Kurt Wüthrich (2013) - Conformational Plasticity of G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) studied by NMR in Solution

As an introduction, some principles of nuclear spin physics applying to studies of integral membrane proteins (IMP) will be reviewed. Applications of resulting nuclear magnetic resonance (NMR) techniques will then be illustrated with studies of G-protein-coupled receptors (GPCR)

Thank you Astrid for your kind introduction. It is always a pleasure to be here in Lindau. On last Monday, the very first lecture that was presented this year Doctor Kobilka gave you a beautiful overview of GPCRs. And he mentioned to you how important this class of membrane proteins is. Maybe I just repeat that more than 40% of all approved prescription drugs on the market today target GPCRs. In our body there are roughly 840 distinct GPCRs functioning and helping us to function. In this lecture I will touch on a very narrow part of research about and around GPCRs focusing on the structural biology of this class of proteins. An important point to be made here is that in protein structure determination we have 2 classes of methods, here represented by x-ray diffraction and nuclear magnetic resonance spectroscopy. One of these types of techniques -there is now electron diffraction as well that plays an always more important role- studies the proteins in crystals. Other spectroscopic methods study the same proteins in solution. There is a lot of talk about the importance of dynamics for the proper functioning of proteins. This is not at all surprising considering that our body is very high above the absolute 0 temperature. It is around 300 degrees K. And so everything is obviously in thermal motion. However in order to obtain well diffracting crystals of proteins, one has to block the dynamics of the molecules in as far as possible. Contributions to blocking the dynamics of proteins for studies by diffraction techniques include that the data are collected at low temperature. There is hardly any x-ray diffraction data collected above liquid nitrogen temperature today. And in addition parts of the polypeptide chains will be truncated if there is evidence that they might be flexibly disordered. Loops may be removed if there is an indication that they might show mobility. And possibly one will study a given protein in complexes with other proteins in order to firstly reduce the dynamics of the molecule of interest. And only then will high resolution diffraction data be obtained. These approaches have yielded fantastic results during the last decade or the last 15 years quite generally in the field of protein structural biology and specifically most recently in the field of membrane protein structural biology. In the case of GPCRs it is so that in spite of the keen interest, in particular on the side of pharmaceutical industry, there were no structures of human GPCRs available until 2007. The structure of beta2AR was shown to you by Doctor Kobilka on Monday. Today we have crystal structures of more than 20 different human GPCRs. And we have more than 100 crystal structures of these. I think its 23 GPCRs at the moment in complexes with different ligands. However as I mentioned 2 minutes ago, these big advances, these breakthroughs came at the price of freezing in the dynamics of these molecules when they are subjected to studies by diffraction in crystals. And therefore it is important that crystallographic data are complemented by investigations in solution where the dynamics of these molecules can be maintained and is available for experimental investigation. And this is what I want to talk to you about today. You remember from Doctor Kobilka's talk, GPCRs are transmembrane proteins which in all cases have 7 transmembrane helices. You have here the periplasmic side. That is the surface of the cell. You have here the cytoplasmic cells. The inside of the cell. And the GPCRs mediate signals from the surface of the cell to the partner proteins in the cytoplasm. I'm here just repeating what Doctor Kobilka has conveyed to you on Monday. The big question that we want to entertain is: How do signals elicitate by binding drug molecules to a binding site, to so called orthosteric ligand binding site of GPCRs? How are they transmitted to the interior of the cell? And this transmission has to go over the distance of about 30 to 35 angstroms. This is a very large distance on the molecular scale. So we want to find out the effects of different orthosteric ligands. We want to find out how allosteric effectors such as cholesterol, shown here on the outside of this schematic picture, or sodium ions which have been shown to sit centrally in the GPCRs, how can such allosteric effectors modulate the way in which that signal transmission occurs from the surface of the cell to the interior of the cell? And the key question here is to know whether or not the receptor protein itself is present in 2 or multiple states which are intrinsic to the protein itself or whether on the contrary there are states that would be induced either by binding of the ligand or possibly even by binding of the partner proteins of the cytoplasmic surface of the receptor proteins. And there are schools... There is a very wide range of scientists who have worked, have done beautiful work on GPCRs. And there are schools who believe that multiple states of the GPCRs are induced and stabilised by the binding of the partner proteins. There are other schools who believe that it is the orthosteric ligand, that induces new confirmations of the protein. But there is also a school that claims: Well, we have 2 or multiple states of the protein. And all that is effective... I mean the allosteric ligands, the cholesterol, sodium ions and possibly the partner proteins on the cytoplasmic site too is to move around actually between multiple states that are intrinsic to the receptor. And it is these kinds of questions that I want to address today. I want to briefly introduce the colleagues who have been involved in this research: Doctor Jeffery Liu, he just got his PhD degree Monday week ago. Doctor Reto Horst, Vsevolod Katritch, Professor Ray Stevens, myself were involved in the work. And you see here again a survey of the GPCRs that you have also seen on Monday. This is an old slide. It shows that 8 crystal structures have been solved as I mentioned. Today it would be 23 crystal structures including representatives of all of the families that are shown up here and that have been described to you on last Monday. And I want to stress that in our case there is a tight interaction, almost a daily interaction between crystallography pursued by Professor Steven's group and my group who tries to obtain complementary information to the structures in crystals by NMR. I would like to give you some technical details on how such a project is approached. The first thing is that we have to decide on what we want to do. In principle we would be in a position today to solve the structure of GPCRs by NMR in for example GPCRs solubilised in detergent micelles. However, considering the high efficiency with which crystallography can now provide us with the scaffold of the structure it seemed more important to try to obtain specific information on the dynamics within the scaffold of these crystal structures. That was the first thing to decide. The next thing is that we have to define the state of our protein when we study it with NMR spectroscopy in solution. In the biological membrane the concentration of the membrane proteins is far too low for direct