Gerald Edelman (1984) - The one-dimensional code and the four-dimensional animal: some molecular bases for embryonic form

Gerald Edelman came to Lindau with a fascinating story about the discovery of CAMs, Cell Adhesion Molecules. By sticking to the surface of cells, these molecules guide the processes by which cells bind with other cells

Count Bernadotte, my colleagues, distinguished guests, fellow students, ladies and gentlemen. It's a very great privilege to be here and to have the opportunity to talk in this company and particularly under the warm hospitality of our hosts in Lindau. And I’m very grateful. I want to talk about the work in my laboratory over the last ten years in the field of developmental biology. Not so much as work in itself but as an example of some ground questions of biology. Whenever I discuss this subject I have considerable degree of embarrassment I must say, it’s an extraordinarily difficult subject at one level. And I always try to make an arrangement or a pact with the audience. And rather than to go into the legal arrangements of that pact before you, I would just like to exemplify it by telling you the story of two tourists who came to a foreign land and on their first night in a new city decided to go to a nightclub where they sat down and heard a comedian telling one line jokes. One of the tourists fell off the chair laughing and the other looked down and he said And he looked up and he said “I trust these people”. What I would like to say in the beginning is that there are two major problems in developmental biology. The first I shall call the developmental genetic problem, how can a one-dimensional genetic code specify the shape of a three-dimensional animal in time? And the second problem I shall call the evolutionary problem. How whatever the solution to the first problem can it be that that solution is compatible with the fact that over very short periods of evolutionary time the radiation of a taxon or a class or even a species can change in form very rapidly. Both of these issues were the great concern of Haeckel and de Beer and the questions of the relationship between ontogeny and phylogeny that they broached upon are still with us. And indeed I would like to say constitute together the central unsolved problem of modern biology. The key issue is to understand the central importance of place or position during ontogeny, the recognition by a cell of its particular position in historical sequence. Now two strategies may be adopted to attack this problem. The first has already a considerable and distinguished history. That is to search for genes regulating structures or their repetitions such as those found in drosophila: the so-called homeotic genes or homeotic mutations, which control or define particular structures during development for example the repetition of the thorax or the replacement of the antenna with a leg-like structure. Undoubtedly this particular strategy shall yield deep inside into the questions that I have raised. But there’s an alternative strategy and it is the one that I would like to talk about today. I would like to discuss the discovery of several new molecules related to that strategy. In this strategy one may attempt to define a molecule that is known to exert a specific function in morphogenesis, to trace its function and then look at the sequence of its temporal expression and finally go back to the gene. And see what this means for these two fundamental questions that I raised. As I said this is of course the strategy of which I wish to speak but although I hope to make a global survey I hope you don’t think that I have the presumption to think that the questions I raised are answered. Indeed what I’d like to do instead since these questions of morphogenesis take their most exquisite form in the central nervous system is ask two quite delimited questions. The first question is, what kinds of molecules and what is the minimum number of molecules required to make that first dramatic distinction during embryonic development between the apparently homogenous collection of cells and the first definition of the nervous system in a structure known as the neural plate? And that is my first question. The second question I would like to ask is, whether the same or different molecules are used later during histogenesis in the formation of complex organs and to concern myself with the mechanisms that might govern this particular formation of organs. And so what I shall do in this lecture after considering some general issues is to discuss a bit about the isolation and the structure of so-called cell adhesion molecules or CAMs as I shall abbreviate them. Look at their appearance then in early embryogenesis and these very critical early events of development. And then take up their function and sequence of expression during the formation of tissues or in histogenesis. And in the end I hope to take up again the questions that I raised in the beginning and see how they look from that aspect. Well on the first slide is a picture (may have the first slide please) of one of the half a million or so chick embryos that we have worked on in our laboratory over the last decade and you are looking at the so-called blastoderm. You are looking down on the egg. This would be the head, this is the tail. And you are looking at that particular formation here known as the primitive streak in the fundamental process of the development of form known as gastrulation. Most of us consider that the three most important events in life are birth, marriage and death. I would like to assure you that that is not so, all due credit to my wife and to the drama of life. In fact it is gastrulation that is the most important thing in life! Now during this process this homogeneous sheet of cells which could represent perhaps 100,000 in number of which about 6,000 to 8,000 will become the chick embryo, organise themselves by a series of morphogenetic movements to cluster up in this structure which will advance towards the head and is known as the primitive streak. And cells will move in a series of movements known as, and I’m glad to hear this since Count Bernadotte announced this that we will have a polonaise, in a series of movements that are known as polonaise movements down through the primitive streak to make the various germ layers and thus constitute gastrulation. These three germ layers you will remember are the so-called ectoderm which will form the skin for example in the nervous system and the endoderm which will form the gut and various structures and the mesoderm which will form the muscles and other things of that kind. Now, in a very short order a historical sequence of events involving some processes of which I will speak shortly occurs. May I have the next slide, this miracle ensues. The chick embryo is rapidly organised through a process known as neurulation into a nervous system with the eye cups and the forebrain vesicles, the neural tube and a series of body segments known as somites and indeed the gut and various numbers of different vascular structures. Anyone who witnesses this event is deeply impressed by both the historical aspect of the event and also its miraculous order. But I want to emphasise as well as its order the uniqueness of certain events and the variation involved. The key principle that I would like you to understand that this is an example of so-called regular development in which cells of different history from those germ layers that I mentioned in showing you the first slide are brought together by morphogenetic movements to influence each other in a process known as induction or milieu-dependent differentiation which leads successively to the formation of the brain and the heart, the gut, the somites and the various structures in three-dimensional space but in fact in four-dimensional process, a historical process. And this process is controlled both by the gene program and also by so-called epigenetic events, historic successive events that depend only indirectly upon the genes but more relate to the relationship of the cells to each other. May I have the next slide, on the next slide I have shown the processes: the considered primary processes of development, the control of cell division, the formation of cells from other cells, differentiation or differential gene expression, the movement of cells relative to each other or of tissue sheets held together under tension either in two dimensions or three dimensions, the interaction of cells which will be my major theme today and cell death. Now these various primary processes in various ratios and at various times are the processes that lead to the development of organic form. And a consideration of them and our knowledge of them easily points out to us why we don’t have an adequate theory of development in the same sense that we have an adequate theory of genetics or of evolution. Each one of these processes involves myriads of molecules, most of which are yet to be defined. They are in parallel sometimes and at other times are serially connected and they are under multiple modes of control. Certainly the first is the gene program so elegantly delineated by Dr. Arber this morning for which I’m grateful. But in fact, the events in the observation of developmental biology, particularly in the vertebrates, indicate quite clearly that the gene program alone cannot account for all of the events that give rise to morphogenesis. An alternative candidate is a process that I have called surface modulation, could I have the next slide? Some time ago I proposed that perhaps some of the epigenetic changes that one sees during development are the result of alterations either in the prevalence or amount of surface molecules or in their position on the cell surface or alternatively the result of chemical alteration of these molecules in such a way during time as to alter their function. Now this of course depends ultimately upon the genetic expression of these molecules and if you will take these molecules to be those that mediate the adhesion of one cell to another we come very close to the subject at hand. What I would like to do today in fact is to show you something about the subject of local cell surface modulation to provide some evidence that it exists in its various forms and that it follows a quite dynamic sequence. And indeed if there is anything that you could take away from this lecture that I think would be of central significance bearing upon the initial questions I asked it would be this. That there is a very dynamic set of alterations at the surface of cells involving adhesion molecules but undoubtedly others as well which are responsible for the regulatory loops that lead to form eventually during the development of the organism. Now, what I intend to do in fact now is show you something about the molecules that undergo such modulations, particularly the cell-adhesion molecules or CAMs. I won’t dwell on the technical details but I would like to show you some pictures of these molecules because they are new and they have several unusual structural features. On the next slide is the strategy that we use to isolate these molecules. As I said I won’t go through the details but basically the strategy was to take the cells of one organism for example the chick, immunise another organism such as a rabbit and search for antibodies that would block the function of cell-adhesion molecules in connecting one cell to another and having isolated those antibodies then to purify the molecules that they blocked, using a series of graded assays and a series of criteria. As a result of that we were able quite early to isolate two kinds of antibodies. One called anti-NCAM, antibodies against the neuro-cell-adhesion molecule in a variety of species and another called anti-LCAM, antibodies to liver-cell-adhesion molecules. As you shall see these are quite different molecules with quite different functions but they are intimately related in their dynamic expressions during development. We found that fragments of the anti-NCAM molecule, fragments because if we used the whole antibody the antibody itself would glue the two cells together by their adhesion molecules so we took advantage of making antibody fragments that had only single valence. These fragments could inhibit the adhesion of neurons to