Hartmut Michel (2013) - Structure and Mechanism of Otto Warburg's Respiratory Enzyme, the Cytochrome c Oxidase

The oxygen, you breathe in, is converted to water by cytochrome c oxidase, using electrons provided by cytochrome c and protons from the aqueous milieu of the body

I am going to talk about one of the complexes which was introduced so nicely by John Walker. But before that I would like to say that I work at the Max Planck Institute of Biophysics here in Frankfurt in Germany. And we have about 200 employees and they all focus on membrane proteins. So this means there should be something very important of membrane proteins. We already had 2 talks on membrane proteins: Brian Kobilka, the first talk this morning, and the previous talk given by John Walker. To give you a more general introduction: Of course membranes are barriers or borders. So membrane proteins have to transfer and transport substances across the membranes. Of course you have to take up nutrients and you have to excrete catabolites and also proteins doing the job outside of the cells. There are various numbers of transports and also John has used one. Not so evident is it that also all, nearly all biological electron transfer happens in membrane proteins. That’s true in photosynthesis and it’s also in cellular respiration as exemplified by John. They act as signal receptors, that’s the third class. And we had this great breakthrough, informed by Brian Kobilka this morning: There are signal transducers to amplify signals. And of course signals can be neurotransmitter hormones, light and many, many things more. And the 4th class is that some membrane proteins are enzymes, preferentially if the substrate is hydrophobic and likes to stay in the membrane. I am going to talk about cellular respiration, about one component there. Before that I show you here the Nobel Prizes which have been awarded for the work on membrane proteins. The first one was already in 1931, given to Otto Warburg. It was the prize for Medicine or Physiology for the respiratory enzyme. The second prize was given for the first atomic structure determination of a membrane protein given to Johann Deisenhofer, Robert Huber and myself. And actually we are really proud that also people getting the prize later like Rod McKinnon, Peter Agre, Brian Kobilka, they used a method which we have... the strategies which we have invented in the ‘80’s. So our work has brought fruit also in the other forms of membrane protein research. And we heard John Walker about this beautiful work there. Now I am going to talk about the membrane integrated respiratory terminal oxidases. Actually there are 2 of them. One is called cytochromes bd, the oxidised quinols. Not much is known about them. And we wait for elucidation of an atomic structure of these classes of terminal oxidases. I am going to talk about the heme-copper containing terminal oxidases, due to the active side which contains a heme and a copper atom which I will show you in detail. These enzymes form a superfamily. And they reduce oxygen to water and they use electrons from various donors, most frequently from cytochrome c, also from hydroquinols or from high potential iron sulphur proteins. And always the electron comes from the external side of the membrane. And the protons are provided from the internal membrane side. And in addition they pump protons across the membrane and this increases the energy conservation. But I have to say here that still the reaction catalysed by cytochrome c oxidase is technically not pleasant. Because we waste about 2/3 of the energy in the reaction despite the proton pumps. And only 1/3 is formed, is stored in the form of these electrochemical proton gradient or the proton motive force. So there would be a good chance for engineers to improve the reaction catalysed by the terminal oxidases. You have seen this slide already in a similar version by John Walker. And I can say here the respiratory chain is now the second area where we know the structures of nearly all membrane proteins. The first one was photosynthesis, and in photosynthesis we know the structures of each component from one or the other organism. Now the mitochondrial respiratory chain has achieved the same level, the last one was NADH dehydrogenase. And I can say here of these structures shown here, Cambridge has contributed 2, these 2, and these are our Frankfurt contributions. And I will go on to work on this complex for the cytochrome c oxidase. And of course, all the details how this works have been shown to you by John. But we still face the challenge to really find out what is in the membrane here in the ADP synthase that holds for the chloroplast system, or for the syntheses, as well as for the respiration system. To outline the reaction catalysed by the heme-copper terminal oxidases more in detail. So we have 1 oxygen molecule, dioxygen. We use 4 protons coming from the inner side of the membrane where 4 cytochrome c molecules are donating electrons from the outside. So we get this product: We get 2 water molecules and we get 4 oxidised cytochrome-c molecules. And because this reaction takes place across the membrane, electrons provide from here, protons from there, we get formation of an electric voltage across the membrane and also a pH gradient. But mainly it is the electric voltage which is created here. In addition we have the coupling to the proton pumping, so a total of 6 to 8 protons. Most of the enzymes use 8 protons in the entire catalytic cycle to pump 4 protons out across the membrane. And now I come to Otto Warburg. Otto Warburg, you have seen his name in the title, he’s a famous German biochemist. And he got the Nobel Prize in Physiology and Medicine in 1931 'for his discovery of the nature and the mode of action of the respiratory enzyme'. But we still work on it and we haven’t solved the problem, how it actually operates. I will show you this later. What I think is maybe a more important contribution, is that he was the original proposer that cancer cells, also slightly mentioned by John, that they generate energy by glycolysis and not by cellular respiration. And glycolysis is by far less efficient than cellular respiration. And actually he presented his hypothesis in detail for the first time at the Lindau meeting on June 30th in 1966. I have asked here the organisers whether his lecture is already on the Mediatheque. But this is not the case. But I’m sure that now they will speed up and put Otto Warburg’s lecture from 1966 into the Mediatheque. So you can see what he told there. But I think this is generally accepted that cancer cells generate energy by glycolysis and not by respiration. Cytochrome c oxidase has been a controversial enzyme from the very beginning. It was actually discovered by a Scottish scientist, MacMunn. And he described the optical absorption changes upon oxidation of animal cells at 605 nm, which is the signature of the cytochrome c oxidase reaction. And 2 German biochemists, actually, they declared that MacMunn observed degradation products of haemoglobins. And actually they were powerful and as a result of that, research on these enzymes ceased for more than 20 years. And until 1923 Hans Fischer, a German, getting the Nobel Prize for heme synthesis in 1930, confirmed MacMunn’s observations. And then we had 2 famous scientists, one Otto Warburg and the other David Keilin in Cambridge, who had vivid controversies. And I have to say people were not very polite at those times; nowadays we are much more polite in science. And Otto Warburg stressed the role of the iron atoms and David Keilin, actually, he coined the name cytochrome c and had this controversy. Then it went on, in 1977 Martin Wikström from Finland, he showed that the enzyme is a proton pump. This was not accepted by Peter Mitchell, the father of the chemiosmosic theory. He couldn’t believe that there are proton pumps. But actually Martin Wikström was right. Martin Wikström was wrong because he postulated that the third and the fourth electrons of the 4 electrons used in the catalytic cycle lead to proton pumping only. And I re-analysed that work and criticised it and it's now... this is no longer maintained. At present we still have many controversies about the pumping mechanism which includes Japanese scientist Yoshikawa and many others. You can trace evolutionary tree of the heme-copper oxidases. And the type A oxidases are listed here. It contains the mitochondrial ones, the human ones, the bovine ones, which is well studied. And we actually work on an enzyme from Paracoccus denitrificans soil bacterium which you see in the evolutionary tree pretty close to the bovine or the mitochondrial enzyme in general. Then we have the type B enzymes which are quite diverse in sequence. We have the type C enzymes which are also called cbb3 oxidases. And I will talk about the paracoccus oxidase and I also will talk about cbb3 type C oxidase from a bacterium called Pseudomonas stutzeri. The differences among these 3 classes are mainly in protein composition and in proton transfer pathways. The A type oxidases, actually they use 2 transfer pathways for the protons, approaching the active side from the inner mitochondrial and inner bacterial side. One is the direct pathway to the ... (inaudible 11:19) centre here and the other one is a second channel leading nearby. The B type enzymes appear to possess only one channel, the direct one. But they are similar to the A type enzymes that