Feodor Lynen

Lieber Herr Kollege Weißschädel, meine Damen und Herren, mit Vorschusslorbeeren bedacht zu werden, ist natürlich immer sehr schwierig. Aber ich hoffe trotzdem, dass ich als letzter Sprecher dieses inhaltsreichen Tages noch eine gewisse Aufmerksamkeit finden kann. Ich möchte ein Thema wieder aufgreifen, das ich vor drei Jahren auf der Lindauer Zusammenkunft schon einmal behandelt habe, und zwar deshalb, weil in der Zwischenzeit auf diesem Gebiet eine Reihe methodischer Fortschritte erzielt und damit wichtige neue Erkenntnisse gewonnen worden sind. Und zum Zweck der Einleitung möchte ich an das anknüpfen, was ich Ihnen beim letzten Mal erzählt habe: Das medizinische Interesse an den Fragen der Regulation der Cholesterinsynthese entspringt zwei Wurzeln. Einmal aus der Tatsache, dass sich die atheromatösen Ablagerungen, die in den Gefäßen kreislaufkranker Patienten gefunden werden, durch einen hohen Cholesteringehalt auszeichnen. Und zum anderen aus dem Ergebnis epidemiologischer Studien. Und mit dem Wesen epidemiologischer Studien sind die Mediziner unter Ihnen wohlvertraut. Für die anderen unter meinen Zuhörern sollte ich aber zu deren Erklärung vielleicht doch ein paar Worte sagen. Und das Wesen epidemiologischer Studien ist die statistische Betrachtungsweise, die darauf beruht, dass man ein möglichst großes Kollektiv von Patienten mit unterschiedlicher Ausgangssituation für mehrere Jahre verfolgt und untersucht, wie sich Unterschiede in der Ausgangssituation auf die Entstehung bestimmter Krankheiten auswirken. Man spricht in diesem Zusammenhang von Risikofaktoren, welche das Auftreten einer bestimmten Krankheit begünstigen. Zur Illustration des Gesagten: Wenn man sich heute in ein Auto setzt, dann besteht in Anbetracht der Verkehrsdichte und der fehlenden Geschwindigkeitsbegrenzung auf unseren Autobahnen ein gewisses Risiko, dass man in einem Unfall schwer beschädigt wird oder gar ganz sein Leben einbüßt. Und dieses Risiko lässt sich durch statistische Erhebungen quantitativ erfassen. Nun hat man solche statistische Erhebungen an Patienten mit unterschiedlichem Cholesteringehalt des Blutes durchgeführt und über einen längeren Beobachtungszeitraum hin die Entstehung von Kreislaufkrankheiten verfolgt. Das Ergebnis von drei derartigen Studien an Einwohnern der amerikanischen Kleinstadt Framingham, wie Sie hier oben sehen können, an leitenden Geschäftsleuten von Minnesota oder an staatlichen Angestellten in Albany durchgeführt, ist in diesem Bild wiedergegeben. In dieser Darstellung war das relative Risiko auf der Ordinate aufgetragen, in den Gruppen unterschiedlichen Serumcholesteringehaltes - wie auf der Abszisse aufgetragen - auf das Risiko der Gruppe mit dem niedrigsten Cholesterinspiegel, das heißt, 200 Milligrammprozent oder weniger, wie auf der linken Seite zu sehen ist. Und dieses Risiko wurde gleich 100 gesetzt. Und wie man aus dieser Abbildung ersehen kann: Das Auftreten von Gefäßkrankheiten des Herzens in der Gruppe von Patienten, deren Serumcholesterinspiegel bei 260 Milligrammprozent oder darüber lagen, drei- bis fünfmal häufiger, als in der Bezugsgruppe. Wie man aus der Abbildung gleichzeitig entnehmen kann, nahm in allen Untersuchungen das Risiko mit steigendem Cholesteringehalt kontinuierlich zu. Welches sind nun die Faktoren, welche den Cholesteringehalt des Serums bestimmen? Zur Beantwortung dieser Frage müssen wir uns daran erinnern, dass Cholesterin ein Bestandteil aller Gewebe darstellt und dort als Bauelement in den Membranstrukturen der Zelle, das heißt, in den Inhalt des Zellinneren gegen die Umgebung abschirmenden Zellmembranen, aber auch in den Mitochondrien, von denen Herr Claude vorhin so viel erzählt hat, den Kraftwerken der Zelle oder dem endoplasmatischen Retikulum, von denen Herr Claude ja auch gesprochen hat, dem Sitz der für die Eiweißsynthese verantwortlichen Ribosomen und vieler membrangebundener Enzymen angetroffen wird. Im Blutstrom ist Cholesterin in freier Form und teilweise auch als Ester, mit organischen Karbonsäuren in der Lipoproteinfraktion enthalten, auf deren Zusammensetzung ich später in meinem Vortrag noch einmal zurückkommen werde. Das Cholesterin des Blutserums steht mit dem der Gewebe, insbesondere mit dem der Leber, in ständigem Austausch. Außerdem wird der Cholesterinspiegel im Serum von der Resorption des Cholesterins aus der Nahrung determiniert und hier ist zu berücksichtigen, dass die tägliche Cholesterinzufuhr mit der Nahrung in verschiedenen Gegenden der Erde in weiten Grenzen, nämlich zwischen Werten von etwa 90 mg für die Völker Ostasiens und etwa 700 mg für die Nordamerikaner schwankt. Für die Mitteleuropäer werden aus statistischen Untersuchungen Werte zwischen 300 bis 400 mg angegeben, also aus der Nahrung 0,1 bis 0,7 g. Und für die Abgabe des Cholesterins aus den Geweben an das Blut spielt die endogene Synthese selbstverständlich eine maßgebliche Rolle. Wie steht es nun mit der Ausscheidung? Für die Ausscheidung des Cholesterins aus dem Organismus spielt seine Umwandlung in Gallensäuren, die in der Leber zustande kommt, eine entscheidende