neurons, of nerve cells to nerve cells, the vesiculation of the processes of nerve cells to form nerves, the retinal layering that occurs even in vitro of chick embryonic retina and even the adhesion of neurons to primitive muscle precursors such as myotubes. These antibodies were found in fact to stain the surface of all neurons both central and peripheral. Similarly antibodies to LCAM which are quite different specificity blocked the interaction of liver cells in culture to form adhesive masses as well as the pseudo tissue formation that one observes during the culture of such liver cells. Well when we (May I have the next slide?) used the quite specific antibodies to isolate these molecules and subjected them to fractionation by electrophoresis we immediately found a quite distinctive set of patterns. In the NCAM or neuro-cell-adhesion molecule, in fact a glycoprotein isolated by this method, we found a very diffuse smear of multiple molecular weights extending from 180,000 to about 250,000 in the embryonic animal. But in the adult much to our surprise we found that the molecule consisted of two very sharp bands of 180,000 and 140,000 and I shall come back to this transition from the embryonic form to the adult form because in fact it represents a form of local cell surface modulation. Now LCAM showed no such change by this criterion. It had a molecular weight of about 124,000 and also was a glycoprotein, had sugar connected with it but did not show this E to A conversion. Neither molecule interacted with the other and indeed each is specific for itself and that is a very critical fact. What I would like to do without dwelling on the details is show something of the structural features of NCAM and compare it very briefly with LCAM. We have a pattern in a linear form of the NCAM molecule situated on the cell surface. This is the so-called amino terminal portion of the molecule which is now known to be arranged in three domains, amino terminal domain, a middle domain and a carboxyl terminal domain. The amino terminal domain contains a small amount of carbohydrate and is responsible for the binding homophilicly to another CAM from an opposite cell through the same domain, it is the binding domain of the molecule. The middle domain which is not involved in binding has a most unusual sugar structure. Indeed it contains 30 grams per 100 grams of the polypeptide of an unusual charged sugar and usual in its linkage as polysialic acid, a most unusual structure not usually seen in vertebrates, seen of course in bacteria but carrying out a most intriguing modulation function of which I shall speak. And the third domain we now know is concerned with the relationship with the molecule to the cell surface, this is an intrinsic protein. It is inserted into the lipid bilayer and in fact it is mobile in the plain of the membrane. When we compare NCAM which is only crudely depicted here with LCAM we see a quite different structure. LCAM is not arranged in this series of domains, has very little structural resemblance to NCAM, is cleaved in a region over here which is possibly a domain and does not have the unusual sialic acid structure. Instead it depends for its binding to LCAM on calcium. And indeed if calcium ions are not present, the molecule is rapidly destroyed by enzymes which cleave it into pieces. So both its structure and its binding function depend upon calcium. This is not the case for NCAM. I would like to show you briefly before turning to my major theme a picture of NCAM on an electron micrographic grid but with the caution that this is not a picture as it exists on the cell surface. with metal of the NCAM molecule, indeed to speak correctly of three NCAM molecules linked through this hub here in the centre. I think you can see the domain structure in this so-called triscelion form of the molecule, it’s not the only form by the way. It resembles the molecule clathrin but it is not that molecule. The molecule can in fact exist in forms carrying four chains and what have you. My main point in showing you this picture is to indicate that one can visualise the domains responsible for the various functions of this binding structure. Now let me turn to my theme and I would like to caution you that on the next slide I’m only showing you a sequence not to labour the details but only to give you some form and frame into which to place some of the pictures I’m going to show you of the development and relation of the CAM molecules to development. So having just shown you the structure of these molecules in a crude way and having mentioned that their binding is homophilic to each other, to each but not cross from NCAM to LCAM let me now show you my main theme which is that these molecules appear in the most extraordinary distributions in time and space during development. That they first appear together on the blastoderm that you saw on the first slide all over the blastoderm. But at just that moment when the nervous system or neural plate is induced in so-called primary induction that milieu-dependent differentiation that creates out of the active derm, non-neural ectoderm and that which is to become the nervous system is a very short transition in which in the centre of the blastoderm there’s a very large increase of NCAM and decrease of LCAM and reciprocally around that ring a very large increase of LCAM and decrease of NCAM. Then in each one of the regions during so-called secondary inductions as cells are moved together historically there’s an extraordinary surface modulation in prevalence of the two cams in a quite distinct order. And then subsequent to that in the formation of the nervous system as the glial cells, the support cells of the nervous system appear yet a new CAM which is not seen in these earlier Epox appear in order to mediate this tissue formation. And finally around birth a most extraordinary set of changes occurs in the chemical structure of the CAMs that has to do with the formation of the detailed tracks of the nervous system as well as the tissue structures such as those of the pancreas, the gut and the liver. And in fact this is my theme. So if you’ll bear with me what I plan to do now is show you very quickly some slides of the distribution of the CAMs using the antibodies appropriately labelled in time, in the embryo very rapidly to come to the fundamental point of early embryogenesis which is this question of positional specification or shape determination by place. And in order to do that I’m going to have to show you a series quickly of fluorescence photographs of labelled antibodies to CAM and their distributions. But my main point will be to come to a mapping of the CAMs and to a discussion of their significance before I turn to tissue structure. And thus answer, I hope, in a tentative form my first question which is how many of these CAMs are involved in making the neural plate the first determination of the nervous system. Well here I come to perhaps the most dramatic observation although it might not appear so on this slide. Here you are looking at the surface of the blastoderm. You were looking before down upon it now we have sectioned it and stained it with antibodies to NCAM. In this so-called epiblast layer of the gastrulating blastoderm you see that all of the cells are lit up or stained with antibodies to NCAM. As are the cells of the other layer but the most distinctive observation is that if we stain for LCAM we see exactly the same result all over the blastoderm. Both NCAM and LCAM stain the entire structure. With one exception that during the movement of the cells through the so-called primitive streak which was that structure I showed you at the bottom of the first slide, to form the middle layer or the mesoderm rudiments. The CAMs disappear from the surface of the moving cells, as they are moving. But even more dramatically during the formation of the so-called neural fold or neural plate the NCAM concentration increases enormously while the LCAM concentration shown on this slide, I don’t know if you can barely see the outline, disappears practically to 0 in the neural tube. This is a symmetric cut. Whereas in the contrasting mode the LCAM increases in the non-neural ectoderm and in the endoderm which is going to form the gut while NCAM disappears from the non-neural ectoderm. That while not dramatically expressed on that slide is exactly what is occurring in time and space during the formation of the first neural plate which is going to become the nervous system thus setting the access of the embryo on a good deal of the fundamental events. Now over here is a slide indicating how certain very specialised cells that are going to form from this neural plate the peripheral nervous system - the ganglia, the sympathetic ganglia, the dorsal root or sensory ganglia of the body, a good part of the peripheral nervous system, some of the bones of the face and other structures such as melanoblast arise from a set of cells known as neural crest cells at the top of the neural tube. On this first panel here the neural crest cells have already begun their characteristic migration to form a ganglion. And as they do that their staining for NCAM completely disappears. They move instead on a molecule which is a substrate molecule known as fibronectin which appears and is made by other cells as they move in this particular gully formed by the various structures in the embryo to their destination. But when they reach their destination after one or two cell divisions they re-express CAM on their cell surface as shown by this stain and they form a ganglion very rapidly as fibronectin disappears. So in the formation of this most exquisite set of movements correlated with the interaction and aggregation of cells to form peripheral structures there is a surface modulation of the CAM molecule that is coordinated in a very conjugate fashion with the appearance of substrate molecules which permit movement. On the next slide you will see another dramatic example of this kind of event, if you will focus your attention on this structure here. This is a time sequence showing the so-called somite just before the somites which are the regular derivatives of the mesoderm and are going to form the segmented structures of the body, various bony and muscular structures, just before these have segmented. At the moment they segment a large star of NCAM staining appears over the cells of the somite as it is organising in that fashion. Well, on the next slide let me turn your attention to the other molecule LCAM which is not related to the nervous system which comes up in organs having to do with the endoderm largely but also other germ layers and show you that in the inductions responsible for forming organs such as the liver, the lungs and the formation of the connection between the pharynx and the skin in a so-called branchial arch this molecule plays a key role. Here we have just before the formation of the anlage of the liver or the liver rudiment a large increase in the diffuse staining of LCAM in the gut. And we can practically diagnose the appearance of the liver rudiment by looking at the appearance of this molecule on the cell surface. The same is true for the two long rudiments and the same is true in the obliteration of the primary germ layers, the endodermal pharynx fusing with the ectoderm that event occurs through LCAM, which shows in that slide. LCAM is also responsible in the kidney but perhaps we could go ahead and look at that. and a most complex organ with a complex evolution we see the following striking thing. First in the inductive tissue known as the Wolffian duct which is really the derivative of the collecting tubular, the most primitive kidney and is responsible for organising the loosely arranged mesenchyme so-called, to make kidney tubules. LCAM appears first, and then as the tubules are organised by this inducing structure NCAM appears on the tubules. but the main point is that when this extends forward this NCAM disappears and LCAM reappears on the extending collecting tubules. So what one has is a sequence of appearance of the surface molecules in a quite defined order. They are all carrying out adhesive functions and that adhesive function as we shall see depends very much on how many molecules are there, where they are disposed and what the chemistry is. Well forgive me