Edmond Fischer (2011) - Protein Cross Talk in Cell Signaling

The main focus of the talk will be on signaling by tyrosine phosphorylation, which has been directly implicated in the regulation of cell growth, differentiation and transformation. External signals coming in the form of mitogenic hormones and growth factors act on transmembrane receptors that are themselves tyrosine kinases

I’m delighted to be here, to have this opportunity to speak with students, I think it’s the 9th time that I have been coming to Lindau, and I love it and I wouldn’t miss it for the world. What I decided to do today is to give you a sort of a rapid historical account of the work we carried out with my lifelong friend and colleague Ed Krebs on glycogen phosphorylase studies that led us to find reversible protein phosphorylation. Now, Ed unfortunately died a year and a half ago, and therefore I decided to introduce a couple of very small video tapes of him speaking, while the two of us were speaking about discussing our early work. The reaction we found, you’ll see it, is really embarrassingly simple and nobody would have paid much attention to it if it didn’t turn out to be absolutely crucial for the regulation of cellular processes. On the other hand, it’s fair to say that when we came out with it, it came out as a very big surprise, because in those days one knew essentially nothing about cellular regulation, and to put this in the proper context, let me tell you how things were about 55 years ago, when we got started. To begin with terms like signalling or signal transduction would not have been understood, they would have been meaningless. Secondly, while endocrinology was already well established as a discipline, it remained purely at the phenomenological level, mostly intact animal level. A few hormones were known that carried messages from one organ to another and resulted in some kind of a physiological response, for instance insulin was known as a message that controlled carbohydrate metabolism, just like adrenalin was known as this kind of message. But the action of those hormones stopped at the cell membrane and what happened next was totally unknown, it was inconceivable that the hormone could act in a cell free system until Earl Sutherland and Ted Rall came up with a stunning discovery of cyclic AMP as you heard yesterday from Ferid Murad. As a second intracellular messenger for the action of adrenalin. Secondly, science was conducted in a totally different way than it is conducted today. In those days, in fact since the days of Claude Bernard, the French physiologist who first showed the glycogenic action of the pancreas, one observed a physiological phenomenon and then one tried to detect the factors, the enzymes, hormones, responsible for it, whereas today by and large it’s the other way around. First enzyme proteins are discovered and with the completion of I don’t know how many genome sequencing projects, So, to paraphrase Pirandello, we went from 6 functions in search of an enzyme to 100’s of enzymes and protein in search of a function. And finally, as I said, one knew essentially nothing about how cells were regulated, the prevailing idea was that enzymes were regulated by the rate at which they were synthesised and then degraded. And that held until the late ‘40s, maybe early ‘50s, when people realised that this could not be the case, that this wouldn’t work because those were far too slow processes, it was clear that cells had to have ways of modulating the activity of the enzyme once they had been produced and liberated inside the cell. They had to have the capability of responding to the environment, of satisfying the metabolic needs in response to whatever internal, external signal was applied on them. And this was the big problem that faced the biologists, the biochemists in those days, and that we decided to tackle with my friend Ed Krebs. We wanted to know how an important enzyme, called glycogen phosphorylase, was regulated, in fact very important, because the Coris in St. Louis and others had shown that it catalysed the rate limiting step of carbohydrate metabolism. That is the first step in the degradation of glycogen to yield blood glucose in the liver, mind you this is probably the most important function of the liver, and then ATP, as a result of carbohydrate energy metabolism everywhere, in every tissue. Phosphorylase was an attractive enzyme to work on because it was already well-known to be under complex hormonal regulation. In the resting state it is almost inactive and very little glycogen breaks down, but the moment you need to elevate blood glucose or ATP, for instance if you are hypoglycaemic or if you exercise, it becomes instantly activated by adrenalin. And adrenalin had been shown to be released under conditions that the physiologist Cannon in the 1920’s termed actions that would prepare an animal for fight or flight when subjected in emergency situations, as depicted here. When a person finds itself in front of this menace, a stress signal is sent to the brain and the brain immediately orders the adrenal to produce adrenalin, which is then distributed in all the body's tissues of the person. And you are all aware, I’m sure, what happens when you have a shot of adrenalin or an adrenalin rush. Heartbeat accelerated, in fact it beats like crazy, blood pressure goes up, respiration increases. But if you have to fight or run away, such as depicted here, the first thing you have to do is to produce ATP in a hurry. By contrast, if the stores of glucose and ATP are high, for instance after a big meal, then the activity of phosphorylase is inhibited by the release of insulin which was known in those days to bring about a deposition of glucose into glycogen, but by a mechanism which was totally unknown until Luis Leloir from Argentina came up with his, what we call the Leloir pathway, involving glycogen synthase. And then also a third hormone, glucagon. It was known as an impurity in insulin, forgotten for many years until Christian de Duve, whom you will hear in a little while, let’s say reactivated this hormone. So anyway it was clear that glucose homeostasis was regulated by the interplay, by the opposing action of those various hormones, and therefore it was clear that phosphorylase had to play a central role in those reactions. This is a picture of Luis Leloir taken in, I think in the mid ‘60s at a meeting in Mexico City, you can see the pyramid in the back, next to this very good looking young guy. Okay. Phosphorylase, the central enzyme, was discovered I the mid ‘30’s by Parnas in Poland and Carl and Gerty