Edmond H. Fischer  (2015) - The Origin of Reversible Protein Phosphorylation as a Regulatory Mechanism

Reversible protein phosphorylation can be considered one of the most prevalent mechanism by which eukaryotic cellular events are regulated. It is directly involved in numerous pathological conditions, and bacterial and viral diseases

What I'm going to give you today is a rapid overview, historical overview of the work I carried out with my colleague and friend, Edwin Krebs on glycogen phosphorylase. Studies that resulted in our finding reversible protein phosphorylation as a regulatory mechanism. Ed died five years ago, so I have introduced a couple of video tapes of him speaking while the two of us were reminiscing about our early work. The reaction we found, reversible protein phosphorylation, is really embarrassingly simple. Nobody would have paid any attention to it if it did not turn out to be absolutely required for cellular processes. On the other hand, it's fair to say that when we came out with it, it came out as a very big surprise. Because one knew at that time essentially nothing about cellular regulation, or enzyme regulation, and terms like "signal transduction," that you use commonly here, would not have been understood. It would have been meaningless in those days. To put that in the proper context, let me tell you how things were 60 years ago in this field when we got started. First of all, while endocrinology was already well recognized as a discipline, it remained purely at the phenomenological level, mostly intact-animal level. A few factors, circulating factors, were known. Hormones that carried a message from one organ to the other, and resulted in some kind of physiological response. Insulin was well known as the messenger sent by the pancreas to regulate carbohydrate metabolism just like adrenaline was known as the messenger from the adrenals. But the actions of those hormones stopped at the cell membrane. What happened next was absolutely unknown. It was inconceivable that the hormone could act in a cell-free system until Earl Sutherland and his student, Ted Rall, came up with a stunning discovery of cyclic AMP that served as an intercellular, a second messenger, intercellular factor for the action of adrenaline. Secondly, science was conducted in a totally different way than it is today. In those days, well, in fact, since the days of Claude Bernard, the French physiologist who first described the glycogenic action of the pancreas. In those days, you observed a phenomenon, and then tried to find the enzyme involved. Today, largely, it's the other way around. First, enzymes are discovered with the completion of I don't know how many genome sequencing projects. By over expressing them, by knocking them in and out, you try to determine their function. To paraphrase Luigi Pirandello, we went to six functions in search of an enzyme to hundreds of enzymes in search of a function. Finally, as I just said, one knew nothing about how cells were regulated. In those days, enzymes were thought to be regulated by the rate at which they were synthesized and then degraded. That's still until the mid 40's, late 40's, early 50's, when it was realized that this could not be the case. That this wouldn't work. That cells had to have ways of modulating the activity of the enzyme once they had been produced and liberated inside the cell. They had to have the capability of adapting to their environment, of satisfying their metabolic, physiological needs almost instantly in response to whatever signal was brought to the cell. That was the big problem, or at least one of the big problems that faced the biologists in those days, and that is precisely the problem that we decided to investigate with my colleague, Ed Krebs. We wanted to know how the activity of an important enzyme, glycogen phosphorylase, was regulated. In fact, very important, because it was already known that it catalysed the rate limiting step of carbohydrate metabolism. That is the first step in the degradation of glycogen, to give blood glucose. By the way, this is the most important function of the liver and then ATP everywhere else, in every tissue. Phosphorylase was an exciting enzyme to work on because it was already known to be under complex hormonal regulation. In the resting state, it's almost inactive and very little glycogen breaks down. But the moment you are, maybe, hypoglycaemic, or you have a need to increase your level of ATP, it becomes instantly activated by the release of adrenaline. Adrenaline was known to be released under conditions that the physiologists, Cannon, said, That was in the 1920's when subjected in this stressful situation. In this situation, a stress signal is sent to the brain, and the brain immediately orders the adrenal to produce adrenaline, which is then distributed in all the organs of the animal. You all know here what happens when you have a shot of adrenaline or an adrenaline rush. Heart begins to beat, in fact, it beats like crazy, blood pressure goes up, respiration accelerates, but what you are not aware of is that if you have to fight or run away, you have to produce ATP in a hurry. By contrast, if the levels of glucose or ATP are high in a cell, for instance, after a big meal, then the activity of phosphorylase is inhibited by insulin, which at that time, by a totally unknown mechanism, was known to bring about a deposition of glucose in glycogen. That was before Luis Leloir from Argentina discovered the glycogen synthase pathway. Then, practically at the same time then, glucagon was discovered by Christian de Duve who was a... I have a picture of him taken on the island of Mainau. You can see Bettina, two, three years ago. Anyway, it was known that glucose homeostasis, the level of glucose in the blood, was regulated by the interplay of those various hormones, by the opposing action of those various hormones, so that phosphorylase obviously had to play a central role in this reaction. That's one of the reasons why we hit it. Here is a picture of Luis Leloir taken at a meeting in Mexico City. You see the pyramid in the back, I think in 1965. Next to this, a very good looking young man. Phosphorylase was discovered in the early 30's, mid 30's by Jakub Parnas in Poland and Carl and Gerty Cori in the United States. The enzyme, the muscle enzyme, was known to be totally inactive and have an absolute requirement of adenylic acid, AMP, for activity. Automatically, the Coris assume that AMP would serve as a coenzyme for that protein. That stood until 1943, when a gal in Cori's lab, Arda Green, crystallized the active form of phosphorylase but in a new species in that it was fully active without any AMP. The