observation either by crystallography or by other techniques. So the proteins have to be extracted from the membrane and taken up into for example detergent micelles, into bicelles, possibly into nano-bodies. Each one of these approaches has proven successful in some cases. We spent several years characterising the solutions of detergent solubilised membrane proteins in particular GPCRs. What we found out is that there is rapid exchange. So it's a highly dynamic system of having empty micelles, detergent monomers and protein loaded micelles. And there is fast exchange among all these species so that we see only a single NMR spectrum. One of the most important observations that we made was that the concentration of detergent was essential with regard to having success either with studies in solution or with crystallisation assays. You see here if the... We have here 1 millimolar solution of... This is a different membrane protein, it's not a GPCR but we use this as a model system. We had 1 millimolar solution of protein. If we used 50-fold excess of detergent, we got this sort of a signal. If we used 100-fold excess we got this signal, about 4 times as high. That's worlds apart. This is clear, that was not surprising. It is clear now that we form species which contain 1 protein molecule and approximately 100 molecules of the detergent. However, when we then increased the detergent concentration further, we increased the concentration of empty micelles, with this the viscosity of the solution is increased and we lose the signal. At 8-fold excess of detergent we have no chance to get reasonable results. And under these conditions crystallisation assays are not promising easy. An important technical point here is that it is very laborious to isolate these proteins. Doctor Kobilka has told you about his many years of fighting in order to get milligram quantities of the proteins. And therefore it is important that all of these exploratory studies of the protein solutions are done with micro-scale equipment. We would typically use 5 microlitres of this protein solution in order to get those data describing the solution behaviour of the protein in detergent micelles. I come to the next point. Now we have found solution conditions that enable studies of the solubilised GPCRs by NMR. And independently NMR methodology had been developed that enables to work with very dilute solutions of such large particles. Then we designed the following experiment based on the availability of the crystal structure. And we worked first on beta2AR which is the same structure that Doctor Kobilka talked about primarily the reason being that this crystal structure has been solved in the laboratories in Stanford and at Krebs. So we decided to add fluorine labels to 3 cysteine residues that are located on the cytoplasmic surface of beta2AR. Now fluorine has the advantage of not being present in biological materials so that if you introduce by chemical modification of some amino acids in the protein, if you introduce fluorine labels you will not have a background signal. And at the same time fluorine has similar sensitivity for NMR observation as the most sensitive nucleus which is the hydrogen atom. So we would label these 3 residues. You see, you look here sideways at the structure of beta2AR. Here you would have the periplasmic surface, cytoplasmic surface. And here we look from the bottom up, from the cytoplasmic side to the bottom of the molecule. And you see that the 3 labels are about equally spaced distances of about 15 angstroms. So having the 3 labels gives us 3 lines and no background. And then Jeff Liu would replace 2 of these cysteines by alanine or serine so that we would have only a single label left. And so we would get singly labelled proteins which enable to study the line shapes of the fluorine signals in detail which would be more difficult if we worked with the overlapping 3 line. And then the project that we followed was to take 10 different drugs which represent inverse agonists, neutral antagonists, full agonists, partial agonists and biased agonists. So we would bind these different chemical structures here in the allosteric binding site and check what happens down here at the tip of helix 6 and at the tip of helix 7. The C terminal probe that we had added here was used as a control which did actually not react to the different ligands. And what did we find? We found that for each of the probes there were 2 parts of the signal. You can see for carazolol which is an inactivate of Beta2AR we get a strong signal here and a weak signal here. And when we look at the tip of helix 7, tip of helix 6, we have a rather broad line with a shoulder here. And when we now go through this list of 10 different drug molecules, you can see that the distribution of the intensity between the 2 parts of the signal changes. And when we then de-convoluted the spectra, you see here you have with the thin black lines, you have the experimental signal. The red line is 1 component. The blue one is another component. That means we have 2 chemical shifts and 2 line shapes. That makes already 4 variables that we can use to try to fit the experimental signal. And the thick black line overlaps quantitatively with the experimental spectrum showing that we have no evidence to assume that more than 2 different states are present in either one of the 2... system of 2 overlapping lines. And you can see that the relative intensity of the blue and the red signals change quite dramatically when we go from inverse agonists to the apo form to biased agonist to full agonist. And you can see that for example for isoetherine, would be here, we have almost full activation at the tip of helix 7. And we have about 50% activation at the tip of helix 6. Now that's where things get really exciting. How did we assign the blue and the red lines to either the inactive state I or the active state of the receptor? Well we found that in the apo form and in the complex with inverse agonists the blue line was highly populated and there was only low population of the red line. So we made the hypothesis the blue line must be an inactive state. And indeed it then turned out that if we used activating drugs we would increase the red line, that is the population of the activated form of the receptor. The most important result here is that the switching from inactive to active state observed at the tip of helix 7 and at the tip of helix 6 are largely uncoupled. So we can activate signals through helix 7 quite independently of activation signals sent through helix 6. And you remember Doctor Kobilka showed this beautiful structure of a complex of beta2AR with the G protein. Now we looked at this structure very closely. We found that the tip of helix 6 is in direct contact with the G protein whereas the tip of helix 7 is 15 angstroms away from the nearest active group of the G protein. So the implication is clear. Activation through helix 6 goes to G protein signalling pathway. Activation through helix 7 goes through an open space. And from independent evidence provided by other groups it is to be assumed that this is the pathway that leads possibly to activation of kinases, possibly activation of -I think I have this shown here- of beta-arrestin. So, that would be this blue pathway and the helix 6 would be the red pathway through the G protein part. At this point we know that we have at least 4 states of the inhibitor. Ok, we have 2 states observed on helix 6, we have 2 states observed on helix 7. It is possible that the inactive state observed on both