Roger  Tsien (2011) - Engineering Molecules for Fun, Profit, and Clinical Relevance

Molecules to observe and manipulate biological systems and disease processes can be devised by a variety of strategies, ranging from pure chemical design and total synthesis to genome mining and high-throughput directed evolution

I want to tell you today about some of my history and some of what we are most interested in now. I'm hoping I'm trying to pitch it to what young people typically most want to know about becoming a scientist, with some examples from my own career and some of what we are interested in now. If I have a theme it's that we are molecular engineers and that distinguishes us a little bit from the traditional sort of biological and physiological research which is based on trying to understand how do natural bio molecules and biological systems work. And the great advantage of that is that anything you discover that's true will last forever. And is something that we deeply understand about nature. Likewise in the chemical world the most prestigious chemical research, at least when I was a graduate student and post-doc, was the field of how to artificially re-synthesise natural bio molecules. So again people went into nature, found molecules that had complicated structures and proved whether or not that they could re-synthesise them. Typically by means other than the way the biological organism actually made them. But instead that didn't really grab me personally. I came to the preference to work on this question of can we design actually our own new molecules. And, of course we then have to build them, that will perform amusing and useful functions in biology. So this way we have enjoyment of working on biological systems which are still the most intricate and fascinating. And yet we have some creativity where we design molecules instead of simply trying to work out what nature has already figured out. And therefore it's a little bit like architecture or sculpture, and it has an ascetic element then it also has a less competitive element because no two sculptors will ever make the same sculpture. No two architects will ever design exactly the same building. Whereas you can have five groups all trying to understand a particular biological phenomenon and in principle there is one relatively correct answer. The first person who gets it wins the Nobel and the other four are consigned to the ash heap. That is I think too competitive for the likes of me. So there's the advantage when you create something you are not in such direct competition. This was even understood by Richard Feynman the famous physicist who said "what I cannot create I do not understand". That's the real test of when you have understood the molecules is when you can make something new out of them and because up to that point you are just rational. You think you understand and you say oh biology works this way but the real proof is that you can do something brand new with it. Not just explain after the fact. Traditionally it was assumed that only drug companies had the resources to, the multi- large groups necessary to do this sort of work, but I didn't care. I wanted to try this in my own lab. Now you might ask why? Well a lot of it in the end you have to figure out what you personally are like. And one of the features about me, and I've been criticised or commented in previous Lindau meetings that people didn't like me psychoanalysing myself but hey, you got to do this in your career if you want to be serious. You want to think what are you good at and what are you not good at. And in my case I happened to come from a whole family of engineers, my father, two brothers, two uncles, a bunch of cousins and yet I felt that biology had the most interesting questions. I didn't want to be an electrical or computer engineer. It also happens that I have been fascinated since childhood by pretty colours and therefore by the means that you make pretty colours. But one of the most important aspects is that I'm the youngest of three boys and it's characteristic that the youngest children have to find an ecological niche that's distinct from their parents and elder siblings. This is the subject of an entire book here called "Born to Rebel" by Frank Sulloway and any of you who are youngest children or any of you who are older children and want to understand your bratty little brothers and sisters, you might find this an interesting book. And it's not surprisingly written by a youngest child, Frank Sulloway admits that that's what he is. And his shining example is Darwin who is the youngest in his family. And Darwin therefore was not going to inherit the land in the British aristocracy. He was not going to be sent to the army. Traditionally the role of the third son was to be sent to the clergy, to become a clergyman and that's what he started his education. And then he found he really wasn't interested, or that interested in preaching. But much more interested in bugs and beetles and insects and animals and rocks and so on. And that set him on the path of natural history and that's partly because psychologically he needed to break away from the mould. And that's all what Frank Sulloway is writing about there. So I'm afraid a certain amount of that came to me that my elder brothers and father were regular engineers, or at least they started that way, so I had to do