Ferid Murad (2014) - Discovery of Nitric Oxide and Cyclic GMP in Cell Signaling and Their Role in Drug Development

The role of nitric oxide in cellular signaling in the past three decades has become one of the most rapidly growing areas in biology. Nitric oxide is a gas and a free radical with an unshared electron that can regulate an ever-growing list of biological processes

Thank you very much, it’s a pleasure to return to Lindau to see old friends and meet with the young people. It’s a lot of fun, it’s challenging but I enjoy it. I'm a clinical pharmacologist and I suspect most of you don’t know what a clinical pharmacologist is. Many of us train in medicine, we often have some training in some sub-specialities along the way, perhaps cardiology or endocrinology or other areas. But we also train in basic pharmacology or biochemistry or cell biology and other disciplines. I'm interested in cell communication and have been my entire career. I was one of the first in the MD-PhD students in the United States. And fortunately I worked with Earl Sutherland and Ted Rall and I joined their laboratory shortly after they discovered cyclic AMP. They discovered that interesting molecule in 1957. I joined them in ’58. And for about 10 years I focused my efforts on cyclic AMP systems and a variety of drugs and hormones that worked through this messenger. And then after about 10 years as I was finishing training on joining a faculty in Virginia I switched my interest to cyclic GMP. It was discovered in the mid-1960s. A couple of labs interested in cyclic AMP made the switch. I was one of them as I went to Virginia. And we thought perhaps this too would be a messenger. Now, the notion of cell communication on signalling is really an old concept. The first individual to suspect this or lead to its discovery as a concept was Beaumont, a physician in Michigan who had a patient with a gunshot wound to his abdomen from a hunting accident. And the patient developed a fistula, a channel, a communication from his stomach to the exterior. And Beaumont noticed that whenever his patient would see or smell, food he would enhance his gastric secretions through this fistula. Well, Pavlov in St. Petersburg Russia, a physiologist interested in gastro and intestinal physiology, learnt about this patient and developed his dog models. He made pouches and fistulas in dogs, repeated the observations that Beaumont made and he too found that when he showed his dogs food, they enhanced their gastric secretions. But then he did a very simple add-on experiment. Every time he showed them food he rang a bell. And he repeated process over and over and over again to the point that he had conditioned the animals as such that he no longer had to show them food to enhance gastric secretion into the pouches or fistulas but he just rang the bell. We call it conditioning. For that work, that simple experiment Pavlov got the Nobel Prize in Medicine in 1904, the fourth year it was awarded. Well, we’ve come a long way since then. We know today as you’ve heard from many of the previous speakers that many, many cells in our body talk to each other. I'm going to review that concept and tell you how it’s done. I’ll sort of progress rapidly through the past forty or fifty years of some of the detailed biochemistry. And then towards the end I’m going to tell you how it applies to clinical medicine and the discovery of drugs and treatment of some important diseases. The first slide. This cartoon represents three different cell types. They can be any cells in the body but I'm going to call cell type 1 a neuronal cell. It could be in the brain or it could be in a peripheral nerve. Cell type 2 I will call endothelial cell lying in your blood vessel like an inner tube in your tire. Very thin layer, one cell thick in all blood vessels, the arteries, veins, all over the place. It’s one of the largest organs in the body, the blood vessels. For miles and miles of these channels all over, for every tissue. And cell type 3 I will call a smooth muscle cell in the wall of that blood vessel. And its contraction and relaxation is going to control the diameter of that blood vessel and therefore the delivery of oxygen and nutrients as well as blood pressure. Cell type 1 is going to produce a substance that it will release into the interstitial space and blood stream. Earl Sutherland called them “first messengers”. Not very popular term actually. Today to lump them all we call them ligands and you’ve heard a lot of us refer to ligands in the last few days. If they are neuronal cells, we call these messengers neurotransmitters. If they are endocrine cells in cell type 1, we call them hormones. If they are inflammatory cells, we might call them cytokines or growth factors. They are given a variety of names and there are hundreds and hundreds of these molecules. They can be very simple amino acids. They can be peptides. They can be big proteins like the gonadotropins, they can be lipids such as the eicosanoids, the prostacyclins. So there are a variety of substances that are released into the blood stream from these cells. And they are going to roam throughout the body to find their target. Now very often these molecules, these ligands will complex with a protein carrier to protect them as they go along their way and prevent them from degradation. And prolong their half-lives. They identify their target by the presence of a protein in the cell membrane, which you’ve heard several speakers talk about. These proteins are in integral membrane proteins that we call receptors. And these ligands will only bind to the appropriate receptor. As you heard the analogy is a key interlock. It’s a three dimensional conformational fit. If the ligand doesn’t recognise the receptor, the receptor doesn’t recognise the ligand, the interaction doesn’t take place. But that’s where the specificity of communication takes place. The previous steps in the pathway are rather nonspecific. And the subsequent steps are relatively nonspecific as well. So most of the specificity comes from this interaction of the cell membrane between ligand and receptor. Now, most receptors are in the cell membrane but there are some that are inside the cell for hormones like the thyroid hormone. So are the steroids. But most often they are in the membrane. And the ligand doesn’t have to go inside of the cell to do its business. This interaction turns on a biochemical cascade that leads to the production often of an intracellular second messenger as Earl Sutherland would call them. The first such second messenger was cyclic AMP. Since then there have been other intracellular messengers, calcium, cyclic GMP, diacylglycerol, some of the peptides, the eicosanoids, and of course my favourite, nitric oxide. Nitric oxide is rather unique because it’s a very simple molecule. It’s a free radical with an unshared electron and therefore rather reactive. And it’s lipid soluble. So it can go wherever it wants. It’s uncharged. It can go into the mitochondria, the nucleus. It can come out of the cell and go back in again. Or it can go tweak a neighbouring cell or it can climb onto some carrier molecule in the interstitial space or blood stream. And go to a distance and come off again. It’s a hormone as well. There is no molecule that has all these possible functions in biology that I'm aware of. And I’ll tell you more about it. When nitric oxide and the other intercellular messengers are made, they have functions in the cell in which they are made. But nitric oxide can come out and go to the neighbouring cell, in this case cell type 3, a smooth muscle, influence the production of another messenger, cyclic guanosine monophosphates, cyclic GMP, that controls the kinase phosphorylase proteins to result in altered smooth muscle contraction. And I’ll tell you more about that story. I think nitric oxide is a very, very old molecule. In fact after hearing Christian de Duve talk here in Germany at a meeting that I went to at the space centre here, I thought perhaps nitric oxide was one of the earliest messengers in evolution. If you think for a moment, these organisms evolved perhaps in the crypts of the ocean near the boiling up magma with transition metals and gases and toxic substances. Somehow these organisms survived. And to survive they had to detoxify these horrible substances. But then they are clever enough to start using them to talk to each other. And maybe they became messengers for communication, phagocytosis, formation of multicellular organisms etc. I wish I could prove that hypothesis. It occurred maybe four billion years ago. But I can’t, I can’t design that experiment. Perhaps one of you students in the audience can figure that out, that’ll get you a ticket to Stockholm I think. Nitric oxide became important about fifty or sixty years ago when it was recognised that all the fossil fuels which possessed nitrogen in their structure when combusted with oxygen, generate a family of nitrogen oxides. NO, NO2, N2O, N2O3 etc. We call them NOX’s. These substances interact with the ozone layer as they enter the atmosphere. And they deplete ozone. And that’s very important because ozone is the ultraviolet filter that prevents the ultraviolet light from the sun causing global warming. So, the environmentalists consider nitric oxides pollutants, toxic horrible substances. And we came along in the mid- and late 1970s and said: Hold on a minute. We think they are important biologically. And we discovered that important drugs such as nitroglycerine, nitroprusside and many others are precursors or prodrugs that are converted to nitric oxide in the body. Nitric oxide, as you’ve heard earlier in the week, was discovered by Italian chemist about 1847. When chemists make compounds they often lick their fingers, stick it in the powder and taste it for some reason. And when they did they got vascular headaches like migraine. However it was explosive and Alfred Nobel picked up on it to make dynamite, made his fortune and that’s why we have the Foundation today or we wouldn't be here. But the physicians around Europe realised this was the potentially new vasodilator and in the late 1800s began to use it for angina pectoris, heart and chest pain. It was used for about a 100 years not knowing how it worked. So it’s possible that the discovered drugs without knowing the mechanism for 100 years we used it and then we came along and said: Wait, it’s really creating a toxic horrible substance that’s an important messenger, nitric oxide. And I’ll tell you more about that. And this field has exploded. That experiment that we first did with nitric oxide was in December 1976. We published our first paper in 1977. We followed up with several papers in various journals. Today 37 years later there are about 150,000 research papers on nitric oxide. There’s no way in the world for any of us to keep up with this. I count on my fellows to go to PubMed periodically or MEDLINE and tell me the important ones that relate to our interest of work. But if I read all the abstracts plus my emails, I wouldn't get anything else done, I'm sure. And this is a partial list on the right hand part of the slide of some of the effects of nitric oxide. And the list is much longer obviously. The first effects were relaxation of smooth muscle. Airways smooth muscle, GI smooth muscle and later we worked with vascular smooth muscle. And along came inhibition of platelet aggregation. And the list grew and grew and grew. And you can read that list. It influences inflammation and participates in all sorts of