanosensor. So all of these are different ways that one can use it. And it really is just the tip of the ice berg since so many other people have made so many other wonderful tools using GFP. So all of this has led us to having this complex that is needed to sense touch but having all these components just allows us to have a lot of new questions. So I’ve labelled a bunch of things in red and I’ll tell you why they’re all in red in a moment as I go through the pictures. So the question we have is, ok this is what senses touch, what are our questions, well one of the questions still is how does this animal generate different types of cells, how does that come about, how do you get different types of cells. The second one is ok now we have the component, how does it work. We really don’t know, this is going to take engineers, physicists, chemists to help us try to understand how this is really working. All those things in red were proteins that are in some way involved with lipid, that lipid is somehow very important in regulating the structure. We haven’t a clue, this is where chemistry is going to become also very important for us. Fourth question is how can we, you know do we have all the genes yet that are needed for this process. And finally another question we’re just starting to ask, is ok we’ve been very happy of learning how genes are turned on, what turns them off? And so I just want to actually talk about 3 of these very briefly. How are different cells generated, so we in the past have identified a whole series of genes, all the things in red are transcription factors, things that turn on genes. And these are the genes that turn on all those components in these touch cells. Now interestingly all of these genes are also expressed in another set of cells, the FLP’s. But none of the touch complex genes are. So if we do antibody we can see the proteins of the complex in the cells on the left but not on the cells on the right. So what makes these 2 different cells different? Well at first we thought we had a wonderful answer. And that was it, that was the answer. So recently we’ve done an experiment. The worst thing in the world to do, once you have a great idea is to do another experiment. And so this is the experiment. We isolated the touch cells, we isolated these other cells, the FLP and we asked what genes are over expressed, there’s about 200 genes in both of them. That’s ok, that’s a manageable number of genes. And then we said well are any in common and 56 of them were in common, that’s ok too because cells should share some genes. But among the 56 are all of the genes that make up those complexes in the touch cells. So we are left with a problem, the genes that make the difference between these 2 cells are expressed in both cells but they seem to be translated into proteins only in one cell. So the question we have now for the future is how is this happening. What's happening in terms of this global turning off of protein in one cell as opposed to another? We have some ideas about how to go about that and I won’t go into that. I want to go to this next question, do we have all the genes needed for touch, we have this wonderful complex, we know that it actually does sense touch, this should be enough for us. But in fact we’re greedy, so I have to explain a little bit of genetics to people. We started this because the only way we could really get at these genes was to find animals that were touch insensitive, they could be touch insensitive either because the cells were never made, that gave us the transcription factors or we could get it because the cells didn’t work and that’s what we were after and that gave us this complex. But doing genetics there’s a bit of a problem because there’s some genes, what if you have 2 versions of the gene, we call this redundancy, you get rid of one, the other one is perfectly fine. So you don’t see any defects because there’s a replacement already there, so we would never have seen that. And then there’s this other problem, what if a gene is really important for touch but it’s also really important in a lot of other cells. If you get rid of that gene the animal dies. I can tell you, it’s very hard to tell if an animal is touch sensitive or not if it’s dead. So we wanted to know could we get other genes. Now how can one go after getting other genes, well partly was by isolating the cells and looking at the RNAs, but many of you know that a couple of years ago, just in general, we could change the discussions, how do we get other genes affecting nerve cells. And you may remember that a couple of years ago Andy Fire and Craig Mello won the second worm prize, Nobel Prize, Sydney Brenner, John Sulston and Bob Horvitz got the first and I consider my prize the third worm prize, for discovering something called RNA interference in which if you give animals double stranded RNA they can, that will eliminate gene activity. It’s a very easy way of getting rid of a gene. And they found that for worms it was really quite wonderful. At first as the middle panel shows there, you can inject the double stranded RNA. Then they had a student that was not very good and he missed hitting the right part in the animal but the experiment still worked. They realised well maybe it wasn’t important where to put it and they could soak the animals in double stranded RNA. And that’s the panel on the right. And then someone said well if we can soak them in double stranded RNA and they’ll pick this up, why not make bacteria that will make the double stranded RNA and have the worms eat it, so we call that feeding RNAi and that works. So virtually all of us have in our freezers the collection of all the known c-elegans genes, each in a bacteria, so if we feed the worms the bacteria it should knock out the genes. And this is a very useful thing and lots of people have done this, its called feeding RNAi. There is a problem though, when they’ve looked at approximately 16,000, almost 17,000 genes, they found 600 genes feeding DNA for those genes, double stranded RNA for these genes, you could get animals that had some sort of defect, a visible phenotype. And then there were about 1,100 that were dead. And then there were all the rest, where there was no effect. And that means that we don’t know anything about the vast majority of genes, that’s exciting. So the question is how does that happen, what's the problem here. So this feeding, this RNAi, feeding RNAi will get rid of genes if the genes are expressed in the muscle. If it’s in the skin, if it’s in the intestine or if it’s in the germ line, it works great for these things and the animals die. Unfortunately for somebody interested in how the nervous system works it does not work in nerve cells and that may be one of the reasons we have so many of these things that are no good. So the question is why and a couple of years ago Craig Hunter at Harvard discovered a gene called SID-1 and the SID-1 protein is a transporter of double stranded RNA into the cells. And wouldn't you know it, its there in the muscle and skin and intestine and germ line but it’s not in the nerve cells. So an obvious solution for us is to make