Cori, husband and wife team, and when discovered it was known to be totally inactive unless adenlyic acid, AMP, was added, and AMP was thought logically to serve the function of a coenzyme. And that stood until 1943, when a gal at Cori’s lab, Arda Green, crystallised phosphorylase, but in a new form. New because it was active without any need for AMP. The Coris called that form phosphorylase A and assumed very logically that in that form AMP was linked covalently to the protein, as what we call a prosthetic group. Further they assumed that this must be the native form of the enzyme in muscle, because if muscle extracts were left standing for a little while, it was rapidly converted to the old form which they now call phosphorylase B, the form that required AMP for activity. So an absolutely logical hypothesis. But if it were correct, AMP would have had to be produced in this reaction and they found none. Furthermore, using the most sensitive biological assays available at that time, they could find no adenine, ribose or AMP in the native enzyme. So the Coris knew that phosphorylase existed in two forms, but they had no idea in which way those two forms might differ and, really strange by today’s standard, they actually dropped the problem. Well, first I want to show you pictures of Carl and Gerty Cori when they got the Nobel prize in 1947, and then a picture I took of Carl while we were walking, that was in the ‘60s, in the vicinity of Seattle, at the foot of Mount Rainier. So this is where Ed and I came into the picture, we started working on this problem when we found ourselves in the same department of biochemistry at the University of Washington in 1953. Ed had been a postdoc with the Coris, so he assumed, like they did, like most people did, that AMP was a kind of coenzyme for phosphorylase, I had done my PhD at the University of Geneva with Kurt Meyer, we had worked on various amylolytic enzymes, and among these we had isolated phosphorylase from potatoes. And it was active without any need for AMP, and even though biochemistry was in its infancy in the ‘50s, one knew enough to know that coenzymes were conserve and it seemed very unlikely that it would serve as a coenzyme for muscle protein and not for a potato enzyme, even though admittedly potatoes are pretty dump when you compare them to muscles. So we decided, well, why don’t we take a crack at this problem, try to find out what is happening. And Ed had at first some hesitations: we might start working on phosphorylase, and at that time postdocs, when they left a lab or students when they left a lab, did not work on the problem that the mentor was going on in the lab. And then I got thinking about it and five years since I was in that laboratory, certainly it may not have been permissible if we worked together. Well, I can tell you we never found out either what AMP was, we never solved that problem, for that we had to wait 8 years for Jacques Monod, Jeffrey Wyman and Jean-Pierre Changeux at the Pasteur institute to come up with a remarkable allosteric model of enzyme regulation, but what we rapidly found out is actually the enzyme was regulated by a totally different kind of mechanism. So, okay, we decided to start working on that, we cleared a corner of a bench in the lab and we started working much more like two friends than like two colleagues in a department. And the first thing we had to do is to purify phosphorylase, using the classical procedure of Cori, it was pretty archaic. It consisted in taking some rabbit muscle, grinding it, extracting it in water, putting this mess in a cheese cloth, you squeezed it, and then filtering the very turbid solution extract that came out through a huge battery of filter paper. Gerty Cori always said you have to work very, very fast, otherwise active and native phosphorylase will be degraded to the inactive B form. So they had this huge, I don’t know 15, 20 filter papers, those were really the good old days of biochemistry, in fact here’s a picture of our lab. You see Ed Kreb standing here under the top hat. So we decided, you know, enough with that jazz, let’s go modern and replace the paper filtration by a centrifugation. It’s true that no good centrifuge existed at the time of the Cori but Sorvall had came up with a large quantity refrigerated centrifuge. So we centrifuge our extracts rather than filtered them, but as fast as we could work, as cleanly as we could work, we could never obtain active phosphorylase A, only the degraded B form. So in desperation we said, you know, we have to go back to Cori’s procedure, paper filtration and all. And to our enormous surprise, this is what we found, that the very first extract coming out of the muscle was not active phosphorylase, as we had expected, but inactive phosphorylase B. And yet when that extract was filtered through filter paper, it was converted to phosphorylase A. Now let me tell you, speaking of a deception, this would be to put it mildly, you know, as two young investigators we thought we’ll discover the very sophisticated mechanism of regulation, maybe a new cofactor, what not, paper filtration to activate an enzyme... the fact that in those days all filtered papers were contaminated by trace amounts of calcium ions and the extract went through sufficient number of filtration that it picked up enough calcium to bring about the conversion. If the papers were washed with dilute acid, no conversion took place. Finally we even took a bunch of paper, we ashed them in a furnace and rather than filtering, we just sprinkled the ashes: Bingo, conversion. And then, very rapidly after that, it was clear that calcium wasn’t act alone, but that ATP was also required. So that strongly suggested that we were dealing with a phosphorylation reaction, but we didn’t know what had become phosphorylated. In those days, you didn’t have any ATP 32, you had to synthesise the damn thing yourself, but we knew that Art Kornberg, a friend of us in St. Louis, had synthesised some ATP 32 that he needed for his biosynthesis of the beautiful work on biosynthesis of DNA. So we called Art on the phone, he immediately sent us some 8 gamma-label ATP 32, we could show it was incorporated into a protein fraction which we could isolate, and it turned out to be phosphorylase. So for the first time we could propose that the regulation of phosphorylase occurred like so, inactive phosphorylase, in the presence of calcium, magnesium and ATP, was become phosphorylated and activated by an enzyme which we called phosphorylase kinase, and therefore the reverse reaction had to be catalysed by a phosphorylase