Aaron Ciechanover (2010) - Why our Proteins Have to Die so We Shall Live

SummaryCiechanover starts his lecture with general remarks about the relevance of inspiration and the evolvement in science in general. He wants to show the logical development of science taking his own experience as an example

Just two comments to start, one is less related to my talk, one is more related. We were talking in the first evening about inspiration which is a very hard term to define and to sense and I think that one way to look at inspiration is just to look at the simple stories of evolvement of different discoveries in nature and to follow them and to see, as I told you in the first evening how simple they were. And how possible they were and this will tell you again as I stressed in the first evening that each and every one of you can do it because otherwise much of what you'll hear as an advice of how to succeed in science is what I call cynically wisdom in retrospect. There are no real secrets that you can follow. Obviously there is mentorship and being passionate and love what you do and serendipity and luck which are very important. But I think that looking at the real discoveries, how people really evolved, how experiments evolved and how fields develop, I think is a very useful lesson. The other one is about evolvement of science in general. If you listen carefully to Bob Horvitz talk yesterday and to mine today you will see that science really is very conservative and evolves slowly and in very logical way. People initially wanted to know how proteins are synthesised so it started with Watson and Crick understanding the information and then the central dogma in biology, the flow of information from DNA to RNA to proteins and very few cared about destruction, the idea of destruction. Apoptosis wasn't known at all, why protein should commit suicide, what's the purpose of it. And protein degradation was known vaguely but people didn't attribute any importance to it, it was kind of an end process, non-specific, well we're enjoying the proteins that are around us, they fulfil all the functions and then we somehow dispose of them. But nobody really, people cared how but people didn't attribute too much importance to it. And then time came and all of a sudden this process, apoptosis which is also in many ways a destructive process and now if you follow the field you'll see how autophagy which is another destructive process are really coming into light as major regulatory processes. So I think that it's very interesting also to follow the evolvement from construction to destruction along the, a long time and it has much to say about the development and the logic behind the development of science. So proteins as you know are all chains of amino acids, that's the simple way to put them. And the amino acids are connected by peptide bonds and peptide bonds are, the chemistry is relatively simple, we take amino acids and the arrow, the black arrow is protein synthesis, with all the machinery that's behind it, the DNA, the RNA and then the regulation by a transcription factor when we are extracting a molecule of water from 2 amino acids and align them, put them together and the destructive process, the chemistry is the opposite, it's a hydrolytic reaction where we introduce a molecule of water and take the 2 amino acids apart. Obviously this is the chemistry but not the biology because the 2 arrows are completely separated from one another in nature and the processes are extremely cumbersome and carried out by completely different mechanisms. So when we talk about the chemistry of proteolysis in the body we have recognised proteolysis for decades and it's carrying at different levels of specificity and selectivity and complexity, the simplest one obviously occurs in the gastro intestinal tract where every protein that is coming in is digested in a non-discriminatory manner. First in order not to challenge the immune system, second to use proteins as a source of energy. Once we are crossing into the body, the gastro intestinal tract is actually outside the body, topologically it's a tube crossing the body. Once we are crossing the gastrointestinal lining, we are coming into the circulation so we are inside the body but still extracellular and we encounter already regulated proteolytic systems like the blood coagulation system which is a cascade of proteolytic event that at the end lead to conversion of fibrinogen to fibrin and to formation of the blood clot. This already must be regulated process, we cannot have the blood clotting in the circulation in an uncontrolled manner, it will be fatal. Like we encounter frequently in one of the most common diseases, myocardial infarction or heart attack as it is better known to the public. And Avram and I, Avram actually my mentor with whom I did my PhD work was not interested in those 2, he was interested in intracellular protein degradation, in how the proteins of the cells are degraded and I join him in '76 as a graduate student when he had already some initial findings. And we started the journey, the journey after the mechanism from that point. Now the question is at all why proteins are degraded. And I think that the introductory words, I will pay tribute to the milestone that were already known because nobody really starts from zero, you don't, in biology these days you don't start from scratch, there is always milestones. And people that were behind you, that started the work and I want to point out to these wonderful people but first of all lets go for the principle, why at all we are degrading our proteins, why proteins are not rock stable. First quality control, we are living at 37 degrees, 21% oxygen, many good reasons why to denature and misfold proteins, quality control has also to do with biosynthesis of non-stoichiometric molar base equipment of quantity of different sub units of complex protein then we have to get rid of the excess. So quality control has really become a major problem in pathogenesis of diseases and a major reason why we have to dispose proteins that are misfolded, denatured, not necessary anymore. Then controlling of processes, you heard yesterday from Roger Tsien about, he showed you the beautiful division of cells, the discovery of Tim and Lee Hartwell, Tim Hunt, Lee Hartwell, Paul Nurse. Cell cycle, from time to time many processes. We need to remove proteins that are functional, healthy, but we don't need them anymore. And this is one way that nature controls processes, transcriptional regulators, p53, Meek, NF KappaB, Fos, Jun, all these proteins that we don't need them anymore, nature disposes them. We can obviously think why nature chose such an expensive way to remove a protein, why not to sequester it now, why not to phosphorylate or dephosphorylate it because we know already on other regulatory mechanisms and you are going to hear from Eddie Fischer on other regulatory mechanisms but think about it and we may discuss it this afternoon, why to choose such an expensive way of disposing a healthy protein rather than regulating its activity via another route. And obviously in order to maintain the differentiated and morphogenetic state of tissues, we need to remove proteins permanently and unfortunately some of them come back during malignant transformations. So the founding father of the field, again it's very difficult to define the beginning of the field was Rudolf Schoenheimer, a Jewish German scientist that worked in Freiburg in the '20's and the '30's and then escaped to the United States among, during the rise of Nazis to power and his name among the names of many other Jewish scientists that escaped is now inscribed in history, you see here, Albert Einstein and many people name it and there are many books and reviews on the name, under this title which is called "Hitler's Gift". And people, the authors of these books meant the gift that Hitler gave to the United States basically which started really the conversion of American science from descriptive to more mechanistic as we know it these days. And it's not only in physics but it's also in biology, this is a review written by Eugene Kennedy at Harvard Medical School and you can see here some of them, like Fritz Lipmann, probably one of the greatest biochemists that ever walked on the face of earth. And here is Rudolf Schoenheimer that I'm going to talk about and Konrad Bloch, the discovery of the biosynthetic pathway of cholesterol. And Rudolf Schoenheimer used a very simple technique, he used labelled amino acids, heavy isotope labelled amino acid, he did a pulse chase experiment, he fed the amino acids into rats, the amino acids labelled the proteins and then he found that the label is phasing out. And he concluded that proteins are in a dynamic state. And this is taken from his obituary, he committed suicide in '41 and the New York Times said that his work had established that the living body is a chemical laboratory where varied and complex transformations of matter are taking place incessantly. He summarised his lectures, actually his successor summarised his lecture in a small book called "The Dynamic State of Body Constituents". But the idea was not easily accepted and here came 20 years later a paper by David Hogness, probably the founding father of modern genetics or fly genetics, Mel Cohan, Jacques Monod that you heard so much about him. And they challenged the idea and again I'm not going to tell you about all the experiments, just to read you part of their discussion saying there seems to be at present