things, gene regulation, stem cell differentiation and proliferation etc. So let’s back up here. Some of us in the late ‘60s early ‘70s wanted to go looking for the enzyme that made cyclic GMP as a new potential second messenger. And this summarises the field for you a little bit. There is an enzyme we call it guanylyl 8 or guanylyl cyclase. I’ll slip sometimes and call it G-cyclase or A-cyclase because it’s lab jargon and we can talk to each other faster in the laboratory. But guanylyl cyclase like adenylate cyclase converts either ATP or GTP into corresponding cyclic nucleotide diphosphate, monophosphate, cyclic GMP. There are seven isoforms of guanylyl cyclase. Back in the early ‘70s when we started working on guanylyl cyclase we suspected multiple isoforms from some of our early experiments. And I’ll tell you a little bit more about that. The soluble isoform is a heterodimer with a heme-prosthetic group on histidine 105 with ferrous iron. Nitric oxide binds to that iron and heme, the heme lifts out of the pocket on the beta sub-unit of the heterodimer and results in the activation of the enzyme 200-400 fold. And it can do it at datable concentrations. There are six particular isoforms of guanylyl cyclase. We found later that they were receptors for other interesting molecules: the atriopeptins, the E-coli heat-stable enterotoxin and some new hormones that were being isolated from the gastrointestinal tract. So they too are receptor cyclases. They are functional as monodimers... homodimers, I’m sorry. They all make cyclic GMP. The guanylyl cyclases have a lot of homology with the adenylate cyclases. In fact when we activate the soluble guanylyl cyclase, we can get it to make some cyclic AMP. If you mutate one of the amino acids in the catalytic domain, you can switch the cyclase from one to the other, either making cyclic A or G. Sort of interesting. This suggests to me that they probably emerged from a single gene and diverged in evolution somehow. That’s another interesting story to pursue perhaps. Cyclic GMP can do several things after it’s made. It can regulate ion channels which you’ve heard a little bit about here, particularly potassium channels and maybe calcium channels. It can be inactivated by the hydrolysis with cyclic nucleotide phosphodiesterases. There are 11 isoforms of the phosphodiesterase family, different gene products. Some hydrolysed cyclic AMP, some hydrolysed cyclic GMP, some hydrolysed both. And they are very interesting targets. The isoforms that you all are aware of and you probably don’t know it is the type 5 phosphodiesterase which is the target for the drugs for erectile dysfunction. They inhibit that phosphodiesterase permitting the nerves in the corpus cavernosum of the penis which are nitrergic nerves releasing nitric oxide as the neurotransmitter that generates cyclic GMP. And when you block its degradation with these phosphodiesterase inhibitors, you get more cyclic GMP, more smooth muscle relaxation, more dilatation, more engorged with the blood and that’s the mechanism of erection. That concept actually came to me back in the ‘70s but I thought it was really sort of a low tech problem to pursue and I didn’t bother. I wish I had! I probably would have made a fortune with those drugs. But I chased the problem off in other directions, mostly cardiovascular areas. These phosphodiesterases cleave the three time phosphodiester bond to make a corresponding monophosphate, 5’-GMP or AMP. Cyclic AMP and GMP as you heard from Eddie Fischer the other day activate protein kinases. When I made this slide a couple of years ago, I thought there were about 150 or 200 isoforms of protein kinase. You just heard today there may be as many as 400 or 500 isoforms from the Genome Project. Some of these are serine-threonine kinases. They transfer the gamma-phosphate from ATP to a serine-threonine residue on the protein, such as cyclic AMP dependent protein kinase, cyclic G dependent protein kinase, calcium-calmodulin kinase or the phospholipid regulating kinase, we call it C kinase. But then there are other kinases that phosphorylate tyrosyl residues as Eddie told you. We call them tyrosine kinases. The serine-threonine kinases are coupled to intercellular messengers, whereas most of the tyrosine kinases are coupled to growth factors and cytokines and don’t have messenger molecules. Now, what we would all love with all of these protein kinases are very selective regulators and inhibitors. And you heard a little bit about that. It’s a tough project, because the catalytic domains are pretty similar and it’s hard to get drug specificity. But that’s what you want. And some successes have been made in the inhibition of some of these kinases have been interesting possible therapeutic agents for cancer and some other problems. So this is the pathway for cells to talk often to each other, it’s rather simple. The problem is with all of these isoforms you don’t know who’s in bed with whom. Who’s talking to whom? What's the messenger molecule? You could send your entire career sorting that out. It’s a lot of fun. And for me it’s exciting because all of these isoforms and the potential pathways and sequences are molecular targets that help us to discover and develop drugs. And that’s what I like to do. And while I’ve done a lot of clinical research in the past, I emphasise basic research to find things to take into the clinic. And I do that as well. But most of my effort is in the laboratory. So when I set out with cyclic GMP, I wanted to address two questions. How do these ligands that increase cyclic GMP and attack tissue -there were a couple of hormones- how do they work? If we understood how they coupled from their receptor to G-cyclase regulation, perhaps we could intervene in making that coupling more efficient or block it as potential therapeutic agents to treat various endocrine diseases. Most endocrine diseases are due to hormone excess or hormone deficiency and this I thought would be an important approach. Because cyclic GMP was there it was first found in urine in rabbits, after P32 labelling to find the organic phosphates in urine. We thought it must be important if it’s there but none of us had any clue as to what it did. So I would also like to find out some of its biological effects. So we started out by looking at the guanylyl cyclase activity in various tissue extracts. And as my training would convince me from my work with adenylate cyclases as a student, I looked at high speed supernatant fractions and pellets for activity and we were quite surprised to find activity both in high speed subs of the homogenates as well as the pellets. Not like adenylate cyclase at all which is always in the pellet because it’s in the membranes. I thought: My goodness, maybe we have different isoforms in different compartments of the cell making different pools of cyclic G perhaps with separate functions. What an interesting project this could be. Well, we began to characterise kinetically some of these activities, the soluble activity from heart, liver and other tissues which displayed typical malleous kinetics with regard to substrate. Linear single GTP on the catalytic side. The particulate however when we did double reciprocal plots with GPT as substrate were curvilinear implying cooperativity. Multiple nucleotide binding sites. There were other differences between the soluble and particulate activity. And we were quite convinced that we had different isoforms. However, you shouldn't interpret kinetic data from crude systems. Because there are competing pathways for substrate and competing pathways for your product that you are measuring. Lot of room for error and mistakes. We realised that to prove this we had to purify and clone these isoforms and we did but it took us about 7 or 8 years. And over that period we basically purified all 7 isoforms of guanylyl cyclase. A lot of work, a lot of postdocs. It took one postdoc 6 or 7 years to purify the particulate isoform for the first time. But I did a simple experiment. I said: Okay, if nuclear kinases and phosphatases are skewing up the kinetics, if phosphodiesterases are messing up the kinetics because of hydrolysis of product, let’s throw in inhibitors for the nuclear kinase, the phosphatases, the phosphodiesterases. And I went in the lab and made a cocktail of compounds that I thought might be inhibitors. Fluoride, azide, pyrophosphate, calcium, hydroxylamine, sodium nitrate, a mixture, methylxanthines. And surprisingly some of them activated the soluble isoform of the enzyme. Hormones wouldn't work after we disrupted the tissue making homogenates. We uncoupled the receptor from cyclase regulation. But now we had some very small molecules, azide, hydroxylamine and sodium nitrite that would work. And I said: Let’s figure out how they are doing it and maybe we will be clever enough to reconstitute a hormone effect in the laboratory. And that was the goal. Well, it turned out to be an interesting journey. And this is an experiment that provided some major clues for our direction. Since we were working with soluble extracts of homogenates, we found that liver could be activated by azides, 15 fold in this experiment. Heart cannot be activated by azide, cerebral cortex could not be activated by azide. But then I mixed liver with heart, the azide effect was blocked. The heart possessed an inhibitor. We purified the inhibitor, turned out to be haemoglobin and myoglobin. We mixed liver with cerebral cortex, the azide effect was enhanced. And that’s because azide was being converted to some activator by liver but now could activate the cyclase contributed by the liver as well as the cerebral cortex. The factor in liver that was responsible for that conversion was catalase. And some of the cytochromes would do it as well. We then began to put these substances on tissues, elevating cyclic GMP levels which they did and began to look at function -glycogenolysis, lipolysis, a variety of things. And fortunately, as serendipity would have it, we were working with smooth muscle. I knew as a student that cyclic AMP relaxed smooth muscle and I thought cyclic GMP would antagonise the effects of cyclic AMP and perhaps cause contraction. So we developed a tracheal smooth muscle system that was quite clean, about 80 or 90% smooth muscle. I learnt a long time ago you never want to do biochemistry in heterogeneous systems because you don’t know what cells are doing biochemistry and what cells are doing the physiology. So we had a clean smooth muscle prep, we put azide, hydroxylamine and sodium nitrate on the smooth muscles, cyclic GMP levels went up. But instead of contracting the muscles, it relaxed. Wow! This was different than I expected. And then I remembered as a resident taking care of patients in the intensive care unit with myocardial infarction. And what we wanted to do was lower their blood pressure. We decreased what we call after-load so the heart doesn’t have to work so hard against the blood pressure. So I said lets add nitroglycerine and nitroprusside which we use clinically to our preparations and see what it does. Well sure enough it activated cyclase, increased cyclic GMP in a variety of tissues. And at this point -this was the mid-1970s- we had a long list of compounds and coined the term nitrovasodilators for this growing list of compounds. It included hydroxylamine, nitrite, nitrate, azide, some other hydrazines, nitroglycerine, nitroprusside, nitrosamines and all the inorganic and organic nitrates that we’d use as vasodilators. A long list. And now it became a mystery