animals that make SID-1 in the nerve cells and then we can use a mutant background to make sure it’s not expressed anywhere else, so we can change the pattern up here from this one to that one. So now it only works in the nerve cells. So why is this exciting? It’s exciting for 2 reasons. We can now go in and look at all those 15,000 genes and ask do they now produce a phenotype, that’s going to lead us into learning a lot about the nervous system. To give you one example of that we’ve done, this is a whole series of strains, little busy of a slide, the white bars are what we started off with and the fact that the animals are 5 out of 5 in all the white bars means there was no RNAi phenotype, we did not make the animals touch insensitive. But as you go through it and you see the different strains we use, you see at the end of each that there’s a black bar and that’s our strain. And now you can see that we’re wiping out the activity. And we do this for just about every gene in the touch system. So we finally now have a tool to look at nerve cells. And so we’re very excited about the idea that we can try to uncover other genes. And the first, and we can look at those 15,000 but now we can also look at those 1,100 genes that cause the animals to die. Because now all the calls that they were active in, that were causing the cells to die, don’t express them. And it’s only in the nerve cells, so we can ask for the first time is there some particular effect in the nerve cell. And we were very interested in one set of genes for this, which was a gene that are part of what's called the integrin signalling pathway. Focal adhesions, attachments of cells, require all these genes diagrammed on the left. And in worms these same genes are needed in muscle cells to attach the muscles. Well, because they’re in muscles, when we do RNAi or we have mutations in these genes, the animals die as early embryos, we don’t know if they’re sensitive to touch or not. But interestingly all of these components are in the touch sensing cells, when we look at antibody or GFP fusions. So we desperately want to know what would happen in the animals if we could spare the muscles and just get rid of this in the touch cells. And to our great joy we found that virtually all of the genes knock out the effect. And so this means we have now discovered a completely new pathway needed for touch sensitivity. We now want to know what its doing and what are the various, how it interacts with our channel and so on. So we have a lot more genes to go through, we have the whole genome to go through so we have a brand new toy and we’re very excited. And the last toy I want to talk about is the problem of turning off transcription, we often think about development as cells acquiring a gene that turns on things and lets it develop the way it wants. And in the touch system it’s very much like that, a gene gets turned on, everything keeps on and you make it. However so we’re looking at one gene called UNC-4 and UNC-4 is made in a bunch of cells. So there are some cells in the early embryo, the DA cells and then a little bit through larval development, because GFP is very stable, all these cells are on at the same time. However we’ve made, you know taking advantage of the ubiquitin system which we’ve heard of in the past, we have made a variant of GFP that is short lived. And this is very nice, this version of GFP when the animals hatch, they have the 6 cells but then as they get a little bit older those 6 cells turn off and we just see the 12 cells. A little bit later those turn off, we just see 6 cells and then finally in the adults we only see 2 cells which you can see up there in the picture. This is a wonderful tool because now we can use genetics and start asking the question what turns these genes off. And we do it by starting off where they’re off, we mutate the animals, looking for any adults that have more green in them. And those will be defective in the system shutting off the gene. We’ve found some, we’re in the middle of cloning them now. There’s going to be a lot more and we have many more genes that show this temporal expression and we think that there’s going to be a very good new way to be able to do this. So let me finish up by saying what I think are some of the lessons of GFP. First: Science is not an individual occupation, it is cumulative. The fact that Osamu discovered this wonderful protein that I was able to hear about his work and modify it and think about how we could use it as a marker. And of all the wonderful things that then Roger did to change it, to make it an even more useful thing is an example of what science is in general. I like to say that in fact all of science is very much, that GFP is a nice metaphor for what we do in science, we receive light, we receive energy of one type from people and then we give it off in a modified form that then gets absorbed by other people and so on. And the whole community of people that have worked on GFP has been inspiring and incredible. There have been just literally hundreds and hundreds of people that have added value to this wonderful process. The second thing I want to say is that it is, the students and the post docs that are really the innovators in science. When we first started giving away GFP I would have the heads of lab call me up and almost invariably they would say you know I heard you have this marker, I heard about it from my graduate student or I heard about it from my post doc and that’s where the communication was going. It wasn’t oh I read about this, it was my graduate student told me about this. So the communication, the interactions that people have, I hope being fostered by this meeting, are really the things that are driving science and bring about innovation. Third, I hope this is an example of how working with jelly fish, how working with c elegans on problems that are very basic, lead to a number of different insights, certainly a lot of new questions to address. So basic research is essential, it’s the engine that drives innovation and it leads to insights in human disease and advances in agriculture and industry. I personally am somewhat dismayed by what I see too much of as an emphasis on what's called translational research. That is that we must now forget all about basic research and apply everything that we know to the clinic and I believe that working on human health is extremely important, I’m not saying it shouldn’t be but not to the exclusion of basic research. For the most part we know so little, most of the genes in the human genome encode proteins of unknown function, we don’t know what they are, we don’t know how they interact. There’s so much more to learn and there’s so much more to learn in all the organisms that we study. And this leads me to my last point, which is that all life should be studied, not just model organisms, not just c-elegans, or not just mice, not just particular human diseases, that there’s so much more out there for us to learn from and the question that I have is what's going to be the next GFP of the future, what's going to be the next jellyfish, the next c-elegans. So thank you very much.

