Randy Schekman (2014) - Genes and Proteins that Control Secretion and Autophagy

Good morning. I am delighted to be here, to see all these bright young faces this morning and to have my first opportunity to speak at a Lindau conference. I hope the first of many as years go on. I’m going to talk this morning about a new research project in my laboratory having to do with the mechanism of protein degradation, Protein and organelle degradation in mammalian and in yeast cells. It begins with the question of how a particular membrane in a cell called the phagophore membrane gives rise to a structure called the autophagosome which is responsible for the turnover of macromolecules in cells that are subject to stressful conditions. So let’s have the first slide. This process was first revealed in mammalian tissues many years ago with the discovery that stress induces wholesale protein turnover in the cell. But the real breakthroughs came I would say with the development of a genetic approach using baker’s yeast to uncover the genes called ATG genes that are required for degradation of organelles and cytoplasmic components when yeast cells are starved for an essential nitrogen source. The pioneering work in this field was achieved by Osumi in Japan and Klionsky now in Michigan. Let me review for you what we’ve learned about this process in yeast and in mammalian cells. We know that the process begins with the creation of a membrane called the phagophore membrane that envelops organelles and cytoplasmic components that will be captured for delivery to the lysosome where they’re turned over by proteases and lipases. This structure, the phagophore membrane, grows eventually to enclose on itself creating a membrane with content and an outer membrane that serves to target the organelle by membrane fusion to the lysosome. The inner membrane and its content are then degraded and the amino acids and sugars are restored to the cytoplasm for renewed use in a new programme that allows cells to survive under conditions of stress. Now in the field of autophagy there’s been a vigorous discussion on the nature of this membrane and its origin in the cell. It’s a substantial membrane. And yet where it comes from in the cell has been a bit of a mystery. So much so that the literature has focused on a number of possible origins. Many investigators have argued that the membrane originates from the endoplasmic reticulum. But others have argued that it may arise from the mitochondrion or possibly a region of adhesion between the mitochondrion and the ER. And others still have suggested that its growth may be sustained by recruiting membrane from endosomes, from the Golgi apparatus and even from the plasma membrane. Now, most of the work in my laboratory has focused on the mechanism of protein traffic in the secretory pathway but about 3 years ago I had an inquiry from a wonderful postdoctoral fellow from Shanghai by the name of Liang Ge. And in discussing potential research projects with Liang we focused on this question of where the autophagosome membrane originates. And Liang, when he joined my laboratory, conceived of a really interesting strategy to using biochemistry to identify the origin of this organelle. Let me tell you the key molecular covalent reaction that he focused on for his investigation. That is the attachment of a lipid called phosphatidylethanolamine to a covalent linkage to glycine at the C terminus of a purely cytosolic protein in mammalian cells called LC31. Now, we know about the biochemistry of this conjugation to phosphatidylethanolamine through the work of Osumi in Japan who characterised a set of ATG genes that act similarly to the E1, E2, E3 cascade of events that allows ubiquitin to be transferred to proteins that are turned over by degradation in the cytoplasm. The same kind of scheme through the final action of this complex results in LC3 being converted to a lipidated species and then anchored to the phagophore membrane, one of the only, very few unique components of the phagophore that can be used in its diagnoses. Now we can follow this event in cultured mammalian cells because lipidation of LC3 results in a protein that migrates more rapidly on an SDS gel. So just at the onset of starvation most of the LC3 migrate slowly on this gel. Within 30 minutes much of it is now at this more rapidly migrating species. And the protein as it becomes lodged in the membrane collects on the concave face of the membrane such that when the phagophore closes on itself, much of the LC3 that’s lipidated is eventually delivered to the lysosome. And as you can see here it’s degraded over the next hours of this regimen of starvation. Liang decided to try to reproduce this event in vitro and specifically to recreate the conditions that would allow LC3 to be converted to its lipidated species in a phagophore that was maturing in an extract consisting of soluble proteins and membranes. And in very short order after he joined my lab he succeeded in the following experiment. He took membranes from a mouse embryonic fibroblast cell line taken from a mouse that had sustained a knockout of 1 of the essential lipidation genes, ATG5. This is an early embryonic lethal event in the mouse but embryos can be collected and fibroblast grown from these. These embryonic fibroblasts grow perfectly well in the laboratory but they are completely deficient in lipidation of LC3. And they are defective at a very early stage in the autophagic process. He harvested membranes from a gentle lysate of ATG5 cells and mixed the membranes with cytosol taken from normal cells that had been starved under conditions that induce autophagy. The incubation of this mixture with ATP resulted in the production of a species that by migration and other criteria is authentic lipidated LC3. This happened whether the cytosol was taken from mouse embryonic fibroblast or from a human embryonic kidney cell line. And importantly if the C terminal glycine to which the phosphatidylethanolamine is attached is mutated to alanine, this reaction is completely arrested. Now, this reaction though it seems to reconstitute the authentic lipidation event, could simply be lipidation without the overarching control elements that are imposed when yeast cells are starved for nitrogen or when mammalian cells are starved for sterol. So it was important