Rolle. So wird ein großer Teil der in den Darm abgegebenen Gallensäuren im enterohepatischen Kreislauf wieder in die Leber zurückgeholt, aber ein Teil kommt mit den Fäzes zur Ausscheidung und diese Menge beträgt etwa 0,8 bis 1 g, wie Sie aus dieser Figur entnehmen können. In einer Bilanz des Cholesterinumsatzes im Organismus können wir den enterohepatischen Kreislauf ignorieren. In diesem Zusammenhang interessieren einerseits die Mengen, die in Form von Gallensäuren ausgeschieden werden, und zum anderen die Mengen, die aus der Nahrung und der endogenen Synthese stammen. Bei dieser Bilanz, dass mit der Nahrung zugeführtes Cholesterin größeren Schwankungen unterliegt, erkennt man sofort, dass die Biosynthese des Cholesterins im Organismus reguliert und auf diese Weise im Einklang mit dem Bedarf gebracht werden muss. Zufuhr von viel Cholesterin mit der Nahrung führt zu einer Drosselung der Cholesterinbiosynthese und umgekehrt, was schon vor vielen Jahren von Gold und Taylor in Amerika erstmalig nachgewiesen wurde. Und an dieser Stelle ist es nun endlich angebracht, den Weg der Cholesterinbiosynthese zu beschreiben, wie er sich uns aufgrund biochemischer Untersuchungen heute darstellt. Demnach geht die Synthese des Cholesterins von Acetyl-CoA, der sogenannten aktivierten Essigsäure aus, die beim biologischen Abbau der Kohlenhydrate, der Fette und auch des Eiweißmoleküls entsteht. Und der Aufbau des Cholesterinmoleküls aus 18 Molekülen Acetyl-Koenzym A geht in einem vielstufigen Prozess vor sich, der etwa 30 Reaktionsschritte umfasst, von denen die Hälfte im Schema der Abbildung wiedergegeben sind. In der Phase (auf der linken Seite zu sehen) werden drei Moleküle Acetyl-Koenzym A unter wiederholter Kondensation zu Beta-Hydroxy-Beta-Methylglutaryl-Koenzym-A kondensiert und diese Verbindung, von der wir noch näher sprechen werden, wird von den Biochemikern in abgekürzter Form HMG-CoA genannt. Und die Reduktion dieses HMG-CoA durch NADPH führt zur Mevalonsäure. Und die Umwandlung der Mevalonsäure in den eigentlichen Baustein des Cholesterins, das von dem Biochemiker als aktives Isopren bezeichnete Isopentenylpyrophosphat, das Sie hier auf der rechten Seite sehen, erfordert drei Moleküle ATP und schließt die Abspaltung eines Kohlenstoffatoms aus dem verzweigtkettigen Molekül der Mevalonsäure in Form von Kohlendioxid ein. In Isopentenylpyrophosphat sind nur noch fünf Kohlenstoffatome vorhanden. Und drei Moleküle Isopentenylpyrophosphat, von denen eines zu Dimethylallylpyrophosphat isomerisiert wird, treten nun zu Farnesylpyrophopshat zusammen, das Sie hier unten rechts sehen, aus dem auf dem Wege einer reduktiven Dimerisierung schließlich das 30 Kohlenstoffatome enthaltende, ungesättigte Derivat Squalen entsteht. Die Umwandlung des Squalens in Cholesterin, die in der Abbildung nicht mehr im Einzelnen dargestellt ist, sie ist eine durch Einbau von Sauerstoff ausgelöste Zyklisierung des Moleküls unter Bildung von Lanosterin 1 und eine sich daran anschließende Folge von Oxidationsprozessen mit dem Resultat, dass wiederum drei Kohlenstoffatome in Form von Kohlendioxid eliminiert werden und schließlich das Cholesterinmolekül mit 27 Kohlenstoffatomen entsteht. Was nun die Regulation dieser langen Reaktionsfolge betrifft, so konnte schon vor mehreren Jahren durch ein Experiment in unserem Laboratorium nachgewiesen werden, dass das für die Reduktion des HMG-CoA zur Mevalonsäure verantwortliche Enzym, HMG-CoA-Reduktase wie es heißt, gesteuert wird. Es ließ sich zeigen, dass die Aktivität dieses Enzyms in der Leber von Hungerratten, in welchen die Synthese von Cholesterin aus Essigsäure oder aus Acetyl-CoA fast vollständig darniederliegt, diejenige aus Mevalonsäure aber kaum betroffen ist, nahezu vollständig verschwunden war. Und der Ausbau dieser Versuche, an denen außer unserem Arbeitskreis auch viele andere Laboratorien beteiligt waren, hat dann die ganz maßgebliche Rolle der HMG-CoA-Reduktase im Regulationsgeschehen der Cholesterinbiosynthese erwiesen. Insbesondere wurde auch gezeigt, dass die homöostatische Kontrolle durch Cholesterin im Endprodukt auf der Stufe von HMG-CoA von anderen Stoffwechselbahnen, wie etwa der Ketogenese, der Bildung von Acetessigsäure, die hier rechts angezeigt ist, abzweigenden Synthesekette an der HMG-CoA-Reduktase angreift. Nach Fütterung der Versuchstiere mit Cholesterin ging die Aktivität dieses Enzyms stark zurück. Und das soll hier durch diesen Balken ausgedrückt werden, der von Beta-Hydroxy-Beta-Methylglutaryl-Koenzym-A zur Mevalonsäure führt. In Übereinstimmung zwischen der Geschwindigkeit der Cholesterinsynthese und der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase ergab sich auch bei Untersuchungen zum täglichen Rhythmus der beiden Größen und es hat sich gezeigt, dass auch hinsichtlich der Cholesterinsynthese ein solcher Rhythmus existiert. Und dieses Phänomen des Rhythmus der Cholesterinsynthese wurde von Back und Hamprecht in unserem Laboratorium entdeckt. Hier wurde der Einbau von radioaktiver Essigsäure in Cholesterin gemessen. Und dabei ergab sich bei Versuchen an der Rattenleber, dass