their sub unit 2 contains a binuclear copper sender, 2 copper atoms here. And the C type oxidases they have in common with the B type enzymes, the subunit 1. But the copper protein here is exchanged for a heme containing subunit. Also we have heme of the B type here which is not the case in the A and the B type oxidases. And they still believe that the B and C type oxidases nowadays pump only 2 protons per cycle and the A type oxidases 4 protons per cycle. We have one paradox which we still have to solve. And they appear to have been present already before photosynthetic oxygen evolution was invented. So the enzyme was there but there was no oxygen. So probably it dictated a different catalytic role but we have no precise idea which reaction they catalysed. There was speculation that they are derived from the NO reductases. But that cannot be true because the present day NO reductases are very closely related to the type C heme-copper oxidases which most likely appeared very late in evolution. Then let me start with the paracoccus enzyme. The first thing which we need are crystals, and this is still tedious work. And for that here we invented one new trick. And the trick was that we made the crystals with the help of fragments from one monoclonal antibody. So we make monoclonal antibody against the protein; clone the part, the gene parts, encoding this blue protein here; produce that in E.coli and make the complexes and then we can crystallise the complex, because this likes to crystallise much more easily than the entire complex here. So the cytochrome c oxidase here, subunit 1 is shown in yellow, subunit 2 here in purple. And here we have the 2 copper atoms which receive the electrons here from the cytochrome c. And here we have the heme groups buried in the membrane up here. And here we have subunit 3, no clear role for that assigned. And we have subunit 4 also without a clear assignment of function. Looking in the atomic detail. So we have here the 2 copper atoms sharing an electron, getting the electron from cytochrome c, from up here. And then we have electron transfer down to the iron of a first heme group; that’s heme-a in this case. And then we have an electron transfer parallel to the membrane, to the heme-a3 iron. And here we have another copper atom sitting here and the electron can jump rapidly between the iron and the copper atom. This is the active site. Naturally... already John Walter told you why Schrödinger cat dies. And actually Schrödinger cat dies because the cyanide binds here to the heme-a3 iron. So no longer oxygen can be accessed by the active side. And this is why you cannot generate energy anymore and the cat dies within seconds. So this is now an enlargement of the active site together with electron density. So here we have the iron atom, the heme group, here we have the copper atom. And what came as a surprise was that a histidine ligand here through the copper atom here is actually covalently cross-linked to a nearby tyrosine. And whether this is really functional, the mechanistic importance of tyrosine, is still under debate. But it’s clear without the tyrosine the enzyme does not function. Most likely it donates an electron and a proton during the catalytic cycle of the enzyme. The entire cytochrome c oxidase is shown here together with the reaction. So we have already... I showed you already much of the details. We have cytochrome c up here binding into that groove of the protein. Electrons move here to the copper A and then down here to the membrane. We have protein uptake via a K pathway. The K pathway is the first pathway and also we have protein uptake and proton pumping via the D pathway. Entirely clear. And we have a total of 13 substrate molecules. But we do not know what is the order of the 13 substrate molecules in detail. This still has to be found out. Some experimental observations: The K pathway is not required for a half turnover when you start with a fully reduced enzyme. The K pathway is also not required when you use hydrogen peroxide as a substrate and not oxygen. And also it’s clear that K pathway mutants are blocked in the reduction of heme-a3. So when this K pathway is not functional you cannot transfer electrons on to the heme-a3 iron. And it is also clear that all protons which are pumped across the membrane use the D pathway exclusively. What about proton transfer? This appears to follow the Grotthuss mechanism. Grotthuss mechanism was already formulated in the middle of the 19th century, before the structure of water was known - which is amazing. So the mechanism that... you have here hydrogen bond donors and always a row of... a hydrogen bond donor here and a hydrogen bond acceptor. And then of course this hydrogen bond accepting molecule donates a hydrogen bond on the other side and so on. And in order to transfer a proton along this chain, hydrogen bonded chain, you have to move over the proton across the barrier. And this of course then leads the next one to jump over. And then you have the proton shifted. In order to get the original position back you have to rotate all these ones here and you are back in the original position. And you can now start off to put the next proton in here and to get the second proton transfer pathway. We see this kind of picture in the D pathway. We have clearly... this is the D pathway, is here starting in aspartate - aspartate abbreviation is D, that’s why it’s called D pathway. And we have here a knife, a row of water molecules. But it’s interrupted here by 3 asparagines - you see here 2 of them. And actually asparagines would interrupt the proton transfer along here. And in the cycle we have somehow to remove the asparagines out of the way in order to be able to transfer protons from this water molecule, up to this water molecule. Up and up, further up here to glutamate 278; this glutamate sits up here and seems to be protonated in the enzyme. And the mechanism of proton pumping, which most people now are in favour of, relies on the charge compensation principle postulated by Pete Rich. And it says that each electron transfer into the hydrophobic part of the enzyme, which happens from the outside, is charge compensated, the electric charge is compensated by the uptake of the positively charged proton from the opposite side. And then these protons which are taken up are stored somewhere in the protein. They are not consumed in the reaction. But these protons are repelled electrostatically by the positive charge of the incoming proton which comes in later and is consumed at the oxygen reduction site. So this is supposed to be the basic mechanism. And the questions which we have to answer: what are the proton acceptors for the charge compensating protons with experimental methods, Fourier transform infrared spectroscopy? We can use theoretical methods, electrostatic calculations, telling us which protonatable residues change the pK values upon reduction of the enzyme. And you can do that and when you see this distribution of the charged residues then it’s obvious that below the hemes, below the active site, there is a clear lack of protonatable residues. You see here a tyrosine. This is a cross-link tyrosine, it seems to be protonated already, so it cannot take up another proton. And we have here a glutamate which at the end of the D pathway seems to be already protonated; so it also cannot be a proton acceptor. So the protons which are taken up have to be stored in that area above the hemes here. So this is the pump proton. And to repeat that: the essential element seems to be the absence of potential proton acceptors between the cytoplasmic surface and the heme groups. The 3 residues here appear to be neutral in the oxidised and reduced states. As a consequence of that we have to store the proteins in the space above the heme groups. Potential proton acceptors around the binuclear site are peroxide or hydroxide at copper B and also the heme-a3 protonates. There was postulated that histidine residue may be in a negatively charged form, imidazolate, but this is very unlikely to be the case. Now how proton pumping might look like: You have here the electron coming from cytochrome c. It moves in onto the copper A. The copper A is now reduced and then it goes on further, on to the heme-a. Now heme-a is reduced and the induction of the heme-a iron has a much stronger electrostatic effect on the heme-a3, when the heme-a propionates on the glutamate 278. So the proton then from glutamate 278 would like to be on the propionate and no longer on the glutamate. And this effect could pull over a proton from the glutamate on to the heme propionate. Some people call this the loading of the pump site. So now we see here the proton jumps over on to the heme propionates, now it’s sitting here. And now, next the glutamate 278 would expect a proton from the closest water molecule. This one from the next water molecule. And this goes on until a proton is taken up from the cytoplasmic site. This would be equivalent to the transport of a hydroxide ion from glutamate to the cytoplasm and not to a proton transfer; so it is a mixture of a hydroxide transfer and a proton pump. And next the proton would move from heme-a to the heme-a3 and the proton would follow as far as possible on the heme propionate. Now the electron can move over. And you see now the electron is up there. And now a proton would be pulled into the active site to be consumed in the catalytic cycle. This again would be