Coris assumed that this form must contain, they called it, Phosphorylase a, and assume it must contain AMP bound covalently to the protein as, what we call, a prosthetic group. They further assumed that this had to be the native form of the enzyme in muscle, because when muscle extracts were left standing, it was rapidly converted to the old form, which they now call phosphorylase B, the form that required AMP for activity. An absolutely logical hypothesis, but if it were correct, AMP would have to be produced in the reaction, and they found none. Furthermore, utilizing the most sensitive microbiological tests available at the time, they could find no AMP in the native enzyme. There, the Coris were stuck. They knew that phosphorylase existed in two forms, but they did not know in which way those two forms deferred. Strange as it would seem today, they actually dropped that problem. They tried to find differences. They found none. This is the problem that Ed and I decided to investigate. We started working on phosphorylase when we found ourselves in the same department of biochemistry at the University of Washington. Ed had been a post doc of the Coris, so he assumed, like they did, that AMP served as a subtype of coenzyme. By the way, here's a picture of Carl and Gerty Cori when they got their Nobel Prize in 1947. And a picture of Carl that I took while the two of us were hiking around Mount Rainier in the vicinity of Seattle. I said Ed assumed that AMP served as a coenzyme. I had carried out my PhD degree at the University of Geneva under Kurt Meyer, and among other things, we had isolated phosphorylase from potatoes, and there was no need for AMP. Even though biochemistry was in its infancy in those days, we knew enough to know that coenzymes were fully conserved. So, it was totally unlikely, for me, that it could serve as a coenzyme for muscle phosphorylase, but not for the potato enzyme, even though potatoes are pretty dumb compared to muscle. At first, Ed had some hesitations. The fact that I had been in the Coris' lab... Here, just about maybe only five years later, we might start working on phosphorylase. Yeah, at that time. At that time, post docs, when they left the lab, or students, when they left the lab, did not work on the problem of the mentor. What's going on in the lab. Then I got to thinking about it, that five years since I was in that laboratory. Certainly. That's okay. I thought it would be permissible if we worked together at that time. We clear the bench and started working, just the two of us side-by-side. Much more like two friends than like two colleagues in the department. Of course, the first thing we had was to prepare some pure crystalline Phosphorylase a utilizing Cori's procedure. Now, Cori's procedure consisted in taking some rabbit muscle, grinding it down, extracting it in water, and then putting all this gunk in cheese cloth. And then squeezing the cheesecloth to get the extract, and then trying to clarify the extract by passing it through a total battery of filter papers. It wasn't unusual for them, you know, the filter paper became clogged up right away, so they had a big glass rod and punched a hole, and went to the next filter, and next filter. It wasn't unusual for them to use maybe 12, 15, or 20 filter paper. The method was totally archaic, very cumbersome. Indeed, I'll show you a picture of our lab. Ed Krebs is here under the half. So, we decided, "Enough with that jazz." In Coris' defence, it should be said that in the mid 30's, there was no good lab centrifuge. So, we centrifuged our extract, but as fast as we work, as cleanly as we work, we could never obtain active Phosphorylase a as we should. Until, finally in desperation, we said, "This is idiotic. And to our immense surprise, this is what we found. That the very first extract from the muscle wasn't active Phosphorylase a as we had expected, but inactive so-called neurodegraded Phosphorylase b, and yet when that extract passed through the filtration process, it was converted to Phosphorylase a. Now, speaking of a disappointment, I can tell you, to put it mildly, two guys thinking that we will discover maybe a very sophisticated new chemical reaction, maybe a new factor, a new something. Paper filtration! To convert an enzyme was really below the pits, but it soon turned out that it was not the filtration that did it. It soon turned out that the conversion occurred because all the filter papers were contaminated by trace amounts of calcium ions. Enough were picked up in those multiple filtrations to do the trick. And then rapidly after that, we found out that ATP was also involved. This strongly suggested that we were dealing with a phosphorylation reaction. We didn't know what had become phosphorylase. Was it small molecule, a large? There was no ATP in those days. You had to synthesize the damn thing yourself, but we knew that Art Kornberg, who was in St. Louis, had made some ATP32 that he needed for his beautiful studies on the synthesis of DNA. So, we called Art right away, and he immediately sent us a sample of gamma-labelled ATP32 with which we could find out that the P32 was incorporate in a protein fraction. We could purify it, and it turned out to be phosphorylase. So, for the first time, we could propose that the conversion of inactive phosphorylase occurs like so: The inactive enzyme becomes phosphorylated and activated in a reaction that requires calcium, magnesium, ATP, and an enzyme which we call phosphorylase kinase. That was the first protein, kinase, and then the second reaction had to be catalysed by a protein phosphatase. We immediately sent the paper to the JBC. One of our very first experiences, the editorial board of the Journal of Biological Chemistry was very small. And I think there were five or six people in the country who reviewed all of the papers that were submitted to the Journal of Biological Chemistry. I do remember that when Ed and I sent in our first paper on phosphorylase, we were aware of the fact that we were... Carl Cori was one of the five or six editors of the Journal of Biological Chemistry. So, when we sent in our first paper on phosphorylase, we knew that he would see it, and we had faith, which was justified, that he would not take advantage. Oh, yeah. Of seeing that paper, and he didn't. He himself was very excited by our findings. Well, this reaction, that I just showed, by two-day standard, would be considered absolutely trivial. I mean very, very simple. When we came out with it, it came out as an enormous surprise because nobody could imagine that the phosphorylation of a protein could be involved in its regulation. One didn't know anything about phosphoproteins. Only two