dieser Einbau in den Nachtstunden dass dieser Einbau in den Nachtstunden um ein Vieles schneller erfolgt, als während des Tages. Die Fähigkeit zur Cholesterinsynthese, also zwischen einem Minimum in der Mittagszeit und einem Maximum um Mitternacht pendelt. Das gilt für die Ratten. Ratten sind Nachttiere, bei denen ist die höchste Aktivität natürlich im Dunkeln. Und bemerkenswert war auch der Befund, dass dieser Anstieg der Syntheserate in den Nachtstunden durch Verfütterung von Gallensäuren, die wie Cholesterin als homöostatischer Inhibitor in den Syntheseprozess eingreifen, verhindert werden kann. Sie sehen hier einen Versuch: Die untere Kurve die vollen Punkte, nebenbei, diese Pfeile geben einfach die Schwankungsbreiten der Messungen aus, es sind natürlich viele Tiere untersucht worden. Also diese senkrechten Pfeile geben die Schwankungsbreite an und Sie sehen, dass hier in dem Versuch mit Cholsäure, also cholic acid, dass hier das Ansteigen in den Nachtstunden ausbleibt. Und dass die beobachteten rhythmischen Erscheinungen sich in entsprechenden Veränderungen in der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität widerspiegeln, wurde dann von Hamprecht in München gezeigt und in mehreren anderen Laboratorien bestätigt. Das nächste Bild zeigt das Ergebnis der Messungen von Hamprecht. Hier ist also die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase auf der Ordinate aufgetragen. Sie sehen, dass zwischen Dunkel und Licht dieses Enzym, die Enzymaktivität diese Schwankungen zeigt. Was nun die Ursache des täglichen Rhythmus der HMG-CoA-Reduktase oder auch die Erniedrigung der Enzymaktivität durch Cholesterin, Gallensäuren oder durch Fasten betrifft, so wurden alle diese Erscheinungen mit Veränderungen in der Syntheserate des Enzymproteins in Verbindung gebracht. Enzymproteine sind wie fast alle anderen Bestandteile lebender Zellen in einem ständigen Umsatz begriffen, sodass ihre Konzentration einen stationären Fließzustand entspricht, der sich durch das Verhältnis der Geschwindigkeiten von Synthese links und Abbau ergibt. Wenn nun die Geschwindigkeit des Abbaus der HMG-CoA-Reduktase konstant bleibt, muss eine gestörte Synthese zu einer Erniedrigung der Enzymaktivität - oder im Gegenteil, eine beförderte Synthese zu einer Erhöhung der Enzymaktivität führen. Und diese Annahme wird durch die Beobachtung gestützt, dass Verabreichung von antibiotischen Inhibitoren der Proteinsynthese an die Versuchstiere den täglichen Rhythmus, das heißt den Anstieg der Enzymaktivität in den Abendstunden, verhindert. Der tägliche Rhythmus der Reduktaseaktivität ließ sich somit durch Veränderungen in der Synthesegeschwindigkeit des Enzymproteins erklären. Der Abbau des Proteins erfolgt mit konstanter Geschwindigkeit entsprechend einer halben Lebensdauer von etwa drei bis vier Stunden. In den letzten Jahren hat man jedoch an verschiedenen Stellen Befunde gewonnen, die dafür sprechen, dass zusätzlich zu dieser Art der Kontrolle, die man als Langzeitkontrolle der HMG-CoA-Reduktase bezeichnen könnte, noch sehr viel schneller wirkende Regulationsmechanismen am Werke sind. In einer Untersuchung von Higgins und Rudney in den Vereinigten Staaten wurden beispielsweise beide Parameter, Gehalt an Enzymprotein und Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in der Leber von Ratten, verfolgt, die an einen Hell-Dunkel-Zyklus gewöhnt waren. Um den Gehalt an Enzymprotein zu messen, wurde ein spezifisches Immunserum benützt, zu dessen Gewinnung die aus dem endoplasmatischen Retikulum durch Behandlung mit Desoxycholatlösungen herausgelöste HMG-CoA-Reduktase gereinigt und das gereinigte Enzym wiederholt an Ziegen injiziert wurde. Mit dem auf diese Weise gewonnenen, spezifisch gegen HMG-CoA-Reduktase gerichteten Antiserum konnte der Gehalt der Rattenleber an Enzymprotein durch Titration quantitativ gemessen werden. Und parallel dazu wurde die Enzymaktivität bestimmt. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist im nächsten Bild gezeigt. Hier waren die Ratten an einem Hell-Dunkel-Zyklus zwischen 18:00 Uhr im Dunkeln und 6:00 Uhr morgens gewöhnt. Und hier auf der linken Seite sind nur die Ergebnisse an normal ernährten Ratten wiedergegeben. Hier ist aufgetragen die Enzymaktivität - das sind die Kreuze - und hier die Menge an Enzymprotein, das mit dem Antiserum bestimmt wurde. Und Sie sehen, dass der Verlauf der beiden Kurven sehr genau übereinstimmt. Auf der rechten Seite wurden nun die Tiere mit Cholesterin gefüttert. Sie sehen, dass der Enzymspiegel durch die das Antiserum bestimmt, denselben Verlauf zeigt, wie in der Kontrollratte. Aber die Enzymaktivität nahm nach sechs Stunden schon sehr stark ab. Und wenn man nun den zweiten Tag beobachtet, also am zweiten Tag, 24 Stunden später, dann zeigte sich in den normal gefütterten Tieren wieder die hohen Werte des Mittags, während hier in den mit Cholesterin gefütterten Tieren dieser Anstieg der beiden Aktivitäten nicht mehr zu beobachten war. Aus diesen Beobachtungen geht eindeutig hervor, dass der tägliche Rhythmus der HMG-CoA-Reduktase in der Tat durch Variationen in