a pull mechanism and the proton pulled in would push out the proton at the heme propionates. So this is now the mechanism which is accepted by most people in the field - of course details are different. We still have to answer what actually is in the binuclear centre in the O state. This is here the heme-a3 iron and this is the copper B and we have electron density, experimental electron density here. And actually it seems to be that the peroxy bridge seems to fit the electron density fairly well, but it’s not expected in the oxidised enzyme. But we have to say, all people having done now, there are now 4 structures of cytochrome c oxidases. And they all have the best fit by peroxide and not by water or oxygen; and oxygen is not possible there in the oxidised form. So if you put only 1 water in the electron density you miss... that’s not enough electron density. If you put 2 water, there is no space in-between. Peroxide provides the best fit. And so actually we think we have to discuss that peroxide is already present in the oxidised form. As I said already, there is not enough space for 2 water molecules or 1 water molecule plus 1 hydroxide or 2 hydroxides. Carbonate which has also been discussed provides too many electrons. The most perfect fit is peroxide. Also chloride, but chloride we can exclude from other experiments. And in my eyes it’s very attractive to have a peroxide there because it’s the best fit for the electron density. And also from the electrostatics, a peroxide dianion with 2 negative charges would provide the best electrostatic compensation for the positive charges at the iron and at the copper B. And also peroxide dianion would be singly protonated upon first reduction and receive a second proton upon the second reduction. It could leave the binuclear site, making it available for dioxygen binding and this would explain why a singly reduced active site does not bind dioxygen. Now I show you conventional catalytic cycle of cytochrome c oxidase. We have here the oxidised form, the oxidised form which was considered to contain maybe an OH minus, and you have the first electron input into the enzyme. And this is accompanied by the uptake of 1 proton. And you probably form a first water molecule here. And then you have the second electron and then an uptake of a proton in here and then you get the reduced form. And if the 2 electrons are at the binuclear site, you get binding of the oxygen molecule. That is compound A. Compound A was discovered by Britton Chance from Philadelphia in the ‘50’s. And then there was the belief that they form a peroxy here but it’s clear from Raman spectroscopy that this is already an oxoferryl state. So we have to cleave the oxygen molecule in the step from A to P already; and that requires actually 4 electrons. So we need a fourth electron and this is now thought to be provided by the tyrosine. And then we get uptake of the third electron in the cycle. And we get proton uptake. And then we get the F state, called oxoFerry state, and the fourth electron, fourth proton and formation of another water molecule. We have to modify that considerably if we already started the peroxide with the peroxide here. And actually we have some evidence that we have... that it might actually contain a super oxide in a bond form. So these are new ideas in the field which we have to prove or which we have to test - not to prove, we have to test. Now I change gears and I come to the cbb3 cytochrome c oxidases. They have been discovered rather recently as essential enzymes for nitrogen fixation in Rhizobia. And for that reason they were called fix, for fixing, fixN, fixO, fixP, the protein subunits. And their role appears to be to remove the oxygen in order to maintain anaerobic conditions which are required in nitrogen fixation in the nodules of plants, nodule bacteria in plants. Cbb3 oxidases are also essential for the pathogenicity of Helicobacter and Campylobacter. The main food poisoning bacterium is Campylobacter. Helicobacter of course is the cause for 90% of the stomach ulcers. And if you block cbb3 oxidases these bacteria can no longer colonise the gut and the stomach. So this has again medical relevance. And as I said already that these cbb3 oxidases share only one subunit with the A and B-type terminal oxidase and they use firmly bound cytochrome-c subunits as electron supply. And we work with that enzyme. Because we go for crystals and to show you what it takes to get well-reflecting crystals, this is here, we use the natural pseudomonas cells, isolate the membranes, purify the enzyme in a detergent called beta-Dodecyl Maltoside, use various steps for purification and you can get a number of various crystals. You change the purification protocol, change detergents for crystallisation and at the end you get a well reflecting crystal, well reflecting means at least 3.5 angstrom isotropic deflection. And I should say here that this actually took Sabine Buschmann 10 years. So again we need trust and time as has been outlined by a previous speaker. And also of course we need the patience of the funding agency. And we need people who dare to start these kinds of projects. Nowadays I think we are a little bit faster, we work with more proteins. And it will probably not take 10 years to get one protein crystal for a student. What was essential for in the work was that we had reduced the number of lipids. But if we reduce during the chromatic procedures the number to 6 to 9 lipids, we do not get well reflecting crystals. We have to use a preparation which contains about 12 lipid molecules. So controlling the lipid contents of membrane proteins is also a very important task in order to be successful. Structure determination was straightforward. You can use the anomalous scattering properties of the iron atoms. And we have here 5 iron atoms in the structure. So this is now the tracing of the polypeptide chains. This is subunit 1, subunit 2 and our subunit 3 or the P subunit here. And if you compare that to the other cytochrome c oxidases of the A and B type, we see that the core is more or less identical but the connecting segments of the helices at both sites are different. And they are most often shorter in the C type oxidase. I will not go into details of the architecture of the other protein subunits. That’s a cytochrome c type of the subunit 2 and the subunit 3 here. It has 2 cytochrome-c domains and it shows inter-domain helix swapping which is sometimes observed. So we have... this domain is formed by this continuous stretching here in the sequence. And if you now look for the distances for electron transfer. Probably soluble cytochrome c binds here, donates the electron, the electron is transferred here via the heme of the cytochrome c to the heme B here, and then on to the copper B and to the iron of the active site. And that’s here now an enlargement of that: So we see here the copper and we see here the iron, there are some differences mainly. Here is a glutamate which may have some special role. And we also surprisingly find a calcium atom bond here. And it actually charge compensates the negative charges of the heme propionates of the heme B3 and the heme B here. And this was not expected and came as a surprise. And all the modulars before that were wrong, they didn’t see that. And this gives us a problem which I will come back to soon. And another difference is that the active-site tyrosine actually protrudes from different helices here. So I will speed up. Ok so you see here that this is different tyrosine, but it’s essential; it comes from transfer from helix 6 in one example and from number 7 in the other one. So that’s the difference. We also have difference in cavities. We have different large cavities in the C-type oxidases; so that is the case. And we also can look for the K pathway. We have only the K pathway. That is clearly seen. And actually we have a problem, because in this proton pumping mechanism we would have to transfer protons from here up to here. And we have no storage here and we have no way for transferring protons up here. So the proton pump mechanism which I showed you may be completely wrong and there might be a very different reason for proton pump mechanism. So still many problems to be solved. We have an absence of D pathway, I showed you already. And to summarise that: cbb3 oxidases possess a completely different electron supply system. The distances are shorter. They only possess 1 proton transfer pathway, they pump protons, which is difficult to understand in the framework of the electrostatic repulsion hypothesis. And all reductases are very similar to this type of oxidases, although they do not pump protons and take up protons from the outer face of the membrane. Of course I wouldn’t like to finish without acknowledging the people doing the work. It’s a rather small group. It was Hao Xie doing genetics on the enzyme. Iris von der Hocht spectroscopy. Sabine Buschmann did the crystallisation for 10 years and aided spectroscopy. And Juergen Koepke did extra crystallography of the A-type enzyme. Which was done by Ulrich Ermler in the C-type oxidases. And we did a lot of mass spectrometry also, which was done by Julian Langer. With that I want to thank you for your attention. And of course you have seen that we still have challenging problems despite 125 years of work on cytochrome-c oxidases. I do not hope that it will continue for another 125 years. Thank you very much. Applause. End.

