Hugo Theorell

Ladies and Gentlemen, my topic today is enzymes which I have chosen for a number of reasons. Firstly, enzymes have a catalysing effect and are responsible for all chemical processes, including the most complex occurring in living cells and tissues, and are therefore of inestimable significance in biology. Furthermore, I myself have worked on this for 35 years, which is also an important reason. The history of our knowledge about the chemical nature of enzymes and ferments is relatively speaking very new. Without exaggerating, we can say that 99 % of what we now know about enzymes was still unknown thirty years ago. However, history that pre-dates this is still of interest. Fermentative processes, such as alcoholic fermentation and digestion in the stomach and intestines, have of course been known for thousands of years though naturally with no understanding of how these processes came about. The first attempt at cleansing a ferment was most likely brought to public attention by the French researchers Payen and Persoz in 1833. They added alcohol to a malt extract, separated the precipitation and dissolved it again in water. The solution proved to be capable of breaking the starch down into sugar. The active substance was therefore called diastase. Shortly afterwards, in 1835, my great compatriot Berzelius made a prophetic statement in which he defined the term catalyst: A hitherto unknown force which was vital in the formation of organic substances in living tissues. Kirchhoff discovered that starch in diluted acid at the right temperature broke down into glucose. Diluted and organic acids also had a diatase effect, strangely enough. As was his nature, Berzelius made a quantitative determination. About this he writes: “It it is to our purpose to observe these changes in order to find out what the acid had extracted from the starch that made the residual substance change into sugar. Nothing however had dissipated in the form of gas, and nothing had combined with the acid, as the acid was found to be unchanged as to its quantity, and the sugar, which was found in the liquid, somewhat outweighed the volume of starch.” Now this is very curious, as this determination is not that easy to carry out and the increase in weight is naturally due to the water, which is absorbed when starch is hydrolysed. And plus 11% is anticipated, which more or less concurs with what Berzelius describes. Now, Berzelius put these observations into the context of Thénard's findings, namely that hydrogen peroxide, which Thénard himself had discovered, was broken down into oxygen and water by a large number of different substances. Alkali, certain metals, metal oxide and fibrin, we now know that the last of these, fibrin, contains catalase, so it is no wonder that hydrogen peroxide breaks down. These substances were not changed themselves and did not therefore apparently take part in the reaction. They operated through a mysterious force, the nature of which was not yet known. I quote again: “This is a new force which causes chemical reactions in both inorganic and organic nature. It is most certainly more widespread than we formerly imagined. In calling it a new force I did not mean that it would be independent from the usual electrochemical relationships. Quite the reverse, I cannot imagine that it could be anything else except a special manifestation of the same. Until more is known about it, it will make our work easier if we call it by a specific name. I will therefore call it a ‘catalytic force’ and the reactions it triggers ‘catalyses’”. Berzelius also tells us that thousands of catalytic processes take place in the living substance, producing huge numbers of different substances. Berzelius was obviously way ahead of development, as he is swimming against the tide of the turn of the century, notably against the developments. This most likely had its origins in the fact that most scientists, with Louis Pasteur at the forefront, believed in a vital, intangible life force. No cells, no life. The new era in the history of the fermentation chemistry begins with Buchner's discovery of cell-free fermentation in 1897. This made it possible to purify enzymes in a test tube, and scientists like Willstätter, Waldschmidt-Leitz and Hans von Euler attempted to prepare pure enzymes. This was no easy task back then. For instance: Willstätter had bad luck in his experiments with horseradish peroxidase. We now know that this is a highly active enzyme. Willstätter removed, around 1920, a lot of impurities but failed to concentrate his solution is sufficiently. Ultimately, what he had was active solutions that did not react to proteins, carbohydrates or iron with the then available methods of analysis and therefore drew the conclusion that the ferments were possibly a natural force without being anchored in the natural substances known at that time. Professor Otto Warburg, whose absence we deeply bemoan here today, added a remark that was typical for him: “What ferments are not, can be of no interest.” Fourteen years later horseradish peroxidase was crystallised in Stockholm and, funnily enough, we discovered exactly what Willstätter was vainly trying to find, namely protein carbohydrate and iron. This was not unexpected back then, as a great deal had happened in the meantime. Light was shed light on the role of haematin in cellular respiration thanks to the pioneering work of Otto Warburg in Dahlem and David Keilin in Cambridge. The work of McMunn in Scotland forty years prior to this had gone unnoticed. Although Warburg's photochemical spectra of the oxygen transferring ferment with iron content showed a range at 280 mµ, which indicated the interaction of protein, this was naturally not sufficient to prove that all enzymes are proteins. In 1926, James B. Sumner announced that he had crystallised the urease enzyme from jack beans in quite large quantities. The disinclination to believe this at first was evident in Sumner's decision to travel to Uppsala a few years later to enlist the aid of Svedberg's ultra-centrifuge, which was new at the time, to ascertain the molecular weight of urease. He went straight to Svedberg's study and announced: “My name is James B. Sumner, I crystallised an enzyme.” Svedberg thought he was mad, escorted him cautiously out of his study and locked the door from the inside. Even when Northrop published his work on the crystallisation of pepsin in 1933, some scientists still refused to believe that the crystals themselves were the enzyme. It remained very difficult to prove that the effect of enzymes was not present as a slight impurity. Northrop mentions this himself in his Nobel Prize lecture in 1946: and we have spent a great deal of time in establishing the purity of our preparations and in testing by every method available the relation between the activity and the protein.” It remained a hopeless cause to prove that the active enzymes were not present as slight impurities. It gradually emerged that the main difficulty consisted in the fact that urease and pepsin are simple as opposed to conjugated proteins. During this time, 1933-35, I was privileged to work in Otto Warburg's Institute in Dahlem. He had, at that time, discovered what is now known as “yellow ferment” and had succeeded in purifying it to the extent that the yellow colour was clearly visible. The identification of the yellow colour as riboflavin by Warburg, Karrer and Kuhn need not be explained in detail here. In the yellow ferment, riboflavin was combined with a high molecular carrier in a hitherto unknown form, whether protein or polysaccharine was initially not known. It was therefore important to produce the ferment in a pure state. This I was able to do in Dahlem with the help of the electrophoretic method which I had formerly worked out in Sweden. The residue from the yellow substance, reversibly separated, was a yellow protein which we now know as flavin mononucleotide, or FMN. In their separated form FMN and protein were less effective than hydrogen carriers, and effective again when reunited. The compound occurred in a stoichiometric relationship, and this experiment showed that the enzyme could not be present as a slight impurity in an impassable protein. Protein and enzyme were identical. Having been produced and crystallised in hundreds of enzymes, they are all proteins without exception. At the same time, in 1934, Warburg discovered in Dahlem that nicotinamide was an active component of triphosphopyridine nucleotide and cozymase diphosphopyridine nucleotide. In exact emulation of flavin nucleotide, pyridine nucleotides only work in combination with enzyme proteins, and one can validly claim that pyridine and flavin are the main carriers of hydrogen in substrates such as haemin-binding proteins to oxygen. The structure of the relatively simple co-ferments was indeed clarified within a short space of time. However, back then, we would never have dreamed it possible to define the whole three-dimensional structure of high molecular proteins. The problem appeared too complex for the human brain ever to solve. Now the problem has been solved through many brains working together. First of all, the sequence of individual amino acids in the relatively short insulin chains was, as we all know, solved by Sanger in Cambridge. In the process, the important thing was not only his own method but also Martin's and Synge's partition chromatography which, as was so aptly put by David Ezra Green, “gave wings to biochemistry”. Moore's