phosphoproteins had been identified. Casein from milk, Ovovitellin from egg yolk, and their only function was for the feeding of the young. Phosphoproteins, they had no biological activity, and therefore, they were dismissed as total non-entities. That was a very big surprise for everybody. The reaction that I just showed you, when we began to purify the elements of the system, it was clear that calcium could not act in that reaction. Only magnesium and ATP, and yet calcium was absolutely needed when crude muscle extracts was used. Crude muscle extracts, where you have a lot of phosphorylase, a lot of phosphorylase kinase, always magnesium and ATP coming from the muscle. No conversion occurred until you added calcium. The only possibility was that calcium had to act at an earlier step. We thought that maybe phosphorylase kinase, just like phosphorylase, might also exist in an inactive and active form. Perhaps, calcium is involved in that reaction, and that turned out to be correct. In the presence of calcium, phosphorylase kinase is rapidly phosphorylated, activated, and then there for the first time, you had a reaction of an enzyme acting on an enzyme to bring about glycogenolysis. At the same time that we were doing that, Earl Sutherland and Ted Rall had made their stunning discovery of cyclic AMP. Earl was a good friend of ours, saw him at every federation meeting, spoke of his work and of our work, did a lot of drinking, which finally did him in. Earl immediately sent us a sample of cyclic AMP with which we could show that its activity was directed towards this reaction. Either by accelerating the rate of auto phosphorylation, or perhaps even acting on yet another enzyme. Which, for want of a better term, we would call a kinase kinase. We always remembered the comments of one of the reviewers who looked at the paper. First of all, he did not believe that another enzyme is involved. He said, "When will it end?" But then he said, "If indeed another enzyme is involved, I would hope that the authors could find a better term than a kinase kinase." I don't know what he would have said if he had known a system like the map kinase pathway we have. Map K, map kk, map kkk, all acting successively on one another. Anyway, this hypothesis was confirmed four years later by the isolation of the cyclic AMP dependent protein kinase. Since at that time, Sutherland and his group had clarified the formation of cyclic AMP at the membrane. The entire... The entire cascade for the glycogenolysis reaction was established. Now, we were very interested, in fact, excited of this involvement of calcium here because the physiologists had known for many years that calcium released from a nerve impulse could trigger muscle contraction by acting on the thin filament. Our finding that precisely the same concentrations of calcium that trigger contraction could trigger glycolysis by acting on false kinase and phosphorylase, bringing about glycolysis to produce, finally, ATP. To show how two totally different fellow processes could be linked, could be synchronously regulated. We did not know in those days whether this phosphorylation reaction we had found was restricted to those two enzymes, or maybe a few other enzymes of carbohydrate metabolism. We wanted, for instance, of nitrogen metabolism. The enzyme will regulate by amidation, deamidation, fat metabolism, by acetylation, deacetylation. As you know, and as luck would have it, that was our luck, it turned out that protein phosphorylation was one of the most prevalent means of regulation of cellular processes being involved in the control of metabolism, transcription, translation, immune response, transformation, secretion, transport, cell cycle, et cetera. It's involved in a number of hereditary diseases or pathologies. Of course, diabetes, Alzheimer's, Parkinson's, and bacterial diseases such as cholera, the plague, viral diseases such as small pox. In fact, it would be very difficult to find today a physiological reaction that is not directly or indirectly affected by protein phosphorylation. Now, quantitatively, better than 99.9% of all phosphorylation reactions occur on serine and threonine. One of the most exciting developments in the field was the discovery by Tony Hunter at the Salk Institute nearly 40 years ago. He was working on the Rous sarcoma virus and polyoma middle-T antigen. You heard about that by Harold Varmus yesterday. He found that phosphorylation of protein on tyrosine residue was intimately implicated in oncogenicity, bringing about tyrosine kinases, tyrosine phosphatases, or tyrosine viral origin, cellular origin, all linked to growth factor receptor. As a matter of fact, the enormous virulence of yersinia pestis. This is the agent of bubonic plague, the black death that wiped out huge proportions of the human populations in centuries past is due to the fact that the bacterium injects, in the host cell, a tyrosine phosphatase. It brings about a catastrophic set of tyrosine dephosphorylation that totally wipes out the immune response of the cell. If you remove that phosphatase from the genome, the bacterium is harmless. Can you think that all this is due to a single enzyme. The bacterium has no necessity for it, plays no role, only to destroy the cell it attack. Anyway, this is more or less the end of this story. We were often asked with Ed Krebs if we realized that we were dealing with a very ubiquitous kind of reaction that was of fundamental importance. Absolutely not. We thought we knew it was an interesting reaction. We were very excited. We worked, we stayed with it, but we could never have guessed all the developments that occurred. Four or five years later, Jacques Monod, Jeffries Wyman, and Jean-Pierre Changeux came up with their allosteric model of enzyme regulation. It's very clear to me that Jacques Monod, he was a very good friend, here's a picture I took of him when he was visiting in Seattle. He didn't believe one minute that protein phosphorylation could play an important role in cellular regulation. Another question that we were often asked is, "How was it to work 50 years together?" I can tell you, it was very easy, very enjoyable. Ed, at first, would laugh at the way I spoke English because every morning, for instance, I would say, In French you say "prendre café" or "prendere un caffè" for the Italian, so I would say "take it." I say he would make fun of that. What he didn't realize that while my English didn't improve very much, his deteriorated completely. Well, all the time we spent, it were marvellous days. All the time we spent together, we never considered what we were doing as work. Really, it was never work for us. It was fun. Thank you for listening.