Ich werde über einen der Komplexe sprechen, die John Walker so schön vorgestellt hat. Vorher möchte ich aber noch erwähnen, dass ich am Max-Planck-Institut für Biophysik hier in Deutschland arbeite, in Frankfurt. Wir haben ungefähr 200 Mitarbeiter, und sie alle befassen sich mit Membranproteinen. Das bedeutet, dass Membranproteine etwas sehr Wichtiges sein müssen. Wir haben bereits zwei Vorträge über Membranproteine gehört: zuerst den von Brian Kobilka heute Vormittag und dann den von gerade eben, den John Walker gehalten hat. Zur Einleitung muss ich etwas weiter ausholen: Membrane sind ja Hindernisse bzw. Grenzen. Membranproteine müssen Substanzen durch die Membrane transferieren und transportieren. Natürlich muss man Nährstoffe aufnehmen, man muss Kataboliten ausscheiden, und es gibt auch Proteine, die ihre Arbeit außerhalb der Zellen verrichten. Es gibt viele verschiedene Transporte; über einen hat John gesprochen. Nicht so klar ist, dass auch alle, fast alle biologischen Elektronentransfers in Membranproteinen ablaufen. Das gilt für die Photosynthese und auch, wie von John erläutert, für die Zellatmung. Sie dienen als Signalrezeptoren, das ist die dritte Klasse. Und Brian Kobilka hat heute Vormittag über einen großen Durchbruch berichtet: Es gibt Signaltransduktoren zur Verstärkung von Signalen. Signale können natürlich Neurotransmitter, Hormone, Licht und noch Vieles mehr sein. Die vierte Klasse – einige Membranproteine sind Enzyme, vorzugsweise dann, wenn das Substrat hydrophob ist und in der Membran bleiben möchte. Ich werde über die Zellatmung sprechen, über eine ihrer Komponenten. Vorher aber zeige ich Ihnen noch die Nobelpreise, die für die Arbeit an Membranproteinen verliehen wurden. Der erste wurde bereits 1931 verliehen, an Otto Warburg. Es handelte sich um den Preis für Medizin oder Physiologie; honoriert wurde das Atmungsenzym. Der zweite Preis ging an Johann Deisenhofer, Robert Huber und mich selbst, für die erste atomare Strukturbestimmung eines Membranproteins. Und natürlich sind wir richtig stolz darauf, dass auch andere, die den Preis später bekommen haben, wie Rod McKinnon, Peter Agre, Brian Kobilka... sie wandten eine Methode an, die wir... die Strategien, die wir in den Achtzigern entworfen haben. Unsere Arbeit hat also auch in den anderen Bereichen der Membranproteinforschung Früchte getragen. Wir haben John Walker gehört, der über diese tolle Arbeit gesprochen hat. Nun spreche ich über die in der Membran integrierten respiratorischen terminalen Oxidasen. Davon gibt es zwei. Eine trägt die Bezeichnung Cytochrom-bd, oxidierte Hydrochinone. Darüber weiß man nicht viel. Wir warten auf eine Aufklärung über die atomare Struktur dieser Klassen terminaler Oxidasen. Ich spreche über die terminalen Oxidasen, die Häm und Kupfer enthalten und ein Kupferatom; das werde ich Ihnen im Einzelnen zeigen. Diese Enzyme bilden eine Superfamilie. Sie reduzieren Sauerstoff zu Wasser und nutzen Elektronen von verschiedenen Spendern, am häufigsten von Cytochrom-c, aber auch von Hydroquinolen oder von Eisen-Schwefel-Proteinen mit hohem Potential. Die Elektronen kommen immer von der Außenseite der Membran, und die Protonen werden von der Innenseite der Membran beigesteuert. Darüber hinaus werden Protonen durch die Membran gepumpt, was die Energieerhaltung erhöht. An dieser Stelle muss ich aber darauf hinweisen, dass die von Cytochrom-c-Oxidase katalysierte Reaktion technisch immer noch nicht befriedigend ist, weil wir trotz der Protonenpumpen ungefähr zwei Drittel der Energie in der Reaktion verschwenden. Nur zwei Prozent werden in Gestalt dieses elektrochemischen Protonengradienten, der Antriebskraft der Protonen, gespeichert. Ingenieure können sich also dadurch hervortun, dass sie die durch die terminalen Oxidasen katalysierte Reaktion verbessern. Eine ähnliche Version dieser Folie haben Sie schon bei John Walker gesehen. Ich kann sagen, die Atmungskette ist mittlerweile der zweite Bereich, in dem wir die Strukturen fast aller Membranproteine kennen. Der erste war die Photosynthese; in der Photosynthese kennen wir die Strukturen aller Komponenten des einen oder anderen Organismus. Jetzt hat die mitochondriale Atmungskette die gleiche Stufe erreicht, zuletzt gab es die NADH-Dehydrogenase. Über die hier gezeigten Strukturen kann ich sagen, dass Cambridge zwei beigesteuert hat, diese beiden, und das sind unsere Frankfurter Beiträge. Und ich werde weiter an diesem Komplex für die Cytochrom-c-Oxidase arbeiten. Alle Einzelheiten darüber, wie das funktioniert, haben Sie von John erfahren. Wir stehen aber immer noch vor einer Herausforderung das gilt für das Chloroplastensystem ebenso wie für die Synthesen oder das Atmungssystem. Nun zu einer ausführlicheren Darstellung der durch die terminale Häm-Kupfer-Oxidase katalysierten Reaktion. Hier haben wir ein Sauerstoffmolekül, Disauerstoff. Wir verwenden vier Protonen, die von der Innenseite der Membran kommen, wo vier Cytochrom-c-Moleküle Elektronen von der Außenseite spenden. Das führt zu diesem Produkt: Wir erhalten zwei Wassermoleküle und vier oxidierte Cytochrom-c-Moleküle. Und da diese Reaktion membranübergreifend abläuft ergibt sich eine membranübergreifende elektrische Spannung, außerdem ein pH-Gradient. Hauptsächlich aber wird hier elektrische Spannung erzeugt. Zusätzlich haben wir die Kopplung an die Protonenpumpe, insgesamt also sechs bis acht Protonen. Die meisten Enzyme verwenden acht Protonen im gesamten katalytischen Zyklus, um vier Protonen durch die Membran zu pumpen. Jetzt komme ich zu Otto Warburg. Otto Warburg, dessen Namen sie im Titel gelesen haben, war ein berühmter deutscher Biochemiker. Doch wir arbeiten immer noch daran; das Problem, wie es tatsächlich funktioniert, haben wir immer noch nicht gelöst. Dazu später mehr. Was in meinen Augen eine vielleicht noch wichtigere Leistung war: Er hat erstmals vorgeschlagen, dass Krebszellen Energie durch Glykolyse erzeugen, nicht durch Zellatmung. Glykolyse ist weit weniger effizient als Zellatmung. Tatsächlich hat er diese Hypothese beim Lindauer Treffen am 30. Juni 1966 erstmals ausführlich präsentiert. Ich habe die Organisatoren gefragt, ob sein Vortrag schon in der Mediathek ist, aber das ist nicht der Fall. Ich bin mir aber sicher, dass sie sich jetzt beeilen werden und Otto Warburgs Vortrag aus dem Jahr 1966 in die Mediathek einstellen, damit Sie alle erfahren, was er hier gesagt hat. Ich denke aber, es ist allgemein anerkannt, dass Krebszellen Energie durch Glykolyse erzeugen, nicht durch Atmung. Die Cytochrom-c-Oxidase war von Anfang an ein kontroverses Enzym. Entdeckt wurde sie von dem