and Stein's automatic amino acid analyser was also extremely important. Even sequencing has recently been automated by Pehr Edman. The defining of the so-called primary structure, meaning the sequence of amino acids, is becoming a routine operation today. Chains with some 400 amino acid residues have already been analysed, one after the other. Not so long ago, Merrifield in New York succeeded in synthesising the first enzyme, ribonuclease. The primary structure, the amino acid sequence, does not suffice in any way for describing the three-dimensional structure of a protein molecule. The chains are bound together in exceptionally complex folded structures with spheres, rods and slices, finding the most thermodynamically favourable form according to Afinsen. These higher structures are determinants for the enzyme's function. It was therefore a huge leap forward when Kendrew and Perutz successfully used X-ray crystallography to determine the three-dimensional structure of myoglobin and haemoglobin. Once the position of the haemin in relation to the neighbouring peptide chains was known, the mechanism of oxidation to iron can be minutely studied, often with the aid of extremely sophisticated physical methods, such as electron spin resonance, nuclear magnetic resonance, proton resonance, Mößbauer effects, etc. In a few years time, ferrous ferments will probably have been elucidated in the same way. In science, work in one field may unexpectedly lead to new insights in another field. I would like to demonstrate this taking a few examples from my own field, although other people have most probably done most of the work. Before I do this, I would like to say something about cytochrome c, a heme protein which often occurs in living nature. It contains iron as is common to haemin, and this iron transfers electrons by way of changing valances into the cellular respiration chain. The iron can also react differently, as with haemoglobin where it can for instance attach carbon monoxide or oxygen. With cytochrom c this needed to be prevented as the intention was to specialise it for transporting electrons. I should mention that this cytochrom c had already been discovered by McMunn in Scotland in the late-1880s, slowly slipped from memory, and was then rediscovered by Keilin in Cambridge in 1925. Our plan was to purify cytochrome c in Stockholm, which we had achieved by around the start of the Second World War, having studied the constitution a little. It emerged thereby that haemin is very strongly anchored in an amino acid chain, specifically with thioether bonds, two cystin deposits were combined with the vinyl side chains of the protohaemin through saturation. It could also be claimed that histidine most likely formed a compound with the iron and that the haemin was packed into a pleat of the protein molecule, making it accessible to free oxygen. Some were also attacked by the haemopeptides, and the sequence as it was, that was a little later, in the mid-1950s, was executed by my colleagues, Paléus in Stockholm and Tuppy who came to us from Vienna. Can I have the first slide please. A short time afterwards, the whole sequence was determined simultaneously, in Vienna by Tuppy and Kreil and in Salt Lake City by Emil Smiths and Margoliash. As you can see here, this is horse cytochrome c, and, you can see here, that it contains the 104 amino acids. This is interesting at first glance. Yes, there is the haematin, and here you can see the thioether bridges which link up to the cystins over here; here number 14 and number 17 from the start, with acetyl ether glycine here. So these thioether bridges were present. You can also see, number 18 histidine, as expected, is close to the haemin. In recent years probably around fifty cytochrome cs from various animals have been analysed leading to extremely interesting results. There are huge variations in the amino acid sequence between different types of animals. I will demonstrate this in more detail. However, there are some regions which are not changed at all. In this case, the mutation would occur, the new animal species would die out. Of these, just to mention, it doesn't have to be lysine here, but a base amino acid instead. This cystin here, position 14, always has to be present. These may vary. Cystin 17 always has to be here, exactly as histidine 18 here. Moreover, this whole region here, seventy asparagine to eighty methionine, must never be altered. In the whole of organic nature, no cytochrome C has ever been found that does not have these eleven amino acids. In a number of others, no mutation has been found yet, but may well be that it will be found. Now, this is a relatively simple molecule with only 100. Naturally, the three-dimensional structure has also been investigated, and Dickerson in Pasadena recently published a model that went up to a six angstrom resolution. Next slide please. So, what we first see from this slide is that the haem disc is slotted in as we would expect it to be, in a pleat, so to speak. It can be viewed from the side here, and we can already see that this histidine 18 is directly bonded here to the iron atom. Furthermore, it is also the case that the cystin is linked to the vinyl group by a thioether bond, similar to cystin 14 up there, just as was chemically found 20 or 30 years ago. Those are the propionyl groups down there, positioned within the protein molecule. So far, so good. Now, what belongs on the other side has been quite strongly, but perhaps not definitively, proven, as I will show you on the next slide. Next slide please. So here, when one has the whole model, we can follow the amino acid chain, but we can stop here. So, here is this hole, this pleat where the haem disc is inserted, with the tip facing outwards and the flat sides left and right. The iron atom is not visible here, it is positioned roughly here and, by chance, coincides with the histidine 18 position. Here is the propionyl residue of the haem in a downwards direction, and there is “M” which stands for methionine 80. Let us now recall that 70 to 80 needs to remain intact, with no mutations permitted, and it seems quite certain that methionine is the other ligand on the other side of the iron, directly opposite the histidine here. The haem is thus protected by this double bond from direct adhesion of oxygen or carbon monoxide. Next slide please. Strangely enough, all this work on the amino acid sequence of various cytochromes has spawned a completely new science. This is generally termed palaeogenetic biochemistry or so. What this means is that certain conclusions can be drawn from the number of mutations and the length of the intervals between these mutations before a new species can emerge from a more primitive form. Consequently, the numbers here indicate units of evolution and, in this case, they are an expression of time dating back around twenty-six or twenty-eight million years. This is naturally quite a long time. If we return to the origin, to a hypothetical primaeval unicellular organism, you can see that there are around 33 different evolutions until we arrive at mankind, and 33 times 26 gives us more than 1,500 million years. This is not so bad at all, as we know more or less exactly that our solar system has existed for around 4,000 to 5,000 million years, that the evolution has taken up a third of this period, the last third. If we start at the bottom, we can compare apes and man. Here there is one difference, meaning that those are the somewhat lower-level apes, as chimpanzees have exactly the same cytochrome c as humans. Naturally, we cannot draw the conclusion that chimpanzees and humans are identical. There are most certainly differences in other proteins but, as it happens, not in this small cytochrome c. It can also be seen that, for instance, the horse and the donkey differ in one respect. What, we might ask, about the mule? We know this, too. They have a straight 50% horse cytochrome and 50% donkey cytochrome, and live very well with this. Indeed there are other animals that are identical by chance. The cow, the pig and the sheep, for example, are all identical in terms of their cytochrome c. But this is no wonder. In contrast, we can well understand that the greater the differences here the longer the time more sophisticated forms have taken to develop from their primitive precursors. I now come to the second example. This concerns alcohol dehydrogenase in the liver. This is a simple protein that reacts with the NAD coenzyme, the nicotinamide mononucleotide. This ferment has been known since 1912 in its effect. The Swiss Battelli and Russian Lina Stern were the first to describe it. It is interesting to note that the Dane Lundsgaard discovered as late as 1938 that the enzyme is only present in the liver. So, it sits in the liver and is active there. More than twenty years have passed since we acquired the enzyme in its crystallised form in Stockholm. An achievement down to my colleagues Bonnichsen and Wassén. And since then we have played around with it a lot as it is relatively easy to produce, is very robust and lends itself well to experiments because the reduced coenyme in its combinations with the enzyme protein show very interesting and useful fluorescence changes. Up until four years ago all this was all fine. The enzyme has a very broad substrate specificity. It was able not only to burn ethanol but also a large number of others which ordinarily occur. We have moved further and further away from ethanol, progressing through