to establish using other criteria that the reaction that we had reconstituted measured some significant element in the origin of the phagophore membrane. And Liang used 2 conditions that have now satisfied us that we’ve captured an essential element in this process. The first experiment was to harvest cytosol from cells that are starved under conditions that induce autophagy or unstarved cells we treated with 1 or another drug that initiates the autophagic process. Let’s look at starvation. If you compare the efficiency of lipidation with cytosol taken from unstarved cells with cytosol taken from starved cells, you see a 3-fold increase in that reaction dependent upon starvation. Likewise if cytosol is harvested from cells treated with a drug that induces autophagy, again a 3-fold stimulation in this event. Another essential physiologic condition to initiate autophagy and indeed to initiate lipidation is the activity of an enzyme, phosphatidylinositol 3-kinase that produces PI3P which is essential for the lipidation and autophagic pathway to proceed. Fortunately there are good inhibitors of that enzyme and so Liang used 2 drugs that block the formation of this lipid in vivo. And found, as you’ll see in the next slide, that lipidation is also prevented in vitro. So here is such a reaction. The 2 drugs are 3-methyladenine which acts in cells in the millimolar range and wortmannin which acts in the nanomolar range. At these concentrations the formation of PI3P is blocked in vivo and lipidation is blocked in vivo. And likewise as you see here there is a progressive inhibition in lipidation by this inhibitor. Even though the inhibitor doesn’t directly block the action of the lipidation enzymes, it blocks the necessary prelude to the activation of the lipidation enzymes. We can also ask if the product, PI3P, must be accessible to the proteins in the cytosol to initiate this pathway. And here is an experiment that tests that. It takes advantage of a protein that has a domain that recognises the head group on PI3P. It’s a domain called the 5 domain embedded within a recombinant protein that we could purify. This recombinant protein on a lipid strip shows great specificity for PI3P. And correspondingly it is a potent inhibitor of the lipidation event in vitro whereas the mutation that inactivates this protein for binding to the head group is without effect in vitro. So we felt comfortable with these results in suggesting that we had reconstituted a significant early event in the formation of the phagophore. And we then focused on the question that initiated this whole project and that is: What is the membrane template in a cell that promotes the lipidation event? Is it a membrane, any membrane in the cell that houses phosphatidylethanolamine? Or is it a special membrane that is uniquely equipped to initiate this reaction? We again chose a biochemical approach. And Liang devised a scheme for fractionating all of the membranes in a lysate of ATG5 mutant cells in an effort to identify a unique membrane that may serve as a template. Now, let me show you the scheme that he developed that was quite successful. He found that a crude homogenate could be subjected to rounds of differential centrifugation under conditions where at this speed of centrifugal force, 25,000 times G for 10 minutes, a membrane that is enriched in lipidation activity is produced. And that activity is not found in lower or in higher speed pellet fractions. This pellet was re-suspended and sedimented to equilibrium on a sucrose step gradient to achieve a fraction further enriched in this activity. And throughout the fractionation scheme in addition to measuring the activity of a membrane to promote lipidation Liang looked at the distribution of marker proteins characteristic of the various membranes in a cell. And even at this stage, after 2 steps, almost all of the endoplasmic reticulum membrane was gone. It was removed. It fractionated elsewhere. All of the mitochondrial membrane that we could detect in the lysate was gone at this point. He then took this fraction and achieved a further substantial purification by sedimenting it to equilibrium on a linear gradient of a dense material called opti-prep. And I’ll show you the data for that experiment that produces a quite nice resolution. So here again is the fractionation scheme. This gradient represents the last fractionation on an opti-prep gradient. The top of the tube is the low buoyant density fraction, the bottom of the tube higher buoyant density. Lipidation activity is more or less restricted to fractions 2, 3 and 4 in this gradient. And this activity coincides quite nicely with proteins that are known to mark an organelle called the ER Golgi intermediate compartment, a way station between the ER that shuttles vesicle material back and forth between these 2 organelles. In contrast other organelles that remain in this last step of the fractionation, the endosome, a membrane that may continue to maturation of the phagophore, the peroxisome, the lysosome and even the cis-Golgi membrane, are nicely resolved. Now a trivial explanation may be that this membrane, the ER Golgi intermediate compartment, may somehow be enriched in most of the phosphatidylethanolamine in the cell. Well that simply isn’t true. PE is distributed elsewhere and was fractionated away. But we could ask very specifically on this last gradient where the preponderance of PE localised. That data is shown here. We’ve quantified the lipidation activity and quantified the recovery of various marker proteins by immunoblot. And then we chemically or enzymatically measured the fractionation of the remaining phosphatidylethanolamine in this gradient. And the highest concentration of PE is in the higher buoyant density fractions clearly resolved from the lipidation activity. Well, this was a very surprising result because the ER Golgi intermediate compartment is a relatively minor membrane in the cell. So we sought an independent orthogonal procedure to enrich this membrane to see if it really did carry along with it the template activity for lipidation. And what Liang devised was an immunol isolation scheme using epitopes on proteins that are exposed on a cytoplasmic face of the ERGIC membrane allowing him to immobilise this membrane and to centrifuge it on beads. Here is 2 versions of that experiment. One