phosphathase, and bingo, we sent the manuscript to the JBC… and I think there were five or six people in the country who reviewed all of the papers that were submitted to the Journal of Biological Chemistry. And I do remember that when Ed and I sent in our first paper on phosphorylase, we were aware of the fact that Carl Cori was one of the five or six editors of the Journal of Biological Chemistry. And so, when we sent in our first paper on phosphorylase, we knew that he would see it and we had faith, which was justified that he would not take advantage of seeing that paper and he didn’t. He himself was very excited by our findings. Well, by today’s standard, this reaction I just gave you would be considered totally trivial, absolutely simple. But when we came up with it in the mid ‘50s, it came up as an enormous surprise because in those days people knew just about nothing about phosphoproteins, only two had been characterised: Casein from milk, ovavitellin from egg yolk, and their only function was for the feeding of the young, and they were thought to be devoid of any biological activity and totally dismissed as nonentities. But that reaction I showed you turned out to be a little bit more complicated, as soon as we began purifying the elements of the reaction, particularly when we began purifying phosphorylase kinase and adding that as a substrate. It was clear that with the purified system calcium could not act in that reaction. And yet it was totally needed when crude extracts were used - crude extracts, where you have a lot of phosphorylase B, a lot of phosphorylase kinase or with magnesium ATP - no conversion took place unless calcium was added. And the only possibility was that phosphorylase kinase, just like phosphorylase, also existed in an inactive and active form. And that perhaps calcium might be involved for that reaction, and that turned out to be correct. In the presence of calcium ions phosphorylase kinase become phosphorylated and activated, and then it can act on phosphorylase. So we had already the beginning of a cascade of one enzyme acting on another enzyme. Note that exactly at the same time Earl Sutherland and his group, Wally Wosilait, Ted Rall had arrived to the same conclusion. Working with liver rather than muscle phosphorylase, they had shown that when liver active phosphorylase was incubated with another liver fraction, some inorganic phosphate was being produced. But an epochal finding that grew from those studies were the discovery of cyclic AMP, as I told you. And Earl was a very good friend, and Ted Rall, we met at every federation meeting, and they didn’t know how cyclic acted, they knew that it increased the amount of active phosphorylase, so they immediately sent us a sample of cyclic AMP and we could show that it acted on the activation, either, we didn’t know, either by accelerating the rate of autophosphorylation or perhaps acting on yet another kinase, for which we wanted of a better term, we called it a kinase, kinase. And that hypothesis turned out to be correct by the isolation four years later of the cyclic AMP dependent protein kinase by Ed Krebs and Don Walsh. And since by that time Sutherland’s group had elucidated the production of cyclic AMP at the membrane, the entire cascade for the degradation of glycogen was established. We were very interested in the fact that calcium was involved in that reaction, because the physiologists knew for a very long time that calcium, released as a result of a nerve impulse, could trigger muscle contraction. Our finding with people in physiology, Glenn Kerrick, that exactly the same concentration of calcium that triggered contraction, would trigger glycolysis but activating the phoskinase, phosphorylase, glycolysis, bringing about the formation of ATP needed to maintain contraction showed how two different physiological processes could be regulated in concert. At that time we had no idea whether or not this phosphorylation reaction we had observed was restricted to maybe a couple of enzyme, of a carbohydrate metabolism. We wondered, for instance, are the enzymes responsible for the regulation of nitrogen metabolism? Are they maybe regulated by amidation, deamidation, the enzymes of fat metabolism, perhaps by acetylation, deacetylation? And our luck really was that, as you well know, phosphorylation is one of the most prevalent means of cellular regulation being involved in the control of carbohydrate metabolism, gene transcription, translation, immune response, differentiation, cell cycle, etc, so that incidentally now you could replace phosphorylation by ubiquitination, and you would have exactly the same picture, I can sell that picture to you if you want. And it’s involved in a number of hereditary, bacterial, viral diseases and things like that, just it’s involved, of course, in diabetes or Alzheimer, Parkinson, chronic myelogenous leukemia, bacterial diseases such as cholera and plague, viral diseases such as smallpox, and increasingly now involved in cancer. Just as an example, the enormous virulence of Yersinia pestis, the agent responsible for bubonic plague, the “black death”, that wiped out a good proportion of the human population in centuries past, is due to the fact that the bacterium injects in the host cell a tyrosine phosphortase that immediately brings a catastrophic set of tyrosine dephosphorylation that totally wipes out the immune defence of the cell. If you delete that enzyme from the bacterium, as done by Jack Dixon, it becomes harmless, non-pathogenic. Ed and I were often asked whether or not we realised at the beginning that we had stumbled on a very ubiquitous and therefore very fundamental reaction. Absolutely not, we thought it was a nice system, we thought it was an interesting one, we stayed with it, but we never could have guessed the enormous development that occurred. In fact, in those days everybody was thinking about allostery of Jacque Monod, or the induced fits of Danny Koshland, as just mentioned a moment ago by Tom Steitz. In fact, at meetings one wondered, is this system regulated by the allosteric system of Monod or the induced fit system of Danny Koshland. And Jacque Monod, who was really a very close friend of mine, never believed for one second that covalent regulation could play a major role in cell regulation. With his death, 35 years ago, and then that of Danny Koshland, showed on the left - that was a meeting in the ‘60s, on the right you have Hans Krebs, the guy responsible for the Krebs cycle and P. P. Cohen in the middle we really have experienced the end of an extraordinary era. Thank you very much.