for the next slide; it is more for my purposes than yours. And it simply summarises what I have said. What I have said so far is that these primary CAMs or cell adhesion molecules appear in very early embryos for LCAM in all three germ layers. LCAM appears in the non-neural ectoderm. In the mesoderm of the Wolffian duct in the kidney, and in the endoderm and is indeed responsible for all gut structure adhesions. In the 5-13 day embryo the various epithelial or tissue sheet derivatives of these layers are seen clearly stained. But the main point of this slide is to show that even in the adult structures that derive concordantly from these germ layers these molecules remain. The LCAM remains in the stratum germinativum of the skin and the epithelium of the kidney and the ova duct and in the whole successive set of epithelia that come from the gut derivatives. Including I should point out several immune precursors, the thymus and the bursa. Several glandular precursors, the thyroid and the parathyroid and indeed Rathke’s pouch which is the glandular portion of the pituitary gland. And NCAM unlike LCAM only belongs to two layers, the ectoderm and the mesoderm and has a derivative comparable in a succeeding embryo and is found mainly in the nervous system in the adult and is found in all parts of the nervous system in the adult. This slide is incomplete, we have recently discovered that the CAMs are present, the NCAM is present also in cardiac muscle and in some form of structure in the testes. Now if I could have the next slide I can summarise what I’ve been saying so far. What I began with is that the key question in development is the question of the relationship of place and time and the historic succession that leads to expression of genes and what controls that. what will become of a particular portion of the blastoderm for a particular portion of the four-dimensional continuum. Let us for example say we want to make a fate map of the blastoderm as Luc Vakaet of Antwerp University so kindly provided me with these details, for the period of organogenesis, the formation of all the tissues in that stage of embryogenesis. The trick is to label a particular cell in a particular place on the blastoderm and see where that cell would go. And thus to construct a map, cells from this region will go to the nervous system, cells from this region to the non-neural ectoderm cells here to the somites, cells in the lateral plate to the heart, the neural genital system and smooth muscle, cells here to the endoderm or the gut derivatives and cells here to the blood forming islands. This is just the primitive streak I started with. Well when we made a composite map of the CAM molecules I’ve spoken about so far we were rather delighted to see an interesting uniformity. That is if we superimpose the distribution of CAM molecules in this fate map onto the classical map we see a rather simple typology. The NCAM indicated by the dots forms a continuously connected simple topological domain all here, consisting of the nervous system, the notochord, the somites and all the lateral plate derivatives here, surrounded by the calcium-dependent ring of endoderm and non-neural ectoderm which express LCAM. So to summarise that, I will come back to this at the end, the two CAMs appear in several germ layers, NCAM in ectoderm and mesoderm, LCAM in all three germ layers. They occupy and cross boundaries of various kinds of cell differentiation, both within and across the CAM denomination. And indeed as you will see there’s a portion of the map that has no CAM so far suggesting that there will be other CAMs to be discovered in the primary map. Now what has this got to do with my original subject? First let me come to a tentative conclusion and that is to form these epithelial sheets through cell-cell interaction it seems fairly clear that you need at least two CAMs of different specificity. You need NCAM and you need LCAM. If you had only one and the various modulation events you would land up with one tissue sheet but just a loosely arranged set of cells around it. And it is these tissue sheets which will fold up in space to form the various tubes, this to form the nervous system, this one to go in here and fold to form the gut and what have you. It is the particularly ordered relationship of the CAMs in time and space that certainly has something to do with the orderly process of that folding. Now let me turn very quickly to my next few subjects. and now I address the question, are they present in other tissues? If I add the CAMs to nerve cells growing in culture, I completely distort the ordered pattern of those nerve cells. Here for ganglion cells and tissue culture and here for retinal cells which completely have destroyed layers in the presence of the antibodies and their cells no longer interact with each other. We can for example in the frog disrupt the maps of the brain by adding antibodies to CAMs in the target portions in the brain as we have here in the frog. which is quite orderly shining light in the eye and recording from the so-called tectum where the optic nerve will end is rather radically disrupted by the presence of these antibodies in a most dynamic fashion. And so we are quite convinced that the CAMs also are involved in this most exquisite tissue formation. In this next slide I want to go back now having shown you the changes in surface modulation of amount, to the chemical change. As I said the embryonic form of the neural molecule changes from a high amount of sugar to a low amount of sugar and I want to now show that that alters its binding. The sialic acid changes from 30 to 10 grams indicated by this electrophoretic change. and we have found by a kinetic test indeed that that is so. The embryonic form binds four times less rapidly as the adult form. We have taken the pure CAM put it into lipid vesicles, interacted the vesicles and find that the rate of binding is influenced by this sugar change. Even more dramatically if the amount of the CAM is doubled in the lipid vesicle the rate of binding goes up over 30-fold. So this chemical change which is occurring later on, (next slide please) also orders the distribution. And you can now see in a mouse embryo in the formation of brain tissue the ordered change from the embryonic form to the adult form of CAM indicated by this very large smear of sialic acid finally to these forms which bind more rapidly. If this is true different areas of the brain should do it on a different schedule. The cerebellum does it faster than the spinal cord, the spinal cord faster than the cerebral cortex. The olfactory bulb where it’s receiving cells which are destroyed and turned over in time has always an amount of embryonic form even in the 180- day-old mouse. And that is true also of the portion of the brain known as the diencephalon. And so we suspected that this chemical change is very important in the mapping of the kind that I told you about in the frog. Now in the next slide you will see an example of that in a disease, we took the so-called staggerer mutation of the mouse. A mutation which causes a disconnection of the cells in the cerebellum of the balancing organ of the brain and we looked for the E to A conversion. And what we found is that at 21 days in the normal the E to A conversion had occurred quite nicely but in the staggerer mouse it was delayed indefinitely. And that appears to be related to the formation of the connections of the particular cells in the cerebellum. And it was quite pleasing to observe it in this mutant which relates to the nerves but not in these mutants of the cerebellum where it is related to the glial support cells. That turned our attention finally to the question of whether new molecules were involved. So far this says that the same molecules that are involved in forming the early embryo are involved in tissue formation even that of the brain. But what happens when you form a new tissue? I have been talking about the binding of NCAM to NCAM and nerve to nerve or of NCAM to muscle via NCAM on the muscle but what of the case of nerve binding to glial cells where possibly two different molecules of different specificity are involved? Well recently we have isolated by the similar tests a molecule called NgCAM, neuron glial-cam. in the chick long after NCAM has appeared. It is different in structure, here is it over here. This is NCAM in the embryonic and in the adult form, this is NgCAM, the two molecules have quite different structure but interestingly enough on the next slide they appear on the same nerve cells. Here are some nerve cells in tissue culture as you see up here, stained for NCAM and NgCAM and you can see that they are on the same cells. Well, may I have that next slide which summarises my comments? Yes, thank you. Now I’ve gone through the question of the CAMs having to do with the early and most fundamental determination in space and time of shape. Now I turn to a rapid consideration of the nervous system, that most exquisite tissue and we found that the same molecules were involved but when particular cells arose an additional CAM was added. Now I go back to that series that I showed you before. That CAMs appear together, diverge in early embryo genesis, change up and down in amounts, putatively altering their rates of binding and finally new CAMs appear when new tissues are formed as for example the glial cells and the nervous system. And then presumably as the structures are finalised in a dynamic way a chemical change occurs in these molecules. The fundamental idea you can leave that slide on and put up the lights please. The fundamental idea is this: That unlike the suppositions that animal form results from a very large number of specific molecules which form addresses for cells hooking together as you would form a jigsaw puzzle. The story looks very much like a mountain stream, a mountain stream which is flowing as cells do on the movement, but under control of its barriers which we might consider the CAMs. Consider that mountain stream hitting a bolder, having a rock which then becomes icy and an ice flow developing and splitting the stream in two. This dynamic principle of growth under molecular control seems to be what guides this sequence. And indeed the idea is that the modulation of CAMs which obviously are the result of gene expressions through these various processes, feedback on the primary processes to alter the tissue patterns. And that that picture is enriched as growth and differentiation arise in such a way as to alter the embryonic induction. That is the genes controlling CAM expression and modulation interact with adhesion so as to control the movements of the cells and thus control the induction which leads to the various formation of organs and tissues. And that undoubtedly as other regulatory genes involved in cell differentiation for example the glial cells that I showed you about intervene the combination of the two yield increasingly complex structures. but they are not the specificity of address, that they are under control of genes but not only under the control of genes and that they themselves regulate the tissue movements that lead to the tissue-dependent differentiations that lead to animal form. Well I hope that this will be some example. I cannot help but take the opportunity since there are so many young people here and I look forward to talking to them about this subject, to indicate to you that this is just the beginning of a subject and that science is about questions as much as it is about answers. I remember the remarks of van t’Hoff who said that science is imagination in the service of the verifiable truth. And as such it is eminently practical. This is true but I would like to emphasise for the young people who may be bedazzled these days by technique, that science is as well like poetry about spirit, about imagination and about variation. And if there’s one human lesson from this modest story it is that for example no two brains will be alike and significantly so, no two individuals will be alike. No one can predict even an embryonic future; even though there is regularity in its minute details and that I share Dr. Arber’s optimism. My optimism is in the range and the poetry of individuality and I hope that all of those students remember that little lesson. Thank you very much.