schottischen Wissenschaftler MacMunn. Er beschrieb die optischen Absorptionsänderungen bei der Oxidation von Tierzellen bei 605 nm, was der Signatur der Cytochrom-c-Oxidase-Reaktion entspricht. Zwei deutsche Biochemiker erklärten jedoch, MacMunn habe die Abbauprodukte von Hämoglobin beobachtet. Sie hatten großen Einfluss, und das Ergebnis davon war, dass mehr als zwanzig Jahre lang nicht mehr an diesen Enzymen geforscht wurde. Bis 1923 Hans Fischer, ein Deutscher, der im Jahr 1930 den Nobelpreis für die Hämsynthese erhielt, MacMunns Beobachtungen bestätigte. Dann gab es zwei berühmte Wissenschaftler, die lebhafte Kontroversen austrugen Ich muss sagen, dass man zu jener Zeit nicht besonders höflich war; heutzutage haben wir in der Wissenschaft viel bessere Umgangsformen. Otto Warburg betonte die Rolle des Eisenatoms, und David Keilin prägte die Bezeichnung Cytochrom-c. Die beiden trugen diese Auseinandersetzung aus. Dann ging es weiter – im Jahr 1977 zeigte Martin Wikström aus Finnland, dass das Enzym eine Protonenpumpe ist. Peter Mitchell, der Vater der chemiosmotischen Theorie, akzeptierte das nicht; er glaubte nicht, dass es Protonenpumpen gibt. Tatsächlich aber hatte Martin Wikström Recht. Martin Wikström hatte allerdings insofern unrecht, als er postulierte, dass nur das dritte und vierte der vier im katalytischen Zyklus eingesetzten Elektronen das Pumpen der Protonen hervorrufen. Ich habe diese Arbeit analysiert und kritisiert, und es wird nicht mehr aufrechterhalten. Derzeit gibt es über den Pumpmechanismus immer noch zahlreiche Kontroversen, an denen neben vielen anderen der japanische Wissenschaftler Yoshikawa beteiligt ist. Man kann den Stammbaum der Häm-Kupfer-Oxidase zurückverfolgen. Die Oxidasen des Typs A sind hier aufgeführt. Hierzu zählen die mitochondrialen, die menschlichen, die bovinen, die gut untersucht sind. Und wir arbeiten an einem Enzym des Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans, das im Stammbaum im Allgemeinen ziemlich nahe am bovinen oder dem mitochondrialen Enzym zu sehen ist. Dann gibt es die Enzyme vom Typ B, die in ihrer Sequenz ziemlich vielfältig sind. Wir haben die Enzyme vom Typ C, die auch cbb3-Oxidasen genannt werden. Ich werde über die Paracoccus-Oxidase sprechen und außerdem über die cbb3-Typ-C-Oxidase von einem Bakterium namens Pseudomonas stutzeri. Diese drei Klassen unterscheiden sich hauptsächlich durch die Proteinzusammensetzung und die Protonentransferpfade. Die Oxidasen vom Typ A nutzen zwei Transferpfade für die Protonen; sie nähern sich dem aktiven Zentrum vom inneren mitochondrialen und dem inneren bakteriellen Zentrum. Der eine ist der direkte Pfad zum katalytischen Zentrum; der andere ist ein zweiter Kanal, der in der Nähe verläuft. Die Enzyme vom Typ B scheinen nur einen Kanal zu besitzen, den direkten. Sie ähneln aber den Enzymen vom Typ A insofern, als ihre Untereinheit 2 ein binukleares Kupferzentrum enthält, zwei Kupferatome hier. Und die Typ-C-Oxidasen haben mit den Enzymen vom Typ B die Untereinheit 1 gemeinsam, aber das Kupferprotein hier ist durch eine Häm-enthaltende Untereinheit ersetzt. Hier gibt es auch Häm b, was bei den Oxidasen des Typs A bzw. B nicht der Fall ist. Heute glaubt man immer noch, dass die Oxidasen des Typs B bzw. C nur zwei Protonen pro Zyklus pumpen und die Oxidasen vom Typ A vier Protonen pro Zyklus. Ein Paradox gilt es noch zu lösen: Die Oxidasen scheint es schon gegeben zu haben, bevor die photosynthetische Sauerstoffentwicklung erfunden wurde. Das Enzym war also da, aber es gab keinen Sauerstoff. Wahrscheinlich hatte es also eine unterschiedliche katalytische Rolle, aber wir haben keine genaue Vorstellung davon, welche Reaktion katalysiert wurde. Es gab Spekulationen darüber, dass sie von den NO-Reduktasen abgeleitet waren. Das kann aber nicht stimmen, da die NO-Reduktasen der Gegenwart eng verwandt sind mit den Häm-Kupfer-Oxidasen des Typs C, die in der Evolution höchstwahrscheinlich sehr spät auftauchten. Nun also zum Paracoccus-Enzym. Das Erste, was wir brauchen, sind Kristalle; das ist immer noch eine langweilige Arbeit. Deshalb dachten wir uns dafür einen neuen Trick aus: Wir stellten die Kristalle unter Zuhilfenahme von Fragmenten eines monoklonalen Antikörpers her. Wir erzeugen also monoklonale Antikörper gegen das Protein, klonen die Genanteile, indem wir dieses blaue Protein verschlüsseln, produzieren es in E.coli und stellen die Komplexe her. Dann können wir den Komplex kristallisieren, denn das kristallisiert viel leichter als der gesamte Komplex hier. Hier haben wir die Cytochrom-c-Oxidase – Untereinheit 1 ist gelb dargestellt, Untereinheit 2 violett. Hier haben wir die zwei Kupferatome, die hier die Elektronen vom Cytochrom-c in Empfang nehmen. Und hier sind die dort oben in den Membranen vergrabenen Hämgruppen. Dort ist Untereinheit 3, der keine eindeutige Rolle zugewiesen ist. Und wir haben Untereinheit 4, ebenfalls ohne eindeutige Funktionszuweisung. Sehen wir uns das Atom im Detail an. Hier haben wir die zwei Kupferatome, die sich ein Elektron teilen; sie erhalten das Elektron vom Cytochrom-c, von hier oben. Dann gibt es den Elektronentransfer hinunter zum Eisen einer ersten Hämgruppe; in diesem Fall handelt es sich um Häm a. Dann haben wir einen Elektronentransfer – parallel zur Membran – zum Häm a3 Eisen. Hier sitzt ein weiteres Kupferatom, und das Elektron kann schnell zwischen dem Eisen- und dem Kupferatom hin- und herspringen. Das ist das aktive Zentrum. Natürlich... John Walter hat Ihnen schon erklärt, warum Schrödingers Katze stirbt. Schrödingers Katze stirbt, weil sich das Zyanid hier an das Häm a3 Eisen bindet. Der Sauerstoff ist also für die das aktive Zentrum nicht mehr erreichbar. Deshalb lässt sich keine Energie mehr erzeugen, und die Katze stirbt innerhalb von Sekunden. Das ist jetzt eine Vergrößerung des aktiven Zentrums, zusammen mit der Elektronendichte. Hier haben wir das Eisenatom, die Hämgruppe, hier ist das Kupferatom. Überraschend war, dass hier ein Histidin-Ligand durch das Kupferatom mit einem nahegelegenen Tyrosin kovalent verknüpft ist. Ob das wirklich funktional ist – die mechanistische Bedeutung von Tyrosin – ist nach wie vor umstritten. Klar ist aber, dass das Enzym ohne das Tyrosin nicht funktioniert. Höchstwahrscheinlich spendet es während des katalytischen Zyklus des Enzyms ein Elektron und ein Proton. Hier sehen Sie die ganze Cytochrom-c-Oxidase zusammen mit der Reaktion. Wir haben also schon... ich habe Ihnen schon viele Details gezeigt. Hier oben haben wir Cytochrom-c, das sich in diese Furche des Proteins bindet. Elektronen bewegen sich hier zum Kupfer