story as to what the activator was going to be. Because there were such diverse compounds, they couldn't be interacting just with G cyclase, because there was some tissue specificity in the system, because these activators and inhibitors that we were isolating. And some of them required oxygen. Azide wouldn't work in an anaerobic environment. It had a time lag of a couple of minutes before the renal reaction became maximal. And we thought there has to be an intermediate. What is it? Well, the discovery that the haemoglobin was an inhibitor gave us the lead. We went to the literature and discovered that haemoglobin had a very high affinity for nitric oxide. We generated nitric oxide in the fume hood in early December of ’76. And it was a simple experiment. We mixed sodium nitrite, ferrous sulphate and sulphuric acid, stirred it and out came a gas that we delivered to our incubations and it activated all of our soluble guanylyl cyclase preparations. For the first time that eureka experiment told us that a free radical in gas could activate an enzyme. That concept had never been shown before and I got quite excited. I wanted to figure out how it was doing it. And now we had a tool, thus began to understand how to regulate cyclic GMP production in tissues. And that’s sort of summarised in this slide. This is what a nitrovasodilator will do to a rat aorta segment in the organ bath in the laboratory. If we pre-contract the muscle with phenylethylamine or some other agent, wait for a couple of minutes when this contraction is stable and add a nitrovasodilator in this case nitroprusside, within 10 or 20 seconds cyclic GMP levels begin to go up. They peak at about a minute, this is followed by relaxation of the tissue and the relaxation persists for a long period of time. I thought cyclic G was mediating the effect. Some people would look at this and say: No, it can’t be because look at the dissociation at late time points. Cyclic GMP is back to basal but the tissue is still relaxed. What's going on? Well in cell signalling pathways the half-lives of all these molecules is quite different. The first messengers, cyclic AMP and GMP and others, have very short half-lives. They peak and a minute or two and they are gone, whereas the activation of a kinase and the phosphorylation of the proteins downstream persist for long periods of time. That’s the explanation. So we published a review. It was a little controversial at the time. Some of my colleagues said: Murad, you are crazy, this can’t be important. Free radicals can’t activate enzymes. And I said: We figured out how nitroglycerine worked, now I'm going to show that it’s an intercellular messenger also. In pharmacology when you have an agent that does something of interest, you should ask yourself is it mimicking endogenous pathway. The opiates led to the search for an endogenous substance. And it was discovered, the encephalins. There are other examples in pharmacology. And I proposed, I said: The scheme proposed may prove to be the mechanism for the activation for this class of agent, the nitrovasodilator including nitroglycerine. But perhaps the effects of hormones in other agents, the increased cyclic GMP, might be attributable to altered redox and nitric oxide formation from endogenous precursors. I couldn't prove it because the nitric oxide concentration required was nanomolar and the methods to measure it were micromolar. We were a thousand fold off the mark. But we were right but it took us another 6 or 8 years or more to prove it. And in order to prove it we had to develop some new technology and assays that were sensitive enough to do the experiment. And we were able ultimately to assay nitric oxide production in tissue extracts, condition media and so forth and we used rat-1 fibroblast which had a big response to nitric oxide to make cyclic GMP. And the production of cyclic GMP in these fibroblasts was our assay for nitric oxide and it worked. Other laboratories came up with other methods, electrodes and chemiluminescence. There were several ways to do it. In 1980... I need to quit soon. I’m sorry. This is a summary of vasodilatation with agents that increase cyclic GMP production in blood vessels. On the left is the endothelium on the right is the smooth muscle. In red there are three classes of vasodilators that all increase cyclic GMP production. The nitrovasodilators are spontaneously converted to nitric oxide in the blood stream depending on Ph, oxygen tension etc. Some require enzymes to make the nitric oxide such as with nitric glycerine. It requires an enzyme to dehydrate the glycerol. The nitric oxide activates soluble cyclase to make cyclic GMP, which activates a kinase, the phosphorylator family of proteins. We labelled vascular segments with P32, did 2D gels and did Western Labs to identify some of the proteins and it turned out that myosin light chain was dephosphorylated while many other proteins were phosphorylated. So what happens is you make NO, you make cyclic G, you activate a kinase, you phosphorylate about a dozen proteins. Some of which regulates salicylic calcium from the outside or redistribution from the inside. And this then regulates the activity of myosin light chain kinase which is a calcium calmodulin dependent protein kinase. And you dephosphorylate myosin. And when you dephosphorylate myosin the active myosin fillers will slide apart. You phosphorylate the myosin they slide back together and latch and you have contraction. The endothelium dependent vasodilators that first got discovered in 1980 and I gave a seminar in Virginia while I was there, agents like acetylcholine, histidine and thrombin work because the receptors are on the endothelium not on the smooth muscle. And they increased calcium to activate an enzyme that converts the amino acid arginine in the endothelium derived relaxing factor. And I suggested to Furchgott it might be in nitric oxide enactor product. And it was. That was proven later. This moves over to smooth muscle, to do the same thing that the various ... [inaudible 00:35:18] do. This is important because when patients -I'm going to tell you later- have atherosclerosis, hypertension, diabetes their blood vessels don’t make enough nitric oxide. They have dysfunction of the endothelium, we call it endothelial dysfunction. And therefore when you treat these patients, you want to treat them with direct acting agents to work on the smooth muscle because the endothelium is defective. And these endothelium dependent vasodilators won’t work. A third class are the atriopeptins. When Pallotti was looking at the organisation of the cell he noticed that cardiac atria had granules. When you have granules in cells it’s usually indicative of stored hormones, peptide hormones like in chromophore tissue. This attracted the attention of de Bold in Canada who isolated the peptides, sequenced them and he called the first one atrial natriuretic factor. Today we have a group of these peptides called atrial peptins, AMP, BMP, CMP. And we learnt that some of the particulate guanylyl cyclases are activated by these atrial peptins and they are the receptors for the atrial peptins. And they make cyclic GMP that causes relaxation. Now there are other ways to relax smooth muscle and blood vessels: agents that lower calcium, agents that inhibit phosphodiesterases, either cyclic A or G diesterase. A variety of ways to get there, but this is the way to do it through cyclic GMP. And I believe in many blood vessels the cyclic GMP pathway is perhaps more important than the cyclic AMP pathway because of vasodilation. But that remains to be seen. I'm going to skip a couple of lab workers. There are three isoforms of the enzyme that make nitric oxide from arginine. This is the reaction. They oxidise the guanidine on nitrogen to an intermediate hydroxy-arginine which is further oxidised to citrulline and nitric oxide. The enzyme requires a complicated array of co-factors. The enzyme is only active as a whole dimer. It has a heme-prosthetic group. It is regulated by calcium, calmodulin, FMN, FAD. It uses oxygen and any Ph besides arginine. And a very important cofactor is tetrahydrobiopterin. If you oxidise the tetrahydrobiopterin to dihydro you uncouple the enzyme, it no longer makes nitric oxide. But instead it makes superoxide amine which is devastating because that’s the scavenger for nitric oxide in many tissues. So if nitric oxide is not operating properly and I’ll show you some diseases where it’s not, you don’t make enough nitric oxide or what you do make is disappearing because it forms a very reactive complex which is very toxic. That now explains ways we started thinking about some of these diseases. Let me put the pathway together for you and I’ll hopefully finish in a couple of minutes. Hormones and ligands interact with appropriate receptors to vary the intercellular cofactors to make nitric oxide from the nitric oxide synthase. They interact with the cyclase, make cyclic G, the cyclic G regulates the kinase to phosphorylate various proteins. Each of these molecular steps, enzymes are possible targets to go discover drugs. That’s what I do. And we’ve discovered lots of drugs. Now, the pathways are always more complicated when you spend some more time while nitric oxide prefers to activate guanylyl cyclase. That’s what it wants to do. It can go off in other directions. It could be converted to nitrite or nitrate. It can interact with other transition metals besides iron. It can form complexes with thiol groups and proteins. There are hundreds of proteins to get nitrosylated. And it can also interact with superoxide amine. So whenever you have inflammation, you induce the production of superoxide from NADPH oxidase, other pathways and you induce the production of NOS2 because those pro-inflammatory cytokines through NF-Kappa-B regulate the transcription and translation of nitric oxide synthase. So you can make a lot of NO. So when you have NO and superoxide together, instantaneously they are converted to peroxynitrite. Very rapid reaction. Very reactive. And peroxynitrite, well nitrate and all sorts of active molecules, DNA, RNA, lipids, proteins, all sorts of things. And it puts the nitrate on the tyrosine in proteins, adjacent to the hydroxyl group and sterically interferes with tyrosine kinase pathways. So the NO pathway can also talk to the tyrosine kinase pathways. Isn’t that interesting? And if we can reverse that process we could come up with new anti-inflammatories that are not cyclooxygenases inhibitors or steroids. That would be an important contribution. We think there is such an enzyme that does that but it’s been a tough one to go find and purify. It really has been very difficult. We’ve worked at it for a few years. I'm going to make a quick... Last slide I promise! Endothelial dysfunction in patients with hypertension, diabetes, arthrosclerosis and probably tobacco use and obesity have blood vessels that do not make enough nitric oxide for a variety of reasons. I won’t go through the list of reasons but by knowing this we can come along now and try to reverse the defects in these diseases with nutritional supplements, with antioxidants and a variety of other ways to start treating these problems. And that’s something else that I do. I made my David Letterman series here, these are my last slides. A list of the possible uses clinically of the effects of nitric oxide and cyclic GMP. And it’s a long list. It’s a short list based on a 150,000 papers. We can talk about those this afternoon. I want to thank you for your attention.