Graf Bernadotte, Kolleginnen und Kollegen, sehr verehrte Gäste, liebe Studenten, meine Damen und Herren. Es ist ein großes Privileg hier zu sein und die Möglichkeit zu haben, in dieser Runde zu sprechen, insbesondere angesichts der herzlichen Gastfreundlichkeit unserer Lindauer Gastgeber. Ich bin sehr dankbar. Ich möchte über die Arbeit sprechen, die mein Labor in den letzten 10 Jahren auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie geleistet hat. Nicht so sehr über die Arbeit selbst, sondern über die Arbeit als Beispiel für einige grundlegende Fragen der Biologie. Ich muss sagen, ich gerate jedes Mal in ziemliche Verlegenheit, wenn ich über dieses Thema diskutiere; in gewisser Weise ist das eine außerordentlich schwierige Thematik. Ich versuche dann immer eine Absprache oder einen Pakt mit den Zuhörern zu schließen. Anstatt Ihnen die rechtlichen Aspekte dieses Pakts zwischen uns näher zu erläutern, möchte ich ihn anhand einer Geschichte veranschaulichen. Zwei Touristen kommen in ein fremdes Land und beschließen, an ihrem ersten Abend in einer neuen Stadt in einen Nachtclub zu gehen. Dort setzen sie sich hin und hören einem Komiker zu, der Witze erzählt. Einer der beiden Touristen fällt vor Lachen vom Stuhl, worauf der andere zu ihm herunterschaut und fragt: "Weshalb lachst du? Du verstehst doch die Sprache gar nicht." Der andere schaut zu ihm hoch und sagt: "Ich vertraue diesen Leuten." Was ich jetzt am Anfang sagen möchte, ist, dass es in der Entwicklungsbiologie zwei Hauptprobleme gibt. Das erste bezeichne ich als das entwicklungsgenetische Problem: Wie kann ein eindimensionaler Code in der Zeit die Gestalt eines dreidimensionalen Tieres vorgeben? Das zweite Problem bezeichne ich als das evolutionäre Problem. Wie kann es - ungeachtet der Lösung des ersten Problems - sein, dass diese Lösung mit der Tatsache kompatibel ist, dass sich die Radiation eines Taxons oder einer Gattung oder sogar einer Spezies über so kurze evolutionäre Zeiträume so schnell verändern kann? Haeckel und von Baer befassten sich eingehend mit diesen beiden Kernpunkten, und die von ihnen angeschnittenen Fragen bezüglich der Beziehung zwischen Ontogenese und Phylogenese beschäftigen uns noch heute und stellen meiner Ansicht nach de facto gemeinsam das zentrale ungelöste Problem der modernen Biologie dar. Die Schlüsselfrage ist das Verständnis der zentralen Bedeutung des Ortes bzw. der Position bei der Ontogenese, d.h. wie die Zelle ihre spezielle Position in einer historischen Abfolge erkennt. Zur Lösung dieses Problems können zwei Strategien zur Anwendung kommen. Die erste hat bereits eine lange und berühmte Geschichte: Es wird nach Genen gesucht, die Strukturen oder ihre Wiederholungen regulieren können - derartige Gene wurden z.B. in der Drosophila entdeckt - den so genannten homöotischen Genen oder homöotischen Mutationen, die während der Entwicklung bestimmte Strukturen steuern bzw. definieren, z.B. die Repetition des Thorax oder die Substitution des Fühlers durch eine beinartige Struktur. Zweifellos geht diese spezielle Strategie den Fragen, die ich aufgeworfen habe, gründlich auf die Spur. Es gibt jedoch eine alternative Strategie, über die ich heute sprechen möchte. Ich möchte die Entdeckung verschiedener neuer Moleküle im Zusammenhang mit dieser Strategie diskutieren. Bei dieser Strategie könnte man versuchen ein Molekül zu definieren, das bekanntermaßen bei der Morphogenese eine spezielle Funktion ausübt, dann seine Funktion weiterverfolgen, die Abfolge seiner zeitlichen Expression beobachten und schließlich zu dem Gen zurückkehren und schauen, was dies für die beiden grundlegenden Fragen, die ich aufgeworfen habe, bedeutet. Wie ich bereits sagte, möchte ich über diese Strategie sprechen, ich hoffe aber, dass Sie nicht denken, dass ich trotz der globalen Bestandsaufnahme, die ich plane, davon ausgehe, dass diese Fragen bereits beantwortet sind. De facto möchte ich angesichts der Tatsache, dass diese Kernfragen der Morphogenese im zentralen Nervensystem ihre beeindruckendste Ausprägung finden, zwei relativ scharf umschriebene Fragen stellen. Die erste Frage lautet: Welche Art von Molekülen und wie viele Moleküle mindestens sind notwendig, um den ersten dramatischen Unterschied bei der embryonalen Entwicklung zwischen der scheinbar homogenen Ansammlung von Zellen und der ersten Definition des Nervensystems in einer als Neuralplatte bezeichneten Struktur hervorzurufen? Das ist meine erste Frage. Die zweite Frage, die ich stellen möchte, lautet: Kommen später während der Histogenese, d.h. bei der Bildung komplexer Organe dieselben oder andere Moleküle zum Einsatz? Außerdem möchte ich mich mit den Mechanismen beschäftigen, die die Entstehung dieser speziellen Organe regulieren. Nachdem ich auf einige allgemeine Punkte eingegangen bin, werde ich mich in diesem Vortrag ein wenig mit der Isolierung und Struktur der so genannten Zelladhäsionsmoleküle, abgekürzt CAMs befassen. Schauen wir uns also zunächst das Erscheinungsbild der CAMs in der frühen Embryogenese mit ihren entscheidenden frühen Entwicklungsereignissen an; anschließend beschäftigen wir uns mit ihrer Funktion und Expressionsabfolge während der Gewebebildung bzw. in der Histogenese. Zum Schluss kehren wir hoffentlich wieder zu den von mir zu Beginn gestellten Fragen zurück, um zu sehen, wie sie sich von diesem Aspekt aus präsentieren. an denen wir in den letzten 10 Jahren in unserem Labor geforscht haben. Was Sie sehen, ist das so genannte Blastoderm. Sie sehen das Ei von oben; das ist der Kopf, das der Schwanz. Dieses spezielle, als "primitive streak" bezeichnete Gebilde tritt im Rahmen des grundlegenden Prozesses der Gestaltentwicklung, der so genannten Gastrulation auf. Die meisten von uns halten Geburt, Heirat und Tod für die drei wichtigsten Ereignisse im Leben. Ich möchte Ihnen versichern, dass dem nicht so ist, bei aller Anerkennung für meine Frau und das Drama des Lebens. In Wirklichkeit ist die Gastrulation das Wichtigste im Leben! Während dieses Prozesses ordnet sich diese homogene Zellschicht, die vielleicht 100.000 Zellen umfasst, von denen etwa 6.000 bis 8.000 zu Hühnerembryos werden, durch eine Reihe morphogenetischer Bewegungen in Form dieser Struktur an, die sich in Richtung Kopf bewegt und als "primitive streak" bezeichnet wird. Die Zellen bewegen sich in einer Bewegungsabfolge, die als Polonaise bezeichnet wird - ich freue mich das zu hören, denn Graf Bernadotte hat angekündigt, dass es eine Polonaise geben wird - durch den "primitive streak" nach unten, wo sie verschiedene Keimschichten bilden und es zur Gastrulation kommt. Diese drei Keimschichten, Sie erinnern sich, sind das so genannte Ektoderm, das die Haut bildet, z.B. im Nervensystem, das Endoderm, das den Darm und verschiedene andere Strukturen bildet, und das Mesoderm, das die Muskeln und dergleichen bildet. Anschließend sehen Sie jeweils kurz hintereinander eine historische Abfolge von Ereignissen. Die dabei auftretenden Prozesse werde ich kurz kommentieren. Kann ich bitte das nächste Dia haben? Jetzt geschieht das Wunder. Der Hühnerembryo ordnet sich in einem als Neurulation bezeichneten Prozess rasch zu einem Nervensystem mit Augenmuscheln und Vorderhirnvesikeln, Neuralrohr und einer Reihe von Körpersegmenten, den so genannten Somiten, Darm und unterschiedlichen Gefäßstrukturen an. Jeder, der Zeuge dieses Ereignisses wird, ist zutiefst beeindruckt sowohl von dem historischen Aspekt des Geschehens als auch von seiner wundersamen Abfolge. Ich möchte jedoch neben der Abfolge auch die Einzigartigkeit bestimmter Ereignisse und die damit einhergehende Vielfalt betonen. Das Hauptprinzip, das ich Ihnen verständlich machen möchte, besteht darin, dass es sich hierbei um eine so genannte reguläre Entwicklung handelt, bei der Zellen unterschiedlicher Historie aus den Keimschichten, die ich Ihnen im ersten Dia gezeigt habe, durch morphogenetische Bewegungen so miteinander verknüpft werden, dass sie sich gegenseitig beeinflussen können, und zwar in einem als Induktion bzw. milieu-abhängige Differenzierung bezeichneten Prozess, der sukzessive zur Bildung von Gehirn, Herz, Darm, Somiten sowie den verschiedenen Strukturen im dreidimensionalen Raum führt; eigentlich ein vierdimensionaler, historischer Prozess. Dieser Prozess wird sowohl durch das genetische Programm als auch durch so genannte epigenetische Ereignisse gesteuert, d.h. historische, aufeinander