helices is the same. But it is clearly so that the states, the activated states observed on helix 6 and helix 7 are 2 different states. So we wanted to know more about the basis for the properties of these states. Now first we did this by studying the thermodynamics and the kinetics of the system. Here we changed the temperature from 280 to 310 degrees K. And you can see that the relative intensities representing the population of the 2 states changed dramatically when we changed the temperature. And this change was reversible. Here we have a partial agonist and a full agonist. We couldn't study an antagonist because then one of the signals was always too small for a quantitative analysis. We analysed this in terms of van't Hoff Plots. It is nice thermodynamic equilibrium. We get delta H values of around 40 kilojoules per mole for the labels on both the helix 6 and helix 7. And we also get very similar values for the entropy. These values simply indicate in a qualitative way that difference in structure between the activated and inactive state must be more than rearrangement of a single side chain. So they have to involve most likely also major parts of the polypeptide backbone. Next we used NMR experiments, 2 types of NMR experiments to investigate the rates with which the molecule changes between the confirmation A for active and I for inactive. One of these experiments is 2 dimensional fluorine-fluorine exchange spectroscopy, an experiment first described by the group of Professor Ernst who will speak right after me. Very simply here you have a 2 dimensional presentation. Here you have cross sections. If there were exchange faster than 10 per second, we would have cross peaks here and here. They would be located here along this dotted line. There is no indication of a cross peak. So this experiment tells us that the exchange is slower than 10 per second. We next used saturation transfer. That means you have here the signal. In this case it is the signal at the tip of helix 7, C327. We would irradiate off resonance and check whether or not the effect of these radio frequency radiations on the blue line was entirely due to the direct influence of this irradiation or whether there was additional transfer of magnetisation from the red to the blue line. The result was clear. We got satisfactory results only with the assumption that there was no exchange. If we assumed that there is exchange at the rate of 100 per second, we were far off. If we assumed that there is no exchange, zero per second, then we got reasonable agreement between the model calculations and the experimental data which are represented by the black diamonds. There is a mistake in the slide. This T2 should be microseconds here as well as here. T2 cannot be longer than T1. Sorry for this typo. The next approach to get more information on the 2 states is to use NMR in order to get direct structural information rather than dynamic and thermodynamic information. For this we have to introduce isotope labelling into the chain. We would typically introduce deuterium on all carbon-proton-bonds. It would replace the non-labile hydrogen atoms with deuterium. We would then have NMR observable hydrogens only on the amide groups. And possibly introduce, reintroduce protonated methyl groups on some peripheral sites on amino acid residues. We have preliminary data on this, I'll show you here. These are now performed not with beta2AR but with a different receptor, A2AAR adenosine receptor. And here you have a correlation experiment, nitrogen 15 protons. And we compare the spectrum of a complex with an inverse agonist which stabilises an inactive state and a complex with an agonist that would ensure that we have an active state. We see one peak that moves from here to here in this particular spectral region. We have the peaks that are perfectly overlapped, red and blue. We have another peak that we have found to move from here to here. So this is very preliminary. I just want to show this. We are on the way of tying down not a new structure of a GPCR but using an NMR spectroscopy to get structure information on the type of structural differences between active and inactive states which we do not get from the probe experiments with fluorine NMR. Here we look at the indole NH resonances and we have a peak that moves from here to here between inactive and active state. And we don't know where this comes from. We have not established a relation here. So I said this is very early on. This is ongoing work. Finally if I can have 2 more minutes. Is that ok? We always go over with time. We have this bad habit. Just wait for Professor Ernst. We have a competition in this regard. I just want to indicate to you how this goes on. When we studied beta2AR with this fluorine NMR technology, we were just plain lucky because in beta2AR we had 16 residues that were sitting right on the cytoplasmic surface of the protein. Now if you go to others. We have several receptors on the study at the moment. It makes one receptor per PhD student so that we can work a few years on each project. Postdocs are too short lived for that. This is h2AR. And here we have no cysteines or lysines. You see you have to have some side chains that can be specifically labelled with a given chemical reagent. So there is no cysteines here. We want to use cysteines at the moment for technical reasons. So we have a lot of cysteines, in this case about 12 cysteines, endogenous in the protein structure. This is a crystal structure and therefore the fusion with T4L is indicated. For the NMR experiments we do not use the fusion protein so we would have just, we would have the loop here closed and work with the near native form of the protein. Now in addition to working against the background that we may cause by fluoride labelling of the indigenous cysteines, we have to engineer cysteines into desired places where we hope that we will get information on the signal transfer. In a similar way as we did with beta2AR. This is a lot of work because for each such change in the amino acid sequence we have to check again that receptor maintains its activity and so on and so forth. Now in the case of A2AAR we are probably near to being able to work along similar lines as with beta2AR. We study here 2 different orthosteric ligands. Both are agonists with different efficacies. UK432097 has higher efficacy than NECA. And what you can see here is the big background signal. We don't know exactly where it comes from. Here which is from the background labelling in the upper part of the molecule. But here we now have a pair of lines which change intensity when we go from NECA, that's the blue signals, to UK432097 where we have these 2 signals. So it looks as if Lukas ...[name] who is working on this is approaching a good line of work to pursue his PhD studies. With this I would like to close. And that will please you I am sure. I show you again the schematic structure of a GPCR. I have tried to illustrate to you how important it is to use multiple techniques in crystals, in solution techniques that enable to obtain high resolutions scaffold of the structure. Other methods that may be less precise and less accurate but work on states of the same molecule where its dynamics is not blocked. And that combination of these techniques may eventually lead us to obtain sufficient insight to give fruitful information to those who want to apply this knowledge, in this case, the case of this class of proteins, primarily in the area of drug development and drug design. I thank you for your attention. Applause.

