Roger  Tsien (2009) - Building and Breeding Molecules to Spy on Cells, Tumors, and Organisms

Molecules to observe and manipulate biological systems can be devised by a variety of strategies, ranging from pure chemical design and total synthesis to genome mining and high-throughput directed evolution

Now we come to the third lecture this morning, and now it will be given by Professor Roger Tsien from the University of California, San Diego which is actually in La Jolla and he also, he shared last years Nobel Prize for the discovery and development of GFP. Now he will speak about another or related topic which is building and breeding molecules to spy on cells, tumours and organisms. So please, Professor Tsien. PROFESSOR ROGER TSIEN. I too would like to thank Countess Bettina and all the other organisers for their tremendous effort in putting together this meeting. And today because the students and the post docs are the explicit audience I thought I would try to bring in some suggestions of how you might start your careers and choose what to work on. Based on my own experience for good or for worse and I hope to show you some of the places we made mistakes as well as the places that we got lucky. And so I’ll begin by, since this is a chemistry meeting, by discussing creativity in chemistry which typically can be either an analysis or synthesis. And also this is of course, this particular prize has a close relationship to biology and so I should remind you that in mainstream biological research our questions are: how do natural bio molecules and biological systems work? And Marty Chalfie just gave you some beautiful examples of that sort of investigation. In mainstream chemical research, particularly when I got started, when I was introduced to it, the emphasis was very much heavily on the total synthesis of natural products, which was essentially asking how do human beings artificially re-synthesis natural bio molecules in ways that may or may not resemble the way the original organism made that. And I guess I wasn’t quite happy with either one and that was part of me and I’ll explain a little bit about why I’m such an ornery sort of person and I wanted to combine the two in a different way which is synthesis but applied to biology, can we design and build new molecules that will perform amusing, we hope and maybe useful functions in biology. And this is sort of fun because it’s sort of like architecture or sculpture on the molecular scale. And also is a little less competitive because you may have several groups all racing to build the same natural product after it has been synthesised. And the first person is the one who first achieved the total synthesis or you could have the people who are first trying to clone the gene for this particular function and then it’s a competition. But in architecture or sculpture you're not, if you’re especially moulding a piece of clay, you're not competing with anybody, nobody else is going to make exactly the same thing you are. And that made me feel a little better about, because I wasn’t, I was doubtful that I was a very good competitor so I like to be able to have my own playpen to work in. And yet it’s also a rigorous test of one’s understanding of molecular systems because not just ability to make things but to predict their properties, that is to make something novel. Of course you can always rationalise after the fact, oh I think I know how this molecule works. Well you really think you have a better evidence that you understand it when you can make it ab-initio. And when I started at these traditionally this was considered something only drug companies would have the resources to do big industrial teams, academics didn’t really try to do this strange combination of chemistry and biology. So why did I do it, well I have to admit that engineering runs in my family, I just happen to come from lots of lots of engineers, but I soon realised that biology has the most interesting grand questions in science that I felt were doable by individuals. At that time of course I was, you know I saw that it was very interesting, what is the origin of the universe, what are future sources of energy, what are, how does the, well anyway, how does nuclear physics work, where do atomic particles come from. And I felt and realised pretty quickly those need enormous teams of people. So in order to work on an individual scale, biology still has some of those wonderful questions. And Marty beautifully alluded to them. And I personally have been fascinated since childhood by pretty colours so that’s me. Finally as the youngest of three children I needed to find an ecological niche which is distinct from parents and older siblings and there’s a whole book about this psychological urge, if any of you are youngest children or if any of you are eldest children who have to cope with bratty youngest children I suggest you read this book. Which is all about how Charles Darwin was driven by the need as a youngest child, the oldest child was going to inherit the family fortune, typically the second one went into the army, the third went into the clergy, he was supposed to go into the clergy, he didn’t like it, he much preferred collecting bugs and beetles. And eventually to find something different to do he became a naturalist and the rest is history. And finally I’ve been trying to avoid competition because I’m scared of it and was useful to realise that interdisciplinary barriers prevented most biologists from knowing how to manipulate molecules other than the traditional linear alphabetic strings, twenty amino acids, four DNA right nucleotides, one extra for RNA. Almost adds up to twenty six, almost, that’s what most biologists knew how to manipulate and therefore anybody who could make molecules that weren’t just linear, that were more like pictorial diagrams, in other words more traditional chemistry would have big opportunities and few competitors, at least back when I was starting. And I urge you maybe to look for the same areas where interdisciplinary barriers create a niche that is thinly populated. So as you’ll see my usual approach has been to identify some sort of need in biology that I think is significant and preferably one whose solution would suit my neurosis and I think you’ll see some of these neurosis that I have. And then I identify what properties the molecular solution would need to have and you know you cannot solve all the problems perfectly, you cannot make the perfect molecule the first time so you have to have some idea what is the most relevant priorities to start with and what can be deferred to later. Then you identify such a starting point and then you try to modify it to gain as many of those that require other properties as possible. And this is the first stage at which you need real experiments and some bravery. So this is typically now in my lab where I have to recruit some member of my lab, I have to convince somebody that this is a problem worth trying. The first three I can do sitting there nowadays ever more at the computer instead of, used to be I had to go to the library and we come up with some suggestion, some potential molecule that we want to make. Finally we try to test it biologically and then we often have to bring in collaborators who are experienced in that form of biology because unlike Marty I am not wedded to one model organism, I have never been able to settle down in that sense. And finally this whole process needs to be reiterated as we find out what's wrong with our existing molecules and what do we most need to improve. So I actually started with intercellular calcium as the first biological target, actually it was my second but the first was so hard that I gave up on it which was membrane potential to begin with. And I’ll just explain briefly why calcium was important but I think Erwin Neher already introduced this topic, that fluctuations in free calcium are crucial for muscle contraction, neuronal communication which is synapses or particularly what he discussed, sperm egg fertilisation, which is another form of secretion, enzyme activation. I believe he mentioned how fast and localised those signals can be and that the calcium levels that you’re looking at are very low, on the order of 10 to the -8 to 10 to the -6 molar in the resting state, possibly rising to 10 to the -5 or -4 at the very, very highest point, very locally. But this is a tiny fraction of the calcium that you measure if you do traditional analytical chemistry which involves as usual grinding up lots of cells and burning them up and measuring how much total calcium, which gives you numbers much, much greater than 10 to the -3 molar. Any damage to the cell membrane causes a flood of calcium to come in from the outside and those levels are in us around 10 to the -3 and in marine creatures around 10 to the -2 molar. So again these are huge numbers compared to what you want to measure. And finally there’s a huge amount of magnesium that you must work in the presence of. The previous calcium indicators aequorin was one of the very best and that’s due to the work of Professor Shimomura but then various synthetic dyes had been made, all of them with certain drawbacks for looking at single cells in particular. And so the way I started was trying to find something new. I decided that the most important problem was the calcium to magnesium selectivity. Rather than worrying immediately about how good a diet was, I just wanted that selectivity. I figured that I could fix the dye part of it later. So I started with chelator called EGTA which was the only then known chelator in common use that had the five orders of magnitude selectivity for calcium over magnesium that was necessary. But you see this molecule has no chromophore, it doesn’t absorb even decent amount of UV, ultraviolet light let alone visible light, so how do you get it to tell you anything. Well you would obviously have to add a chromophore, the simplest chromophore that is chemically stable is a benzene ring, so how could you stick a benzene ring into this molecule. Well one direct option is to stick a benzene ring down here. On replacing this single bond between the two in the ethylenedioxy unit, by a benzene ring. And I thought about it and realised this would be a little bit more difficult to make. But then there was another alternative that you could put the benzene ring and insert it annulated basically into this side. And for symmetry it would be easier to do it on both sides. And this molecule will have the great advantage that now when calcium bound in here, and this I did now with CPK models before computers, actually built the model, tried to put calcium in here and saw that the nitrogen to carbon bond would have to twist upon complexation with calcium. And that nitrogen carbon bond twisting would disconnect the nitrogen from the rest of the benzene ring and cause a spectroscopic change. And also the presence of the benzene ring would lower the PKA of the nitrogen so that it wasn’t so prone to protonate and that would make the calcium indicator PH insensitive. And so this is the molecule I chose to make and fortunately it took only about a month to do so. Now of course any good synthetic chemist would be able to now do it in six hours or so, would look at it and know how to do it but I was really not a very good chemist but I’m glad it didn’t take more than a month because I was already at the last stages of my PhD having basically ruined three other projects, this was my last desperate attempt to get something that would be a road for the future. And fortunately it didn’t take that long, in a month I had the proof that I could make this and it did indeed have the properties of very high calcium to magnesium selectivity. A big change in the UV spectrum, fast kinetics and no PH dependence. Exactly as designed, it was a lousy chromophore because it was only a benzene ring but that was expected because that was part of the principle. And then it took about another eight years I’m afraid, through many evolutions to turn it into fura-2, I think is one of the molecules that Erwin Neher might actually have eluded to, where obviously we have now extended the chromophore a great deal and now this has a useful green florescence. But then came the problem of how to get this inside the cell and with all of these negative charges, this is fura-2 again, it has five negative charges, four of them are essential for binding the calcium up here, one of them is down here, partly for synthetic convenience and partly so that we don’t have a detergent. If this was non polar this entire zone of the molecule could be relatively greasy and that might make a detergent. So we’ve spoiled the hydrophobicity by this negative charge here. But with all these negative charges this molecule won’t cross plasm the cell membrane very readily and I too was obsessed with the problem that Marty has eluded to, that we want to work on live