to steroid alcohols where, all of a sudden, it became evident that a rather weak but nonetheless steroid alcohol activity was present. We were able to localise this quite specifically, the hydroxyl group must be present in the three position and in the beta position. Moreover, the fusion between region A and B must also be of the beta type, which adds up to a quite high substrate specificity on a totally unexpected substrate. We initially thought that this was something that the small enzyme could make itself. The activity was very weak but present nonetheless. However, at the same time the discovery was made in America that, when comparing several commercial preparations, this steroid activity actually did vary, with the lessor displaying one kind of activity and the others another. And this could not be reconciled with the purity of an enzyme at all. We took the old mother liquors from the crystallisations that had been standing around for three years in the cold and found large volumes of these steroid enzymes, steroid-active alcohol hydrogenase. Now, they still have their customary effect on alcohol, but might have somehow gained a new property as well. However, everything first needed to be reduced to a pure form and, in essence, there are two different forms of these steroid active things distinguishable by the fact that one is twice as effective as the other, also steroid enzyme. The solubility is also somewhat different. The first had already been crystallised in 1966 by us, and the other still remains a fantastical protein which one cannot precipitate, not even in 40% alcohol. It becomes denatured but does not precipitate. But this may happen one day, or so we hope. Now, what is interesting is that we have been able to break it down in urea, as is commonplace, where it is split in half, allowing the separate halves to be investigated, for instance using electrophoresis. This process shows that the old tried-and-tested ferment dispersed uniformly even when split in two. And the last, very soluble thing I mentioned, with only one strand, the dimers were identical but dispersed at a speed that differed from the first. And now, how does the third behave? If one uses urea to split it into two, you get two different halves that can be separated by electrophoresis. One half migrates towards the one enzyme that is only ethanol active and the other half migrates similar to other which is steroid active. If urea is removed, the two halves join together again, and then I know that that is purely ethanol-active, that nothing happens, as before, nothing happens, also with the other. But this last one, which was split into two, different one, results in three different strands. Next slide please. Indeed, there are a few crystals. That is the free, common ethanol active enzyme (inaudible 0:34:42). Next slide please. By the way, if one singles out the coal enzyme, a conformational change occurs in the protein molecule, which is even reflected in the crystal form, as we can see here. X-ray images also show the same, that is a huge difference. Next slide please. Yes, this is not a very good picture of (inaudible 0:35:12). That is the free enzyme which was first discovered and steroid active. Next slide please. We conducted an overall amino acid analysis in order to compare steroid-active and ethanol-active. There are no sure differences with one possible exception: threonine is slightly lower here in the steroid-active but perhaps nonetheless within the ... boundaries (inaudible 0:35:48). Next slide please. Here we need to pay careful attention. We have a gel electrophoresis diagram which shows that the purely ethanol-active halves which are present here migrate homogeneously and the most steroid-active halves also migrate here homogeneously but at a different speed. The enzyme in between is composed of two strands, one ethanol-active and the other steroid-active. Next slide please. If urea is removed we see that this behaves as before – which is then a check – and the split and recombined enzyme migrates over here. As before, only s-active controls and the same in reverse when combined. But this thing there which comprises the two activities and which was split in two, now results in three different ones. Most of it is as it was before but in a considerable amount of e and s which has been newly formed. What seems to have happened is that the intermediary enzyme is a hybrid, made up of one half which is steroid-active and the other half which is ethanol-active. Next slide please. It now became interesting to investigate whether these halves the various types reacted in the same way with coenzyme, and whether they interact. Which is why we, for instance, compared the disassociation constants of the e-e enzyme with s-s. This is easily ascertained through a spectrophoto-/fluorimetric titration with co-enzymes in various pHs from 6 to 10. Here we can see that the disassociation constants of an e-active enzyme, for example, positioned here, the values are micromolar, in actual fact, the bond is therefore immensely strong. This constant is 10 to the power of -7 molar. With the steroid enzyme it is more or less the same. A little lower down here, as you can see, but it remains low, rises a little in the phosphate buffer while remaining constant in the TRIS buffer. The e-enzyme there is quite different, with the low pH values here, they are still low. However, if one goes up to pH 10, the disassociation constants here also increase. Something must therefore have happened to change the conformation or chemical composition of the binding site for the coenzyme. Next slide please. Yes, even when the free coenzyme, the reduced one, binds with the protein, this triggers an increase and shift in the fluorescence intensity. The free coenzyme is here, and the various others more or less steroid-active or ethanol-active enzymes are positioned around here. When a tertiary complex is made, meaning that we introduce an inhibitor to the site where the substrate should be, in this case isobutylamide, then we see that there is a huge difference after all. The steroid-active enzyme causes the fluorescence intensity to increase very gradually, immensely with the alcohol-active enzyme and, as to be expected, 50% between this hybrid enzyme. This is indeed already an indication that the two half molecules in the hybrid molecule are quite independent from one another. And we have many other reasons for this. I don't want to spend too much time on this. Do we have another slide? No. Then lights please. Now, we are naturally working on determining the complete constitution of the enzyme, not only the primary structure, but also the three-dimensional x-ray structure. We have made a great deal of progress with both. What I can say briefly about the x-ray structure is that all exposures of the free enzyme and the three heavy metal derivatives have already been included, and calculations are being made. As far as the primary structure of the amino acid sequence is concerned, we expect that we will have a handle on this in a few months, we already know most of it. There are, however, a few small points which remain unclear. And my young colleague Hans Jörnvall deserves the most praise here. We have naturally compared e-ethanol-active an s-steroid-active types. What emerged was that they are distinguishable from one another at five points of the 380 amino acids in the whole chain. So, the difference is a little more than 1%, which is what is responsible for the differences between the activities. I might mention, for instance, that at position 17 from the end, E active has glutamine acid while s-active has glutamine. At position 92 from the same end, e has threonine and s has isolysin. And another seven steps further, which is not much, e has argenine and steroid serine. And at position 108, e has phenylalanine and s lysine. And very close to the other end, around 365, e has glutamine and s lysine. This last mutation is interesting because it takes away two negative charges here, when a sour amino acid, glutamine, is replaced by a base, lysine. And this is the reason for these electrophoretic differences that we saw in these gel electrophoretic experiments. So, I have taken the two examples of cytochrome c and liver alcohol hydrogenase because they are so hugely different. With the first case, cytochrome c, nature has found, right from the start, a very simple but extremely useful instrument. Only a few positions need to remain intact for something to happen at all. Therefore, of these 104 amino acids, 70 can be changed without much ado, and probably even more. The only thing is the (inaudible 0:43:55), as in specifically active groups nothing may be changed. In the hydrogenases... Here we see that a mere one percent of the amino acids suffices to enable a new modification. And if one compares these sequences, the ones we have here, with the other hydrogenases known to date, there are evidently analogies, for example, 23% consistencies or thereabouts with glycerine aldehyde phosphate dehydrogenase. And there is so much more that would be theoretically possible. It may therefore be that in both cases, cytochrome C and hydrogenase, all formulas which now occur originate from a common ancient molecule. It will indeed be very interesting to see how things develop. It is interesting to see, however, that pure biochemistry can also give rise to paleogenetics and other such things, things which could hardly be tackled with other tools. Thank you.