Vielen Dank Astrid, für Ihre freundliche Einführung. Es ist mir immer eine Freude, hier in Lindau sein zu können. Am letzten Montag gab Ihnen Dr. Kobilka, im ersten Vortrag dieses Jahres, einen wunderbaren Überblick über GPCRs. Und er sagte Ihnen, wie wichtig diese Klasse der Membranproteine ist. Vielleicht wiederhole ich einfach, dass es sich bei den Zielmolekülen von mehr als 40 % aller gegenwärtig auf dem Markt zugelassenen, verschreibungspflichtigen Medikamenten um GPCRs handelt. In unserem Körper erfüllen etwa 840 verschiedene GPCRs ihre Funktion und helfen uns zu funktionieren. In diesem Vortrag werde ich auf einen sehr kleinen Teil der mit GPCRs in Zusammenhang stehenden Forschung eingehen und mich auf die Strukturbiologie dieser Klasse von Proteinen konzentrieren. Eine wichtige Bemerkung, die an dieser Stelle gemacht werden muss, ist folgende: Zur Bestimmung der Proteinstruktur gibt es zwei Methoden, die hier durch die Beugung von Röntgenstrahlen und die Kernspinresonanz-Spektroskopie dargestellt sind. Eine dieser Arten von Technik – es gibt mittlerweile auch Elektronenbeugung, die eine zunehmend wichtigere Rolle spielt – untersucht die Proteine in Kristallform. Andere spektroskopische Methoden untersuchen dieselben Proteine in Lösung. Man redet sehr viel über die Bedeutung der Reaktionsdynamik für die richtige Funktion der Proteine. Dies ist in keiner Weise verwunderlich, da die Temperatur unseres Körpers sehr hoch über dem absoluten Nullpunkt liegt. Sie beträgt etwa 300 Grad K, und daher befindet sich alles offensichtlich in, durch Wärme erzeugter, Bewegung. Um jedoch Strahlen deutlich beugende Proteinkristalle zu erhalten, muss man die Reaktionsdynamik der Moleküle blockieren, soweit dies möglich ist. Zu den Schritten, mit denen die Reaktionsdynamik der Proteine für Untersuchungen mithilfe von Beugungstechniken blockiert wird, gehört die Datenerhebung bei niedrigen Temperaturen. Heute werden kaum noch irgendwelche Daten zur Röntgenstahlbeugung oberhalb der Temperatur von flüssigem Stickstoff gesammelt. Darüber hinaus werden Teile der Polypeptidketten abgeschnitten, wenn es Hinweise darauf gibt, dass sie sich aufgrund ihrer Flexibilität in Unordnung geraten könnten. Schleifen werden möglicherweise entfernt, wenn es so aussieht, dass sie Beweglichkeit zeigen könnten; und ein bestimmtes Protein wird vielleicht in Komplexen mit anderen Proteinen untersucht, um zuerst die Reaktionsdynamik des Proteins, dem das Interesse gilt, zu verringern. Erst im Anschluss daran werden hochaufgelöste Beugungsdaten gewonnen. Diese Vorgehensweisen haben in den letzten 10 oder 15 Jahren auf dem Gebiet der Strukturbiologie der Proteine im Allgemeinen fantastische Ergebnisse geliefert, und im Besonderen auf dem Forschungsgebiet der Strukturbiologie der Membranproteine. Im Falle der GPCRs verhält es sich so, dass man vor dem Jahre 2007 – trotz des starken Interesses, insbesondere von Seiten der pharmazeutischen Industrie – über keine Daten zur Struktur der GPCRs des Menschen verfügte. Die Struktur von beta2AR wurde Ihnen am Montag von Dr. Kobilka gezeigt. Heute kennen wir die Kristallstruktur von mehr als 20 verschiedenen GPCRs des Menschen. Und wir kennen mehr als 100 Kristallstrukturen von diesen. Ich glaube, es sind derzeit 23 GPCRs in Komplexen mit verschiedenen Liganden. Wie ich Ihnen jedoch vor zwei Minuten gesagt habe, wurden diese Fortschritte, diese Durchbrüche, um den Preis erzielt, dass man die Reaktionsdynamik dieser Moleküle einfror, als man die Beugung von Strahlen an ihren Kristallen untersuchte. Deshalb ist es wichtig, dass kristallographische Daten durch Untersuchungen in Lösungen ergänzt werden, da darin die Reaktionsdynamik dieser Moleküle erhalten werden kann und für experimentelle Untersuchungen zur Verfügung steht. Dies ist es, worüber ich heute zu Ihnen sprechen möchte. Sie werden sich von Dr. Kobilkas Vortrag daran erinnern, dass GPCRs transmembrane Proteine sind, die in allen Fällen über 7 Transmembranhelices verfügen. Hier haben Sie die periplasmatische Seite. Dies ist die Zelloberfläche. Hier haben Sie die zytoplasmatischen Zellen. Das Innere der Zelle. Und die GPCRs übertragen Signale von der Zelloberfläche zu den Partnerproteinen im Zytoplasma. Ich wiederhole hier lediglich, was Dr. Kobilka Ihnen am Montag erläutert hat. Die große Frage, der wir nachgehen wollen, lautet: Wie werden Signale durch die Bindung der Moleküle von Medikamenten an eine Bindungsstelle ausgelöst, an die sogenannte orthosterische Ligandenbindungsstelle der GPCRs? Wie werden sie ins Innere der Zelle übertragen? Diese Übertragung muss einen Abstand von etwa 30 bis 35 Angström überbrücken. Im Maßstab der Moleküle ist dies ein sehr großer Abstand. Wir wollen also die Wirkung verschiedener orthosterischer Liganden ermitteln. Wir möchten herausfinden, wie allosterische Effektoren wie etwa Cholesterol, das hier auf der Außenseite dieser schematischen Abbildung dargestellt ist, oder Natriumionen, von denen man gezeigt hat, dass sie in der Mitte der GPCRs sitzen, wie derartige allosterische Effektoren die Art und Weise verändern, auf die diese Signalübertragung von der Oberfläche zum Inneren der Zelle stattfindet? Und die entscheidende Frage ist in diesem Zusammenhang, ob das Rezeptorprotein selbst in zwei oder mehr Zuständen vorkommt, die dem Protein selbst eigentümlich sind, oder ob im Gegensatz dazu Zustände vorliegen, die entweder durch die Bindung des Liganden induziert wurden oder möglicherweise sogar durch die Bindung der Partnerproteine der zytoplasmatischen Oberfläche der Rezeptorproteine. Und es gibt Schulen... Es gibt eine große