Ich freue mich außerordentlich bei Ihnen zu sein und mit Studenten sprechen zu können. Ich glaube, ich bin jetzt zum neunten Mal in Lindau. Ich bin überaus gerne hier, und ich würde es um nichts in der Welt verpassen wollen. Was ich heute tun möchte, ist Folgendes: Ich möchte Ihnen einen kurzen historischen Abriss der Arbeit geben, die ich zusammen mit meinem lebenslangen Freund und Kollegen Ed Krebs zur Erforschung der Glykogenphoshorylase durchgeführt habe, in deren Verlauf wir die reversible Proteinphosphorylierung entdeckt haben. Ed ist leider von anderthalb Jahren gestorben, weshalb ich einige kurze Videoaufnahmen wiedergeben möchte, auf denen er spricht. Es handelt sich dabei um Teile eines Gesprächs, in dem wir unsere frühen Arbeiten diskutieren. Wie Sie sehen werden, ist die Reaktion, die wir gefunden haben, beschämend einfach, und niemand würde ihr viel Beachtung geschenkt haben, wenn sich nicht herausgestellt hätte, dass sie für die Regulierung der Abläufe in der Zelle absolut entscheidend ist. Andererseits muss man fairerweise sagen, dass es eine große Überraschung war, als wir das Ergebnis unserer Arbeit vorstellten, weil man damals noch fast nichts über die Regulierung der Abläufe in der Zelle wusste. Lassen Sie mich Ihnen, um dies in den richtigen Kontext zu stellen, erzählen, was vor etwa 55 Jahren, als wir unsere Arbeit begannen, der Stand der Dinge war. Erstens wären Begriffe Signalisierung oder Signaltransduktion nicht verstanden worden: Sie waren noch ohne Bedeutung. Und zweitens bewegte sich die Endokrinologie, obwohl sie sich bereits als Fachgebiet etabliert hatte, auf einer rein phänomenologischen Ebene. Sie beschäftigte sich größtenteils noch mit dem Gesamtorganismus. Man kannte einige Hormone, die Informationen von einem Organ auf ein anderes übertrugen und eine Art von physiologischer Reaktion hervorriefen. So wusste man beispielsweise, dass Insulin ein Botenstoff ist, der den Kohlenhydratstoffwechsel steuert, und dass Adrenalin ein gleichartiger Botenstoff ist. Die Wirkung dieser Hormone konnte man jedoch nur bis zur Zellwand verfolgen: Was danach geschah, war völlig unbekannt. Es war unvorstellbar, dass Hormone in einem zellfreien System wirken könnten, bis Earl Sutherland und Ted Rall, wie sie gestern von Ferid Murad erfahren haben, die umwerfende Entdeckung machten, dass zyklisches AMP als zweiter intrazellulären Botenstoff für die Wirkung von Adrenalin fungiert. Zweitens wurde die Wissenschaft damals auf völlig andere Art und Weise betrieben, als dies heute der Fall ist. Seit den Zeiten von Claude Bernhard, des französischen Physiologen, der als erster die glykogenische Funktion der Bauchspeicheldrüse bewies, beobachtete man ein physiologisches Phänomen und versuchte anschließend die Faktoren Heute ist es hingegen in der Regel umgekehrt: Zuerst werden Enzymproteine entdeckt, und bei – ich weiß nicht wie vielen – Projekten zur Sequenzierung des Genoms werden Hunderte von ihnen entdeckt. Anschließend versucht man dann, durch ihre Überexpression oder indem man sie eliminiert oder hinzufügt, ihre Funktion zu entschlüsseln. Um es in Worten auszudrücken, die denen von Pirandello ähnlich sind: Wir begannen damit, für sechs Funktionen ein Enzym zu suchen, und hatten schließlich Hunderte von Enzymen und Proteine, deren Funktion wir zu entdecken versuchten. Und wie ich bereits sagte, verstand man so gut wie nichts über die Zellregulierung. Nach der vorherrschenden Auffassung wurden die Enzyme durch die Rate reguliert, mit der sie synthetisiert wurden und dann wieder zerfielen. Diese Annahme hielt sich bis in die späten 1940er Jahre und vielleicht sogar bis in die frühen 1950er Jahre, als man erkannte, dass dies nicht der Fall sein konnte. Es konnte nicht so verhalten, weil diese Prozesse zu langsam abliefen. Es war klar, dass Zellen über Mechanismen verfügen mussten, die die Aktivität der Enzyme abwandeln, nachdem sie hergestellt und im Inneren der Zelle freigesetzt worden waren. Sie mussten über die Fähigkeit verfügen, auf die Umwelt sowie auf die Anforderungen des Stoffwechsels zu reagieren, die sich aufgrund eines beliebigen inneren oder äußeres Signal ergaben, das die Zellen erhielten. Dies war das große Problem, mit dem die Biologen, die Biochemiker dieser Zeit konfrontiert waren, und zu dessen Lösung ich mit meinem Freund Ed Krebs einen Beitrag leisten wollte. Wir wollten verstehen, wie ein wichtiges Enzym namens Glykogenphosphorylase reguliert wurde. Tatsächlich war es ein sehr wichtiges Enzym, denn Coris in St. Louis und andere hatten gezeigt, dass es ein Katalysator für diejenigen Schritte des Kohlenhydratstoffwechsels war, der seine Geschwindigkeit begrenzte. Dies ist der erste Schritt des in der Leber ablaufenden Abbaus von Glykogen zur Gewinnung von Blutzucker (wahrscheinlich ist es die wichtigste Funktion der Leber) und dann zur Gewinnung von ATP, als Ergebnis des Kohlenhydratenergiestoffwechsels in jedem Gewebe des Körpers. Das Enzym Phosphorylase war ein attraktives Forschungsobjekt, denn es war bereits wohlbekannt, dass es einer komplizierten hormonalen Steuerung unterlag. Im Ruhezustand ist