Vielen Dank. Es ist jedes Mal eine Freude, nach Lindau zu kommen und hier alte Bekannte wieder zu treffen und junge Menschen kennenzulernen. Es macht Spaß und es ist herausfordernd, aber ich mag es. Ich bin klinischer Pharmakologe und wahrscheinlich wissen die meisten von Ihnen gar nicht, was ein klinischer Pharmakologe ist. Viele von uns haben Medizin studiert und oft zusätzliche Ausbildungen in bestimmten Spezialbereichen, wie Kardiologie oder Endokrinologie oder in anderen Bereichen, angeschlossen. Aber wir sind auch in grundlegender Pharmakologie oder Biochemie oder Zellbiologie und anderen Disziplinen ausgebildet. Ich interessiere mich für die Zellkommunikation und das gilt für meine gesamte berufliche Laufbahn. Ich war einer der ersten MD-PhD Studenten in den Vereinigten Staaten und hatte das Glück, mit Earl Sutherland und Ted Rall in ihrem Labor zusammenzuarbeiten, kurz nachdem sie zyklisches AMP entdeckt hatten. Dieses interessante Molekül entdeckten sie 1957. Ich kam 1958 dazu. Und rund zehn Jahre lang habe ich mich intensiv mit zyklischen AMP-Systemen und einer Vielzahl von Arzneimitteln und Hormonen beschäftigt, die über diesen Botenstoff wirken. Und als ich dann nach rund zehn Jahren mit der Ausbildung fertig war und zu einer Hochschule in Virginia wechselte, begann ich mich für zyklisches GMP zu interessieren. Das wurde Mitte der 1960er Jahre entdeckt. Einige der Labors, die sich mit zyklischer AMP beschäftigt hatten, vollzogen damals diesen Wechsel. Und ich war einer von ihnen, als ich nach Virginia ging. Und wir dachten, dass es sich dabei vielleicht auch um einen Botenstoff handeln würde. Die Vorstellungen zur Bedeutung der Zellkommunikation für Signalübertragungsprozesse sind ein relativ altes Konzept. Der erste Mensch, der dies vermutet hat oder zu dieser Entdeckung als Konzept beigetragen hat, war Beaumont, ein Arzt in Michigan, der einen Patienten mit einer Schusswunde im Bauch nach einem Jagdunfall behandelte. Dieser Patient entwickelte eine Fistel, einen Kanal, eine Kommunikation von seinem Magen nach außen. Und Beaumont beobachtete, dass bei diesem Patienten, wann immer er Nahrungsmittel sah oder roch, die Darmsekretionen über diese Fistel angeregt wurden. Pawlow, ein Physiologe aus St. Petersburg, Russland, der sich mit gastrointestinaler Physiologie beschäftigte, erfuhr von diesem Patienten und konzipierte seine Studien an Hunden. Er legte bei den Hunden Beutel und Fisteln an, wiederholte die Beobachtungen von Beaumont und fand ebenfalls heraus, dass diese Hunde, sobald er ihnen etwas Fressbares zeigte, ihre gastritische Sekretion verstärkten. Aber dann führte er noch ein sehr einfaches, zusätzliches Experiment durch. Jedes Mal, wenn er ihnen Futter zeigte, ließ er eine Glocke ertönen. Er wiederholte diesen Prozess immer wieder, bis er die Tiere so konditioniert hatte, dass er ihnen zur Anregung der gastritischen Sekretion in die angelegten Beutel oder Fisteln kein Fressen mehr präsentieren musste, sondern nur noch die Glocke betätigte. Wir bezeichnen das als Konditionierung. Für diese Arbeit, dieses einfache Experiment erhielt Pawlow 1904 den ersten Nobelpreis für Medizin, es war das vierte Jahr der Nobelpreisverleihungen. Seitdem ist viel Zeit vergangen. Heute wissen wir, wie Sie von vielen der vorherigen Redner gehört haben, dass sehr viele Zellen in unserem Körper miteinander kommunizieren. In meinem Vortrag geht es um das Konzept und ich werde Ihnen erzählen, wie das funktioniert. Ich bewege mich dabei in einem Schnelldurchgang durch die letzten 40 oder 50 Jahre detaillierter Biochemie. Und dann zum Ende hin werde ich Ihnen erzählen, wie sich die Erkenntnisse in der klinischen Medizin und in der Entdeckung von Arzneimitteln und Behandlungsmethoden für einige bedeutende Krankheiten anwenden lassen. Die erste Folie. Auf dieser Zeichnung sehen Sie drei verschiedene Zelltypen. Das können irgendwelche Zellen im Körper sein, aber ich nenne den Zelltyp Nummer 1 eine Nervenzelle. Das könnte eine Zelle im Gehirn sein oder ein peripherer Nerv. Zelltyp 2 nenne ich Endothelzelle. Sie liegt in unserem Blutgefäß wie ein Schlauch im Innern eines Reifens. Sehr dünne Schicht, eine Zelle stark, in allen Blutgefäßen, den Arterien, Venen, überall. Das ist eines der größten Organe im Körper, die Blutgefäße. Kilometerlange Kanäle, für jedes Gewebe. Und Zelltyp 3 nenne ich eine glatte Muskelzelle in der Wand dieses Blutgefäßes. Und ihre Kontraktion und Relaxation steuert den Durchmesser dieses Blutgefäßes und deshalb die Abgabe von Sauerstoff und Nährstoffen sowie den Blutdruck. Zelltyp 1 produziert eine Substanz, die in den interstitiellen Raum und den Blutstrom freigesetzt wird. Earl Sutherland bezeichnete sie als „erste Boten“. Nicht wirklich ein sehr beliebter Begriff. Heute werden sie alle pauschal als Liganden bezeichnet. Sie haben viele der Vortragenden in den letzten Tagen über Liganden reden hören. Wenn es Nervenzellen sind, bezeichnen wir diese Boten als Neurotransmitter. Wenn es sich um endokrine Zellen des Zelltyps 1 handelt, nennen wir sie Hormone. Wenn es sich um Entzündungszellen handelt, nennen wir sie Zytokine oder Wachstumsfaktoren. Sie haben eine Vielzahl unterschiedlicher Bezeichnungen und es gibt Hunderte solcher Moleküle. Dabei kann es sich um sehr einfache Aminosäuren handeln. Es können Peptide sein. Es können große Proteine wie Gonadotropine sein, es können Lipide wie Eicosanoide oder Prostacycline sein. Es gibt also eine Vielzahl von Stoffen, die aus diesen Zellen in den Blutstrom abgegeben werden. Und sie wandern auf der Suche nach ihrem Ziel durch den Körper. Diese Moleküle, diese Liganden schließen sich sehr oft mit einem Protein zu einem Komplex zusammen, der sie auf ihrem Weg schützen, ihre Zersetzung verhindern und ihre Halbwertzeiten verlängern soll. Ihr Ziel identifizieren sie durch die Existenz eines Proteins in der Zellmembran, über das schon mehrere Redner gesprochen haben. Diese Proteine sind integrale Membranproteine, die wir Rezeptoren nennen. Und diese Liganden binden nur an den geeigneten Rezeptor. Wie Sie gehört haben, ist die Tastensperre ein analoges Bild dafür. Es handelt sich um eine dreidimensionale Konformationsanpassung. Wenn der Ligand den Rezeptor nicht erkennt, der Rezeptor den Liganden nicht erkennt, erfolgt keine Interaktion. Aber genau hier liegt die Spezifität der Kommunikation. Die früheren Schritte im Signalweg sind relativ unspezifisch. Und die späteren Schritte sind ebenfalls relativ unspezifisch. Der Großteil der Spezifität hängt also mit dieser Wechselwirkung der Zellmembran zwischen Ligand und Rezeptor zusammen. Die meisten Rezeptoren befinden sich in der Zellmembran, aber einige, etwa Hormone wie die Thyroidhormone, befinden sich innerhalb der Zelle. Das gilt auch für die Steroide. Aber meistens befinden sie sich in der Membran. Und der Ligand muss nicht in die Zelle gelangen, um seine Funktion zu erfüllen. Diese Interaktion setzt eine biochemische Kaskade in Kraft, die oft zur Produktion eines intrazellulären sekundären Botenstoffs führt, wie Earl Sutherland ihn bezeichnen würde. Der erste derartige Botenstoff war zyklisches AMP. Seitdem gab es weitere interzelluläre Botenstoffe, Calcium, zyklisches GMP, Diacyglycerol, einige Peptide, Eicosanoide und natürlich mein Favorit, Stickstoffmonoxid. Stickstoffmonoxid ist ziemlich einzigartig, weil es sich dabei um ein sehr einfaches Molekül handelt. Es ist ein freies Radikal mit einem einsamen Elektron und deshalb ziemlich reaktiv. Und es ist lipidlöslich. Es kann sich also bewegen, wohin es will. Es ist ungeladen. Es kann in Mitochondrien eindringen, den Kern. Es kann aus der Zelle austreten und wieder dahin zurückkehren. Oder es kann Einfluss auf eine Nachbarzelle nehmen oder sich auf einem Trägermolekül in den interstitiellen Raum oder den Blutstrom einschleusen und sich zu einem entfernten Ziel begeben und wieder zurückkommen. Es ist auch ein Hormon. Es gibt in der Biologie, soweit mir bekannt ist, kein anderes Molekül, das all diese möglichen Funktionen hat. Und darüber möchte ich Ihnen noch mehr erzählen. Wenn Stickstoffmonoxid und die anderen interzellulären Botenstoffe hergestellt werden, übernehmen sie Funktionen in der Zelle, in der sie erzeugt wurden. Stickstoffmonoxid kann aber austreten und zu einer Nachbarzelle wandern, in diesem Fall Zelltyp 3, glattes Muskelgewebe, die Herstellung eines anderen Botenstoffes beeinflussen, zyklische Guanosin-Monophosphate, zyklisches GMP, das die Kinase-Phosphorylase-Proteine steuert, was zu einer veränderten Kontraktion von glatter Muskulatur führt. Darüber möchte ich Ihnen noch mehr erzählen. Ich glaube, dass Stickstoffmonoxid ein sehr, sehr altes Molekül ist. Als ich Christian de Duve hier in Deutschland bei einer Konferenz im Raumfahrtzentrum sprechen hörte, dachte ich in der Tat, dass Stickstoffmonoxid vielleicht einer der frühesten Botenstoffe in der Evolution ist. Wenn man darüber nachdenkt, könnten sich diese Organismen vielleicht in den Gruften des Ozeans neben