Roger  Tsien (2010) - Designing Molecules and Nanoparticles to Help See and Treat Disease

Molecules to observe and manipulate biological systems can be devised by a variety of strategies, ranging from pure chemical design and total synthesis to genome mining and high-throughput directed evolution. Examples of both successes and failures will be chosen mainly from my own experience

Thank you, well since the important audience here are the students and the young people, not the old folks in front. And also because you're such a wide and diverse group of people in all sorts of areas, I thought I would try to slightly deemphasise the details of the science, though I want to get into the science and this is not just a talk about, just for personal philosophy. But I want to sort of focus I think on, what I think are some of the most difficult challenges you will have to face, which is how do you choose a problem in science, or a general area. So I will try to go through how I made many decisions in getting to where I am. And in the hope that this will help all of you and the next time that you come to Lindau that you’ll be up here, instead of out there. So when I started really thinking as an undergraduate, what did I really want to concentrate on, actually I had tried pretty much everything, I had tried being, I even tried for a little while to be a theoretical physicist and very rapidly realised I did not have the talent. I was very good at chemistry in high school and found that college courses made me totally disillusioned with chemistry. I tried biology but didn’t really feel I had much of a talent. But in the end, this is basically sort of what I came to near the end of my undergraduate career, beginning of graduate school. Which is that mainstream biological research consists of asking how do natural bio molecules and biological systems work. Meanwhile the most prestigious form of chemical research that I came across back in the late ‘60’s, early ‘70’s which is when I was having to make this decision, was this question of total synthesis of natural products. This was and still is of course a very dominant theme in chemistry. How do we artificially re-synthesise natural bio molecules. But often without much concern for what they actually do. Mainly for whether they are beautiful and whether they are difficult to make and whether they will show off the latest synthetic technology, organic synthetic technology. And instead I wanted to take some sort of weird combination of these 2, I decided can we design and build new molecules and ones that may never have existed in nature. That will nevertheless perform amusing and useful functions in biology. So I felt that this was and I still feel that this is rather like architecture or sculpture on the molecular scale, with one great advantage is that in many of the other areas you are in tense competition with other groups going after the same goal, the same biological problem or the same area of chemistry, the same target molecule. But if you're doing sculpture or architecture nobody is going to design exactly the same thing as you will and so you have a greater chance of showing off without having to, you know directly be, you can’t quite be beaten by somebody else to the given goal, you can’t be scooped. And of course then there’s, this is what really gives you understanding I think, is when you, there’s a famous quote from Richard Feynman, ‘what I cannot create I do not understand’, he certainly had this feeling too. Traditionally this type of molecular design was assumed you could only do it in a drug company because only there would you have the huge resources, the big teams necessary to do it. And now why did I wind up doing this, well partly because engineering runs in my family, you know my father, my older brothers were both engineering majors, my uncles on various sides of the family. Even my mother was a nurse and that was the closest a woman in China could come to being a scientist. And nevertheless I felt that biology had the most interesting questions, that at least an individual could experimentally answer. I felt that particle physics for example had some wonderful questions but I was scared of the headlines when you read how many hundreds of people had to be involved in an experiment. I wanted something that was a little bit more personal. I have been fascinated since childhood by pretty colours, that’s what first got me interested in chemistry was not a chemistry set but something better that had more colours and actually was more dangerous, that did attract me when I was little. I was the youngest of 3 brothers, I needed to find an ecological niche that was distinct, so despite the engineering running in the family, none of them wanted to touch molecules, they were all mechanical or electrical or aircraft engineers. And this psychological need has an entire book written about it if any of you are interested. Finally I then realised that there were many, again I worried about the competition, I realised that most biologists were prevented from competing with me because they knew how to manipulate alphabetic strings, that is 20 amino acids, 4 bases of DNA one extra for RNA typically and they couldn’t deviate outside that alphabet. And that’s like if you are a, want to compose a scientific paper and all you know is a word processor and you can type letters one by one but you can’t draw graphs. And to me the ability to build unusual molecules is like the ability to use a power point or adobe illustrator or something compared to Microsoft word or what have you. So at least back in those early days there wasn’t much competition. And the first place we had some success, after some false starts admittedly, I didn’t get it right first time. Was to work on intracellular calcium and first I have to explain to you why that’s important but challenging. Fluctuations in free calcium turn out to be important in all sorts of signal transduction, ranging from every motion of my muscles, every communication basically in the brain between one neuron and another through synaptic signalling. Even at the beginning of life when the sperm first meets the egg etc, etc, these signals can be very fast, down to milliseconds and localised below microns. But chemically there’s the challenge that the concentration of calcium that we’re trying to measure is on the order of 10 to the minus 8 to 10 to the minus 6 molar and that’s what's controlling. But you cannot measure that simply by destroying the cell and measuring a total calcium. Because there’s many orders of magnitude. More total calcium and worse yet this low calcium is surrounded by a sea, an ocean of high, much higher calcium. Again orders of magnitude greater so that it’s like if you were trying to measure the contents of a sealed container of this fluid underneath the ocean and you're not allowed to lift it above the ocean. And if you stick a needle in to here the salt water will flood in and immediately destroy the contents of what you are trying to analyse underneath all this water. And yet there was finally that there’s a vast excess, again several orders of magnitude more of magnesium which is a divalent ion that is chemically fairly similar to calcium and that we needed the discrimination. And then I realised also nobody had ever tried to design an indicator specifically, no human being had designed an indicator for calcium. And every time people had used an indicator dye it had been something designed for other purposes. Now this, when you find this out, this can be both elating because you know you have virgin territory or very scary because you’re desperately afraid of somebody, many people probably tried, failed quietly and not published, which is the nature of, you know we tend not to publish our failures. And maybe you will just be doomed to retrace their steps in wasted effort. So where we actually, what I actually started from and this was as a graduate student, I looked at the structure, EGTA was the only known molecule that had the necessary affinity and selectivity for calcium. And biologists used it but it had no optical properties. It never gave us a report of how much calcium it had bound. And so I realised I needed to give it some absorbance, some, you know optical property and the simplest way to give this absorbance is to just tie on 2 benzene rings like that. And I gave myself about 2 or 3 weeks to try it because actually I had done 3 failed projects in my PhD and I wasn’t supposed to be doing anymore, I was supposed to be fixing those 3. But quietly without the knowledge of my supervisor who certainly would have forbidden it, I started to make this molecule and I knew I was on a short leash, I was running out of time. And fortunately in about 2 or 3 weeks I was able to make it and it actually worked, it had the desired properties. So I was hooked. But it’s still not good enough to measure inside cells because this only has ultraviolet absorbance. So it took, nevertheless the hook was in my mouth. And we continued and continued and eventually with the help of even more skilled organic chemists than myself, when I could eventually hire them, we evolved this molecule called fura-2. You can see just by continual extension around the core binding site that we did not change. And this molecule does measure calcium because it can be excited by, it will fluoresce and when it binds calcium the calcium sits in this cavity here and twists the nitrogen carbon bond. The lone pairs on the nitrogen are sort like the tip of my nose and the calcium is sitting over here, in order to bind I have to twist like that. And that twisting basically disconnects the top of me from the bottom of me with a spectra electronic structure and therefore we shift the shorter wavelengths. But then came the problem, I had to get this into a living cell and remember I’m not allowed to puncture the living cell because that membrane once punctured the calcium rushes in. And there are people who are good enough to stick glass needles into cells without disrupting them and I was not one of them. I’m a little too impatient and to clumsy. And I also knew that there was too much competition in the area, other people were better. So if I could work on cells that nobody could micro inject then I would have the field to myself. But how do you accomplish that. Well here’s the plasma membrane, the cell membrane and we have to get this molecule through and it won’t get through with 5 negative charges on it, 1, 2, 3, 4 which are absolutely essential for binding the calcium. And there’s a fifth one down here. So what do we do, well the chemical solution turns out to be you cover up all the negative charges with something called an ester group and you have to pick a very special ester group that the cell itself knows how to get rid of for you. So we’ve synthesised this molecule and it can walk across the membrane, just by simple diffusion because it’s somewhat hydrophobic. And once it hits the inside of the cell fortunately for us the most mammalian cells have the