of the antibodies he used was against the ERGIC membrane protein Sec22b. This antibody very effectively precipitates a membrane that promotes lipidation and correspondingly precipitates 2 proteins of the ERGIC membrane while not precipitating a marker of the endosome. If the immunoprecipitation is conducted in the presence of competing levels of the peptide against which the antibody is raised, the membrane, lipidation membrane is not precipitated nor is the ERGIC membrane. Equivalently and using another protein that marks this membrane a receptor that cycles between the ER and Golgi with a flag epitope, the membrane is very efficiently precipitated. The lipidation activity recovered nearly quantitatively. But it is not precipitated if the peptide, flag peptide is included as a competitor. Well, in the final experiments then we addressed in cells whether the ERGIC membrane really could be detected as a station in the development of the phagophore. And one strategy that Liang devised was to use one of 2 drugs that block the formation of the ERGIC by inhibiting the formation of transport vesicles, COPII vesicles, that bud from the ER. Here is one such experiment. The 2 drugs are H89 and Clofibrate which when exposed to normal cultured fibroblasts result in the dispersal of a marker that is diagnostic of this compartment. Clofibrate more dramatically so. A complete dispersal in just 20 minutes of drug treatment. If cells are incubated with the drug for just 20 minutes and lysate is prepared and evaluated by the lipidation assay, the 2 drugs dramatically remove the template activity that promotes lipidation. Whereas 2 inhibitors that block downstream in the secretory pathway have much lower effect. Now, Liang also observed the reversal of the drug effect when the drug is withdrawn from cells. They very quickly restore the ERGIC membrane and as you’ll see in the next slide. The ability of the template to be detected in a lysate of cells from which the drug has been withdrawn is restored. Very rapidly indeed. So after 0 time or 20 minutes of drug treatment the membrane template activity is gone. But within just 2 minutes and fully after 5 minutes the ability of a membrane detected in vitro is restored to these cells. The kinetics of reappearance of the activity in vitro parallels substantially the reappearance of the ERGIC membrane and precedes the reformation of the Golgi membrane as detected by quantitative immunofluorescence. Now in the last experiment, a simple one, we ask: Is there something special about this membrane that allows it to serve as a template? Is there some protein that fractionates along with the membrane that remains to be discovered, that can somehow serve as an anchor to initiate this pathway? A very simple experiment that Liang conducted, shown here, is to expose either crude membranes or purified ERGIC membranes to trypsin on ice. Under conditions where proteins exposed on the outside surface of the membrane are clipped or shaved. You see that with increasing concentrations of trypsin the ability of this membrane to promote lipidation is destroyed even though all of the core components for lipidation are in the cytosol and are provided by the addition of crude cytosol to the isolated membrane. The membrane itself is not disrupted by the trypsin treatment because this protein which is largely housed inside the organelle is resistant to trypsin whereas another protein that is exposed on the outside surface is very sensitive to proteolysis. Well, let me summarise the conclusions in 2 forms. First in the form of a diagram which shows the position of this organelle mediating flow between the ER and Golgi. A kind of a bus station that collects vesicles from the ER and delivers them to the Golgi. Nonetheless a station that exists in the steady state at least in mammalian cells and must house 1 or more proteins that serve to mark this organelle as a unique compartment. We’d love to know what that protein is. We’re actively pursuing using this biochemical approach. Well I’ll summarise the results before I move on to another topic of interest. And that is by telling you that we have achieved this cell-free reaction. We believe that it represents a very early event in the generation of this interesting membrane. The reaction is stimulated by conditions known to induce autophagy in yeast and in mammalian cells including the action of regulatory proteins, Protein kinase, a lipid kinase, that were established by genetic and physiologic studies. We’ve used this reaction to identify a novel compartment that mediates a very early stage in the creation of the phagophore. And we’ve shown in vivo that the formation of this organelle depends upon active vesicular flow from the ER. Now, I’m going to turn my attention in the remaining minutes to another question that you’re all interested in whether you’re interested in autophagy or not. And that is the important issue of where we seek to publish our most important work. I can tell by the response that you may anticipate some remarks on my part. I believe that our system, that you, the young scholars in this audience, are now subjected to is broken. There is a distortion of influences that forces your hand in where you choose to publish your work. You are increasingly driven to publish in a very few venues that have captured your imagination because they present to you a sense of exclusivity and the promise of great promotion of your work and even treasure. Let me show you an example of one of the distortions that I learned of last year in the form of a document published by the Chinese Academy of Sciences shown in my next slide. Now I’m afraid you can’t read this. But I have a number of Chinese scholars in my office, in my laboratory. And they’ve translated this for me. It is an authentic document that basically is a reward notice. Basically a bribe that offers scholars in China a cash reward. The equivalent of 33,000 US dollars, private spending money, not for your laboratory necessarily if you win the lottery and publish your work in the 3 most exclusive venues in the life sciences, Cell, Nature and Science. This I believe is a terrible distortion of the values that we hold as scholars in the life sciences. It reduces our achievements to a monetary prize. Now this is bad enough. But I was particularly offended by the