Ich werde Ihnen heute einen raschen Überblick, einen historischen Überblick, der Arbeit geben, die ich mit meine Kollegen und Freund, Edwin Krebs, zur Glykogen-Phosphorylase durchgeführt habe. Untersuchungen, bei denen unsere Ergebnisse reversible Protein-Phosphorylierung als einen Regelmechanismus fanden. Vor fünf Jahren starb Ed, ich habe hier also einige Videoaufnahmen von ihm, in denen er spricht, in denen wir uns beide an unsere frühen Arbeiten erinnern. Die Reaktion, die wir fanden, reversible Protein-Phosphorylierung, ist wirklich lächerlich einfach. Niemand hätte dem die geringste Beachtung geschenkt, wenn es sich nicht für zelluläre Prozesse als absolut erforderlich herausgestellt hätte. Andererseits, es muss auch gesagt werden, als wir damit an die Öffentlichkeit traten, war das eine große Überraschung. Damals wusste man so gut wie nichts über zelluläre Regulation oder Enzymregulation und Begriffe wie „Signalübertragung“, die Sie hier gewöhnlich verwenden, wären nicht verstanden worden. Damals wären sei bedeutungslos gewesen. Um dies in den richtigen Zusammenhang zu stellen, möchte ich Ihnen erzählen, wie die Dinge vor 60 Jahren, als wir auf diesem Gebiet zu forschen begannen, waren. Zuerst, Endokrinologie war bereits als Disziplin anerkannt, sie blieb auf rein phänomenologischem Niveau, weitgehend auf der Stufe unversehrter Tiere. Einige Faktoren, zirkulierende Faktoren, waren bekannt. Hormone, die eine Botschaft von einem Organ an ein anderes weitergeben und als Ergebnis eine Art physiologischer Reaktion haben. Insulin war als Bote gut bekannt, ausgesendet von der Bauchspeicheldrüse zur Regulierung des Kohlehydratstoffwechsels, Ebenso war Adrenalin als Bote der Nebennieren bekannt. Doch die Tätigkeiten dieser Hormone endeten an den Zellmembranen. Was danach geschah, war völlig unbekannt. Es war unvorstellbar, dass Hormone in einem zellfreien System agieren könnten, bis Earl Sutherland und sein Student, Ted Rall, mit einer erstaunlichen Entdeckung aufwarteten, dem zyklischen AMP, das als ein interzellulärer, als zweiter Bote, ein interzellulärer Faktor zur Wirkung von Adrenalin diente. Zweitens wurde Wissenschaft in einer völlig anderen Form als heute betrieben. Damals... nun eigentlich seit den Tagen von Claude Bernard, dem französischen Physiologen, der zuerst die glykogene Tätigkeit der Bauchspeicheldrüse beschrieb. Damals beobachtete man ein Phänomen und versuchte dann das darin involvierte Enzym zu finden. Heute wird weitgehend umgekehrt verfahren. Zuerst werden Enzyme entdeckt, durch das Abschließen von, ich weiß nicht wie vielen Genomsequenzierungsprojekten. Indem sie überexprimiert werden, indem sie an- und ausgeschaltet werden, versucht man ihre Funktion zu bestimmen. Um Luigi Pirandello zu paraphrasieren, wir sind bei unserer Suche von einem Enzym in sechs Funktionen zu hunderten von Enzymen auf der Suche nach einer Funktion angelangt. Schließlich, wie bereits gesagte, wusste man nichts darüber, wie Zellen reguliert werden. Damals dachte man, Enzyme würden durch die Rate, in der sie synthetisiert wurden, reguliert und dann abgebaut. Dies war noch bis Mitte der 40er, Ende der 40er, Anfang der 50er Jahre so, dann realisierte man, dass dies nicht der Fall sein könne. Das dies so nicht funktionieren kann. Zellen mussten Möglichkeiten haben, die Aktivität der Enzyme zu regulieren, sobald diese erzeugt und innerhalb der Zelle freigesetzt waren. Sie mussten die Fähigkeit haben, sich ihrer Umgebung anzupassen, um ihre Stoffwechsel- und physiologischen Bedürfnisse beinahe unmittelbar als Antwort auf welches Signal auch immer, das der Zelle vermittelt wurde, zu befriedigen. Das war das große Problem, oder zumindest eines der großen Probleme mit denen Biologen in jenen Tagen konfrontiert wurden, und es ist genau das Problem, das ich mit meinem Kollegen Ed Krebs untersuchen wollte. Wir wollten wissen, wie die Tätigkeit eines wichtigen Enzyms, des Glykogen-Phosphorylase, reguliert wurde. Das ist tatsächlich sehr wichtig, da man bereits wusste, dass es den limitierenden Schritt des Kohlehydratstoffwechsels beschleunigte. Dies ist der erste Schritt beim Abbau von Glykogen, um Blutzucker zu erhalten Übrigens ist dies die wichtigste Funktion der Leber und dann überall sonst ATP, in jedem Gewebe. Es war aufregend, mit dem Enzym Phosphorylase zu arbeiten, denn man wusste bereits, dass es sich unter komplexer hormonaler Regulierung befand. Im Ruhezustand ist es fast inaktiv und es wird sehr wenig Glykogen abgebaut. In dem Moment aber, wenn Sie vielleicht unterzuckert sind, oder sie einen Anstieg