enzymes to cut off these R groups and convert them back to the material we wanted. And then we had a solution. And to give you just one little biological example amongst the 20 or 30,000 that have been published since, this is one of the first ones and I’m rather found of it because it was one of the first things that worked, it’s also from the beginning of life for a sea urchin that is. This is just after adding sperm to a sea urchin egg. Here was the egg, the sperm have just been put into the dish 15 seconds ago but none of them has yet found the egg, so the egg is this sphere that is coated here, is a deep blue colour because it’s calcium is very low. So this is a false colour scale that actually is derived by measuring constantly the 340 to 380, 340, 380, 340, 380 nanometre ratio back and forth a couple of times a second. And then at this moment here or at least a second ago, the sperm just hit over here and the calcium is going up in this region, in the red region, it has risen from about .1 micro molar which is 10 to the minus 7, up to about 1.2 or 1.3 micro molar, a factor of 13 or so. And as we go on here over the next few seconds the high calcium envelops the entire egg and basically tells the maternal, the mother’s DNA that daddy has arrived. In other words the sperm has come, you now have a full complement of DNA, start the process of development. And then the calcium comes back down because you can’t stay high in calcium for very long without it becoming toxic. So that was all well and good and it got me tenure. But I found that things were still, we wanted new challenges and also politically it wasn’t good just to work on calcium which has an inorganic ion, I had to become more bio chemically respectable and so the next target that we picked was cAMP, the prototypic second messenger for which the concept of second messenger had been developed. And that’s so important that Nobel prizes had been given to Earl Sutherland, Ed Krebs and Eddie Fischer I believe who may be somewhere in the audience, he’s here at the meeting. This is the structure of cAMP but despite all this work, the existing ways to measure cAMP basically required that you take millions of cells, kill them, grind them up and do a biochemically assay. And that meant that the dynamics of intercellular cAMP in precise analogy to the calcium were pretty much obscure. And again there’s a selectivity problem because there is less than micromolar levels of cAMP in the presence of millimolar levels of ATP, the main fuel of the cell from which cAMP is made. So it became obvious that there was no hope here of organic chemically synthesising a molecule with all the selectivity properties big enough to wrap around a molecule of decent size anyway. So we had to hijack the natural cAMP sensor which is called cAMP dependent protein kinase or nowadays protein kinase A. And we hoped to label it with fluorophores in a way to detect the cAMP binding. So once again we had a natural starting point but it didn’t give us a signal, this is the natural starting point, this enzyme and schematically just shown here is 4 subunits, 2 regulatory, 2 catalytic and when it binds cAMP the regulatory subunit undergoes a conformational change and dissociates the catalytic subunit. And I think this is, you know much of what Ed Krebs’s Nobel was about. So how do we turn this into an indicator. Well, eventually we figured out that if we put fluorocene on the catalytic subunit, rhodamine on the regulatory subunit, then in this complex we’d get something called fluorescence resonance energy transfer which is a quantum mechanical interaction between 2 fluorophores which was well known in biochemistry for detecting protein, protein proximity. And once we broke that up with cAMP then we would lose this quantum mechanical phenomenon and get a change of colour. And indeed this principle worked but the problem was that original protein sensor required that somebody had to express and purify the regulatory and catalytic subunits of the protein in E-coli because that’s where we got pure protein, you had to make a lot of this protein. And that was Susan Taylor’s job. In fact that was so important that that was one of the main reasons I moved from Berkley to San Diego was to be near Susan. Also labelling with rhodamine and fluorecene I can blindly just draw how we just added them like that but it’s actually not quite so simple. And to figure out how to add them without screwing up the interfaces between the catalytic and regulatory subunit took a huge amount of work. And finally then you had to put them back together and micro inject it into cells. And remember I told you I hate to do micro injection, I’m no good at it. Now of course at this point I’m tenured, I can hire post docs and tell them you practice for 6 months until you get good at it. But that’s still not desirable. So we wanted a general means to fluorescently label proteins using genetics because then, and do it in the living cell because then we aught to be able to fuse some naturally fluorescent protein, ideally we wanted 2 colours, the equivalent of fluorescence and rhodamine. Fuse them to the R and C subunits and then express and we would generate what we wanted in situ. So I remembered that our big competitor in calcium measurement was the stuff called aequorin which was the natural jellyfish protein that measured calcium. So the jelly fish has sort of wanted to measure calcium, remember I said no human being had tried to design one. And this is Professor Shimomura and he’s somewhere I hope here. And those of you who choose will hear him later on. Of course this is a much later picture and he had discovered the green fluorescent protein as a contaminate of aequorin. And I remember that there was such a thing. And one thing that I thought I would show you, which is a fairly unique sequence. It is remarkably hard to find a video of the jelly fish glowing, which is the basis of all of this stuff. And I asked Shimomura and he couldn’t give me a video. And, Marty, if I understand you’ve never even seen it. So I had to go to Alaska last summer and chose to visit this place and ask them to get me some jelly fish and I hope this, I’m sorry the beaker is sort of fluorescent so that obscures it but you notice that the jelly fish itself is fluorescent, we are shining ultraviolet light on it and this ring here is the cells that are going to glow and then we’re getting ready to poke it. If you turn of the lights, you see that flash, that was it. So that’s the pleasure of doing an experiment with your own hands. So of course the next crucial step is that this man, Douglas Prasher in 1992 cloned a gene for GFP which made all the subsequent work possible. And then Marty who you will hear in a moment, in a few minutes here, of course was the first to show that the GFP would actually work outside the jelly fish. And I’ll let him tell the rest of the story, his part. So the original jelly fish had some pretty poor spectra, it was made for the jelly fish for its own reasons, which we still do not really understand. But its spectrum clearly needed improvement and chasing a bunch of wild ideas we mutagenised it and eventually found that by changing the amino acid next to the one that makes most of the chromophore we could make its spectrum much better. So this was an early example of redesigning the protein to make it more useful for the human beings or the scientists. And then of course it was helpful to get the crystal structure which was mainly done in the lab of Jim Remington. This protein proved to be an 11 stranded beta barrel, almost beautiful cylindrical shape and symmetry. With the chromophore deeply embedded right in the middle of this cylinder. There’s much interest among young people and all sorts of people these days in chemistry that is green and environmentally friendly and doesn’t use toxic organic solvents and doesn’t leave waste products. I would like to point out this is green chemistry in several ways. Obviously because it’s green literally and also because every fluorescent in protein is actually encoded by DNA, that’s what makes it so powerful. And it’s not toxic. Synthesisable by any aerobic organism. Here is a mouse that has just made it under our direction because we put the DNA in it. It takes 230 successive condensations, one cyclosation and 1 or 2 auto-oxidations. Consumes oxygen gas, works in a few minutes. A 100% yield in aqueous solution at room to 37 degrees. And the only by-product is hydrogen peroxide. So I think that’s pretty good as a goal for green chemistry. So eventually we managed to get lots and lots of colours, I’ve shown you some of the ones from the jelly fish, later we got one from coral, there was a lot of fun in the lab or argument as to what we should call them and eventually after consulting the Crayola website, we came up with these names which are honey dew, banana orange tomato, tangerine etc which are a little bit more mnemonic to help you remember the colours in which they go with. And these were evolved by a deliberate process of evolution, which I think is, you know many people, we’re not the only ones to have done this, but is a form of biological engineering that I think for example has a lot of potential to help in the energy crisis in the way, when we need to generate renewable fuels, bio fuels and so on. Just to give you one pretty, visually pretty example of the use of the fluorescent proteins, here I’m going to take from the work of my former post doc Atsushi Miyawaki in his own lab now at Riken who built some very clever molecules that used cell cycle dependent synthesis in breakdown of particular proteins involved in cell cycle that’s Tim Hunt and Hershko and Ciechanover’s work all wrapped into that. And they’re all here at the meeting. So Atsushi arranged for a green protein to be made during mitosis and broken down the rest of the time. And there’s other proteins that are made in exactly out of phase way, almost exactly. And he chose to make them red or tag them with a red protein so that they are on when you are not in mitosis and then they turn off when you’re in. Now, that's a very clever choice of colour because green therefore means “go” and red means “stop” and even in Japan we use the same colour code and that makes it easier for people to remember. And so here’s a week’s worth of these cells and as you see that they are flashing red, green, red, green, red, green as they go through the cell cycle. And you may think that this is also sort of trivial because we can here, directly see my morphology what stage of the cell cycle they’re in. But many times inside a living organism say we do not know what stage a cell was at because we only get to see it once. But with the colour code now we can always work out what stage it was at retrospectively. Ok so that’s enough on fluorescent proteins. And then more recently I have been switching much more to trying to apply molecular imaging to human beings and in particular to actual patients. And this is sort of translational and it’s motivated