something different. The one thing they all hated was chemistry that's maybe why I ended up doing chemistry. And furthermore I found that at least when I was starting inter-disciplinary barriers prevented most biologists from understanding chemistry. They knew about molecules to the extent of being able to build a linear alphabetic string, you know twenty amino acids, make up of proteins and four make up DNA and one extra makes up RNA. And other than those twenty-five letters most people in biology couldn't do chemistry that was deviated from those linear building blocks. And that meant big opportunities and few competitors and that's another theme I don't particularly like competition. And so I'm always trying to get away from it and find some area that's relatively under-populated where a little bit of work can produce a rather large bang, we hope. And so I'm going to cut past a lot of the early stuff we did for lack of time and go onto the beginning of our work on GFP, Green Flouescent Protein, which I have to mention because of course that's what took me to Stockholm and eventually to here. And this is a video of the jelly fish and I'm going to try to reproduce for you now, I think this is the only video I know, despite searching the internet, this is the only video of the actual glow of the jelly fish. And I did it after the Nobel because I found that I needed it for talks like this. Now I had to go all the way up to Alaska because the jelly fish is no longer available in Friday Harbour where Professor Shimomura actually discovered it, because of pollution and so on. And run off or maybe global warming or a mixture of causes it's basically extinct at Friday Harbour. So I had to go up to Alaska and let's try to run this movie. This is a beaker with a jelly fish in it, poor little jelly fish is trapped in there and you actually can see it by this glow which is we are shining a UV light on it. And this is the glow of the GFP in the ring around the periphery of the jelly fish. In a moment we are going to, after a little bit of hemming and hawing we have to turn out the lights so then we can poke the jelly fish to make it glow by bioluminescence. But of course in the dark it's a little hard to poke it so we had to practice making sure that the stick was in right place. You can hear a bit of recorded sound, you can have the sound up a little bit, and jelly fish is slightly rotating here. Get the stick in place, turn off the lights. So a real demonstration such as it is on film, one of the rare chances I get to do science...ha-ha. Okay, so that's the initial phenomenon not awfully impressive and out of that was built the three shares of the Nobel Prize. Plus a small revolution in biology because the protein that changes the colour of the flash from blue to green is the green fluorescent protein. And that protein was cloned by Douglas Prasher and then shown to work by Marty Chalfie in other organisms. And here for example you can make a mouse that's glowing fluorescently throughout its body. Because by putting the DNA for the green fluorescent protein into the mouse now the mouse and all this progeny once we've incorporated it in the germ line now the mouse is permanently green. Just for those of you who are interested in greenness of chemistry this is encoded by DNA, not toxic, synthesisable by any organism that can tolerate air. And it does so in 230 sequential compensations roughly. One cyclization, one or two autoxidations goes on 100% yield in aqueous solution and the only by-product is hydrogen peroxide. And so that's pretty good for so-called green chemistry. We changed its colours and fixed up the brightness of the green from the jelly fish, made a cyan, a blue version, eventually a yellow version. All of that with the help of the crystal structure which I guess I didn't have in here but it's familiar to most of you as an eleven stranded beta barrel almost perfectly cylindrical. We've used it now to do all sorts of biochemistry inside cells. But we want to not just tag proteins that's sort of 90% of what most people want to do. But we particularly from my past interest wanted to see what the inter-cellular biochemistry was doing. And so we devised ways of making sensors artificially in which say we would tie a cyan fluorescent protein and a yellow fluorescent protein together with a protease sensitive linker. And then we would capitalise on the quantum mechanical phenomenon of fluorescent resonance energy transfer or FRET. Where if the CFP and YF P are in proximity they talk to each other. The cyan protein when excited transfers its energy to the yellow florescent protein. But if we break that linkage in the two halves of the molecule drift apart then we disrupt energy transfer and we go back to omitting cyan. This can be used to measure calcium if you put a calcium sensitive linker there you can look at cyclic AMP by grafting this onto the cyclic AMP dependent protein kinase. Ed Fischer is here and he shared the Nobel for some of these important discoveries about protein kinases. And in general phosphorylation we can also make sense of it this way by using phosphor amino acid binding proteins together with protein kinase substrates. I'll show you just one example that's all I have time for involving a calcium change. And this is looking at the early development of a zebra fish embryo where red means high calcium and the