no conclusive evidence that the protein molecules within the cells of mammalian tissues are in a dynamic state. Remember Rudolf Schoenheimer called his book "The Dynamic State of Body Constituents". And they are not shying out and they are using his very words. Moreover our experiments have shown that proteins of growing E-coli are static. They stay like stones, they don't move, they don't wear and tear. Therefore it seems necessary to conclude that the synthesis and maintenance of proteins within growing cells is not necessarily or inherently associated with a dynamic state, again dynamic state. The 2 words that were used by Schoenheimer are repeated twice in the discussion within 4 lines. So if these big scientist, great scientists, tell you that proteins don't degrade, you should better believe them and stop working on it. And again I am not cynical about this because these were very serious scientists, I just show you the spirit of the attitude at the time of the discovery of the double helix. But things started to move, Mel Simpson at Yale showed that protein degradation paradoxically requires metabolic energy. So this is protein degradation, normal, doesn't matter what he measured, the release of radioactivity to the medium. And once he changed the atmosphere in the incubator from oxygen to nitrogen, protein degradation ceased which didn't make any sense thermodynamically because proteins are high energy macro molecules and they should release energy during the degradation rather than digest and combust energy during their degradation. Which was thermodynamically paradoxical but it hinted that the process is controlled and specific. Whenever there is specificity and control nature pays with a coin called energy, chemically the molecule of ATP. And then came this wonderful scientist Christian de Duve, that was supposed to be here I understand and he discovered this wonderful organelle, the lysosome. And the lysosome is an intercellular organelle that contains proteases inside, it's surrounded by a membrane which protects the sharks. The protease is from the environment and the problem was how the cellular proteins are getting into the lysosomes to be degraded. And extracellular protease during, along the work of many wonderful scientists, among them Mike Brown, Joe Goldstein but many others found that proteins from the outside of the cell coming in to the cell via receptor mediated endocytosis or phagocytosis or pinocytosis. And then they are delivered via a series of vesicles that fuse with the lysosome and they pour their contents into the lysosome to be degraded. And how about intracellular proteins. Intracellular proteins, if you see here the arrow, are pinched off by micro autophagic vesicles from the cytosol, these micro autophagic vesicles become vacuoles and these vacuoles pour their contents into the lysosome to be degraded. So here people already know that proteins are degraded, both extra cellular proteins that the cells digest in the lysosome and Christian de Duve wanted to believe it also. Intracellular proteins and the problem was also always crossing the membrane, how to get into the active proteins that remember are always destructive. But then doubt started to arise whether indeed the lysosome is the organelle that degrades intracellular proteins and I will not take you through all the discussions, I just show you one table taken from a review written by Fred Goldberg, one of the pioneers in the field, in Harvard medical school showing that different proteins have different half-life times. Varying from few minutes to many hours. So how could it be that if you are engulfed in a micro autophagic vesicle that has all the cytosolic proteins in it and you're exposed to the hostile environment in the lysosome, some proteins can survive it forever while others are destroyed? This didn't sound right. And then many other discoveries were found, some of them, obviously the discovery again of Tim Hunt, the beautiful gel that he shows and probably will show here, that the same protein can change its stability. You take cyclin, it's stable all along the cell cycle and here come mitosis and bang within few minutes it's degraded. And people realise that also certain proteins change their stability so this couldn't be explained at all based on the lysosomal hypothesis. So people started to look for other explanations and just again I'm just giving you snap shots into the history, into the milestones that probably guided Avram when he started to work in the field and one of them came from Brian Poole, that was an associate of Christian de Duve at the Rockefeller University. And Brian did a brilliant experiment that I will not go into the details, what he did, he monitored the degradation of intra and extracellular proteins in the same cells. So he labelled cells to monitor their degradation but he also fed cells from the outside with otherwise labelled proteins, with proteins that were labelled with another isotope. And he monitored the degradation under controlled conditions but also under conditions in which he drugged the cell, he treated the cell with chloroquine and chloroquine inhibits the lysosome by dissipating the low intra lysosomal pH, I am sorry, I fail to tell you that the intra lysosomal pH is low, is around 5, which is optimal for the activity of the intra lysosomal proteases. And once you are incubating the cells with chloroquine which is a base like sodium hydroxide but we don't treat cells with sodium hydroxide. It dissipates the intra lysosomal pH, raises it up by 2 logs. And the lysosome is shut down. And what Brian showed, that while the intracellular degradation is not effected by the treatment with chloroquine, you see only mild effect of 17% going down from 4 to 3.3 or from 2.4 to 2.3. The extracellular degradation, the degradation of extra cellular proteins is heavily effected. So he concluded that the lysosome is involved only in the degradation of extra cellular protein because this is inhibitable by shutting down the lysosome but has nothing to do with the degradation of intracellular proteins and probably some other mysterious system is involved in their degradation. And I need to read for you and you'll read yourself the very poetic way in which he put his findings. Let's just read from the middle, not the entire experiment. The exogenous protein, the extracellular proteins will be broken down in the lysosome, why, because we could inhibit the degradation by shutting down the lysosome, while the endogenous proteins will be broken down wherever it is that endogenous proteins are broken down, somewhere, go and find it. This is really very poetic way to put things, not typical to scientists I would say but this was kind of a green light and Brian obviously started to look for this system, he died unfortunately early on, tragically. And then Avram got interested in this problem, did his post doc with Gordon Tompkins, corroborated the findings that protein degradation requires ATP on a very specific protein, that he studied at the time tyrosine amino transfer and then I joined him. In '76 then we started to look after the mechanism. Now when you start to look into a biological system obviously, into a biological problem you need a system. So the system that we picked up is the reticulocyte which is a terminally differentiating cell that doesn't have lysosome, lysosome it already expelled them out during its maturation in the bone marrow. And we started to look into the system in reticulocytes where nature provided us with a cell that doesn't have a background. At that time there was not shRNA or siRNA or knocking down or knocking in, we had to rely on nature and nature trust me always provides you with unbelievable systems. And the first paper we published in '78, and the paper was really illuminating, it was illuminating because it already took us out of paradigm. In a very simple experiment, we took high speed supernate and just the lysate, the extract of the cell and in the extract we already found an ATP dependent proteolytic activity, like here, you can see. And we used just a model substrate. But then like biochemists you want to purify the protease so you put it on a column and you start to split the system and to follow and already the first step, once we put it on an ionic change column, we split the extract into 2 crude fractions, none of the fractions had the activity. Neither fraction 1, nor fraction 1 that was the breakthrough, nor fraction 2 that came at high salt, none of them had the ATP dependent activity but we had to recombine the 2, to reconstitute the 2. Now why would this experiment, was in my opinion probably the most critical experiment we ever done. And therefore I am again taking you to the simplicity of the system. Because the paradigm in the proteolysis field was that for this Tango we need only 2 always. We need a protease and a substrate, you take trypsin, you digest proteins, you take chymotrypsin you digest proteins. Here we needed 3, we needed fraction 1, fraction 2 and the substrate. Now don't forget that fraction 1 and fraction 2 are crude fractions so who told us that fraction 1 has only 1 component, maybe it has 2, maybe it has 20, maybe it has 200. So using this thinking we made the biochemical patch clamping experiment, like Erwin Neyer and Bert Sakmann did. We took one fraction, fraction 1 and we fixed it, we kept it constant and then we took fraction 2, we put it on a column and then again we lost the activity, the complementary activity. So we went back to the column