for a couple of reasons. First I would like to do something more directly clinical relevant than just providing tools for other people to go screen drugs for, like the drug companies. When we develop these techniques I think that’s sort of cool chemistry but from the biological community’s point of view, this is often disparaged or dismissed as it’s just techniques development, ok. Whereas if I do this now for patients it’s actually just the same molecular engineering but now it’s translational research and the funding agencies think that’s all cool and it’s all fashionable. But more personally my father, my nephew, my PhD supervisor, many other colleagues died from cancer, my mother had a stroke, this is going to get me, too, eventually, so I would like to do something about it. Now, the problem is that fluorescent proteins require gene transfer, to use their main virtue which is that they’re encodable by DNA. And that’s not really technically feasible to do in sick people. Gene therapy isn’t advanced well enough and usually it’s not ethically allowable, we’re not going to make transgenic human beings the way we made a transgenic mouse. As you saw a little while ago. It might be very useful to us researchers to have fluorescent human beings but they might not feel quite so pleased by it. And then furthermore humans are basically too thick and opaque, if you want to scan the entire body with fluorescence, you can get away with it in a zebra fish and in a worm and so on but we are a bit too thick and fat basically. And for that we need techniques like magnetic resonance imaging which of course earned Nobel Prizes of its own. And we need amplification. So what we’ve done instead is to develop contrast agents that go after proteases in cancer and proteases are important because for a cancer cell to invade healthy tissue and get into the blood circulation and out into a distant tissue which is what kills you in the end, it needs the activation of these proteases. And at a molecular level what we did, again we started with a known mechanism that wasn’t quite suited to our purpose which was that polycationic peptides, rich in argenines have been long known to be able to stick to the outside of the cell and eventually go into the cell. At least into some organelles of the cell by endocytosis, even a little bit can escape from the endosomes and into the cyctosol and nucleus. And in some systems, particularly cell-free systems there’s some evidence that they don’t need endosomes and can go through to plasma membrane. But this process is pretty non-selective between cells and to make it selective for tumour cells and particularly to read out those proteases, what we did here is to deliberately cripple the polycation or mask it up or hide it by giving it an equal sequence of negative charges connected by a hair pin linker. And in this mode this molecule is internally self neutralised and doesn’t have the stickiness anymore. But if we come along with a protease and we arrange that the protease should be the one that the cancer cells have, they cut this apart and they’re the ones which will then take up the prob. Where if the normal tissue can’t cut it apart and remains, the stuff remains non-sticky, and it comes and checks out tissue and leaves without sticking, the cancer cells cut it and then they get loaded up with the payload. So to show you how this works in vivo , I skipped the cellular work, this is a peptide with the appropriate structure, These are 9 argenines that are the sticky portion, being masked for the time being by the 9 negative charges here. And a deep red dye Cy5 to mark, so that we can see through some tissue that has blood in it say, where the cancer is. And in this special case here we cheated, we marked the tumour with GFP to give you an example also of how GFP can be used in a mouse to mark the cells that you care about. And so there’s the tumour glowing green and the point is that we can get the same image equivalently in the red dye by this stuff that we inject and it’s not genetic and it sort of basically finds the same tissue that was tumorous. And if we, an important control is if we remake the molecule with diamino acids here, then the enzyme doesn’t recognise it and the molecule is the same size and hydrophobicity but it doesn’t load that tumour because it can’t be cut. Can we reach things like magnetic resonance imaging, which are the techniques that we’ll work on intact human beings and the answer is we think we’re getting there. Here is a mouse with a tumour and this is before we’ve injected it and the tumour doesn’t really contrast much against the rest of the mouse, this is a section, you know using the computer MRI scanner to cut across the waist so to speak or up in the shoulder level actually, arm pit level. Here however is a mouse whose tumour, well we have injected the entire mouse through its tail vein 24 hours ago with this construct which is a nanoparticle. Loaded with gadolinium and our activatible cell penetrating peptides, these targeting motifs that are sensitive to the protease. And yeah the tumour now has lit up and we can see it contrasting with the rest of the tissue. Here again is the control where we made the same particle with uncleavable amino acids and it doesn’t light up. But the use of fluorescence is, there is one place fluorescence is still valuable. Which is in surgery because that’s where we actually cut away the overlying tissue anyway and the patient needs to have that cut away. So if I, here’s a piece of a mouse, a segment, the mouse is alive, can you see where the tumour is? This is what surgeons have been faced with for thousands of years, when they cut out, try to cut out your cancer. It’s pretty hard to tell where the cancer starts and ends. So when we start the movie if we switch into fluorescent mode, there’s the fluorescence, deep red fluorescence that actually shows us where the tumour is, based on this biochemical mechanism I just described. But to actually cut, it’s much better if we overlay one on the other in the computer in real time such that we fake GFP. Now there is really no GFP in there, but we’re faking with this deep red dye because we’re not allowed to put genetic probes in and here for example again we see the tumour and it’s much, much easier for the surgeon to cut when they can see where all the green stuff is. And there’s my surgical collaborator Doctor Nguyen, she actually is a real surgeon who cuts people Monday and Thursday and works in the lab the rest of the time, Tuesday, Wednesday and Friday. And so you can see how it helps her a great deal. But the other thing you want to see are the nerves. Because if you cut the nerves then you will have long term paralysis or loss of sensation. Other things grow back, the nerves have a hard, hard time if they do at all. So you really want to see where the nerves are, to avoid cutting them. And we developed a separate peptide with a different fluorophore that stains the nerve. Now this is not a complicated biochemical amplification. Nevertheless we have false coloured that light blue. Now you can’t see here any more than 2 branches of the sciatic nerve running here. But in a moment we’ll switch to the fluorescence and what now is revealed is that there’s a hidden branch of the nerve diving into the tumour tissue that you wouldn’t, or close to the tumour tissue that you would like to avoid chopping. And in overlay, again we can see that much more clearly and then we go back to the tumour view and then that tells us where we want to cut. So it’s very much like when the gas company is digging under the side walk to put in a new gas line, you hope they know where the electricity cables are buried. And with techniques like this, we are beginning to actually improve the survival rate of cancers at least in mice where with guidance by surgery, in this case we were able to cure about half the mice where traditional surgery got less than 10%. I know my time is running out, I just want to mention on the science side that we can also look at atherosclerotic plaques which are the root causes of strokes and heart attacks, there we have to use a different protease sequence because we’re looking at the enzyme thrombin rather than MMP matrix metalloproteinase. Most of you looking at this wouldn’t even know where the carotid artery is but when you see the fluorescence you can actually light up the plaques and even get a bit of a hint as to how dangerous the plaques are because it turns out that the more ready they are to rupture the more enzyme activity they have. So let me end up with what I hope are lessons for young scientists. I hope that you find important problems, obviously that would give the maximum pay off for the least pain. Now that sort of sounds trivial and of course this is judgement, luck, this is what distinguishes successful people from not so successful people. One hint is to try to find projects that give you some sensual pleasure because then the pain at least will be less. You want to do this anyway if it’s fun. Or in my case a lot of the times it was to put my neurosis to constructive use. It isn’t just pleasure, I’m afraid, at least I have and maybe you too have some demons driving you and if you can use your projects to sort of quieten the demons down, that will also minimise the pain involved. And then you’ll do it vigorously and then if you do it for fun and joy and for your own purposes then you are best likely to do a good job that will eventually earn the recognition which should not be your primary goal, outside recognition. Accept that your batting average will be low but hopefully not zero and that especially includes accept that your best papers may be rejected from the fashionable journals. Or sometimes when you’re accepted it’s for the wrong reasons. Learn to make lemonade from lemons, at least that's what we say in America. When nature hands you an unexpected result or sometimes a failure, sometimes you can make, that’s a great opportunity. Persistence often pays off. But in order to be persistent one thing you haven’t been told is, gratuitous advice, is that my advice is that if you want to stay alive and especially if you want to keep your brain alive for long enough, like persistence and to stick it out to become a grey haired old fart like us, exercise. Prizes are a matter of luck, so avoid being motivated or impressed by them. And I particularly want to tell the students who always seem to want to have, Dr. Tsien can I have a photograph with you, can I have your autograph, I feel a bit like a brass idol in which you think that if you rub me you get luck and I’d much rather discuss science with you than simply pose for a photograph or sign some piece of paper. Of course all of this requires finding the right collaborators whom you must exploit but in a kind way for mutual benefit, those are the only useful collaborations. And with that I’ll show you the people who did the work and a picture of green flashes viewed from our lab but drawn but bacteria expressing the different colours.