Meine Eingebung kam am 25. April 1989, als ich ein Seminar von Paul Brehm besuchte und Paul die Arbeit beschrieb, über die Osamu gerade gesprochen hat, mit Quallen. Er beschrieb, dass Aequorea, wenn sie Kalzium hätte, blau leuchten würde, das hatte ich vorher schon einmal gehört, aber dann kam etwas, wovon ich noch nie gehört hatte, nämlich dass Aequorea plus Kalzium plus dieses wundervolle Protein mit der Bezeichnung Grün Fluoreszierendes Protein grünes Licht ergeben würden. Und dass man UV-Licht auf GFP richten und grünes Licht erhalten würde. In den vorangegangenen 10 Jahren hatte ich stets erzählt, dass das wirklich Wunderbare an diesem kleinen Wurm, mit dem ich arbeitete, die Tatsache sei, dass er durchsichtig ist. Wenn man das 10 Jahre lang immer wieder sagt, beginnt man selbst zu glauben, dass das Tier durchsichtig ist. Und ich erzählte, wie schwierig es für uns war, die Genexpression zu untersuchen. Als ich das nun hörte, war der gesamte Rest des Seminars plötzlich unwichtig geworden, ich überlegte mir die ganze Zeit nur noch, was wir daraus machen würden. Am nächsten Tag – nun, hier habe ich Gekritzel vom nächsten Tag, als ich versuchte, jemanden zu finden, der diese Arbeit ausführen konnte und ich stellte fest, dass Douglas Prasher am Klonen der CDNA arbeitete. Es war etwas schwierig, weil wir einige Jahre keinen Kontakt mehr gehabt hatten. Aber 1992 trafen wir uns wieder und Douglas sandte uns den Klon für die CDNA, ich hatte glücklicherweise eine sehr nette Doktorandin, Ghia Euskirchen, die gerade angefangen hatte und wir wollten jetzt herausfinden, ob dies funktionieren könnte. Jetzt möchte ich ein paar allgemeine Hintergrundinformationen liefern, seinerzeit wusste man, dass das fluoreszierende Protein keine Zugabe anderer Komponenten benötigte. Das war gut, weil wir die Zellen nicht durchdringen oder verletzten wollten, um etwas einzuführen. Das Problem war aber – ich glaube, das ist jetzt etwas durcheinander geraten, ich habe die Folie gerade verloren, sie muss hier irgendwo sein. Ich will die Situation kurz ohne Bild beschreiben. Das Problem war, dass dieses Rückgrat aus primären Aminosäuren einen 5-gliedrigen Ring bilden musste und niemand wusste, wie viele Enzyme man dafür brauchen würde. Es war also ein Spiel und die meisten dachten, dass man noch etwas zusätzlich brauchen würde, dass es nicht von allein funktionieren würde. Ghia hatte also den Klon und wir überlegten, wie wir vorgehen wollten, hier ist ein Bild von Ghia. Und binnen eines Monats gelang es dieser neuen Doktorandin tatsächlich, grün fluoreszierende Bakterien herzustellen, wie hier in ihrem Labortagebuch zu sehen ist. Wir waren extrem aufgeregt. Aber es gibt noch einen anderen wichtigen Punkt: Man hat den Eindruck, dass die Experimente ganz einfach sind, man macht einfach diesen Versuch und wir hatten Glück. Warum wir Glück hatten, hat aber mit dem Mikroskop zu tun. Sie hatte das Mikroskop von 368 Engineering Terrace benutzt und sie hatte gerade ihren Master in chemischer Verfahrenstechnik gemacht und wusste, dass es in ihrem alten Labor an der Columbia Universität ein sehr gutes Fluoreszenzmikroskop gab. Sie wusste auch, dass das Fluoreszenzmikroskop in meinem Labor eigentlich ein Witz war, und dass es nicht funktionieren würde. Hätten wir ihre Proben mit unserem eigenen Mikroskop betrachtet, dann hätten wir festgestellt, dass das Experiment nicht funktioniert hat, das wäre schrecklich gewesen. Sie hat glücklicherweise schnell erkannt, dass unser Mikroskop nicht ausreichte, es war schon ziemlich alt. Sie fuhr also in ihr altes Labor, benutzte das Mikroskop dort und erhielt dieses wunderbare Ergebnis. Es stellte sich uns also das Problem, wie man weiter forschen sollte, nachdem wir etwas Aufregendes entdeckt hatten, aber wussten, dass unsere Ausrüstung nicht gut genug war. Zunächst versuchte ich das Problem zu lösen, indem ich bei der Fakultät ein Mikroskop auslieh, aber das ging nicht lange gut. Dann rief ich bei verschiedenen Firmen an und erzählte ihnen, dass ich ein Mikroskop kaufen wollte und ob sie mir vielleicht ein Gerät zum Ausprobieren zur Verfügung stellen könnten, und ob es vielleicht auch möglich wäre, es beispielsweise einen Monat lang zu behalten. Das hat funktioniert und wenn Sie einen Blick in unseren Vortrag werfen, finden Sie eine etwas merkwürdige Fußnote, die darauf hinweist, dass die Fluoreszenz unter diesem und diesem und unter jenem oder jenem Mikroskop zu sehen ist. Ich danke in diesem Vortrag allen, die mir ihr Mikroskop zur Verfügung gestellt haben. Wir haben dies also mit unseren Würmern umgesetzt, führten weitere Experimente durch und gingen dann an die Veröffentlichung. Wie Sie wissen, erschien unser Bericht in „Science”, aber zuvor mussten noch einige Probleme gelöst werden. Das erste betraf den Titel, wir reichten den Bericht ein unter dem Titel ein neuer Marker für die Genexpression”) und waren von diesem Titel sehr begeistert. Wie Sie vielleicht wissen, schauen sich die Leute bei „Science“ zuerst den Bericht an und entscheiden dann, ob es sich lohnt, ihn ins Lektorat zu geben. Ich erhielt also einen Anruf, dass der Bericht nicht interessant