Ihres ATP-Niveaus brauchen, wird es sofort durch die Ausschüttung von Adrenalin aktiviert. Es war bekannt, Adrenalin wurde unter Bedingungen ausgeschüttet, von denen der Physiologe Cannon sagte: das war in den 1920ern, wenn man einer stressreichen Situation ausgesetzt ist. In dieser Situation wird ein Stresssignal ans Gehirn gesendet und das Gehirn befiehlt den Nebennieren umgehend, Adrenalin zu produzieren, das dann in alle Organe des Tieres verteilt wird. Sie alle wissen hier, was geschieht, wenn man eine Adrenalinspritze bekommt oder einen Adrenalinschub hat. Das Herz schlägt heftig, tatsächlich schlägt es wie verrückt, der Blutdruck steigt, die Atmung beschleunigt sich, doch was Ihnen nicht bewusst ist, wenn Sie kämpfen oder wegrennen müssen, muss in aller Eile ATP produziert werden. Im Gegensatz, ist der Blutzuckerspiegel oder ATP in einer Zelle hoch, beispielsweise nach einer üppigen Mahlzeit, wird die Aktivität der Phosphorylase durch das Insulin gehemmt, und damals war bekannt, dass, durch einen völlig unbekannten Mechanismus, eine Deponierung von Glukose in Glykogen herbeigeführt wurde. Das war ehe Luis Leloir aus Argentinien die Glykogen-Synthase entdeckte. Praktisch zur gleichen Zeit wurde von Christian de Duve Glucagon entdeckt, er war ein… Ich habe ein Bild von ihm, das auf der Insel Mainau aufgenommen wurde. Sie sehen Bettina, vor zwei, drei Jahren. Jedenfalls war bekannt, der Glukosehaushalt, der Spiegel von Glukose im Blut, wurde durch ein Zusammenspiel dieser verschiedenen Hormone reguliert, durch die Gegenaktion dieser verschiedenen Hormone, so dass Phosphorylase bei dieser Reaktion offensichtlich eine zentrale Rolle spielen musste. Das war einer der Gründe, warum wir uns darauf stürzten. Hier ein Bild von Luis Leloir, das bei einer Versammlung in Mexico City aufgenommen wurde. Sie sehen die Pyramide im Hintergrund, ich glaube das war 1965. Daneben ein sehr gut aussehender junger Mann. Phosphorylase war in den frühen 30er, Mitte der 30er Jahre von Jakub Parnas in Polen entdeckt worden und von Carl und Gerty Cori in den Vereinigten Staaten. Das Enzym, das Muskelenzym, war als völlig inaktiv bekannt und dass, damit es aktiv werde, unbedingt Laktazidogen, AMP, erforderlich war. Automatisch nahm Coris an, AMP würde als ein Coenzym für das Protein dienen. Das wurde bis 1943 so gesehen, bis ein Mitarbeiterin im Labor von Coris, Arda Green, die aktive Form der Phosphorylase kristallisierte, doch in einer neuen Spezies, in der es ohne AMP vollständig aktiv war. Die Coris nahmen an, diese Form müsse sogenannten Phosphorylase a enthalten, und vermuteten, es müsse AMP enthalten und kovalent an das Protein als eine prosthetische Gruppe gebunden sein. Sie nahmen weiter an, dies müsse die native Form des Enzyms im Muskel sein, denn wenn Muskelextrakte zurückgelassen werden, werden sie schnell in die alte Form umgewandelt, was sie dann Phosphorylase B nannten, die Form, die AMP zur Aktivität verlangt. Eine völlig logische Hypothese, aber sie stimmte nicht, denn AMP hätte in der Reaktion erzeugt werden müssen, sie fanden aber keines. Ferner, unter Verwendung der empfindlichsten mikrobiologischen Tests, die damals verfügbar waren, konnten sie im nativen Enzym kein AMP finden. Hier saßen die Coris fest. Sie wussten, Phosphorylase existierte in zwei Formen, wussten aber nicht, auf welche Weise die beiden Formen zeitlich verschoben waren. So seltsam dies heute erscheinen mag, sie schoben das Problem beiseite. Sie versuchten Unterschiede zu finden. Sie fanden keine. Dies war das Problem, das Ed und ich erforschen wollten. Wir begannen unsere Arbeit mit Phosphorylase, als wir im gleichen Fachbereich für Biochemie an der University of Washington zusammentrafen. Ed hatte einen Post-Doc bei den Coris gemacht, daher nahm er, so wie sie, an, AMP diene als Unterart eines Coenzyms. Übrigens, hier ist ein Bild von Carl und Gerty Cori, als sie 1947 den Nobelpreis erhielten. Und ein Bild von Carl, das ich aufgenommen habe, als wir um den Berg Rainier in der Nähe Seattles wanderten. Ich sagte, Ed nahm an, AMP wirke als ein Coenzym. Ich hatte an der Universität Genf promoviert, unter Kurt Meyer, und unter anderem hatten wir Phosphorylase aus Kartoffeln isoliert, und da war AMP nicht erforderlich. Auch wenn die Biochemie in jenen Tagen noch in den Kinderschuhen steckte, wussten wir, Coenzyme wurden vollständig konserviert. Für mich war es daher völlig unwahrscheinlich, dass es als Coenzym für die Muskel-Phosphorylase dienen könnte, doch für das Kartoffelenzym, auch wenn Kartoffeln verglichen mit Muskeln ziemlich doof