Danke. Nun, da die wichtigsten Zuhörer hier die Studenten und die jungen Leute sind, nicht die alten Leute hier vorne, und weil sie eine so breite und unterschiedliche Gruppe von Leuten aus allen möglichen Bereichen sind, habe ich mir gedacht, dass ich versuchen sollte, weniger wissenschaftliche Einzelheiten weniger zu betonen, obwohl ich auf die wissenschaftlichen Tatsachen eingehen will. Dies ist nicht nur ein Vortrag über persönliche philosophische Ansichten. Doch ich möchte mich, denke ich, auf das konzentrieren, was nach meiner Ansicht einige der größten Herausforderungen sein werden, denen Sie sich werden stellen müssen. Eine von Ihnen lautet: Wie wähle ich ein Problem in der Wissenschaft aus, oder ein allgemeines Forschungsgebiet? Ich werde also versuchen darzustellen, wie ich meine Entscheidungen auf dem Weg dorthin getroffen habe, wo ich jetzt stehe – und zwar in der Hoffnung, dass dies allen von Ihnen helfen wird. Und wenn Sie das nächste Mal nach Lindau kommen, stehen Sie hier oben, statt dort unten zu sitzen. Als ich also als Student in den ersten Semestern begann, ernsthaft darüber nachzudenken, worauf ich mich wirklich konzentrieren wollte – tatsächlich hatte ich fast alles ausprobiert: Ich habe mich sogar eine Weile in der theoretischen Physiker versucht und dabei sehr schnell erkannt, dass mir dazu das Talent fehlt. Ich war in der Schule sehr gut in Chemie, stellt aber fest, dass mich die Kurse an der Universität völlig desillusionierten. Ich studierte dann Biologie, gelangte aber zu der Überzeugung, dass ich [auch] dafür nicht besonders talentiert war. Schließlich gelangte ich gegen Ende meines Grundstudiums und zu Beginn meines Graduiertenstudiums zu der folgenden Ansicht: dass die etablierte biologische Forschung sich mit der Frage beschäftigt, wie natürliche Biomoleküle und biologische Systeme funktionieren. Zwischenzeitlich verfolgte die renommierteste chemische Forschung, der ich in den späten 1960er und frühen 1970er Jahren begegnete – zu der Zeit, zu der ich diese Entscheidung treffen musste – das Ziel, natürliche Produkte vollständig zu synthetisieren. Dies war – und ist natürlich auch noch heute – ein sehr dominantes Thema in der Chemie: Wie gelingt uns die künstliche Synthese natürlicher Biomoleküle? Doch häufig [sind diese Forscher] ziemlich unbekümmert um das, was sie tatsächlich tun. Hauptsächlich geht es ihnen darum, ob diese Moleküle schön sind, ob sie schwer herzustellen sind, und ob sich mit Ihnen die neueste synthetische Technologie, organisch synthetische Technologie, zur Schau stellen lässt. Stattdessen wollte ich eine Art seltsame Kombination dieser beiden Ansätze zustandebringen. Ich entschied mich für die Frage: Können wir neue Moleküle entwerfen und herstellen, und zwar solche, die es in der Natur noch nie gegeben hat, die aber dennoch unterhaltsame und nützliche Funktionen in der Biologie übernehmen werden? Ich dachte, und denke noch immer, dass dies ähnlich wir Architektur oder Bildhauerei im molekularen Maßstab ist, mit einem großen Vorteil. In vielen anderen Forschungsgebieten befindet man sich in einem intensiven Wettbewerb mit anderen Gruppen, die dasselbe Ziel verfolgen, dasselbe biologische Problem oder denselben Bereich der Chemie erforschen, dasselbe Zielmolekül. Doch wenn man Bildhauer oder Architekt ist, entwirft niemand dasselbe wie man selbst. Und so hat man eine größere Chance andere zu beeindrucken, ohne von jemand anderem auf dem Weg zum selben Ziel überholt werden zu können. Es kann einem niemand zuvorkommen. Und dann gibt es da noch – dies ist es, was einem wirkliches Verstehen ermöglicht, denke ich – das berühmte Zitat von Richard Feynman: Traditionellerweise nahm man an, dass man diese Art von molekularem Design nur in einem Pharmaunternehmen durchführen könnte, da allein sie über die umfangreichen Ressourcen verfügen, die großen Teams, die hierfür erforderlich sind. Und warum bin ich in diesem Beruf gelandet? Nun, zum Teil deshalb, weil die Ingenieurwissenschaft in meiner Familie liegt. Mein Vater, meine älteren Brüder: Alle haben sie Ingenieurwesen studiert. Ebenso meine Onkel auf verschiedenen Seiten der Familie. Selbst meine Mutter war Krankenschwester. Näher konnte eine Frau in China der Wissenschaft damals nicht kommen. Dennoch hatte ich den Eindruck, dass die Biologie die interessantesten Fragen stellt, zumindest diejenigen, die ein einzelner experimentell beantworten konnte. Ich war der Meinung, dass zum Beispiel die Teilchenphysik einige wunderbare Fragen aufwarf. Allerdings machte es mir Angst, wenn ich in den Schlagzeilen las, wie viel hundert Leute benötigt werden, um ein Experiment [in diesem Wissenschaftsbereich] durchzuführen. Ich suchte nach etwas, das ein wenig persönlicher war. Seit meiner Kindheit faszinierten mich schöne Farben. Das erste, was die Chemie für mich interessant machte, war nicht ein Chemiebaukasten, sondern etwas Besseres, das mehr Farben hatte und gefährlicher war, zog mich an, als ich klein war. Ich war der jüngste von drei Brüdern. Ich musste eine ökologische Nische finden, die von der meiner Brüder verschieden war. Obwohl uns also die Ingenieurwissenschaft in die Wiege gelegt war, wollte keiner etwas mit Molekülen zu tun haben. Die anderen waren alle entweder Maschinenbauer oder Elektroingenieure, oder sie beschäftigten sich mit Flugzeugbau. Über dieses psychologische Bedürfnis ist ein ganzes Buch geschrieben worden, falls jemand von Ihnen daran interessiert ist. Schließlich erkannte ich dann, dass es viele [solcher Nischen] gab. Wieder machte ich mir um Konkurrenz sorgen. Ich erkannte, dass die meisten Biologen nicht mit mir konkurrieren konnten. Sie wussten zwar, wie man alphabetische Stränge manipuliert, d.h 20 Aminosäuren, vier Basen der DNA, typischerweise eine zusätzliche für die RNA. Sie konnten sich nicht jedoch außerhalb dieses Alphabets bewegen. Das ist so, als wenn Sie einen wissenschaftlichen Aufsatz schreiben wollten, aber nur einen Word Processor kennen. Sie können einen Buchstaben nach dem anderen eingeben, aber keine Diagramme zeichnen, und für mich ist die Fähigkeit, ungewöhnliche Moleküle zu bauen, wie die Fähigkeit PowerPoint oder Adobe Illustrator oder so etwas zu verwenden, statt Microsoft Word oder irgendein anderes Programm. Zumindest gab es also damals nicht viel Konkurrenz. Anfänglich hatten ich erste Erfolge, nach einigen Fehlstarts – zugegeben. Bei den ersten Versuchen, hatte ich noch keinen Erfolg. Ich arbeitete an intrazellulärem Kalzium. Als Erstes muss ich Ihnen erklären, warum das zwar wichtig ist, aber eine Herausforderung darstellt. Schwankungen in der Menge des freien Kalziums erweisen sich bei allen möglichen Signalübertragungen als wichtig: Sie reichen von jeder Bewegung meiner Muskeln bis zu jeder Kommunikation im Gehirn zwischen einem Neuron und einem anderen durch, die synaptische Signalübertragungen stattfindet. Selbst zu Beginn des Lebens, wenn ein Spermium auf eine Eizelle trifft usw., usw. Diese Signale können sehr schnell sein. Sie können in Millisekunden übertragen werden, und es geht dabei um räumliche Distanzen von wenigen Mikronen. Doch chemisch betrachtet besteht die Herausforderung darin, dass die Kalziumskonzentration, die wir zu messen versuchen, in der Größenordnung von 10 hoch -8 bis 10 hoch -6 mol liegt, und das stellt die kontrollierende Größe dar. Allerdings man kann dies nicht einfach dadurch messen, dass man die Zelle zerstört und die Gesamtmenge an Kalzium bestimmt. Doch es gibt noch viele andere Größenordnungen. Größere Werte für die Gesamtmenge von Kalzium – und was noch schlimmer ist: Diese geringen Kalziumwerte sind von einem Meer umgeben, von einem Ozean höherer, sehr viel höherer Kalziumwerte. Auch in diesem Fall um ein Vielfaches größer. Es ist so, als würde man versuchen, den Inhalt eines versiegelten Behälters mit dieser Flüssigkeit unterhalb des Ozeans zu messen, und als wäre es einem nicht erlaubt, ihn aus dem Wasser zu heben. Und wenn Sie eine Nadel hineinstechen, strömt das Salzwasser hinein und zerstört auf der Stelle den Inhalt dessen, was sie unterhalb dieses ganzen Wassers zu analysieren versuchten. Und dann war da