and we found fraction 2A and 2B. Then we said ok let's take 2B and fix it and go to 2A, we went to 2A and we put it on another column and now it went to 2A prime and 2M2 primes. And then we fixed the other one and so on and so forth. At the end we were very lucky and we were able to get all the principle activities of the system, not all the system and to establish the proteolytic activity but mostly to understand the action of the different components, what they are doing and I am going to show it to you in a minute. So at the end of the day we came up with about 8 or 9 factors that were all needed to be present in the test tube. And it took more than 20 years to unravel the human genome, to get the real number of the components of the ubiquitin system, which is close to 2,000. So the ubiquitin system now with all the tributaries and the kinases and the modifying enzyme is almost 7 or 8% of the totally human genome which is about 22,000 plus proteins, not taking genes, not taking into consideration obviously antibodies, spliced genes and products and so on and so forth. So it's a huge system but I think that the hint was already in this very primitive and simple, primitive code by code and simple experiment that we carried out in the late '70's. So we took one of the components, that we purified and we labelled it and we called it at that time APF1 or ATP dependent proteolysis factor 1 and we incubated it with the other factors and we found that once we are adding ATP into the system, if there is no ATP in lane 1, this iodinated labelled protein doesn't attach at all, it may appear to you now as a mystery but in a minute it will be clear. But once we are adding ATP this component, this labelled protein attaches covalently to numerous proteins in the extract. And you can see here in lane 2 that you get radio activity along the lane. And once we added into the system exogenous protein, a known bone fide substrate of the system, we started to see distinct band. So we realised already that there must be probably labelling of the substrate for degradation by the system, it cannot be that this component out of the many components, this APF1 really activates an enzyme. Because if it activates an enzyme it will probably attach to 1 or to 2 components but not to numerous ones. So I'll take you now to the ubiquitin system as we currently know it and you will see that things really get clear. So here is the substrate, the target substrate to be degraded, this is the victim, this is our protein that we want to degrade. In this case the protein is getting phosphorylated. Once it gets phosphorylated it is bound to an enzyme called E3 or ubiquitin ligase. This is the enzyme that binds ubiquitin covalently to the substrate and takes it for degradation. In the data base there are close to 1,000 ligases. So the family of ligases is the family that endow the system with a high specificity and selectivity towards its numerous substrate. And this is again one of the secretes of the system that we were after, what makes the system specific, how is it that one single protein out of many thousand in the cell is selected for degradation at one particular minute. The secret is the selective and specific recognition by the ubiquitin ligase and there are thousands of them that will recognise each a small subset of proteins. Meanwhile a small protein called ubiquitin that turned out to be our APF1, the protein that gets conjugated, that initially we didn't know what it is, gets activated by ATP, by an enzyme called E1, there is a single E1 in the data base. Transferred to another enzyme called E2, there are about 30 E2's in the data base and then bound to the substrate. And is bound covalently, it doesn't bound once, it bounds several times, the first ubiquitin to the substrate, the second ubiquitin to the first ubiquitin and the third to the second and so on and so forth. And we are building a poly ubiquitin chain which is a downstream signal for the substrate to be recognised by a protease. So here is the protease, the protease is the 26S proteasome and the structure of the 26S proteasome was resolved by Wolfgang Baumeister and Robert Huber in the Max Planck institute in Martinsried, in a beautiful study but the prediction that this protein is the one that degrades ubiquitinated proteins came by the work of Marty Rechsteiner. And ubiquitin is a bridge, it's a recognition element in trans, it binds to the substrate, to the protease and leads to unfolding of the substrate. Its injection into the proteolytic chamber which is here, it's a 2 megadalton protease, it's a huge protease, unlike any other protease that we know, it's a regulated protease and degraded into small peptides. So this is the ubiquitin system, I will not go through the chemistry, and meanwhile the ubiquitin system grew up, the data base revealed to us other ubiquitin like proteins and ubiquitin, one of them is SUMO, this is the SUMO warrior but SUMO is not the Japanese sumo warrior, it's the small ubiquitin modifier, that's the name of the protein. And you see that it's very similar to ubiquitin when you align it. Meanwhile other ubiquitin like proteins were discovered. And if we have to define the ubiquitin modifying system this day, it's not a proteolytic system anymore, but it's rather a post translational modifying system in which the modified substrate are being targeted to different purposes. Some of them are being targeted for degradation, some of them are targeted to the nuclear pore complex to be part of the nuclear pore complex, some of them are stabilised by the modification and so on and so forth. So the language of the ubiquitin system became much more rich. Let me just jump now to the very last 2 minutes, to show you the translation of the system into drugs. So again I don't have the time but I'll just give you in 2 minutes a taste why to target at all the ubiquitin system. On the left side you can imagine that the system of 2,000 proteins, if a protein is dis-regulated, either it's excessively degraded and goes below its steady state or it's not degraded and is accumulated, it will lead to disease. And one disease is obviously malignant transformation, again I'm doing a huge injustice to a complex disease but again you can imagine it very simply. On the left hand if an oncogenic protein or a growth promoting protein will not be degraded, it will signal to the cell nonstop, like beta catenin or a mutated EGF receptor and it will cause malignant transformation. And on the other hand if a tumour suppressor like B53 will be excessively degraded and this is the part of the work of Harald zur Hausen about the human papillomavirus that targets B53 for degradation, then again we shall face malignant transformation. So here you can understand why any aberration and it depends on the protein affected, will and can lead to malignant transformation and there are many other reasons for that. So now where to target the ubiquitin system, obviously the best place to target the ubiquitin system will be at the recognition plane between the substrate and the ligases because this is the broadest plane where we expect the least side effects. But the first drug was a proteasome inhibitor, still very successful drug and it's an active inhibitor, it's an inhibitor of the active site of the tryonine residue in the active site inside the proteasome. And I'll show you, this is the drug, it's called Velcade or Bortezomib, it's already in the market and I'll show you just the disease and the disease is multiple myeloma. Multiple myeloma is a type of a blood leukaemia where b cells expand, one clone of b cell expands, monoclonal expansion of a b cell, they push away all the other normal progenitors of the bone marrow and it's a deadly disease because we are losing all other elements of the bone marrow, pathologic fractures of the vertebra, of the long bones. And here you can see these cells secret an immunoglobulin so you see that the immunoglobulin is riding, then there is a little drop here when chemotherapy started but then the patient relapses and here is treatment with a proteasome inhibitor is started and you see that the immunoglobulin go down to signify the shrinkage of the tumour. And 2 last slides, here you can see the bone marrow, just to give you an idea without being histo hematopathologist, you see on the left side the malignant bone marrow, that is homogeneous, 41% of the cell of malignant and following treatment you can see that the mass of the malignant cells went down to 1% and the bone marrow is occupied again, repopulated again with the normal progenitors. And the last one, a cousin disease which is called non-Hodgkin Lymphoma, and you can see here a tumour, this is a computerised tomography, a CAT scan of the chest, a section, cut section, you see here the lungs, the ribs, the sternum, the vertebra and you can see here a tumour that sits at the gate of the right lung. And you can see here that the tumour resist. So I tried in 30 minutes to take you through a huge marathon from an idea that wasn't that well accepted at the '70's and now became a major regulatory platform, not only for biological processes but also drug development. And I think that there is much to learn from this simple approach and I think that at the end of this meeting if you'll take all those simple stories that you heard from Bob and from Roger and from many others, you will see that nature is complex but the beginnings of the discoveries are always, as I said on Sunday, embarrassingly simply. So thank you very much.