Bandbreite von Wissenschaftlern, die über GPCRs geforscht habe, die wunderbare Arbeit dazu geleistet haben. Und es gibt Schulen, die der Auffassung sind, dass mehrere Zustände der GPCRs durch die Bindung der Partnerproteine induziert und stabilisiert werden. Es gibt andere Schulen, die glauben, dass es der allosterische Ligand ist, was neue Konformationen der Proteine induziert. Allerdings gibt es auch eine Schule, die behauptet: Nun ja, wir haben es mit 2 oder mehr Zuständen des Proteins zu tun. Und alles, was wirksam ist ... ich meine die allosterischen Liganden, das Cholesterol, Natriumionen und möglicherweise auch die Partner-Ionen an der zytoplasmatischen Bindungsstelle ... ist die tatsächliche Bewegung zwischen den verschiedenen Zuständen, die dem Rezeptor eigentümlich sind. Und es sind diese Art von Fragen, auf die ich heute eingehen möchte. Ich möchte Ihnen kurz die Kollegen vorstellen, die an diesen Forschungen beteiligt waren: Es waren Dr. Jeffrey Liu, der soeben am Montag vor einer Woche seinen Doktorgrad verliehen bekommen hat, Dr. Reto Hors, Vsevolod Katritch, Professor Ray Stevens und ich selbst. Und Sie sehen hier nochmals eine Übersicht der GPCRs, die Sie bereits am Montag gesehen haben. Dies ist ein altes Dia. Es zeigt, dass 8 Kristallstrukturen aufgelöst wurden, wie ich erwähnte. Heute wären es 23 Kristallstrukturen, einschließlich der Vertreter aller der Familien, die hier oben dargestellt sind und die Ihnen am letzten Montag beschrieben wurden. Ich möchte betonen, dass es in unserem Fall eine enge, fast tägliche Zusammenarbeit zwischen der von Prof. Stevens verfolgten Kristallographie und meiner Arbeitsgruppe gibt, die mithilfe der Nuklearmagnetresonanz versucht, komplementäre Informationen über die Strukturen in Kristallen zu gewinnen. Ich möchte Ihnen einige technische Einzelheiten dazu erläutern, wie man an ein solches Projekt herangeht. Der erste Schritt besteht darin, dass wir entscheiden müssen, was wir tun wollen. Im Prinzip wären wir heute dazu in der Lage, die Struktur von GPCRs durch Nuklearmagnetresonanz aufzuklären, zum Beispiel von GPCRs, die in Detergensmizellen gelöst sind. In Anbetracht der hohen Effizienz, mit der uns die Kristallographie heute das Gerüst der Struktur liefern kann, schien es uns wichtiger, zu versuchen spezifische Informationen über die Reaktionsdynamik innerhalb des Gerüsts dieser Kristallstrukturen zu gewinnen. Das war das erste, was entschieden werden musste. Als nächstes müssen wir den Zustand unseres Proteins definieren, wenn wir es mit Nuklearmagnetresonanz-Spektroskopie in Lösung untersuchen. In der biologischen Membran ist die Konzentration der Membranproteine für eine direkte Beobachtung mit der Kristallographie oder mit anderen Techniken viel zu gering. Die Proteine müssen daher aus der Membran extrahiert und beispielweise in Detergensmizellen aufgenommen werden, in Bizellen, möglicherweise in Nanokörper. Jede dieser Vorgehensweisen hat sich in bestimmten Fällen als erfolgreich erwiesen. Wir haben mehrere Jahre damit zugebracht, die in Detergenzien gelösten Membranproteine in bestimmten GPCRs zu charakterisieren. Wir fanden heraus, dass dabei ein schneller Austausch stattfindet. Es ist ein hochdynamisches System, bei dem leere Mizellen vorliegen, Detergensmonomere und mit Protein beladene Mizellen. Außerdem findet der Wechsel zwischen diesen Komponenten so schnell statt, dass wir nur ein einziges NMR-Spektrum sehen. Eine der wichtigsten Beobachtungen, die wir gemacht haben, war, dass die Konzentration des Detergens im Hinblick auf den Erfolg, sowohl der Untersuchungen in Lösung als auch derjenigen anhand von Kristallisationsanalysen, von entscheidender Bedeutung war. Sie sehen hier, ob die ... Wir haben hier eine 1-Millimolar-Lösung von ... Dies ist ein anderes Membranprotein. Es ist kein GPCR, aber wir verwenden es als ein Modellsystem. Wir hatten eine 1-millimolare Proteinlösung. Wenn wir ein 50faches Übermaß des Detergens verwendeten, erhielten wir dieses Signal, wenn wir ein 100faches Übermaß verwendeten ergab sich dieses Signal, etwa viermal so hoch. Dazwischen liegen Welten. Dies ist klar, das war nicht überraschend. Es ist jetzt klar, dass wir Gemische herstellen, die 1 Proteinmolekül enthalten und ungefähr 100 Moleküle des Detergens. Wenn wir dann jedoch die Konzentration des Detergens weiter erhöhten, erhöhten wir die Konzentration leerer Mizellen. Dadurch wird die Viskosität der Lösung erhöht und wir verlieren das Signal. Bei einem 8fachen Überschuss des Detergens hatten wir keine Aussicht auf vernünftige Ergebnisse, und unter diesen Bedingungen sind Kristallisationsanalysen ebenfalls nicht vielversprechend. Ein wichtiger technischer Aspekt hierbei ist, dass es sehr arbeitsintensiv ist, diese Proteine zu isolieren. Dr. Kobilka hat Ihnen von seinem jahrelangen Kampf erzählt, den er führen musste, allein um Mengen von nur wenigen Milligramm des Proteins zu erhalten. Daher ist es wichtig, dass sämtliche dieser exploratorischen Untersuchungen der Proteinlösungen mit Geräten durchgeführt werden, die kleinste Mengen registrieren können. Normalerweise verwenden wir 5 Mikroliter dieser Proteinlösung, um diejenigen Daten zu gewinnen, die das Lösungsverhalten des Proteins in den Detergensmizellen beschreiben. Ich komme zum nächsten Punkt. Wir haben nun Lösungsbedingungen gefunden, die die Untersuchung von gelösten GPCRs mit Hilfe der Nuklearmagnetresonanz ermöglichen. Außerdem wurden unabhängig NMR-Methoden entwickelt, die die Arbeit mit sehr stark verdünnten Lösungen von solchen großen Partikeln ermöglichen. Anschließend entwarfen wir, basierend auf der Verfügbarkeit