red pre-stages and predicts every cleavage furrow. So just before the cleavage furrow happens you see this wave of high red that is the high calcium, which then triggers actomyosin like contractions that then pinch the daughter cells apart by tightening the belt and constricting them. And this goes on and on over minutes past fertilization, this of course time-lapse and after a while the divisions become essentially a synchronous and so on. The first one was the most spectacular. Because it was a nice big single equatorial belt. This is the work of my former post-doc Atsushi Miyawaki. So this is just an example of the fun types of things you can learn biologically, but I picked it of course because it's a pretty movie. I told you that I loved pretty colours and it was always very frustrating to me that as a kid my favourite colour was bright red and that the green fluorescent protein refused to give us any reproducible bright red colours. It got us cyan and blues and yellowish yucky green. But never a good honest red. And so it was a revelation when a Russian group showed that corals which are actually distant biological relatives jelly fish, very distant. But they of course have many colours but what nobody had guessed before then was that some of those colours are exactly homologous to the jelly fish GFP. And in particular they picked out this protein from discosoma that they called DsRed, for its bright red colour. But they didn't know what the structure of the chromophor was or how this protein became red. And this was something we managed to contribute by doing mass spec on protein, on hydrolysis and so on. Here we've actually drawn for you the structure, the core structure of the DsRed chromophor consisting of a hydroxybenzylidine imidazolinone coupled to an acylimine. That's quite a mouth full. But here is it drawn out using the actual bacteria that expressed DsRed, using them as the ink. So we have some dextrous people in the lab who can use sterile toothpicks and pick up bacteria, draw them on the petri-dish in the scale of about 1 angstrom = 1cm on the plate. And so you both get to see the beautiful red colour of the real protein together with the structure of the chromophor. And it turned out to be not so difficult to change the colour of this DsRed to a wide variety of colours that pretty much filled out the rest of the spectrum. You see this is what we managed to get out of the jelly fish. And with the coral proteins we were able to diversify them into this whole family and the only question left was what to call these guys. There were so many of them all at once that we had to come up with a more interesting nomenclature. And after a lot of argument in the lab we came up with these notoriously fruity names where the name of the fruit gives you a little bit of a mnemonic for the colour. Like Honeydew, banana orange, tomato, tangerine, strawberry, cherry etc. And again these have proven fairly popular but of course the field keeps moving on, this was 2004 and there are many, many other flavours now available. But just to give you one example of the use of these different colours. Here I've taken an example from the monitoring of the cell cycle. Using the cell cycle dependent synthesis and breakdown of certain proteins and you'll hear more about the mechanism of breakdown from Prof. Hershko and Prof. Ciechanover later this morning so it's actually appropriate. These are cells which are filled with a pair of proteins and we arranged so that one protein that's basically greenish, it's actually yellowish green is made during mitosis. It's made during the G2 phase of the cell cycle, G2S. And then it's broken down during interface. There are known trigger signals that tell a protein make me now and break me down at another stage. And that's how we control the cell cycle as Tim Hunt got his prize for. And then we've another set of proteins that do exactly the opposite, majoring inter-phase and broken down during the active dividing part of the cell cycle. And we use those signals to control the red protein, which actually is M cherry. And so during the cell cycle when the cell is actively dividing it would be green because it's making green and destroying red. And then when it's in inter-phase it will be red and not green. It's just like stop lights. Atsushi Miyawaki could have picked it the other way round it's totally arbitrary which ones you make and which ones you break down but it's easier for all of us who are used to traffic lights to make green being go and red being stop. And so if this movie will play, you will see one week in the life of these two cells, as they divide and every time they divide they cycle between green and red, in this fun time-lapse way. And so this again indulges my love of pretty colours. And eventually most of them sort of get a little bit arrested by density dependent mechanisms and that's why they are mostly red near the end. Now this is just a stunt here, again it makes a pretty movie the real biological application of the cell cycle in large masses of cancer cells inside the body where you don't have the ability to watch them one by one in time-lapse. But here the biochemistry colour read out is tremendously helpful. And I take one last example from fluorescent proteins again of a visually spectacular sort. Many of you will know of the beautiful work that Jeff Lichtman who published