A und dann hinunter zur Membran. Über einen K-Pfad wird Protein aufgenommen. Der K-Pfad ist der erste Pfad; eine Proteinaufnahme findet ebenso wie ein Pumpen von Protonen auch über den D-Pfad statt. Ganz klar. Und wir haben insgesamt 13 Substratmoleküle. Über die Reihenfolge der 13 Substratmoleküle wissen wir aber im Einzelnen nicht Bescheid. Das gilt es noch herauszufinden. Einige experimentelle Beobachtungen: Wenn man mit einem vollständig reduzierten Enzym beginnt, wird der K-Pfad für einen halben Umsatz nicht benötigt. Der K-Pfad wird auch dann nicht benötigt, wenn man als Substrat nicht Sauerstoff verwendet, sondern Wasserstoffperoxid. Außerdem ist es klar, dass K-Pfad-Mutanten in der Reduktion von Häm a3 blockiert werden. Wenn also dieser K-Pfad nicht funktional ist, lassen sich Elektronen nicht auf das Häm a3 Eisen transferieren. Klar ist auch, dass alle Protonen, die über die Membran gepumpt werden, ausschließlich den D-Pfad nutzen. Wie steht es um den Protonentransfer? Er scheint dem Grotthuß-Mechanismus zu folgen. Der Grotthuß-Mechanismus wurde bereits in der Mitte des 19. Jahrhunderts formuliert, noch bevor die Struktur von Wasser bekannt war – das ist erstaunlich. Der Mechanismus, der... hier haben wir Wasserstoffbindungsdonor und eine Reihe von... hier haben wir einen Wasserstoffbindungsdonor und einen Wasserstoffbindungsakzeptor. Und natürlich spendet dieses die Wasserstoffbindung akzeptierende Molekül eine Wasserstoffbindung auf der anderen Seite und so weiter. Um ein Proton entlang dieser Kette zu transferieren, entlang dieser wasserstoffgebundenen Kette, muss man das Proton über die Barriere bringen. Das bringt dann natürlich das nächste dazu, hinüberzuspringen, und dann ist das Proton verschoben. Um zur Ausgansposition zurückzukehren, muss man alle, die sich hier befinden, in Rotation versetzen; dann ist man wieder in der Ausgangsposition. Jetzt kann man das nächste Proton hier einbringen, um den zweiten Protonentransferpfad zu bekommen. Im D-Pfad zeigt sich uns dieses Bild. Wir haben eindeutig... das ist der D-Pfad, er beginnt hier in Aspartat – die Abkürzung von Aspartat ist D, deshalb heißt er D-Pfad. Hier ist eine Reihe von Wassermolekülen, die aber hier von drei Asparaginen unterbrochen wird; hier sehen sie zwei davon. Tatsächlich würden Asparagine den Protonentransfer hier entlang unterbrechen. Im Zyklus müssen wir die Asparagine irgendwie aus dem Weg räumen, um Protonen von diesem Wassermolekül hinauf zu diesem Wassermolekül transferieren zu können und weiter hinauf zu Glutamat 278; dieses Glutamat sitzt hier oben; es scheint im Enzym protoniert zu werden. Der Protonenpumpmechanismus, den die meisten heute bevorzugen, stützt sich auf das von Pete Rich postulierte Prinzip der Ladungskompensation. Es besagt, dass jeder Elektronentransfer in den hydrophoben Teil des Enzyms, der von außen geschieht, ladungskompensiert ist; die elektrische Ladung wird durch die Aufnahme der positiv geladenen Protonen von der entgegengesetzten Seite kompensiert. Diese aufgenommenen Protonen werden dann irgendwie im Protein gelagert; sie werden in der Reaktion nicht verbraucht. Sie werden aber durch die positive Ladung des später eintreffenden Protons, das im Sauerstoffreduktionszentrum verbraucht wird, elektrostatisch abgestoßen. So stellt man sich also den grundlegenden Mechanismus vor. Nun stellt sich die folgende Frage: Was sind die Protonenakzeptoren für die ladungskompensierenden Protonen? Wir können die Frage mit experimentellen Methoden beantworten, durch die Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie. Wir können auf theoretische Methoden zurückgreifen, auf elektrostatische Berechnungen, aus denen sich ergibt, welche protonierbaren Reste die pK-Werte bei der Reduktion des Enzyms verändern. Das kann man machen. Und wenn man die Verteilung der geladenen Reste sieht, dann wird klar, dass unter den Hämen, unter dem aktiven Zentrum, ein deutlicher Mangel an protonierbaren Resten herrscht. Hier sehen Sie ein Tyrosin. Das ist ein verknüpftes Tyrosin; es scheint bereits protoniert zu sein, kann also kein weiteres Proton mehr aufnehmen. Und hier haben wir ein Glutamat am Ende des D-Pfades; es scheint bereits protoniert zu sein, steht also als Protonenrezeptor ebenfalls nicht zur Verfügung. Die Protonen, die aufgenommen werden, müssen also in diesem Bereich oberhalb der Häme gelagert werden. Das sind dann die gepumpten Protonen. Nochmals: Das wesentliche Element scheint die Abwesenheit potentieller Protonenakzeptoren zwischen der zytoplasmischen Oberfläche und den Hämgruppen zu sein. Die drei Reste hier scheinen in den oxidierten und reduzierten Zuständen neutral zu sein. Als Folge davon müssen wir die Proteine im Raum oberhalb der Hämgruppen lagern. Potentielle Protonenakzeptoren rings um dieses binukleare Zentrum sind Peroxid oder Hydroxid am Kupfer B sowie die drei Häm a3-Propionate. Es wurde postuliert, dass Histidinreste möglicherweise eine negativ geladene Form annehmen, Imidazolat, aber das ist sehr unwahrscheinlich. Kommen wir dazu, wie das Pumpen von Protonen aussehen könnte: Hier ist das vom Cytochrom-c kommende Elektron. Es bewegt sich zum Kupfer A; das Kupfer A ist jetzt reduziert. Dann geht es sich weiter, zum Häm a. Jetzt ist das Häm a reduziert, und die Reduktion des Häm a-Eisens hat einen viel stärkeren elektrostatischen Effekt auf das Häm a3, auf die Häm a-Propionate als auf das Glutamat 278. Das Proton vom Glutamat 278 wäre also lieber auf dem Propionat als auf dem Glutamat. Dieser Effekt könnte ein Proton vom Glutamat zum Häm-Propionat herüberziehen. Das nennen manche das Laden der Pumpe. Hier sehen wir, wie das Proton zu den Häm-Propionaten hinüberspringt; jetzt sitzt es hier. Als nächstes würde jetzt das Glutamat 278 ein Proton vom nächstgelegenen Wassermolekül erwarten, das wiederum eines vom nächsten Wassermolekül, und so geht das weiter, bis ein Proton vom zytoplasmischen Zentrum aufgenommen wird. Das würde dem Transport eines Hydroxidions von Glutamat zum Zytoplasma entsprechen, nicht einem Protonentransfer. Wir haben es also mit einer Mischung aus Hydroxidtransfer und Protonenpumpe zu tun. Als nächstes würde sich das Elektron vom Häm a zum Häm a3 bewegen, und das Proton würde auf dem Häm-Propionat so weit wie möglich folgen. Jetzt kann das Elektron Platz machen, und man sieht, dass das Elektron dort oben ist. Jetzt würde ein Proton in das aktive Zentrum gezogen werden, um im katalytischen Zyklus verbraucht zu werden. Das wäre wieder ein Zugmechanismus, und das hereingezogene Proton würde das Proton an den Häm-Propionaten hinausdrücken. Das ist der Mechanismus, der