cells, we don’t want to have to kill cells and fix them and permeabilise them for everything we want to work live. And the traditional answer would be to micro inject this material inside cells. Eventually Professor Neher’s discovery of the patch clamp made this much easier, but at the time this didn’t exist and I was really bad at doing micro injection, I didn’t have the patience nor the manual dexterity. So here’s an example of compensating for my neurosis, I had to develop a chemical solution and that was to discover a protecting group in organic chemical nomenclature which makes an ester that is hydrophobic. Blocks all the negative charges but there’s lots of those hydrophobic, you know ester groups. But the key is that this acetoxymethyl ester is one that can be de-protected by the cytosol itself. In other words our cells contain enzymes that break this up and spontaneously revert with the help of this enzyme back to all the negative charges. And so simply by making this and putting it outside self, it will soak in and regenerate the material and hey we have a chemical solution to the need for micro injection. When calcium binds after that, it twists this nitrogen carbon bond as I’ve tried to draw crudely here and that shifts the spectrum. So one very simple example, I won’t pick the beautiful one from neurons that may have already been shown, this is the beginning of life for sea urchin eggs so it’s sort of cute. Here is a sea urchin egg that has just had the die put in it, sperm was just put in the dish but the sperm haven’t quite found the egg yet. So this is time after addition of sperm into the dish. But by thirty six seconds one sperm clearly has made it and has touched the egg here and started this wave of high calcium which is symbolised here by the warm colours. And over the next eight seconds it gets a quarter way, fifty two seconds it’s half way and by sixty eight seconds which is less than a minute since we started, the entire egg is fused with this high calcium which we pick to be this bright red colour because I wanted to pick pretty colours and I psychologically associated blue with rest and red with activation. That’s entirely a human choice, it’s quite common now in the literature and I believe I may be one of the people to blame for that, but it enabled my colleague Rick Steinhardt to call this the blush of conception. Then afterward because high calcium maintained is toxic to cells, this calcium wave has done many things like trigger all the subsequent events of development, at least early development and caused a secretion of a protective membrane around the egg, a sort of chastity belt because the egg having had one sperm, definitely does not want any more sperm. And so it raises this barrier to protect itself from any additional fathers. And so eventually the cell cools back down to a low calcium. Now that was all well and good and it fed my career for a while but I then wanted to extend myself beyond inorganic ions and the problem is, is that calcium is nice, it’s spherical but the next most important messenger is cyclic AMP. The actual prototype of the concept of an internal signal transduction molecule whose importance was recognised by Nobel Prizes to Sutherland for the discovery of the messenger and then Krebs and Fischer for the mechanism by which it activated cell function. But for me the problem was that as working on this mixture of chemistry in physiology and calcium being an inorganic ion, I was consigned to the so called salt and water gulag at Berkley because there was going to be a big reorganisation of the biological sciences and people who worked just on salt and water were very sort of low class citizens compared to the people who worked on molecular biology and worms and proteins and glorious things like that. And so in order to make myself look respectable I wanted to be able to work on this molecule, this famous messenger. But here too, just as before with the calcium the existing means for measuring cyclic AMP were and still mostly are destructive, people even now still grind up millions of cells and buy a kit from Amersham or something to do radio immunoassays after the cells are all dead. And therefore the dynamics of intercellular, cyclic AMP were obscure. And there’s another problem that there’s all these micro molar levels of this messenger to be detected in the presence, again swamping amounts of other adenine nucleotides, like ATP which is what cyclic AMP is made from, is present, that’s maybe five millimolar where the cyclic AMP is less than a micro molar. So again we have a huge selectivity problem and again the solution may be hijack somebody else’s already existing cyclic AMP sensor of which there are several possibilities. But then you would have to label them with fluorophores to detect the cyclic AMP conformational change. And so what we came up with is this scheme for hijacking this cyclic AMP dependent protein kinase which is again what Krebs particularly had gotten the prize, his prize for. It consists of two regulatory sub units, two catalytic sub units and when cyclic AMP binds to the regulatory sub units and the cyclic AMP are symbolised by the yellow circle, then the regulatory sub unit undergoes some sort of conformational change, kicks out the catalytic sub unit which is set free to do phosphorylation. But in the process it splits the protein sub units apart. And then I realised that we could use the trick called florescence resonance energy transfer or FRET to monitor this process in situ, in a living cell, if only we could put say fluorescein on the catalytic sub unit, rhodamine on the regulatory sub unit and in this complex we would get FRET because the fluorescein and rhodamine would be close. And just like with aequorin and GFP when they are close to each other the blue light from aequorin is, the energy is transferred to the GFP which then glows green, here it’s a green red example but the same principle applies. On the other hand there you would get FRET, blue light into the fluorescein, instead of giving you green out would give you red out. And then when cyclic AMP split the sub units, blue light into the fluorescein would just simply give you green because the rhodamine was too far away. And we got that to work and I won’t take the time to show you all the examples, but it did require that we express and purify these sub units in E-coli and I had to even move to San Diego to collaborate with Susan Tailor who had that working. And it took my people a year sitting next to hers and learning from her how to handle the enzyme in order to figure out how to label with rhodamine and fluorescein, without destroying the protein function and to put it back together and to micro inject it into living cells. And I kept telling you I hated micro injection and I still hate it but at least at this stage I was a full professor and I could tell my students you learn how to micro inject. I’m no good at it but you learn. But clearly this was still a very cumbersome procedure that would be hard to generalise to other proteins and so we wanted a general means to fluorescently label genetically designated proteins in living colours and I needed two colours because I needed the equivalent of fluorescein and rhodamine and that’s the other reason, the scientific reason aside from my personal obsession with pretty colours, on why we had to immediately, once we got GFP, why we had to change its colour. So indeed here, this is my take on the Douglas Prasher, I was delighted, I hadn’t heard Paul Brehm but I knew from aequorin and Professor Shimomura’s work that there was this nasty component that you had to get rid of called green florescent protein. And then I realised that GFP if it had been cloned would be useful. I looked this up in Medline and I was lucky that this was about a month after, this by coincidence a month after Prasher and Eckenrode had published their paper and this is a copy of the paper. By the way this is really in evidence for the importance of basic research and the blindness of some granting agencies, this work, Douglas had tried to get the money from NIH, the National Institutes of Health, he was turned down. The National Science Foundation which would more normally do marine organisms, they turned him down, only the American Cancer Society of all things, which is actually rather translational, had the courage to give him a very small grant which funded the earlier part of his work. But poor Douglas did not manage in the early stage of his work to get something full length enough to work in E-coli and so that led eventually to his departure from science. Nevertheless the rest I think you know from Marty’s beautiful story, that Marty actually also got the gene and was the first to show that it would express E-coli in worms by itself. But let me just come back to my part of the story now, which is that actually wild type GFP, despite its inherent advantages had some real problems, it had its main excitation peak in the UV and only a minor excitation at the desired blue light wavelength. And people didn’t, don’t really like to use UV light if they don’t have to. And it brought excitation spectrum, already was enough to prevent it from being useful as a FRET acceptor so we needed to fix this and its folding efficiency and codon usage and slow formation. So here’s the excitation spectrum of wild type GFP, shown in the dotted line, there’s the big UV peak and the small visible peak. And I had this strange hypothesis, I mean I had to speculate chemically what’s going on here and I thought that maybe this chromophore as drawn, this is the Shimomura structure that he proposed for the chromophore even before the cloning, I thought maybe that’s responsible for this big peak. And that maybe a small fraction dehydrates this bond here, putting an extra double bond, creating a sort of dehydroalanine unit. That extra double bond might lengthen the conjugation and might be responsible for this little peak. And in that case our job was to promote dehydration of serine 65 or what's left over. So there’s a simple way to test this hypothesis, I asked Roger Heim who was the post doc who could do the molecular biology, change this, what used to be a serine into an alanine. With an alanine we now have no OH, we just have hydrogen and that you couldn’t do an elimination on. So that should entirely drive the spectrum over to this peak. So Heim did it, he made S65A and he proved that I was completely 100% wrong, completely the opposite happened, instead of emphasising this peak it went away and all we got was the longer peak. Well ok so you know nature tells you, dumb, dumb, start again. So we then kept trying the other amino acids such as cysteine, cysteine with an SH here should eliminate more readily than hydrogen sulphide, well ok sure enough it also emphasised this peak. And then we went to threonine which only adds a methyl group here and that should eliminate just fine but if anything that killed this, also killed this peak. And so it happened to be about ten nanometres further red shifted and the threonine is what every molecular biologist considers the most palatable substitute for serine, the most conservative. So for that psychological reason we advocated serine 65 to threonine as the most suitable mutation for future use because it now was six fold brighter and had gotten rid of this peak and was not suitable for FRET and so on. And it also made expression a little easier and so on. So that was all well and good. So all of that was done without the help of a three dimensional structure and we wanted to get one and when Jim Remington came to me and said let’s, would you like to collaborate on a crystal structure, I said great, but we know there’s five other groups competing with us, they’re trying to solve the crystal structure too. And that's a horse race, I hate these competitions and you see this is a constant theme. How do we get ourselves out of the horse race and yet sort of still in it. Let’s solve S65T, nobody is working on that one and that way we have it to ourselves and even if somebody else scoops us on the wild type, we can still publish. And we’ll publish it because it will be interesting, how did one extra carbon atom and one methylene going from serine to threonine in one amino acid, improve the spectrum so much. Well it turned out that Mats Ormo was one of the first if not the first to get crystals and to solve the structure and that revealed this famous eleven stranded beta barrel with the chromophore hidden inside. And the fact that the chromophore is so well buried explains in a sort of way why no other enzyme could be involved because no other enzyme could ever get at it. So we were very pleased with ourselves, we even made a yellow version by rational mutagenesis, semi rational mutagenesis based on the crystal structure. And then we tried to get it published in Science and we too had our problems. The first referee