sind. Zuerst zögerte Ed etwas. Die Tatsache, dass er im Labor der Coris gearbeitet hatte… Hier, ungefähr fünf Jahre später, wir haben vermutlich mit der Arbeit an Phosphorylase begonnen. Ja, um diese Zeit. Damals, wenn Post-Docs oder Studenten das Labor verließen, dann arbeiteten sie nicht an den Fragestellungen ihres Mentors. Sie fragten nicht: Was findet im Labor statt? Dann begann ich darüber nachzudenken, über diese fünf Jahre, seit ich in diesem Labor arbeitete. Sicher ist das in Ordnung. Ich dachte, es wäre zulässig, wenn wir zu dieser Zeit zusammenarbeiten würden. Wir räumten den Tisch auf und begannen zu arbeiten, nur wir beide, Seite an Seite. Viel mehr wie zwei Freunde als zwei Kollegen desselben Fachbereichs. Natürlich, als erstes mussten wir reines kristallines Phosphorylase a herstellen, unter Verwendung des Cori-Verfahrens. Das Cori-Verfahren bestand darin, einige Kaninchenmuskeln zu nehmen, sie zu zerreiben, in Wasser zu extrahieren und dann all dieses klebrige Zeug in ein Käsetuch zu geben. Dann das Käsetuch auszudrücken, um diesen Extrakt zu erhalten, dann zu versuchen den Extrakt zu klären, indem man ihn durch eine ganze Reihe von Filterpapier passieren ließ. Es war nicht ungewöhnlich, dass das Filterpapier sofort verstopfte, daher hatten sie einen großen Glasstab, stanzten ein Loch und gingen weiter zum nächsten Filter und dem nächsten Filter. Es war nichts Ungewöhnliches für sie etwa 12, 15 oder 20 Filterpapiere zu verwenden. Die Methode war vollkommen veraltet, sehr mühsam. Ich werde Ihnen ein Bild von unserem Labor zeigen. Ed Krebs ist hier unter der Hälfte. Wir entschieden: „Klassik hilft uns nicht.“ Zur Verteidigung der Coris sei gesagt, Mitte der 30er gab es keine guten Laborzentrifugen. Wir zentrifugierten also unseren Extrakt, doch so schnell und so sauber wir auch arbeiteten, wir konnten nie Phosphorylase a erhalten. Bis wir schließlich verzweifelt meinten: „Das ist idiotisch. Es ist verrückt, es funktioniert bei den Coris. Wir müssen zurück zum Cori-Verfahren und es exakt nachbauen.“ Und zu unserem unglaublichen Erstaunen fanden wir dies: Der allererste Extrakt aus dem Muskel war nicht, wie wir erwartet hatten, aktive Phosphorylase a, sondern inaktive, sogenannte neurodegraded Phosphorylase b, doch wenn dieser Extrakt einen Filtrierungsvorgang durchlief, wurde er in Phosphorylase a umgewandelt. Um von der Enttäuschung zu reden, ich kann Ihnen sagen, milde gesagt, da glauben zwei Typen, sie würden vielleicht eine sehr raffinierte neue chemische Reaktion entdecken, vielleicht einen neuen Faktor, ein neues Irgendwas. Papierfiltration! Ein Enzym umzuwandeln war wirklich unterstes Niveau, doch bald zeigte sich, dies wurde nicht durch die Filtration hervorgerufen. Die ganze Umwandlung fand deshalb statt, weil das Filterpapier durch Spuren von Kalzium-Ionen verunreinigt war. Wir erhielten in diesen vielfachen Filtrierungen genug davon, so dass es wirksam wurde. Und rasch danach entdeckten wir, dass auch ATP daran beteiligt war. Die lies stark vermuten, dass wir es mit einer Phosphorylierung zu tun hatten. Wir wussten nicht, was zur Phosphorylase geworden war. War es ein kleines Molekül, ein großes? In jenen Tagen gab es ATP nicht. Man musste das Ding selbst synthetisieren, wir wussten aber... Art Kornberg, der in St Louis war, hatte einige ATP32 gemacht, die er für seine schönen Untersuchungen zur Synthese der DNA benötigte. Also riefen wir umgehend Art an und er schickte uns gleich eine Probe von gamma-markiertem ATP32, mit dem wir herausfanden, dass das P32 in einer Proteinfraktion enthalten war. Wir konnten es reinigen und es entpuppte sich als Phosphorylase. Zum ersten Mal konnten wir also vorschlagen, dass die Umwandlung inaktiver Phosphorylase wie folgt stattfand: Das inaktive Enzym wird in einer Reaktion phosphoryliert und aktiviert, für die Kalzium, Magnesium, ATP und ein Enzym, das wir Phosphorylase-Kinase nannten, erforderlich sind. Das war das erste Protein, Kinase und dann die zweite Reaktion musste durch eine Protein-Phosphatase katalysiert werden. Wir schickten die Abhandlung umgehend an JBC. Eine unserer ersten Erfahrungen war: die Redaktionsleitung des Journal of Biological Chemistry bestand aus sehr wenigen Leuten. Ich denke da gab es fünf oder sechs Menschen im ganzen Land, die alle Abhandlungen, die beim Journal of Biological Chemistry eingereicht wurden, überprüften. Ich erinnere mich, als Ed und ich unsere erste Arbeit zur Phosphorylase abschickten, waren wir uns bewusst, dass wir… Carl Cori war einer der fünf oder sechs Lektoren des Journal of Biological