schließlich noch die Tatsache, dass es einen großen Überschuss an Magnesium gibt, wiederum ein Überschuss um mehrere Größenordnungen. Magnesium ist ein zweiwertiges Ion, das chemisch gesehen Kalzium recht ähnlich ist, und dass wir unterscheiden können mussten. Und dann erkannte ich auch, dass niemand jemals versucht hatte, einen speziellen Indikator hierfür zu entwerfen. Kein Mensch hatte je einen Indikator für Kalzium entworfen. Wann immer man versucht hatte, einen Indikatorfarbstoff einzusetzen, war es ein Stoff gewesen, der zu anderen Zwecken verwendet worden war. Nun, wenn man dieses herausfindet, kann dies sowohl erhebend sein (da man weiß, dass man ein noch unbetretenes – oder zumindest kaum betretenes – Gelände vor sich hat) weil man große Angst davor hat, dort jemandem zu begegnen. Wahrscheinlich haben es schon viele versucht und sind im Stillen gescheitert, haben nichts veröffentlicht. Nun ja, das ist das Wesen von Publikationen: Unsere Niederlagen veröffentlichen wir im Allgemeinen nicht. Oder Sie sind vielleicht dazu verurteilt, auf fremden Spuren zu wandeln und ihre eigene Mühe zu verschwenden. Also: Dasjenige, womit ich tatsächlich begann – als Doktorand – war die Untersuchung der Struktur von EGTA, des einzigen bekannten Moleküls, das die erforderliche Affinität und Selektivität für Kalzium besaß. Es wurde zwar von Biologen verwendet, aber es hatte keine optischen Eigenschaften. Es gab uns nie Auskunft darüber, wie viel Kalzium es gebunden hatte. Und so erkannte ich, dass ich dem Molekül Absorptionsfähigkeit verleihen musste, eine optische Eigenschaft, wissen Sie. Und die einfachste Art dem Molekül diese Absorptionsfähigkeit zu geben bestand darin, ihm auf diese Weise einfach zwei Benzolringe anzufügen. Und ich gab mir zwei oder drei Wochen, dies zu versuchen, denn ich hatte bereits drei fehlgeschlagene Projekte während der Arbeit an meiner Dissertation hinter mich gebracht, und sollte kein weiteres in Angriff nehmen. Ich sollte diese drei anderen zum Erfolg führen. Doch insgeheim begann ich – ohne das Wissen meines Doktorvaters, der dies sicherlich verboten haben würde – dieses Molekül herzustellen, und ich wusste, dass ich mich an einer kurzen Leine bewegte: die Zeit lief mir davon. Doch glücklicherweise konnte ich dieses Molekül in etwa zwei oder drei Wochen herstellen, und es funktionierte tatsächlich. Es hatte die gewünschten Eigenschaften. Ich kam also nicht mehr davon los. Doch es war immer noch nicht gut genug, um damit Messungen in Zellen durchführen zu können, denn es verfügt nur über die Fähigkeit Ultraviolett zu absorbieren. Doch es nahm mich trotzdem gefangen. Der Haken war in meinem Mund. Und ich machte weiter und weiter, und schließlich – als ich sie mir leisten konnte – entwickelte ich mit Hilfe von organischen Chemikern, die geschickter waren als ich selbst, dieses als Fura-2 bezeichnete Molekül. Wie Sie sehen: Einfach durch die ständige Erweiterung um die zentrale Bindungsstelle, die ich nicht veränderte. Und mit diesem Molekül lässt sich der Kalziumgehalt messen, weil es angeregt werden kann, weil es fluoresziert. Wenn es Kalzium bindet, sitzt das Kalzium in diesem Hohlraum hier und verdreht die Bindung zwischen Stickstoff und Kohlenstoff. Die einsamen Paare auf dem Stickstoff sind wie die Spitze meiner Nase, und das Kalzium sitzt hier drüben. Um es binden zu können, muss ich mich auf diese Weise drehen. Und dieses Verdrehen führt im Wesentlichen zu einer Trennung meines oberen und unteren Teils, mit einer elektronischen Spektralstruktur, und damit verschieben wir die kürzeren Wellenlängen. Doch dann kam das Problem. Ich musste dies in eine lebende Zelle bekommen. Erinnern Sie sich: Ich darf die lebende Zelle dabei nicht durchstechen. Denn sobald die Membran durchstochen ist, strömt Kalzium hinein. Es gibt Leute, die sind geschickt genug, Nadeln in Zellen zu stechen, ohne sie zu beschädigen. Doch ich gehörte nicht zu ihnen. Ich bin ein wenig zu ungeduldig und zu tollpatschig. Außerdem wusste ich, dass es auf diesem Gebiet zu viel Konkurrenz gibt. Andere Leute waren besser. Wenn es mir also gelingen würde an Zellen zu arbeiten, bei denen niemand Mikroinjektionen vornehmen konnte, dann würde ich dieses Feld für mich haben können. Doch wie gelingt einem das? Nun, hier ist die Plasmamembran, die Zellmembran, und wir müssen dieses Molekül hindurchbekommen. Mit 5 negativen Ladungen auf dem Molekül – 1, 2, 3, 4 – die unerlässlich für die Bindung mit Kalzium sind, gelingt das nicht. Und hier unten ist eine fünfte Ladung. Was tun wir also? Nun ja, als chemische Lösung stellte sich Folgendes heraus: Man verdeckt alle negativen Ladungen mit etwas, das als Estergruppe bezeichnet wird. Man muss eine sehr spezielle Estergruppe auswählen, von der die Zelle selbst weiß, wie sie sie wieder los wird. Wir haben also dieses Molekül synthetisiert, und es kann durch die Membran wandern, durch einfache Diffusion, und zwar weil es etwas wasserabweisend ist. Und nachdem es ins Innere der Zelle gelangt ist, verfügen – zu unserem Glück – die meisten Säugetierzellen über Enzyme, die diese R-Gruppen abtrennen und die Moleküle wieder in das Material verwandeln, das wir wollten. Und dann hatten wir eine Lösung. Und um Ihnen nur ein kleines biologisches Beispiel aus den 20 oder 30 tausend zu nennen, die seither veröffentlicht wurden: Dies ist eines der ersten, und ich mag es sehr, weil es eines der ersten war, die funktionierten. Es steht mit Beginn des Lebens eines Seeigels in Zusammenhang. Dies ist der Moment, unmittelbar nachdem man dem Ei eines Seeigels Spermien hinzugefügt hat. Hier war das Ei. Die Spermien waren erst vor 15 Sekunden in die Schale gegeben worden. Noch hatte keines von ihnen das Ei gefunden. Das Ei ist diese umhüllte Kugel hier. Es hat eine tiefblaue Farbe, da sein Kalziumgehalt sehr niedrig ist. Dies ist eine falsche Farbskala, die abgeleitet wird, indem man ständig das 340 zu 380, 340, 380, 340, 380 Nanometer-Größenverhältnis misst, mehrmals pro Sekunde hin und her. Und dann, in diesem Moment hier, oder zumindest eine Sekunde früher – das Spermium ist hier auf die Eizelle getroffen – bewegt sich das Kalzium in diesen Bereich, den roten Bereich. Es ist von etwa 0,1 Mikromol, was einer Konzentration von 10 hoch –7 entspricht, bis auf 1,2 oder 1,3 Mikromol angestiegen, um einen Faktor von 13 oder so. Wenn wir dies hier über die nächsten paar Sekunden weiterverfolgen, steigt der Kalziumgehalt im gesamten Ei. Im Wesentlichen sagt dies der DNA der Mutter, dass Papa eingetroffen ist. Mit anderen Worten: Das Spermium ist angekommen. Du hast jetzt einen kompletten Satz DNA. Beginne mit dem Prozess der Entwicklung. Und dann geht die Kalziumkonzentration zurück, da eine zu hohe Kalziumkonzentration schon nach kurzer Zeit giftig wird. Das war alles gut und schön und es trug mir eine feste Stelle ein. Doch ich suchte nach neuen Herausforderungen und es war auch keine besonders gute Strategie, nur über Kalzium zu arbeiten, das ein anorganisches Ion hat. Ich musste biochemisch respektabler werden. Daher wählte ich als mein nächstes Ziel cAMP, den prototypischen „sekundären Botenstoff“, für den der Begriff des sekundären Botenstoffs entwickelt worden war. Er ist so wichtig, dass Nobelpreise an Earl Sutherland, Ed Krebs und Eddie Fischer vergeben worden waren. Ich glaube Eddie könnte irgendwo im hier Zuhörerraum sein. Er ist hier auf der Tagung. Dies ist die Struktur von cAMP. Doch trotz all dieser Arbeit machen es die gegenwärtigen Methoden zur Messung von cAMP im Wesentlichen erforderlich, dass man Millionen von Zellen nimmt, sie abtötet und zerkleinert und dann eine biochemische Analyse durchführt. Und dies bedeutete, dass die interzelluläre Dynamik von cAMP – in direkter Analogie zu Kalzium – ziemlich vollständig im Dunkeln lag. Und auch hier gibt es wieder ein Selektivitätsproblem, denn in Gegenwart von Millimolar-Konzentrationen von ATP liegen die Konzentrationen von cAMP unterhalb des mikromolaren Bereichs. ATP ist die Hauptenergiequelle der Zelle, aus der cAMP hergestellt wird. Es wurde also ohnehin deutlich, dass hier keine Hoffnung bestand, auf organisch-chemische Weise ein Molekül