Nur zwei Bemerkungen zu Beginn, von denen die eine weniger und die andere mehr mit meinem Vortrag zu tun hat. Am ersten Abend sprachen wir über Inspiration. Dieser Begriff ist sehr schwer zu definieren und zu erfassen, und ich bin der Meinung, dass eine Möglichkeit, Inspiration zu betrachten, darin besteht, sich die einfachen Geschichten der Entwicklung verschiedener Entdeckungen in der Natur anzuschauen und diesen nachzugehen und, wie ich Ihnen am ersten Abend erzählte, zu erkennen, wie einfach sie waren. Dies wird Ihnen wieder zeigen, dass, wie ich am ersten Abend betonte, jeder einzelne von Ihnen es schaffen kann, denn andernfalls ist Vieles von dem, was Sie als Ratschlag dazu zu hören bekommen, wie man in der Wissenschaft Erfolg hat, etwas, das ich zynisch als „Weisheit im Nachhinein“ bezeichne. Es gibt keine wirklichen Erfolgsgeheimnisse, an die Sie sich halten können. Natürlich spielt Mentorschaft eine Rolle, und selbstverständlich ist es wichtig, mit Leidenschaft an die Arbeit zu gehen und seine Arbeit zu lieben, und Glück und Zufall sind ebenso von Bedeutung. Dennoch glaube ich, dass es eine sehr nützliche Lektion ist, sich die tatsächlichen Entdeckungen anzuschauen und sich die Forschungsgebiete herausbildeten. Die andere Vorbemerkung bezieht sich auf die Entwicklung der Wissenschaft im Allgemeinen. Wenn Sie dem Vortrag von Bob Horvitz gestern und meinem Vortrag heute aufmerksam zugehört haben und zuhören, werden Sie feststellen, dass Wissenschaft tatsächlich sehr konservativ ist und sich langsam und auf sehr logische Art und Weise weiterentwickelt. Anfangs wollten die Menschen wissen, wie Proteine synthetisiert werden, und so begann es mit Watson und Crick, die die Information und dann das zentrale Dogma der Biologie, den Informationsfluss von der DNA zur RNA zu den Proteinen erkannten, und nur sehr wenige interessierten sich für die Zerstörung, die Idee der Zerstörung. Apoptose war überhaupt nicht bekannt. Warum sollten Proteine Selbstmord begehen, welchen Sinn hat das? Vom Proteinabbau hatte man eine vage Ahnung, aber man schrieb ihm keine Bedeutung zu. Er war eine Art von abschließendem Prozess, unspezifisch – wir freuen uns über die Proteine um uns herum, sie erfüllen all die Funktionen und dann entledigen wir uns ihrer irgendwie. Man interessierte sich für das Wie, aber maß dem Vorgang keine allzu große Bedeutung bei. Zeit verging, und auf einmal bekam dieser Prozess, die Apoptose, die in vielerlei Hinsicht ein destruktiver Prozess ist, Bedeutung, und wenn Sie jetzt diesen Forschungsbereich verfolgen, dann werden Sie sehen, dass die Apoptose und die Autophagie, die ein anderer destruktiver Prozess ist, als wichtige Regulierungsprozesse ans Licht kommen. Ich finde es sehr interessant, auch die Entwicklung von Bildung und Aufbau zu Zerstörung und Abbau über eine lange Zeit hinweg zu verfolgen. Diese Entwicklung sagt viel über die Entwicklung der Wissenschaft und die dieser Entwicklung zu Grunde liegende Logik aus. Wie Sie wissen, sind alle Proteine Aminosäureketten – das ist die einfache Art und Weise, sie zu beschreiben. Die Aminosäuren sind durch Peptidbindungen verbunden. Die Chemie ist verhältnismäßig einfach. Wir nehmen Aminosäuren, und der Pfeil, der schwarze Pfeil ist die Proteinsynthese, mit dem gesamten Mechanismus, der dahinter steht, der DNA, der RNA und dann der Regulierung mittels eines Transkriptionsfaktors, wenn wir ein Wassermolekül aus zwei Aminosäuren extrahieren und sie aneinander ausrichten, sie zusammensetzen. Die Chemie des destruktiven Prozesses ist das Gegenteil. Es handelt sich um eine hydrolytische Reaktion, bei der wir ein Wassermolekül einbringen und die beiden Aminosäuren zerlegen. Offensichtlich ist dies die Chemie, aber nicht die Biologie, denn in der Natur sind die zwei Pfeile vollständig voneinander getrennt und die Prozesse sind sehr umständlich und werden von völlig unterschiedlichen Mechanismen durchgeführt. Wenn wir also von der Chemie der Proteolyse im Körper sprechen, dann haben wir die Proteolyse schon seit Jahrzehnten erkannt, und sie vollzieht sich auf verschiedenen Ebenen der Spezifität, Selektivität und Komplexität. Die einfachste Form der Proteolyse findet offensichtlich im Magendarmkanal statt, wo jedes eintreffende Protein auf unspezifische Art und Weise verdaut wird, damit erstens das Immunsystem nicht angegriffen wird und zweitens die Proteine als Energiequelle verwendet werden können. Wenn wir uns in den Körper begeben und die Auskleidung des Magendarmkanals überqueren und stellt, topologisch betrachtet, eine Röhre dar, die den Körper durchzieht), gelangen wir in den Blutkreislauf und befinden uns somit innerhalb des Körpers, aber immer noch außerhalb der Zellen, und treffen bereits auf regulierte proteolytische Systeme wie das System der Blutgerinnung, das aus einer Kaskade proteolytischer Ereignisse besteht, die letztendlich zur Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin und zur Bildung des Blutkoagulums führen. Dies muss bereits ein regulierter Prozess sein. Die Blutgerinnung darf innerhalb des Blutkreislaufs nicht auf unkontrollierte Art und Weise stattfinden, dies wäre fatal und tritt häufig bei einer der am weitesten verbreiteten Krankheiten auf, dem Myokardinfarkt oder Herzinfarkt, wie er allgemein besser bekannt ist. Avram, der eigentlich mein Mentor war, bei dem ich an meiner Dissertation arbeitete, interessierte sich nicht für diese zwei Prozesse, er interessierte sich für den intrazellulären Proteinabbau, dafür, wie die Proteine der Zelle abgebaut werden. Ich schloss mich ihm 1976 als Doktorand an, als er bereits einige erste Ergebnisse gefunden hatte. Und wir begannen die Reise, die Suche nach dem Mechanismus ab diesem Punkt. Die Frage ist nun, warum Proteine überhaupt abgebaut werden. Und ich denke, mit Bezug auf die einleitenden Bemerkungen werde ich den Meilensteinen, die bereits bekannt waren, Tribut zollen, denn niemand beginnt wirklich bei Null. Heutzutage fängt man in der Biologie nicht ganz von vorne an, es gibt immer Meilensteine. Und es gibt Leute, die schon vor einem die Arbeit begannen, und ich möchte diese wunderbaren Leute hervorheben. Aber als allererstes sollten wir uns um die grundlegende Frage kümmern, warum wir überhaupt Proteine abbauen, warum Proteine nicht völlig stabil sind. Der erste Grund ist die Qualitätskontrolle. Wir leben bei 37 ° C Körpertemperatur, 21 % Sauerstoff – viele gute Gründe, warum Proteine denaturieren oder fehlerhaft gefaltet werden. Die Qualitätskontrolle hat auch mit der Biosynthese von nicht-stöchiometrischer molarer Menge von verschiedenen Untereinheiten komplexer Proteine zu tun. Dann müssen wir den Überschuss loswerden. Qualitätskontrolle ist in der Tat zu einer wichtigen Problematik der Pathogenese von Krankheiten geworden und ist ein Hauptgrund dafür, dass wir uns der Proteine entledigen müssen, die fehlerhaft gefaltet, denaturiert und nicht länger erforderlich sind. Dann haben wir die Steuerung von Prozessen. Darüber haben Sie gestern etwas von Roger Tsien gehört. Er zeigte Ihnen die schöne Teilung von Zellen, die Entdeckung von Tim und von Lee Hartwell, Tim Hunt, Lee Hartwell, Paul