von den meisten, die auf diesem Gebiet forschen, akzeptiert wird – mit Unterschieden im Detail natürlich. Wir müssen noch die Frage beantworten, was sich im O-Zustand im binuklearen Zentrum befindet. Das ist das Häm a3-Eisen, das ist das Kupfer B, und hier haben wir Elektronendichte, experimentelle Elektronendichte. Und so, wie es aussieht, passt sich die Peroxy-Brücke der Elektronendichte ziemlich gut an; sie wird aber nicht im oxidierten Enzym erwartet. Wir müssen aber sagen... alle, die sich damit befasst haben... es gibt jetzt vier Strukturen von Cytochrom-c-Oxidasen. Zu allen passt Peroxid am besten, nicht Wasser oder Sauerstoff; und Sauerstoff ist dort in oxidierter Form nicht möglich. Wenn man also nur ein Wasseratom in die Elektronendichte gibt, dann fehlt... dann gibt es nicht genug Elektronendichte. Nimmt man zwei Wasseratome, gibt es keinen Platz dazwischen. Peroxid passt am besten. Deshalb sind wir der Ansicht, dass wir davon ausgehen müssen, dass Peroxid bereits in oxidierter Form vorhanden ist. Wie ich schon sagte, reicht der Platz für zwei Wassermoleküle oder ein Wassermolekül plus ein Hydroxid oder zwei Hydroxide nicht aus. Ein Wasseratom hat nicht genügend Elektronen zu bieten, um die Elektronendichte zu speisen. Kohlenstoff war ebenfalls im Gespräch, hat aber zu viele Elektronen. Am besten passt Peroxid. Chlorid auch, aber Chlorid können wir aufgrund anderer Experimente ausschließen. In meinen Augen ist es sehr attraktiv, dort ein Peroxid zu haben, denn es passt am besten zur Elektronendichte. Auch vom Standpunkt der Elektrostatik aus; ein Peroxid-Dianion mit zwei negativen Ladungen würde den positiven Ladungen am Eisen und am Kupfer B die beste elektrostatische Kompensation bieten. Ein Peroxid-Dianion würde außerdem bei der ersten Reaktion einzeln protoniert werden und bei der zweiten Reduktion ein zweites Proton erhalten. Es könnte das binukleare Zentrum verlassen und es damit für die Disauerstoffbindung verfügbar machen. Das würde erklären, warum ein einzeln reduziertes aktives Zentrum keinen Disauerstoff bindet. Jetzt zeige ich Ihnen den konventionellen katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase. Wir sehen hier die oxidierte Form, von der man annahm, dass sie ein OH- enthält, und wir sehen die erste Elektroneneinspeisung in das Enzym, begleitet von der Aufnahme eines Protons. Und wahrscheinlich bildet sich hier ein erstes Wassermolekül. Dann kommt das zweite Elektron, hier drin wird ein Proton aufgenommen, und man erhält die reduzierte Form. Und wenn die zwei Elektronen im binuklearen Zentrum sind, erhält man eine Bindung des Wasserstoffmoleküls. Das ist Verbindung A. Verbindung A wurde in den Fünfzigern von Britton Chance aus Philadelphia entdeckt. Damals glaubte man, dass sie hier eine Peroxy-Form bilden, aber aus der Raman-Spektroskopie wird deutlich, dass dies bereits ein Oxoferryl-Zustand ist. Wir müssen also das Sauerstoffmolekül bereits auf dem Weg von A nach P spalten; dafür benötigt man vier Elektronen. Vier Elektronen braucht man dafür, doch das Eisen kann nur zwei spenden und das Kupfer eines. Wir brauchen also ein viertes Elektron, und das wird, so glaubt man heute, vom Tyrosin beigesteuert. Dann wird das dritte Elektron im Zyklus aufgenommen, und das Proton wird aufgenommen. Dann erhalten wir den F-Zustand, OxoFerry-Zustand genannt, das vierte Elektron, das vierte Proton und die Bildung eines weiteren Wassermoleküls. Wir müssen das erheblich modifizieren, wenn wir hier mit dem Peroxid begonnen haben. Und tatsächlich gibt es Hinweise darauf, dass wir... dass es ein Superoxid in einer Bindungsform enthalten könnte. Das sind neue Vorstellungen auf diesem Gebiet, die wir beweisen bzw. überprüfen müssen – nicht beweisen; mir müssen prüfen. Jetzt schalte ich einen Gang höher und komme zu den cbb3-Cytochrom-c-Oxidasen. Sie wurden erst vor kurzem als für die Stickstofffixierung wesentliche Enzyme in Rhizobien entdeckt. Aus diesem Grund nannte man sie „Fix“, von fixieren – FixN, FixO, FixP, die Protein-Untereinheiten. Ihre Rolle scheint darin zu bestehen, den Sauerstoff zu entfernen, um anaerobe Bedingungen beizubehalten, die in den Knollen von Pflanzen, in Knollenbakterien in Pflanzen für die Stickstofffixierung benötigt werden. cbb3-Oxidasen sind auch für die Pathogenität von Helicobacter und Campylobacter wesentlich. Das bedeutendste Bakterium für die Vergiftung von Lebensmitteln ist Campylobacter. Helicobacter ist die Ursache von 90 % der Magengeschwüre. Und wenn man cbb3-Oxidasen hemmt, können diese Bakterien die Eingeweide und den Magen nicht mehr kolonisieren. Auch das ist also von medizinischer Relevanz. Wie ich bereits sagte, teilen sich diese cbb3-Oxidasen nur eine Untereinheit mit den terminalen Oxidasen des Typs A und B, und sie nutzen stark gebundene Cytochrom-c-Untereinheiten zur Elektronenversorgung. An diesem Enzym arbeiten wir. Wir haben es ja auf Kristalle abgesehen – hier zeige ich Ihnen, was man braucht, um gut beugende Kristalle zu erhalten. Wir nehmen die natürlichen Pseudomonas-Zellen, isolieren die Membrane, reinigen das Enzym in mehreren Schritten in einem Detergens namens beta-Dodecyl-Maltosid, und schon hat man eine Anzahl verschiedener Kristalle. Man ändert das Reinigungsprotokoll, ändert die Detergenzien für die Kristallisation und hat am Ende ein gut beugendes Kristall. Gut beugend bedeutet eine isotrope Beugung von mindestens 3,5 Angström. Ich sollte hier erwähnen, dass Sabine Buschmann hierfür zehn Jahre gebraucht hat. Auch hier benötigen wir also Vertrauen und Zeit, wie von einem meiner Vorredner ausgeführt. Außerdem benötigen wir natürlich die Geduld der finanzierenden Stelle. Und wir brauchen Menschen, die es wagen, Projekte dieser Art anzugehen. Ich denke, heutzutage sind wir ein bisschen schneller, wir arbeiten mit mehr Proteinen. Es wird wahrscheinlich keine weiteren zehn Jahre dauern, bis wir ein Proteinkristall für einen Studenten erhalten. Für die Forschungsarbeit wesentlich war, dass wir die Anzahl der Lipide reduziert hatten. Doch wenn wir deren Anzahl während der chromatographischen Verfahren auf sechs bis neun Lipide verringern, erhalten wir keine gut beugenden Kristalle. Wir müssen ein Präparat verwenden, das etwa zwölf Lipidmoleküle enthält. Wenn man also Erfolg haben möchte, ist die Steuerung des Lipidgehalts von Membranproteinen ist eine sehr wichtige Aufgabe. Die Strukturbestimmung war unkompliziert. Man kann die anomalen Streueigenschaften des Eisenatoms nutzen. Hier haben wir fünf Eisenatome in der Struktur. Das ist jetzt die Nachverfolgung der Polypeptidketten. Das ist Untereinheit 1, Untereinheit 2, und