said that it was, competent crystal structure, uninteresting protein, yeah, not particularly interesting enough to be publishable in Science. Second referee, very important protein, but it doesn’t, this paper on the x-ray structure and mutagenesis does not answer the crucial question about GFP, which is what is its function for the jelly fish. What, how the hell is a crystal structure supposed to tell you ever what the ecological function is in its native environment, it’s the wrong sort of technique. But with two negative reviews they obviously couldn’t accept it. I appealed and the most that the editor could do, even trying to be kind was to say well I’ll send it to a third referee. And so that went out and the third referee never answered, never answered, never answered. Months went by and then finally on the internet appeared a comment from a young lady called Fan Yang in George Phillips lab saying hey everybody we just saw the crystal structure GFP and it’s coming out next month in Nature Biotechnology. So we simply took that comment and emailed it to Science and next day our paper was accepted without waiting for referee number three. So there’s a couple of morals of the story here. But I have to say the internet is great but be careful about what you say on it because you know had that comment not appeared we would have been way, way trailing in the dust. So eventually we managed to make FRET indicators out of all sorts of biochemical processes like proteases, eventually we got cyclic AMP working, though that was one of the more difficult ones actually, calcium and phosphorylation indicators that measure protein phosphorylation and kinases and so with this a lot of the dreams that I had came to pass. But one thing also bothered me, we could never get an honest to goodness red and that was always my favourite colour as a kid, bright red and we never managed to make GFP turn red. And so we were both amazed and a little envious when a Russian group showed the corals which are not bioluminescent, actually generate red fluorescent proteins. So this came out of left field, we didn’t do it, another one I wish I had done. But what they had not done was solve the structure of the chromophore, they just had a DNA sequence, it didn’t explain why was this gene that was homologous to GFP turn red instead of green. And that we were pleased to be able to contribute because they made the gene available, fortunately we bought a copy and made it in bacteria and by a combination of mass spec and chromo peptide analysis and some chemical tests and so on, we realised that where the chromophore GFP is this hydroxybenzylidene-imidazolinone but stops here in its conjugation, what the red protein has figured out how to do is dehydrogenate this carbon nitrogen bond and extend it by two units and therefore get to a long wavelength. And this is a famous photograph of where we got the 2004 with a wide variety of colours. But in the last few minutes I want to tell you that fluorescent proteins as good as they are, have some major limitations, sometimes they’re just too big and there are times when fusing GFP to your favourite protein does screw it up, alas. The excitation wavelengths of 600 that up to now have not exceeded 600 nanometres and that does not penetrate far enough through relatively opaque organisms like mice. And then we are even bigger and more opaque and for that we need imaging techniques such as magnetic resonance. And finally the great virtue of GFP and all the fluorescent proteins is that they are genetically transferable but that is their Achilles heel when it comes to application to human beings where both genetic therapy is technically difficult and morally fraught with some concerns. So to answer both of those questions one of the areas we’ve been working on are infrared fluorescent proteins and here we’ve had to venture completely away from the original eleven stranded beta barrel and go to a completely new family of proteins, derived from the phytochrome series and they use biliverdin a tetrapyrrol like chromophore who a little bit of a tetrapyrrol was introduced in Professor Shimomura’s lecture as one of the luminescent luciferase but a different tetrapyrrol that you and I already make in large quantity every day called biliverdin. This is the first break down product of Heim, everyone of you is making about a quarter gram of biliverdin per day. This can be incorporated into a protein that makes it florescent, makes a covalent atom that is florescent. And now with these longer wavelengths we can much more readily see into an intact mouse. This is the liver of a live mouse that has been adenovirally transfected. Whereas previous florescent proteins were much, much dimmer, were hardly visible, GFP was quite useless in this context because the liver is so darkly red as you know. But finally we’ve been getting away from, back to my roots in synthetic chemistry, completely getting away from florescent and genetically encoded ones for the use of clinical application. Our target has been these proteases such as matrix metalloproteinase 2 and 9 that are so famous for their involvement in tumour metastasis that we could just steal a cartoon from a commercial website so it’s very valuable to be able to see the activity of these proteases. And the molecular scheme by which we do so is now quite different, instead of FRET we are using something called a cell penetrating peptide which is a polycationic peptide that has a bunch of positive charges, something like 6 to 10 positive charges. And if that is fused to a payload that normally wouldn't be able to enter the cell, that combination will stick to the outside of the cell by electrostatic attraction of the plus charges for the outside, negative charges. And then some of this gets endocytosed into internal organelles and from there a little bit of it may be able to escape into the cytosonal nucleus, though there’s also some indication that under some circumstances may be cell penetrating peptides can bypass the endosomal process. But this as I’ve just described to you is a very indiscriminate process in cells and in order to make it selective and thereby workable inside a living organism we had to figure out a way to stop it from happening. And the way we do it is to fuse in a row of negative charges of matching but opposite charge and that polyanion keeps the polycatine neutralised and busy and therefore not sticky. As long as those two are held together covalently a cleavable linker. I said it’s a cleavable linker because we want to be able to cut it apart and when that gets cut apart by something like MMP2 and 9 that the tumour has, a normal tissue does not have much of, that locally releases the polycatine from its inhibitory constraint and then the polycatine can do its usual thing, as if it had been locally injected at the site of enzyme activity, note that this is an amplifying mechanism because one enzyme can cut many molecules and trigger the entry or at least cell adhesion of a large number of payload molecules. So a little example of how this works is in these artificial tumours which are in xenograpts, this is the peptide, in red is the acidic domain, lower case indicates d-amino acids, upper case, in this case PLGLAG is a good substrate from MMP2 and 9. Lower case arginines, these are d-amino acids and the red dye, Cy5, deep red so that it can penetrate flesh, it’s florescent, is there and this was injected in to the animal systemically and yet it homes in or is retained in the tumour when the normal tissues don’t hold on to this material, so that the tumour lights up. If you use a control peptide where you simply invert the stereochemistry of the four amino acids, PLL and A, now they’re d-amino acids, the enzyme doesn’t recognise it, even though the molecule is the same molecular weight in hydrophobicity. And then the tumour does not light up with our dye. This tumour happened to have been marked with GFP, it’s too bad human tumours don’t come with GFP already in them. So finally to show you an example of how this might actually help surgeons, I have this little movie here and I hope that the lights could come down for this one movie please, could someone please help me there. And what you’ll see is this is the ordinary view and then the florescent view and finally this is an overlay where we have combined the florescence on top of the regular view and the florescence which is actually deep red is false colour green. Now the green is not from GFP, I have to keep emphasising this, reporters who don’t understand science look at this and say oh that’s Dr. Tsien putting GFP into the tumour, this is a false colouring, we only pick green because normally there is nothing green inside a mouse, ok. So this is an overlay that clearly distinguishes the florescence from the rest. And so we move it around a bit so you can see that this is live and then in a moment there’s another view, there’s the tumour and finally this helps the surgeon cut more accurately. You can’t tell from one of the views where you just see the reddish flesh but with the green overlay it becomes quite simple to go and snip out the tumour. You want to get rid of everything green. Now there’s one thing that the surgeons must not cut which is the nerve and I’m going to freeze it there because we have a separate peptide that labels the nerve and there its florescence we encode as light blue, not because it really is light blue, because again light blue is a colour that doesn’t normally exist inside flesh. And this particular branch that’s coming out here is one that you wouldn’t have been able to see otherwise. The rest is all obvious and anyone probably could have seen that there was a nerve there or this trunk of white flesh but this hidden branch would be otherwise not so obvious. As shown, there’s the florescence but if I stop it there you can see again the nerve is very visible but that extra branch wasn’t visible except by the help of this molecular staining in the live organism. And so here the job of the surgeon is to cut out the green stuff without damaging the blue material and we think that this may eventually be a way in which all this molecular understanding and the proteases and so on can help surgeons go on and make more accurate tumour resection which when it works is still the quickest way and cheapest way to achieve a complete cure. Ok so we can actually improve survival when we use surgery guided by florescence compared to traditional surgery, this is time in weeks after surgery and in a very aggressive tumour where only one out of twelve animals would survive otherwise, we can raise it to almost five or six out of twelve and so we think that this may be a form of personalised medicine where the imaging guides the therapy. So my last is to comment some lessons for young scientists, I hope to have given you my feeling which is try to find important problems but also to put your own neurosis to constructive use, try to find projects that give you some essential pleasure, in my case the love of pretty colours. Accept that your batting average will be low but hopefully not quite zero. That your best papers may be rejected from the fashionable journals or when they finally do accept it for the wrong reasons and grant proposals are just the same or worse for funding. Learn to make lemonade from lemons, so often you turn out to be completely wrong but don’t just give up, let nature teach you a lesson, sometimes persistence pays off. I really want to emphasise prizes are ultimately a matter of luck, don’t be motivated or impressed by them. And I’m not any smarter on October 9th than I was on October 7th, even though I’m a lot more famous by October 9th and so on. Of course we have to find the right collaborators and exploit them kindly in a mutually beneficial way so that everybody, you know is happy and gains from. And in particular these are my collaborators and in a lot of, I have to really emphasise many a senior scientist get up and say all the work, I didn’t do it, the work was done by the people in my lab and that is not only true in my case, I couldn’t even have done the work because I am personally incompetent in the techniques of molecular biology, I have to confess I never learned how to run a gel or a PCR reaction. I have yet to do one in my life. And so really dependent on smart people who are willing to do all of this. When I do have fun I do try to go back and make some dyes, that’s about all I know how to do and I don’t even do it very well. It’s only between Christmas and New Years that the emails will let up enough for me to do it and basically I sort of do a rotation in my own lab and generally come up with the opinion that if had to hire myself I wouldn't do it, I’m so terrible at it. Nevertheless we’ve had some fun and we draw pretty pictures such as this sun set with green flash, drawn with the bacteria expressing all the different colours, so thank you.