der Kristallstruktur, das folgende Experiment, und arbeiteten zuerst an beta2AR, bei dem es sich um dieselbe Struktur handelt, von der Dr. Kobilka sprach, vor allem aus dem Grund, dass diese Kristallstruktur in den Laboratorien in Stanford und in Krebs beschrieben wurde. Wir entschieden uns also, Fluormarkierungen an 3 Zysteinreste zu hängen, die sich auf der zytoplasmatischen Oberfläche von beta2AR befinden. Nun hat Fluor den Vorzug, dass es in biologischen Materialien nicht vorkommt, so dass man, fügt man es durch die chemische Änderung einer Aminosäure in das Protein ein, wenn man Fluormarkierungen einführt, kein Hintergrundsignal hat. Und gleichzeitig verfügt Fluor, als der empfindlichste Kern, bei dem es sich um das Wasserstoffatom handelt, über eine ähnliche Empfindlichkeit für die NMR-Beobachtung. Wir markierten also diese drei Reste. Sehen Sie, man schaut hier seitlich auf die Struktur von beta2AR. Hier hat man die periplasmatische Oberfläche, die zytoplasmatische Oberfläche. Und hier schauen wir von unten nach oben, von der Seite des Zytoplasmas auf die Unterseite des Moleküls. Und Sie sehen, dass die drei Markierungen einen gleichmäßigen Abstand von etwa 15 Angström voneinander haben. Diese drei Markierungen geben uns 3 Linien und keinen Hintergrund. Und Jeff Liu ersetzte dann zwei dieser Cysteine durch Alanin oder Serin, sodass uns nur noch eine einzige Markierung übrig blieb. Auf diese Weise erhielten wir einfach markierte Proteine, was uns die Möglichkeit gab, die Einzelheiten der Linienformen der Fluorsignale zu studieren, was schwieriger wäre, wenn wir mit den drei überlappenden Linien arbeiten müssten. Und das von uns verfolgte Projekt bestand dann darin, dass wir 10 verschiedene Medikamente nahmen, die inverse Agonisten, neutrale Antagonisten, volle Agonisten, partielle Agonisten und selektive Agonisten darstellten. Wir machten also diese verschiedenen chemischen Strukturen hier an dieser allosterische Bindungsstelle fest und überprüften, was hier unten, an der Spitze von Helix 6 und der Spitze von Helix 7 geschah. Die C-Terminal-Probe, die wir hier unten hinzugefügt haben, wurde als Kontrolle verwendet, die mit den verschiedenen Liganden tatsächlich nicht reagiert hat. Und was fanden wir heraus? Wir stellten fest, dass es für jede der Proben zwei Teile des Signals gab. Sie können erkennen, dass wir für Carazolol, bei dem es sich um eine inaktive Form von Beta2AR handelt, hier ein starkes Signal erhalten, und dort ein schwaches. Und wenn wir an der Spitze von Helix 7, an der Spitze von Helix 6 nachschauen, haben wir eine eher breite Linie, mit einer Schulter hier. Gehen wir nun durch diese Liste der 10 verschiedenen Medikamentenmoleküle, so sehen Sie, dass die Stärke des Signals zwischen seinen 2 Teilen wechselt. Entwirren wir dann die Spektren, erhält man – Sie sehen es hier – die dünnen schwarzen Linien, das Signal des Experiments. Die rote Linie ist eine Komponente. Die blaue Linie ist eine andere Komponente: Dies bedeutet, dass wir zwei chemische Verschiebungen und zwei Linienformen haben. Damit haben wir bereits 4 Variablen, die wir verwenden können, um zu versuchen, das experimentelle Signal zur Deckung zu bringen. Und die breite schwarze Linie überlappt quantitativ das experimentelle Spektrum, was zeigt, dass wir keine Hinweise für die Annahme haben, dass in einem der beiden..... mehr als 2 verschiedene Zustände vorhanden sind... Ein System aus 2 überlappenden Linien. Sie können erkennen, dass sich die relative Intensität der blauen und roten Signale ziemlich drastisch ändert, wenn wir von den inversen Agonisten, zur Apo-Form, zum selektiven Agonisten bis zum vollen Agonisten gehen. Und Sie können sehen, dass wir zum Beispiel für Isoetharine, was hier wäre, eine fast vollständige Aktivierung an der Spitze von Helix 7 haben. Und an der Spitze von Helix 6 haben wir eine Aktivierung von etwa 50 %. Nun, dies ist der Punkt, an dem die Dinge wirklich faszinierend werden. Wie haben wir die blauen oder roten Linien dem inaktiven beziehungsweise aktiven Zustand des Rezeptors zugeordnet? Nun, wir stellten fest, dass die blaue Linie in der Apo-Form und im Komplex mit inversen Agonisten stark besetzt war und dass es nur eine geringe Besetzung der roten Linie gab. Und so stellten wir die Hypothese auf, dass die blaue Linie einem inaktiven Zustand entsprechen musste. Und tatsächlich stellte sich dann heraus, dass die rote Linie, wenn wir aktivierende Medikamente verwendeten, zunahm, d.h. die Besetzung der aktivierten Form des Rezeptors zunahm. Das wichtigste Ergebnis ist in diesem Zusammenhang, dass die Umschaltungen vom inaktiven zum aktiven Zustand, die an der Spitze von Helix 6 und an der Spitze von Helix 7 zu beobachten waren, weitgehend unabhängig voneinander waren. Wir können demnach Signale über Helix 7 ziemlich unabhängig von den über Helix 6 gesendeten Aktivierungssignalen aktivieren. Sie erinnern sich daran, dass Ihnen Dr. Kobilka diese wunderschöne Struktur eines komplexen Beta2AR mit dem G-Protein gezeigt hat. Nun, wir haben uns diese Struktur sehr genau angesehen. Wir stellten fest, dass sich die Spitze von Helix 6 in direktem Kontakt mit dem G-Protein befindet, während die Spitze von Helix 7 sich 15 Angström von der nächsten aktiven Gruppe von Protein G befindet. Die Implikation der Sache ist klar: Die Aktivierung über Helix 6 geht zum Signalweg des G-Proteins. Die Aktivierung von Helix 7 erfolgt über einen offenen Raum. Und nach unabhängigen Hinweisen, die von anderen Arbeitsgruppen stammen, kann man davon ausgehen, dass dies der Signalweg ist, der möglicherweise zur Aktivierung von Kinasen