es fast völlig inaktiv und nur sehr wenig Glykogen wird aufgespalten. Sobald man jedoch einen höheren Blutzucker- oder ATP-Spiegel benötigt, weil man unterzuckert ist oder sich körperlich anstrengt, wird es augenblicklich durch Adrenalin aktiviert. Und von Adrenalin wusste man, dass es in Situationen freigesetzt wird, die der Physiologe Cannon in den 1920er Jahren als solche beschrieben hatte, in denen sich ein Tier zum Kampf oder zur Flucht vorbereitet, wenn es sich in Notsituationen befindet, wie hier beschrieben wurde. Wenn Sich ein Mensch in einer bedrohlichen Situation befindet, wird ein Stresssignal an das Gehirn gesendet und das Gehirn befiehlt den Nebennieren sofort, Adrenalin herzustellen, das dann in allen Geweben des Körpers verteilt wird. Und Sie wissen sicherlich alle, was geschieht, wenn Sie einen Adrenalinstoß oder –schub erhalten: Die Herzfrequenz steigt, ja das Herz schlägt wie verrückt, der Blutdruck steigt, die Atmung wird intensiver. Wenn ein Organismus jedoch kämpfen oder fliehen muss, wie es hier beschrieben ist, muss zu allererst auf die Schnelle ATP produziert werden. Sind hingegen die Glukose- und ATP-Speicher voll, wie zum Beispiel nach einer üppigen Mahlzeit, dann ist die Aktivität der Phosphorylase durch die Freisetzung von Insulin gehemmt, von dem man damals wusste, dass es zur Ablagerung von Glukose in Form von Glykogen führt, allerdings durch einen Mechanismus, der völlig unbekannt war, bis Luis Leloir aus Argentinien seinen Mechanismus vorstellte, den wir den Leloir-Stoffwechselpfad nennen und an dem Glykogensynthase beteiligt ist. Und dann auch noch ein drittes Hormon: Glykagon. Man kannte es als eine Verunreinigung von Insulin, die viele Jahre lang vergessen wurde, bis Christian de Duve, von dem Sie wenig später noch mehr hören werden, das Hormon – sagen wir reaktiviert hatte. Jedenfalls war klar, dass das Glukosegleichgewicht durch das Zusammenspiel der antagonistischen Wirkung dieser verschiedenen Hormone reguliert wurde, und daher war klar, dass die Phosphorylase eine zentrale Rolle bei diesen Reaktionen spielen musste. Dies ist ein Foto von Luis Leloir: Ich glaube es wurde in der Mitte der 1960er Jahre in Mexiko City aufgenommen. Im Hintergrund sehen Sie die Pyramide, neben diesem gutaussehenden jungen Mann. Okay. Die Phosphorylase, das zentrale Enzym, wurde Mitte der 1930er Jahre von Parnas in Polen und von Carl und Gerty Cori gefunden, einem aus einem Ehepaar bestehenden Team. Als man es entdeckte, wusste man, dass es völlig inaktiv war, wenn man keine Adenylsäure, AMP, hinzufügte, und man nahm logischerweise an, dass es die Funktion eines Koenzyms habe. Diese Annahme hielt sich bis 1943, als eine junge Frau in Coris Labor, Arda Green, Phosphorylase kristallisierte, allerdings in einer neuen Form. Es handelte sich um eine neue Form, weil sie aktiv war, ohne dass es dazu AMP bedurfte. Die Coris nannten diese Form Phosphorylase A und zogen den sehr logischen Schluss, dass AMP in dieser Form kovalent an das Protein gebunden war, als sogenannte prosthetische Gruppe. Sie nahmen ferner an, es handele sich hierbei um die native Form des Enzyms in Muskelgewebe, denn wenn man Muskelextrakte eine Weile stehen ließ, wurde es schnell wieder in die alte Form umgewandelt, die sie jetzt als Phosphorylase B bezeichneten, die Form, die zur Aktivierung AMP benötigte. Es handelte sich also um eine absolut logische Hypothese. Doch wenn sie zutraf, würde AMP bei dieser Reaktion entstehen müssen, und sie fanden keins. Außerdem konnten Sie, unter Verwendung der damals empfindlichsten biologischen Analysemethoden, im nativen Enzym keine Adenin, keine Ribose und kein AMP finden. Die Coris wussten also, dass die Phosphorylase in zwei Formen existierte, doch sie hatten keinerlei Vorstellung davon, auf welche Weise sich diese beiden Formen voneinander unterschieden, und sie gingen – was wir uns nach heutigen Standards kaum vorstellen können – dem Problem nicht weiter nach. Nun, zunächst möchte ich Ihnen Fotos von Carl und Gerty Cori bei der Entgegennahme des Nobelpreises im Jahre 1947 zeigen, und dann ein Foto, das ich von Carl gemacht habe, als wir zusammen wanderten. Es entstand Mitte der 1960er Jahre, in der Nähe von Seattle am Fuß von Mount Rainier. An diesem Punkt kamen Ed und ich ins Bild. Wir begannen diesem Problem nachzugehen, als wir 1953 in der gleichen Abteilung für Biochemie an der Universität Washington arbeiteten. Ed hatte eine Postdoc-Stelle bei den Coris. Also nahm er wie sie – und die meisten anderen Leute – an, dass AMP eine Art Koenzym der Phosphorylase sei. Ich hatte meine Doktorarbeit an der Universität Genf bei Kurt Meyer geschrieben. Wir untersuchten verschiedene amylolytische Enzyme. Unter anderem war es uns gelungen, Phosphorylase aus Kartoffeln zu isolieren, und sie war aktiv, ohne hierzu AMP zu bedürfen. Und obwohl die Biochemie in den 1950er Jahren noch in ihren Kinderschuhen steckte, reichten die Erkenntnisse aus, um zu wissen, dass Koenzyme konservativ sind. Es war daher sehr unwahrscheinlich, dass AMP als Koenzym für Muskelprotein diente, jedoch nicht für eine Kartoffelenzym, obwohl