next line. Because as the former editor of the proceedings of the National Academy of Sciences I was disturbed to learn that the bribe was considerably less than that offered for publication in these venues. Only 8,000 dollars. And finally if you lose the lottery and publish in some local journal you only get 100 bucks. This represents, I think, a misapplication of the values that we hold dear in scholarly achievement. And it creates an influence that forces some unfortunate members of our scholarly community to misrepresent their work. And I’ll give you one important example. Early this year 2 seemingly revolutionary papers were published in Nature that claim that adult cells could be induced to form embryonic stem cells by exposure to a simple medium of low pH. This made the evening news in the US, the front page of the New York Times, the Wall Street Journal. It was sensational. But we learned in the weeks following that laboratories skilled in this approach failed to reproduce these results. We subsequently learn that images in the paper were inversions of each other. The images were used over and over in different orientations to give the impression that it was a different sample of cells. Indeed language in the paper was borrowed from previous publications of the first author. Now every journal and every editor can have such troubling experience with papers in their journal. But I would submit to you that the journals that are most exclusive and that rely on for example the impact factor in deciding whether a paper is going to be important for publication in that venue, such journals and the editors of those journals are responsible for creating pressures on us that do not... are not subject to the normal scholarly recognition and achievement that we seek. Indeed many others have suggested that the system of publication at the high end and the review process is broken. Hidde Ploegh publishing ironically in Nature. Peer review of scientific papers and top journals get bogged down by unnecessary demands for extra lab work. Or Marty Raff, Sandy Johnson, Peter Walter. In science the stress associated with publishing experimental results can drain much of the joy of practicing science. Why is this? Journals increasingly rely on what I consider to be a flawed metric called the impact factor. Indeed probably the postdocs in the audience can recite the impact factors of the journals that they wish to publish into 3 significant figures. And they will use minor differences in these numbers to determine which journal they will seek for their publications. And this creates on the other side increasing pressure to be highly selective, to look for those articles that seem to make claims that are extraordinary. Very often unfortunately these claims turn out to be wrong. Now many of us in the community have tried to do something to fight the influence of this phoney number impact factor. Several years ago Bruce Albert, then the editor of science magazine, and a group of journal editors gathered together in San Francisco to promote a document called the DORA document, Declaration of Research Assessment. If you haven’t seen it, you could Google it under DORA San Francisco. It recommends that scholars, publishers, review committees, university administrators, government officials move away from the use of impact factor and develop other means of evaluating scholarship. Maybe even reading the papers. Many of us have signed this document. I would urge you to do so. If you haven’t there are now over 10,000 people who have signed on. Now let me leave you finally with what I’m doing about it. Of course it’s one thing to complain about it. It’s another thing to do something. And I was asked several years ago by the Howard Hughes Medical Institute, by the Max Planck Society and by the Welcome Trust to create a new open access journal that’s led and run by scientists, by active scientists where all the decisions at the editorial level are made by active scholars. Truth in advertising. As the editor in chief in spend half of my time on the journal. So in fact I am compensated, part of my salary comes from this journal. It’s a journal called eLife. It is completely funded by these organisations. It has open access. It is free for a submission. We have no page charges. At least for the time being. And all of the decisions are made by active scientists in a highly consultative manner. I’d be happy to talk to you about this later on. And I would encourage you when you have time to look us up and see what we’ve been publishing in the year and a half that we’ve been available. I thank you for your attention. Applause.

Guten Morgen. Ich freue mich, hier zu sein, heute Morgen in all diese strahlenden jungen Gesichter schauen zu dürfen und zum ersten Mal die Gelegenheit zu haben, bei einem Lindauer Nobelpreisträgertreffen zu sprechen. Ich hoffe, diese ist die erste von vielen weiteren Gelegenheiten. Ich möchte heute Vormittag über ein neues Forschungsprojekt in meinem Labor sprechen, das mit dem Mechanismus des Proteinabbaus zu tun hat, mit dem Protein- und dem Organellenabbau in Säugetier- und Hefezellen. Es beginnt mit der Frage, wie eine bestimmte Zellmembran, die als Phagophormembran bezeichnet wird, eine als Autophagosom bezeichnete Struktur ausbildet, die in Zellen, die Stressbedingungen unterliegen, für den Austausch von Makromolekülen zuständig ist. Die erste Folie bitte. Dieser Prozess wurde vor vielen Jahren erstmalig in Säugetiergewebe entdeckt. Dabei wurde festgestellt, dass Stressbedingungen einen umfassenden Proteinumsatz in der Zelle in Gang setzen. Aber die wirklichen Erfolge, würde ich sagen, kamen mit der Entwicklung eines genetischen Ansatzes, bei dem mit Hilfe von Bäckerhefe die als ATG-Gene bezeichneten Gene entdeckt wurden, die für den Abbau von Organellen und zytoplasmatischen Komponenten erforderlich sind, wenn Hefezellen eine essenzielle Stickstoffquelle entzogen wird. Die Pionierarbeit auf diesem Gebiet leisteten Osumi, Japan, und Klionsky, der heute in Michigan tätig ist. Lassen Sie mich zunächst zusammenfassen, was wir inzwischen über diesen Prozess in Hefe- und Säugetierzellen wissen. Wir wissen, dass der Prozess mit der Bildung einer Membran beginnt, die als Phagophor-Membran bezeichnet wird und Organellen und zytoplasmatische Bestandteile umhüllt, die für die Abgabe an