der Geschwindigkeit der Proteinsynthese verursacht ist. Die Fütterung von Cholesterin hat jedoch eine doppelte Wirkung. Erstens einen unmittelbaren Effekt, der von der Proteinsynthese unabhängig ist. Sie sehen hier, die Aktivität nimmt ab im rechten Bild, aber das Enzymprotein ist noch vorhanden. Und daneben zweitens, einen sehr viel langsamer einsetzenden Effekt, der eine Hemmung der Proteinsynthese im Sinne einer Repression bewirkt. Eine solche doppelte Wirkung des Cholesterins geht aus Untersuchungen von Fruns und Mitarbeitern hervor. Diese Autoren fanden bei Versuchen an lebenden Ratten, dass die Injektion des Proteinsynthesehemmers Cycloheximid die Cholesterinsynthese beträchtlich langsamer unterdrückt, als die Injektion von Cholesterin. Was nun die in diesen Versuchen gefundene Kurzzeitkontrolle der HMG-CoA-Reduktase durch Cholesteringabe betrifft, so steht sie möglicherweise im Einklang und Beziehung zu den kürzlich veröffentlichten Befunden von Beg, Allman und Gibson. Wie die amerikanischen Autoren fanden, lässt sich die HMG-CoA-Reduktase-Aktivität von Leberhomogenaten - Leberschnitten - und isolierten Zellen durch Vorinkubation mit zyklischem 3'-5'ANP, dem Second Messenger von Haverland hemmen. Sie fanden außerdem, dass die Enzymaktivität einer gewaschenen Mikrosomenfraktion aus Leber, wie die Komponenten des endoplasmatischen Retikulums unter Einschluss der HMG-CoA-Reduktase enthält, bei Vorinkubation mit Magnesium, ATP und einer Proteinfraktion aus dem löslichen Anteil der Leberzelle stark abnimmt, diese Aktivitätsabnahme jedoch dadurch wieder aufgehoben werden kann, wenn die Mikrosomenfraktion mit einer zweiten Proteinfraktion, die ebenfalls aus dem löslichen Anteil stammte, inkubiert wurde. Und diese Befunde, die durch Beobachtungen anderer Forscher unterstützt wurden, könnte man so deuten, dass HMG-CoA-Reduktase zur Klasse der sogenannten interkonvertierbaren Enzyme zählt, jener Enzymklasse, die ja durch die Untersuchungen von unserem Gast, Herrn Cori, ans Licht gebracht wurden, und dass diese bei HMG-CoA-Reduktase durch Phosphorylierung unter der Wirkung einer cyclo-ANP-abhängigen Proteinkinase, wie Sie hier oben sehen, unter Beteiligung von ATP in eine inaktive Form umgewandelt wird und dann durch das Eingreifen einer Phosphorproteinphosphatase unter Abspaltung von anorganischem Phosphat wieder reaktiviert werden kann. Und ich möchte mich mit der Erwähnung dieser Hypothese begnügen. Ob sie im vollen Umfang zutrifft und sich mit ihrer Hilfe eventuell auch die von verschiedenen Seiten gefundene hormonelle Beeinflussung der Cholesterinsynthese erklären lassen wird, müssen weitere Versuche klären. Ich will mich in meinem Vortrag mit der Feststellung begnügen, dass die Hormone Insulin und Trijodthyronin aber wegen der Unklarheit, die hinsichtlich ihres Wirkungsmechanismus besteht, nicht weiter darauf eingehen. Ich möchte mich stattdessen mit Versuchen meines Mitarbeiters Joachim Siedel beschäftigen, in denen erstmalig der HMG-CoA-Gehalt in der Leber von Ratten unter den verschiedensten Stoffwechselbedingungen untersucht wurde. Der Gehalt an diesem Zwischenprodukt der Cholesterin- und - wie Sie sich erinnern werden - auch der Acetessigsäuresynthese ist so gering, dass es nötig war, eine sehr empfindliche Bestimmungsmethode auszuarbeiten. Und das Prinzip der Methode ist schnell erzählt: Sie bedient sich der enzymatischen Reduktion des aus der Leber extrahierten HMG-CoA mittels tritiumhaltigem NADPH. Bei dieser Reduktion, die ich in Gegenwart eines aus der Hefe isolierten Enzyms durchgeführt ... Wenn man also hier ein NADPH einsetzt, das hier in der B-Seite durch Tritium markiert ist, dann entsteht dabei eine Mevalonsäure, die hier oben zwei Tritiumatome enthält. Die kann man nun isolieren und aus dem Tritiumgehalt dieser Mevalonsäure kann man natürlich auf die Menge ursprünglich vorhandenen HMG-Koenzyms A zurückschließen. Und diese Bestimmungsmethode erfordert eine Eichkurve, die mit bekannten Mengen HMG-Koenzym A gewonnen werden kann. Das nächste Bild zeigt die Abhängigkeit der Radioaktivität des Mevalonsäurelactons, Abhängigkeit zur Menge des HMG-Koenzym A eingesetzt, das heißt, mit dieser Methode kann man also ohne Weiteres den HMG-Koenzym-A-Gehalt, wie Sie sehen, in sehr kleinen ... Nanomole HMG-CoA ..., kann man also sehr genau bestimmen. Nun, Herr Siedel hat diese neue Methode zunächst bei Ratten eingesetzt, die durch Injektion von Alloxan in den diabetischen Zustand versetzt worden waren. Diese Ratten wurden nach der Alloxangabe 8 Tage lang mit Depotinsulin substituiert, um sie in einen scheingesunden Zustand zu bringen. mit dem Resultat, dass die Tiere einen akuten Diabetes mit starker Gewichtsabnahme und größerem Flüssigkeitsverlust entwickelten. Das Ergebnis einer solchen Versuchsreihe, wobei für jeden Messpunkt mindestens sieben Ratten ausgewertet wurden, ist im nächsten Bild wiedergegeben. Hier ist die normale Ratte, hier ist die alloxandiabetische Ratte, die aber mit Insulin substituiert war, und hier ist die Insulinentzug 24 Stunden vor der Schlachtung. Und hier ist nun der HMG-Koenzym-A-Spiegel