mit allen Selektivitätseigenschaften zu synthetisieren, das groß genug war, um sich um ein recht großes Molekül wickeln zu können. Also mussten wir zu diesem Zweck den natürlichen cAMP-Sensor, der als cAMP-abhängige Proteinkinase bezeichnet wird, oder heute als Proteinkinase A, „entführen“. Wir hofften, dass es uns gelingen würde, ihn mit Fluorophoren zu markieren, auf eine Weise, die die cAMP-Bindung anzeigt. Wieder hatten wir einen natürlichen Ausgangspunkt. Doch er gab uns kein Signal. Dies ist der natürliche Ausgangspunkt, dieses Enzym. Schematisch sind hier vier Untereinheiten dargestellt: zwei regulierenden und zwei katalytische. Und wenn es cAMP bindet, macht die regulierende Untereinheit eine Konfirmationsänderung durch und stößt die katalytische Untereinheit ab. Ich glaube dies ist ein Großteil dessen, wofür Ed Krebs seinen Nobelpreis erhielt. Wie machen wir hieraus einen Indikator? Nun, schließlich fanden wir heraus, dass wir – wenn wir Fluoreszin an die katalytische Untereinheit binden, Rhodamin an die regulierende Untereinheit – in diesem Komplex etwas erhalten, was als „Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer“ bezeichnet wird. Hierbei handelt es sich um eine quantenmechanische Wechselwirkung zwischen zwei Fluorophoren, die in der Biochemie als Reagenz für Protein, oder für die Ähnlichkeit mit Proteinen, bekannt war. Und nachdem wir diesen Komplex mit cAMP aufgebrochen hatten, verloren wir dieses quantenmechanische Phänomen und erhielten eine Farbänderung. Und dieses Prinzip funktionierte in der Tat. Das Problem bestand jedoch darin, dass der ursprüngliche Protein-Sensor es erforderlich machte, dass man die regulierenden und katalytischen Untereinheiten des Proteins in E. coli exprimierte und reinigte, denn dort erhielten wir reines Protein. Man musste größere Mengen dieses Proteins herstellen, und das war Susan Taylors Aufgabe. Tatsächlich war dies so wichtig, dass es einer der Hauptgründe war, warum ich von Barkley nach San Diego umzog, weil ich in der Nähe von Susan sein wollte. Was die Markierung mit Rhodamin und Fluoreszin betrifft: Ich kann einfach blind hier einzeichnen, wie wir sie eingefügt haben. In Wirklichkeit ist es jedoch nicht so einfach. Herauszufinden, wie man sie hinzufügen können, ohne die Schnittstellen zwischen der katalytischen und regulierenden Untereinheit zu beschädigen, erforderte einen riesigen Arbeitsaufwand. Und schließlich musste man die Teile wieder zusammensetzen und mit Hilfe der Mikroinjektion in Zellen bringen. Erinnern Sie sich: Ich habe ihnen gesagt, dass ich es hasse, Mikroinjektion durchzuführen. Ich kann das nicht. Mittlerweile habe ich natürlich eine feste Stelle. Ich kann PostDocs anheuern und ihnen sagen: Sie üben das jetzt für sechs Monate, bis Sie es gut können. Doch das ist immer noch keine optimale Lösung. Wir suchten also nach einer allgemeinen Methode, mit der sich Proteine mit genetischen Techniken fluoreszent markieren ließen, und zwar in der lebenden Zelle. Denn dann sollten wir in der Lage sein, irgendein auf natürliche Weise fluoreszierendes Protein zusammenzusetzen – idealerweise wünschten wir uns zwei Farben, das Äquivalent von Fluoreszin und Rhodamin. Wir wollten sie mit den regulierenden und katalytischen Untereinheiten verbinden und dann exprimieren. Wir würden, was wir benötigten, in situ herstellen. Ich erinnere mich daran, dass unsere große Konkurrenz bei der Kalziummessung der als Aequorin bezeichnete Stoff war, wobei es sich um das natürliche Quallenprotein handelte, dass Kalziumkonzentrationen misst. Quallen wollen also Kalzium messen. Erinnern Sie sich daran, dass kein Mensch je versucht hat, einen solchen Stoff zu entwickeln. Und dies ist Professor Shimomura, und ich hoffe, dass er sich irgendwo hier befindet. Wer von ihnen möchte, kann ihn später hören. Dies ist natürlich ein sehr viel späteres Bild. Er hatte das grün fluoreszierende Protein als Verunreinigung von Aequorin gefunden. Und ich erinnerte mich daran, dass es so etwas gab. Eine Sache, die ich Ihnen zeigen wollte, ist eine ziemlich einmalige Filmsequenz. Es ist erstaunlich schwierig, einen Film einer leuchtenden Qualle zu finden, die diesem ganzen Zeug zugrundeliegt. Ich fragte Shimomura, und er konnte mir keinen Film geben. Und Marty, wenn ich dich verstanden habe, hast du ihn noch nie gesehen. Ich musste im letzten Sommer nach Alaska reisen. Ich fasste den Entschluss, diesen Ort zu besuchen und bat die Leute, mir Quallen zu besorgen. Und ich hoffe Sie erkennen – es tut mir leid, der Becher ist etwas fluoreszent, das macht die Sache etwas undeutlich –, dass die Qualle selbst fluoresziert. Wir scheinen ein ultraviolettes Licht darauf, und dieser Ring hier entspricht den Zellen, die leuchten werden. Und dann machen wir uns bereit, die Qualle anzustoßen. Wenn Sie die Beleuchtung ausschalten, sehen Sie den Lichtblitz. Das war er. Das ist also das Vergnügen, ein Experiment mit den eigenen Händen durchzuführen. Der nächste wichtige Schritt besteht natürlich darin, dass dieser Mann, Douglas Prasher, im Jahre 1992 ein Gen für GFP klonte, was alle nachfolgenden Arbeiten erst möglich machte. Und dann war Marty, den Sie in ein paar Minuten hören werden, der erste, der zeigte, dass GFP tatsächlich auch außerhalb einer Qualle funktionierte. Ich lasse ihn den Rest der Geschichte erzählen, seinen Teil. Die ursprüngliche Qualle hatte einige schwache Spektren. Sie wurden von der Qualle für ihre eigenen Zwecke produziert, die wir immer noch nicht wirklich verstehen. Doch ihr Spektrum musste offensichtlich verbessert werden, und indem wir eine Reihe wilder Ideen verfolgten, haben wir es durch Mutationen verändert und fanden schließlich heraus, dass wir das Spektrum wesentlich verbessern konnten, in dem wir die Aminosäure neben derjenigen austauschten, die den größten Teil des Chromophors herstellt. Dies war also ein frühes Beispiel dafür, wie man das Protein umgestaltete, um es für Menschen oder die Wissenschaftler nützlicher zu machen. Und dann war es natürlich hilfreich, die Kristallstruktur aufzuklären, was hauptsächlich im Labor von Jim Remington durchgeführt wurde. Es stellte sich heraus, dass dieses Protein ein 11strängiges Beta-Fass war, mit einer fast schönen zylindrischen Form und Symmetrie, wobei das Chromophor tief in der Mitte dieses Zylinder eingebettet war. Es gibt heutzutage unter jungen Leuten und allen möglichen Personen ein großes Interesse an einer Chemie, die grün und umweltfreundlich ist und keine giftigen organischen Lösungsmittel verwendet oder Abfallprodukte hinterlässt. Ich möchte darauf hinweisen, dass diese Chemie in mehrerer Hinsicht grün ist. Offensichtlich, weil sie im wahrsten Sinne des Wortes grün ist, und auch, weil jeder fluoreszente Stoff in Protein tatsächlich durch DNA codiert ist. Das macht sie so leistungsstark. Und er ist nicht giftig. Er kann von jedem aeroben Organismus synthetisiert werden. Hier ist eine Maus, die ihn gerade unter unserer Anleitung hergestellt hat, weil wir ihr die DNA eingefügt haben. Es erfordert 230 aufeinanderfolgende Kondensationen, eine Zyklisierung und ein oder zwei Auto-Oxidationen. Konsumiert Sauerstoff, funktioniert in ein paar Minuten. Ein 100%iger Ertrag in einer wässrigen Lösung bei einer Temperatur zwischen der Zimmertemperatur und 37°C. Und das einzige Nebenprodukt ist Wasserstoffperoxid. Ich denke also, das ist ziemlich gut als Ziel für eine grüne Chemie. Schließlich gelang es uns, jede Menge verschiedener Farben zu erhalten. Ich habe Ihnen einige von den Quallen gezeigt. Später gewannen wir eine aus Korallen. Wir hatten im Labor viel Spaß oder Streitigkeiten darüber, was wir sie nennen sollten, und schlussendlich, nachdem wir uns auf der Website von Crayola informiert hatten, entschieden wir uns für diese Namen, d.h.: Honigtau, Banane, Orange, Tomate, Orangerot usw., die etwas mnemotechnischer sind, um Ihnen eine Gedächtnisstütze für die Farben zu geben, zu denen sie gehören. Und diese wurden durch einen absichtlichen Evolutionsprozess entwickelt. Ich denke, wir waren nicht die einzigen, die dies getan haben. Viele andere haben es ebenfalls getan. Doch als Form von biologischem Engineering