das Lysosom gespeichert werden, wo sie durch Proteasen und Lipasen umgesetzt werden. Diese Struktur, die Phagophormembran, wächst schließlich, umschließt sich selbst und bildet dabei eine Membran mit Inhalt und einer Außenmembran aus, die dazu dient, die Organelle durch Membranverschmelzung mit dem Lysosom ins Visier zu nehmen. Die Innenmembran und ihr Inhalt werden dann abgebaut und die Aminosäuren und Zucker zur erneuten Verwendung in einem neuen Programm, das den Zellen ein Überleben unter Stressbedingungen ermöglicht, im Zytoplasma gespeichert. Auf dem Gebiet der Autophagie gab es lebhafte Diskussionen über die Art dieser Membran und ihren Ursprung in der Zelle. Sie ist eine wesentliche Membran und dennoch ist ihre Herkunft ziemlich mysteriös. Die Literatur hat sich deshalb mit verschiedenen möglichen Ursprüngen beschäftigt. Viele Forscher haben argumentiert, dass die Membran aus dem endoplasmatischen Retikulum stammt. Andere meinen aber, dass sie aus dem Mitochondrium oder möglicherweise aus einer Adhäsionsregion zwischen Mitochondrium und ER stammen könnte. Und wiederum andere haben vermutet, dass ihr Wachstum durch Membranrekrutierung aus Endosomonen, vom Golgi-Apparat und sogar aus der Plasmamembran unterstützt wird. Der Großteil der Arbeiten in meinem Labor hat sich auf den Mechanismus des Proteinverkehrs im Sekretionsweg konzentriert. Aber vor rund 3 Jahren erreichte mich eine Anfrage von einem wunderbaren Postdoktoranden aus Shanghai mit dem Namen Liang Ge. Und in den Gesprächen mit Liang über potenzielle Forschungsprojekte konzentrierten wir uns dann auf diese Frage, woher die Autophagosommembran stammt. Und als Liang dann die Tätigkeit in meinem Labor aufnahm, dachte er sich eine wirklich interessante Strategie darüber aus, wie Biochemie zur Identifizierung des Ursprungs dieser Organelle eingesetzt werden könnte. Ich möchte Ihnen zunächst die entscheidende kovalente Molekülreaktion erklären, auf die er sich in seiner Untersuchung konzentriert hat. Das ist die Bindung eines Lipids mit der Bezeichnung Phosphatidylethanolamin an eine kovalente Bindung an Glycin am C-Terminus eines rein cytosolischen Proteins in Säugetierzellen mit der Bezeichnung LC31. Durch die Arbeit von Osumi in Japan, der eine Reihe von ATG-Genen charakterisierte, die ähnlich auf die E1-, E2-, E3-Ereigniskaskade reagieren, was die Übertragung von Ubiquitin auf Proteine ermöglicht, die durch Abbau im Zytoplasma umgesetzt werden, wissen wir etwas über die Biochemie dieser Verbindung mit Phosphatidylethanolamin. Dasselbe Programm führt über die letzte Aktion dieses Komplexes zur Umwandlung von LC3 in eine lipidierte Spezies und seine Verankerung an der Phagophormembran, eine der sehr wenigen einzigartigen Bestandteile des Phagophors, die in seiner Diagnostik verwendet werden können. Wir können dieses Ereignis jetzt in Säugetier-Zellkulturen verfolgen, weil die Lipidierung von LC3 zu einem Protein führt, das auf einem SDS-Gel schneller migriert. Unmittelbar zu Beginn der Unterversorgung wandert der Großteil des LC3 auf diesem Gel langsam. Innerhalb von 30 Minuten gehört der Großteil dann zu dieser schneller wandernden Spezies. Und wenn sich das Protein in der Membran eingenistet hat, sammelt es sich auf der konkaven Fläche der Membran, sodass – wenn das Phagophor sich selbst abkapselt – schließlich ein Großteil des lipidierten LC3 an das Lysosom abgegeben wird. Und wie Sie hier sehen können, wird es in den nächsten Stunden des Entzugsprozesses abgebaut. Liang wollte dieses Ereignis in vitro reproduzieren und insbesondere die Bedingungen wiederherstellen, die eine Umwandlung von LC3 in seine lipidierte Spezies in einem Phagophor ermöglichen würden, das in einem aus löslichen Proteinen und Membranen bestehenden Extrakt heranreifte. Und bereits kurz nach Aufnahme seiner Tätigkeit in meinem Labor gelang ihm das folgende Experiment: Er nahm Membranen von der embryonalen Fibroblasten-Zelllinie einer Maus mit Knock-out eines der essenziellen Lipidierungsgene, nämlich ATG5. Dies ist ein frühembryonales letales Ereignis in der Maus. Die Embryonen können aber entnommen und daraus Fibroblasten gezüchtet werden. Dieses embryonalen Fibroblasten wachsen im Labor bestens, sind aber absolut unzulänglich in der Lipidierung von LC3 und in einer sehr frühen Phase des autophagen Prozesses gestört. Er entnahm Membranen aus einem leichten ATG5-Zelllysat und mischte die Membranen mit Cytosol aus normalen Zellen, die unter Bedingungen, die zur Autophagie führen, ausgehungert worden waren. Die Inkubation dieser Mischung mit ATP resultierte in der Erzeugung einer Spezies, bei der es sich nach Migrations- und anderen Kriterien um authentisch lipidierte LC3 handelt. Dies geschah unabhängig davon, ob das Cytosol von embryonalen Fibroblasten der Maus oder aus einer humanembryonalen Nierenzellenlinie entnommen wurde. Wenn das C-Terminus-Glycin, an dem das Phosphatidylethanolamin gebunden ist, zu Alanin mutiert, wird diese Reaktion komplett verhindert. Bei dieser Reaktion, die zwar das authentische Lipidierungsereignis wiederherzustellen scheint, könnte es sich auch einfach um eine Lipidierung ohne die übergreifenden Steuerungselemente handeln, die eingebracht werden, wenn Hefezellen Stickstoff entzogen wird oder Säugetierzellen Sterol entzogen wird. Es war also wichtig, mit Hilfe anderer Kriterien nachzuweisen, dass die von uns wiederhergestellte Reaktion ein wesentliches Entstehungselement der Phagophormembran erfasste. Liang verwendete 2 Bedingungen, die uns jetzt ausreichend bestätigt haben, dass wir ein wesentliches Element dieses Prozesses erfasst haben. Beim ersten Experiment wurde Cytosol aus Zellen geerntet, die unter eine Autophagie hervorrufenden Bedingungen ausgehungert werden, oder aus nicht ausgehungerten Zellen, die wir mit dem einen oder anderen Wirkstoff behandelten, der den autophagischen Prozess initiiert. Schauen wir nun die Aushungerung an. Wenn man die Effizienz der Lipidierung mit Cytosol aus nicht ausgehungerten Zellen mit Cytosol aus ausgehungerten Zellen vergleicht, sieht man eine dreifache Zunahme dieser aushungerungsabhängigen Reaktion. Wenn Cytosol aus Zellen geerntet wurde, die mit einem Autophagie auslösenden Wirkstoff behandelt wurden, war ebenfalls eine dreifache Stimulierung dieses Vorgangs festzustellen. Eine weitere physiologische Voraussetzung für die Initiierung der Autophagie und natürlich