wiedergegeben. Sie sehen, dass - wie zu erwarten - in der diabetischen Ratte, die ja Riesenmengen von Acetessigsäure und Betahydroxybuttersäure ausscheidet, die also auch einen hohen Glukosespiegel im Blute hat, dass in dieser Ratte der HMG-Koenzym-A-Spiegel angestiegen ist. Das heißt Ausdruck dafür, dass die erhöhte Acetessigsäurebildung in der Leber im diabetischen Zustand im Wesentlichen auf die gesteigerte Anlieferung von HMG-Koenzym A als Folge der Umspaltung der Energiegewinnung von Kohlenhydratoxidation auf Fettoxidation beruht. Eine solche Umschaltung tritt auch im fastenden Organismus ein und demzufolge fand Siedel, wie das nächste Bild zeigt, in der Leber von Ratten, die 24 Stunden gehungert hatten, parallel zum Anstieg der Ketonkörper parallel zum Anstieg der Ketonkörper im Blut einen erhöhten HMG-CoA-Spiegel. Im Zusammenhang mit unseren Untersuchungen zur Regulation der Cholesterinsynthese studierte Siedel auch den Einfluss einer Cholesterinfütterung auf den HMG-CoA-Spiegel. In dieser Versuchsreihe wurden die Ratten zwei Tage lang mit einem Standardfutter, dem drei Prozent Cholesterin zugesetzt war, gehalten, und in der Dunkelperiode um 22:00 Uhr geschlachtet. Und die Ergebnisse der verschiedenen Messungen sind in der Abbildung wiedergegeben. Hier ist nun wiedergegeben: Sie sehen, normal gefüttert, HMG-CoA-Spiegel, HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Ketonkörperbildung und nun, nach Cholesterinfütterung wie erwähnt, wir haben ein Absinken der HMG-Koenzym-A-Reduktase-Aktivität, keinen Einfluss auf den Ketonkörperspiegel, aber interessanterweise ein Absinken des HMG-Koenzym A in der Leber. Nun, die Erklärung dieses Versuches fällt uns im Augenblick noch schwer. Insbesondere auch deshalb, weil wir mit unserer Messmethode nur das gesamte HMG-CoA, damit auch der Zelle, bestimmen, und nicht zwischen dem HMG-CoA der Mitochondrien und dem des Zytoplasmas differenzieren konnten. Dies wäre aber nötig gewesen, weil es heute durch Untersuchungen mehrerer Arbeitskreise erwiesen ist, dass in der Zelle in beiden Kompartimenten HMG-CoA gebildet wird. Der eine Prozess in den Mitochondrien (auf der linken Seite gezeigt), ist für die Ketogenese verantwortlich. Der zweite, davon unabhängige Prozess läuft im Zytoplasma ab und ist für die Cholesterinsynthese von Bedeutung. Und Lane und seine Mitarbeiter konnten experimentell nachweisen, dass die Enzyme Thiolase und HMG-CoA-Synthase, die für die Bildung des HMG-CoA verantwortlich sind in beiden Prozessen, dass diese Enzyme ebenfalls reguliert sind. Und besonders die Synthase in ihrer Aktivität durch Cholesterinfütterung beeinflusst wird. Wir sind in Anbetracht dieser Komplikationen nun darum bemüht, den HMG-CoA-Gehalt des Zytoplasmas und der Mitochondrien getrennt zu bestimmen, um auf diesem Wege zu definierten Aussagen über die Flussgeschwindigkeit der Syntheseprozesse in beiden Kompartimenten zu gelangen. Lassen Sie mich nun im letzten Abschnitt meines Vortrags noch auf ganz neue Ergebnisse zu sprechen kommen, die bei Arbeiten mit isolierten Zellen oder mit Zellen in der Gewebekultur erhalten wurden. Die Anwendung dieser neuen Technik auf das Problem der Evaluation der Cholesterinbiosynthese hat den großen Vorzug, dass die Wirkung von zugesetzten Stoffen an der isolierten Zelle unmittelbar studiert werden kann und die beobachteten Effekte nicht durch die Mitwirkung anderer Gewebe, wie bei den Versuchen am lebenden Tier, zustande kommen. Und viele Zelltypen, wie Hepatomazellen, menschliche Nierenzellen, menschliche Leukozyten oder menschliche Fibroblasten der Haut sprechen in der Gewebekultur auf den Lipidgehalt des Mediums an. In Gegenwart von lipidfreiem Serum, also einem Serum, bei dem man die Lipide durch Zentrifugation abgetrennt hat, synthetisieren diese Zellen Cholesterin in wesentlich größerer Geschwindigkeit als in Gegenwart von Normalserum, also einem Serum, das auch Lipid enthält. Dabei ließe sich wiederum nachweisen, dass diese Steuerung der Cholesterinsynthese durch Lipide das Enzym HMG-CoA-Reduktase betrifft; die Erniedrigung der Cholesterinsynthese im lipidhaltigen Medium, also auf eine niedrige HMG-CoA-Reduktase-Aktivität zurückgeht. Nun, die im Normalserum für diesen Effekt verantwortlichen Faktoren konnten mit zwei pro Fraktionen von Lipoproteinen in sogenannten Low-Density-Proteinen (abgekürzt: LDL) und den Very-Low-Density-Lipoproteinen (abgekürzt: VLDL) identifiziert werden. Die dritte Lipoproteinfraktion des Serums, die sogenannten High-Density-Lipoproteine (abgekürzt: HDL) war im Gegensatz dazu zur Erniedrigung der Enzymaktivität in den kultivierten Zellen nicht befähigt. Und dies legte den Verdacht nahe, dass ein besonderes Protein, das Apolipoprotein B oder Apo-LDL genannt, das in LDL und VLDL enthalten ist, aber in HDL fehlt, an der gefundenen Unterdrückung von HMG-CoA-Reduktase maßgeblich beteiligt ist. Das nächste Bild soll Ihnen nur eine Analyse des VLDL, des Very-Low-Density-Lipoproteins wiedergeben. Hauptsache sind Triglyceride, aber es ist Cholesterin, zehn Prozent auch Cholesterinester vorhanden, dann Phosphorlipide 15 