Wir kommen jetzt zur dritten Vorlesung des heutigen Morgens. Sie wird von Professor Roger Tsien von der Universität von Kalifornien, in San Diego gegeben. Er teilte sich letztes Jahr den Nobelpreis für die Entdeckung und Weiterentwicklung eines grün fluoreszierenden Proteins Heute wird er über ein anderes, jedoch verwandtes Thema sprechen: über die Herstellung und Vermehrung von Molekülen, mit denen man Zellen, Tumore und Organismen bespitzeln kann. Bitte, Professor Tsien. PROFESSOR ROGER TSIEN. Ich möchte mich bei Gräfin Bettina und allen anderen Organisatoren für die enorme Mühe bedanken, die sie in die Vorbereitung dieses Treffens investiert haben. Und da heute ausdrücklich die Studenten und Postdoktoranden die Zuhörerschaft ausmachen, dachte ich mir, ich sollte einige Vorschläge darüber machen, wie Sie Ihre Karriere beginnen und Ihr Arbeitsgebiet aussuchen könnten. Meine Ausführungen basieren – wohl oder übel – auf meinen eigenen Erfahrungen, und ich hoffe Sie sowohl auf die Stellen aufmerksam zu machen, an denen ich Fehler gemacht habe, als auch auf die, an denen ich Glück gehabt habe. Daher werde ich, da dies ein Treffen über Chemie ist, mit der Erörterung der Kreativität in der Chemie beginnen, bei der es sich typischerweise um Analyse oder Synthese handeln kann. Dieser Preis hat natürlich auch eine enge Beziehung zur Biologie. Daher sollte ich Sie daran erinnern, dass unsere Frage in der regulären biologischen Forschung lautet: Wie funktionieren natürliche biologische Moleküle und biologische Systeme? Marty Chalfie hat Ihnen soeben einige wunderschöne Beispiele für diese Art der Forschung gegeben. In der regulären chemischen Forschung, besonders als ich mein Studium begann, als ich in die chemische Forschung eingeführt wurde, legte man sehr großes Gewicht auf die vollständige Synthese natürlicher Produkte. Die Frage lautete im Wesentlichen: Wie können Menschen auf künstliche Weise natürliche Biomoleküle mit Methoden synthetisieren, die denjenigen der ursprünglichen Organismen gleichen mögen oder nicht? Ich vermute, ich war mit beiden Bestrebungen nicht recht einverstanden. Das war ein Teil von mir, und ich werde ein wenig erklären, warum ich eine solche störrische Person bin. Ich wollte beide Vorgehensweisen auf andere Weise kombinieren: Ich war an der Synthese interessiert, aber angewendet auf die Biologie. Können wir neue Moleküle konstruieren und herstellen, die amüsante – und wie wir hoffen – auch nützliche Funktionen in der Biologie übernehmen? Dies macht Spaß, denn es ist etwa so, als ob man auf molekularer Ebene Architektur betreibt oder Skulpturen entwirft, und es ist außerdem etwas weniger kompetitiv, da man mehrere Arbeitsgruppen haben kann, die alle darum konkurrieren, dasselbe Naturprodukt, nachdem es synthetisiert wurde, möglichst in Rekordzeit herzustellen. Und der Gewinner ist derjenige, dem es als erstem gelingt, die vollständige Synthese durchzuführen. Oder es kann Leute geben, die zuerst versuchen, das Gen für diese besondere Funktion zu klonen, und dann setzt der Wettlauf ein. Doch in der Architektur oder Skulptur konkurriert man, wenn man ein Stück Ton modelliert, mit niemandem. Kein anderer wird genau das hervorbringen, was Sie herstellen. Und dabei fühlte ich mich etwas wohler, denn ich hatte Zweifel daran, ob ich ein guter Wettstreiter sei. Ich arbeite gern in meinem eigenen Laufstall. Dennoch ist dies ein strenger Test des Verständnisses der molekularen Systeme: nicht nur ein Test der Fähigkeit, Dinge herzustellen, sondern auch der Fähigkeit, ihre Eigenschaften vorherzusagen, d.h. etwas Neues herzustellen. Natürlich kann man rückblickend immer rationalisieren: denkt man tatsächlich, dass man einen besseren Beweis für das Verständnis des Moleküls besitzt. Als ich mit meiner Arbeit in dieser Richtung begann, nahm man traditionellerweise an, dass nur Pharma-Unternehmen über die Ressourcen verfügten, dies zu versuchen, große industrielle Teams. Akademiker haben diese seltsame Kombination aus Chemie und Biologie nie wirklich betrieben. Warum habe ich es also getan? Nun, ich muss zugeben, dass das Ingenieurwesen in meinen Genen liegt. Ich komme einfach aus einer Familie von sehr, sehr vielen Ingenieuren. Doch ich erkannte sehr bald, dass es in der Wissenschaft die Biologie ist, die die meisten großen Fragen aufwirft, die von Einzelpersonen gelöst werden können. Damals, wissen Sie, sah ich natürlich, dass diese Fragen hochinteressant waren: Was ist der Ursprung des Universums? Was sind die Energiequellen der Zukunft? Wie funktioniert die Physik der Atomkerne? Woher stammen die Elementarteilchen der Atome? Und ich erkannte recht schnell, dass diese Fragen nur von großen Teams bearbeitet werden konnten. Um in einem kleineren Maßstab als Einzelforscher zu arbeiten, hält die Biologie noch immer einige dieser wunderbaren Fragen bereit. Und Marty hat wunderbar darauf angespielt. Persönlich haben mich schöne Farben von Kindesbeinen an fasziniert. So bin ich nun mal. Und schließlich musste ich als jüngstes von drei Kindern eine ökologische Nische finden, die von derjenigen meiner Eltern und älteren Geschwister verschieden war. Es gibt ein ganzes Buch über diesen psychologischen Drang. Wenn irgend jemand unter Ihnen das jüngste Kind seiner Familie ist, oder das älteste Kind, das sich mit ungehorsamen jüngeren Geschwistern auseinandersetzen muss, so empfehle ich Ihnen die Lektüre dieses Buches. Es handelt davon, wie Charles Darwin von diesem Drang bestimmt war. Das älteste Kind würde das Familienvermögen erben, das zweite Kind schlug eine militärische Laufbahn ein, das dritte wurde Geistlicher. Er solle Geistlicher werden. Es gefiel ihm nicht, viel lieber sammelte er Käfer und andere Insekten. Um schließlich etwas anderes zu finden, was der tun konnte, wurde er Naturforscher; und der Rest ist Geschichte. Letztlich habe ich versucht, Wettbewerb zu vermeiden, weil ich mich davor fürchte, und es war nützlich zu erkennen, dass interdisziplinäre Barrieren die meisten Biologen daran hindern zu verstehen, wie man andere Moleküle als die herkömmlichen linearen alphabetischen Stränge manipuliert, zwanzig Aminosäuren, vier DNA-Nukleotide, ein zusätzliches für RNA. Das macht fast 26 aus, fast. Das ist es, womit die meisten Biologen arbeiten konnten. Daher würde jeder, der Moleküle herstellen konnte, die nicht nur linear waren, die mehr wie bildliche Diagramme aussahen, mit anderen Worten [deren Herstellung mehr] wie herkömmliche Chemie aussah, große Chancen und wenige Mitbewerber haben, zumindest damals, als ich damit begann. Ich würde Ihnen dringend raten, dass Sie nach ebensolchen Gebieten suchen, in denen interdisziplinäre Schranken für eine Nische sorgen, die dünn besiedelt ist. Sie werden sehen, dass meine übliche Vorgehensweise darin bestanden hat, (1) einen Bedarf in der Biologie zu erkennen, der nach meiner Meinung bedeutsam war – vorzugsweise einen, dessen Lösung meiner Neurose entsprach. Ich denke, Sie werden einige von den Neurosen kennen, die ich habe. Wissen Sie: Man kann nicht alle Probleme perfekt lösen. Man kann nicht beim ersten Mal das perfekte Molekül herstellen. Man muss daher eine ungefähre Vorstellung davon haben, welches die relevantesten Prioritäten sind, mit denen begonnen werden sollte, und was für später verschoben werden kann. um möglichst viele solcher Punkte zu erhalten, die möglichst viele andere Eigenschaften erfordern. Dies ist das erste Stadium, in dem Sie echte Experimente und einigen Mut benötigen. Diese Situation ist in meinem Labor typisch. Ich muss einen Mitarbeiter des Labors dafür gewinnen, ihn überzeugen, dass etwas ein Problem ist, das die Beschäftigung damit lohnt. Die ersten drei Schritte kann ich heute immer öfter an meinem Computer bearbeiten, statt wie früher in die Bibliothek gehen zu müssen. Wir beginnen mit einigen Vorschlägen, einigen möglichen Molekülen, die wir herstellen wollen. Zum Schluss versuchen wir, sie biologisch zu testen. Dann müssen wir häufig Mitarbeiter hinzuholen, die mit dieser Art von Biologie Erfahrung haben. Denn im Gegensatz zu Marty bin ich mit keinem Modellorganismus verheiratet. Es war mir nie möglich, in diesem Sinne „sesshaft“ zu werden. Schließlich muss der gesamte Prozess wiederholt werden, wenn wir feststellen, was bei unseren vorhandenen Molekülen falsch ist und was wir am dringendsten verbessern müssen. Tatsächlich begann ich mit interzellularem Kalzium als meinem ersten biologischen Zielobjekt. Eigentlich war es mein zweites, aber das erste war so kompliziert, dass ich es aufgab: Es ging dabei um das Membranpotenzial. Ich werde kurz erläutern, warum Kalzium wichtig war, doch ich glaube Erwin Neher hat dieses Thema bereits eingeführt: dass Fluktuationen des freien Kalziums für die Muskelkontraktion unerlässlich sind, für die neuronale Kommunikation, die an den Synapsen erfolgt, oder besonders – was er besprochen hat – für die Befruchtung von Eizellen, bei der es sich um eine andere Form von Sekretion handelt: um die Aktivierung von Enzymen. Ich glaube, er hat erwähnt, wie schnell und lokal begrenzt diese Signale sein können, und dass die Kalziumwerte, um die es hierbei geht, sehr niedrig sind, [sie liegen] etwa im Bereich von 10 hoch -8 bis 10 hoch -6 mol im Ruhezustand, und dass sie am allerhöchsten Punkt, lokal sehr begrenzt, bis auf 10 hoch -5 oder 10 hoch -4 mol ansteigen können. Doch hierbei handelt es sich um einen winzigen Bruchteil des Kalziums, das man