für die Initiierung der Lipidierung ist die Aktivität eines Enzyms, nämlich Phosphatidylinositol-3-Kinase, die PI3P erzeugt, das eine wesentliche Rolle für die Fortsetzung der Lipidierung und des autophagischen Weges spielt. Glücklicherweise gibt es gute Inhibitoren für dieses Enzym. Liang verwendete 2 Wirkstoffe, die die Bildung dieses Lipids in vivo hemmen. Und wie man auf der nächsten Folie sieht, fand er heraus, dass die Lipidierung auch in vitro verhindert wird. Hier ist eine derartige Reaktion zu sehen. Die beiden Wirkstoffe sind 3-Methyladenin, das im millimolaren Bereich in Zellen agiert, und Wortmannin, das im nanomolaren Bereich agiert. Bei diesen Konzentrationen werden die PI3P-Bildung und die Lipidierung in vivo blockiert. Und gleichermaßen erfolgt, wie hier zu sehen ist, eine progressive Hemmung der Lipidierung durch diesen Inhibitor. Der Inhibitor blockiert den Vorgang der Enzymlipidierung zwar nicht direkt, aber er blockiert das erforderliche Vorspiel für die Aktivierung der Lipidierungsenzyme. Wir können uns auch die Frage stellen, ob das Produkt, PI3P, zur Initiierung dieser Übertragung für die Proteine im Cytosol zugänglich sein muss. Und hier ist ein Experiment, das genau diesen Aspekt untersucht hat. Es nutzt ein Protein mit einer Domäne, die die Kopfgruppe auf PI3P erkennt. Diese Domäne wird als 5-Domäne bezeichnet und ist in einem rekombinanten Protein enthalten, das wir reinigen konnten. Dieses rekombinante Protein auf einem Lipidstrang zeigt eine große Spezifität für PI3P. Und dementsprechend ist es ein potenter Inhibitor des Lipidierungsereignisses in vitro, während die Mutation, die die Bindung dieses Proteins an die Kopfgruppe inaktiviert, in vitro keine Wirkung zeigt. Diese Ergebnisse schienen unsere Annahme zu bestätigen, dass wir ein wesentliches Frühereignis in der Phagophorbildung wiederhergestellt hatten. Und wir konzentrierten uns dann auf die Frage, die dieses gesamte Projekt angestoßen hatte: Wie sieht das Membranmodell in einer Zelle aus, die die Lipidierung fördert? Ist es eine Membran, irgendeine Membran in der Zelle, die Phosphatidylethanolamin enthält? Oder ist es eine Spezialmembran, die speziell dazu ausgelegt ist, diese Reaktion zu initiieren? Erneut wählten wir einen biochemischen Ansatz. Liang entwickelte ein System zur Fraktionierung aller Membranen in einem Lysat von ATG5-Mutantenzellen, um eine einzigartige Membran zu identifizieren, die als Template dienen könnte. Hier zeige ich Ihnen das von ihm entwickelte System, das sehr erfolgreich wurde. Er fand heraus, dass ein rohes Homogenat mehreren Runden einer Differenzialzentrifugation unter Bedingungen unterzogen werden kann, unter denen bei einer Zentrifugalkraftgeschwindigkeit von 25.000 Mal G für 10 Minuten eine Membran erzeugt wird, die mit Lipidierungsaktivität angereichert ist. Und diese Aktivität ist in Pelletbruchteilen geringerer oder höherer Geschwindigkeit nicht zu finden. Dieses Pellet wurde resuspendiert und auf einem Saccharose-Step-Gradienten auf Equilibrium sedimentiert, um einen in dieser Aktivität weiter angereicherten Bruchteil zu erhalten. Und während des gesamten Fraktionierungsprogramms erfasste er zusätzlich zur Messung der Membranaktivität in der Unterstützung der Lipidierung die Verteilung von Markerproteinen, die für die verschiedenen Membranen in einer Zelle charakteristisch sind. Und selbst in dieser Phase war nach 2 Schritten bereits fast die gesamte endoplasmatische Retikulummembran verschwunden. Sie war weg, sie war irgendwohin fraktioniert. Zu diesem Zeitpunkt war die gesamte mitochondrische Membran, die wir im Lysat erkennen konnten, verschwunden. Er nahm dann diesen Bruchteil und erreichte eine weitere erhebliche Reinigung, indem er ihn auf einem linearen Gradienten eines dichten Materials mit der Bezeichnung Opti-Prep sedimentierte. Ich zeige Ihnen die Daten für dieses Experiment, das eine ziemlich schöne Lösung ergibt. Hier sehen Sie also noch einmal das Fraktionierungsschema. Dieser Gradient repräsentiert die letzte Fraktionierung auf einem Opti-Prep-Gradienten. Oben im Reagenzglas befindet sich der Bruchteil mit geringer Schwimmdichte, am unteren Teil des Reagenzglases die höhere Schwimmdichte. Die Lipidierungsaktivität ist mehr oder weniger auf die Bruchteile 2, 3 oder 4 in diesem Gradienten beschränkt. Und diese Aktivität fällt ziemlich gut mit der von Proteinen zusammen, die bekanntlich eine Organelle kennzeichnen, die als ER-Golgi-Intermediärkompartiment bezeichnet wird, eine Zwischenstation zwischen dem ER, das Vesikelmaterial zwischen diesen beiden Organellen hin- und hertransportiert. Im Gegensatz dazu sind die anderen Organellen, die in diesem letzten Schritt der Fraktionierung verbleiben, nämlich das Endosom, eine Membran, die sich bis zur Reifung des Phagophor fortsetzen kann, das Peroxisom, das Lysosom und sogar die cis-Golgi-Membran gut aufgelöst. Eine banale Erklärung dafür könnte sein, dass diese Membran, das ER-Golgi-Intermediärkompartiment, irgendwie im Großteil des Phosphatidylethanolamins in der Zelle angereichert wird. Aber das ist ganz einfach nicht der Fall. PE breitet sich anderweitig aus und wurde wegfraktioniert. Aber wir könnten uns sehr speziell diesem letzten Gradienten zuwenden, bei dem der PE-Überhang lokalisiert wurde. Die Daten werden hier dargestellt. Wir haben die Lipidierungsaktivität quantifiziert und die Ausbeute verschiedener Markerproteine mit Immunoblot quantifiziert. Und dann haben wir die Fraktionierung des restlichen Phosphatidylethanolamins in diesem Gradienten chemisch oder enzymatisch erfasst. Die höchste PE-Konzentration befindet sich in den Bruchteilen mit der höheren Schwimmdichte, die sich deutlich aus der Lipidierungsaktivität herausgelöst haben. Das war ein sehr überraschendes Ergebnis, weil das ER-Golgi-Intermediärkompartiment eine relativ unbedeutende Membran in der Zelle ist. So suchten wir nach einem unabhängigen orthogonalen Verfahren, um diese Membran anzureichern und zu beobachten, ob sie tatsächlich die Template-Aktivität für Lipidierung transportierte. Und Liang entwickelte ein Immunol-Isolierungsprogramm mit Epitopen auf Proteinen, die in exponierter Stellung auf einer zytoplasmatischen Oberfläche der ERGIC-Membran liegen, was ihm die Immobilisierung dieser Membran und ihre Zentrifugierung auf Beads ermöglichte. Hier sind zwei Versionen dieses Experiments. Einer der Antikörper, die