genug sei, wegen des Titels. Ich fragte: ich müsste den Titel daher anders formulieren. Ich mag es nicht, wenn man mir vorschreibt, was ich zu tun habe. Die Lektoren erhielten also einen anderen Titel, nämlich „The Aequorea Victoria green florescent protein needs no exogenously added component to produce a florescent product in prokaryotic and eukaryotic cells“ („Das grün fluoreszierende Protein in Aequorea Victoria benötigt keine exogen zugeführten Komponenten für die Erzeugung von Fluoreszenz in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen“), also eine Zusammenfassung des gesamten Inhalts. Daraufhin haben sie den Artikel angenommen und der Redakteur sagte: Das habe ich getan und legte ihnen fast wieder genau den ursprünglichen Titel vor, vielleicht war das ja von Anfang an so gewollt. Ein anderer Punkt hat mit dem Bild hier zu tun, auf das ich sehr stolz war, man sieht hier diese Nervenzelle beim Wachstum mit ihrer Wachstumsknospe, eine Aufnahme von einem lebenden Tier, davon war ich sehr begeistert. Der für das Titelbild verantwortliche Redakteur rief mich an und sagte: weil sie so schwer zu drucken ist, nämlich Grün, können wir stattdessen eine andere Farbe nehmen?“ Und ich sagte: Das sind die Probleme, die man zu bewältigen hat, wenn man seine Arbeit veröffentlichen will, das ist wirklich so. Wir hatten bereits Proben der CDNA an eine Reihe von Leuten geschickt, die uns schon über ihre Erfolge berichteten. Wir baten einige von ihnen, ihre unveröffentlichte Arbeit in unserem Artikel verwenden zu dürfen und die meisten stimmten bereitwillig zu. Außer einer Person, die diesen Brief geschrieben hat: aber nur unter den folgenden Bedingungen: Du kochst die nächsten zwei Monate samstagmorgens pünktlich um 8.30 h Kaffee, Du bereitest ein französisches Essen zu einem Zeitpunkt meiner Wahl zu und leerst für den nächsten Monat jeden Abend den Mülleimer.“ Das war meine Frau. Aber das war sehr wichtig, denn ihr gelang wirklich der nächste Schritt in der Entwicklung von GFP, sie erzeugte als erste ein Fusionsprotein, indem sie GFP einem Protein hinzufügte, an dem sie arbeitete. Es handelte sich um ein Protein in einem sich entwickelnden Ei, das ist dieses große Teil rechts hier im Bild, von Drosophila und sie wollte wissen, wo dieses Protein hinwandert. Sie können sehen, wie es hier von den Zellen links in das wachsende Ei rechts transportiert wird und sich am Pol absetzt, genauer gesagt, an beiden Polen. Sie konnte dies dann in eine Mutation einbringen, die nicht das normale Gen hatte, und das fehlende Gen damit ersetzen. Sie wusste also, dass es richtig funktionierte. Und sie konnte beobachten, wie es sich in lebenden Ovozyten verhielt. Das war also eine ganz wichtige Entdeckung. Ich bin der Meinung, ich habe all ihre Forderungen erfüllt, sie sieht das leider nicht so, daher streiten wir immer noch darüber, aber der Artikel wurde schließlich veröffentlicht. Was GFP so nützlich macht, ist vor allem Folgendes: Es kann genetisch codiert werden, wir können es in einen Organismus einbringen und die nächste Reihe, die Nachkommen, haben es alle, wir müssen es nicht jedesmal wieder hinzufügen. Es ist nicht invasiv, wir müssen es nur mit blauem Licht bestrahlen und erhalten grünes Licht zurück. Wir brauchen die Tiere nicht zu fixieren, wir verletzen sie nicht, wir bestrahlen sie nur mit Licht, das ist völlig unschädlich. Das Molekül ist klein und monomer und hat den Vorteil, dass es durch die Zelle diffundieren kann, wenn es nicht irgendwo festgemacht wird; man kann so eine gesamte Nervenzelle darstellen, das zeige ich Ihnen gleich. Und schließlich kann es, wie ich bereits mehrfach erwähnte, in lebenden Organismen eingesetzt werden und bietet uns damit erstmals eine dynamische, statt einer rein statischen Sicht auf sie. Eine große Hilfe war hierbei die Arbeit von Roger Tsien; ich weiß nicht, ob er darüber sprechen wird, daher will ich nur kurz erklären, dass er die Strahlungs- und Anregungseigenschaften verändert hat, er ist auch für diese wunderbaren farbigen Bilddarstellungen und molekularen Maschinen auf der Grundlage von FRET bekannt. Dank all dieser Vorteile wurde GFP immer stärker eingesetzt, in PubMed sind mindestens 30.000 Artikel zu Fluoreszenzproteinen gelistet und das ist wahrscheinlich nur die Hälfte von dem, was tatsächlich existiert, denn meistens tauchen „GFP“ oder „Fluoreszenz“ überhaupt nicht mehr im Titel, der Zusammenfassung oder den Schlagworten auf. Es gibt also sicher noch viel mehr. Um Ihnen eine Vorstellung von der ganzen Palette zu geben, hier eine Art Fotogalerie - Würmer, Fliegen, Canolapflanze ganz oben, Mäuse, Zebrafische in der Mitte und unten links hier sehen Sie Elba, das GFP-Kaninchen, das für den Künstler Eduardo Kac hergestellt wurde, der es als Haustier hielt, es aber auch ausstellte, um Diskussionen über Technologie, Forschung und Kunst und so weiter anzustoßen. Und rechts sehen Sie eine Auswahl verschiedener Zelltypen mit GFP-Expression. Aber, wie ich bereits sagte, ist das Wichtigste an GFP, dass man einen Einblick in lebende Zellen erhält, das möchte ich Ihnen an einigen Beispielen zeigen. Eines ist dieses wunderbare Bild von