Kartoffeln, verglichen mit Muskeln, zugegebenermaßen ziemlich dumm sind. Also trafen wir die Entscheidung, uns dem Problem zu verschreiben, festzustellen, wie die Dinge sich in Wahrheit verhielten. Ed war zunächst etwas zögerlich: Tatsache war, dass ich im Labor der Coris gearbeitet hatte, und hier – nur knapp 5 Jahre später – sollten wir anfangen, über Phosphorylase zu arbeiten. Damals war es nicht üblich, dass Postdocs oder Studenten, wenn sie ein Labor verließen, über das Problem ihres Mentors arbeiteten. Doch dann dachte ich darüber nach: Es war fünf Jahre her, seit ich das Labor verlassen hatte. Sicherlich wäre es nicht zulässig gewesen, wenn wir noch Seite an Seite gearbeitet hätten. Nun ja, ich kann Ihnen sagen, dass auch wir nicht herausfanden, was AMP ist. Dieses Problem haben wir nie gelöst. Dafür mussten wir noch 8 Jahre auf Jacques Monod, Jeffrey Wyman und Jean-Pierre Changeux am Pasteur-Institut warten, die das bemerkenswerte allosterische Modell der Enzymregulation entdeckten. Doch was wir sehr bald erkannten war, dass das Enzym tatsächlich durch einen völlig anderen Mechanismus reguliert wurde. Also okay, wir entschlossen uns, über dieses Problem zu arbeiten. Wir räumten eine Ecke auf einem Labortisch frei und begannen unsere Arbeit mehr wie zwei Freunde als zwei Kollegen in einer Forschungsabteilung. Das erste, was wir tun mussten, war Folgendes: Wir mussten Phosphorylase in einer reinen Form gewinnen, unter Verwendung des klassischen Verfahrens der Coris. Es war ziemlich archaisch. Es bestand darin, dass man etwas Muskelfleisch eines Kaninchens zerkleinerte, in Wasser extrahierte, diesen Matsch in ein Stofftuch wickelte, ausquetschte und dann dieses höchst „schmutzige“ Lösungsextrakt durch eine Batterie von Filterpapier reinigte. Gerty Cori sagte immer, dass man sehr, sehr schnell arbeiten müsse, da ansonsten die aktive und native Phosphorylase zur inaktiven B-Form zerfällt. Sie hatten diese riesigen Papierfilter – ich weiß nicht mehr genau wie viele: es mögen 15 oder 20 gewesen sein. Es war die gute alte Zeit der Biochemie. Hier ist ein Foto unseres Labors. Hier sehen Sie Ed Krebs mit seinem Zylinder. Wissen Sie, wir kamen dann zu dem Entschluss: genug mit diesem ganzen Theater. Lass’ uns zu moderneren Methoden greifen und die Papierfilter durch eine Zentrifuge ersetzen. Es stimmt, dass es zur Zeit der Coris noch keine gute Zentrifuge gab, doch Sorvall hatte eine gekühlte Zentrifuge für große Volumina entwickelt. Also zentrifugierten wir unsere Extrakte statt sie zu filtern. Doch so schnell und so sauber wir auch arbeiteten: Es gelang uns nie, aktive Phosphorylase A zu gewinnen, nur die degradierte B-Form. Verzweifelt sagten wir uns: Wir müssen wieder zum Verfahren der Coris zurückkehren, zur Papierfilterung und allem, was damit zusammenhing. Und zu unserer riesigen Überraschung fanden wir Folgendes heraus: Das erste Muskelextrakt enthielt keine aktive Phosphorylase, wie wir vermutet hatten, sondern inaktive Phosphorylase der B-Form. Und dennoch wurde sie, wenn das Extrakt durch das Papier gefiltert wurde, in Phosphorylase A umgewandelt. Ich will Ihnen sagen: Selbsttäuschung wäre untertrieben. Als zwei junge Forscher glaubten wir, wir würden den höchst komplizierten Mechanismus der Regulation entdecken, vielleicht einen neuen Kofaktor, was auch immer: Papierfilterung zur Aktivierung eines Enzyms... Doch bald zeigte sich, dass es nicht die Filterung war, die zur Aktivierung führte, sondern die Tatsache, dass damals alle Filterpapiere mit Spuren von Kalziumionen verunreinigt waren, und das Extrakt passierte genug Filter, dass es genug Kalzium aufnahm, um die Umwandlung herbeizuführen. Wenn die Filterpapiere mit verdünnter Säure gewaschen wurden, kam es zu keiner Umwandlung. Zum Schluss nahmen wir sogar einiges Filterpapier, verbrannten es in einem Ofen, und statt das Extrakt zu filtern, streuten wir einfach etwas Asche darauf. Und siehe: Es kam zu einer Umwandlung. Und es dauerte nicht lange, bis klar wurde, dass Kalzium nicht alleine wirksam war, sondern dass ATP ebenfalls erforderlich war. Dies deutete stark darauf hin, dass wir es mit einer Phosphorylierungsreaktion zu tun hatten, doch wir wussten nicht, das phosphoryliert worden war. Wir hatten damals noch kein ATP 32, sodass man das verdammte Zeug selbst synthetisieren musste. Doch wir wussten, dass Art Kornberg, ein Freund von uns in St. Louis, etwas ATP 32 synthetisiert hatte, das er für seine Biosynthese benötigte, für seine wunderbaren Arbeiten zur Biosynthese der DNA. Wir riefen also Art an, und er schickte uns sogleich etwas gamma-label ATP 32. Es gelang uns zu zeigen, dass es in einen Proteinanteil integriert wurde, den wir isolieren konnten, und er stellte sich als Phosphorylase heraus. Wir konnten daher erstmals vorschlagen, dass die Regulierung der Phosphorylase auf folgende Weise geschieht: Inaktive Phosphorylase wurde in Gegenwart von Kalzium, Magnesium und ATP phosphoryliert und durch ein Enzym aktiviert, das wir als Kinase der Phosphorylase-Kinase bezeichneten. Die Umkehrreaktion musste daher durch eine Phosphorylase-Phosphathase katalysiert werden. Es