dem aufkochenden Magma mit Übergangsmetallen, Gasen und toxischen Substanzen entwickelt haben. Und irgendwie haben diese Organismen überlebt. Und um zu überleben, mussten sie diese schrecklichen Substanzen entgiften. Aber dann sind sie auch clever genug, sie für die Kommunikation untereinander zu nutzen. Und vielleicht wurden sie die Boten der Kommunikation, Phagozytose, ich wünschte, ich könnte diese Hypothese beweisen. Vielleicht passierte das vor über vier Milliarden Jahren. Aber ich kann, ich kann dieses Experiment einfach nicht entwickeln. Vielleicht wird es einem von Ihnen, den Studenten hier im Publikum, gelingen. Dann würde Ihnen sicherlich der Fahrschein nach Stockholm winken, denke ich. Stickstoffmonoxid gewann vor 50 oder 60 Jahren an Bedeutung, als man herausfand, dass alle fossilen Brennstoffe, die in ihrer Struktur Stickstoff enthielten, bei Verbrennung mit Sauerstoff eine Familie von Stickstoffmonoxiden erzeugen. NO, NO2, N2O, N2O3 und so weiter. Wir nennen sie NOXe. Diese Substanzen interagieren beim Eintritt in die Atmosphäre mit der Ozonschicht. Und sie bauen Ozon ab. Und das ist ziemlich wichtig, weil Ozon als UV-Filter verhindert, dass die ultraviolette Strahlung aus der Sonne globale Erwärmung verursacht. Umweltschützer halten Stickstoffmonoxide also für Schadstoffe, schreckliche Giftstoffe. Und dann kamen wir Mitte und Ende der 1970er Jahre und sagten: Moment mal. Wir denken, dass sie biologisch wichtig sind. Und wir entdeckten, dass wichtige Wirkstoffe wie Nitroglycerin, Nitroprussid und viele andere Vorläufer oder Prodrugs sind, die im Körper in Stickstoffmonoxid verwandelt werden. Wie Sie bereits in dieser Woche gehört haben, wurde Stickstoffmonoxid ungefähr 1847 von einem italienischen Chemiker entdeckt. Wenn Chemiker Verbindungen herstellen, befeuchten sie des Öfteren ihre Finger, tauchen sie in das Pulver und schmecken es aus bestimmten Gründen. Und als sie das in diesem Fall machten, bekamen sie vaskuläre, migräneartige Kopfschmerzen. Allerdings war der Stoff auch explosiv. Das hat Alfred Nobel aufgegriffen, um Dynamit herzustellen und damit glücklich zu werden. Das ist der Grund, warum wir heute die Nobelstiftung haben. Sonst wären wir nicht hier. Aber die Ärzte in Europa erkannten, dass das ein potenziell neuer Vasodilator war. Und so begannen sie Ende des 19. Jahrhunderts, es bei Angina pectoris, Herz- und Brustschmerzen einzusetzen. Es wurde mehr als 100 Jahre eingesetzt, ohne zu wissen, wie es funktioniert. So war es also möglich, dass die entdeckten Arzneimittel, ohne den Wirkmechanismus zu begreifen, 100 Jahre lang eingesetzt wurden. Und dann kamen wir und sagten: Moment mal, es erzeugt in Wirklichkeit eine schreckliche Giftsubstanz, die ein bedeutender Botenstoff ist, Stickstoffmonoxid. Und darüber möchte ich Ihnen noch mehr erzählen. Dieser Bereich hat sich dann explosionsartig entwickelt. Unser erstes Experiment mit Stickstoffmonoxid haben wir im Dezember 1976 durchgeführt. Unseren ersten Artikel dazu haben wir 1977 veröffentlicht. Danach haben wir weitere Artikel in verschiedenen Fachjournalen veröffentlicht. Heute, 37 Jahre später, gibt es rund 150.000 Forschungsartikel über Stickstoffmonoxid. Und es ist keinem von uns möglich, da auf dem Laufenden zu bleiben. Ich setze auf meine Kollegen, die regelmäßig PubMed oder MEDLINE konsultieren und mir über die wichtigsten Entwicklungen berichten, die mit unserem Arbeitsbereich zu tun haben. Würde ich all die Abstracts plus meine E-Mails lesen, käme ich zu nichts anderem mehr. Da bin ich sicher. Hier sehen Sie rechts auf der Folie eine unvollständige Liste der Wirkungen von Stickstoffmonoxid. Die Liste ist natürlich noch wesentlich länger. Die ersten Wirkungen waren die Relaxation des glatten Muskels, die glatten Muskelgewebe der Atemwege, die glatten Muskelgewebe des Gastrointestinaltraktes und später erforschten wir glatte Gefäßmuskulatur. Und dazu kam die Hemmung der Blutplättchenaggregation. Die Liste wuchs ständig weiter. Und Sie können die Liste hier lesen. Es wirkt auf Entzündungsprozesse ein und ist an allen möglichen Vorgängen beteiligt, Genregulation, Stammzelldifferenzierung, Proliferation und ähnliches. Aber fassen wir zusammen: Einige von uns wollten Ende der 60er, Anfang der 70er Jahre das Enzym aufklären, das zyklisches GMP als neuen potenziellen Botenstoff erzeugte. Und hier ist das gesamte Gebiet in einer Übersicht zu sehen. Es gibt ein Enzym, das wir als Guanylyl 8 oder Guanylyl-Zyklase bezeichnen. Ich werde das zum Teil auch als G-Zyklase oder A-Zyklase bezeichnen, weil das der übliche Sprachjargon im Labor ist und wir miteinander so im Labor schneller reden können. Aber Guanylyl-Zyklase setzt wie Adenylat-Zyklase ATP oder GTP in entsprechendes zyklisches Nukleotid-Diphosphat, Monophosphat, zyklisches GMP um. Es gibt sieben Isoformen der Guanylyl-Zyklase. Als wir Anfang der 70er Jahre anfingen, uns mit der Guanylyl-Zyklase zu beschäftigen, vermuteten wir als Ergebnis einiger unserer frühen Experimente multiple Isoformen. Und darüber möchte ich Ihnen einiges mehr erzählen. Die lösliche Isoform ist ein Heterodimer mit einer häm-prosthetischen Gruppe auf Histidin 105 mit Eisen. Stickstoffmonoxid bindet an dieses Eisen und Häm, das Häm hebt sich aus der Tasche auf der Beta-Untereinheit des Heterodimers heraus, was in einer 200 bis 400-fachen Aktivierung des Enzyms resultiert. Und dazu ist es bei datierbaren Konzentrationen in der Lage. Es gibt sechs spezielle Isoformen der Guanylyl-Zyklase. Später fanden wir heraus, dass sie Rezeptoren für andere interessante Moleküle sind, die Atriopeptine, das hitzestabile E-Coli-Enterotoxin und einige neue Hormone, die aus dem gastrointestinalen Trakt isoliert wurden. Das sind also auch Rezeptor-Zyklasen. Sie funktionieren als Monodimere … Homodimere, Entschuldigung. Sie alle erzeugen zyklisches GMP. Die Guanylyl-Zyklasen haben große Ähnlichkeiten mit den Adenylat-Zyklasen. Wenn wir die lösliche Guanylyl-Zyklase aktivieren, können wir sie dazu bringen, zyklisches AMP zu erzeugen. Wenn man eine der Aminosäuren in der katalytischen Domäne mutiert, kann man zwischen den Zyklasen wechseln, also entweder zyklisches A oder zyklisches G herstellen. Das ist interessant. Das sagt mir, dass sie wahrscheinlich aus einem einzigen Gen hervorgegangen sind und sich entwicklungsgeschichtlich irgendwie getrennt haben. Das ist vielleicht ein weiteres Thema, dass interessant sein könnte. Zyklisches GMP kann mehrere Dinge bewirken, nachdem es hergestellt wurde. Es kann Ionenkanäle regulieren, worüber Sie hier ein wenig gehört haben, insbesondere Kaliumkanäle und möglicherweise Calciumkanäle. Es kann durch die Hydrolyse mit zyklischen Nukleotid-Phosphodiesterasen inaktiviert werden. Es gibt elf Isoformen der Phosphodiesterasefamilie, unterschiedliche Genprodukte. Einige haben zyklisches AMP hydrolysiert, einige zyklisches GMP hydrolysiert, einige haben beides hydrolysiert. Und das sind sehr interessante Target-Strukturen, die Isoformen, die Sie alle kennen. Wahrscheinlich wissen Sie aber nicht, dass die Typ-5-Phosphodiesterase die Targetstruktur für Wirkstoffe gegen die erektile Dysfunktion ist. Sie hemmt diese Phosphodiesterase. Dadurch können die Nerven im Schwellkörper des Penis, die nitrergenen Nerven, Stickstoffmonoxid als den Neurotransmitter freisetzen, der zyklisches GMP produziert. Und wenn man seinen Abbau mit diesen Phosphodiesterase-Inhibitoren blockiert, erhält man mehr zyklisches GMP, eine stärkere Entspannung der glatten Muskulatur, mehr Dilatation, eine größere Blutanstauung und das ist dann der Mechanismus der Erektion. Der Gedanke zu diesem Konzept kam mir während meiner Arbeit in den 70er Jahren. Aber ich hielt das wirklich für ein einfach zu lösendes Problem und fand es nicht der Mühe wert, es umzusetzen. Ich wünschte, ich hätte es getan! Wahrscheinlich hätte ich mit diesen Arzneimitteln ein Vermögen verdient. Aber stattdessen beschäftigte ich mich Problemen in anderen Richtungen, meistens im kardiovaskulären Bereich. Diese Phosphodiesterasen spalten die dreifache Phosphodiesterbindung, um ein entsprechendes Monophosphat zu erzeugen, 5’-GMP oder AMP. Zyklisches AMP und GMP aktivieren Proteinkinasen, wie Sie dieser Tage von Eddie Fischer gehört haben. Als ich diese Folie vor einigen Jahren erstellte, ging ich von einem Bestand von rund 150 bis 200 Isoformen der Proteinkinase aus. Sie haben heute gehört, dass es möglicherweise 400 oder 500 Isoformen aus dem Genomprojekt gibt. Einige dieser Isoformen sind Serin-Threonin-Kinasen. Sie transferieren das Gamma-Phosphat aus ATP auf einen Serin-Threonin-Rest am Protein, wie die vom zyklischen AMP abhängige Proteinkinase, vom zyklischen G abhängige Proteinkinase, Calcium-Calmodulin-Kinase oder die Phospholipid regulierende Kinase, die wir als C-Kinase bezeichnen. Dann gibt es aber auch noch weitere Kinasen, diese Phosphorylat-Tyrosyl-Reste, von denen Eddie gesprochen hat. Wir bezeichnen sie als Tyrosin-Kinasen. Die Serin-Threonin-Kinasen sind an interzelluläre