führt, möglicherweise zur Aktivierung von – ich glaube, ich habe dies hier angezeigt – Beta-Arrestin. Das wäre also dieser blaue Signalweg, und die Helix 6 wäre der rote Signalweg über den Teil des G-Proteins. Zum jetzigen Zeitpunkt wissen wir, dass es mindestens 4 Zustände des Inhibitors gibt. Ok, wir haben zwei Zustände an Helix 6 beobachtet, wir haben zwei Zustände an Helix 7 beobachtet. Es ist möglich, dass der an beiden Helices beobachtete inaktive Zustand derselbe ist. Es ist jedoch klarerweise der Fall, dass die Zustände, die an Helix 6 und Helix 7 beobachteten aktivierten Zustände, zwei verschiedene Zustände sind. Wir wollten also mehr über die Grundlage für die Eigenschaften dieser Zustände wissen. Zunächst taten wir dies, indem wir die Thermodynamik und die Kinetik dieses Systems studierten. Hierzu änderten wir die Temperatur von 280 zu 310 K, und Sie können erkennen, dass sich die relativen Intensitäten, die die Besetzungen der beiden Zustände darstellen, dramatisch änderten, als wir die Temperatur änderten. Und diese Änderung war irreversibel. Hier haben wir einen teilweisen und hier einen vollständigen Agonisten. Einen Antagonisten konnten wir nicht untersuchen, weil dann eines der Signale für eine quantitative Analyse stets zu schwach war. Wir untersuchten dies anhand von van’t Hoff-Diagrammen. Es ist ein schönes thermodynamisches Gleichgewicht. Wir erhalten Delta-H-Werte von etwa 40 Kilojoules pro Mol für die Markierungen an der Helix 6 und der Helix 7. Außerdem erhalten wir sehr ähnliche Werte für die Entropie. Diese Werte zeigen auf qualitative Weise einfach an, dass die Strukturunterschiede zwischen dem aktiven und inaktiven Zustand auf mehr als einer Neuanordnung einer einzelnen Seitenkette beruhen. Aller Wahrscheinlichkeit nach müssen sie daher auch wichtige Teile des Polypeptidrückgrats einbeziehen. Als nächstes verwendeten wir NMR-Experimente, zwei Arten von NMR-Experimenten, um die Raten zu untersuchen, mit der die Moleküle zwischen den Konformationen A für aktiv und I für inaktive wechselten. Eines dieser Experimente ist eine zweidimensionale Fluor-Fluor-Austausch-Spektroskopie, ein Experiment, das erstmals von der Arbeitsgruppe von Prof. Ernst, der unmittelbar nach mir sprechen wird, beschrieben wurde. Sie haben hier eine sehr vereinfachte 2D-Darstellung. Hier sehen Sie Querschnitte. Wenn es Austausche von mehr als 10 pro Sekunde gäbe, würden wir hier und dort Cross Peaks haben. Sie würden sich entlang dieser punktierten Linie befinden. Es gibt keinen Hinweis auf einen Cross Peak. Dieses Experiment sagt uns daher, dass der Austausch mit einer Rate von weniger als 10 pro Sekunde stattfindet. Als nächstes setzten wir einen Sättigungstransfer ein. Dies bedeutet, dass man hier ein Signal hat. In diesem Fall ist es das Signal an der Spitze von Helix 7, C327. Wir strahlten die Resonanz ab und überprüften, ob die Wirkung dieser Radiofrequenzstrahlungen auf die blaue Linie vollständig vom direkten Einfluss dieser Abstrahlung abhing oder nicht, und ob es eine zusätzliche Übertragung der Magnetisierung von der roten zur blauen Linie gab. Das Ergebnis war eindeutig. Wir erhielten befriedigende Ergebnisse nur unter der Voraussetzung, dass kein Austausch stattfand. Wenn wir annahmen, dass ein Austausch mit einer Rate von 100 pro Sekunde stattfand, lagen wir weit daneben. Gingen wir davon aus, dass kein Austausch stattfindet, null pro Sekunde, so erhielten wir eine akzeptable Übereinstimmung zwischen den Modelberechnungen und den experimentellen Daten, die durch die schwarzen Rauten dargestellt sind. Das Dia enthält einen Fehler. Dieses T2 sollte hier in Mikrosekunden angezeigt werden, ebenso wie hier. T2 kann nicht länger sein als T1. Entschuldigen Sie diesen Fehler. Die nächste Vorgehensweise, um mehr Informationen über die zwei Zustände zu bekommen, ist die Verwendung von NMR, um direkte Daten über die Struktur zu erhalten, statt reaktions- und thermodynamische Daten. Hierzu müssen wir eine Isotopenmarkierung in die Kette einfügen. Normalerweise führten wir in sämtliche Kohlenstoff-Proton-Bindungen Deuterium ein. Hierdurch wurden die nicht-labilen Wasserstoffatome durch Deuterium ersetzt. Wir hatten dann nur in den Amidgruppen mithilfe von Kernspinresonanz beobachtbare Wasserstoffe. Manchmal führten wir auch an einigen peripheren Stellen an Aminosäureresten protonierte Methylgruppen ein bzw. führten sie wieder ein. Wir haben hierzu vorläufige Daten, ich zeige Sie Ihnen hier. Diese [Untersuchungen] werden jetzt nicht mit Beta2AR, sondern mit einem anderen Rezeptor, dem Rezeptor A2AAR-Adenosine durchgeführt. Und hier sehen Sie ein Korrelationsexperiment, Stickstoff-15-Protonen. Wir vergleichen das Spektrum eines Komplexes mit einem inversen Agonisten, der einen inaktiven Zustand stabilisiert, mit einem Komplex mit einem Agonisten, der sicherstellt, dass wir einen aktiven Zustand haben. In diesem bestimmten Spektralbereich sehen wir einen Spitzenwert, der von hier nach hier wandert. Wir haben die Scheitelpunkte, die sich vollständig überlappen, rot und blau. Wir haben einen anderen Spitzenwert, von dem wir feststellten, dass er von hier nach hier wandert. Also, dies ist sehr vorläufig. Ich möchte es Ihnen jedoch einfach zeigen. Wir sind auf dem Wege, nicht eine neue Struktur eines GPCRs aufzuklären, sondern eine NMR-Spektroskopie einzusetzen, um Strukturdaten über die Art von strukturellen Unterschieden zwischen aktiven und inaktiven Zuständen zu erhalten, die wir aus den Probenexperimenten mit Fluor-NMR nicht bekommen. Hier sehen wir die Indol-NH-Resonanzen, und wir haben einen Scheitelpunkt, der sich – zwischen