der Teilung eines Drosophila Fruchtfliegenembryos, in dem die Tubuline markiert sind, so dass man die Spindeln an allen sich teilenden Zellen erkennen kann. Wenn man den Film abspielt, kann man die Zellteilung erkennen. Sie sehen, wie herrlich synchron sie abläuft und wie immer mehr Zellkerne in der Zelle entstehen. Diese Person hier, Rosalind Silverman Gavrila, ist eine erstaunliche Künstlerin, streng genommen ist sie keine Künstlerin, aber sie hat etwas, was man als begnadet bezeichnen kann, und das will ich Ihnen zeigen. Sie hat GFP mit einem Peptid verschmolzen, das ein Signal für die Lokalisierung von Zellkernen ist. Immer wenn ein Zellkern in der Nähe ist, wird das GFP hineingesaugt. Aber wenn die Zellkerne während der Zellteilung in diesen Embryos kollabieren, diffundiert es durch die Zelle. Mit Hilfe dieser Farben zur Darstellung der Intensitäten konnte sie somit diesen wunderbaren Film aufnehmen. Man sieht, wie sich die Zellkerne bilden und wie das ganze GFP in den Zellkern wandert. Dann verschwinden sie alle wie eine einzige Welle. Der ganze Embryo wird gefüllt und dann erscheint die nächste Runde Zellkerne. Und sie verschwinden auch wieder. Sie sehen, was alles gemacht worden ist. Jeff Lichtman und Josh Sanes haben diese wunderbare Art entwickelt, Zellen mit verschiedenen Mengen farbiger Fluoreszenzproteine zu markieren und viele verschiedene Zellen im Gehirn zu unterscheiden. Es sind wunderbare Arbeiten entstanden. Osamu hat nicht erzählt, wie schwierig es für ihn war, GFP in Aequorea zu isolieren und dann das GFP zu finden. In seiner Rede anlässlich der Nobelpreisverleihung können Sie die ganze Geschichte hören, aber es war wirklich schwierig. Als dieser Film über eine andere Art der GFP-Isolierung erschien, war es daher eine große Überraschung. Man nimmt einfach eine Qualle, steckt eine Pipette hinein und saugt das GFP heraus. Man muss dann noch etwas mit den Chromosomen arbeiten, aber man erhält grüne Biolumineszenz in Aequorea, die hier als der Organismus bezeichnet wird. Und eine sehr schnelle Reaktion. Das ist das Poster zu einem Film, in dem so etwas wie die erste transgene Anwendung von GFP beim Menschen proklamiert wird, der Film „Hulk“ von Ang Lee - meines Wissens ist so etwas noch nie wirklich passiert. Ich möchte jetzt etwas über unsere Arbeit im Labor erzählen und über die Probleme, auf die wir stießen. Wir haben GFP in meinem Labor also auf ganz verschiedene Arten eingesetzt, um die Tastempfindlichkeit zu untersuchen. Wir haben untersucht, wie in der Tafel oben zu sehen ist, ob ein Gen sich in den sechs tastempfindlichen Zellen zeigt. Das ist ein Beispiel, bei dem das GFP durch alle Nervenzellen hindurch diffundiert ist. Die mittleren Tafeln zeigen mit Hilfe von zwei verschiedenen Farben, dass eine Kolokalisierung stattfindet und wir sehen die Expression von zwei Genen in den gleichen Zellen. Und unten sehen wir, dass GFP beim Verschmelzen mit einem Protein nicht lokalisiert ist oder nicht durch die Zelle diffundiert, sondern sich in bestimmten Bereichen in den Zellen lokalisiert. Das ermöglichte uns die Entdeckung dieser mechanosensitiven Zentren in den Zellen. Wir haben dies auch als Grundlage für eine Mutagenese genutzt; wenn man eine Zelle findet, kann man das Tier nehmen, die Zelle mutieren und die Veränderung beobachten. Wenn nicht die richtige Anzahl von Zellen vorhanden ist, aus denen die Nervenzellen unnatürlich wachsen, stimmt vielleicht etwas mit der Richtung nicht oder sie verzweigen sich falsch. Hier unten sieht man zum Beispiel eine GFP-Fusion mit einem Protein, das nur die Synapsen betrifft, man kann dann nach Mutanten suchen, die keine Synapsen haben. Man kann also gezielt Gene suchen, die für die Verbindungen zwischen Nervenzellen wichtig sind, dafür gibt es viele Möglichkeiten, je nach Einfallsreichtum der Forscher. Durch die Markierung von Zellen mit GFP ist es ferner möglich, diese Zellen zu isolieren und die Tafel oben rechts zeigt Zellen, die wir aus einem Embryo entnommen und auf einer Nährlösung gezüchtet haben. Nur die tastempfindlichen Zellen exprimieren GFP, sie wachsen auf dem Substrat und wir können sie durch einen Zellensortierer schicken, von den anderen Zellen isolieren und dann feststellen, welche RNAs in diesen Zellen zu stark exprimiert sind. Darauf werde ich später noch zurückkommen. Wir haben GFP ferner für die Markierung von Zellen genutzt, für die wir elektrische Signale aufgezeichnet haben, das sieht man im Diagramm unten rechts. So konnten wir den ersten echten Beweis für einen tierischen Mechanosensor erzeugen. Das alles sind ganz unterschiedliche Einsatzmöglichkeiten. Und das ist alles nur die Spitze des Eisbergs, zahlreiche Leute haben viele andere wunderbare Möglichkeiten für den Einsatz von GFP entwickelt. Wir haben also nun diesen Komplex für die Tastempfindlichkeit, aber diese vielen Einzelteile führen auch zu vielen neuen Fragen. Ich habe daher einiges hier rot markiert, und während ich die Bilder durchgehe, werde ich erzählen, was das jeweils bedeutet. Es stellt sich uns also die Frage: Ok, das ist tastempfindlich, nun fragen wir uns, wie kann dieses Tier verschiedene Zelltypen