Lieber Herr Kollege Sund, ich danke Ihnen herzlich für die freundlichen Worte. Meine Damen und Herren, ich habe es gewählt heute über Enzyme zu sprechen, und zwar aus verschiedenen Gründen. Erstens mal, die Enzyme bewirken, leiten alle von den äußerst komplizierten chemischen Umwandlungen in den lebenden Zellen und Geweben und sind deswegen von unüberschätzbarer Bedeutung in der Biologie. Außerdem habe ich selbst seit 35 Jahren damit gearbeitet, auch ein triftiger Grund. Die Geschichte unseres Wissens über die chemische Natur der Enzyme oder Fermente ist verhältnismäßig sehr kurz. Ohne zu übertreiben, kann man wohl behaupten, dass 99 % von dem, was wir heute über Enzyme wissen, noch vor dreißig Jahren unbekannt war. Die ältere Geschichte ist jedoch nicht uninteressant. Fermentative Vorgänge, wie die alkoholische Gärung und die Verdauung im Magen und Darm, waren natürlich seit tausenden von Jahren bekannt, aber wie sie zustande kamen, hat man natürlich nicht verstanden. Der erste Versuch, ein Ferment zu reinigen, wurde wahrscheinlich von französischen Forschern Payen und Persoz in 1833 veröffentlicht. Sie gaben Alkohol zu einem Malzextrakt, trennten den Niederschlag ab und lösten ihn wieder in Wasser auf. Die Lösung erwies sich als fähig, Stärke zu Zucker zu spalten. Der wirksame Stoff wurde deshalb Diastase genannt. Kurz danach, 1835, machte mein großer Landsmann Berzelius eine prophetische Aussage, worin er den Begriff Katalyse definierte: Eine bisher unbekannte Kraft, die in der Bildung der organischen Substanzen in den lebenden Geweben wirksam teilnahm. Kirchhoff hatte gefunden, dass Stärke in verdünnter Säure bei geeigneter Temperatur zu Traubenzucker gespalten wurde. Verdünnte anorganische Säuren hatten also auch eine Diastasewirkung, merkwürdigerweise. Seiner Natur gemäß machte Berzelius eine quantitative Bestimmung. Er schreibt darüber: dass die zurückgebliebene Substanz instande setzte, sich zu Zucker zu verwandeln. Nichts war aber in Gasform weggegangen, nichts hatte sich mit der Säure verbunden, denn die Säure wurde quantitativ unverändert gefunden und in der Flüssigkeit wurde Zucker gefunden in etwas größerer Menge als die Stärke." Das ist ja nun sehr merkwürdig, denn diese Bestimmung ist gar nicht so einfach durchzuführen und die Gewichtszunahme kommt ja natürlich vom aufgenommenen Wasser, wenn Stärke hydrolysiert wird. Und erwartet ist plus 11%, das ist ungefähr, was Berzelius beschreibt. Nun, Berzelius setzte diese Beobachtungen in Zusammenhang mit Thénards Beobachtung, dass Wasserstoffsuperoxid, das Thénard selbst entdeckt hatte, durch eine große Anzahl von verschiedenen Substanzen zu Sauerstoff und Wasser gespalten wurde. Alkali, gewisse Metalle, Metalloxide, Blutfibrin, das letzte, das Blutfibrin, wissen wir jetzt, enthält ja Katalase, kein Wunder, dass Wasserstoffsuperoxid gespalten wird. Diese Substanzen wurden selbst nicht verändert, nahmen also scheinbar nicht an der Reaktion teil. Sie operierten durch eine geheimnisvolle Kraft, dessen Natur noch unbekannt war. Ich zitiere wieder: Sie ist sicherlich viel mehr verbreitet als wir uns früher vorgestellt haben. Wenn ich sie eine neue Kraft nenne, meine ich nicht, dass sie von den gewöhnlichen elektro-chemischen Beziehungen unabhängig wäre. Im Gegenteil, ich kann mir nicht vorstellen, dass sie etwas anderes wäre als eine besondere Manifestation davon. Solange nichts Näheres darüber bekannt ist, wird es unsere Arbeit erleichtern, wenn wir einen eigenen Namen dafür haben. Ich werde sie darum die 'katalytische Kraft' nennen und die davon bewegten Reaktionen 'Katalysen'." Berzelius sagt auch aus, dass in der lebendigen Substanz tausende von katalytischen Vorgängen stattfinden, die eine Menge von verschiedenen Substanzen hervorbringen. Offenbar war Berzelius weit voraus der Entwicklung, denn erst gegen die Jahrhundertwende, ging die Entwicklung nennenswert weiter. Das hat wohl darauf beruht, dass die meisten Wissenschaftler, mit Louis Pasteur an der Spitze, an eine substantiell nicht zu erfassende Lebenskraft glaubten. Ohne Zellen kein Leben. Die neue Zeit in der Geschichte der Fermentchemie beginnt mit Buchners Entdeckung der zellfreien Gärung in 1897. Dadurch wurde es möglich, Enzyme im Reagenzglas zu reinigen und Forscher wie Willstätter, Waldschmidt-Leitz, Hans von Euler versuchten es, reine Enzyme darzustellen. Das war damals gar nicht so einfach. Zum Beispiel: Willstätter hatte Pech, wenn er die Meerrettichperoxidase in Angriff nahm. Wie wir jetzt wissen, ist das ein sehr stark aktives Enzym. Willstätter entfernte um 1920 herum eine Menge von Verunreinigungen, konzentrierte aber nicht seine Lösung hinreichend, so dass er schließlich aktive Lösungen hatte, die nicht mit den damals zur Verfügung stehenden Analysemethoden auf Proteine, Kohlenhydrate oder Eisen reagierten und zog daraus den Schluss, dass die Fermente vielleicht eine Naturkraft ohne Verankerung in bisher bekannten Naturstoffen wären. Professor Otto Warburg, dessen Abwesenheit wir hier tief beklagen, fügte dazu eine typische, für ihn typische Bemerkung: Vierzehn Jahre später kristallisierten wir die Meerrettichperoxidase in Stockholm und fanden komischerweise darin gerade, was Willstätter vergeblich suchte, nämlich Protein, Kohlenhydrate und Eisen. Das war damals nicht mehr unerwartet, weil inzwischen doch viel passiert war. Die Rolle der Hämatine in der Zellatmung war durch die Pionierarbeiten von Otto Warburg in Dahlem und David Keilin in Cambridge aufgeklärt worden. Die vierzig Jahre früheren Arbeiten von McMunn in Schottland waren inzwischen unbeachtet geblieben. Warburgs fotochemische Wirkungsspektren des eisenhaltigen Atmungsferments zeigten zwar einen Band bei 280 mµ, der die Mitwirkung von Eiweiß andeutete. Aber dies war natürlich nicht genug, um zu beweisen, dass alle Enzyme Eiweißkörper sind. In 1926 verkündete James B. Sumner, dass er das Enzym Urease aus Jackbohnen in ziemlich großen Mengen kristallisiert hätte. Wie wenig man daran zu Anfang glaubte, zeigte sich, als Sumner ein paar Jahre später nach Uppsala fuhr, um mit Hilfe von Svedbergs damals neuer Ultrazentrifuge das Molekulargewicht der Urease zu bestimmen. Er trat direkt in Svedbergs Arbeitszimmer herein und sagte: Svedberg glaubte, der Mann wäre geisteskrank, geleitete ihn vorsichtig heraus und verschloss die Tür von innen. Auch wenn Northrop 1933 die Kristallisation