folgende Geschehnisse, die nur indirekt von den Genen abhängen, sondern eher mit der Beziehung der Zellen untereinander in Zusammenhang stehen. Kann ich bitte das nächste Dia haben? Hier habe ich die möglichen primären Entwicklungsprozesse dargestellt: die Steuerung der Zellteilung, die Entstehung von Zellen aus anderen Zellen, die Differenzierung oder differenzielle Genexpression, die Bewegung der Zellen relativ zueinander, die zwei- oder dreidimensionale Bewegung von Gewebeschichten, die unter Spannung zusammengehalten werden, die Wechselwirkung zwischen den Zellen - das wird heute mein Hauptthema sein - und der Zelltod. Es sind diese unterschiedlichen primären Prozesse - in unterschiedlichen Verhältnissen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten - die zur Entwicklung der organischen Gestalt führen. Die Betrachtung dieser Prozesse und unserer Erkenntnisse lässt mühelos erkennen, warum wir anders als bei der Genetik oder Evolution bei der Entwicklung über keine adäquate Theorie verfügen. Jeder dieser Prozesse schließt Myriaden von Molekülen ein, von denen die meisten noch definiert werden müssen. Manchmal sind sie parallel, ein andermal wieder in Reihe geschaltet, und sie werden in verschiedenster Weise gesteuert. Der erste Prozess ist sicherlich das genetische Programm, das Dr. Arber heute Morgen freundlicherweise so elegant dargestellt hat. De facto deuten die Ereignisse bei der Beobachtung der Entwicklungsbiologie, insbesondere bei den Wirbeltieren ganz eindeutig darauf hin, dass das genetische Programm allein nicht für alle Vorgänge verantwortlich sein kann, die die Morphogenese hervorrufen. Ein alternativer Kandidat ist ein Vorgang, den ich als Oberflächenmodulation bezeichne. Könnte ich bitte das nächste Dia haben? Vor einiger Zeit habe ich gesagt, dass einige der epigenetischen Veränderungen, die man bei der Entwicklung beobachtet, das Resultat einer veränderten Prävalenz bzw. Menge der Oberflächenmoleküle oder ihrer Position auf der Zelloberfläche oder alternativ das Ergebnis einer chemischen Veränderung dieser Moleküle, die im Verlauf der Zeit zu einer Veränderung ihrer Funktion führt, sein könnten. Das hängt natürlich letztlich von der genetischen Expression dieser Moleküle ab. Geht man davon aus, dass sie die Adhäsion zwischen zwei Zellen vermitteln, kommt man unserem Thema schon erheblich näher. Ich möchte Ihnen heute etwas zur lokalen Zelloberflächenmodulation zeigen, um zu belegen, dass sie in ihren unterschiedlichen Ausgestaltungen existiert und eine recht dynamische Abfolge aufweist. Wenn Sie etwas meiner Ansicht nach zentral Bedeutendes bezüglich meiner anfänglichen Fragen aus diesem Vortrag mitnehmen können, so ist es dies: Auf der Oberfläche von Zellen, die Adhäsionsmoleküle tragen, zweifellos aber auch andere Moleküle, die für die Regelkreise verantwortlich sind, die während der Entwicklung des Organismus letztendlich zur Gestaltbildung führen, finden äußerst dynamische Veränderungen statt. Ich möchte Ihnen nun etwas über die Moleküle erzählen, die solchen Veränderungen unterzogen werden, insbesondere die Zelladhäsionsmoleküle oder CAMs. Ich werde mich nicht mit den technischen Einzelheiten aufhalten, sondern möchte Ihnen einige Aufnahmen dieser Moleküle zeigen; sie sind neu und weisen einige ungewöhnliche Strukturmerkmale auf. Auf dem nächsten Dia sehen Sie die Strategie, die wir bei der Isolierung dieser Moleküle anwenden. Wie bereits erwähnt, werde ich nicht näher auf die Einzelheiten eingehen. Grundsätzlich bestand die Strategie darin, die Zellen eines Organismus, z.B. eines Huhns zu nehmen, einen anderen Organismus wie z.B. ein Kaninchen damit zu immunisieren, nach Antikörpern zu suchen, die die Funktion der Zelladhäsionsmoleküle - die Verknüpfung von Zellen - blockieren, und nach Isolierung dieser Antikörper die Moleküle, die sie blockieren, mit Hilfe einer Reihe von Staffeltests nach verschiedener Kriterien zu reinigen. Infolgedessen konnten wir recht bald zwei Arten von Antikörpern isolieren: anti-NCAM, Antikörper gegen das neurale Zelladhäsionsmolekül bei einer Reihe von Arten, und anti-LCAM, Antikörper gegen Leberzelladhäsionsmoleküle. Wie Sie sehen, handelt es sich hierbei um recht unterschiedliche Moleküle mit verschiedenartigen Funktionen, die aber bezüglich ihrer dynamischen Expression während der Entwicklung eng miteinander verwandt sind. Wir haben festgestellt, dass Fragmente des anti-NCAM-Moleküls - Fragmente deshalb, weil bei Verwendung des gesamten Antikörpers dieser die beiden Zellen mit Hilfe ihrer Adhäsionsmoleküle verkleben würde - wir haben also den Vorteil genutzt und Antikörperfragmente mit nur einer Valenz hergestellt. Diese Fragmente könnten die Adhäsion von Neuronen, also Nervenzellen untereinander, die Vesikulation der Fortsätze bei der Nervenbildung, die Entstehung von Netzhautschichten, die selbst in vitro in der embryonalen Hühnernetzhaut stattfindet, und sogar die Adhäsion von Neuronen an primitive Muskelvorläuferzellen wie Myotuben hemmen. Es stellte sich heraus, dass diese Antikörper die Oberfläche sowohl der zentralen als auch der peripheren Neuronen färbt. In ähnlicher Weise blockierten Antikörper gegen LCAM mit ganz einer anderen Spezifität in Kultur die Wechselwirkung von Leberzellen und somit die Bildung adhäsiver Massen sowie die Pseudogewebebildung, die sich bei der Kultivierung solcher Leberzellen beobachten lässt. und diese einer Fraktionierung mittels Elektrophorese unterzogen, stellten wir sofort recht charakteristische Muster fest. Bei NCAM, dem neuralen Zelladhäsionsmolekül - eigentlich ein nach diesem Verfahren isoliertes Glycoprotein - fand sich im embryonalen Tier eine äußerst diffuse Verschmierung mit einem Molekulargewicht von 180.000 bis etwa 250.000. Beim erwachsenen Tier stellten wir zu unserer Überraschung fest, dass das Molekül aus zwei sehr scharfen Banden von 180.000 und 140.000 bestand. Ich komme auf diesen Übergang von der embryonalen zur erwachsenen Gestalt noch einmal zurück, da er eigentlich eine Form der lokalen Zelloberflächenmodulation ist. LCAM wies keine Veränderung nach diesem Kriterium auf. Es besaß ein Molekulargewicht von etwa 124.000 und war ebenfalls ein Glycoprotein mit einem angehängten Zucker, zeigte aber nicht diese Umwandlung von E zu A. Keines der Moleküle trat mit dem anderen in Wechselwirkung. De facto sind sie alle sehr spezifisch, was ein ganz entscheidendes Faktum darstellt. Ohne mich allzu lang mit den Einzelheiten aufzuhalten, möchte ich Ihnen einige der Strukturmerkmale von NCAM zeigen und sie ganz kurz mit denen von LCAM vergleichen. Wir haben ein Muster des NCAM-Moleküls in linearer Form auf der Zelloberfläche. Es handelt sich hierbei um den so genannten terminalen Aminoabschnitt des Moleküls, das, so weiß man heute, aus drei Domänen besteht: der terminalen Aminodomäne, einer mittleren Domäne und einer terminalen Carboxyldomäne. Die terminale Aminodomäne enthält eine kleine Menge Kohlenhydrate und ist für die homophile Bindung an das CAM einer anderen Zelle über dieselbe Domäne verantwortlich; sie ist die Bindungsdomäne des Moleküls. Die mittlere Domäne, die an der Bindung nicht beteiligt ist, weist eine höchst ungewöhnliche Zuckerstruktur auf. Sie enthält pro 100 Gramm des Polypeptids 30 Gramm eines ungewöhnlichen geladenen Zuckers - ungewöhnlich was die Bindung betrifft - nämlich Polysialinsäure, einer bei Wirbeltieren nur selten auftretenden die jedoch eine äußerst faszinierende Modulationsfunktion besitzt, auf die ich noch zurückkommen werde. Die dritte Domäne, die wir heute kennen, reguliert die Beziehung zwischen dem Molekül und der Zelloberfläche; es handelt sich um ein in der Lipiddoppelschicht befindliches intrinsisches Protein, das im Prinzip in der Membranebene mobil ist. Vergleicht man NCAM, das hier nicht im Detail dargestellt ist, mit LCAM, fällt eine völlig andersartige Struktur auf. LCAM ist nicht in Form mehrerer Domänen angeordnet, hat kaum strukturelle Ähnlichkeit mit NCAM, ist in diesem Bereich hier, bei dem es sich möglicherweise um eine Domäne handelt, gespalten und weist nicht die ungewöhnliche Sialsäurestruktur auf. Stattdessen hängt es bezüglich seiner Bindung an LCAM von Calcium ab. Liegen keine Calciumionen vor, wird das Molekül in der Tat rasch von Enzymen zersetzt, die es aufspalten. Sowohl seine Struktur als auch seine Bindungsfunktion hängen also von Calcium ab. Das ist bei NCAM nicht