a way they combinatorially turn on and off red, yellow and blue proteins by sort of rolling the dice on each one of them. It's like pulling a molecular slot machine and depending on how the tumblers settle you can come out with either all of them switched on. In which case you get a sort of white, or you could have predominantly green or predominantly one green and two red makes orange and so on. So there's this whole combinatorial gamut of colours that each neuron picks its own colour by pulling the slot machine independently of its neighbours. And with that you get these beautiful sorts of maps like here. Where all the cells in the dentigerus come out with different colours and the usefulness is that this is like the colour coding on wires that electronic engineers use. They use coloured wires to help them trace from here to there, you don't have to follow the detailed pathway if they match in this beautiful colour pattern. You can track them over long distances. That's just one little example. So that's perhaps my most successful, influential type of work scientifically. But I want to admit that just because you are a Nobel Prize winner doesn't mean you have some humiliating failures and I want to confess. For example one of our big failures which started with a good idea and this is an email I wrote to a man called Peter Hegemann all the way back in 1999, saying, Professor Hegemann I've been interested for some time in potential methods by which mammalian neurons might be transfected with genes whose product could permit light-triggering of depolarization and action potentials. And this really was not such a brilliant idea. We have long been interested in ways of stimulating cells with light not just reading out their biochemical activity. We had already done so with small molecules. Now with the power of GFP we are getting much better at reading say calcium signals or all sorts of biochemical signals in the cell and it became obvious let's try to do that genetically as well. And I looked around in the literature what is the simplest biological system where you can shine light and turn on a cell and that when you read the literature was probably green algae based on the work do Professor Hegemann who was a plant biologist. And that's why I wrote to him hoping that he could give me some of his genes that might act for us the way that Doug Prasher's gift of the jelly fish GFP had made our work possible now. I'm not a good gene cloner from scratch. We go and find interesting genes that other people may not have recognised the potential usefulness off and we asked them and Professor Hegemann was happy to give us some of the genes for the absence of vulvox in Chlamydomonas. Unfortunately what actually happened is that Rene Meijer a student in my lab spent two or three years trying to get those genes to work and the worse thing is that for one week it seemed to be working really well. And that later proved to be an artefact that we didn't know it at the time. I kept this going for a year or two trying to reproduce that result that eventually proved to be a waste of time. And so then when we finally gave up on these two proteins we went into the genome or Rene went into the genome and fished out two more plausible candidates. Better candidates than these ones and he started with ChR1 and he spent the year trying to make it work and he failed. And by that point he failed on three proteins - that's chlamyopsin, vovoxopsin, and ChR1, and he said Prof. Tsien, I need a new project. Because I got to get a PhD and so we started something completely different, we left ChR2 in the freezer and that turned out to be the right one. That other people have now taken in all over the place in neurobiology and I suspect in a few years we will get those people appropriate Nobel Prize including Hegemann and his collaborators. Rene did get his PhD by the way but he is discouraged by his little foray into biology he went back to being an optical instrumentation engineer. And he actually seems to be quite happy and not bitter at me for having bobbled his attempt that otherwise might have gotten him famous. So just because you think that, I know, I'm up here I must be imminent, no we make mistakes and foul up projects too. So I want to end with our most recent efforts which are to start apply molecular imagining to patients. This has to do partly with my wish in my declining phase to do something more clinically relevant than the work we've done up to now who's main clinical relevance was to provide tools for high through-put drugs screening, and that's okay but it's pretty indirect. And we didn't have much involvement. Also you may have noticed that what we are developing from the pure biologist point of view it can be dismissed as just techniques development. Oh, the Tsien Lab they just make techniques. Now from a chemistry point of view I think it's pretty interesting engineering. But from the biologist point of view and also prestigious journals point of view. But the great thing is that when you start to work on something clinically relevant the very same thought process suddenly becomes translational research. Bench to bedside and this is what the granting agencies think is the greatest stuff. And it's absolutely no different except that you put a veneer of clinical relevance on it. But you know it's not just a veneer, my father, my