des Pepsins veröffentlichte, glaubten manche Forscher doch nicht, dass die Kristalle selbst das Enzym wären. Es blieb sehr schwer zu beweisen, dass die Enzymwirkung nicht als kleine Verunreinigung anwesend war. Northrop erwähnte selbst die Sache in seiner Nobelpreis-Vorlesung 1946: and we have spent a great deal of time in establishing the purity of our preparations and in testing by every method available the relation between the activity and the protein." Es blieb eine hoffnungslose Sache zu beweisen, dass die wirksamen Enzyme nicht als kleine Verunreinigungen anwesend waren. Wie sich allmählich zeigte, bestand die Hauptschwierigkeit darin, dass Urease und Pepsin einfache, aber nicht konjugierte Proteine sind. Zu dieser Zeit, 1933-35, hatte ich das Privilegium, in Otto Warburgs Institut in Dahlem zu arbeiten. Er hatte damals das jetzt so genannte "gelbe Ferment" entdeckt und so weit gereinigt, dass die gelbe Farbe deutlich zu sehen war. Auf die Identifizierung der gelben Farbe als Riboflavin durch Warburg, Karrer und Kuhn brauche ich hier nicht einzugehen. Im gelben Ferment war das Riboflavin in unbekannter Weise mit einem hochmolekularen Träger verbunden, ob Eiweiß oder Polysaccharin konnte man zuerst nicht wissen. Es war deshalb wichtig, das Ferment in reinem Zustand darzustellen. Dies gelang mir in Dahlem mit Hilfe der elektrophoretischen Methode, die ich schon früher in Schweden ausgearbeitet hatte. Zurück blieb ein gelbes Protein, von dem der gelbe Farbstoff, jetzt als Flavinmononukleotid, FMN, bekannt, reversibel abgetrennt werden konnte. Getrennt waren FMN und Protein unwirksam als Wasserstoffüberträger, wenn wieder zusammengebracht wirksam. Die Verbindung geschah in stöchiometrischem Verhältnis und dieser Versuch zeigte, dass das Enzym nicht als kleine Verunreinigung in einem unwegsamen Protein vorhanden sein konnte. Protein und Enzym waren identisch. Nachdem sie in hunderten von Enzymen rein dargestellt und kristallisiert wurden, ohne Ausnahme sind sie Proteine. Zur gleichen Zeit, 1934, entdeckte Warburg in Dahlem das Nikotinsäureamid als wirksamen Bestandteil des Triphosphopyridinnucleotids und der Cozymase Diphosphopyridinnucleotid. Genauso wie die Flavinnucleotide wirken die Pyridinnukleotide nur in Verbindung mit Enzymproteinen und man kann wohl sagen, dass Pyridine und Flavine die hauptsächlichen Überträger des Wasserstoffes von Substraten wie Hämin-Proteinen zum Sauerstoff sind. Die Struktur der verhältnismäßig einfachen Co-Fermente wurde ja in kurzer Zeit bestimmt, aber man hatte damals keine Hoffnung, die gesamte dreidimensionale Struktur der hochmolekularen Proteine jemals bestimmen zu können. Das Problem erschien zu kompliziert für das menschliche Gehirn, jemals gelöst zu werden. Jetzt ist das Problem doch durch Zusammenwirken vieler Gehirne gelöst. Erstens mal, die Reihenfolge der einzelnen Aminosäuren in den verhältnismäßig kurzen Insulinketten wurde, wie wir alle wissen, von Sanger in Cambridge gelöst. Wichtig war dabei nicht nur seine eigene Methode, sondern auch Martins und Synges Papierchromatographie, von welcher David Ezra Green so richtig bemerkte, dass sie "gave wings to biochemistry". Sehr wichtig war auch Moores und Steins automatische Gesamtaminosäureanalyse. Sogar die Sequenzanalyse ist durch Pehr Edman neuerdings automatisiert worden. Die Bestimmung der so genannten Primärstruktur, das heißt, die Reihenfolge der Aminosäuren, beginnt also heute, Routine zu werden. Schon sind Ketten mit gegen 400 Aminosäureresten, einer nach dem anderen, analysiert worden. Neulich ist es Merrifield in New York gelungen, das erste Enzym, die Ribonuclease, zu synthetisieren. Die Primärstruktur, also die Aminosäuresequenz, ist ja gar nicht genügend, um die dreidimensionale Struktur eines Proteinmoleküls zu beschreiben. Denn die Ketten sind zu sehr komplizierten Kugeln, Stäbchen oder Scheiben zusammen gewunden, wobei nach Anfinsen die thermodynamisch günstigste Form schließlich gefunden wird. Für die Funktion des Enzyms sind diese höheren Strukturen maßgebend. Es war deswegen ein ungeheurer Fortschritt, als es Kendrew und Perutz gelang, mit Hilfe der Röntgenkristallographie die dreidimensionale Struktur des Myoglobins und des Hämoglobins aufzuklären. Wenn man jetzt die Lage des Hämins im Verhältnis zu den benachbarten Peptidketten kennt, kann man den Mechanismus der Sauerstoffanlagerung zum Eisen in Einzelheiten studieren, oft mit Hilfe sehr "sophisticaten" physikalischen Methoden, wie Elektronspin-Resonanz, kernmagnetische Resonanz, Protonenresonanz, Mößbauer-Effekte usw. In wenigen Jahren werden wohl die eisenhaltigen Fermente in derselben Weise aufgeklärt werden. Es kommt in der Wissenschaft vor, dass Arbeiten auf einem Gebiet unerwartet zu neuen Kenntnissen auf einem anderen Gebiet leiten. Das will ich illustrieren mit ein paar Beispielen aus meinem eigenen Arbeitskreis, obwohl andere Leute wohl die meiste Arbeit vielleicht dabei gemacht haben. Ich möchte zuerst etwas über das Cytochrom c erwähnen, das ist ein Häminprotein, das man überall in der belebten Natur findet und es enthält Eisen, wie gewöhnlich in Hämin eingebaut, und dieses Eisen überträgt durch Valenzwechsel Elektronen in der Zellatmungskette. Das Eisen kann auch anders reagieren, wie im Hämoglobin. Es kann da zum Beispiel Kohlenoxid oder Sauerstoff anlagern. Das musste nun beim Cytochrom c verhindert werden, weil es sollte für Elektronentransport spezialisiert werden. Ich möchte vielleicht sagen, dass dieses Cytochrom c schon von McMunn in Schottland in den späten 1880ern entdeckt wurde, wurde langsam vergessen und wieder entdeckt von Keilin 1925 in Cambridge. Wir nahmen uns vor, das Cytochrom C in Stockholm zu reinigen, so gegen Beginn des letzten Weltkrieges hatten wir das, und hatten so ein bisschen die Konstitution studiert. Dabei stellt sich heraus, dass das Hämin sehr stark verankert war an einer Aminosäurenkette, und zwar mit Thioetherbindungen, zwei Cystinreste waren mit den Vinyl-Seitenketten des Protohämins verbunden, durch Absättigung. Man konnte auch sagen, dass wahrscheinlich Histidin mit dem Eisen verbunden war und dass das Hämin in eine Falte des Proteinmoleküls eingepackt war, so dass es für freien Sauerstoff unzugänglich war. Es wurden auch einige von den Hämopeptiden angegriffen und die Sequenz da bestehend, das war etwas später, Mitte der fünfziger Jahre und