einem inaktiven und aktiven Zustand – von hier nach hier bewegt. Und wir wissen nicht, woher dies kommt. Wir haben hier noch keinen Zusammenhang festgestellt. Also, wie ich sagte, wir stehen hier noch am Anfang. Dies sind laufende Arbeiten. Zum Schluss, wenn ich noch 2 Minuten haben dürfte. Ist das ok? Ich überschreite ständig die Zeit. Ich habe diese schlechte Angewohnheit. Warten Sie nur auf Prof. Ernst. Wir beiden konkurrieren in dieser Sache. Ich möchte Ihnen lediglich zeigen, wie dies weitergeht. Als wir Beta2AR mit dieser Fluor-NMR-Technology studierten, hatten wir ganz einfach Glück, weil wir in Beta2AR 16 Reste hatten, die direkt auf der zytoplasmatischen Oberfläche des Proteins saßen. Wenn Sie nun zu anderen weitergehen. Wir untersuchen gegenwärtig mehrere Rezeptoren. Pro Doktorand wird ein Rezeptor untersucht, so dass wir ein paar Jahren an jedem Projekt arbeiten können. Postdocs haben zu wenig Zeit dafür. Dies ist H2AR. Und hier haben wir keine Cysteine oder Lysine. Sehen Sie, man muss einige Seitenketten haben, die mit einem bestimmten chemischen Reagenz speziell markiert werden können. Hier liegt also kein Cystein vor. Aus technischen Gründen wollen wir gegenwärtig Cysteine verwenden. Wir haben also eine Menge Cysteine, in diesem Falle etwa 12 Cysteine, die zur Struktur des Proteins gehören. Dies ist eine Kristallstruktur und daher ist die Fusion mit T4L angezeigt. Für die NMR-Experimente verwenden wir das Fusionsprotein nicht, so dass wir einfach, dass wir die Schleife hier geschossen haben und mit der nahezu nativen Form des Proteins arbeiten. Nun, zusätzlich zur Arbeit vor dem Hintergrund, den wir durch Fluor-Markierungen der angestammten Cysteine schaffen, müssen wir Cysteine an gewünschte Stellen bringen, an denen wir hoffen, Informationen zur Signalübertragung zu erhalten. Auf ähnliche Weise, wie wir dies mit Beta2AR getan haben. Dies ist sehr viel Arbeit, weil wir für jede solche Änderung in der Aminosäurensequenz erneut prüfen müssen, dass der Rezeptor seine Aktivität behält und so weiter und so fort. Im Fall von A2AAR sind wir wahrscheinlich fast an dem Punkt angelangt, ab dem wir nach ähnlichen Prinzipien arbeiten können wie bei Beta2AR. Wir untersuchen hier 2 verschiedene orthosterische Liganden. Beides sind Agonisten mit unterschiedlichen Wirksamkeiten. UK432097 hat eine höhere Effizienz als NECA. Und was Sie hier sehen, ist das starke Hintergrundsignal. Wir wissen nicht genau, woher es stammt. Hier stammt es von der Hintergrundmarkierung im oberen Teil des Moleküls. Aber hier haben wir ein Paar von Linien, die ihre Intensität ändern, wenn wir von NECA, das sind die blauen Signale, zu UK432097 gehen, wo wir diese 2 Signale haben. Es sieht also so aus, als ob Lukas [Name], der hierüber forscht, auf ein gutes Arbeitsgebiet zugeht, auf dem er sein Promotionsstudium verfolgen kann. Hiermit möchte ich schließen. Und darüber, da bin ich sicher, werden sie sich freuen. Ich zeige Ihnen nochmals die schematische Struktur eines GPCRs. Ich habe versucht, Ihnen zu veranschaulichen, wie wichtig es ist, mehrere Techniken bei Kristallen und in Lösungen einzusetzen, die es möglich machen, ein hochaufgelöstes Gerüst der Struktur zu erhalten. Andere Methoden sind möglicherweise weniger präzise und genau, sie funktionieren jedoch bei Zuständen desselben Moleküls, bei denen seine Reaktionsdynamik nicht blockiert ist. Und diese Kombination dieser Techniken führt uns vielleicht schließlich dahin, Einsichten zu gewinnen, die ausreichen, um denjenigen fruchtbare Informationen geben zu können, die dieses Wissen anwenden wollen, in diesem Fall, dem Fall dieser Klasse von Proteinen, hauptsächlich auf dem Gebiet der Medikamenten-Entwicklung und des Wirkstoffdesigns. Ich danke Ihnen für Ihre Aufmerksamkeit. Applaus.

Kurt Wüthrich (2013)

Conformational Plasticity of G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) studied by NMR in Solution

Kurt Wüthrich (2013)

Conformational Plasticity of G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) studied by NMR in Solution

Abstract

As an introduction, some principles of nuclear spin physics applying to studies of integral membrane proteins (IMP) will be reviewed. Applications of resulting nuclear magnetic resonance (NMR) techniques will then be illustrated with studies of G-protein-coupled receptors (GPCR). GPCRs are targets for more than 30% of the presently available prescription drugs approved for use in human medicine. The family of GPCRs are IMPs located on the cell surface, where they mediate a wide range of intercellular communications. Binding of a variety of drug molecules to the extracellular GPCR surface elicits intracellular signaling by conformational changes in locations at distances of more than 30 A from the Iigand binding site. We use solution NMR techniques to collect data on the associated allostery-related conformational equilibria and rate processes. Specifically, 19F NMR spectroscopy and site-specific mutagenesis is used to monitor equilibria between inactive and activated states of GPCRs, which affords novel insights into the pathways for signaling to intracellular partner proteins.

References:
Liu, J.J., Horst, R., Katritch, V., Stevens, R.C. and Wüthrich, K. (2012) Science 335, 1106-1110.
Biased signaling pathways in ß2-adrenergic receptor characterized by 19 F-NMR.

Stevens, R.C., Cherezov, V., Katritch, V., Abagyan. R., Kuhn, P., Rosen, H. and Wüthrich, K. (2013) Nat. Rev.Drug Disc. 12, 1-10.
The GPCR Network: a large-scale collaboration to determine human GPCR structure and function.

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