nephew, my PhD supervisor, many colleagues for example died of cancer. My mother had a stroke actually recently. I was diagnosed with cancer and fortunately I'm okay. And so all of this concentrates one's mind. The problem with fluorescent proteins is what makes them so powerful in biology is that they are codable by DNA. Which means that we can directly tap in all the power of molecular biology and make them sensitive to you know the fundamentals of life processes. Unfortunately the one place that fluorescent proteins become the gene transfer or genetics a handicap is when you want to work in real sick people. Now, it's one thing to work on stem cells that are derived from humans or human cells that are taken out of a person. But when you want to go back into a live person it is neither technically feasible nor ethically allowable right now at least to put say a jelly fish gene into you if you were the patient. Because you know now we have to ask what good is it to you personally. It may be very good for us as researchers, us, but is it good for you. And further more humans are two thick and opaque for fluorescents even though fluorescents has obviously been pretty good to me. So we need other techniques like magnetic resonance imaging, MRI is the subject of its own set of Nobel Prizes. It's great except that when we want to use molecular contrast it's not very sensitive, it needs a lot of the contrast agent to show up, those typically are Gd chelates. So what do we do? Well we study proteases in cancer because they are biologically important, they are actually responsible and necessary for metastasis, which is when cancer cells leave the primary tumour and go to distance sites. That's what kills cancer patients. Not the primary tumour genesis though of course that's where everything starts. But what kills people is this migration to distant organs. And that requires that the cancer cells acquire the ability to cut their way through normal tissue including the basement endothelial membrane that lines blood vessels, including normal extra cell matrix. And they use enzymes such as matrix metalloproteinases 2 and 9 to do so and fairly universally, perhaps you could escape that requirement but it's nearly universal. So we try to sense the activity of those proteases that enable metastasis because of its biological relevance. And also because it's amenable to the mechanism I'm about to describe where if you have a highly positively charged set of amino acids, a row of arginines for example they love to stick to the outside of cells by electro-static interaction. And then go in by processes that are still somewhat poorly understood. But this process as I just described is electro-static but very indiscriminate because essentially all cells have negative charges or negatively charged coating around their surface. So what we contributed beyond this known phenomenon is the idea of masking the positive charges with a non-stick backing paper made out of equal set of negative charges. And the polycadine and polyamine, the arginines and glutamates neutralise each other and keep each other out of the way until we cut the linker, which was shown here in green and we used the MMPs to cut the linker. So the tumour cells but not normal cells have the ability to tear off the backing paper and restore the stickiness, unmask the stickiness of the polycadine which then sticks to the tissue. So an example of what it looks like is here in a tumour that has been labelled with GFP, now this is an example of the usefulness of GFP, but this is something can only do in a mouse not in a human being. Human tumours never come glowing green, not in a patient at least. But we can inject our synthetic molecule which has a deep red dye on it and because of this mechanism I've just described it labels the cancer and makes it glow red. Because only the cancer can cut this linker right in the middle between the glycine and leucine unmasked the negative, throw away the negative charges; unmask the positive charges which then cause adhesion to the cell. As an important control if we remake the molecule with d-amino acids here. So we haven't changed the molecular weight. We haven't changed the hydrophobicity but this otherwise matching molecule is not an enzyme substrate then the tumour does not light up. Then we said we wanted to be able to work in magnetic resonance imaging and this is the evidence that we can. Here is a mouse with a tumour before we injected it and in this initial controlled state the tumour is not any different in MRI brightness from the rest of the tumour. But after we've injected the correct molecule which in this case is a little more complicated but has six of these peptides hanging off it now the tumour lights up. And this is something we hope can be done on human beings, you could inject the same molecule and it could be even done as part of your annual check-up. And we would see by anything glowing whether you had a cancer anywhere in your body because MRI can scan throughout the body. This is the control where the material we injected has got the d-amino acids and so it doesn't accumulate. And it's important to detect cancer early because if we could detect cancer at this sort of stage then when the tumour is localised we have a good chance of survival. Whereas if we wait till out here it costs a huge amount more to the health care system