wurde von meinem Mitarbeiter Paléus in Stockholm und Tuppy, der aus Wien zu uns kam, ausgeführt. Jetzt möchte ich das erste Bild haben, bitte. Etwas später wurde die ganze Sequenz bestimmt, und zwar parallel in Wien und in Salt Lake City, in Wien von Tuppy und Kreil, in Salt Lake City von Emil Smith und Margoliash. Man kann hier sehen, dies ist Pferde-Cytochrom c, man kann sehen, dass es die 104 Aminosäuren enthält hier. Besonders interessant ist erstens mal. das sind nun Nummer 14 und Nummer 17 vom Anfang, Acetyletherglycin hier. Also diese Thioetherbrücken waren da. Man kann weiter sehen das Nummer 18 Histidin wie erwartet nahe am Hämin. In den letzten Jahren sind nun wahrscheinlich ungefähr fünfzig Cytochrom cs von verschiedenen Tieren analysiert worden und das hat nun zu sehr interessanten Ergebnissen geführt. Es gibt ganz große Verschiedenheiten in der Aminosäuresequenz zwischen verschiedenen Tieren. Ich werde das näher zeigen. Aber es gibt einige Regionen, die überhaupt nicht verändert werden. Dann würde eine Mutation eintreffen, würde die neue Tierart aussterben. Von diesen, möchte ich erwähnen, hier muss es nicht Lysin sein, aber eine Basisaminosäure. Dieses Cystin hier, Position 14, muss immer da sein. Diese können variieren. Cystin 17 hier muss immer da sein, genauso wie Histidin 18 hier. Außerdem diese ganze Region hier, siebzig Asparagin bis achtzig Methionin darf überhaupt nicht geändert werden. In der ganzen organischen Natur hat man niemals ein Cytochrom c gefunden, das nicht diese elf Aminosäuren da hätte. In einigen anderen hat man bis jetzt keine Mutationen gefunden, aber das könnte wohl sein, dass man so etwas findet. Nun, dies ist ein verhältnismäßig sehr einfaches Molekül mit nur 100. Man hat nun natürlich auch die dreidimensionale Struktur in Angriff genommen und Dickerson in Pasadena hat neulich ein auf sechs Angström Auflösung gehendes Modell veröffentlicht. Nächstes Bild, bitte. Also, erstens mal kann man auf diesem Bild sehen, dass die Häminscheibe so eingebaut ist wie wir es erwartet hatten, in einer Falte sozusagen. Es wird hier von der Seite gesehen und man kann schon sehen, dass dieses Histidin 18 direkt an das Eisenatom hier gekoppelt ist. Weiter stimmt es, dass das Cystin hier an die Vinylgruppe durch Thioetherbindung gekoppelt ist und das Cystin 14 da oben in derselben Weise, so wie wir es chemisch vor zwanzig oder dreißig Jahren schon gefunden hatten. Das sind die Propionylgruppen hier unten, sie stehen innerhalb des Eiweißmoleküls. Also so weit stimmt dann alles. Nun, was auf der anderen Seite dahin kommt, das ist ziemlich stark bewiesen, aber vielleicht nicht endgültig und ich werde es auf dem nächsten Bild zeigen. Nächstes Bild, bitte. Also hier kann man, wenn man das ganze Modell hat, die Aminosäurenkette verfolgen, aber das können wir hier aufgeben. Also hier ist dieses Loch, diese Falte, wo die Häminscheibe hereinsteckt, also mit der Kante nach außen und die flachen Seiten links und rechts. Das Eisenatom kann man hier nicht sehen, es sitzt hier ungefähr, und kommt zufälligerweise gerade mit Histidin 18 Position zusammen. Hier sind die Propionylreste des Hämins nach unten gerichtet und da steht "M", das bedeutet Methionin Nummer 80. Jetzt können wir uns erinnern, dass 70 bis 80 intakt bleiben müssen, keine Mutationen erlaubt, und es erscheint ziemlich sicher, dass Methionin der andere Ligand auf der anderen Seite des Eisens ist, gerade gegenüber dem Histidin hier. Dadurch also, durch diese zweifache Bindung, ist das Hämin gegen direkte Anlagerung von Sauerstoff oder Kohlenoxid geschützt. Nächstes Bild, bitte. Nun, von diesen Arbeiten über die Aminosäuresequenz von verschiedenen Cytochromen ist man merkwürdigerweise zu einer ganz neuen Wissenschaft gekommen. Das wird im Allgemeinen paläogenetische Biochemie genannt oder so was. Das heißt, man kann von der Anzahl der Mutationen gewisse Schlüsse ziehen, wie viel Zeit dazwischen zurückgelegt sein muss, um aus einer primitiveren Art neuere zu bilden. Also, die Ziffern hier deuten Einheiten der Entwicklung an, units of evolution, und in diesem Fall drücken sie aus, ist das, in Zeit gemessen, ungefähr sechs- oder achtundzwanzig Millionen Jahre. Das ist eine erhebliche Zeit natürlich. Wenn man nun zum Ursprung, zu einem hypothetischen ur-einzelligen Organismus zurückgeht, so sehen Sie, die Unterschiede sind ungefähr 33 bis man zum Menschen kommt und 33 mal 26, da kommt man ja auf über 1.500 Millionen Jahre. Das ist auch gar nicht so schlimm, denn wir wissen ja ziemlich genau, dass unser Sonnensystem so zwischen vier- und fünftausend Millionen Jahre existiert, aber die Entwicklung hat ein Drittel, das letzte Drittel von dieser Zeit genommen. Wenn wir von unten beginnen, dann können wir Affe und Mensch vergleichen. Da besteht ein Unterschied, das heißt, das sind die etwas niedrigen Affen, denn die Schimpansen haben genau dasselbe Cytochrom c wie der Mensch. Daraus kann man natürlich nicht den Schluss ziehen, dass ein Schimpanse und ein Mensch identisch sind, bestimmt sind ja Verschiedenheiten in anderen Proteinen vorhanden, aber in diesem kleinen Cytochrom c zufälligerweise nicht. Man kann auch sehen, dass zum Beispiel das Pferd und der Esel sich an einer Stelle unterscheiden. Jetzt kann man sich ja fragen, wie sieht dann ein Maultier aus? Ja, das weiß man auch. Die machen ruhig 50 % Pferde-Cytochrom und 50 % Esel-Cytochrom und leben damit glücklich weiter. Es gibt auch andere, die zufälligerweise ganz gleich sind. Kuh, Schwein und Schaf zum Beispiel sind identisch vom Cytochrom-c-Standpunkt aus. Aber das ist ja gar nicht verwunderlich. Dagegen kann man ja sehen, dass, je größer die Unterschiede hier sind, je längere Zeit hat es natürlich gedauert, bis die höheren Formen sich aus den primitiveren entwickelt haben. Und das handelt von Alkoholdehydrogenase in der Leber. Das ist ein einfaches Protein, das mit dem Coenzym NAD zusammenwirkt, also das Nikotinsäureamid-Mononukleotid. Dieses Ferment war ja schon seit 1912 als Wirkung bekannt. Die Schweizer Battelli und die Russin Lina Stern haben das zuerst beschrieben. Bemerkenswert war wohl auch, dass der Däne Lundsgaard so spät wie 1938 bewiesen hat, dass das Enzym nur in der Leber vorkommt. Also, es sitzt in der Leber und wirkt in der Leber. Es ist ja über zwanzig Jahre her seitdem wir das Enzym kristallisiert bekommen haben in Stockholm. Das