bilden, wie ist das möglich, wie erhält man verschiedene Zelltypen. Die zweite Frage lautet: Jetzt haben wir zwar etwas gefunden, aber wie funktioniert es eigentlich. Wir wissen es nicht, dafür brauchen wir Ingenieure, Physiker, Chemiker, die uns helfen, zu verstehen, wie es tatsächlich funktioniert. Alles was rot dargestellt ist, waren Proteine, die in irgendeiner Weise mit dem Lipid zu tun hatten, dieses Lipid scheint für den Aufbau der Struktur sehr wichtig zu sein. Wir haben keine Ahnung, an diesem Punkt wird auch die Chemie sehr wichtig für uns. Die vierte Frage lautet: Wie können wir wissen, ob wir schon alle Gene gefunden haben, die für diesen Prozess erforderlich sind. Und schließlich die letzte Frage, die wir gerade erst stellen: Ok, wir haben jetzt gesehen, wie man Gene aktiviert, aber wie werden sie wieder deaktiviert? Ich möchte hier nur kurz über drei davon sprechen. Wie werden unterschiedliche Zelltypen erzeugt? In der Vergangenheit haben wir eine ganze Reihe von Genen identifiziert, alle roten Markierungen sind Transkriptionsfaktoren, die die Gene aktivieren. Und dies sind die Gene, die all diese Komponenten in diesen sensorischen Zellen aktivieren. Interessanterweise sind all diese Gene auch in anderen Zellen, den FLPs, vorhanden. Aber keines der Gene für die Tastempfindlichkeit. Wenn wir einen Antikörper erzeugen, sehen wir die Proteine des Komplexes in den linken Zellen, aber nicht in den rechten Zellen. Wodurch unterscheiden sich also diese zwei Zelltypen? Zuerst glaubten wir, eine wunderbare Antwort zu haben. Zwei weitere Transkriptionsfaktoren. Und das war es tatsächlich, das war die Antwort. Wir haben daher kürzlich ein Experiment durchgeführt. Das schlimmste, was man tun kann, wenn man eine gute Idee hat, ist noch ein Experiment durchzuführen. Es lief wie folgt ab: Wir isolierten die Sensorzellen, wir isolierten diese anderen Zellen, die FLP, und wir suchten nach den Genen, die übermäßig stark exprimiert sind, das waren etwa 200 Gene. Das ist in Ordnung, mit dieser Anzahl kann man umgehen. Dann suchten wir nach Genen, die in beiden Zelltypen vorhanden sind, das waren 56, auch das ist in Ordnung, weil einige Gene in allen Zellen vorhanden sein sollten. Aber unter diesen 56 sind alle Gene, die diese Komplexe in den Sensorzellen bilden. Es stellt sich jetzt die Frage: Die Gene, die den Unterschied zwischen diesen zwei Zellen ausmachen, sind in beiden Zellen vorhanden, sie werden aber nur in einer Zelle in Proteine umgewandelt. In Zukunft müssen wir also die Frage klären, wie das geschieht. Warum wird das Protein nur in einer Zelle erzeugt, in der anderen aber nicht? Es gibt einige Ansätze, um diese Frage zu klären, ich will dies aber jetzt nicht weiter vertiefen. Ich möchte jetzt zur nächsten Frage kommen. Haben wir alle Gene gefunden, die für die Tastempfindlichkeit erforderlich sind? Wir haben diesen wunderbaren Komplex, wir wissen, dass er auf Berührung reagiert, das sollte uns genügen. Wir sind aber nicht zufrieden, daher muss ich ein wenig zur Genetik erklären. Wir haben diese Forschung begonnen, weil wir diese Gene nur finden konnten, wenn wir Tiere entdeckten, die tastunempfindlich sind, entweder weil die Zellen nie erzeugt wurden, damit würden wir die Transkriptionsfaktoren erhalten, oder weil die Zellen nicht funktionierten; genau dies wollten wir entdecken und wir fanden diesen Komplex. Es gibt jedoch in der Genetikforschung ein Problem: Einige Gene sind doppelt vorhanden, wir nennen dies Redundanz, das heißt, wenn eines nicht mehr funktioniert, ist das andere immer noch intakt. Man erkennt dann keine Defekte, weil fehlerhafte Elemente gleich ersetzt werden, wir hätten sie also nie gesehen. Das andere Problem lautet: Was ist mit einem Gen, das für die Tastempfindung wichtig, aber auch in anderen Zellen sehr wichtig ist? Wenn dieses Gen verschwindet, stirbt das Tier. Wenn es tot ist, kann man leider schwer feststellen, ob ein Tier tastempfindlich ist oder nicht. Wir wollten also wissen, ob wir noch weitere Gene finden können. Wie ist das überhaupt möglich? Nun, teilweise durch die Isolierung der Zellen und Untersuchung der RNA, aber viele von Ihnen wissen, dass vor einigen Jahren die Diskussion über die Suche nach anderen Genen, die die Nervenzellen betreffen, eine neue Richtung erhielt. Sie erinnern sich vielleicht, dass vor einigen Jahren Andy Fire und Craig Mello den zweiten Nobelpreis für die Forschung mit Würmern erhielten, Sydney Brenner, John Sulston und Bob Horvitz erhielten den ersten, und mein Preis war der dritte „Wurmpreis“ für die Entdeckung der so genannten RNA-Interferenz, wobei Tieren eine Doppelstrang-RNA eingepflanzt wird, die dazu führt, dass die Genaktivität eingestellt wird. So kann man ein Gen problemlos loswerden. Man stellte fest, dass dies bei Würmern wunderbar funktioniert. Auf dem mittleren Bild hier ist zu sehen, wie die Doppelstrang-RNA injiziert wird. Dann gab es einen Studenten, der nicht besonders gut war und die richtige Stelle im Tier verpasste, aber das Experiment hat trotzdem funktioniert. Man dachte dann, vielleicht ist es gar nicht wichtig, wo die RNA injiziert wird, und überschwemmte die Tiere mit