like a hundred times more but the prognosis is terrible and the cancer is generally caught too late. Unfortunately industry prefers to work out here because a) they can make a lot more money and b) it's a lot easier to enrol the patients when they are on the verge of death than when they are, most of them are still relatively healthy when you are trying to do the screening. So let me end up with one last movie or so which is showing you this in action and here I want to introduce the idea. We almost have a separate type of peptide that can stain peripheral nerve which is what we are most afraid of cutting during surgical operations. And here's the movie, in the beginning state you could hardly see where the tumour was. In the fluorescent mode here when we turn looking at fluorescent you can see where the tumour is but you can't operate. The best is to combine the two, this is white light alone can you see where the tumour is? No? Fluorescent you can but you can't operate but we use the computer to combine the views fifteen times a second. So that it looks as though the tumour has GFP but it's really not GFP it's our synthetic molecule. And now we've revealed, here's a big massive tumour remember because it was glowing green in fake colour, that means it's got the protease active. And here's the nerve that's been exposed but you might be ready to try to save the nerve and cut out the tumour by cutting along this line. But that would be a mistake. Because in a moment now when we check with the nerve peptide, where the nerve runs this is the missing branch, the hidden branch diverted by the tumour. This is the branch of the nerve that you couldn't have seen by regular white light. And in our overlay mode we colour it light blue just because it's another colour that's not in the body and now the job of the surgeon is made much more easy. Cut out the green stuff, leave the light blue stuff and the light blue is the nerves that you don't want to injure and there they are. So by mechanisms like this we can actually improve the survival after surgery in various tumour models and here's one where we happened to be able to raise the survival rate about a factor of five. Of course much more work needs to be done and my last slide is some lessons for young scientists. Try to find important problems that will either influence a lot of other research, answer important questions or maybe give you clinical relevance. But they have to be ones that give you some internal sensual pleasure or at least on the other side make you more comfortable with your neurosis. Including for example getting away from my older relatives. Accept that your batting average will be low but hopefully not zero. It's better to have a lot of ideas and you saw that in some cases we struck out like in the Channelrhodopsin, in other cases we were lucky. You have to learn to make lemonade from lemons, nature often gives you strange directions and learn to exploit them. Not necessarily stick forever with your original plan. I will mention by the way something completely non-scientific, but that if you want to say alive and healthy for longer enough to outlive your competitors at least scientifically I do suggest that you get regular exercise. And there's now scientific evidence that having exercise actually promotes the growth of stem cells in the brain and injects the pulses of growth hormones and so on. It's good for you, particularly especially in a meeting like this remember prizes are ultimately a matter of luck, you try lots of things not necessarily your most brilliant ideas, maybe the ones that are most successful do not be motivated or impressed by prizes because you cannot predict them and you cannot run your life by them. And just because so many people want to have our signatures or photographs and think that we are some sort of idol I hope to have shown you that we have a field to play just like everybody else. Of course it's absolutely crucial you have to find the right collaborators both junior and senior and you exploit them but in a kind way so that both of you benefit. And only that way can we do the best science. And so here with one of our final pictures painted with fluorescent bacteria are a lot of the people who were responsible for this work. Thank you.

Ich möchte Ihnen heute etwas über meine Geschichte erzählen und darüber, wofür ich mich heute am meisten interessiere. Ich hoffe, dass ich mich bemüht habe, es an dem zu orientieren, was junge Menschen heute typischerweise an der beruflichen Laufbahn eines Wissenschaftlers am interessantesten finden, mit einigen Beispielen aus meiner eigenen Karriere und einigen, an denen ich heute interessiert bin. Wenn ich ein Thema habe, dann ist es dies: dass wir Molekularingenieure sind. Das unterscheidet uns ein wenig von der traditionellen Art biologischer und physiologischer Forschung, die auf dem Versuch beruht, zu verstehen, wie natürliche Biomoleküle und biologische Systeme funktionieren. Und der große Vorteil daran ist, dass alles, was man entdeckt, für immer wahr sein wird. Dies entspricht unserem tiefen Verständnis der Natur. In ähnlicher Weise war in der Welt der Chemie die angesehendste Forschung, zumindest als ich Doktorand und Postdoc war, das Forschungsgebiet, das sich mit dem Problem beschäftigte, wie man natürliche Bio-Moleküle künstlich resynthetisiert. Die Leute gingen in die Natur, fanden