waren meine Mitarbeiter Bonnichsen und Wassén. Und seitdem haben wir damit sehr viel herumgespielt, denn es ist verhältnismäßig einfach darzustellen, es hält sich sehr gut und man kann damit schöne Versuche anstellen, weil das reduzierte Coenzym in seinen Verbindungen mit dem Enzym-Protein sehr interessante und verwendbare Fluoreszenz-Veränderungen zeigen. Alles war schön und gut sozusagen, bis vor vier Jahren. Das Enzym hat eine sehr breite Substratspezifizität. Es konnte nicht nur Ethanol verbrennen, sondern sehr viel andere gewöhnliche. Wir sind weiter und weiter von Ethanol weggekommen, bis zu den Steroidalkoholen, und da plötzlich hat sich gezeigt, dass eine ziemlich schwache, aber doch Steroidealkoholwirkung sich vorfand. Wir konnten diese auch ziemlich spezifisch lokalisieren, die Hydroxylgruppe muss in Dreistellung stehen und auch in beta-Stellung, außerdem muss die Fusion zwischen Region A und B auch beta-Typ sein, also eine ziemlich hohe Substratspezifizität auf einem ganz unerwarteten Substrat. Zuerst haben wir geglaubt, dass dies so eine Sache wäre, die das kleine Enzym selbst machen könnte. Die Wirkung war zwar schwach, aber war ja da. Nun hat man in Amerika gleichzeitig gefunden, wenn man verschiedene kommerzielle Präparate verglichen hat, dass diese Steroid-Wirkung doch variierte, das geringere hatte eine Art von Wirkung und die anderen eine andere. Und das konnte ja gar nicht mit Reinheit eines Enzyms vereinbart werden. Wir hatten dort aus alten Mutterlaugen von den Kristallisationen, die jahrelang dort herumgestanden waren in der Kälte, da haben wir mengenweise von diesen Steroid-Enzymen gefunden, steroid-aktiven Alkoholhydrogenasen gefunden. Nun, die wirken immer noch auf Alkohol wie gewöhnlich, aber haben eine neue Eigenschaft erworben, irgendwie. Zuerst mussten ja die Dinge rein dargestellt werden und in der Hauptsache gibt es zwei verschiedene Formen von diesen steroid-aktiven Dingen und die unterscheiden sich eigentlich dadurch, dass der eine zweimal so wirksam ist wie der andere, auch Steroid-Enzym. Die Löslichkeit ist auch etwas verschieden. Also das Erste wurde schon 1966 kristallisiert bei uns, das Andere bleibt immer noch ein phantastisches Protein, das man sogar in 40%igem Alkohol nicht ausfällen kann. Es wird denaturiert, aber es fällt nicht aus. Aber das wird wohl vielleicht kommen, wollen wir hoffen. Nun, was da interessant ist, ist, dass, wir haben es in Harnstoff aufspalten können, das ist ja ganz gewöhnlich, da wird es in Hälften gesplittet und dann kann man eben die separierten Hälften untersuchen, z.B. mit Elektrophorese. Dabei zeigt es sich, dass das alte, wohl bewährte Ferment, das auch, wenn es in zwei gesplittet war, wanderte einheitlich. Und das letzte, das sehr lösliche Ding, von dem ich gesprochen habe, auch dasselbe, nur eine Bande, die Dimere waren identisch, aber wanderte mit einer anderen Geschwindigkeit als das erste Ding. Und nun, wie macht das Dritte. Wenn man das in zwei zerschlägt durch Harnstoff, dann bekommt man zwei verschiedene Hälften, die man durch Elektrophorese trennen kann. Und die eine Hälfte wandert zu dem einen, dem nur ethanol-aktiven Enzym, die andere Hälfte wandert so wie die andere, die steroid-aktiv ist. Wenn man dann den Harnstoff wegnimmt, dann verbinden sich die Hälften wieder und da weiß ich, dass das nur ethanolaktive, dass nichts passiert, so wie früher, nichts passiert, das andere auch. Aber dieses letzte, das in zwei gesplittet wurde, verschiedene, da kommen drei verschiedene Banden raus. Das nächste Bild, bitte. Ja, da sind zuerst einige Kristalle. Das ist das freie, gewöhnliche ethanolaktive Enzym (inaudible 0:34:42). Das nächste Bild, bitte. Ja, hier nebenbei, wenn man das Coenzym da heranhebt, dann geschieht eine Konformationsänderung des Proteinmoleküls, was sich auch sogar in der Kristallform abspiegelt, wie wir hier sehen. Auch die Röntgenbilder zeigen dasselbe, das ist ein großer Unterschied. Das nächste Bild, bitte. Ja, das ist nun ein schlechtes Bild von (inaudible 0:35:12). Das ist das freie Enzym, das zuerst entdeckt wurde und das ist steroid-aktiv war. Das nächste Bild, bitte. Wir haben diese Gesamtaminosäureanalyse gemacht, um zu vergleichen steroid-aktive und das ethanol-aktive. Das sind keine sicheren Unterschiede mit einer möglichen Ausnahme, Threonin ist ein bisschen niedrig hier in den steroid-aktiven, aber vielleicht doch innerhalb der ... Grenzen (inaudible 0:35:48). Das nächste Bild, bitte. Ja, hier muss man genau aufpassen. Also hier ist ein Gelelektrophoresediagramm, das zeigt, dass die nur ethanol-aktiven Hälften, die hier sind, die wandern homogen und die am meisten steroid-aktiven Hälften wandern auch hier homogen, aber mit einer anderen Geschwindigkeit. Das Enzym dazwischen gibt hier zwei Banden, die eine gleich ethanol-aktiv, die andere gleich steroid-aktiv. Das nächste Bild, bitte. Nun, wenn man den Harnstoff wegnimmt, dann wird man sehen, das hier kommt wie zuvor, das ist dann eine Kontrolle, und das gespaltene und wieder rekombinierte Enzym wandert hier. So wie früher, nur s-aktiv Kontrolle und zurück kombiniert wieder dasselbe. Aber dieses Ding da, das beide Aktivitäten enthält und das in zwei gesplittet war, das gibt jetzt drei verschiedene. Das meiste ist so wie früher, aber in einer beträchtlichen Menge von e bzw. s ist neu gebildet. Also damit war ja die Sache offenbar so, dass das intermediäre Enzym ein Hybrid ist, das eine Hälfte von steroid-aktiv und eine Hälfte von ethanol-aktiv enthält. Das nächste Bild bitte. Es war nun von Interesse, zu untersuchen, ob diese Hälften die verschiedenen Typen in der gleichen Weise mit Coenzym reagierten zum Beispiel, auch ob sie aufeinander einwirkten. Deswegen haben wir zum Beispiel die Dissoziationskonstanten des e-e-Enzyms mit s-s verglichen. Das kann man einfach bestimmen durch spektrophotofluorimetrische Titration mit Coenzym in verschienen pH von 6 bis 10. Da kann man sehen, dass die Dissoziationskonstante zum Beispiel von einem e-aktiven Enzym, das liegt hier, die Werte sind mikromolar, die Verbindung ist also kolossal stark eigentlich. Diese Konstante meint 10 hoch -7 molar. Mit dem Steroid-Enzym ist es ziemlich dasselbe. Ein bisschen niedriger hier, wie man sieht, aber es bleibt niedrig, steigt ein bisschen an im Phosphatpuffer im TRIS-Puffer bleibt es konstant. Das e-Enzym ist da ganz verschieden, bei