Nurse. Der Zellzyklus, mit vielen Prozessen zu jedem Zeitpunkt. Wir müssen Proteine entfernen, die funktionsfähig und gesund sind, aber die wir nicht mehr benötigen. Und dies ist ein Weg, auf dem die Natur Prozesse steuert, Transkriptionsregulatoren, p53, Meek, NF-kappaB, FOS, JUN Wir können uns natürlich vorstellen, warum die Natur solch einen aufwändigen Weg wählte, um ein Protein zu beseitigen, warum sie es nicht bindet, es phosphoryliert oder dephosphoryliert, denn wir kennen bereits andere Regulierungsmechanismen, und Sie werden von Eddie Fischer etwas über diese anderen Regulierungsmechanismen erfahren. Aber denken Sie darüber nach, und vielleicht werden wir heute Nachmittag darüber diskutieren, warum man eher einen solch aufwändigen Weg wählen sollte, um ein gesundes Protein zu entsorgen, anstatt seine Aktivität auf einem anderen Weg zu regulieren. Und offensichtlich müssen wir, um den differenzierten und morphogenetischen Zustand der Gewebe aufrechtzuerhalten, Proteine dauerhaft beseitigen, und unglücklicherweise kehren einige von ihnen bei bösartigen Veränderungen zurück. Der Gründervater dieses Fachgebiets – wobei es wiederum sehr schwierig ist, den Beginn des Fachgebiets zu bestimmen – war Rudolf Schönheimer, ein deutscher jüdischer Wissenschaftler, der in den 1920er und 1930er Jahren in Freiburg arbeitete und dann in die Vereinigten Staaten flüchtete, als die Nazis an die Macht kamen. Zusammen mit den Namen vieler anderer jüdischer Wissenschaftler, die damals flohen, ist sein Name nun in die Geschichte eingeschrieben. Zu diesen gehören Albert Einstein und viele andere, und es gibt viele Bücher und Aufsätze zu diesem Thema, das als “Hitlers Geschenk” bekannt ist. Die Autoren dieser Bücher möchten damit sagen, dass Hitler den Vereinigten Staaten ein Geschenk machte, welches im Wesentlichen dazu führte, dass sich die amerikanische Naturwissenschaft von einer deskriptiven zu einer mehr mechanistischen Wissenschaft wandelte, wie wir sie heute kennen. Dies betrifft nicht nur die Physik, sondern auch die Biologie. Hier haben wir einen Aufsatz, der von Eugene Kennedy an der Harvard Medical School verfasst wurde, und Sie können hier einige von diesen Wissenschaftlern sehen, wie Fritz Lipmann, wahrscheinlich einer der bedeutendsten Biochemiker, die je geboren wurden. Hier sind Rudolf Schönheimer, von dem ich gleich sprechen werde, und Konrad Bloch, denen wir die Entdeckung der Einzelschritte der Biosynthese von Cholesterol verdanken. Rudolf Schönheimer bediente sich eines sehr einfachen Verfahrens. Er verwendete markierte Aminosäuren, mit schweren Isotopen markierte Aminosäuren, führte ein Pulse-Chase-Experiment durch, verfütterte die Aminosäuren an Ratten, die Aminosäuren markierten die Proteine, und dann stellte er fest, dass die Markierung allmählich verschwand. Er schlussfolgerte, dass Proteine sich in einem dynamischen Zustand befinden. Dies hier stammt aus seinem Nachruf – er beging 1941 Selbstmord –, und die New York Times schrieb, dass seine Arbeit nachgewiesen habe, dass der lebende Körper ein chemisches Labor ist, in dem unaufhörlich verschiedene komplexe Umwandlungen von Stoffen stattfinden. Er – oder vielmehr sein Nachfolger – fasste seine Vorträge in einem kleinen Buch mit dem Titel „The Dynamic State of Body Constituents“ zusammen. Dieses Konzept wurde jedoch nicht ohne weiteres akzeptiert. oder der Genetik der Fliegen ist, Mel Cohan und Jacques Monod, über den Sie schon viel gehört haben. Sie hinterfragten dieses Konzept – wieder werde ich Ihnen nicht alles über die Experimente erzählen, sondern Ihnen nur einen Auszug aus ihrer Diskussion vorlesen, in der gesagt wird, dass es derzeit kein stichhaltiges Beweismaterial dafür gebe, dass sich die Moleküle in den Zellen der Gewebe von Säugetieren in einem dynamischen Zustand befinden. Erinnern Sie sich daran, dass Rudolf Schönheimer seinem Buch den Titel „The Dynamic State of Body Constituents“ gab. Sie scheuen nicht vor der Konfrontation zurück, und sie verwenden seine eigenen Worte. Darüber hinaus haben unsere Experimente gezeigt, dass die Proteine von wachsenden E.coli-Bakterien statisch sind. Sie sind wie Steine, sie bewegen sich nicht, sie verschleißen nicht. Daher scheint die Schlussfolgerung unumgänglich, dass die Synthese und Aufrechterhaltung von Proteinen in wachsenden Zellen nicht notwendigerweise oder von Natur aus mit einem dynamischen Zustand in Zusammenhang steht Die beiden von Schönheimer verwendeten Worte werden in dieser Diskussion innerhalb von vier Zeilen zweimal wiederholt. Wenn Ihnen also diese bedeutenden Wissenschaftler, diese großen Wissenschaftler sagen, dass Proteine nicht abgebaut werden, dann sollten Sie Ihnen besser Glauben schenken und nicht weiter daran forschen. Ich meine dies wiederum nicht zynisch, denn es handelte sich wirklich um sehr ernstzunehmende Wissenschaftler Aber allmählich veränderten sich die Dinge. Mel Simpson an der Yale University wies nach, dass der Proteinabbau paradoxerweise Stoffwechselenergie erforderte. Dies also ist der Proteinabbau, normal, es spielt keine Rolle, was er gemessen hatte, die Freisetzung von Radioaktivität in das Medium. Sobald er die Atmosphäre innerhalb des Inkubators von Sauerstoff zu Stickstoff veränderte, wurde der Proteinabbau angehalten. Aus thermodynamischer Sicht ergab das keinen Sinn, da Proteine energiereiche Makromoleküle sind und während des Abbaus Energie freisetzen sollten, anstatt Energie aufzunehmen und zu verbrennen. Thermodynamisch betrachtet war das paradox, aber es deutete darauf hin, dass der Prozess gesteuert und spezifisch ist. Wo immer es Spezifität und Steuerung gibt, bezahlt die Natur mit einer Münze namens Energie, chemisch gesehen mit dem ATP-Molekül. Und dann kam dieser wunderbare Wissenschaftler Christian de Duve dazu, der, wie ich höre, hier sein sollte, und er entdeckte dieses wunderbare Organell, das Lysosom. Das Lysosom ist ein interzelluläres Organell, das Proteasen enthält und von einer Membran umgeben ist, die die Haie, die Proteasen, vor der Umwelt schützt. Die Frage war, wie die zellulären Proteine in die Lysosome hineingelangen, um abgebaut zu werden. Durch die Arbeit vieler wunderbarer Wissenschaftler, darunter Mike Brown, Joe Goldstein und viele andere, fand man heraus, dass die extrazelluläre Protease die Endozytose oder Phagozytose oder Pinozytose der Proteine bewirkt, die von außerhalb der Zelle mittels eines Rezeptors in die Zelle hineingelangen. Dann werden die Proteine durch eine Folge von Vesikeln, die sich mit dem Lysosom zusammenschließen, weiter transportiert, und sie geben ihren Inhalt in das Lysosom ab, damit er dort abgebaut wird. Wie verhält es sich mit intrazellulären Proteinen? Intrazelluläre Proteine werden, wenn Sie den Pfeil hier betrachten, von autophagischen Mikro-Vesikeln vom Zytosol abgeschnürt. Diese autophagischen Mikro-Vesikel werden zu Vakuolen, und diese Vakuolen geben ihren Inhalt in das Lysosom ab, damit er dort abgebaut wird. Man weiß hier also bereits, dass Proteine abgebaut werden, sowohl die extrazellulären Proteine, die von den Zellen im Lysosom verdaut werden, und, wie Christian de Duve glauben wollte, auch