misst, wenn man traditionelle analytische Chemie betreibt, bei der es wie immer darum geht, jede Menge Zellen zur zerkleinern und zu verbrennen und dann zu messen, wie viel Kalzium sie insgesamt enthalten, wobei man Zahlen erhält, die viel größer sind als 10 hoch -3 mol. Jegliche Beschädigung der Zellmembran hat zur Folge, dass eine Flut von Kalzium ins Innere der Zelle strömt, und diese Werte betragen in unserem Inneren etwa 10 hoch -3 mol und bei Meereslebewesen etwa 10 hoch -2 mol. Auch dies sind wieder große Zahlen im Vergleich mit denjenigen, die man messen [können] möchte. Und schließlich gibt es noch eine riesige Menge von Magnesium, in dessen Gegenwart man arbeiten muss. Der früher verwendete Kalzium-Indikator Aequorin war einer der besten, und das dank der Arbeit von Professor Shimomura. Doch seither wurden verschiedene synthetische Farbstoffe hergestellt, von denen alle gewisse Nachteile haben, besonders wenn es darum geht, Einzelzellen zu betrachten. Anfänglich bestand meine Arbeit in dem Versuch, etwas Neues zu finden. Ich entschied, das wichtigste Problem sei die Selektivität zwischen Kalzium und Magnesium. Statt mir sofort darüber Sorgen zu machen, ein wie guter Farbstoff es war, wollte ich einfach diese Selektivität. Ich dachte mir, ich könnte das Problem mit dem Farbstoffelement später lösen. Ich begann also mit einem Chelator namens EGTA, der der einzige damals üblicherweise verwendete Chelator war, dessen Selektivität für Kalzium, den Erfordernissen entsprechend, fünfmal so hoch war wir für Magnesium. Doch Sie sehen hier, dass dieses Molekül über keinen Chomophor (= Farbträger) verfügt. Es absorbiert noch nicht einmal größere Mengen von ultraviolettem Licht, geschweige denn von sichtbarem Licht. Wie soll man es also dazu bringen, dass es uns irgendetwas anzeigt? Nun, man muss offensichtlich einen Chomophor hinzufügen. Der einfachste Chomophor, der chemisch stabil ist, ist ein Benzolring. Wie könnte man also einen Benzolring in das Molekül integrieren? Nun, eine direkte Möglichkeit besteht darin, einen Benzolring hier unten anzubringen. Indem man diese einzelne Bindung in der Äthylendioxy-Einheit ersetzt. Ich dachte darüber nach und erkannte, dass dies schwierig herzustellen sein würde. Doch dann gab es noch eine andere Alternative, und zwar, dass man den Benzolring auf dieser Seite anbringt. Und aus Symmetriegründen wäre es besser, dies auf beiden Seiten zu tun. Dieses Molekül wird den großen Vorteil haben, dass – wenn sich Calcium jetzt hier bindet – das wusste ich aus CPK-Modellen, bevor es Computer gab. Ich habe das Modell tatsächlich gebaut und versucht, Kalzium hier zu binden und [dabei] erkannt, dass die Stickstoff-Kalzium-Bindung sich nach der Komplexion mit Kalzium drehen müsste. Und durch diese Drehung der Stickstoff-Kalzium-Bindung würde der Stickstoff vom Rest des Benzolrings entfernt und eine spektroskopische Veränderung bewirken. Außerdem würde das Vorhandensein des Benzolrings den Wert der Säurekonstante des Stickstoffs senken, so dass er nicht so leicht protonieren würde, und dies würde den Kalzium-Indikator pH-unempfindlich machen. Dies ist das Molekül, das ich mich entschied herzustellen. Glücklicherweise kostete es mich nur etwa einen Monat, dies zu tun. Heute würde dies ein guter synthetischer Chemiker natürlich in etwa 6 Stunden schaffen können. Er würde es sich anschauen und wissen, wie er es synthetisiert, doch ich war wirklich kein sehr guter Chemiker. Dennoch bin ich froh, dass es mich nicht mehr als einen Monat Zeit kostete, denn ich befand mich bereits in der Endphase meiner Doktorarbeit und hatte im Prinzip bereits drei andere Projekte in den Sand gesetzt. Dies war mein letzter verzweifelter Versuch, ein Ergebnis zu erhalten, das mir einen Weg in die Zukunft bahnen würde. Und glücklicherweise dauerte es nicht so lange. Innerhalb eines Monats hatte ich den Beweis dafür, dass ich dies herstellen konnte, und es hatte tatsächlich die Eigenschaften einer sehr hohen Selektivität zwischen Kalzium und Magnesium. Eine große Änderung im UV-Spektrum, eine schnelle Reaktionskinetik und keine ph-Abhängigkeit. Genau wie entworfen. Es war ein äußerst schlechter Chromophor, denn es war nur ein Benzolring. Doch das hatte ich erwartet, weil es Teil des Prinzips war. Und dann dauerte es noch weitere acht Jahre, fürchte ich, um es durch viele Entwicklungen in Fura-2 zu verwandeln. Ich glaube, dies ist eines der Moleküle, auf die Erwin Neher angespielt hat, wo wir nun offensichtlich den Chromophor stark erweitert haben. Dieses Molekül hat nun eine nützliche grüne Fluoreszenz. Dann tauchte jedoch das Problem auf, wie man dies in eine Zelle bekommen sollte, mit all diesen negativen Ladungen. Dies ist erneut Fura-2. Es hat fünf negative Ladungen, doch vier von ihnen sind unerlässlich dafür, Kalzium hier oben zu binden. Eine von ihnen ist hier unten: teils aufgrund der Praktikabilität der Synthese und teils auch aus dem Grund, kein Reinigungsmittel zu erhalten. Wenn dies nicht-polar wäre, könnte diese gesamte Zone des Moleküls relativ fettig sein, und das könnte ein Reinigungsmittel ergeben. Durch diese negative Ladung hier haben wir die hydrophobe Eigenschaft verhindert. Doch mit all diesen negativen Ladungen bewegt sich das Molekül nicht durch das Plasma, und es durchdringt so nur schwer die Zellmembran. Auch ich beschäftigte mich obsessiv mit dem Problem, auf das Marty angespielt hatte: dass wir an lebenden Zellen arbeiten wollen. Wir wollen Zellen nicht töten und fixieren müssen und sie nicht für alles durchlässig machen. Wir wollen mit lebenden Zellen arbeiten. Und die traditionelle Antwort bestand darin, dieses Material in mikroskopischem Maßstab in die Zellen zu injizieren. Schließlich wurde dies durch die Erfindung der Patch-Clamp-Methode durch Professor Neher viel einfacher. Damals stand sie jedoch noch nicht zur Verfügung, und Mikroinjektionen machten mir wirklich sehr große Mühe. Dazu fehlte mir sowohl die Geduld als auch die manuelle Geschicklichkeit. Hier ist also ein Beispiel der Kompensation für meine Neurose. Ich musste eine chemische Lösung entwickeln, und die bestand darin, das zu finden, was man in der organischen Chemie als „Schutzgruppe“ bezeichnet, wodurch ein Ester entsteht, der hydrophob ist. Er blockiert sämtliche negativen Ladungen. Es gibt allerdings jede Menge dieser hydrophoben, dieser Estergruppen. Doch der Schlüssel ist, dass dieser Acetoxymethylester ein Ester ist, dessen Schutzfunktion durch das Zytosol selbst aufgehoben werden kann. Mit anderen Worten: Unsere Zellen enthalten Enzyme, die diese Verbindung aufbrechen, so dass mithilfe dieses Enzyms spontan wieder das [ursprüngliche] Molekül mit all seinen negativen Ladungen entsteht. Und einfach durch die Herstellung dieses Esters und dadurch, dass wir ihn auf die Außenseite von Zellen brachten, Und siehe da: Wir haben eine chemische Lösung, die die Mikroinjektion überflüssig macht. Wenn es anschließend zu einer Bindung mit Kalzium kommt, dreht sie die Stickstoff-Kohlenstoff-Bindung, wie ich hier etwas vereinfacht darzustellen versucht habe, und dadurch wird das Spektrum verschoben. Ich möchte Ihnen ein einfaches Beispiel zeigen. Ich wähle nicht das schöne Beispiel der Neuronen, das vielleicht schon gezeigt worden ist. Dies ist der Beginn des Lebens eines Seeigeleies. Das ist irgendwie sehr hübsch. Hier ist ein Seeigelei, in das man soeben den Farbstoff gebracht hat. Spermien wurden soeben in die Schale gegeben, doch die Spermien haben das Ei noch nicht gefunden. Dies ist also der Zeitpunkt, nachdem die Spermien in die Schale gegeben wurden. Doch nach 30 Sekunden hat es ein Spermium klarerweise geschafft, das Ei hier berührt und damit diese Welle hoher Kalziumkonzentration ausgelöst, die hier durch die warmen Farben symbolisiert wird. Und über die nächsten 8 Sekunden legt die Welle ein Viertel des Weges zurück. Nach 52 Sekunden hat die Welle die Mitte des Eies erreicht. Nach 68 Sekunden, weniger als 1 Minute nach unserem Start, ist das ganze Ei mit dieser hohen Kalziumkonzentration durchdrungen. Wir haben dafür diese helle rote Farbe ausgesucht, weil ich schöne Farben aussuchen wollte, und weil ich psychologisch Blau mit Ruhe und Rot mit Aktivität assoziiere. Das ist eine rein menschliche Entscheidung. Sie ist in der Literatur jetzt recht weit verbreitet, und ich glaube ich bin einer von denjenigen, die dafür verantwortlich sind. Dies gab meinem Kollegen Rick Steinhardt die Chance, dies die „Röte der Empfängnis“ (blush of conception) zu nennen. Später hat dann – weil eine dauerhafte hohe Kalziumkonzentration für Zellen giftig ist – diese Kalziumwelle viele Dinge ausgelöst, wie zum Beispiel alle folgenden Entwicklungsereignisse (zumindest der frühen Entwicklung) angestoßen, und zu einer Sekretion einer Schutzmembran um das Ei geführt, von einer Art „Keuschheitsgürtel“; denn nachdem das Ei von einem Spermium befruchtet wurde, will es definitiv nicht, dass weitere Spermien einbringen. Und so richtet es diese Barriere auf, um sich vor weiteren Vätern zu schützen. Und schließlich „kühlt“ sich die Zelle wieder zu einer niedrigen Kalziumkonzentration ab. Nun, das war alles gut und schön und es brachte meine Karriere eine Zeit lang voran, doch dann wollte ich über anorganische Ionen hinausgehen und das Problem ist, dass Kalzium sehr angenehm ist. Es ist rund. Aber der nächste wichtige Botenstoff ist zyklisches AMP. Der tatsächliche Prototyp des Konzepts eines internen