den niedrigen pH-Werten hier, sind die immer noch niedrig, aber wenn man bis auf pH 10 kommt, dann steigt die Dissoziationskonstante hier in die Höhe. Da muss also irgendwas passiert sein, was die Konformation oder chemische Zusammensetzung der Haftstelle für das Coenzym geändert hat. Nächstes Bild, bitte. Ja, auch wenn das freie Coenzym, das reduzierte, sich mit dem Protein kuppelt, dann geschieht eine Erhöhung und Verschiebung der Fluoreszenz-Intensität. Das freie Coenzym liegt hier, die verschiedenen anderen mehr oder weniger steroid-aktiven oder ethanol-aktiven liegen ungefähr gleich hier. Aber wenn man einen Ternärkomplex daraus macht, das heißt, wir führen da einen Hemmer hin auf der Stelle, wo das Substrat sein sollte, in diesem Falle Isobutylamid, dann sieht man, da ist doch ein großer Unterschied. Das steroid-aktive Enzym, da steigt die Fluoreszenzintensität sehr mäßig an, mit dem alkohol-aktiven kolossal viel und, wie man erwarten sollte, bei diesem Hybrid-Enzym 50 % dazwischen. Das deutet ja schon an, dass die beiden halben Moleküle im Hybrid-Molekül voneinander ziemlich unabhängig sind. Und wir haben auch viele andere Gründe dafür. Ich will die Zeit damit nicht zu viel aufhalten. Ist noch ein Bild da? Nein. Also Licht, bitte. Nun, wir sind natürlich dabei, die vollständige Konstitution des Enzyms zu bestimmen, nicht nur die Primärstruktur, sondern auch die dreidimensionale Röntgenstruktur. Und beide sind ziemlich weit fortgeschritten. Von der X-Ray-Struktur kann ich kurz sagen, dass die alle Exponierungen vom freien Enzym und die drei Schwermetall-Derivate sind schon aufgenommen und es wird berechnet. Mit der Primärstruktur der Aminosäuresequenz, das wird auch in wenigen Monaten erwartet, dass wir sie endgültig da haben, schon wissen wir das meiste. Aber es sind ein paar kleine Punkte, die noch unsicher sind. Und mein junger Mitarbeiter Hans Jörnvall hat dabei den Hauptverdienst. Nun haben wir da natürlich E-Ethanol-aktive und S-Steroid-aktive Typen verglichen. Da stellt sich heraus, die unterscheiden sich in fünf Stellen von 380 Aminosäuren in der ganzen Kette. Also etwas mehr als 1 % unterscheidet sich da und darin liegt der Unterschied zwischen den Aktivitäten. Ich kann ja erwähnen zum Beispiel, dass in der Stelle Nr. 17 von dem Ende, hat E-aktiv Glutaminsäure, S-aktiv hat Glutamin. In der Stelle 92 vom selben Ende, da hat E Threonin, das S hat Isolysin. Und weitere sieben Schritte, das ist nicht viel, da hat E Arginin und Steroid Serin. Und bei 108 hat E Phenylalanin, S hat Lysin. Und ganz nahe am anderen Ende, ungefähr 365, da hat E Glutamin, S hat Lysin. Diese letzte Mutation ist deswegen interessant, weil es beraubt ja hier zwei negative Ladungen, wenn eine saure Aminosäure, Glutamin, durch eine basische, Lysin, ersetzt wird. Und das ist der Grund dieser elektrophoretischen Unterschiede, die wir da sahen in den Gelelektrophorese-Experimenten. Also, ich habe diese zwei Beispiele Cytochrom C und Leber-Alkoholhydrogenase genommen, weil, die sind ja kolossal verschieden. Im ersten Fall, Cytochrom C, da hat die Natur schon von Anfang an ein einfaches, aber sehr nützliches Instrument gefunden. Wenn es nur an einigen wenigen Stellen intakt bleibt, dann kann überhaupt irgendwas passieren. Also, von diesen 104 Aminosäuren, da kann man also 70 ohne weiteres ändern, wahrscheinlich noch mehr. Das Einzige ist das (inaudible 0:43:55), denn in spezifischen wirksamen Gruppen, da darf nichts geändert werden. So scheint es gar nicht zu sein, was in den Hydrogenasen - Da sieht man, dass ein Prozent von den Aminosäuren schon genug ist, um eine neue Modifikation zu machen. Und wenn man diese Sequenzen, die wir hier haben, mit den bisher bekannten anderen Hydrogenasen vergleicht, so sind offenbar Analogien da, zum Beispiel mit der Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase sind zu 23 % oder so was Übereinstimmungen. Und da ist ja viel mehr, was da theoretisch möglich wäre. Es könnte also sein, dass in beiden Fällen, Cytochrom C und Hydrogenasen, alle die jetzt vorkommenden Formeln aus einem gemeinsamen Ur-Molekül stammen. Und es wird ja sehr interessant, der Entwicklung zu folgen. Es ist ja doch interessant zu sehen, dass aus reiner Biochemie auch Paläogenetik und solche Dinge rauskommen können, Dinge, die man wohl mit anderen Mitteln kaum angreifen könnte. Dankeschön.

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Hugo Theorell only gave two lectures at the Lindau Meetings. The first was in 1963 and its topic was how alcohol is burnt in the liver. The second and present lecture puts into a historical perspective the Nobel rewarded research which the young Theorell performed in Germany 1933-5 and which then continued at the Nobel Institute for Biochemistry in Stockholm. Theorell starts with the alcohol fermentation process, which has been used for thousands of years without a clear understanding of the mechanism. He then gives a review following the discoveries of, among others, the Nobel Laureates Buchner, Willstätter, von Euler, Warburg, Svedberg, Northrop and Stanley, Sumner, Martin and Synge, Sanger, Perutz and Kendrew, together with Merrifield and his last PhD student Hans Jörnvall, most of whom at one time or another visited the Lindau Meetings. In particular Theorell regrets that his colleague, the 1931 Nobel Laureate in Physiology or Medicine, Otto Warburg, is not present at the meeting (Warburg passed away in 1970). This is not so strange, since it was at Warburg’s institute in Berlin-Dahlem that Theorell made his first important enzyme discovery. When he showed his results, the story goes that Warburg commented “If this is correct you will receive the Nobel Prize”. But the years went by and Theorell had to wait. When his Swedish colleague Arne Tiselius was given the Nobel Prize in Chemistry in 1948, it is said that Theorell developed an ulcer that appeared every autumn before the announcement of the new Nobel Laureates. But in 1955 he was richly rewarded for his ulcer pains by becoming the choice of both the Chemistry Nobel Committee and the Committee for Physiology or Medicine. After some initial confusion, it was decided that he should be given the prize in Physiology or Medicine. He thus became the first researcher at Karolinska Institutet to receive its Nobel Prize. And the ulcer problem magically disappeared!

Anders Bárány