Prozent. Die Fraktion der Proteine ist ebenfalls aus zwei verschiedenen ..., aus mehreren Komponenten zusammengesetzt, aber der wesentliche Bestandteil ist dieses Apo-LDL oder das Lipo-Betalipoprotein, Apolipoprotein, wie es genannt wird. Und es lag also der Verdacht nahe, dass dieses Apo-LDL oder Betalipoprotein für die Unterdrückung der HMG-CoA-Reduktase-Synthese in Gegenwart dieser Lipoproteinfraktion verantwortlich ist. Die beste Übereinstimmung mit dieser Annahme wurde dann auch tatsächlich gefunden: dass das Blutserum eines Patienten, der an einer A-Beta-Lipoproteinämie litt, einer erblichen Krankheit, die das Fehlen des Apolipoproteins B oder des Apo-LDL, wie es hier in dieser Figur eingezeichnet ist, und folglich auch der zugehörigen Lipide ausgezeichnet ist, die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in normalen Zellen nicht beeinflusst. Und die Wirkung der aktiven Lipoproteinfraktion des Serums war besonders ausgeprägt in Kulturen von Fibroblasten aus menschlicher Haut. Hier fanden die amerikanischen Autoren Brown und Goldstein (und ich glaube, ich sollte ihren Namen hier anschreiben) ... Diese Autoren fanden bei Versuchen an den Fibroblastenkulturen aus der menschlichen Haut, dass die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in normalen Fibroblasten, die bei Züchtung im vollserumhaltigen Medium nur niedrige Enzymaktivitäten erreichten, auf das 40-fache anstiegen, wenn die Lipoproteinkomponenten aus dem Serum entfernt wurden. Und die Untersuchungen der amerikanischen Autoren eröffneten schließlich einen ganz neuen Einblick in die Pathologie des Cholesterinstoffwechsels, als sie in ihre Experimente auch Fibroblasten aus Patienten, die an familiärer Hypercholesterinämie litten, einbezogen. Bei dieser dominant vererblichen Krankheit ist die in der Fraktion der Lipoproteine vom LDL-Typ des Blutplasmas anzutreffende Cholesterinkonzentration stark erhöht. Und das will ich Ihnen anhand einer Familiengeschichte zeigen, die im nächsten Bild wiedergegeben ist. Hier ist also das Schicksal einer Familie wiedergegeben, in der zwei heterozygote Eltern insgesamt neun Kinder bekamen. Drei von ihnen waren glücklicherweise normal, vier heterozygot und zwei homozygot. Und hier ist nun aufgetragen untereinander das Alter und der Cholesteringehalt. Und Sie sehen, dass bei dieser Krankheit der Cholesteringehalt des Serums sehr stark ansteigt. Hier bei den Homozygoten Werte von 618 bzw. 730 Milligrammprozent. Auch in den Heterozygoten ist der Wert sehr viel höher als in den normalen Patienten, bei denen es bei ungefähr 200 Milligrammprozent liegt. Und parallel zu diesem Anstieg des Cholesterinspiegels im Plasma findet man auch eine Anreicherung von Cholesterin in den Körpergeweben, die bis zur Bildung cholesterinhaltiger Xanthelasmen und Xanthome reicht und von einer Arteriosklerose der Blutgefäße des Herzens begleitet ist. Personen, die an dieser Krankheit leiden, sterben im Allgemeinen schon in jugendlichem Alter an Herzversagen. Das nächste Bild, die nächsten beiden Bilder sollen Ihnen nur solche Xanthome zeigen. Das sind also Ablagerungen, die sich vor allen Dingen in Gelenken anhäufen und die bestehen zu 70 bis 80 Prozent aus Cholesterin. Das nächste Bild: Hier an den Fingern, hier an den Knien, das sind also solche Auswüchse, solche Xanthome, die eben aufgrund dieser erhöhten Cholesteringehaltes in den Geweben sich ausbilden können. Und das Interessante war, dass Fibroblasten, die aus Homozygoten mit familiärer Cholesterinämie stammten, auf die Lipoproteine des Serums nicht mehr ansprachen. Das gab sich darin zu erkennen, dass sie nach Züchtung im Vollserum 50mal mehr HMG-CoA-Reduktase enthielten als Fibroblasten, die aus gesunden Personen stammten, und diese Enzymaktivität weder durch Entfernung der Lipoproteine erhöht noch durch nachträglichen Zusatz der Lipoproteine gesenkt werden konnte. Hier ist also aufgetragen die HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, hier bei den Homozygoten. Sie sehen, dass also hier ..., das war folgendermaßen: Hier sind also die Lipoproteine aus dem Serum entfernt worden und dann wurde also wieder kultiviert. Sie sehen, dass diese Homozygoten auf die Entfernung des Lipoproteins überhaupt nicht ansprechen, während bei normalen also hier zwei HMG-CoA-Reduktase-Einheiten, während hier also bei 150, also 50mal höher, während hier bei denen nach Entfernung der Lipoproteine der HMG-CoA-Reduktase-Spiegel ansteigt. Und hier wurde nun den Fibroblasten, die im lipidfreien Serum gezüchtet wurden, das LDL zugesetzt. Kein Zusatz, kein Effekt auf die Homozygoten kein Effekt, während in den normalen Zellen durch LDL die HMG-CoA-Reduktase-Aktivität wieder unterdrückt werden kann. Und damit war dargetan, dass die homozygoten Zellen resistent gegen die normalerweise bestehende Feedback-Suppression der HMG-CoA-Reduktase durch LDL sind. Eine Resistenz, die offensichtlich genetisch festgelegt ist. Da LDL isoliert aus dem Serum von Homozygoten die Suppression der Reduktase in normalen Fibroblasten bewirkte, war es klar, dass der biochemische Defekt auf einem anormalen