Signalleitungsmoleküls, dessen Bedeutung durch Nobelpreise an Sutherland für die Entdeckung des Botenstoffs und an Krebs und Fischer für den Mechanismus, mit dem es die Zellfunktion aktiviert, anerkannt wurde. Doch für mich bestand das Problem darin, dass ich – als jemand, der in diesem Grenzgebiet von Chemie und Physiologie arbeitete, und weil Kalzium ein anorganisches Ion ist – dazu verurteilt war, im so genannten „Salz-und-Wasser“-Gulag in Berkeley zu arbeiten, da es eine große Neuorganisation der biologischen Wissenschaften geben sollte, und weil Leute, die lediglich über Salz und Wasser arbeiteten, ziemlich niedrige Bürger waren, verglichen mit denen, die über Molekularbiologie und Würmer und Proteine und dergleichen glorreiche Dinge forschten. Um mich also respektabel erscheinen zu lassen, wollte ich über dieses Molekül arbeiten, diesen berühmten Botenstoff. Doch auch in diesem Fall, ebenso wie vorher bei Kalzium, waren die vorhandenen Messmethoden für zyklisches AMP größtenteils destruktiv, und sie sind es bis heute. Leute zertrümmern heute immer noch Millionen von Zellen und kaufen einen Kit von Amersham oder so etwas, um Radio-Immunassays durchzuführen, nachdem alle Zellen tot sind. Daher lag die Reaktionsdynamik von interzellulärem zyklischem AMP im Dunklen. Es gibt noch ein weiteres Problem: dass alle diese Konzentrationen des Botenstoffs im mikromolaren Bereich liegen und dass sie in Gegenwart anderer Substanzen gemessen werden müssen, die wiederum von riesigen Mengen anderer Adeninnukleotide überschwemmt werden, wie zum Beispiel von AMP, der Vorstufe von zyklischem AMP. Es ist in Konzentrationen von vielleicht 5 Millimol vorhanden, während das zyklische AMP eine Konzentrationen von weniger als ein Mikromol hat. Wiederum haben wir das Problem einer sehr hohen Selektivität, und wiederum besteht die Lösung möglicherweise darin, den bereits vorhandenen AMP-Sensor eines anderen zu „entführen“, wozu es mehrere Möglichkeiten gibt. Doch dann müsste man sie mit Fluor-Trägerstoffen markieren, um die Konformationsänderung des zyklischen AMP zu erkennen. Schließlich fasste ich den Plan, diese AMP-abhängige Proteinkinase zu entführen, wofür insbesondere Krebs seinen Preis bekommen hatte. Sie besteht aus zwei regulierenden Untereinheiten, zwei katalytischen Untereinheiten. Und wenn sich zyklisches AMP an die regulierende Untereinheit bindet – das zyklische AMP ist durch die gelben Kreise dargestellt Sie „schmeißt“ die katalytische Untereinheit „heraus“, die dadurch zur Phosphorylierung freigesetzt wird. Doch hierbei spaltet sie die Proteinuntereinheit auf. Und dann erkannte ich, dass wir den als „Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer“ (FRET) bezeichneten Trick verwenden konnten, um diesen Vorgang in situ zu beobachten, in einer lebenden Zelle, wenn es uns nur gelänge, zum Beispiel Fluoreszin an der katalytischen Untereinheit anzubringen, Rhodamin an der regulierenden Untereinheit. In diesem Komplex würden wir einen Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer erhalten, da das Fluoreszin und das Rhodamin sich nahe beieinander befinden würden, ebenso wie bei Aequorin und GFP, wenn sie sich nahe genug beieinander befinden, das blaue Licht von Aequorin, seine Energie, auf das GFP übertragen wird, das dann grün leuchtet. Hier ist es ein Rot-Grün-Beispiel, doch dasselbe Prinzip findet Anwendung. Andererseits würden Sie dort einen Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer erhalten: blaues Licht an Fluoreszin. Statt grünes Licht herauszubekommen, bekäme man dann rotes Licht, und wenn zyklisches AMP die Untereinheiten spaltet, würde das auf Fluoreszin übertragene blaue Licht einfach grünes Licht ergeben, weil das Rhodamin sich nicht nahe genug befinden würde. Wir bekamen das hin, und ich werde mir nicht die Zeit nehmen, Ihnen alle Beispiele zu zeigen. Doch es erforderte, dass wir diese Untereinheiten aus E. coli exprimierten und reinigten. Ich musste sogar nach San Diego umziehen, um mit Susan Tailor zusammenarbeiten zu können, der das gelungen war. Es dauerte ein ganzes Jahr, in dem meine Leute neben ihren Leuten saßen und von ihr lernten, wie man dem Enzym umgehen musste, um herauszufinden, wie es möglich sein würde, die Markierung mit Rhodamin und Fluoreszin vorzunehmen, ohne die Funktion des Proteins zu zerstören, und es wieder zusammenzusetzen und mit der Mikroinjektionsmethode in lebende Zellen zu bringen. Und ich habe Ihnen ja immer wieder gesagt, dass ich die Mikroinjektionsmethode hasste, und ich hasse sie noch immer. Doch immerhin hatte ich mittlerweile eine Professur und ich konnte meinen Studenten sagen: Ich komme damit nicht zurecht. Aber Ihr, lernt ihr sie“. Doch dies war offensichtlich noch eine sehr umständliche Methode, die für andere Proteine nur schwer zu verallgemeinern sein würde. Daher suchten wir nach einer allgemeinen Methode, mit der man genetisch festgelegte Proteine mit lebhaften Farben fluoreszierende markieren konnte, denn ich brauchte ein Äquivalent von Fluoreszin und Rhodamin. Das ist der andere Grund, der wissenschaftliche Grund – unabhängig davon, dass ich von schönen Farben besessen war –, warum wir nach der Entdeckung von GFP sofort seine Farbe ändern mussten. Und dies ist also nun meine Interpretation von Douglas Prasher. Ich war hoch erfreut. Ich hatte noch nicht von Paul Brehm gehört, aber ich kannte Aequorin und wusste aus den Arbeiten von Professor Shimomura, dass es da diese üble kleine Komponente gab, das sogenannte grün fluoreszierende Protein, das man los werden musste. Und dann erkannte ich, dass GFP – wenn man es geklont hätte – nützlich sein würde. Ich sucht hiernach in Medline und hatte Glück: Dies war einen Monat später, zufällig war es einen Monat, nachdem Prasher und Eckenrode ihren Aufsatz veröffentlicht hatten. Dies ist eine Kopie des Aufsatzes. Dies ist nebenbei bemerkt wirklich ein Beweis für die Bedeutung von Grundlagenforschung und die Blindheit einiger der Leute, die Forschungsgelder bereitstellen. Douglas hatte versucht, das Geld vom NIH (National Institutes of Health) zu bekommen. Sein Antrag wurde abgelehnt. Die National Science Foundation, die sich eher für Meeresorganismen einsetzen würde, lehnte seinen Antrag ebenfalls ab. Ausgerechnet die amerikanische Krebsgesellschaft, die tatsächlich eher translationale Forschungen fördert, hatte den Mut, ihm ein kleines Stipendium zu geben, mit dem er den ersten Teil seiner Arbeit finanzieren konnte. Doch der arme Douglas blieb in der Anfangsphase seiner Arbeit ohne Erfolg, und es gelang ihm nicht, einen umfassenden Forschungsbeitrag über seine Arbeit an E. coli zu veröffentlichen, was schließlich dazu führte, dass er der Wissenschaft den Rücken kehrte. Dennoch kennen Sie den Rest, glaube ich, aus Martys wunderschöner Geschichte: dass auch Marty das Gen fand und dass Marty die erste war, der zeigte, dass es in E. coli und Würmern von sich aus exprimiert wird. Doch lassen Sie mich nun noch auf meinen Teil der Geschichte zurückkommen, dass nämlich das GFP des wilden Typs trotz seiner inhärenten Vorzüge einige echte Probleme aufwies. Sein hauptsächliches Anregungsmaximum lag im Ultraviolettbereich. Es hatte nur eine geringe Anregung im gewünschten blauen Lichtwellenbereich, und niemand verwendet gerne UV Licht, wenn es nicht sein muss. Ein breites Anregungsspektrum reichte bereits aus zu verhindern, dass es als FRET-Akzeptor von Nutzen sein könnte. Wir mussten dies also beheben, ebenso wie seine Falteffizienz, seine Codon-Verwendung und seine langsame Formation. Dies ist das Anregungsspektrum des Wildtyps von GFP, angegeben durch die gestrichelte Linie. Hier ist die große UV-Spitze und der kleine sichtbare Scheitelwert. Und ich stellte diese merkwürdige Hypothese auf, ich meine, ich musste chemisch spekulieren, was hier vor sich geht. Ich dachte, dass vielleicht dieser Farbträger, wie er hier gezeichnet ist, dass dies die Shimomura-Struktur ist, die er bereits vor dem Klonen für den Chromophor vorschlug. Ich dachte, dass diese Struktur vielleicht für diese große Spitze verantwortlich ist und dass vielleicht eine kleine Fraktur diese Bindung hier dehydriert, eine zusätzliche Doppelbindung schafft, eine Art Dehydroalanin-Einheit. Diese zusätzliche Doppelbindung könnte die Konjugation verlängern und für diese kleine Spitze hier verantwortlich sein. Und in diesem Fall würde unsere Aufgabe darin bestehen, die Dehydation von Serin zu fördern, oder von dem, was davon übrig ist. Es gibt eine einfache Möglichkeit, diese Hypothese zu testen. Ich fragte Roger Heim, der der Postdoktorand war, der sich mit der Molekularbiologie auskannte, und änderte dies: von einem Serin zu einem Alanin. Bei einem Alanin haben wir jetzt kein OH mehr, und darauf ließ sich keine Eliminierung anwenden. Das hätte also das Spektrum völlig über diesen Spitzenwert hinaustreiben sollen. Heim tat dies: Er stellte S65A her, und er bewies, dass ich zu 100 % Unrecht hatte. Es geschah das gerade Gegenteil. Statt diese Spitze zu verstärken, verschwand sie, und das Einzige, was übrig blieb, war die längere Spitze. Nun gut, ok. Die Natur sagt einem: dumm, dumm. Fang von vorne an. Wir wiederholten den Versuch dann mit anderen Aminosäuren, wie zum Beispiel Cystein, mit einem SH hier. Das sollte leichter eliminiert werden als Wasserstoffsulfid. Ok, auch hierdurch wurde diese Spitze erwartungsgemäß verstärkt. Und dann gingen wir weiter zu Threonin, das lediglich hier eine Methylgruppe hinzufügt. Das sollte problemlos eliminiert werden. Doch wenn überhaupt, dann beseitigt es dies. Es beseitigte auch diese Spitze. So traf es sich, dass es etwa 10 Nanometer nach Rot verschoben war, und Threonin ist das, was jeder Molekularbiologe für den passendsten Ersatz für Serin hält, den konservativsten. Aus diesem psychologischen Grund übernahmen wir als passendste Mutation für die künftige Verwendung Serin 65 statt Threonin, denn es war jetzt sechsmal heller, und wir waren diese Spitze losgeworden, und es war für FRET nicht geeignet usw. Außerdem machte es die Expression etwas einfacher usw. Das war alles gut und schön. All dies wurde ohne die Unterstützung einer dreidimensionalen Modellstruktur durchgeführt, und wir wollten über eine verfügen. Als Jim Remington zu mir kam und fragte: Aber wir wissen, dass fünf andere Arbeitsgruppen mit uns konkurrieren. Sie versuchen ebenfalls, die Kristallstruktur zu finden.