hat dies, denke ich, ein großes Potential, um uns in der Energiekrise zu helfen, wenn wir erneuerbare Energien herstellen müssen, biologische Brennstoffe usw. Nur um Ihnen ein schönes, visuell ansprechendes Beispiel der Verwendung fluoreszierender Proteine zu geben, nehme ich hier etwas aus der Arbeit meines früheren PostDocs Atsushi Miyawaki, der jetzt in seinem eigenen Labor in Riken arbeitet. Er baute einige sehr clevere Moleküle, die eine vom Zellzyklus abhängige Synthese verwendeten, um bestimmte Proteine abzubauen, die am Zellzyklus beteiligt sind. Das entspricht der kombinierten Arbeit von Tim Hunt und Hershko und Ciechanover. Sie sind alle auf diesem Treffen hier. Atsushi arrangierte also die Herstellung eines grünen Proteins, das während der Mitose synthetisiert und für den Rest der Zeit zerlegt sein sollte. Und es gibt andere Proteine, die genau umgekehrt hergestellt werden, fast genau umgekehrt. Und der entschied sich, sie rot zu machen oder sie mit einem roten Protein zu markieren, so dass sie aktiviert sind, wenn keine Mitose stattfindet. Und dann werden sie deaktiviert, wenn eine Mitose abläuft. Nun, das ist eine sehr clevere Farbwahl, weil grün „Losgehen“ bedeutet und rot „Stehen bleiben“. Selbst in Japan verwenden wir dieselbe farbliche Kodierung, und das macht es Leuten einfacher, sich ihre Bedeutung zu merken. Hier sehen Sie die Entwicklung dieser Zellen über den Zeitraum einer Woche. Und wie Sie sehen, leuchten sie abwechselnd rot, grün, rot, grün, rot, grün, während sie den Zellzyklus durchlaufen. Sie könnten nun annehmen, dass dies irgendwie trivial ist, da wir hier direkt anhand der Morphologie sehen können, an welchem Punkt des Zellzyklus sich eine Zelle befindet. Doch häufig können wir in einem lebenden Organismus nicht wissen, in welchem Stadium sich eine Zelle befand, da wir sie nur einmal sehen können. Doch mit Hilfe der Farbcodierung können wir nun retrospektiv immer herausfinden, in welchem Stadium sich eine Zelle befand. O.k.: Das soll über fluoreszierende Proteine genügen. In letzter Zeit bin ich verstärkt dazu übergegangen zu versuchen, die molekulare Bildgebung auf den Menschen zu übertragen, und insbesondere auf kranke Menschen. Dies ist eine Art translationaler Forschung, die durch eine Reihe von Gründen motiviert ist. Erstens möchte ich gern etwas machen, das klinisch relevanter ist als einfach nur für andere Leute Werkzeuge zur Verfügung zu stellen, mit denen sie Medikamente untersuchen können, wie zum Beispiel die Pharmaunternehmen. Wenn wir diese Techniken entwickeln, denke ich, das ist eine Art cooler Chemie. Doch aus dem Blickwinkel der biologischen Forschergemeinschaft wird dies häufig wenig geschätzt oder verworfen, da es sich hierbei lediglich um die Entwicklung von Techniken handelt, ok. Während, wenn ich dies nun für Patienten tue, es tatsächlich dasselbe molekulare Engineering ist. Doch nun ist es translationale Forschung und die Institutionen zur Vergabe von Forschungsgeldern denken, das sei alles cool und alles sei modern. Doch um persönlicher zu reden: Mein Vater, mein Neffe, mein Doktorvater, viele andere Kollegen sind an Krebs gestorben. Meine Mutter hatte einen Schlaganfall. Das wird auch mich schließlich erwischen. Also möchte ich etwas dagegen tun. Das Problem besteht nun darin, dass fluoreszierende Proteine einen Gentransfer benötigen, um von ihrem Hauptnutzen Gebrauch zu machen, der darin besteht, dass sie von DNA codiert werden können. Und das lässt sich bei kranken Menschen technisch nicht wirklich umsetzen. Die Gentherapie ist nicht weit genug fortgeschritten und normalerweise ist sie ethisch nicht zulässig: Wir werden keine transgenetischen Menschen erstellen, wie wir das bei Mäusen tun, wie Sie es vor ein paar Minuten gesehen haben. Für uns Forscher könnte es sehr nützlich sein, fluoreszierende Menschen zu haben, doch sie selbst wären wahrscheinlich weniger froh darüber. Und außerdem sind Menschen zu dick und zu opak. Wenn man den gesamten Körper mit Fluoreszenz untersuchen wollte, so gelingt einem das bei einem Zebrafisch, einem Wurm und so weiter. Doch wir Menschen sind im Wesentlichen zu dick und zu fett. Hierfür benötigen wir Techniken wie die Kernspintomographie, für die natürlich ein eigener Nobelpreis vergeben wurde. Und wir benötigen eine Signalverstärkung. Was wir also stattdessen taten, war Folgendes: Wir haben Kontrastmittel entwickelt, die Proteasen bei Krebs ausfindig machen. Und Proteasen sind wichtig, denn um in gesundes Gewebe einzudringen und in den Blutstrom und entfernte Gewebe zu gelangen – was schließlich zum Tode führt – ist eine Krebszelle auf die Aktivierung dieser Proteasen angewiesen. Was wir auf molekularer Ebene taten, war, dass wir erneut mit einem bekannten Mechanismus begannen, der für unsere Zwecke nicht recht geeignet war. Er bestand darin, dass seit langem bekannt war, dass polykationische Peptide, reich an Argininen, in der Lage waren, sich an die Außenseite der Zelle zu heften und dass sie schließlich ins Innere der Zelle gelangen – zumindest in einige Organelle der Zelle, durch Endozytose. Selbst kleine Mengen können den Endosomen entkommen und in das Zytosol und den Zellkern gelangen. Und In einigen Systemen, besonders bei zellfreien Systemen, gibt es einige Hinweise darauf, dass sie keine Endosomen benötigen und durch die Plasmamembran wandern können. Dieser Vorgang ist jedoch ziemlich nicht-selektiv bezüglich der Zellen. Um ihn für Tumorzellen selektiv zu machen, um insbesondere diese Proteasen herauszulesen zu können, taten wir Folgendes: Wir haben das Polykation absichtlich verkrüppelt, um es zu maskieren oder zu verbergen, indem wir ihm mit einem „Haarnadel-Linker“ eine gleiche Sequenz negativer Ladungen anhefteten. In diesem Zustand ist dieses Molekül intern selbstneutralisiert und ist nicht mehr „klebrig“. Wenn wir jedoch mit einer Protease daherkommen, und wir richten es so ein, dass die Protease diejenige sein sollte, die die Krebszellen haben, dann zerschneiden sie es. Sie sind es dann, die die „Messsonde“ [probe] übernehmen. Während, wenn das normale Gewebe es nicht zerschneiden kann, das Zeug „nicht-klebend“ bleibt. Und es kommt und prüft Gewebe und geht wieder, ohne zu kleben. Die Krebszellen zerschneiden es, und dann werden sie mit der „Traglast“ angefüllt. Um Ihnen zu zeigen, wie dies in vivo funktioniert – ich überspringe die zellulare Arbeit: Dies ist ein Peptid mit der passenden Struktur: aufspaltbar durch die als Matrix-Metalloproteinasen 2 und 9 bezeichneten Tumorproteasen. Dies sind 9 Arginine, sie sind der klebrige Teil, der im Moment durch 9 negative Ladungen maskiert ist. Dies ist ein tiefroter Farbstoff, Cy5, zur Markierung, damit wir durch einige Gewebe, die Blut enthalten und in denen sich die Krebszellen befinden, hindurchschauen können. In diesem besonderen Fall hier haben wir gemogelt. Wir markierten den Tumor mit GFP, um Ihnen auch ein Beispiel dafür zu geben, wie GFP in einer Maus verwendet werden kann, um die Zellen zu markieren, an denen man interessiert ist. Und hier ist also der grün leuchtende Tumor. Das Interessante ist nun, dass wir dasselbe Bild äquivalent in dem roten Farbstoff bekommen können, durch das Zeug, das wir injizieren. Es ist nicht genetisch codiert und es findet im Wesentlichen dasselbe Gewebe, das bösartig war. Und wenn wir – was eine wichtige Kontrolle ist – das Molekül mit Di-Aminosäuren neu erstellen, dann erkennt das Enzym es nicht, und das Molekül hat dieselbe Größe und Hydrophobie, „belädt“ aber die Tumorzellen nicht, weil es nicht zerlegt werden kann. Können wir Techniken wie die Kernspintomographie erreichen, die den Techniken entsprechen, mit denen wir an Menschen nichtinvasiv arbeiten? Die Antwort lautet: Ich glaube, wir kommen ihnen näher. Hier ist eine Maus mit einem Tumor, und dies ist der Zustand vor der Injektion. Der Tumor hebt sich nicht besonders vom Rest der Maus ab. Dies ist ein Querschnitt, Sie wissen schon, mit einem computergestützten MRI-Scanner, um sozusagen einen Schnitt durch die Taille zu legen oder auf Schulterhöhe, auf der Höhe der Achselhöhlen. Hier ist jedoch eine Maus, deren Tumor... Nun ja, wir haben die