Zellstoffwechsel beruht und nicht etwa auf anormalen Lipoproteinen. Durch andere Versuche wurde dann auch noch bestätigt, dass LDL die HMG-CoA-Reduktase-Aktivität von normalen Fibroblasten durch die Hemmung der Synthese neuer Enzymmoleküle beeinträchtigt; ein Phänomen, das wir vorhin als Langzeitkontrolle bezeichnet haben. Des Weiteren stellten die amerikanischen Autoren fest, dass die aus Normalzellen und aus den Zellmutanten isolierten HMG-CoA-Reduktasen die gleichen genetischen Eigenschaften besaßen, woraus wir schlossen, dass durch die Mutation in den hypercholesterinanämischen Zellen ein Genprodukt betroffen sein musste, dass von HMG-CoA-Reduktase verschieden, jedoch für die normale Regulation der Enzymsynthese durch LDL unentbehrlich ist. Und dieses genabhängige Produkt konnte mit einem spezifischen Rezeptormolekül auf der Oberfläche der Fibroblasten identifiziert werden, das zur Bindung von LDL wahrscheinlich über dessen Apolipoprotein-B-Komponente befähigt ist. Und diese spezifische Bindung ließ sich in einer Versuchsreihe nachweisen, in welcher der Proteinanteil des LDL mit radioaktivem Jod 125 markiert war. Dabei stellte sich heraus, dass das markierte LDL von normalen Fibroblasten spezifisch und mit hoher Affinität an den Rezeptorstellen der Außenseite der Membran gebunden wird, während die homozygoten Zellen aus den Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie zur Bindung des LDL nicht fähig waren. Aber damit nicht genug. LDL an den Rezeptoren der normalen Zellen gebunden, erleidet nun einen proteolytischen Abbau seiner Proteinkomponenten mit dem Erfolg, dass die Peptidfragmente in das Medium entlassen werden, während ein Teil der damit freigesetzten Lipide, vor allem die cholesterinhaltigen Bestandteile, in die Zellen eindringen und dort die Synthese der HMG-CoA-Reduktase entweder auf der Stufe der Transkription oder derjenigen der Translation unterdrücken. Es gibt sogar einen experimentellen Hinweis darauf, dass das Eindringen des Cholesterins in die Zelle mit seiner Veresterung verknüpft ist. So fanden Brown und Goldstein, dass gleichzeitig mit dem proteolytischen Abbau der Proteinkomponente von LDL das freigesetzte Cholesterin verestert wurde, was sich durch die Zugabe von radioaktiver, Kohlenstoff-14-markierter Ölsäure folgern ließ. Nun, die nächste Abbildung fasst die verschiedenen Funktionen des LDL-Rezeptormoleküls zusammen. In der zugrunde liegenden Versuchsreihe wurden normale Fibroblasten in lipidfreiem Serum angezüchtet, zur Zeit 0 (auf der Abszisse eingetragen) wurde dann LDL, also Light-Density-Lipoprotein zugesetzt. In den folgenden Stunden die Kinetik der LDL-Bindung und des sich anschließenden proteolytischen Abbaus, also hier wurde die Bindung verfolgt in Abhängigkeit von der Zeit, hier der Degradation des Proteins, die Suppression der HMG-CoA-Reduktase und die Geschwindigkeit der Cholesterolveresterung. Sie sehen, dass im Laufe der Zeit der Cholesteringehalt in den Zellen sich nicht ändert, obwohl hier die HMG-CoA-Reduktase unterdrückt wird, während der Cholesterinestergehalt ansteigt, was dafür spricht, dass nicht das freie Cholesterin, sondern Cholesterinester vielleicht für die Suppression der HMG-CoA-Reduktase-Synthese verantwortlich ist. Nun, die entscheidende Rolle, welche die LDL-Rezeptormoleküle in dem ganzen Prozess spielen, ließ sich durch Versuche an kultivierten Fibroblasten unterbauen, die aus einem heterozygoten Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie stammten. In bester Übereinstimmung mit der Erwartung wurde in diesen Versuchen gefunden, dass die Bindungskapazität des heterozygoten etwa die Hälfte des normalen, unbehandelten Patienten ausmacht, während in der homozygoten keinerlei Bindung eintritt. Auch die Degradation zeigt den halben Wert. Hier ist wieder aufgetragen die Konzentration an LDL. Und hier ist nun ein interessanter Befund: Die Suppression der Reduktaseaktivität, und wie Sie daraus sehen können, kann auch in der heterozygoten Zelle, in der heterozygoten Zelle Unterdrückung, aber um den gleichen Effekt auf die HMG-CoA-Reduktase-Aktivität zu erzielen, ist hier in der heterozygoten Zelle 2,5mal die Konzentration von LDL, von Lipoprotein, anzusetzen, wie in der normalen Zelle. Und das Modell, das von Brown und Goldstein vorgeschlagen wurde, um zu erklären, wie durch einen Mangel an Zellrezeptoren für LDL der Stoffwechseldefekt in den Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie ausgelöst wird, ist in der letzten Abbildung wiedergegeben: In den normalen Zellen wird ... hier ist also etwas zu erklären ... Hier sind also ...Diese roten Elemente sind die LDL-Rezeptormoleküle. Wenn in der normalen Zelle ein Teil dieser Moleküle besetzt wird, dann wird durch Abbau der Proteine bekommen wir von LDL das Cholesterin und das Cholesterinester freigesetzt, da kommt in die Zelle hinein, in den Zellkern oder an den Ribosomen wird hier die Reduktasesynthese unterdrückt und die Folge davon ist, dass in diesen Zellen nur wenig Cholesterin vorhanden ist. In der homozygoten Zelle fehlt der LDL-Rezeptor, das heißt, das LDL kann hier seine Wirkung