war ein Volltreffer, und wir schickten das Manuskript an das JBC (Journal of Biological Chemistry) Ich weiß, dass der Redaktionsrat des Journal of Biological Chemistry für unsere ersten Erfahrungen sehr klein war, und ich glaube, es gab fünf oder sechs Leute im Land, die alle Artikel begutachteten, die dem Journal of Biological Chemistry eingereicht wurden. Und ich erinnere mich daran, dass Ed und ich uns bewusst waren, als wir unseren ersten Aufsatz über Phosphorylase eingereicht hatten, dass Carl Cori einer der fünf oder sechs Gutachter des Journal of Biological Chemistry war. Und als wir also unseren ersten Aufsatz über Phosphorylase eingereicht hatten, wussten wir, dass er ihn lesen würde und wir vertrauten darauf – zu Recht, wie sich zeigen sollte –, dass er sich die Kenntnis unseres Aufsatzes nicht zunutze machen würde, und er tat es nicht. Er selbst fand unsere Entdeckung äußerst faszinierend. Nun, nach heutigen Maßstäben würde man die Reaktion, die ich Ihnen beschreiben habe, völlig trivial finde, absolut einfach. Doch als wir damit in der Mitte der 1950er Jahre hervortraten, war es eine riesige Überraschung, da man damals so gut wie nichts über Phosphoproteine wusste. Nur zwei hatte man beschrieben: Casein aus der Milch und Ovavitellin aus dem Eigelb, und ihre einzige Funktion war die eines Nährstoffs für Jungtiere. Man dachte nicht, dass sie irgendeine biologische Funktion haben und missachtete sie als belanglos. Doch sobald wir ihre Elemente in reiner Form gewannen, erwies sich diese Reaktion, die ich Ihnen gezeigt habe, als etwas komplizierter, besonders als wir begannen, reine Formen der Phosphorylase-Kinase zu gewinnen und sie als Substrat hinzuzufügen. Es war klar, dass in dem gereinigten System Kalzium an dieser Reaktion nicht beteiligt sein konnte. Und dennoch war es unerlässlich, wenn man noch ungereinigte Extrakte verwendete – ungereinigte Extrakte, in denen sehr viel Phosphorylase B, sehr viel Phosphorylase-Kinase mit oder ohne Magnesium ATP vorhanden war. Wenn man kein Kalzium hinzufügte, fand keine Unwandlung statt. Die einzig mögliche Antwort auf dieses Problem war, dass auch die Phosphorylase-Kinase, genauso wie die Phosphorylase, in einer inaktiven und einer aktiven Form existiert, und dass Kalzium möglicherweise an dieser Reaktion beteiligt war. Diese Hypothese erwies sich als zutreffend. In Gegenwart von Kalziumionen wurde Phosphorylase-Kinase phosphoryliert und aktiviert, und dann konnte sie auf die Phosphorylase einwirken. Somit hatten wir den Beginn einer Kettenreaktion eines Enzyms, das auf ein anderes einwirkt. Beachten Sie, dass genau zur gleichen Zeit Earl Sutherland und seine Arbeitsgruppe, Wally Wosilait, Ted Rall, zur selben Schlussfolgerung gelangt waren. Sie arbeiteten mit Phosphorylase aus der Leber statt aus Muskelgewebe. Sie konnten Folgendes zeigen: Wenn man aktive Leber-Phosphorylase mit einem anderen Leberextraktanteil inkubierte, entstanden einige anorganische Phosphate. Doch eine epochale Entdeckung, die aus diesen Studien hervorging, war die Entdeckung von zyklischem AMP, wie ich Ihnen bereits sagte. Und Earl war ein sehr guter Freund, ebenso Ted Rall. Wir begegneten uns auf jedem Treffen des Verbandes. Sie wussten nicht, wie das zyklische AMP reagierte. Sie wussten [nur], dass es die Menge der aktiven Phosphorylase vergrößerte. Sie schickten uns sogleich eine Probe des zyklischen AMP und wir konnten zeigen, dass es eine Rolle bei der Aktivierung spielte: entweder – wir wussten es nicht – indem es die Rate der Autophosphorylierung erhöhte, oder vielleicht indem es auf noch eine weitere Kinase einwirkte, die wir in Ermangelung eines besseren Namens als „Kinase-Kinase“ bezeichneten. Vier Jahre später erwies sich diese Hypothese durch die Isolierung der von zyklischem AMP abhängigen Proteinkinase durch Ed Krebs und Don Walsh als korrekt. Und da zum damaligen Zeitpunkt Sutherlands Arbeitsgruppe die Synthese von zyklischem AMP an der Zellmembran aufgeklärt hatte, war die gesamte Kettenreaktion zum Abbau von Glykogen erforscht. Es interessierte uns sehr, dass Kalzium an der Reaktion beteiligt war, denn die Physiologen wussten seit sehr langer Zeit, dass Kalzium, wenn es als Ergebnis eines Nervenimpulses freigesetzt wurde, eine Muskelkontraktion auslösen konnte. Unsere Entdeckung mit Leuten aus der Physiologie, Glenn Kerrick, dass genau dieselbe Konzentration von Kalzium, die zu einer Kontraktion führt, die Glykolyse auslöste, indem sie die Phosphokinase, die Phosphorylase und die Glykolysis aktivierte und auf diese Weise zur Bildung des ATP führte, das zur Aufrechterhaltung der Kontraktion benötigt wurde, zeigte, wie zwei verschiedene physiologische Prozesse gemeinsam reguliert werden konnten. Zum damaligen Zeitpunkt hatten wir keine Vorstellung davon, ob diese von uns beobachtete Phosphorylierungsreaktion vielleicht nur auf ein paar Enzyme eines Kohlenhydratstoffwechselprozesses beschränkt war. So fragten wir uns beispielsweise, ob die Enzyme für die Regulierung des Stickstoffstoffwechsels verantwortlich sind. Werden sie vielleicht durch Amidierung, Deamidierung, die Enzyme des