gesamte Maus durch die Schwanzvene 24 Stunden vorher mit diesem Konstrukt injiziert, bei dem es sich um ein Nanopartikel handelt. Beladen mit Gadolinium und unserem aktivierbaren, Zellwände durchdringenden Peptiden, diesen …, die für die Proteasen empfindlich sind. Und ja, der Tumor hat nun aufgeleuchtet, und wir können ihn vor dem Hintergrund des restlichen Gewebes erkennen. Hier ist wieder eine Kontrollversuch, in dem wir dasselbe Partikel mit nichtspaltbaren Aminosäuren hergestellt haben. Er leuchtet nicht. Für die Verwendung von Fluoreszenz steht jedoch noch ein Gebiet zur Verfügung: die Chirurgie. Denn hier schneiden wir das darüberliegende Gewebe weg, und für den Patienten muss es weggeschnitten werden. Wenn ich also .... Hier ist ein Stück Mausgewebe, ein Segment. Die Maus lebt. Können Sie sehen, wo der Tumor ist? Chirurgen stehen seit Tausenden von Jahren vor diesem Problem, wenn Sie Krebs herausschneiden, wenn sie versuchen Krebsgewebe herauszuschneiden. Es ist sehr schwer zu sagen, wo der Krebs anfängt und wo er endet. Wenn wir also den Film ablaufen lassen und auf den fluoreszenten Modus umschalten: Hier ist die Fluoreszenz, eine tiefrote Fluoreszenz, die uns tatsächlich zeigt, wo sich der Tumor befindet, basierend auf dem biochemischen Mechanismus, den ich soeben beschrieben habe. Doch wenn wir schneiden, ist es viel besser, wenn wir das eine in Echtzeit im Computer über das andere legen, auf solche Weise, dass wir GFP nachahmen. Tatsächlich befindet sich kein GFP hier, doch mit diesem roten Farbstoff ahmen wir dies nach, denn es ist uns nicht erlaubt, genetische Messstoffe einzuführen. Und hier sehen wir zum Beispiel erneut den Tumor, und es ist viel, viel leichter für Chirurgen zu schneiden, wenn sie sehen können, wo sich all das grüne Zeug befindet. Hier ist meine chirurgische Mitarbeiterin Dr. Nguyen. Sie ist eine echte Chirurgin, die montags und donnerstags Patienten operiert und den Rest der Zeit im Labor arbeitet: Dienstag, Mittwoch und Freitag. Sie können also sehen, dass es hier sehr hilft. Doch das andere, was man sehen können will, sind die Nerven. Denn wenn man die Nerven schneidet, kommt es zu einer längerfristigen Lähmung oder zum Verlust der Empfindung. Andere Gewebe wachsen zurück. Bei den Nerven dauert es sehr, sehr lange – wenn es überhaupt geschieht. Man will also definitiv sehen, wo die Nerven sind, um zu verhindern, dass sie durchtrennt werden. Und wir haben ein anderes Peptid mit einem Fluorophor entwickelt, das den Nerv färbt. Nun, dies ist keine komplizierte biochemische Erweiterung. Dennoch haben wir das helle Blau falsch eingefärbt. Sie sehen hier nur zwei Äste des Ischiasnervs, der hier verläuft. Doch gleich werden wir auf die Fluoreszenz umschalten, und jetzt zeigt sich, dass hier ein verborgender Zweig des Nerven in das Tumorgewebe, das Sie nicht wollen, eintaucht, oder der sich in der Nähe des Tumorgewebes befindet, den Sie nach Möglichkeit nicht schneiden wollen. In der Überlagerung können wir dies sehr viel deutlicher sehen. Und dann gehen wir zur Tumoransicht zurück, und die sagt uns, wo wir schneiden sollten. Es ist also so, als wenn das Gaswerk den Gehweg aufgräbt, um eine neue Gasleitung zu legen: Sie hoffen, dass es weiß, wo die Stromkabel verlegt sind. Und mit derartigen Techniken beginnen wir die effektive Überlebensrate bei Krebs zu erhöhen, zumindest bei Mäusen, durch Anleitung bei der Operation. In diesem Fall gelang es uns, die Hälfte der Mäuse von ihrem Krebs zu heilen, wo die traditionelle Chirurgie nur eine Heilungsquote von 10 % erreichte. Ich weiß, dass meine Zeit zu Ende geht. Ich möchte – auf der wissenschaftlichen Seite – lediglich erwähnen, dass wir auch die Ablagerungen bei der Arteriosklerose betrachten können, die die Grundursache bei Schlaganfällen und Herzinfarkten sind. Dort müssen wir eine andere Proteasesequenz verwenden, da wir es hier mit dem Enzym Thrombin statt mit der Matrix-Metalloproteinase (MMP) zu tun haben. Die meisten von ihnen, die sich dies anschauen, würden noch nicht einmal wissen, wo sich die arteria carotis befindet. Doch wenn Sie die Fluoreszenz sehen, können Sie die Ablagerungen aufhellen und sogar einen Hinweis darauf bekommen, wie gefährlich diese Ablagerungen sind. Denn wie sich gezeigt hat: Je bereiter Sie sind, zu zerreißen, umso mehr Enzymaktivität zeigen sie. Lassen Sie mich mit dem schließen, was für mich die Hoffnungen für junge Wissenschaftler sind: Ich hoffe, dass Sie wichtige Probleme finden werden. Das würde offensichtlich den größten Ertrag für die kleinste Anstrengung erbringen. Nun, das klingt irgendwie trivial, und natürlich bedarf es hierfür Urteilskraft, Glück. Das unterscheidet erfolgreiche Leute von weniger erfolgreichen Leuten. Ein Rat von mir lautet, dass Sie versuchen sollten, Projekte zu finden, die Ihnen ein sinnliches Vergnügen bereiten. Denn dann wird wenigstens die Anstrengung geringer sein. Sie wollen dies dann sowieso tun, weil es Spaß macht. In meinem eigenen Fall habe ich meine Neurose häufig konstruktiv zum Einsatz gebracht. Es ist nicht nur Vergnügen, fürchte ich. Ich zumindest – und vielleicht auch Sie – werde von Dämonen getrieben, und wenn Sie Ihre Projekte dazu verwenden können, diese Dämonen irgendwie zum Schweigen zu bringen, so wird dies ebenfalls die mit der Arbeit verbundene Anstrengung auf ein Minimum reduzieren. Sie werden es dann mit Nachdruck tun. Und wenn Sie es zum Spaß und zur Freude tun, und zu Ihren eigenen Zwecken, dann ist es am wahrscheinlichsten, dass sie eine gute Arbeit leisten, die Ihnen schließlich Anerkennung einbringen wird, die nicht ihr Hauptziel sein sollte, äußere Anerkennung. Akzeptieren Sie, dass Ihre durchschnittliche Trefferquote gering sein wird, jedoch hoffentlich von null verschieden. Dazu gehört auch, dass Sie akzeptieren, dass Ihre besten Aufsätze von den begehrten Fachzeitschriften abgelehnt werden. Oder manchmal – wenn sie angenommen werden – geschieht es aus den falschen Gründen. Lernen Sie es, aus Zitronen Limonade zu machen. So nennen wird das in Amerika. Wenn die Natur Ihnen ein unerwartetes Ergebnis liefert oder manchmal ein Fehlschlag, so können Sie dies gelegentlich tun. Es ist eine tolle Gelegenheit. Durchhaltevermögen zahlt sich aus. Doch um ausdauernd zu sein.... eine Sache habe ich Ihnen noch nicht gesagt – es ist ein kostenloser Rat. Mein Rat lautet, dass Sie – wenn Sie am Leben bleiben wollen, und besonders wenn Sie Ihr Gehirn lange genug am Leben erhalten wollen, wenn Sie das Durchhalten lieben und am Ball bleiben wollen, um ein grauhaariger alter Knacker zu werden wie wir, dass Sie dann Sport treiben sollten. Preise sind Glückssache. Vermeiden Sie also, dadurch motiviert oder davon beeindruckt zu sein. Besonders möchte ich den Studenten, die scheinbar immer ein Autogramm von mir wollen – Ich fühle mich immer wie ein Götzenbild aus Kupfer, von dem man denkt, dass es Glück bringt, wenn man es reibt. Viel lieber diskutiere ich mit Ihnen über wissenschaftliche Fragen, als einfach eine Pose für ein Foto einzunehmen oder ein Stück Papier zu unterschreiben. Natürlich verlangt all dies, dass man die richtigen Mitarbeiter findet, die man ausbeuten muss – allerdings auf eine dem gegenseitigen Nutzen dienende Weise. Das sind die einzig nützlichen Kollaborationen. Und hiermit zeige ich Ihnen die Leute, die die Arbeit gemacht haben, und ein Foto von grünen Blitzen, von unserem Labor aus betrachtet, doch von Bakterien gezeichnet, wie die verschiedenen Farben experimentieren.

Roger Tsien (2010)

Designing Molecules and Nanoparticles to Help See and Treat Disease

Roger Tsien (2010)

Designing Molecules and Nanoparticles to Help See and Treat Disease

Abstract

Molecules to observe and manipulate biological systems can be devised by a variety of strategies, ranging from pure chemical design and total synthesis to genome mining and high-throughput directed evolution. Examples of both successes and failures will be chosen mainly from my own experience. The key challenge is to match one’s own neuroses and pleasures with research challenges that will have the widest possible impact.

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