“ Das ist ein Pferderennen. Ich hasse diese Wettläufe, und Sie sehen, dass dies ein ständig wiederkehrendes Thema für mich ist. Wie kommen wir aus dem Pferderennen heraus, und bleiben trotzdem irgendwie drin? Daran arbeitet niemand. So haben wir es für uns. Und selbst wenn uns jemand mit dem wilden Typ zuvorkommt, können wir immer noch etwas veröffentlichen. Und wir werden es publizieren, weil es interessant sein wird. Wie konnte es sein, dass ein zusätzliches Kohlenstoffatom und ein Methylen, was sich beim Austausch einer Aminosäure von Serin durch Threonin ergibt, das Spektrum so sehr verbessern?“ Nun, es traf sich, dass Mats Ormo einer der ersten, wenn nicht sogar der erste war, der Kristalle erhielt und die Struktur aufklärte. Das enthüllte dieses berühmte 11-strängige Beta-Fass, in dessen Inneren der Chromophor verborgen ist. Die Tatsache, dass der Chromophor so gut verborgen ist, erklärt irgendwie, warum keine anderen Enzyme involviert sein konnten: weil ein anderes Enzym jemals da herankäme. Wir waren also sehr zufrieden mit uns. Wir erstellten sogar eine gelbe Version durch rationale Mutagenesis, semi-rationale Mutagenesis, basierend auf der Kristallstruktur. Und dann versuchten wir die Sache in Science zu veröffentlichen und hatten auch dabei unsere Probleme. Der erste Gutachter sagte, es sei eine kompetente Kristallstruktur, ein uninteressantes Protein, nun ja, nicht interessant genug, um in Science veröffentlicht werden zu können. Der zweite Gutachter meinte: sehr interessantes Protein. Aber dieser Aufsatz über die Röntgenstruktur und die Mutagenesis gibt keine Antwort auf die wesentliche Frage zu GFP, die lautet: Worin besteht seine Funktion für die Qualle? Was? Wie zum Teufel soll einem eine Kristallstruktur jemals erklären, welche ökologische Funktion sie in ihrer ursprünglichen Umgebung hat? Das ist die falsche Art von Fragestellung. Doch bei zwei negativen Beurteilungen konnten sie den Aufsatz offensichtlich nicht annehmen. Ich legte dagegen Widerspruch ein, und dass Einzige, was der Herausgeber tun konnte, bei dem Versuch, freundlich zu sein, war: mir zu sagen, dass er ihn einem dritten Gutachter schicken werde. Und der Aufsatz wurde an ihn verschickt und der dritte Gutachter schickte nie eine Antwort, schickte nie eine Antwort, schickte nie eine Antwort. Monate vergingen. Dann erschien schließlich im Internet ein Kommentar einer jungen Dame namens Fan Yang aus dem Labor von George Phillips, die sagte: Wir haben soeben die Kristallstruktur von GFP gesehen, sie wir nächsten Monat in Nature Biotechnology veröffentlicht.“ Wir nahmen also einfach diesen Kommentar und schickten ihn am nächsten Tag per Email an Science. Am nächsten Tag wurde unser Aufsatz angenommen, ohne das Urteil des dritten Gutachters abzuwarten. Aus dieser Geschichte lässt sich einiges lernen. Ich muss sagen, dass das Internet eine tolle Sache ist, aber seien Sie mit dem, was Sie dort veröffentlichen, vorsichtig. Wissen Sie, wenn dieser Kommentar nicht erschienen wäre, würden wir irgendwo im Staub versunken sein. Schließlich gelang es uns also FRET-Indikatoren aus allen möglichen biochemischen Prozessen wie etwa Proteasen zu machen. Letztendlich gelang uns die Sache mit zyklischem AMP, obwohl das eines der schwerer zu lösenden Probleme war: Kalzium- und Phosphorylierungs-Indikatoren, die Proteinphosphorylierung zu messen und Kinasen und so weiter. Damit gingen viele Träume von mir in Erfüllung. Eine Sache ärgerte mich jedoch: Es gelang uns nie ein waschechtes Rot zu erhalten. Als Kind war das immer meine Lieblingsfarbe gewesen: leuchtendes Rot. Es ist uns nie gelungen, GFP rot werden zu lassen. Daher waren wir etwas erstaunt und ein wenig neidisch, als eine russische Arbeitsgruppe zeigte, dass die nicht-biolumineszenten Korallen tatsächlich rot fluoreszierende Proteine produzieren. Dies kam also aus dem linken Feld. Wir haben es nicht gefunden. Noch so eine Sache, von der ich wünsche, sie wäre mir gelungen. Doch was der Gruppe nicht gelang, war die Struktur des Chromophors zu enträtseln. Sie hatten lediglich eine DNA-Sequenz. Sie erklärte nicht, warum dieses Gen, das zu GFP homolog ist, rot statt grün leuchtet. Wir freuten uns darüber, dass wir dieser Erklärung beisteuern konnten, denn sie machten uns das Gen zugänglich. Glücklicherweise kauften wir eine Kopie des Gens und stellten es in Bakterien her. Und durch eine Kombination von Massenspektroskopie und Chromopeptidanalyse und einiger chemischer Tests usw. erkannten wir, dass der Chromophor von GFP dieses Hydroxybenzyliden-Imidazolinon ist, das hier aber seine Konjugation nicht fortsetzt, und dass das Problem, welches das rote Protein gelöst hat, dieses ist: diese Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung zu dehydrogenieren und um zwei Einheiten zu erweitern. Auf diese Weise erhält man eine größere Wellenlänge. Dies ist ein berühmtes Foto über den Stand unserer Forschung im Jahr 2004. Es zeigt eine große Vielzahl von Farben. In den letzten paar Minuten möchte ich Ihnen erläutern, dass fluoreszierende Proteine, so gut sie auch sind, einige größere Einschränkungen mit sich bringen. Manchmal sind sie einfach zu groß, und es gibt Situationen, in denen Ihr Lieblingsprotein durch die Bindung an GFP – leider – zerstört wird. Die Anregungswellenlängen von 600 – bislang wurden 600 Nanometer noch nicht überschritten – dringen nicht tief genug durch relativ opake Organismen wie Mäuse. Und wir selbst sind noch größer und noch opaker, und dafür benötigen wir Bildgebungsverfahren wie Magnetresonanz. Und schließlich liegt der große Vorzug von GFP und aller dieser fluoreszierenden Proteine darin, dass sie genetisch übertragbar sind. Doch das ist ihre Achilles-Ferse, wenn es um die Anwendung auf den Menschen geht, wo Gentherapie sowohl technisch kompliziert ist als auch einige ethische Probleme aufwirft. Um beide diese Fragen zu beantworten: Eines der Gebiete, auf denen wir gearbeitet haben, sind infrarote fluoreszierende Proteine, und dabei mussten wir uns von dem ursprünglichen 11-strängigen Beta-Fass völlig entfernen und uns einer völlig neuen Familie von Proteinen zuwenden, die aus der Reihe der Pflanzenfarbstoffe stammten. Sie verwenden Biliverdin, einen tetrapyrol-ähnlichen Farbträger. Tetrapyrol wurde ein wenig in Professor Shimomuras Vortrag eingeführt, als eine der lumineszenten Luziferasen, doch ein anderes Tetrapyrol, dass Sie und ich bereits jeden Tag in großer Menge herstellen, trägt den Namen Biliverdin. Dies ist das erste Zerfallsprodukt von Häm. Jeder von Ihnen produziert täglich etwa ein Viertelgramm Biliverdin. Es kann in ein Protein integriert werden, das es fluoreszent macht, das ein kovalentes Atom ergibt, das fluoreszent ist. Und mit diesen größeren Wellenlängen können wir sehr viel leichter in eine lebende Maus schauen. Dies ist die Leber einer lebenden Maus, die mit einem Adenovirus transfiziert wurde. Während frühere fluoreszierende Proteine sehr viel schwacher leuchteten, kaum sichtbar waren, war GFP in diesem Kontext ziemlich nutzlos, da die Leber – wie sie wissen – so dunkelrot ist. Doch schließlich habe ich mich von fluoreszenten und genetisch codierten Proteinen für die Nutzung in klinischen Anwendungen völlig distanziert und mich zu meinen Wurzeln in der synthetischen Chemie zurückbegeben. Unser Ziel waren diese Proteasen, wie zum Beispiel Matrixmetalloproteinase 2 und 9, die für ihren Zusammenhang mit der Metastasierung von Tumoren so bekannt sind, dass wir einfach ein Cartoon von einer kommerziellen Webseite stehlen konnten. Es ist also äußerst wertvoll, die Aktivität dieser Protease sehen zu können. Das molekulare Schema, nach dem wir hierbei Verfahren, ist jetzt recht verschieden. Statt FRET verwenden wir heute etwas, das als „in Zellen eindringendes Peptid“ (cell penetrating peptide) bezeichnet wird. Dabei handelt es sich um ein Peptid mit mehreren Kationen, das über eine Reihe positiver Ladungen verfügt, etwa zwischen sechs und zehn positive Ladungen. Wird dies mit einer Nutzlast verbunden, die normalerweise nicht in der Lage wäre, in die Zelle einzudringen, dann heftete sich diese Kombination durch elektrostatische Anziehung zwischen den positiven Ladungen und den negativen Ladungen auf der Außenseite der Zelle an die Zellwand. Daraufhin gelangen einige von ihnen durch Endozytose in innere Zellorganellen, und von dort gelangen einige möglicherweise in den zytosolaren Kern. Es gibt allerdings einige Hinweise darauf, dass in Zellen eindringende Peptide den