er einsetzte, richtete sich gegen das ERGIC-Membranprotein Sec22b. Dieser Antikörper präzipitiert sehr effektiv eine Membran, die Lipidierung unterstützt. Dementsprechend präzipitiert er zwei Proteine der ERGIC-Membran, während kein Marker des Endosoms präzipitiert wird. Wenn die Immunopräzipitation bei Anwesenheit von konkurrierenden Mengen des Peptids durchgeführt wird, gegen das der Antikörper eingesetzt wird, werden weder die Lipidierungsmembran noch die ERGIC-Membran präzipitiert. Äquivalent dazu und bei Verwendung eines anderen Proteins, das diese Membran markiert, eines zwischen ER und Golgi kreisenden Rezeptors mit einem Marker-Epitop, wird die Membran sehr wirksam präzipitiert. Die Lipidierungsaktivität hat sich quantitativ nahezu erholt. Aber sie wird nicht präzipitiert, wenn das Peptid, das gekennzeichnete Peptid, als Konkurrent einbezogen wird. In den letzten Experimenten haben wir in Zellen untersucht, ob die ERGIC-Membran tatsächlich als eine Station in der Entwicklung des Phagophors entdeckt werden könnte. Eine Strategie, die Liang zu diesem Zweck entwickelte, war die Verwendung von einem von 2 Wirkstoffen, die die Bildung von ERGIC durch Hemmung der Bildung der Transportvesikel, COPII-Vesikel, hemmt, die aus dem ER sprießen. Hier ist ein solches Experiment zu sehen: Die beiden Wirkstoffe sind H89 und Clofibrat, die bei Kontakt mit normalen, kultivierten Fibroblasten zur Ausbreitung eines Markers führen, der für dieses Kompartiment diagnostisch ist. Und zwar bei Clofibrat wesentlich drastischer. Eine vollständige Ausbreitung in nur 20 Minuten nach Verabreichung des Wirkstoffes. Wenn Zellen gerade einmal 20 Minuten mit dem Wirkstoff inkubiert werden und Lysat ausgeführt und durch den Lipidierungsassay evaluiert wird, beseitigen die beiden Wirkstoffe die Template-Aktivität, die die Lipidierung fördert, extrem, während zwei Inhibitoren, die den Sekretionsweg weiter unten hemmen, wesentlich geringere Effekte zeigen. Liang beobachtete auch den umgekehrten Wirkstoffeffekt, wenn der Wirkstoff aus den Zellen entzogen wird. Sie stellen die ERGIC-Membran sehr schnell wieder her. Und wie Sie in der nächsten Folie sehen, wird die Möglichkeit, das Template in einem Zelllysat zu entdecken, dem der Wirkstoff entzogen wurde, wieder hergestellt. Und zwar sehr schnell. Nach dem Startmoment oder 20 Minuten Wirkstofftherapie ist die Template-Aktivität der Membran verschwunden. Aber innerhalb von gerade einmal 2 Minuten und vollständig nach 5 Minuten ist die Fähigkeit der Membran, die in vitro festgestellt wurde, in diesen Zellen wieder hergestellt. Die Kinetik des Wiederauftretens der Aktivität in vitro entspricht im Wesentlichen dem Wiederauftreten der ERGIC-Membran und geht der Erneuerung der Golgi-Membran voraus, wie sie durch die quantitative Immunofluoreszenz entdeckt wurde. In dem letzten Experiment, einem ganz einfachen Experiment, stellen wir die Frage: Gibt es etwas Spezielles an dieser Membran, das es ihr ermöglicht, als Template zu dienen? Gibt es ein noch nicht entdecktes Protein, das zusammen mit der Membran fraktioniert und das in irgendeiner Weise als Anker für die Initiierung dieses Signalweges dienen kann? Ein sehr einfaches Experiment, das Liang durchführte und das hier zu sehen ist, besteht darin, entweder Rohmembranen oder gereinigte ERGIC-Membranen mit Trypsin auf Eis in Kontakt zu bringen Sie sehen hier, dass die Fähigkeit dieser Membran, Lipidierung zu unterstützen, mit zunehmenden Trypsin-Konzentrationen auch dann zerstört wird, wenn alle Kernbestandteile der Lipidierung im Cytosol vorhanden sind und durch Zugabe von Rohcytosol zur isolierten Membran bereitgestellt werden. Die Membran selbst wird durch die Trypsinbehandlung nicht beeinträchtigt, weil dieses Protein, das sich größtenteils innerhalb der Organelle befindet, gegenüber Trypsin resistent ist, während ein anderes Protein, das sich auf der Außenseite befindet, sehr proteolyse-anfällig ist. Ich möchte die Schlussfolgerungen in zweifacher Weise zusammenfassen. Zunächst in der Form einer Grafik, die die Position dieser Organelle darstellt, die den Fluss zwischen ER und Golgi vermittelt. Das ist eine Art Bushaltestelle, die Vesikel vom ER aufnimmt und diese beim Golgi abliefert. Gleichwohl eine Station, die zumindest in Säugetierzellen im Dauerzustand besteht und eines oder mehrere Proteine enthält, die zur Markierung dieser Organelle als einzigartiges Kompartiment dienen. Gerne wüssten wir, welches Protein das ist, und wir verfolgen diesen biochemischen Ansatz offensiv weiter. Ich möchte die Ergebnisse zusammenfassen, bevor ich zu einem anderen interessanten Thema wechsele. Wir haben diese zellfreie Reaktion erreicht. Wir glauben, dass sie ein sehr frühes Ereignis in der Erzeugung dieser interessanten Membran repräsentiert. Die Reaktion wird durch Bedingungen stimuliert, die bekanntermaßen Autophagie in Hefe- und in Säugetierzellen bewirken, insbesondere die Aktion regulatorischer Proteine, Protein-Kinase, eine Lipid-Kinase, die durch genetische und physiologische Studien bestätigt wurden. Wir haben diese Reaktion dazu genutzt, ein neuartiges Kompartiment zu identifizieren, das eine sehr frühe Phase in der Phagophor-Erzeugung vermittelt. Und wir haben in vivo gezeigt, dass die Bildung dieser Organelle von einem aktiven Vesikel-Fluss vom ER abhängig ist. Die verbleibenden Minuten möchte ich einer anderen Frage widmen, die Sie alle interessieren dürfte, ganz egal, ob Sie an der Autophagie interessiert sind oder nicht. Und das ist die wichtige Frage, wo wir unsere wichtigsten Arbeitsergebnisse veröffentlichen sollten. Ihrer Reaktion entnehme ich, dass Sie vielleicht schon ahnen, in welche Richtung meine Bemerkungen gehen werden. Ich glaube, dass unser System, dem Sie als junge Wissenschaftler ausgesetzt sind, nicht mehr funktioniert. Durch verzerrende Einflussnahmen werden Sie gezwungen, Ihre Arbeiten an bestimmten Schauplätzen zu veröffentlichen. Man wird zunehmend gezwungen, an einigen wenigen Stellen zu veröffentlichen, die attraktiv erscheinen, weil sie einem das Gefühl von Exklusivität vermitteln und versprechen, großartige Werbung für die Arbeit zu machen und mit einer Vergütung locken. Ich möchte Ihnen ein Beispiel für eine dieser verzerrenden Entwicklungen demonstrieren, von denen ich im letzten Jahr in Form eines Dokumentes erfuhr, das von der Chinesischen Akademie der Wissenschaften