der Fall. Bevor ich mich meinem Hauptthema zuwende, möchte ich Ihnen kurz eine Aufnahme eines NCAM auf einem elektronenmikroskopischen Gitter zeigen. Bitte beachten Sie jedoch, dass dieses Bild nicht die Situation auf der Zelloberfläche widerspiegelt. Auf diesem Dia sehen Sie eine elektronenmikroskopische Aufnahme des metall-bedampften NCAM-Moleküls. Richtigerweise müsste man sagen, dass es sich um drei NCAM-Moleküle handelt, die über diesen Knotenpunkt hier in der Mitte verknüpft sind. Sie können die Domänenstruktur in dieser so genannten Triskelenform des Moleküls sehen. Das ist übrigens nicht die einzige Form. Die Triskelenform erinnert an das Molekül Clathrin, es handelt sich aber nicht um Clathrin. Das Molekül kann de facto in Ausformungen mit vier Ketten und so weiter existieren. Ich zeige Ihnen diese Aufnahme aber hauptsächlich, damit Sie sich die Domänen, die für die verschiedenen Funktionen dieser Bindungsstruktur verantwortlich sind, vorstellen können. Lassen Sie mich nun zu meinem eigentlichen Thema kommen. Ich möchte Sie aber vorwarnen: Ich zeige Ihnen bei meinem nächsten Dia nicht deshalb eine zeitliche Abfolge, um mich in Einzelheiten zu ergehen, sondern um einen Rahmen zu schaffen, in den Sie die Aufnahmen, die ich Ihnen zum Thema Entwicklung und Zusammenhang zwischen CAM-Molekülen und Entwicklung zeigen werde, einordnen können. Nachdem ich Ihnen eben die Struktur dieser Moleküle grob dargelegt habe und erwähnt habe, dass ihre Bindung untereinander homophiler Natur ist - untereinander, aber nicht zwischen NCAM und LCAM - möchte ich Ihnen nun mein eigentliches Thema vorstellen, nämlich dass diese Moleküle während der Entwicklung in zeitlich und räumlich höchst außergewöhnlicher Verteilung auftreten. Zunächst erscheinen sie zusammen auf dem Blastoderm, das Sie auf dem ersten Dia gesehen haben, und zwar auf dem gesamten Blastoderm. In dem Moment, wo das Nervensystem bzw. die Neuralplatte in der so genannten primären Induktion, d.h. der milieu-abhängigen Differenzierung, die Ektoderm in nicht-neurales Ektoderm umwandelt, das wiederum zum Nervensystem wird, angeregt wird, gibt es einen ganz kurzen Übergang, während dessen es in der Mitte des Blastoderms zu einem starken NCAM-Anstieg und einem LCAM-Rückgang sowie umgekehrt um diesen Ring herum zu einer starken LCAM-Zunahme und einem NCAM-Rückgang kommt. Während der so genannten sekundären Induktionen, bei denen die Zellen in historischer Abfolge angeordnet werden, findet bei Prävalenz der beiden CAMs in einer der Regionen eine außergewöhnliche Oberflächenmodulation in genau festgelegter Reihenfolge statt. Im Anschluss an das CAM, das bei der Entstehung des Nervensystems vorliegt, wo die Gliazellen, die Unterstützerzellen des Nervensystems erscheinen, findet sich jetzt ein neues, bislang noch nicht in Erscheinung getretenes CAM, das diese Gewebebildung vermittelt. Um die Geburt herum kommt es schließlich zu einer Reihe höchst bemerkenswerter Veränderungen in der chemischen Struktur der CAMs, die mit der Entstehung der detaillierten Bahnen des Nervensystems sowie der Bildung von Gewebestrukturen wie Pankreas-, Darm- oder Lebergewebe zu tun haben. Genau damit beschäftige ich mich. Ich möchte Ihnen ganz schnell einige Dias zur Verteilung der CAMs mittels der entsprechend markierten Antikörper im Embryo zeigen, um dann zum entscheidenden Punkt der frühen Embryogenese zu kommen, nämlich der Frage der positionellen Spezifizierung bzw. Gestaltbestimmung mittels Position. Hierfür muss ich Ihnen rasch eine Reihe von Fluorenzenzaufnahmen der markierten Antikörper gegen CAM sowie ihre Verteilung zeigen. Vor allem möchte ich aber, bevor ich mich der Gewebestruktur zuwende, auf die Kartierung der CAMs zu sprechen kommen, Ihnen ihre Bedeutung erklären und so hoffentlich vorläufig meine erste Frage beantworten: Wie viele dieser CAMs sind an der Entstehung der Neuralplatte, der ersten Determinierung des Nervensystems beteiligt? auch wenn es auf dem Dia nicht so aussieht. Sie sehen hier die Oberfläche des Blastoderms. Vorhin haben Sie von oben herab darauf geschaut, jetzt haben wir es aufgeschnitten und mit Antikörpern gegen NCAM gefärbt. Sie sehen, dass in dieser so genannten Epiblastenschicht des gastrulierenden Blastoderms alle Zellen mit Antikörpern gegen NCAM gefärbt sind, genau wie die Zellen der anderen Schicht. Die markanteste Beobachtung ist jedoch die, dass wir bei LCAM-Färbung auf dem gesamten Blastoderm genau dieselben Resultate sehen. NCAM und LCAM färben also die gesamte Struktur. Mit einer Ausnahme - während der Bewegung der Zellen durch den so genannten "primitive streak", also die Struktur zur Bildung der mittleren Schicht bzw. der Mesodermrudimente, die ich Ihnen unten auf dem ersten Dia gezeigt habe, verschwinden die CAMs von der Oberfläche der sich bewegenden Zellen. Noch dramatischer: Die NCAM-Konzentration nimmt während der Entstehung der so genannten Neuralfalte oder Neuralplatte stark zu, während die auf dieser Seite dargestellte LCAM-Konzentration im Neuralrohr - ich weiß nicht, ob Sie die Konturen überhaupt sehen können - praktisch auf 0 sinkt. Es handelt sich hier um einen symmetrischen Schnitt. Im entgegen gesetzten Modus nimmt das LCAM dagegen im nicht-neuralen Ektoderm und dem den Darm bildenden Endoderm zu, während NCAM aus dem nicht-neuralen Ektoderm verschwindet. Auch wenn das Dia die Dramatik nicht zum Ausdruck bringt, geschieht genau das in Raum und Zeit während der Entstehung der ersten Neuralplatte, aus der später das Nervensystem wird, wodurch die embryonale Achse auf zahlreiche andere grundlegende Ereignisse eingestellt wird. Hier haben wir ein Dia, das zeigt, wie bestimmte sehr spezialisierte Zellen, die aus dieser Neuralplatte das periphere Nervensystem bilden - die Ganglien, die sympathetischen Ganglien, die Hinterwurzel- oder sensorischen Ganglien des Körpers, einen Großteil des peripheren Nervensystems, einige Gesichtsknochen und andere Strukturen wie z.B. Melanoblasten - aus so genannten Neuralleistenzellen am oberen Ende des Neuralrohrs entstehen. Auf der ersten Platte hier haben die Neuralleistenzellen bereits ihre charakteristische Umwandlung in ein Ganglion begonnen. Dabei verschwindet ihre NCAM-Färbung vollständig. Stattdessen bewegen sie sich auf einem nun auftauchenden Substratmolekül namens Fibronektin, das durch andere Zellen gebildet wird, während diese durch eine von den verschiedenen Strukturen in dem Embryo gebildete spezielle Rinne zu ihrem Ziel wandern. Wenn sie nach ein oder zwei Zellteilungen ihr Ziel erreicht haben, exprimieren sie CAM erneut auf der Zelloberfläche, wie diese Färbung zeigt. Es entsteht sehr rasch ein Ganglion, während das Fibronektin verschwindet. Bei der Ausbildung dieser außerordentlichen Bewegungsabfolge, die mit der Interaktion und Aggregation von Zellen zu peripheren Strukturen korreliert, findet eine Oberflächenmodulation des CAM-Moleküls statt, die mit dem Escheinen von Substratmolekülen, die die Bewegung ermöglichen, konjugierend koordiniert ist. Auf dem nächsten Dia sehen Sie ein weiteres dramatisches Beispiel für diese Art von Ereignis, wenn Sie Ihre Aufmerksamkeit auf diese Struktur hier lenken. Es handelt sich dabei um eine zeitliche Abfolge, die einen so genannten Somiten kurz vor der Segmentierung zeigt. Somiten sind reguläre Derivate des Mesoderms und bilden die Strukturabschnitte des Körpers, verschiedene Knochen- und Muskelstrukturen. Im Moment der Segmentierung erscheint eine NCAM-Färbung in Form eines großen Sterns über den Zellen des Somiten, während dieser sich entsprechend anordnet. Beim nächsten Dia möchte ich Ihre Aufmerksamkeit auf das andere Molekül - LCAM - lenken, das nicht mit dem Nervensystem zusammenhängt, sondern in Organen vorliegt und hauptsächlich mit dem Endoderm, aber auch anderen Keimschichten in Beziehung steht. Ich möchte Ihnen zeigen, dass dieses Molekül bei den für die Entstehung von Organen wie Leber und Lunge sowie für die Bildung der Verbindung zwischen Rachen und Haut, des so genannten Branchialbogens verantwortlichen Induktionen eine wichtige Rolle spielt. Hier haben wir direkt vor der Bildung der Leberanlage bzw. des Leberrudiments eine starke Zunahme der diffusen LCAM-Färbung im Darm. Das Erscheinen des Leberrudiments lässt sich praktisch diagnostizieren, indem man das Erscheinen dieses Moleküls auf der Zelloberfläche beobachtet. Dasselbe gilt für die beiden lange Rudimente und auch