Botenstoffe gekoppelt, während die meisten Tyrosin-Kinasen an Wachstumsfaktoren und Zytokine gekoppelt sind und keine Botenmoleküle aufweisen. Was uns allen an diesen Proteinkinasen gefallen würde, wären sehr selektive Regulatoren und Inhibitoren. Und Sie haben bereits etwas darüber gehört. Es ist ein anspruchsvolles Projekt, weil die katalytischen Domänen ziemlich ähnlich sind und es schwierig ist, Wirkstoffspezifität zu erreichen. Und das möchte man ja. Gewisse Erfolge sind in der Hemmung einiger dieser Kinasen erreicht worden und es gibt einige potenziell interessante therapeutische Wirkstoffe gegen Krebs und andere Probleme. Das also ist der Signalweg für die ständige Kommunikation der Zellen untereinander. Es ist ziemlich einfach. Das Problem bei all diesen Isoformen ist jedoch, dass man nicht weiß, wer mit wem ins Bett geht. Wer redet mit wem? Welches ist das Botenstoffmolekül? Man könnte seine gesamte Karriere damit verbringen, das herauszufinden. Das macht Spaß. Und für mich ist es auch aufregend, weil all diese Isoformen und die potenziellen Übertragungswege und Sequenzen molekulare Zielstrukturen sind, die uns bei der Entwicklung von Arzneimitteln helfen. Und diese Arbeit liebe ich. Und ich habe zwar in der Vergangenheit viel klinische Forschung betrieben, aber mein Schwerpunkt ist die Grundlagenforschung, weil ich Dinge herausfinden möchte, die man klinisch umsetzen kann. Und das mache ich auch. Aber der Großteil meiner Tätigkeiten findet im Labor statt. Als ich begann, mich mit dem zyklischen GMP zu beschäftigen, wollte ich zwei Fragen untersuchen. Wie funktionieren diese Liganden, die zyklisches GMP vermehren und Gewebe angreifen – es gab eine Reihe von Hormonen – wie funktionieren diese Liganden? Wenn wir verstehen würden, wie sie sich von ihrem Rezeptor an die G-Zyklase-Regulation koppeln, könnten wir vielleicht eingreifen, indem wir diesen Kopplungsprozess effizienter gestalten oder ihn als potenzielles Therapeutikum zur Behandlung verschiedener endokriner Erkrankungen blockieren. Viele endokrine Erkrankungen haben mit Hormonüberschüssen oder Hormonmangel zu tun und ich hielt das für einen wichtigen Ansatz, weil zyklisches GMP erstmalig im Urin von Kaninchen gefunden wurde, nachdem ein P32-Labelling erfolgt war, um organische Phosphate im Urin aufzuspüren. Wir dachten, dass es wichtig sein müsste, wenn es vorhanden ist. Aber keiner von uns hatte eine Ahnung, wozu es gut war. Deshalb wollte ich auch etwas über seine biologischen Wirkungen herausfinden. So begannen wir also mit der Untersuchung der Guanylyl-Zyklase-Aktivität in verschiedenen Gewebeextrakten. Und vor dem Hintergrund meiner Arbeiten zu Adenylat-Zyklasen, die ich während meiner Ausbildung als Student durchgeführt hatte, untersuchte ich überstehende High-Speed-Fraktionen und -pellets auf Aktivität. Wir waren ziemlich überrascht, als wir sowohl bei High-Speed-Untereinheiten der Homogenate als auch bei den Pellets Aktivität fanden. Überhaupt nicht wie Adenylat-Zyklase, die immer im Pellet zu finden ist, weil sie sich in den Membranen befindet. Ich dachte: Meine Güte, vielleicht gibt es verschiedene Isoformen in verschiedenen Kompartimenten der Zelle, die verschiedene Pools von zyklischem G, möglicherweise mit verschiedenen Funktionen, herstellen. Das könnte doch ein äußerst interessantes Projekt sein. Wir begannen damit, einige dieser Aktivitäten kinetisch zu charakterisieren, die Löslichkeitsaktivität von Herz, Leber und anderen Geweben, die eine typische malleoläre Kinetik in Bezug auf Substrat zeigte. Lineares einzelnes GTP auf der katalytischen Seite. Als wir doppelt-reziproke Darstellungen mit GPT als Substrat erstellten, war die partikuläre Aktivität jedoch kurvenförmig, was Kooperativität vermuten lässt. Mehrere Nukleotid-Bindungsstellen. Es gab weitere Unterschiede zwischen der löslichen und der partikulären Aktivität. Und wir waren ziemlich sicher, verschiedene Isoformen vor uns zu haben. Man sollte allerdings kinetische Daten nicht aus Rohsystemen interpretieren, weil es konkurrierende Signalwege für Substrat und konkurrierende Signalwege für das Produkt gibt, das man gerade misst. Das lässt viel Spielraum für Fehler. Deshalb wussten wir, dass wir diese Isoformen für den Nachweis reinigen und klonen mussten. Das nahmen wir dann auch in Angriff, aber es hat rund sieben oder acht Jahre gedauert. Und in diesem Zeitraum haben wir letztendlich alle sieben Isoformen von Guanylyl- Zyklase gereinigt. Jede Menge Arbeit, jede Menge Postdoc-Mitarbeiter. Ein Postdoc-Mitarbeiter hat sechs oder sieben Jahre benötigt, um das partikuläre Isoform erstmalig zu reinigen. Aber ich machte ein einfaches Experiment. Ich sagte mir: Okay, wenn nukleare Kinasen und Phosphatasen die Kinetik verzerren, wenn Phosphodiesterasen die Kinetik aufgrund der Produkthydrolyse durcheinander bringen, dann lasst uns doch Inhibitoren für die nukleare Kinase, die Phosphatasen, die Phosphodiesterasen einbringen. Und so ging ich ins Labor und stellte einen Cocktail von Verbindungen her, die nach meiner Einschätzung Inhibitoren sein sollten. Fluorid, Azid, Pyrophosphat, Calcium, Hydroxylamin, Natriumnitrat, eine Mischung, Methylxanthine. Und überraschenderweise haben einige von ihnen eine lösliche Isoform des Enzyms aktiviert. Die Hormone wirkten nicht, nachdem wir die gewebe-erzeugenden Homogenate zum Erliegen gebracht hatten. Wir entkoppelten den Rezeptor von der Zyklaseregulation. Aber jetzt hatten wir einige sehr kleine Moleküle, Azid, Hydroxylamin und Natriumnitrit, die funktionieren würden. Und ich sagte: Lasst uns herausfinden, wie sie funktionieren. Vielleicht sind wir ja intelligent genug, einen Hormoneffekt im Labor zu rekonstruieren. Das war also das Ziel. Nun, das Ganze stellte sich als eine interessante Reise heraus. Das hier ist ein Experiment, das einige wichtige Anhaltspunkte in unserer Richtung lieferte. Als wir mit löslichen Extrakten von Homogenaten arbeiteten, fanden wir heraus, dass Leber durch Azide aktiviert werden konnte, in diesem Experiment um das 15-fache. Das Herz kann nicht durch Azid aktiviert werden, die Großhirnrinde konnte nicht durch Azid aktiviert werden. Aber dann habe ich Leber mit Herz gemischt und der Azideffekt war blockiert. Das Herz verfügte über einen Inhibitor. Wir reinigten den Inhibitor, der sich als Hämoglobin und Myoglobin herausstellte. Wir mischten Leber mit Großhirnrinde, der Azideffekt verstärkte sich. Und der Grund dafür ist, dass Azid durch Leber in einen Aktivator verwandelt wurde und jetzt die Zyklase aktivieren konnte, die von Leber sowie Großhirnrinde unterstützt wurde. Der in der Leber für diese Umwandlung verantwortliche Faktor war Katalase. Und einige Cytochrome schienen dieselbe Wirkung zu haben. Wir begannen dann, diese Substanzen auf Gewebe aufzubringen, um die zyklischen GMP-Bestände anzuheben, was funktionierte. Und dann untersuchten wir die Funktion: Glycogenolyse, Lipolyse, zahlreiche Sachen. Und wie der glückliche Zufall es wollte, arbeiteten wir mit glatter Muskulatur. Ich wusste aus dem Studium, dass zyklisches AMP glatte Muskulatur entspannt und dachte deshalb, dass zyklisches GMP den Effekten des zyklischen AMP entgegenwirken würde und vielleicht Kontraktion verursachen könnte. Wir entwickelten also ein tracheales glattes Muskelsystem, das ziemlich rein war, rund 80% bis 90% glattes Muskelgewebe. Ich habe vor langer Zeit gelernt, dass man Biochemie nie in heterogenen Systemen betreiben sollte, weil man dann nie weiß, welche Zellen für die Biochemie und welche für die Physiologie verantwortlich sind. Wir hatten also ein reines Präparat glatter Muskulatur und brachten Azid, Hydroxylamin und Natriumnitrat auf das glatte Muskelgewebe auf. Der Gehalt an zyklischen GMP nahm zu. Aber statt einer Kontraktion der Muskel erfolgte eine Relaxation. Wow! Das hatte ich nicht erwartet. Dann erinnerte ich mich, dass ich als Assistenzarzt auf einer Intensivstation für Patienten zuständig war, die einen Herzinfarkt erlitten hatten. Wir waren bemüht, ihren Blutdruck zu senken. Wir senkten das, was wir als die Nachlast bezeichnen, damit das Herz nicht so stark gegen den Blutdruck an arbeiten muss. Deshalb schlug ich vor, unseren Präparaten Nitroglycerin und Nitroprussid zuzugeben, die uns aus der klinischen Anwendung bekannt sind. Und dann wollten wir sehen, was passiert. Das führte natürlich in einer Vielzahl von Geweben zur Aktivierung der Zyklase, zur Erhöhung des zyklischen GMP. Und zum damaligen Zeitpunkt, das war Mitte der 1970er Jahre, verfügten wir über eine lange Liste von Verbindungen und prägten den Begriff Nitrovasodilatoren für diese wachsende Liste von Verbindungen. Dazu zählten Hydroxylamin, Nitrit, Nitrat, Azid, einige weitere Hydraxine, Nitroglycerin, Nitroprussid, Nitrosamine und all die anorganischen und organischen Nitrate, die wir als Vasodilatoren benutzen konnten. Eine lange Liste. Und dann war es wirklich Detektivarbeit herauszufinden, was denn der Aktivator wäre, weil es so unterschiedliche Verbindungen gab, die nicht