hier unsere Untereinheit 3 oder die P-Untereinheit. Wenn man das mit den anderen Cytochrom-c-Oxidasen vom Typ A und B vergleicht, dann sehen wir, dass der Kern mehr oder weniger identisch ist, aber die verbindenden Segmente der Helices an beiden Zentren sind unterschiedlich. In der Oxidase vom Typ C sind sie meistens kürzer. Auf die Architektur der anderen Proteinuntereinheiten will ich nicht näher eingehen. Das hier ist ein Cytochrom Typ c der Untereinheit 2 und der Untereinheit 3. Es besitzt zwei Cytochrom-c-Domänen und lässt einen domäneninternen Helixtausch erkennen, der manchmal zu beobachten ist. Wir haben also... diese Domäne bildet sich hier durch das ständige Ziehen in der Sequenz. Sehen wir uns jetzt die Entfernungen beim Elektronentransfer an. Wahrscheinlich bindet lösliches Cytochrom-c hier, spendet das Elektron, das Elektron wird hier über das Häm des Cytochrom-c auf Häm B hier, dann auf das Kupfer B und das Eisen des aktiven Zentrums transferiert. Das hier ist eine Vergrößerung davon: Hier sehen wir das Kupfer, und wir sehen das Eisen; hauptsächlich sind hier einige Unterschiede zu sehen. Hier ist ein Glutamat, das vielleicht eine besondere Funktion hat. Und überraschenderweise finden wir hier auch eine Kalzium-Atombindung. Sie kompensiert die negativen Ladungen der Häm-Propionate des Häms B3 und des Häms B. Das hat man nicht erwartet; es war eine Überraschung. Alle Modellierer zuvor lagen falsch; das haben sie nicht gesehen. Das stellt uns vor ein Problem, auf das ich gleich zurückkommen werde. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass das Tyrosin des aktiven Zentrums hier aus verschiedenen Helices herausragt. Ich werde mich also beeilen. Was Sie hier sehen, ist das andere Tyrosin. Es ist von größter Bedeutung – es stammt aus dem Transfer von Helix 6 in einem Beispiel und von Nummer 7 im anderen. Das ist der Unterschied. Auch bei den Kavitäten gibt es Unterschiede; wir haben unterschiedlich große Kavitäten in den Oxidasen vom Typ C; das ist eine Tatsache. Und wir können auch nach dem K-Pfad sehen. Es gibt nur den K-Pfad, das ist deutlich zu sehen. Und da haben wir ein Problem, denn in diesem Protonen-Pumpmechanismus müssten wir Protonen von hier bis dort oben transferieren. Aber hier haben wir keine Lagerstelle, und dort oben haben wir keine Möglichkeit, Protonen zu transferieren. Der Protonen-Pumpmechanismus, den ich Ihnen gezeigt habe, kann also völlig falsch sein; es könnte einen ganz anderen Grund für den Protonen-Pumpmechanismus geben. Es gibt also noch viele Probleme zu lösen. Wir haben keinen D-Pfad, das habe ich Ihnen schon gezeigt. Fassen wir zusammen: cbb3-Oxidasen besitzen ein völlig anderes System der Elektronenversorgung. Die Entfernungen sind kürzer. Sie besitzen nur einen Pfad für den Protonentransfer, sie pumpen Protonen, was vor dem Hintergrund der Theorie der elektrostatischen Abweisung schwer zu verstehen ist. Und alle Reduktasen sind dieser Art von Oxidasen sehr ähnlich, obwohl sie keine Protonen pumpen und Protonen von der Außenseite der Membrane aufnehmen. Ich will natürlich nicht schließen, ohne den Personen, die die Arbeit machen, Anerkennung zu zollen. Die Gruppe ist ziemlich klein. Hao Xie kümmerte sich um die Genetik am Enzym, Iris von der Hocht um die Spektroskopie. Sabine Buschmann kümmerte sich zehn Jahre lang um die Kristallisation und unterstützte die Spektroskopie. Jürgen Koepke erledigte zusätzlich die Kristallographie der Enzyme vom Typ A, was bei den Oxidasen vom Typ C von Ulrich Ermler übernommen wurde. Und wir nutzten eine Menge Massenspektrometrie, was die Aufgabe von Julian Langer war. Damit möchte ich mich für Ihre Aufmerksamkeit bedanken. Sie haben gesehen, dass wir trotz der 125-jährigen Forschungsarbeit an Cytochrom-c-Oxidasen noch immer vor großen Problemen stehen. Ich hoffe nicht, dass das 125 Jahre lang so weiter geht. Vielen Dank.

Hartmut Michel (2013)

Structure and Mechanism of Otto Warburg's Respiratory Enzyme, the Cytochrome c Oxidase

Hartmut Michel (2013)

Structure and Mechanism of Otto Warburg's Respiratory Enzyme, the Cytochrome c Oxidase

Abstract

The oxygen, you breathe in, is converted to water by cytochrome c oxidase, using electrons provided by cytochrome c and protons from the aqueous milieu of the body. This fundamental enzyme has been discovered already in 1886, and studied extensively by Otto Warburg, who worked in Berlin, Germany, and received the Nobel Prize “for his discovery of the nature and mode of action of the respiratory enzyme” in 1931, and by David Keilin in Cambridge, England. Nevertheless, hundreds of scientists still try to work out its function and mechanism of action.
Otto Warburg did not know: Cytochrome c oxidase is located in the inner membranes of mitochondria and of many prokaryotes. The electrons are provided from the outer side of the membrane, whereas the protons originate from the inner side. This separation of the charged substrates leads to the generation, upon water formation, of an electric voltage across the membranes. This electric voltage is enhanced by the additional “pumping” of protons across the mitochondrial or bacterial membranes. The electric voltage (“membrane potential”) and to a minor extent the transmembrane pH gradient drive protons back via the ATP-synthase leading to the synthesis of the universal biological energy carrier adenosine-5’-triphosphate (“ATP”) from adenosine-5’-diphosphate (“ADP”) and inorganic phosphate.
Despite the fact that we have published the first atomic structure of a cytochrome c oxidase already in 1995 the reaction catalysed by the cytochrome c oxidase is understood insufficiently and the subject of controversial discussions. There are proton transfer pathways in the enzyme which allow and control the access of protons, required for water formation, to the active site. One of these pathways is also used for protons to be pumped. More recently we have determined the structure of a cbb3 type cytochrome c oxidase. These enzymes are essential for biological nitrogen fixation, and for the pathogenicity of some bacteria like Helicobacter and Campylobacter. The cbb3 type cytochrome c oxidases show a very high affinity for oxygen and possess only one proton transfer pathway. Nevertheless they pump protons. For all cytochrome c oxidase it is unclear which chemical entity is bound to the active site when the enzyme is in its oxidized form. Evidence will be presented that the oxidized form contains a peroxide dianion, the classical reaction cycle of the enzyme may have to be revised completely.

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