für die Eliminierung der primären Keimschichten, die Verschmelzung der endodermalen Pharynx mit dem Ektoderm, die mit Hilfe von LCAM erfolgt - Sie sehen das hier auf dem Dia. LCAM ist auch für die Niere verantwortlich, aber vielleicht können wir weitergehen und uns das anschauen. und ein höchst komplexes Organ mit einer komplizierten Entwicklung handelt, sehen wir etwas Erstaunliches. Zunächst in dem als Wolff-Gang bezeichneten Induktionsgewebe, bei dem es sich eigentlich um das Derivat des Sammelrohrs, also der ganz primitiven Niere handelt und das für den Zusammenschluss des lose angeordneten so genannten Mesenchyms zu Nierentubuli verantwortlich ist. Zunächst erscheint LCAM; nachdem die Tubuli durch diese Induktionsstruktur angeordnet worden sind, erscheint NCAM auf den Tubuli... Der Hauptpunkt ist, dass im Verlauf NCAM verschwindet und LCAM wieder auf den größer werdenden Sammelrohren erscheint. Wir haben hier also eine Abfolge des Erscheinens der Oberflächenmoleküle in einer recht genau definierten Reihenfolge. Sie alle fungieren als Haftvermittler; diese Eigenschaft hängt, wie wir sehen werden, stark von der Anzahl der vorliegenden Moleküle, ihrer Anordnung und ihren chemischen Eigenschaften ab. Bitte entschuldigen Sie das nächste Dia, es dient eher meinen Zwecken als Ihren, da es schlichtweg zusammenfasst, was ich gesagt habe. Ich habe Ihnen bisher erläutert, dass diese primären CAMs oder Zelladhäsionsmoleküle im ganz frühen Embryo in den Keimschichten auftreten. LCAM erscheint sogar in allen drei Keimschichten, im nicht-neuralen Ektoderm, im Mesoderm des Wolff-Gangs in der Niere sowie im Endoderm und ist eigentlich für sämtliche Adhäsionsvorgänge in den Darmstrukturen verantwortlich. Im 5 bis 13 Tage alten Embryo sind die verschiedenen Epithel- oder Gewebeschichtderivate dieser Keimschichten deutlich gefärbt. Dieses Dia zeigt aber vor allem, dass diese Moleküle sogar noch in adulten Strukturen zu finden sind, die übereinstimmend von diesen Keimschichten abstammen. LCAM verbleibt im Stratum germinativum der Haut und des Epithels der Niere und der Eileiter sowie im gesamten sukzessive aus den Darmderivaten entstehenden Epithel einschließlich verschiedener Immunvorstufen wie Thymusdrüse und Bursa und verschiedener glandulärer Vorstufen wie Schilddrüse, Nebenschilddrüse und Rathke-Tasche (Drüsenbestandteil der Hypophyse). Anders als LCAM gehört NCAM nur zwei Schichten an, dem Ektoderm und dem Mesoderm. Sein Derivat ist mit dem in einem nachfolgenden Embryo vergleichbar und liegt hauptsächlich im Nervensystem von Erwachsenen vor; dort ist es in allen Abschnitten zu finden. Dieses Dia ist lückenhaft. Wir haben kürzlich entdeckt, dass NCAM auch im Herzmuskel sowie in einigen Strukturen der Hoden vorliegt. Könnte ich jetzt bitte das nächste Dia haben? Ich fasse dann zusammen, was ich bisher gesagt habe. Ich habe mit der Schlüsselfrage der Entwicklung begonnen, nämlich der Frage nach der Beziehung zwischen Ort und Zeit und der historischen Abfolge, die zur Genexpression und ihrer Steuerung führt. die ausdrücken soll, was mit einem bestimmten Teil des Blastoderms in einem bestimmten Abschnitt des vierdimensionalen Kontinuums geschieht. Sagen wir z.B., wir möchten einen Anlageplan des Blastoderms für den Zeitraum der Organogenese, also die Entstehung sämtlicher Gewebe in diesem Stadium der Embryogenese erstellen. Luc Vakaet von der Universität Antwerpen hat mir freundlicherweise die Details zur Verfügung gestellt. Der Trick besteht darin, eine bestimmte Zelle an einer bestimmten Stelle auf dem Blastoderm zu markieren und zu schauen, wohin diese Zelle wandert, um so einen Plan zu konstruieren. Zellen aus dieser Region wandern zum Nervensystem, Zellen aus dieser Region zum nicht-neuralen Ektoderm, die Zellen hier zu den Somiten, die Zellen in der Seitenplatte zum Herzen, dem Urogenitaltrakt und der glatten Muskulatur, die Zellen hier zum Endoderm oder den Darmderivaten und die Zellen hier zu den blutbildenden Inseln. Das hier ist der "primitive streak", mit dem ich begonnen habe. Bei der Konstruktion eines Anlageplans für alle CAM-Moleküle, von denen ich bisher gesprochen habe, hat uns die interessante Einheitlichkeit beeindruckt. Bei Überlagerung des klassischen Plans mit der Verteilung der CAM-Moleküle in diesem Anlageplan lässt sich eine recht simple Typologie erkennen. Das als Punkte dargestellte NCAM bildet eine kontinuierlich verknüpfte einfache topologische Domäne, die aus dem Nervensystem, dem Notochord, den Somiten und den Derivaten der Seitenplatte besteht. Es ist von dem calcium-abhängigen Endodermring und dem nicht-neuralen Ektoderm umgeben, die LCAM exprimieren. Zusammenfassend erscheinen die beiden CAMs in unterschiedlichen Keimschichten, NCAM im Ektoderm und Mesoderm, LCAM in allen drei Keimschichten; ich komme am Ende noch einmal darauf zurück. Sie bilden und überschreiten Grenzen unterschiedlicher Arten von Zelldifferenzierung, sowohl innerhalb eines CAM als auch CAM-übergreifend. De facto gibt es, wie Sie sehen werden, einen Abschnitt des Anlageplans, der bislang kein CAM aufweist, was nahe legt, dass es im primären Plan noch weitere CAMs zu entdecken gibt. Nun, was hat das mit meinem ursprünglichen Thema zu tun? Lassen Sie mich zunächst zu einem vorläufigen Schluss kommen, nämlich folgendem: Zur Entstehung dieser Epithelschichten durch interzelluläre Interaktion benötigt man, soviel scheint klar zu sein, mindestens zwei CAMs unterschiedlicher Spezifität, nämlich NCAM und LCAM. Bei nur einem CAM hätte man angesichts der verschiedenen Modulationsereignisse am Ende zwar eine Gewebeschicht, die aber wäre nur von lose angeordneten Zellverbänden umgeben. Es sind diese Gewebeschichten, die sich im Raum zu den verschiedenen Rohren falten - diese hier zum Nervensystem, diese zum Darm und so weiter. Die besonders geordnete Beziehung der CAMs in Zeit und Raum hat sicherlich etwas mit diesem systematischen Faltprozess zu tun. Lassen Sie mich nun ganz schnell zu meinen nächsten Themen kommen. ob sie auch in anderen Geweben vorliegen - zu in Kultur gezüchteten Nervenzellen das geordnete Muster dieser Nervenzellen völlig verzerre, hier bei Ganglienzellen und Gewebekultur, hier bei Netzhautzellen, deren Schichten in Gegenwart der Antikörper vollständig zerstört worden sind und deren Zellen nicht mehr miteinander in Wechselwirkung treten. in den Zielabschnitten des Gehirns unterbrechen. der recht systematisch ist (soweit nach Lichtstimulation durch Ableitung vom so genannten Tektum, wo der Sehnerv endet, überprüfbar), durch die Gegenwart dieser Antikörper höchst dynamisch und ziemlich radikal unterbrochen wird. Daher sind wir überzeugt, dass die CAMs auch an der Entstehung dieses komplexen Gewebes beteiligt sind. möchte ich nun zu den chemischen Veränderungen zurückkehren. Wie ich bereits erwähnt habe, verändert sich die embryonale Gestalt des neuralen Moleküls von einem hohen zu einem niedrigen Zuckeranteil, und ich möchte Ihnen zeigen, dass sich hierdurch auch seine Bindung verändert. Die Sialsäure sinkt von 30 auf 10 Gramm, was durch diese elektrophoretische Änderung angezeigt wird. Wir haben mit Hilfe eines kinetischen Tests herausgefunden, dass dies tatsächlich der Fall ist. Die embryonale Form bindet sich viermal schneller als die adulte. Wir haben das reine CAM in Lipidvesikel inseriert, die Vesikel in Wechselwirkung treten lassen und festgestellt, dass die Bindungsgeschwindigkeit durch diese Veränderung des Zuckers beeinflusst wird. Verdoppelt man die CAM-Menge in dem Lipidvesikel, steigt die Bindungsgeschwindigkeit sogar noch dramatischer auf mehr als das 30-Fache. Diese chemische Veränderung, die später geschieht (das nächste Dia bitte), reguliert auch die Verteilung. Sie können jetzt in einem Mausembryo bei der Entstehung des Gehirngewebes die geordnete Veränderung von der embryonalen zur adulten CAM-Form, die durch diese große Sialsäure-Verschmierung angezeigt wird, und schließlich zu diesen Formen, die sich rascher binden, erkennen. Wenn das stimmt, sollten die verschiedenen Bereiche des Gehirns auch nach einem unterschiedlichen Plan vorgehen. Das Cerebellum ist schneller als das Rückenmark, das Rückenmark schneller als der cerebrale Cortex. Der Riechkolben mit seinen Empfängerzellen, die im Laufe der Zeit zerstört und abgebaut werden, weist stets eine bestimmte Menge an embryonaler Form auf, sogar bei einer 180 Tage alten Maus. Das gilt auch