Doppelstrang-RNA. Das ist das Bild hier rechts. Dann hatte jemand die Idee, wenn man sie mit Doppelstrang-RNA überschwemmen kann und sie diese aufnehmen, warum sollte man nicht Bakterien herstellen, die die Doppelstrang-RNA erzeugen und sie den Würmern verfüttern, dies ist die so genannte RNAi-Fütterung und sie hat funktioniert. Jeder von uns hat in seinen Kühlschränken eine Sammlung aller bekannten c-elegans-Gene, jedes in einem Bakterium, und wenn die Würmer mit den Bakterien gefüttert werden, sollten die Gene ausgeschaltet werden. Diese RNAi-Fütterung ist sehr nützlich und wurde von vielen Forschern durchgeführt. Es bleibt trotzdem ein Problem: Man hat 16.000, fast 17.000 Gene untersucht und 600 Gene entdeckt, bei denen die DNA-Fütterung, also die Doppelstrang-RNA für diese Gene funktioniert, man hatte dann Tiere mit einem bestimmten Defekt, einen sichtbaren Phänotypen. Und dann gab es etwa 1.100, die tot waren. Und dann alle anderen, bei denen keine Wirkung zu erkennen war. Das heißt, wir wissen nichts über die meisten Gene, das ist aufregend. Die Frage lautet also: Wie geschieht dies, was ist hier das Problem? Diese RNAi-Fütterung führt dazu, dass Gene ausgeschaltet werden, die die Muskeln betreffen. Oder die Haut, den Darm oder die Keimorgane, hier funktioniert es sehr gut und die Tiere sterben. Leider funktioniert es nicht in Nervenzellen und vielleicht haben wir deswegen so viele Ergebnisse, die nicht gut sind – ein Nachteil für diejenigen, die die Funktion des Nervensystems untersuchen wollen. Vor einigen Jahren entdeckte Craig Hunter an der Universität Harvard ein Gen mit der Bezeichnung SID-1. Das SID-1-Protein transportiert Doppelstrang-RNA in die Zellen. Und wie Sie sich denken können, findet man es in den Muskeln, in der Haut, im Darm und in den Keimzellen, aber nicht in den Nervenzellen. Die Lösung für uns wäre also die Erzeugung von Tieren, die SID-1 in den Nervenzellen bilden, dann könnten wir mit Hilfe von Mutanten sicherstellen, dass es an keiner anderen Stelle gebildet wird und wir könnten das Muster hier so verändern. Jetzt funktioniert es nur in den Nervenzellen. Warum das aufregend ist? Aus zwei Gründen. Wir können jetzt all diese 15.000 Gene betrachten und beobachten, ob sie einen Phänotypen erzeugen, daraus können wir vieles über das Nervensystem lernen. Um ihnen ein Beispiel von unserer Arbeit zu zeigen, sehen Sie hier eine Reihe von Balken, ziemlich viel für eine Folie, die weißen Balken stellen den Ausgangspunkt unserer Arbeit dar; dass die Tiere in den weißen Balken fünf von fünf ausmachen, bedeutet, dass kein RNAi-Phänotyp vorhanden war, die Tiere wurden nicht tastunempfindlich. Wenn Sie aber jetzt weiter die verschiedenen Balken betrachten, die wir benutzten, sehen Sie am Ende jeder Reihe einen schwarzen Balken und das ist unser Filter. Jetzt sehen Sie, dass wir die Aktivität löschen und so können wir für jedes Gen im Tastsystem vorgehen. Damit haben wir endlich ein Instrument, mit dem wir Nervenzellen betrachten können. Der Gedanke, weitere Gene zu entdecken, ist aufregend. Als erstes betrachten wir diese 15.000, aber wir können jetzt auch diese 1.100 Gene betrachten, die die Tiere sterben ließen. Weil sie jetzt überall dort, wo sie vorher aktiv waren, wodurch der Tod der Zellen verursacht wurde, nicht mehr erscheinen. Und hier geht es nur um die Nervenzellen, so dass wir erstmals fragen können, ob in der Nervenzelle eine bestimmte Wirkung auftritt. Vor allem ein Satz Gene interessierte uns, nämlich ein Gen, das zum so genannten Integrin-Signalweg gehört. Fokale Adhäsion, also Zellverbindungen, erfordern all diese links dargestellten Gene. In Würmern werden diese Gene in Muskelzellen für die Muskelhaftung benötigt. Weil sie in den Muskeln vorliegen, sterben die Tiere bei der RNAi-Fütterung oder bei Mutationen dieser Gene im frühen Embryonalstadium, wir wissen nicht, ob sie tastempfindlich sind. Aber interessanterweise finden sich all diese Komponenten, betrachtet man Antikörper oder GFP-Fusionen, in den tastempfindlichen Zellen. Wir wollen also unbedingt wissen, was in den Tieren geschieht, wenn man die Muskeln beiseite lässt und diese nur in den tastempfindlichen Zellen ausschaltet. Zu unserer großen Freude stellten wir fest, dass praktisch alle Gene diese Wirkung unterbinden. Das bedeutet, dass wir einen völlig neuen Weg für die Untersuchung der Tastempfindlichkeit entdeckt haben. Jetzt wollen wir wissen, was daraus entsteht, welche Interaktionen daraus entstehen. Wir haben also viel mehr Gene, die untersucht werden wollen, wir haben das ganze Genom und damit ein ganz neues Spielzeug, wir sind sehr aufgeregt. Und das letzte Spielzeug, über das ich sprechen will, ist das Problem der Deaktivierung der Transkription. Die Entwicklung stellen wir uns oft so vor, dass Zellen ein Gen erwerben, das Prozesse auslöst und sich wie gewünscht entwickeln lässt. Im Tastsystem ist es wirklich so, ein Gen wird aktiviert, alles läuft seinen Gang und funktioniert. Wir betrachten jetzt ein Gen namens UNC-4, das in einem Zellbündel entsteht. Im frühen Embryonalstadium sind nur wenige Zellen vorhanden, die DA-Zellen, dann geht es weiter durch die