endosomalen Vorgang vielleicht auch überspringen können. Doch dies, wie ich es Ihnen soeben beschrieben habe, ist ein sehr unspezifischer Vorgang in Zellen, und um ihn selektiv zu machen und dadurch nutzbar im Inneren von lebenden Organismen, müssen wir einen Weg finden, wie man ihn unterbinden kann. Unsere Methode besteht hier darin, eine Reihe negativer Ladungen einzubinden, die entsprechende, aber entgegengesetzte Ladung, und dieses Mehrfachanion hält das Mehrfachkation neutralisiert und beschäftigt, und es kann sich daher nicht mehr an die Zellwand anheften, solange diese beiden durch eine spaltbare Verbindung kovalent zusammengehalten werden. Ich habe gesagt, dass es sich um eine spaltbare Verbindung handelt, weil wir in der Lage sein wollen, die beiden zu trennen, und wenn diese durch etwas wie zum Beispiel MMP2 oder MMP9, worüber der Tumor verfügt und wovon ein normales Gewebe nicht viel hat, getrennt werden, dann wird dadurch das Mehrfachkation lokal von seiner hemmenden Beschränkung befreit. Dann kann das Mehrfachkation tun, was es normalerweise tut, wenn es am Ort der Enzymaktivität lokal injiziert worden wäre. Beachten Sie, dass es sich hierbei um einen verstärkenden Mechanismus handelt, denn ein Enzym kann zahlreiche Moleküle spalten und damit das Eindringen oder zumindest das Anheften einer großen Zahl von Nutzlastmolekülen auslösen. Hier ist ein kleines Beispiel dafür, wie dies in diesen künstlichen Tumoren funktioniert, die sich in einem Fremdtransplantat befinden. Dies ist das Peptid. Die saure Domäne ist rot dargestellt, die Kleinbuchstaben zeigen eine d-Aminosäure an, die Großbuchstaben, in diesem Fall PLGLAG, sind ein gutes Substrat von MMP2 und 9. In Kleinbuchstaben sind Arginine angegeben. Dies sind d-Aminosäuren und der rote Farbstoff, Cy5, dunkel rot, so dass er Fleisch durchdringen kann. Er ist fluoreszent, befindet sich dort, und dies wurde systematisch in das Tier injiziert, und dennoch bewegt es sich zum Tumor oder wird darin zurückgehalten, während die normalen Gewebe dieses Material nicht festhalten, so dass der Tumor aufleuchtet. Wenn man ein Kontrollpeptid verwendet, bei dem man einfach die Stereochemie der vier Aminosäuren umkehrt, PLL und A, jetzt sind es d-Aminosäuren, dann erkennt es das Enzym nicht, obwohl es sich bei der Hydrophobie um dasselbe Molekulargewicht handelt. Und dann leuchtet der Tumor mit unserem Farbstoff nicht auf. Dieser Tumor wurde zufällig mit GFP markiert. Es ist zu dumm, dass die Tumore des Menschen nicht bereits GFP enthalten. Abschließend möchte ich Ihnen noch ein Beispiel dafür zeigen, wie dies die Arbeit von Chirurgen unterstützen kann. Ich habe hier einen kleinen Film, und ich hoffe, dass die Beleuchtung genug gedimmt werden kann, um ihn zeigen zu können. Könnte mir hier jemand helfen, bitte? Und was Sie sehen werden, ist diese normale Ansicht und dann die fluoreszierende Ansicht. Dies ist eine Überlagerung, bei der die fluoreszierende Ansicht auf die normale Ansicht gelegt wurde. Und bei der Fluoreszenz, die in Wirklichkeit tiefrot ist, handelt es sich um ein falsches Grün. Nun, dieses Grün stammt nicht von GFP. Darauf muss ich immer hinweisen. Journalisten, die von Naturwissenschaft keine Ahnung haben, schauen sich dies an und sagen: Dies ist eine falsche Färbung. Wir haben nur deshalb grün gewählt, weil es normalerweise nichts Grünes in einer Maus gibt, ok? Dies ist also ein Overlay, das die Fluoreszenz deutlich vom Rest unterscheidet. Und wir bewegen es also ein wenig umher, damit sie sehen können, dass dies ein lebender Organismus ist. Und gleich sehen sie eine andere Ansicht. Dies ist der Tumor, und dies hilft den Chirurgen genauer zu schneiden. In einer der Ansichten können Sie [die Grenze zwischen dem Tumor und dem gesunden Gewebe] nicht erkennen. Sie sehen nur rötliches Fleisch. Doch mit dem grünen Overlay wird es sehr einfach, den Tumor herauszuschneiden. Alles Grün soll beseitigt werden. Es gibt etwas, das der Chirurg nicht schneiden darf, und das ist der Nerv. Ich hatte den Film hier an, denn wir haben ein anderes Peptid, das den Nerv markiert. Hier ist eine Fluoreszenz, die wir als hellblau codiert haben. Nicht weil sie wirklich hellblau ist, sondern wiederum, weil hellblau eine Farbe ist, die im Fleisch normalerweise nicht existiert. Und dieser besondere Ast, der hier herauskommt, ist einer, der ansonsten unsichtbar gewesen wäre. Der Rest ist ganz offensichtlich und wahrscheinlich hätte jeder sehen können, dass sich dort ein Nerv befindet, oder dieser Ast aus weißem Fleisch. Aber dieser verborgene Ast wäre ansonsten nicht so deutlich gewesen. Wie ich bereits gezeigt habe, befindet sich hier die Fluoreszenz. Doch wenn ich den Film anhalte, können Sie erneut erkennen, dass der Nerv sehr sichtbar ist, dieser zusätzlich fluoreszierende Ast jedoch nicht, es sei denn mit der Hilfe dieser molekularen Einfärbung im lebenden Organismus. Die Aufgabe des Chirurgen besteht hier darin, das grüne Zeug herauszuschneiden, ohne das blaue Material zu beschädigen. Wir sind der Ansicht, dass dies eines Tages der Weg sein wird, auf dem das Verständnis all dieser Moleküle und Proteasen usw. Chirurgen helfen werden, Tumorresektionen exakter vorzunehmen. Wenn sie gelingt, ist die Resektion noch immer die schnellste und billigste Methode eine vollständige Heilung zu erzielen. Ok, wir können tatsächlich die Überlebensrate im Vergleich zur traditionellen Chirurgie verbessern, wenn wir uns bei Operationen von Fluoreszenz leiten lassen. Dies ist die Zeit in Wochen nach der Operation eines sehr aggressiven Tumors, bei dem normalerweise nur eins von zwölf Tieren überlebt. Wir konnten die Überlebensrate auf fast fünf oder sechs von 12 anheben. Wir sind der Ansicht, dass dies eines Tages möglicherweise eine Form der auf individuelle Personen zugeschnittenen Medizin sein wird, bei der die Bildgebung die Therapie leitet. Ganz zum Schluss möchte ich noch etwas über die Lehren für junge Wissenschaftler sagen. Ich hoffe, ich habe Ihnen meinen Eindruck wiedergegeben, der darin besteht, dass man versuchen sollte, diese Probleme zu finden, doch auch, seine eigene Neurose konstruktiv einzusetzen. Versuchen Sie Projekte zu finden, bei denen Sie eine elementare Freude erleben. In meinem Fall war es die Liebe zu schönen Farben. Akzeptieren Sie, dass längst nicht jeder Schuss ein Treffer sein wird, hoffentlich jedoch nicht alle das Ziel verfehlen werden; dass Ihre besten Aufsätze von den begehrten Fachzeitschriften vielleicht abgelehnt werden, oder dass sie – wenn sie schließlich angenommen werden – aus den falschen Gründen angenommen werden. Bei Vorschlägen für Forschungsvorhaben verhält sich die Sache genauso oder ist vielleicht sogar noch schlimmer. Lernen Sie, wenn man Ihnen Zitronen gibt, Limonade daraus zu machen! Häufig wird sich herausstellen, dass Sie sich vollständig geirrt haben. Doch geben Sie nicht auf. Lassen Sie sich von der Natur belehren. Manchmal zahlt sich Beharrlichkeit aus. Ich möchte wirklich betonen, dass Preise letztlich eine Glückssache sind. Lassen Sie sich davon nicht motivieren oder beeindrucken. Ich bin am 9. Oktober nicht intelligenter, als ich es am 7. Oktober war, obwohl ich am 9. Oktober sehr viel berühmte bin, usw. Natürlich müssen wir die richtigen Mitarbeiter finden und sie zum gegenseitigen Nutzen freundlich ausbeuten, damit, wissen Sie, jeder froh ist und davon profitiert. Dies sind meine Mitarbeiter. Ich muss wirklich betonen, dass viele erfahrene Wissenschaftler aufstehen und zugeben: Sie wurde von den Leuten in meinem Labor gemacht.“ Und das trifft nicht nur in meinem Fall zu. Ich hätte die Arbeit noch nicht einmal tun können, da ich in den Techniken der Molekularbiologie persönlich inkompetent bin. Ich muss zugeben, dass ich nie gelernt habe, eine Gel- oder PCR-Reaktion durchzuführen. Ich habe bis heute keine einzige durchgeführt. Ich hänge also tatsächlich von schlauen Leuten ab, die bereit sind, all dies zu tun. Wenn ich Spaß habe, versuche ich zurück ins Labor zu gehen und einige Farbstoffe herzustellen. Das ist in etwa das Einzige, womit ich mich auskenne, und selbst das gelingt mir nicht sehr gut. Nur zwischen Weihnachten und Neujahr, wenn die Flut der E-Mails zurückgeht, finde ich Zeit, dies zu tun. Und im Grunde findet in meinem Labor eine Art Rotation statt. Im Allgemeinen bin ich der Meinung, dass ich, wenn ich mich selbst einstellen müsste, dies nicht tun würde. Ich bin so schlecht darin. Dennoch hatten wir einigen Spaß und nahmen schöne Bilder auf, wie diesen Sonnenuntergang zum Beispiel, mit grünem Licht, das von den Bakterien stammt, die all die verschiedenen Farben hervorbringen. Vielen Dank.

Roger Tsien (2009)

Building and Breeding Molecules to Spy on Cells, Tumors, and Organisms

Roger Tsien (2009)

Building and Breeding Molecules to Spy on Cells, Tumors, and Organisms

Abstract

Molecules to observe and manipulate biological systems can be devised by a variety of strategies, ranging from pure chemical design and total synthesis to genome mining and high-throughput directed evolution. Examples of both successes and failures will be chosen mainly from my own experience, including calcium and sodium indicators, caged second messengers, molecular voltmeters and photomultipliers, fluorescent proteins, genetically encoded indicators of intracellular biochemistry, and clinically applicable peptides to target human tumors.

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