Chemistry. Als wir unsere erste Abhandlung zur Phosphorylase abschickten wussten wir, er würde sie lesen, und wir vertrauten darauf, mit gutem Grund, dass er es nicht ausnutzen würde, Oh ja, wenn er diese Arbeit sah, und so war es auch. Er selbst war von unseren Entdeckungen sehr begeistert. Nun, diese Reaktion, die ich aufgezeigt habe, würde nach heutigem Standard als absolut trivial angesehen. Ich meine damit, als sehr, sehr einfach. Als wir aber damit an die Öffentlichkeit traten, war das eine enorme Überraschung, da niemand sich vorstellen konnte, dass die Phosphorylierung eines Proteins in diese Regulierung eingebunden sein könnte. Man wusste nichts über Phosphoproteine. Bislang waren nur zwei Phosphoproteine identifiziert worden. Casein von der Milch, Ovovitellin vom Eigelb, und ihre alleinige Funktion diente der Ernährung des Nachwuchses. Phosphoproteine hatten keine biologische Aktivität und waren daher als völlig unbedeutend beiseitegeschoben worden. Das war für jedermann eine sehr große Überraschung. Die Reaktion, die ich Ihnen gerade gezeigt habe, als wir damit begannen, die Elemente des Systems zu reinigen, war eindeutig; Kalzium konnte in dieser Reaktion nicht agieren. Nur Magnesium und ATP, und doch war Kalzium absolut notwendig, wenn Muskelextrakt im Rohzustand verwendet wurde. Muskelextrakte im Rohzustand, da hat man eine Menge Phosphorylase, eine Menge Phosphorylase-Kinase, immer Magnesium und ATP, die von den Muskeln stammen. Es fand solange keine Umwandlung statt, bis man Kalzium hinzugab. Die einzige Möglichkeit war, Kalzium musste bereits in einem früheren Schritt auftreten. Wir überlegten, ob vielleicht Phosphorylase- Kinase, so wie Phosphorylase, auch in einer inaktiven und aktiven Form vorhanden sein könnte. Vielleicht ist Kalzium in diese Reaktion involviert und es zeigte sich, dem war so. In Gegenwart von Kalzium wird Phosphorylase-Kinase rasch phosphoryliert, aktiviert und dann, zum ersten Mal, hatte man die Reaktion eines Enzyms, das auf ein Enzym einwirkte, um den Glykogenabbau zu veranlassen. Zur selben Zeit, während wir diese Arbeit leisteten, machten Earl Sutherland und Ted Rall ihre erstaunliche Entdeckung des zyklischen AMP. Earl war ein guter Freund, wir sahen ihn bei jeder Verbandskonferenz, sprachen über seine Arbeit und unsere Arbeit, tranken eine Menge, was ihn schließlich umbrachte. Earl schickte uns sofort eine Probe zyklischen AMPs, mit dem wir zeigen konnten, dass diese Aktivität gegen diese Reaktion gerichtet war. Entweder durch Beschleunigung der Rate der Auto-Phosphorylierung, oder vielleicht sogar durch das Einwirken auf ein weiteres Enzym. Was wir, wegen Mangels eines besseren Begriffs, eine Kinase-Kinase nannten. Wir erinnerten uns immer an die Kommentare eines der Reviewer, der sich die Arbeit anschaute. Zum einen, konnte er nicht glauben, ein anderes Enzym sei mit involviert. Er sagte: „Wann soll das enden?“ Dann sagte er aber: „Wenn wirklich ein anderes Enzym involviert ist, dann hoffe ich, die Autoren finden einen besseren Begriff als Kinase-Kinase.“ Ich weiß nicht, was er gesagt hätte, hätte er ein System wie den MAP-Kinase-Weg gekannt, den wir jetzt haben. Map K, Map kk, Map kkk, die alle nacheinander aufeinander einwirken. Jedenfalls wurde diese Hypothese vier Jahre später, durch Isolierung der vom zyklischen AMP abhängigen Protein-Kinase, bestätigt. Seit der Zeit hatten Sutherland und seine Gruppe die Bildung des zyklischen AMP auf der Membran geklärt. Die gesamte… Die gesamte Reaktionskaskade der Glykogenolyse wurde festgestellt. Wir waren jetzt sehr interessiert, ja begeistert von dieser Beteiligung des Kalziums, denn Physiologen wussten seit vielen Jahren, dass Kalzium, das über einen Nervenimpuls freigegeben wurde, Muskelkontraktionen auslösen konnte, indem es auf die dünnen Fasern einwirkte. Unsere Entdeckung war, genau die gleiche Konzentration Kalzium, die die Kontraktion auslöste, könnte die Glykolyse auslösen, indem es auf eine falsche Kinase und Phosphorylase einwirkte, und veranlasste Glykolyse herzustellen, schließlich ATP. Zu zeigen, dass zwei völlig verschiedene Verfahren verknüpft werden könnten, synchron reguliert werden könnten. Damals wussten wir nicht, ob diese Phosphorylierungsreaktion, die wir gefunden hatten, auf diese beiden Enzyme beschränkt war, oder auf ein paar weitere Enzyme des Kohlehydratstoffwechsels. Wir wollten, beispielsweise, den Stickstoffstoffwechsel. Das Enzym wird durch Amidierung, Deamidierung reguliert, Fettstoffwechsel durch Acetylierung, Deacetylierung. Wie Sie wissen war unser Glück, dass die