miteinander interagieren konnten, wie beispielsweise G-Zyklase, weil aufgrund der Aktivatoren und Inhibitoren, die wir isolierten, eine gewisse Gewebespezifität im System bestand. Und einige von ihnen benötigten Sauerstoff. Azid würde in einem anaeroben Umfeld nicht funktionieren. Es gab eine zeitliche Verzögerung von einigen Minuten, bevor die renale Reaktion den Höhepunkt erreichte. Und wir glaubten, dass es ein Zwischenprodukt geben musste, aber welches? Die Entdeckung, dass Hämoglobin ein Inhibitor war, gab uns den entscheidenden Hinweis. Wir konsultierten Fachliteratur und entdeckten, dass Hämoglobin eine sehr hohe Affinität für Stickstoffmonoxid hat. Anfang Dezember 1976 erzeugten wir Stickstoffmonoxid im Laborabzugsschrank. Das war ein einfaches Experiment. Wir mischten Natriumnitrit, Eisensulfat und Schwefelsäure, verrührten das Ganze miteinander und heraus kam ein Gas, das wir in unsere Inkubationen einbrachten. Das aktivierte unsere gesamten löslichen Guanylyl-Zyklase Präparate. Zum ersten Mal bestätigte uns dieses Aha-Erlebnis-Experiment, das ein freies Radikal in Gas ein Enzym aktivieren kann. Dieses Konzept war nie vorher nachgewiesen worden und ich war natürlich ziemlich aufgeregt. Ich wollte unbedingt herausfinden, wie das funktionierte. Und jetzt hatten wir ein Instrument und begannen also zu verstehen, wie die zyklische GMP-Produktion in Geweben reguliert wird. Und das wird in dieser Folie zusammengefasst. Das hier macht ein Nitrovasodilator mit dem Aortensegment einer Ratte im Organbad im Labor. Wenn wir den Muskel mit Phenylethylamin oder einem anderen Wirkstoff prä-kontrahieren, einige Minuten bis zur Stabilisierung dieser Kontraktion warten und dann einen Nitrovasodilator zugeben, in diesem Fall Nitroprussid, steigt innerhalb von 10 bis 20 Sekunden der Gehalt an zyklischem GMP. Nach ungefähr einer Minute erreicht er den Höhepunkt. Danach folgt eine Entspannung des Gewebes und die Relaxation dauert für eine längere Zeitperiode an. Ich dachte, dass zyklisches G den Effekt vermitteln würde. Dagegen meinten andere: Nein, das kann nicht sein, schau dir die Dissoziation zu späten Zeitpunkten an. Zyklisches GMP ist wieder auf Basalniveau, während das Gewebe immer noch entspannt ist. Was passiert da? Die Halbwertzeiten all dieser Moleküle in den Zellsignalwegen unterscheiden sich stark voneinander. Die ersten Botenstoffe, zyklisches AMP und GMP und andere, haben sehr kurze Halbwertzeiten. Sie erreichen den Höhepunkt und nach ein oder zwei Minuten sind sie vergangen, während die Aktivierung einer Kinase und die Phosphorylierung der nachgelagerten Proteine für längere Zeiträume anhalten. Das ist die Erklärung. Wir veröffentlichten dann einen Artikel. Das war zum damaligen Zeitpunkt etwas brisant. Einige meiner Kollegen sagten: Murad, du bist verrückt, das hier kann nicht von Bedeutung sein. Freie Radikale können nicht Enzyme aktivieren. Und ich sagte: Wir haben herausgefunden, wie Nitroglycerin funktioniert. Jetzt möchte ich nachweisen, dass das auch ein interzellulärer Botenstoff ist. Wenn man in der Pharmakologie einen Wirkstoff findet, der etwas Interessantes bewirkt, sollte man sich fragen, ob er einen endogenen Pfad nachahmt. Die Opiate führten zur Suche nach einer endogenen Substanz. Und die wurde gefunden, nämlich die Encephaline. Dafür gibt es in der Pharmakologie weitere Beispiele. Und deshalb vermutete ich, dass sich das vorgeschlagene Schema als der Mechanismus zur Aktivierung dieser Kategorie von Wirkstoffen Aber vielleicht waren die Effekte von Hormonen in anderen Wirkstoffen, das erhöhte zyklische GMP einem veränderten Redox und einer Stickstoffmonoxid-Bildung aus endogenen Vorläufern zuzuschreiben. Ich würde das nicht nachweisen können, weil die erforderliche Stickstoffmonoxid-Konzentration nanomolar war, während die Methoden zur Messung mikromolar waren. Wir waren also tausendfach vom Ziel entfernt. Wir lagen richtig, benötigten aber weitere sechs bis acht Jahre oder so, um das nachzuweisen. Und für den Nachweis mussten wir neue Technologien und neuartige Analysen entwickeln, die empfindlich genug für das Experiment waren. Schließlich gelang es uns dann, die Stickstoffmonoxid-Produktion in Gewebeextrakten, Zustandsmedien und so weiter zu analysieren. Wir verwendeten einen Rat-1-Fibroblasten, der eine starke Reaktion auf Stickstoffmonoxid in der Erzeugung von zyklischem GMP zeigte. Und die Produktion des zyklischen GMP in diesen Fibroblasten war unser Assay für Stickstoffmonoxid und das funktionierte. Andere Labors entwickelten andere Methoden, Elektroden und Chemilumineszenz. Es gab mehrere Möglichkeiten dafür. In 1980 … ich muss gleich aufhören. Entschuldigung bitte. Das hier ist eine Übersicht über die Vasodilation mit Wirkstoffen, die die Produktion von zyklischem GMP in Blutgefäßen erhöhen. Links das Endothel, rechts die glatte Muskulatur. In Rot gekennzeichnet sind drei Vasodilator-Kategorien, die alle die Produktion von zyklischem GMP erhöhen. Die Nitrovasodilatoren werden im Blutstrom, abhängig von Ph, Sauerstoffspannung usw., spontan in Stickstoffmonoxid umgewandelt. Einige brauchen Enzyme, um Stickstoffmonoxid herzustellen, wie etwa Nitroglycerin. Es braucht ein Enzym zur Dehydratisierung von Glycerol. Das Stickstoffmonoxid aktiviert lösliche Zyklase zur Produktion von zyklischem GMP, das eine Kinase aktiviert, die Phosphorylator-Familie der Proteine. Wir haben vaskuläre Segmente mit P32 markiert, 2D-Gels hergestellt und ließen Western Labs einige der Proteine identifizieren. Es stellte sich heraus, dass die leichte Kette von Myosin dephosphoryliert wurde, während viele andere Proteine phosphoryliert wurden. Es passiert also das Folgende: Man stellt NO her, zyklisches G, aktiviert eine Kinase, phosphoryliert rund ein Duzend Proteine, von denen einige Salicyl-Calcium von außen oder eine Umverteilung von innen regulieren. Und darüber wird dann die Aktivität der leichten Kette von Myosin reguliert, wobei es sich um eine von Calcium-Calmodulin abhängige Proteinkinase handelt. Und dann wird Myosin dephosphoryliert. Und wenn man Myosin dephosphoryliert, gleiten die Myosin-Füllstoffe auseinander. Wenn man das Myosin phosphoryliert, schieben sie sich wieder zusammen, klammern sich aneinander und es entsteht eine Kontraktion. Die endothel-abhängigen Vasodilatoren, die erstmalig 1980 entdeckt wurden also Wirkstoffe wie Acetylcholin, Histadin und Thrombin, funktionieren, weil sich die Rezeptoren auf dem Endothel und nicht auf dem glatten Muskelgewebe befinden. Und sie erhöhen den Kalziumgehalt, um ein Enzym zu aktivieren, das die Aminosäure Arginin in den endothel-abhängigen Relaxationsfaktor umwandelt. Ich sagte zu Furchgott, dass es ein Stickstoffmonoxid aktivierendes Produkt sein könnte. Und das bewahrheitete sich später. Das geht dann weiter mit der glatten Muskulatur und verursacht dasselbe, das die zahlreichen … [unverständlich 00:35:18] machen. Das ist wichtig, weil Patienten – dazu später mehr – mit Arteriosklerose, Bluthochdruck, Diabetes nicht genügend Stickstoffmonoxid in ihren Blutgefäßen produzieren. Bei ihnen liegt eine Dysfunktion des Endothels vor, wir bezeichnen das als endotheliale Dysfunktion. Und wenn man diese Patienten behandelt, möchte man sie mit Wirkstoffen behandeln, die direkt auf die glatte Muskulatur einwirken, weil das Endothel gestört ist. Und diese endothel-abhängigen Vasodilatoren funktionieren dann nicht. Eine dritte Kategorie sind die Atriopeptine. Als Pallotti die Organisation der Zelle untersuchte, stellte er fest, dass in kardialen Vorhöfen Granalien zu finden waren. Granalien in Zellen weisen normalerweise auf abgelagerte Hormone, Peptidhormone wie beispielsweise in Chromophorgewebe hin. Das erregte Aufmerksamkeit bei de Bold in Kanada, der die Peptide isolierte, sie sequenzierte und er bezeichnete erstere als den artrialen natriuretischen Faktor. Heute kennen wir eine Gruppe dieser Peptide, die als artriale Peptine bezeichnet werden, AMP, BMP, CMP. Und wir haben festgestellt, dass einige der partikulären Guanyly-Zyklasen von diesen artrialen Peptinen aktiviert werden. Sie sind die Rezeptoren für die artrialen Peptine. Und sie stellen zyklisches GMP her, das Relaxation verursacht. Es gibt weitere Wege zur Relaxation von glatter Muskulatur und Blutgefäßen: Wirkstoffe, die den Calcium-Gehalt senken, Wirkstoffe, die Phosphodiesterasen hemmen, entweder zyklische A- oder G-Diesterase. Es gibt eine Vielzahl verschiedener Möglichkeiten, die zum Ziel führen, aber das ist der Weg über das zyklische GMP. Und ich glaube, dass das zyklische GMP-System aufgrund der Vasodilation in vielen Blutgefäßen vielleicht wichtiger ist als das zyklische AMP-System, aber das ist noch zu beweisen. Ich werde hier einige der Labormitarbeiter überspringen. Es gibt drei Isoformen des Enzyms, die Stickstoffmonoxid aus Arginin herstellen. Das ist die Reaktion. Sie oxidieren das Guanidin bei Stickstoff auf ein Zwischenprodukt Hydroxy-Arginin, das weiter zu Citrullin und Stickstoffmonoxid oxidiert wird. Das