Fettstoffwechsels, vielleicht durch Acetylierung oder Deacetylierung gesteuert? Und unser Glück bestand darin, dass – wie Sie genau wissen – die Phosphorylierung einer der häufigsten Mechanismen der Steuerung der Abläufe in der Zelle ist. Sie ist beteiligt an der Steuerung des Kohlenhydratstoffwechsels, der Gentranskription, der Gentranslation, der Immunreaktion, der Differenzierung, dem Zellzyklus etc., sodass man – nebenbei gesagt – statt von Phosphorylierung von Ubiquitinierung reden könnte. Und man würde genau das gleiche Bild erhalten. Wenn Sie möchten, kann ich Ihnen dieses Bild verkaufen. Außerdem ist die Phosphorylierung an einer Reihe von Erbkrankheiten sowie an bakteriellen und viralen Erkrankungen und ähnlichen Phänomenen beteiligt, ebenso wie sie natürlich bei Diabetes, Alzheimer, Parkinson, chronischer myelogener Leukämie, Bakterieninfektionen wie Cholera und der Pest und bei Virenerkrankungen wie den Pocken eine Rolle spielt. Man erkennt auch immer deutlicher, welche Bedeutung ihr bei Krebs zukommt. Um nur ein [weiteres] Beispiel zu nennen: Die ungeheure Virulenz von Yersinia pestis, dem Erreger der Beulenpest bzw. des „Schwarzen Todes“, dem in vergangenen Jahrhunderten ein Großteil der Menschen zum Opfer fiel, beruht darauf, dass das Bakterium ein Tyrosinphosphat in die Wirtszellen injiziert, das augenblicklich zu einer Reihe katastrophaler Tyrosindephosphorylierungen führt, die die Immunabwehr der Zelle vollständig zerstören. Wenn man dieses Enzym aus dem Bakterium entfernt, wird es vollkommen harmlos und löst keine Krankheit mehr aus, wie Jack Dixon gezeigt hat. Ed und ich wurden oft gefragt, ob uns zu Beginn unserer Arbeit klar war, dass wir eine allgegenwärtige und daher äußerst grundlegende Reaktion gefunden hatten. Ganz und gar nicht: Wir dachten, es sei ein elegantes System, wir hielten es für interessant, wie arbeiteten weiter darüber, doch wir hätten die enorme Entwicklung, die dann stattfand, niemals vorausahnen könne. Tatsächlich standen damals im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit der meisten Leute die von Jacques Monod entdeckten allosterischen Effekte oder die induzierte Anpassung [„induced fit“] von Danny Koshland, die vorhin von Tom Seitz erwähnt wurden. Ja, bei Konferenzen fragte man sich, ob dieses System durch das allosterische System von Monod oder die induzierte Anpassung von Danny Koshland gesteuert wurde. Und Jacques Monod, mit dem ich wirklich eng befreundet war, glaubte keinen Augenblick, dass eine kovalente Regulierung eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Zellabläufe spielen könnte. Mit seinem Tod vor 35 Jahren und dann dem Tod von Danny Koshland, der hier links zu sehen ist und P. P. Cohen in der Mitte – mit Dannys Tod vor 5 Jahren und dann jetzt mit dem von Ed Krebs vor nur 2 Jahren haben wir das Ende einer wirklich außergewöhnlichen Ära erlebt. Ich danke Ihnen sehr.

Edmond Fischer (2011)

Protein Cross Talk in Cell Signaling

Edmond Fischer (2011)

Protein Cross Talk in Cell Signaling

Abstract

The main focus of the talk will be on signaling by tyrosine phosphorylation, which has been directly implicated in the regulation of cell growth, differentiation and transformation. External signals coming in the form of mitogenic hormones and growth factors act on transmembrane receptors that are themselves tyrosine kinases. These, in turn, transduce the signals with the help of a variety of adapter or docking proteins that interact with one another in a tinker-toy sort of way, through a diversity of binding domains, thereby initiating different signaling pathways. Some of the properties of these modules will be detailed. The src-homology 2 domain (SH2), in addition to allowing adapter or linker proteins to bind to activated receptors, can also serve as an internal conformational switch to regulate the activity of various enzymes. The PH domain recruits protein to the membrane while the PDZ domain which is usually found in multiple copies within a protein serves mainly to cluster ion-channels and receptors on the membrane, and bridge them to the cytoskeleton. Transmembrane protein tyrosine phosphatases, which catalyze the reverse reaction, also have a modular structure, often containing immunoglobulin-like and/or fibronectin type III repeats. Surprisingly and contrary to the tyrosine kinase growth factor receptors that respond mainly to circulating ligands, the tyrosine phosphatase receptors display all the hallmarks of cell adhesion molecules. This would suggest that they are involved in, or regulated by, cell-cell or cell-matrix interaction, with the exciting possibility that they might be directly implicated in contact inhibition. Tyrosine phosphatases do not act unidirectionnally. They are not merely scavenger enzymes, present only to remove the phosphate groups introduced by the kinases. Under certain circumstances, they can act synergistically with the kinases to enhance a cellular response. Some of the problems that confront us in the field of cell signaling and remain to be solved will be summarized.

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