Protein-Phosphorylierung eine der vorherrschenden Methoden zur Regulierung zellulärer Prozesse war, beteiligt an der Steuerung von Stoffwechsel, Transkription, Translation, Immunantwort, Umwandlung, Sekretion, Transport, Zellzyklus und so weiter. Sie ist an einer Anzahl von Erbkrankheiten oder Pathologien beteiligt. Natürlich Diabetes, Alzheimer, Parkinson und bakteriologische Krankheiten wie etwa Cholera, die Pest, virale Erkrankungen, etwas die Pocken. Es wäre tatsächlich ziemlich schwierig heute eine physiologische Reaktion zu finden, die nicht direkt oder indirekt von der Protein-Phosphorylierung betroffen ist. Quantitativ treten mindestens 99,9% aller Reaktionen von Phosphorylierung bei Serin und Threonin auf. Eine der spannendsten Entwicklungen auf diesem Gebiet war die Entdeckung Tony Hunters am Salk Institut, vor fast 40 Jahren. Er arbeitete am Rous-Sarkomavirus und Polyoma middle-T Antigen. Gestern haben Sie von Harold Varmus darüber gehört. Er fand, dass die Phosphorylierung von Protein an Tyrosinresten in enger Verbindung mit Onkogenität stand, Tyrosinkinasen hervorrief, Tyrosin-Phosphatasen, oder Tyrosin viralen Ursprungs, zellulären Ursprungs, alle verbunden mit dem Wachstumsfaktorrezeptor. Tatsächlich, die enorme Ansteckungskraft von Yersinia pestis. Dies ist der Erreger der Beulenpest, des schwarzen Todes, der riesige Anteile der Bevölkerung in vergangenen Jahrhunderten ausgelöscht hat, da das Bakterium in die Wirtszelle eine Tyrosin-Phospatase injiziert. Dies ruft eine katastrophale Reihe von Tyrosin-Dephosphorylierung hervor, welche die Immunantwort der Zelle vollkommen auslöscht. Wenn man die Phosphatase aus dem Genom entfernt, dann ist das Bakterium harmlos. Man kann glauben, dies wird durch ein einziges Enzym verursacht. Das Bakterium braucht es nicht, es spielt keine Rolle, nur um die Zelle, die es angreift, zu zerstören. Jedenfalls ist dies immer mehr oder weniger das Ende der Geschichte. Ed Krebs und ich wurden oft gefragt, ob es uns klar gewesen sei, das wir mit einer sehr ubiquitären Reaktion zu tun hatten, die von grundlegender Bedeutung ist. Absolut nicht. Wir wussten, es war eine interessante Reaktion. Wir waren sehr begeistert. Wir arbeiteten, wir blieben am Ball, wir hätten aber nie alle die eintretenden Entwicklungen vermuten können. Vier oder fünf Jahre später, dachten sich Jacques Monod, Jeffries Wyman und Jean-Pierre Changeux ihr allosterisches Modell der Enzymregulation aus. Es ist für mich sehr klar, dass mein guter Freund Jacques Monod, hier ein Bild von ihm, dass ich bei seinem Besuch in Seattle aufgenommen habe, nicht eine Minute daran glaubte, dass Protein-Phosphorylierung eine wichtige Rolle bei der Zellregulierung spielen könnte. Eine andere Frage, die oft gestellt wird ist: „Wie war das, 50 Jahre lang zusammenzuarbeiten?“ Ich kann Ihnen versichern, es war sehr unbeschwert, sehr erfreulich. Anfangs lachte Ed über mein Englisch, denn jeden Morgen, zum Beispiel, sagte ich: Auf Französisch sagt man "prendre café" oder "prendere un caffè" für die Italiener, und ich sagte „take it“. Er machte sich darüber lustig. Was er nicht realisierte war, während mein Englisch nicht sehr viel besser wurde, wurde seines immer schlechter. Nun, all die Zeit, die wir gemeinsam verbrachten, waren wunderbare Tage. All die Zeit, die wir gemeinsam verbrachten haben wir nie als Arbeit angesehen. Wirklich, es war niemals Arbeit für uns. Es war ein Vergnügen. Vielen Dank, dass Sie zugehört haben.

Edmond H. Fischer (2015)

The Origin of Reversible Protein Phosphorylation as a Regulatory Mechanism

Edmond H. Fischer (2015)

The Origin of Reversible Protein Phosphorylation as a Regulatory Mechanism

Abstract

Reversible protein phosphorylation can be considered one of the most prevalent mechanism by which eukaryotic cellular events are regulated. It is directly involved in numerous pathological conditions, and bacterial and viral diseases. This process was discovered sixty years ago in an attempt to elucidate the complex hormonal regulation of glycogen phosphorylase. While it is extremely simple, it came nevertheless as a complete surprise because essentially nothing was known at that time about the structure and regulation of enzymes. The study led to the establishment of the first hormonal cascade of successive enzymatic reactions, kinases acting on kinases, initiated by cAMP and discovered by Earl Sutherland. It also showed how two different physiological processes (carbohydrate metabolism and muscle contraction) could be regulated in concert.

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