die intrazellulären Proteine. Problematisch war hier immer auch das Überqueren der Membran Doch dann erhoben sich erste Zweifel, ob das Lysosom tatsächlich das Organell ist, das die intrazellulären Proteine abbaut. Ich will Sie nicht durch all die Diskussionen führen, sondern zeige Ihnen nur eine Aufstellung aus einem Artikel, der von Fred Goldberg, einem der Pioniere dieses Fachgebiets, an der Harvard Medical School verfasst wurde. Sie zeigt, dass unterschiedliche Proteine unterschiedliche Halbwertszeiten haben, die von wenigen Minuten bis zu mehreren Stunden variieren können. Wie konnte es möglich sein, dass, umflossen von einem autophagischen Mikro-Vesikel und der feindlichen Umgebung im Lysosom ausgesetzt, einige Proteine ewig überleben konnten, während andere zerstört wurden? Dies klang nicht richtig. Dann wurden viele weitere Entdeckungen gemacht, darunter natürlich wiederum die Entdeckung von Tim Hunt, das wunderschöne Gel, das er [immer] vorführt und wahrscheinlich auch hier vorführen wird, die Entdeckung, dass dasselbe Protein seine Stabilität verändern kann. Nehmen Sie den Zellzyklus – das Protein ist während des gesamten Zellzyklus stabil, dann findet die Mitose statt, und auf einmal wird es innerhalb weniger Minuten abgebaut. Man erkannte, dass auch bestimmte andere Proteine ihre Stabilität verändern können, und das konnte auf der Grundlage der Lysosom-Hypothese überhaupt nicht erklärt werden. Man begann daher, nach anderen Erklärungen zu suchen. Wieder gebe ich Ihnen nur Momentaufnahmen aus der Geschichte, Schnappschüsse von den Meilensteinen, die Avram wahrscheinlich leiteten, als er in diesem Gebiet zu arbeiten begann. Einer dieser Meilensteine ist Brian Poole zu verdanken, einem Kollegen von Christian de Duve an der Rockefeller University. Brian führte ein brillantes Experiment durch – ich werde nicht auf die Details eingehen – und beobachtete den Abbau intra- und extrazellulärer Proteine in denselben Zellen. Er markierte die Zellen, um den Abbau zu verfolgen, aber er verfütterte auch Zellen von außerhalb mit anders markierten Proteinen, mit Proteinen, die mit einem anderen Isotop markiert waren. Er beobachtete den Abbau unter kontrollierten Bedingungen, aber auch unter Bedingungen, bei denen er die Zellen mit Medikamenten behandelte. Er führte ihnen Chloroquin zu. Chloroquin hemmt das Lysosom, indem es den niedrigen intra-lysosomalen pH-Wert zerstört. Ich bitte um Entschuldigung – ich hatte Ihnen noch nicht gesagt, dass im Inneren des Lysosoms ein niedriger pH-Wert von ungefähr 5 herrscht, der für die Aktivität der intra-lysosomalen Proteasen optimal ist. Chloroquin ist eine Base, ähnlich wie Natriumhydroxid. Allerdings behandelt man Zellen nicht mit Natriumhydroxid. Wenn Sie die Zellen mit Chloroquin inkubieren, ändert dies den intra-lysosomalen pH-Wert und erhöht ihn um zwei Logarithmen, und das Lysosom stellt seine Aktivität ein. Brian wies nach, dass der extrazelluläre Abbau, der Abbau extrazellulärer Proteine, in hohem Maße beeinträchtigt wird, während der intrazelluläre Abbau durch die Behandlung mit Chloroquin kaum beeinflusst wird. Man erkennt nur eine leichte Auswirkung, der Abbau reduziert sich um 17 % von 4 auf 3,3 oder von 2,4 auf 2,3. Somit gelangte er zu der Schlussfolgerung, dass das Lysosom nur am Abbau extrazellulären Proteins beteiligt ist, denn dieser Abbau kann gehemmt werden, wenn man das Lysosom stilllegt, dass es aber nichts mit dem Abbau intrazellulärer Proteine zu tun hat und dass wahrscheinlich ein anderes geheimnisvolles System am Abbau dieser Proteine beteiligt ist. Ich muss Ihnen vorlesen, auf welche sehr poetische Art und Weise er seine Erkenntnisse in Worte fasste, und Sie werden es selbst lesen. Lassen Sie uns etwas aus dem Mittelteil lesen, nicht das gesamte Experiment. indem wir das Lysosom stilllegten – „wohingegen die endogenen Proteine dort zerlegt werden, wo auch immer endogene Proteine zerlegt werden.“ Irgendwo – gehen Sie hin und finden Sie heraus, wo. Das ist wirklich sehr poetisch ausgedrückt und, wie ich finde, nicht typisch für Naturwissenschaftler. Es war eine Art von grünem Licht, und natürlich begann Brian, nach diesem System Ausschau zu halten. Leider starb er schon früh auf tragische Weise. Dann begann Avram, sich für diese Fragestellung zu interessieren. Er promovierte bei Gordon Tompkins, bestätigte die Erkenntnis, dass für den Proteinabbau ATP bei einem sehr spezifischen Protein erforderlich ist, das er zu diesem Zeitpunkt untersuchte Wenn man beginnt, ein biologisches System, eine biologische Fragestellung zu untersuchen, dann braucht man selbstverständlich ein System. Das System, das wir uns aussuchten, war der Retikulozyt. Dabei handelt es sich um eine begrenzt differenzierende Zelle, die nicht über ein Lysosom verfügt, da sie während ihres Heranreifens im Knochenmark das Lysosom bereits ausgestoßen hat. Wir fingen an, das System in den Retikulozyten zu untersuchen, mit denen uns die Natur eine Zelle zur Verfügung stellte, die keinen Hintergrund hat. Damals gab es weder shRNA noch siRNA, keine An- und Abschaltung, wir mussten uns auf die Natur verlassen Sie war aufschlussreich, denn sie führte uns bereits über das Paradigma hinaus. In einem sehr einfachen Experiment verwendeten wir ein Hochgeschwindigkeits-Supernat und nur das Lysat, den Zellextrakt. In dem Extrakt stellten wir schon eine ATP-abhängige proteolytische Aktivität fest, wie Sie hier sehen können. Wir verwendeten einfach ein Modell-Substrat. Doch dann möchte man wie Biochemiker die Protease jedoch in reiner Form gewinnen. Also bedienten wir uns einer Trennsäule und begannen, das System aufzuspalten. Nachdem wir das Extrakt in einen Ionenaustauscher gegeben hatten, spalteten wir es bereits im ersten Schritt in zwei grobe Teile auf. Keiner dieser beiden wies die Aktivität auf. Weder Teil 1, was den Durchbruch bedeutete, noch Teil 2, der sich bei hohem Salzgehalt ergab, zeigte die ATP-abhängige Aktivität. Wir mussten die beiden Teile wieder miteinander kombinieren, wir mussten die Kombination der beiden wiederherstellen. Dieses Experiment war meiner Ansicht nach das wichtigste Experiment, das wir je durchgeführt hatten. Daher nehme ich Sie wieder mit zu der Einfachheit des Systems. Das Paradigma auf dem Gebiet der Proteolyse besagte, dass für diesen Tango immer nur zwei Partner erforderlich waren. Wir benötigen eine Protease und ein Substrat. Wenn man Trypsin einsetzt, werden Proteine verdaut, wenn man Chymotrypsin einsetzt, werden Proteine verdaut. Hier benötigten wir drei Teile, wir benötigten Teil 1, Teil 2 und das Substrat. Vergessen Sie nicht, dass Teil 1 und Teil 2 grobe Teile sind. Wer sagt uns, dass Teil 1 nur eine Komponente enthält – vielleicht enthält er 2 Komponenten, vielleicht 20, vielleicht 200. Mit Hilfe dieser Überlegungen führten wir das biochemische Patch-Clamp-Experiment durch, wie Erwin Neher und Bert Sakmann dies taten. Wir nahmen einen Teil, Teil 1, und fixierten ihn, hielten ihn konstant, und dann nahmen wir Teil 2, brachten ihn in eine Trennsäule ein und verloren wieder die Aktivität, die komplementäre Aktivität. Wir gingen also zur Trennsäule zurück und entdeckten