für den als Diencephalon bezeichneten Abschnitt des Gehirns. Wir gehen daher davon aus, dass diese chemische Veränderung für die Konstruktion von Anlageplänen, wie ich sie Ihnen beim Frosch gezeigt habe, von großer Bedeutung ist. Auf dem nächsten Dia sehen Sie ein Beispiel hierfür bei einer Krankheit. Wir haben die so genannte Staggerer-Mäusemutante gewählt. Diese Mutation bewirkt eine Entkopplung der Zellen im Cerebellum, dem Gleichgewichtsorgan des Gehirns. Wir suchten nach einer E-zu-A-Umwandlung und stellten fest, dass diese Umwandlung bei normalen Mäusen bis Tag 21 ordnungsgemäß vonstattengeht; in der Staggerer-Maus hatte sie sich dagegen auf unbestimmte Zeit verzögert. Dies scheint mit der Entstehung der Verknüpfungen zwischen den einzelnen Zellen des Cerebellums zusammenzuhängen. Wir waren erfreut, diese Beobachtung bei einer nerven-bezogenen Mutante zu machen und nicht bei Mutanten des Cerebellums, die mit glialen Stützzellen in Zusammenhang stehen. Das lenkte unsere Aufmerksamkeit schließlich auf die Frage, ob neue Moleküle involviert sind. Bislang gilt, dass dieselben Moleküle, die an der Entstehung des frühen Embryos beteiligt sind, auch an der Gewebeentstehung, sogar der des Gehirns beteiligt sind. Doch was geschieht, wenn neues Gewebe entsteht? Ich habe über die Bindung von NCAM an NCAM, von Nerv an Nerv bzw. von NCAM an den Muskel via NCAM auf dem Muskel gesprochen, doch wie sieht es mit der Bindung eines Nervs an Gliazellen aus, wenn möglicherweise zwei unterschiedliche Moleküle oder Spezifitäten beteiligt sind? Vor kurzem haben wir mittels eines ähnlichen Tests ein Molekül namens NgCAM (neuron-glia-CAM) isoliert. also lange nach NCAM. Es besitzt auch eine andere Struktur; hier können Sie sie sehen. Das ist NCAM in der embryonalen und in der adulten Form, hier sehen Sie NgCAM. Die beiden Moleküle haben eine recht unterschiedliche Struktur, befinden sich aber interessanterweise im nächsten Dia auf denselben Nervenzellen. Hier oben sind einige NCAM- und NgCAM-gefärbte Nervenzellen in einer Gewebekultur. Wie Sie sehen, befinden sie sich auf denselben Zellen. Kann ich bitte das nächste Dia haben? Es fasst meine Anmerkungen zusammen. Danke. Ich habe mich bislang mit der Frage beschäftigt, ob CAMs etwas mit der frühen und grundlegendsten Festlegung der Gestalt in Raum und Zeit zu tun haben. Jetzt möchte ich mich einer raschen Betrachtung des Nervensystems, dieses höchst komplexen Gewebes zuwenden. Wir stellten fest, dass auch hier dieselben Moleküle beteiligt waren, bei Erscheinen bestimmter Zellen jedoch ein weiteres CAM hinzukam. Ich komme nun nochmals auf diese Abfolge zurück, die ich Ihnen vorher gezeigt habe. Diese CAMs erscheinen gemeinsam, entwickeln sich in der frühen Embryogenese auseinander und senken bzw. erhöhen ihre Konzentration und vermeintlich auch ihre Bindungsgeschwindigkeit. Schließlich erscheinen bei der Entstehung von neuen Geweben wie Gliazellen und dem Nervensystem neue CAMs. Nach dem dynamischen Abschluss der Strukturbildung kommt es vermutlich zu einer chemischen Veränderung in diesen Molekülen. Bitte lassen Sie uns bei diesem Dia bleiben. Könnten Sie bitte das Licht anmachen? Die grundlegende Idee ist folgende: Im Gegensatz zu den Vermutungen, dass die tierische Gestalt das Ergebnis einer sehr großen Anzahl spezieller Moleküle ist, die Andockpunkte für Zellen bilden, die wie bei einem Puzzle ineinander greifen, bewegen sich die Zellen eher wie ein dahinfließender, jedoch von seinen Begrenzungen, d.h. den CAMs kontrollierter Bergbach. Stellen Sie sich vor, der Bergbach trifft auf einen Felsen; dieser vereist und es entwickelt sich ein Eisstrom, der aufgespalten wird. Diese Abfolge scheint von dem dynamischen, molekular gesteuerten Wachstumsprinzip reguliert zu werden. In der Tat besteht die Idee darin, dass die Modulation der CAMs, die offensichtlich das Ergebnis von Genexpressionen infolge dieser verschiedenen Prozesse sind, zur Veränderung der Gewebemuster eine Rückkopplung zu den primären Prozessen bewirkt und sich dieses Bild mit zunehmendem Wachstum und zunehmender Differenzierung dass sich die embryonale Induktion verändert, d.h. dass die die CAM-Expression und -Modulation steuernden Gene mit der Adhäsion interagieren, um die Bewegungen der Zellen und damit die Induktion, die zur Entstehung der verschiedenen Organe und Gewebe führt, zu steuern. Daran besteht kein Zweifel, da auch andere an der Differenzierung von Zellen wie z.B. den vorher genannten Gliazellen beteiligte Steuergene in die Kombination der beiden zunehmend komplexen Strukturen eingreifen. Es handelt sich um Glycoproteine (Könnten Sie bitte das Licht anmachen?), die sich auf der Zelloberfläche befinden, größeren Veränderungen unterliegen, eine Spezifität, aber keine spezifische Andockstelle aufweisen, von Genen, aber nicht nur von ihnen gesteuert werden und Gewebebewegungen, die zu gewebe-abhängigen Differenzierungen und damit zur tierischen Gestalt führen, selbst regulieren. Ich hoffe, das wird Schule mache. Ich muss einfach die Gelegenheit ergreifen, denn hier sind so viele junge Menschen, und ich freue mich, Ihnen von diesem Thema zu berichten, Ihnen zu zeigen, dass wir hier noch in den Kinderschuhen stecken und es in der Wissenschaft ebenso sehr um Fragen als um Antworten geht. Ich erinnere mich an die Bemerkung von van t'Hoff, der sagte, dass die Wissenschaft Phantasie im Dienste der nachweisbaren Wahrheit und als solche unglaublich praktisch ist. Das ist richtig, doch ich möchte für die jungen Leute, die heutzutage vielleicht von der Technik geblendet sind, betonen, dass Wissenschaft auch Poesie ist - Poesie über Geist, Phantasie und Mannigfaltigkeit. Wenn der Mensch eine Lehre aus dieser bescheidenen Geschichte ziehen kann, so ist es die, dass z.B. keine zwei Gehirne - und ganz maßgeblich - auch keine zwei Individuen gleich sind. Niemand kann die Zukunft vorhersagen, nicht einmal die des Embryos, auch wenn es Gesetzmäßigkeiten in den allerkleinsten Details gibt. Ich teile Dr. Arbers Optimismus. Mein Optimismus liegt in der Individualität und ihrer Poesie, und ich hoffe, dass sich alle Stundenten hier an diese kleine Lektion erinnern. Vielen Dank.

Gerald Edelman (1984)

The one-dimensional code and the four-dimensional animal: some molecular bases for embryonic form

Gerald Edelman (1984)

The one-dimensional code and the four-dimensional animal: some molecular bases for embryonic form

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Gerald Edelman came to Lindau with a fascinating story about the discovery of CAMs, Cell Adhesion Molecules. By sticking to the surface of cells, these molecules guide the processes by which cells bind with other cells. In particular they play an important role in the way animals build their nervous systems and achieve their shape and form. This was the second time that Edelman lectured at the Lindau meetings, but already his first lecture in 1975 showed his interest in the research, which eventually led to the discovery of CAMs. With a considerable number of Nobel Laureates in Physiology or Medicine in the audience, it seems that Edelman to some extent gave his lecture for them and only now and then for the students and young scientists. That he was aware of what he was doing is underpinned by the story he tells in the beginning: Someone laughing to jokes given in an un-understandable foreign language just because he trusted that they were funny. Edelman’s lecture must have been to a large part far over the heads of the students and many of the young scientists. It is accompanied with very many slides, sometimes shown very quickly. But when he arrives at the end, a little bit out of breath and maybe with a little bit of a bad conscience, he stops and addresses himself to the young people in the audience. To these he gives several optimistic messages, one of them being that there is much more to find out, another that science is about questions as much as it is about answers. After quoting the very first Nobel Laureate in Chemistry, J.H. van ‘t Hoff, Edelman turns to poetry by noting the similarities of science and poetry, both being about spirit, imagination and variation. Finally, he ends with a more scientific message: No two brains or no two individuals will be alike and no one can predict the embryonic process in all its minute details! Anders Bárány

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