Larvenentwicklung, hier werden weitere zwölf Zellen entwickelt und etwas später wieder sechs Zellen; all diese Zellen sind gleichzeitig aktiv, weil GFP sehr stabil ist. Wir haben nun das Ubiquitin-System genutzt, von dem wir bereits früher gehört haben, und eine kurzlebige Variante von GFP hergestellt. Das ist sehr schön, diese Version von GFP, wenn die Tiere sich entwickeln, haben sie die sechs Zellen, wenn sie etwas älter werden, verschwinden diese sechs und wir sehen nur noch die zwölf Zellen. Und wiederum etwas später verschwinden auch diese und wir haben wieder nur sechs Zellen und schließlich bei den erwachsenen Tieren sind es nur noch zwei Zellen, die man hier im Bild sieht. Das ist ein wunderbares Hilfsmittel, mit dem wir jetzt verstärkt mit Genetik arbeiten können und der Frage nachgehen, was diese Gene ausschaltet. Dafür beginnen wir dort, wo sie ausgeschaltet sind, wir erzeugen mutierte Tiere und suchen nach erwachsenen Tieren, die mehr Grün aufweisen. Bei diesen ist der Mechanismus, der das Gen ausschaltet, defekt. Wir haben bereits einige gefunden und sind jetzt dabei, sie zu klonen. Wir werden noch viel mehr finden und es gibt noch viel mehr Gene, die diese temporale Expression aufweisen und wir denken, dass wir neue Wege entdecken werden, um diese Fragen zu klären. Zum Abschluss möchte ich einige Erkenntnisse aus der Arbeit mit GFP zusammenfassen. Erstens: Wissenschaft ist keine Beschäftigung mit isolierten Themen, sie ist vielmehr kumulativ. Erst nachdem Osamu dieses wundervolle Protein entdeckt hat, habe ich von seiner Arbeit gehört und konnte es verändern und überlegen, wie man es als Marker nutzen kann. Dann kamen die wunderbaren Fortschritte von Roger, der es weiter verändert und neue Möglichkeiten erschlossen hat, all dies ist ein Beispiel für das, was Forschung allgemein ist. Ich möchte sagen, dass GFP eine schöne Metapher dafür ist, was wir Wissenschaftler eigentlich tun, wir erhalten Licht und Energie von Menschen und geben sie in einer veränderten Form ab, die wieder von anderen Menschen genutzt wird. Die ganze Gemeinschaft, die sich mit GFP beschäftigt hat, war inspirierend und unglaublich. Es waren wirkliche Hunderte Menschen, die diesen wunderbaren Prozess mit entwickelt haben. An zweiter Stelle steht die Erkenntnis, dass die Forschung am meisten durch die Studenten und Post-Doktoranden vorangetrieben wird. Als wir GFP erstmals abgaben, riefen mich viele Laborleiter an und sagten fast übereinstimmend, dass sie von diesem Marker über ihre Studenten oder ihre Post-Doktoranden gehört hatten. In dieser Richtung verlief die Kommunikation. Sie sagten nicht: „Oh, ich habe darüber gelesen“, sondern „Einer meiner Studenten hat mit davon berichtet“. Es ist also die Kommunikation, die Interaktion zwischen Menschen, die die Forschung wirklich voranbringt und neue Entdeckung ermöglicht und die hoffentlich durch diese Tagung weiter gefördert wird. Drittens hoffe ich, dass diese Beispiele unserer Grundlagenforschung an Quallen, an c-elegans, gezeigt haben, wie viele neue Einsichten wir gewonnen haben und wie viele neue Fragen sich daraus wieder ergeben. Grundsatzforschung ist wichtig, sie ist der Motor für jede Innovation und ermöglicht Erkenntnisse über Krankheiten und Fortschritte in Landwirtschaft und Industrie. Mich persönlich erschrickt die zu starke Betonung der so genannten translationalen Forschung. Das bedeutet, dass wir die Grundlagenforschung komplett vergessen und alles, was wir wissen, auf die klinische Forschung konzentrieren sollen. Natürlich ist die Forschung für die menschliche Gesundheit extrem wichtig und ich würde sie nie in Frage stellen, aber sie darf nicht die Grundlagenforschung verdrängen. Wir wissen noch so wenig, die meisten Gene des menschlichen Genoms enthalten Proteine, deren Funktion noch unbekannt ist, wir wissen nicht, was sie sind, wie sie funktionieren. Es gibt noch so vieles zu erfahren und zu erforschen in allen Organismen, die wir untersuchen. Damit komme ich zu meinem letzten Punkt, nämlich dass jedes Leben untersucht werden sollte, nicht nur Modellorganismen, nicht nur c-elegans oder Mäuse, nicht nur bestimmte menschliche Erkrankungen, wir können noch so vieles lernen und ich frage Sie, was wird das nächste GFP sein, was wird die nächste Qualle, das nächste c-elegans sein. Vielen Dank.

Martin Chalfie (2009)

GFP and After

Martin Chalfie (2009)

GFP and After

Abstract

Since its introduction as a biological marker, the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein (GFP) has had a strong impact in biology, being used in an ever-increasing variety of ways. I will review a bit of the history of GFP and show how having a genetically encoded marker that can be visualized in living tissues has affected the research in my laboratory. Instead of dwelling entirely on the past, however, I will describe some of the problems that we are currently trying to address. These problems range from the genetic control of cell differentiation to the molecular basis of mechanosensation, work that utilizes molecular genetics in the nematode Caenorhabditis elegans.

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