die Teile 2A und 2B. Dann sagten wir uns: Gut, wir nehmen 2B und fixieren diesen Teil und gehen dann zu 2A über. Dann gingen wird zu 2A und brachten diesen Teil in eine weitere Trennsäule, und nun ging es weiter zu 2A’ und 2M’’. Dann fixierten wir den anderen Teil und so weiter und so fort. Letztendlich hatten wir sehr viel Glück und konnten alle grundlegenden Aktivitäten des Systems feststellen, nicht das gesamte System, und die proteolytische Aktivität nachweisen. Vor allem konnten wir die Aktivitäten der verschiedenen Komponenten verstehen, was sie jeweils taten. Das werde ich Ihnen gleich zeigen. Im Endeffekt hatten wir schließlich acht oder neun Faktoren, die alle im Reagenzglas vorliegen mussten. Es dauerte mehr als 20 Jahre, um das menschliche Genom zu enträtseln und die tatsächliche Anzahl der Komponenten des Ubiquitin-Systems zu bestimmen, die nahe bei 2000 liegt. Das Ubiquitin-System mit allen Zubringern, den Kinasen und den modifizierenden Enzymen macht fast 7 oder 8 % des gesamten menschlichen Genoms aus, das ungefähr 22.000 und mehr Proteine umfasst, wobei hier natürlich Antikörper, gespleißte Gene und Produkte etc. nicht berücksichtigt sind. Es handelt sich also um ein umfangreiches System. Doch ich glaube, dass bereits dieses sehr "primitive" und einfache Experiment, das wir in den späten 1970er Jahren durchführten, einen Hinweis auf dieses System darstellte. Wir nahmen also eine der Komponenten, die wir in einer reinen Form gewonnen hatten, und markierten sie. Damals bezeichneten wir diese Komponente als APF1 oder ATP-abhängigen Proteolyse-Faktor 1. Wir inkubierten diesen Faktor mit den anderen Faktoren und stellten bei Zugabe von ATP in das System fest, dass dieses mit Jod markierte Protein sich überhaupt nicht anheftet, wenn sich kein ATP in Bahn 1 befindet. Das mag Ihnen jetzt noch rätselhaft erscheinen, aber in einer Minute wird es klar werden. Sobald wir ATP hinzufügen, heftet sich diese Komponente, dieses markierte Protein kovalent an zahlreiche Proteine in dem Extrakt. Hier in Bahn 2 können Sie sehen, dass man entlang dieser Bahn Radioaktivität bekommt. Als wir dem System exogenes Protein hinzufügten, ein bekanntes angemessenes Substrat des Systems, begannen wir, ein deutliches Band zu sehen. Somit erkannten wir bereits, dass es wahrscheinlich eine Markierung des Substrats für den Abbau durch das System geben muss. Es ist unmöglich, dass diese Komponente von den vielen Komponenten, dieses APF 1 tatsächlich ein Enzym aktiviert. Denn wenn es ein Enzym aktiviert, dann wird es sich wahrscheinlich an eine oder zwei Komponenten anheften, aber nicht an zahlreiche. Ich gehe mit Ihnen jetzt zum Ubiquitin-System, wie wir es zur Zeit kennen, und Sie werden sehen, dass die Dinge jetzt wirklich klar werden. Hier ist also das Substrat, das Ziel-Substrat, das abgebaut werden soll. Dies ist das Opfer, das ist unser Protein, das wir abbauen möchten. In diesem Fall wird das Protein phosphoryliert. Sobald es phosphoryliert wird, wird es an ein E3 oder Ubiquitin-Ligase genanntes Enzym gebunden. Das ist das Enzym, das Ubiquitin kovalent an das Substrat bindet und dem Abbau zuführt. In der Datenbank befinden sich nahezu 1.000 Ligasen. Die Familie der Ligasen ist die Familie, die das System mit einem hohen Maß an Spezifität und Selektivität in Bezug auf die zahlreichen Substrate ausstattet. Das ist wieder eines der Geheimnisse des Systems, denen wir auf der Spur waren: Was macht das System spezifisch? Wie kommt es dazu, dass ein einziges Protein von den vielen Tausend Proteinen in der Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt zum Abbau ausgewählt wird? Das Geheimnis besteht in der selektiven und spezifischen Erkennung durch die Ubiquitin-Ligase. Von diesen gibt es Tausende, von denen eine jede eine kleine Untereinheit von Proteinen erkennt. Währenddessen wird ein kleines Protein namens Ubiquitin, das sich als unser APF1 erwies, das Protein, das konjugiert wird und von dem wir anfangs nicht wussten, was es war, durch ATP aktiviert, und zwar von einem als E1 bezeichneten Enzym. In der Datenbank gibt es ein einziges E1. Dann wird es auf ein anderes Enzym namens E2 übertragen. Es liegen ungefähr 30 E2 in der Datenbank vor. Anschließend wird es an das Substrat gebunden. Es wird kovalent gebunden, nicht einfach, sondern mehrfach. Das erste Ubiquitin wird an das Substrat gebunden, das zweite Ubiquitin wird an das erste Ubiquitin und das dritte an das zweite gebunden und so weiter und so fort. Es bildet sich eine Poly-Ubiquitin-Kette, die ein nachgeschaltetes Signal darstellt, damit das Substrat von einer Protease erkannt wird. Hier ist also die Protease, die Protease ist das 26S-Proteasom. Die Struktur des 26S-Proteasoms wurde von Wolfgang Baumeister und Robert Huber am Max Planck-Institut in Martinsried in einer sehr schönen Studie aufgeklärt. Die Vorhersage, dass dieses Protein dasjenige ist, welches ubiquitinierte Proteine abbaut, stammt jedoch aus der Arbeit von Marty Rechsteiner. Ubiquitin ist eine Brücke, ein Erkennungselement, ein Eingang. Es bindet sich an das Substrat, an die Protease und führt zur Auffaltung des Substrats. Hier ist die Injektion in die proteolytische Kammer dargestellt. Es handelt sich um eine 2 Megadalton-Protease, eine sehr große Protease, im Gegensatz zu allen anderen uns bekannten Proteasen. Es ist eine regulierte Protease, und das Protein wird zu kleinen Peptiden abgebaut. Das ist also das Ubiquitin-System – ich werde nicht die Chemie durchexerzieren –, und das Ubiquitin-System wuchs, und die Datenbank enthüllte uns andere Ubiquitin-ähnliche Proteine. Eines davon ist SUMO, das ist der SUMO-Krieger, aber es handelt sich nicht um den japanischen Sumo-Kämpfer, sondern um den kleinen Ubiquitin-Modifizierer (small ubiquitin modifier) – das ist der Name des Proteins. Sie sehen, dass es dem Ubiquitin sehr ähnlich ist, wenn man es daran ausrichtet. Inzwischen wurden weitere Ubiquitin-ähnliche Proteine entdeckt. Und wenn wir heute das System der Ubiquitin-Modifizierung definieren sollen, so handelt es sich nicht länger um ein proteolytisches System, sondern eher um ein post-translationales Modifizierungs-System, in dem auf die modifizierten Substrate zu unterschiedlichen Zwecken abgezielt wird. Einige werden gezielt abgebaut, einige werden ausgewählt, um Teil des Kernporen-Komplexes zu werden, andere werden durch die Modifizierung stabilisiert und so weiter und so fort. Die Sprache des Ubiquitin-Systems wurde sehr viel reicher. Lassen Sie mich nun zu den letzten zwei Minuten meines Vortrags springen und Ihnen die Umsetzung dieses Systems in Medikamente zeigen. Wieder habe ich nicht die Zeit, aber ich werde Ihnen in zwei Minuten einen Vorgeschmack darauf geben, warum man sich auf das Ubiquitin-System konzentrieren sollte. Wenn in diesem System von 2.000 Proteinen ein Protein fehlreguliert ist, verursacht es Krankheiten. Entweder wird es im Übermaß abgebaut und unterschreitet seinen Gleichgewichtszustand, oder es wird nicht abgebaut und reichert sich an. Maligne Transformationen sind eine solche Krankheit – ich tue einer komplexen Erkrankung hiermit massives Unrecht, aber Sie können sich das