veröffentlicht wurde. Es ist auf meiner nächsten Folie zu sehen. Nun fürchte ich natürlich, dass Sie das nicht lesen können. Aber in meinem Labor arbeiten mehrere chinesische Wissenschaftler, die das für mich übersetzt haben. Es ist ein authentisches Dokument, das eigentlich eine Belohnungsanzeige ist, eigentlich sogar eine Form der Bestechung, die Wissenschaftlern in China eine Belohnung in Form von Bargeld anbietet. Und zwar in Höhe von umgerechnet 33.000 US-Dollar, Privatgeld, nicht zwangsläufig für das Labor, wenn man das große Los gewinnt und seine Arbeit an den 3 exklusivsten Orten der Biowissenschaften veröffentlicht, nämlich in Cell, Nature und Science. Das ist nach meiner Meinung eine schreckliche Verzerrung der Werte, die für uns als Wissenschaftler in den Biowissenschaften gelten. Das reduziert unsere Leistungen auf einen Geldpreis. Das ist schon schlimm genug. Aber ich war besonders aufgebracht über die nächste Zeile. Als früherer Herausgeber der Tagungsbände der National Academy of Sciences war ich entsetzt zu erfahren, dass das der Betrag wesentlich geringer war als für diese Publikationsorte - nur 8.000 Dollar. Und wenn man in dieser Lotterie verliert und in einem lokalen Magazin veröffentlicht, erhält man nur 100 Dollar. Ich halte dies für einen falschen Umgang mit den Werten, die uns in Bezug auf unsere wissenschaftlichen Leistungen wichtig sind. Und es schafft eine Einflussnahme, die einige unglückliche Mitglieder unserer wissenschaftlichen Gemeinschaft dazu zwingt, ihre Arbeit falsch zu präsentieren. Ich möchte Ihnen dazu ein wichtiges Beispiel geben: Anfang dieses Jahres wurden in Nature zwei offensichtlich revolutionäre Artikel veröffentlicht, in denen behauptet wurde, dass adulte Zellen dazu veranlasst werden könnten, embryonale Stammzellen zu bilden, indem sie einem einfachen Medium mit niedrigem pH-Wert ausgesetzt würden. In den USA wurde das in den Abendnachrichten, auf der Titelseite der New York Times und im Wall Street Journal kommuniziert. Es war sensationell. In den darauf folgenden Wochen erfuhren wir aber, dass kompetente Labors mit Erfahrungen in diesem Ansatz solche Ergebnisse nicht reproduzieren konnten. Später hörten wir dann, dass die in dem Artikel verwendeten Bilder Umkehrungen voneinander waren. Die Bilder wurden immer und immer wieder in unterschiedlichen Ausrichtungen verwendet, damit der Eindruck entstand, dass es um verschiedene Zellenproben ging. Und die Formulierungen im Aufsatz waren früheren Publikationen des ersten Autors entlehnt. Natürlich kann jedes Magazin und jeder Redakteur solche besorgniserregenden Erfahrungen mit Artikeln machen. Aber ich möchte Sie darauf hinweisen, dass die Fachmagazine, die zu den exklusivsten zählen und sich beispielsweise bei der Entscheidung, ob ein Artikel für eine Veröffentlichung an dieser Stelle bedeutsam ist, auf den Impact-Faktor stützen, dass solche Fachmagazine und die Redakteure solcher Fachmagazine dafür verantwortlich sind, dass Druck auf uns ausgeübt wird, der keine normale wissenschaftliche Anerkennung darstellt, wie wir sie eigentlich anstreben. In der Tat haben auch viele andere gesagt, dass das Publikationssystem im oberen Segment und der Überprüfungsprozess nicht mehr funktionieren. Hidde Ploeg, der ironischerweise in Nature veröffentlicht, sagte: Oder Marty Raff, Sandy Johnson, Peter Walter: kann einen Großteil der Freude an der Ausübung von Wissenschaft zunichte machen.) Warum ist das so? Zunehmend stützen sich Fachjournale auf das, was ich als den falschen Parameter wahrnehme, nämlich den Impact-Faktor. Wahrscheinlich können die Postdoktoranden im Publikum die Impact-Faktoren der Journale, in denen sie veröffentlichen möchten, anhand von 3 wesentlichen Zahlen zitieren. Und sie werden geringfügige Differenzen in diesen Zahlen als Argument für ihre Entscheidung gelten lassen, in welchem Journal sie veröffentlichen sollten. Und dies lässt andererseits einen wachsenden Druck entstehen, sehr selektiv vorzugehen und gezielt nach Aufsätzen zu suchen, die möglichst außergewöhnliche Behauptungen aufstellen. Und leider stellen sich gerade diese Behauptungen oft als falsch heraus. Viele von uns in der wissenschaftlichen Gemeinschaft haben schon versucht, den Einfluss dieser Phantomzahl „Impact-Faktor“ zu bekämpfen. Vor mehreren Jahren engagierten sich Bruce Albert, damals Herausgeber von Science, und zahlreiche Journal-Redaktionen in San Francisco in Form eines Dokuments unter der Bezeichnung DORA, Declaration of Research Assessment. Wenn Sie das nicht kennen, können Sie das unter DORA San Francisco googeln. Darin wird empfohlen, dass sich Wissenschaftler, Verleger, Gutachterausschüsse, Hochschulverwaltungen und Regierungsvertreter von der Orientierung am Impact-Faktor abwenden und andere Mittel der Beurteilung von Wissenschaft entwickeln, vielleicht sogar die Artikel selbst lesen. Viele von uns haben dieses Dokument inzwischen unterschrieben. Ich empfehle Ihnen dringend, das auch zu tun. Bisher haben mehr als 10.000 Befürworter das Papier unterschrieben. Ich möchte Ihnen abschließend vermitteln, worum es mir dabei geht. Es ist nämlich eine Sache, die Entwicklung zu beanstanden. Eine andere Sache ist es, aktiv zu werden. Und ich wurde vor mehreren Jahren vom Howard Hughes Medical Institute, der Max-Planck-Gesellschaft und dem Welcome Trust gebeten, ein neues Open Access-Journal zu initiieren, das von Wissenschaftlern, aktiven Wissenschaftlern, geleitet und betrieben wird und bei dem alle Entscheidungen auf redaktioneller Ebene von aktiven Wissenschaftlern getroffen werden. Apropos Richtigkeit der Werbeaussagen: Als Chefredakteur bin ich die Hälfte meiner Zeit für dieses Journal tätig. Ich werde also tatsächlich auch bezahlt. Ein Teil meines Gehaltes stammt aus diesem Journal. Es ist ein Journal mit der Bezeichnung eLife. Es wird vollständig von diesen Organisationen finanziert. Es kann unentgeltlich genutzt werden. Zumindest zum jetzigen Zeitpunkt werden keine Gebühren für die Inanspruchnahme von Seiten erhoben. Und alle Entscheidungen werden im Rahmen eines echten Konsultationsprozesses von aktiven Wissenschaftlern getroffen. Gerne erzähle ich Ihnen darüber noch mehr. Und ich möchte Sie einladen, unsere Seite zu besuchen und sich anzuschauen, was wir in den eineinhalb Jahren veröffentlicht haben, seitdem es uns gibt. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit. Applaus.