Enzym ist auf eine komplizierte Reihe von Kofaktoren angewiesen. Das Enzym ist nur als ganzes Dimer aktiv. Es hat eine häm-prosthetische Gruppe. Es wird durch Calcium, Calmodulin, FMN, FAD reguliert. Neben Argin nutzt es Sauerstoff und Ph. Ein weiterer wichtiger Kofaktor ist Tetrahydrobiopterin. Wenn man das Tetrahydrobiopterin zu Dihydro oxidiert, entkoppelt man das Enzym. Es erzeugt dann kein Stickstoffmonoxid mehr. Aber stattdessen produziert es Superoxidamin und das ist verheerend, weil das in vielen Geweben eine Skavenger-Funktion für Stickstoffmonoxid hat. Wenn Stickstoffmonoxid also nicht einwandfrei funktioniert - und ich zeige Ihnen einige Krankheiten, bei denen das der Fall ist - wird nicht genügend Stickstoffmonoxid hergestellt oder der hergestellte verschwindet, weil er einen sehr reaktiven Komplex bildet, der äußerst giftig ist. Und das sind die Denkrichtungen, mit denen wir uns jetzt in Bezug auf einige solcher Krankheiten beschäftigen. Lassen Sie mich den Weg für Sie zusammenfassen und dann hoffentlich in wenigen Minuten zum Schluss kommen. Hormone und Liganden interagieren mit entsprechenden Rezeptoren, um die interzellulären Kofaktoren zu verändern und Stickstoffmonoxid aus Stickoxid-Synthase herzustellen. Sie interagieren mit der Zyklase, produzieren zyklisches G. Das zyklische G reguliert die Kinase, um verschiedene Proteine zu phosphorylieren. In jedem dieser molekularen Zwischenschritte, Enzyme stecken mögliche Targets für neue Arzneimittel. Und das ist das, womit ich mich beschäftige. Wir haben schon eine Menge Arzneimittel entdeckt. Die Wege sind meistens noch komplizierter, wenn man sich näher mit ihnen beschäftigt. Stickstoffmonoxid bevorzugt die Aktivierung der Guanylyl-Zyklase. Das ist das, was es tun möchte. Es kann aber auch andere Richtungen einschlagen. Es könnte in Nitrid oder Nitrat umgewandelt werden. Es kann mit anderen Übergangsmetallen außer Eisen interagieren. Es kann Komplexe mit Thiolgruppen und Proteinen bilden. Es gibt Hunderte von Proteinen für die Nitrosylierung. Es kann auch mit Superoxid-Amin interagieren. Wann immer es um Entzündungen geht, wird die Produktion von Superoxid aus NADPH-Oxidase und anderen Signalwegen induziert. Und man induziert die Erzeugung von NOS2, weil diese proinflammatorischen Zytokine über NF-Kappa-B die Transkription und Translation der Stickoxid-Synthase regulieren. So kann man also eine Menge NO herstellen. Wenn NO und Superoxid zusammenkommen, werden sie sofort in Peroxynitrit umgewandelt. Eine sehr schnelle Reaktion. Sehr reaktiv. Und Peroxynitrit, Nitrat und alle Sorten aktiver Moleküle, DNA, RNA, Lipide, Proteine, alle möglichen Dinge. Und es überträgt das Nitrat auf das Tyrosin in Proteinen, neben der Hydroxylgruppe, und behindert sterisch die Tyrosin-Kinase-Wege. Der NO-Weg kann also auch mit den Tyrosin-Kinase-Wegen kommunizieren. Ist das nicht interessant? Wenn wir diesen Prozess umkehren können, könnten wir neue entzündungshemmende Mittel entwickeln, die keine Zyklooxygenase-Hemmer oder Steroide sind. Das wäre ein bedeutender Schritt. Wir glauben, dass es ein Enzym gibt, das so funktioniert. Aber es ist sehr schwierig, es zu finden und zu reinigen. Das ist wirklich schwierig. Wir arbeiten seit mehreren Jahren daran. Schnell noch…eine letzte Folie, versprochen! Patienten mit endothelialer Dysfunktion, Patienten mit Bluthochdruck, Diabetes, Arteriosklerose und wahrscheinlich Niktionmissbrauch und Fettleibigkeit haben Blutgefäße, die aus zahlreichen Gründen nicht genügend Stickstoffmonoxid herstellen. Ich möchte nicht näher auf die vielen verschiedenen Gründe eingehen, aber auf der Grundlage dieses Wissens können wir versuchen, die Störungen bei diesen Krankheiten mit Nahrungsergänzungsmitteln umzukehren, mit Antioxidantien und einer Vielzahl anderer Möglichkeiten zur Behandlung dieser Probleme. Und auch damit beschäftige ich mich. Ich habe hier meine David-Letterman-Show abgezogen. Dies sind meine letzten Folien. Eine Liste der möglichen klinischen Anwendungen für die Effekte von Stickstoffmonoxid und zyklischem GMP. Das ist eine lange Liste. Sie ist hier auf der Grundlage von 150.000 Artikeln auf eine Liste der engeren Wahl eingekürzt. Darüber können wir heute Nachmittag reden. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.

Ferid Murad (2014)

Discovery of Nitric Oxide and Cyclic GMP in Cell Signaling and Their Role in Drug Development

Ferid Murad (2014)

Discovery of Nitric Oxide and Cyclic GMP in Cell Signaling and Their Role in Drug Development

Abstract

The role of nitric oxide in cellular signaling in the past three decades has become one of the most rapidly growing areas in biology. Nitric oxide is a gas and a free radical with an unshared electron that can regulate an ever-growing list of biological processes. Nitric oxide is formed from L-arginine by a family of enzymes called nitric oxide synthases period. These enzymes have a complex requirement for a number of cofactors and regulators, including NADPH, tetrahydrobioterin, flavins, calmodulin and heme. The enzymes are present in most cells and tissues. In many instances, nitric oxide mediates its biological effects by activating the soluble isoform of guanylyl cyclase and increasing cyclic guanine nucleotide monophosphate (GMP) synthesis from Orotidine triphosphate (OTP). Cyclic GMP, in turn, can activate cyclic GMP-dependent protein kinase (PKG) and can cause smooth muscles and blood vessels to relax, decrease platelet aggregation, alter neuron function, etc. These effects can decrease blood pressure, increase blood flow to tissues, alter memory and behavior, decrease blood clotting, etc. The list of effects of nitric oxide that are independent of cyclic GMP formation is also growing at a rapid rate. For example, nitric oxide can interact with transition metal s such as iron, thiol groups, other free radicals, oxygen, superoxide anion, unsaturated fatty acids, and other molecules. Some of these reactions result in the oxidation of nitric oxide to nitrite and nitrate to terminate the effect, while other reactions can lead to altered protein structure function and/or catalytic capacity. These effects probably regulate bacterial infections, inflammation of tissues, tumor growth, and other disorders. These diverse effects of nitric oxide that are cyclic GMP dependent or independent can alter and regulate numerous important physiological events in cell regulation and function. Nitric oxide can function as an intracellular messenger, an antacoid, a paracrine substance, a neurotransmitter, or as a hormone that can be carried to distant sites for effects. Thus, it is an unique molecule with an array of signaling functions. However, with any messenger molecule, there can be too little or too much of the substance, resulting in pathological events. Some of the methods used to regulate either nitric oxide formation metabolism, or function have been in clinical use for more than a century, such as with the use of organic nitrates and nitroglycerin in angina pectoris that was initiated in the 1870s. Inhalation of low concentrations of nitric oxide can be beneficial in premature infants with pulmonary hypertension and increase survival rates. Ongoing clinical trials with nitric oxide synthase inhibitors and nitric oxide scavengers are examining the effects of these agents in septic shock, hypotension with dialysis, inflammatory disorders, cancer therapy, etc. Recognition of additional molecular targets in the areas of nitric oxide and cyclic GMP research will continue to promote drug discovery and development program s in this field. Current and future research will undoubtedly expand the clinician's therapeutic armamentarium to manage a number of important diseases by perturbing nitric oxide formation and metabolism. Such promise and expectation s have obviously fueled interests in nitric oxide research for a growing list of potential therapeutic applications. There have been and will continue to be many opportunities from nitric oxide and cyclic GMP march to develop novel and important therapeutic agents. There are presently more than 80,000 publications in the area of nitric oxide research. My lecture will discuss our discovery of the first biological effects of nitric oxide and how the field has evolved since our original reports in 1977. The possible utility of this signaling pathway to facilitate novel drug development and the creation of numerous projects in the pharmaceutical and biotechnology industrials will also be discussed.

References:
1. Murad F. Discovery of some of the biological effects of nitric oxide and its role in cellular signaling. Nobel Lecture. Bioscience Reports 19: 133-154. 1999 and Les Prix Nobel. 1998 (the Nobel Prizes. 1998). pp. 273-307. 1999.
2. Murad F. Shattuck Lecture. The Discovery of nitric oxide and cyclic GMP in cell signaling and their role in drug development. New England J. Med 355. 2003- 2011. 2006.

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