sehr einfach vorstellen. Links sehen Sie, dass ein onkogenes Protein oder ein Wachstum förderndes Protein, wenn es nicht abgebaut wird, der Zelle ein Nonstop-Wachstum signalisiert. Dies ist der Fall bei beta-Catenin oder einem mutierten EGF-Rezeptor und wird zu malignen Transformationen führen. Wenn andererseits ein Tumorsuppressor wie B53 im Übermaß abgebaut wird, dann sind wir ebenfalls mit malignen Transformationen konfrontiert. Mit diesem Thema hat sich Harald zur Hausen in seiner Arbeit zum Papillomvirus des Menschen, das für den gezielten Abbau von B53 verantwortlich ist, beschäftigt. Sie können also nachvollziehen, warum jede mögliche Abweichung, abhängig von dem betroffenen Protein, zu malignen Transformationen führen kann und wird. Dafür gibt es noch viele andere Ursachen. Doch worauf sollte man nun am Ubiquitin-System konkret abzielen? Offensichtlich ist die beste Stelle, die man im Ubiquitin-System gezielt untersuchen sollte, die Ebene der Erkennung zwischen dem Substrat und den Ligasen, da sie die breiteste Ebene ist, auf der die geringsten Nebenwirkungen zu erwarten sind. Das erste Medikament war jedoch ein Proteasom-Inhibitor und ist immer noch ein sehr erfolgreiches Medikament. Es handelt sich um einen aktiven Inhibitor, um einen Inhibitor auf der aktiven Seite des Threoninrests im aktiven Bereich im Inneren des Proteasoms. Dies ist das Medikament. Es ist unter dem Namen Velcade oder Bortezomib bekannt und befindet sich bereits auf dem Markt. Ich zeige Ihnen hier die entsprechende Krankheit, das multiple Myelom. Das multiple Myelom ist eine Form der Leukämie, bei der die B-Zellen sich im Übermaß vermehren. Der Klon einer B-Zelle vermehrt sich, eine monoklonale Vermehrung einer B-Zelle, und die Klone verdrängen die anderen normalen Vorläuferzellen des Knochenmarks. Die Krankheit ist tödlich, denn man verliert alle anderen Elemente des Knochenmarks und es kommt zu krankheitsbedingten Brüchen der Wirbel und der langen Knochen. Wie Sie hier sehen können, sondern diese Zellen ein Immunoglobulin ab. Der Immunoglobulinspiegel steigt an, dann kommt es zu Beginn der Chemotherapie zu einem geringfügigen Abfall, doch dann erleidet der Patient einen Rückfall. Hier beginnt die Behandlung mit einem Proteasom-Inhibitor, und Sie sehen, dass das Immunoglobulin abnimmt, was auf das Schrumpfen des Tumors hinweist. Zwei letzte Dias: Hier können Sie das Knochenmark sehen, damit Sie sich, ohne ein Hämatopathologe zu sein, eine Vorstellung machen können. Links sehen Sie das maligne Knochenmark, das homogen ist, 41 % der Zellen sind maligne Zellen, und nach der Behandlung ist die Menge der malignen Zellen auf 1 % gesunken und das Knochenmark wird wieder von normalen Vorläuferzellen besiedelt. Das letzte Dia zeigt eine verwandte Krankheit namens Non-Hodgkin-Lymphom. Hier können Sie einen Tumor erkennen, es ist eine Computertomografie des Brustkorbs, ein Teil des Brustkorbs. Man sieht hier die Lunge, die Rippen, das Sternum, die Wirbel und einen Tumor, der am Eingang des rechten Lungenflügels sitzt. Wie Sie hier sehen können, bleibt der Tumor bestehen. Ich habe versucht, Sie in 30 Minuten auf einen langen Marathon mitzunehmen – beginnend mit einer Idee, die in den 1970er Jahren noch nicht allgemein akzeptiert war, und nun zu einer bedeutenden Regulierungsplattform nicht nur für biologische Prozesse, sondern auch für die Entwicklung von Medikamenten geworden ist. Und ich bin der Ansicht, dass man von diesem einfachen Ansatz viel lernen kann und dass Sie am Ende dieses Treffens, wenn Sie all die einfachen Geschichten, die Sie von Bob und Roger und vielen anderen gehört haben, mitnehmen, erkennen werden, dass die Natur zwar komplex ist, aber die Anfänge von Entdeckungen immer, wie ich am Sonntag sagte, beschämend einfach sind. Vielen Dank. (Applaus)

Aaron Ciechanover (2010)

Why our Proteins Have to Die so We Shall Live

Aaron Ciechanover (2010)

Why our Proteins Have to Die so We Shall Live

Abstract

Summary

Ciechanover starts his lecture with general remarks about the relevance of inspiration and the evolvement in science in general. He wants to show the logical development of science taking his own experience as an example. He talks about the synthesis and degradation of proteins, the chemistry of proteolysis in the body, and the reasons for degradation. The lecture continues with a remark on the founding fathers of the field mentioning especially the consequences for scientific research of the migration of Jewish scientists from Nazi Germany to the US. Rudolf Schoenhammer was the first scientist to postulate that intracellular proteins were not static (“dynamic state of body constituents”). Professor Ciechanover continues with the discovery of the lysosome and first experimental evidence that intracellular protein degradation has nothing to do with lysosomes and thus requires a different mechanism. Hershko and Ciechanover worked with reticulocytes which are free of lysosomes and discovered that the Ubiquitin system (with its many components) is acting as a marker for intracellular protein degradation and the degradation of proteins with a poly-Ubiquitine chain is actually taking place at the proteasome. Ciechanover describes the Ubiquitin-proteasome system as a “post-translational modifying system in which the modified substrates are being targeted to different purposes”. A very important application is “the translation of the system into drugs” and a few examples are presented. The lecture closes with “Nature is complex, but the beginnings of discoveries are always simple”.

Abstract

Between the 50s and 80s, most studies in biomedicine focused on the central dogma - the translation of the information coded by DNA to RNA and proteins. Protein degradation was a neglected area, considered to be a non-specific, dead-end process. While it was known that proteins do turn over, the high specificity of the process - where distinct proteins are degraded only at certain time points, or when they are not needed any more, or following denaturation/misfolding when their normal and active counterparts are spared - was not appreciated. The discovery of the lysosome by Christian de Duve did not significantly change this view, as it was clear that this organelle is involved mostly in the degradation of extracellular proteins, and their proteases cannot be substrate-specific. The discovery of the complex cascade of the ubiquitin solved the enigma. It is clear now that degradation of cellular proteins is a highly complex, temporally controlled, and tightly regulated process that plays major roles in a variety of basic cellular processes such as cell cycle and differentiation, communication of the cell with the extracellular environment and maintenance of the cellular quality control. With the multitude of substrates targeted and the myriad processes involved, it is not surprising that aberrations in the pathway have been implicated in the pathogenesis of many diseases, certain malignancies and neurodegeneration among them, and that the system has become a major platform for drug targeting.

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