nicht entfalten, die Reduktase hat einen hohen Wert. Es wird also eine Riesenmenge Cholesterin in den Zellen produziert. In der heterozygoten Zelle haben wir die Situation, dass zwar nur die Hälfte der Rezeptorenmoleküle auf der Oberfläche vorhanden ist, aber wenn nun die LDL-Konzentration genügend hoch ist, dann können genauso viele Rezeptormoleküle besetzt werden wie in der normalen Zelle. Das heißt als Erfolg dieser Besetzung, tritt dann dieselbe Unterdrückung der Reduktasesynthese ein, das heißt, wir haben eine gehemmte Cholesterinsynthese. Das Attraktive an diesem Modell der Regulation im heterozygoten Organismus ist in der Tatsache zu sehen, dass sich damit auch die zunächst verwirrenden Ergebnisse klinischer Studien an heterozygoten Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie zwanglos erklären lassen. Bei In-vivo-Studien war nämlich gefunden worden, dass bei ihnen unter den Bedingungen einer 2-3-fachen Erhöhung der Serumkonzentration an LDL-Cholesterin die absoluten Geschwindigkeiten für die Synthese von Cholesterin im Gesamtorganismus und für den LDL-Abbau normal waren. Zusammenfassend lässt sich damit feststellen, dass unsere Annahme, die Regulation der Cholesterinsynthese erfolge in erster Linie auf der Stufe der HMG-CoA-Reduktase, aufgrund neuer experimenteller Befunde heute fest unterbaut ist und von fast allen Arbeitskreisen auf diesem Gebiet geteilt wird. Ob es daneben in bestimmten Geweben, beispielsweise in der Leber, noch zusätzliche Steuerstellen gibt, müssen wir vorerst noch offen lassen. Das Ergebnis unserer Messungen des HMG-CoA-Spiegels in der Leber von Ratten nach Cholesterinfütterung könnte man so interpretieren. Außerdem ist es auch noch ganz ungeklärt, ob in Leberzellen eine Regulation über LDL-Rezeptoren wie im Falle der Fibroblasten existiert. In Anbetracht der Tatsache, dass die Leber bekanntlich der Ort für die Biosynthese der Lipoproteine darstellt und so in dem Inneren der Zelle die Komponenten der Lipoproteine zunächst vor dem Zusammenbau noch frei vorliegen dürften, erscheint es sehr fraglich, ob ein solcher Steuerungsmechanismus in diesem Organ überhaupt möglich ist. Das heißt, hier müssen weitere Versuche abgewartet werden, bis wir eine endgültige Entscheidung treffen können.

Comment

The present lecture is the last of three given by Feodor Lynen in Lindau from 1966 to 1975. Like his 1972 lecture, it is concerned with cholesterol, a steroid which is, at the same time, an essential constituent of our tissues and a major health threat due to its tendency to form solid deposits in arteries causing blockages and arteriosclerosis (background information on cholesterol can be found in the comment on Lynen’s 1972 lecture).

For the major part of the present lecture, Lynen is concerned with discussing new data on the regulation of cholesterol synthesis in our bodies. The rate of this synthesis is adjusted according to the cholesterol intake via food. If more cholesterol is consumed, less is synthesized and vice versa. Synthesis proceeds via the so-called mevalonate pathway, a sequence of enzymatically controlled, biochemical reactions. The mevalonate pathway yields isopentenyl pyrophosphate, the compound that Lynen refers to as activated isoprene (“aktiviertes Isopren”). Isopentenyl pyrophosphate is the core building block required for cholesterol synthesis. Regulating the rate of its production in the mevalonate pathway is one of our body’s means of controlling cholesterol levels.

Today (2013) we know, that a complex range of mechanisms and feedback loops are involved in the regulation of cholesterol biosynthesis. Not all of them were elucidated at the time of Lynen’s talk. However, it had already become obvious that they all have one thing in common: they work by affecting a single enzyme involved mevalonate pathway. This enzyme, called HMG-CoA reductase, converts HMG-Coenzyme A to mevalonate, which is then further reacted to yield activated isoprene. The regulation of cholesterol synthesis thus takes place at a relatively early stage: activated isoprene contains only five of the 27 carbon atoms present in cholesterol.

Interestingly, cholesterol itself has a major impact on cholesterol biosynthesis: it can deactivate the HMG-CoA reductase enzyme and trigger its degradation in the proteasome. Cholesterol furthermore affects the expression of genes coding for the HMG-CoA reductase enzyme. Hence, less HMG-CoA reductase is made if cholesterol levels are high. Both mechanisms reduce the rate of cholesterol synthesis and help to avoid excessive cholesterol accumulation. A further regulation mechanism involves the phosphorylation (covalent modification) of the HMG-CoA reductase enzyme by other enzymes, thus reducing its activity.

Unfortunately, Lynen himself could not witness the elucidation of the comprehensive picture of cholesterol regulation we have today. He died from the consequences of an aneurism operation in August 1979 [1].

David Siegel

[1] Angewandte Chemie International Edition 2011, 50, page 11580.

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Feodor Lynen