Moleküle mit komplizierten Strukturen und bewiesen, ob Sie sie resynthetisieren konnten oder nicht, normalerweise mit Methoden, die sich von denen unterscheiden, die der biologische Organismus tatsächlich verwendet. Aber trotzdem hat mich das persönlich nicht ergriffen. Ich zog es vor, die Frage zu bearbeiten, ob wir unsere eigenen, neuen Moleküle entwickeln konnten. Und dann müssen wir sie natürlich herstellen, Moleküle, die unterhaltsame und nützliche Funktionen erfüllen. Auf diese Weise haben wir die Freude, über biologische Systeme zu arbeiten, die nach wie vor die kompliziertesten und faszinierendsten sind. Und dennoch haben wir einige Kreativität, indem wir Moleküle entwickeln, statt einfach nur zu versuchen herauszufinden, was die Natur bereits herausgefunden hat. Daher ist dies ein wenig wie in der Architektur oder wie das Herstellen von Skulpturen, und es enthält ein ästhetisches Element. Offensichtlich ist man hierbei auch weniger einer Konkurrenz ausgesetzt, denn zwei Bildhauer erschaffen niemals dieselbe Statue. Keine zwei Architekten entwerfen jemals dasselbe Gebäude, während man fünf Gruppen haben kann, die alle versuchen, ein bestimmtes biologisches Phänomen zu verstehen, und im Prinzip gibt es eine relativ richtige Antwort. Der erste Forscher, der sie findet, erhält den Nobelpreis, und die vier andere landen auf dem Abfallhaufen. Das ist für Leute wie mich zu viel Konkurrenz. Darin besteht der Vorteil: Wenn man selbst etwas hervorbringt, befindet man sich nicht in solch direktem Wettbewerb. Dies wurde sogar von dem berühmten Physiker Richard Feynman verstanden, der sagte: "Was ich nicht herstellen kann, verstehe ich nicht". Der wirkliche Test, ob man Moleküle verstanden hat, besteht darin, ob man etwas Neues aus ihnen machen kann, weil man bis zu diesem Punkt nur denkt, dass man etwas verstanden hat und sich sagt: Doch der wirkliche Beweis besteht darin, dass man etwas völlig Neues damit machen, nicht lediglich die vorhandenen Fakten erklären kann. Herkömmlicherweise nahm man an, dass nur Pharma-Unternehmen, große multinationale Firmen, über die Ressourcen verfügen, die erforderlich sind, um diese Art von Arbeit durchzuführen, doch das war mir gleichgültig. Ich wollte dies in meinem eigenen Labor versuchen. Nun mögen Sie sich vielleicht fragen: Warum? Nun, vieles hat schließlich damit zu tun, dass man herausfinden muss, was für ein Mensch man ist, und eine meiner persönlichen Eigenschaften..., und man hat mich auf früheren Lindau-Treffen dafür kritisiert oder man hat es kommentiert, dass es die Leute nicht mögen, wenn ich mich selbst psychoanalysiere. Doch, hey, man muss dies auf seinem Berufsweg tun, wenn man ihn ernst nimmt. Man möchte sich fragen, wo die eigenen Stärken und Schwächen liegen. Und in meinem Fall ist es so, dass ich aus einer ganzen Familie von Ingenieuren stamme: mein Vater, zwei Brüder, zwei Onkel, eine Reihe von Cousins. Und doch schien es mir, dass die Biologie die interessantesten Fragen stellt. Ich wollte kein Elektro- oder Computeringenieur werden. Außerdem trifft es sich, dass ich seit meiner Kindheit von schönen Farben fasziniert war, und daher auch von den Methoden, mit denen man sie herstellt. Doch einer der wichtigsten Aspekte ist, dass ich der jüngste von drei Brüdern bin, und es ist charakteristisch, dass die jüngsten Kinder eine ökologische Nische finden müssen, die von derjenigen ihrer Eltern und Geschwister verschieden ist. Dies ist das Thema eines ganzen Buches mit dem Titel "Zur Rebellion geboren" von Frank Sulloway, und alle unter Ihnen, die die Jüngsten in ihren Familien sind, und alle, die ältere Geschwister sind und ihre biestigen kleinen Brüder und Schwestern verstehen wollen, werden dieses Buch vielleicht interessant finden. Es wird niemanden erstaunen, dass es von einem jüngsten Kind geschrieben wurde. Frank Sulloway gibt zu, dass er eins ist. Sein Paradebeispiel ist Darwin, der der jüngste in seiner Familie war. Darwin würde daher nicht das Land der britischen Aristokratie erben. Er würde nicht zur Armee geschickt werden. Traditionellerweise wurde der dritte Sohn in den Klerus geschickt, um Pfarrer zu werden, und mit diesem Ziel begann er seine Ausbildung. Und dann stellt er fest, dass er wirklich nicht übermäßig daran interessiert war, zu predigen. Dafür aber umso mehr an allen möglichen Krabbeltieren wie Käfern und Insekten und an Tieren und Gesteinen. Und das brachte ihn auf den Weg der Naturgeschichte, und der Grund dafür ist teilweise, dass er sich psychologisch von der für ihn bestimmten Laufbahn distanzieren musste. Und über all diese Dinge schreibt Frank Sullivan in seinem Buch. Ich fürchte, dass diese Dinge teilweise auch für mich galten, weil meine älteren Brüder und mein Vater Ingenieure waren, bzw. zumindest zunächst diese Richtung eingeschlagen haben. Ich musste also etwas anderes machen. Das eine, was sie alle hassten, war die Chemie. Das ist vielleicht der Grund dafür, warum ich schließlich Chemie studierte. Und darüber hinaus hinderten nach meiner Meinung - zumindest als ich mein Studium begann - interdisziplinäre Barrieren die meisten Biologen daran, die Chemie zu verstehen. Sie wussten genug über Moleküle, um daraus eine lineare alphabetische Kette herzustellen. Proteine bestehen aus 20 verschiedenen Aminosäuren, DNA aus 4 und RNA aus einer zusätzlichen Aminosäure. Und mit Ausnahme dieser 25 Buchstaben verstanden die meisten Leute in der Biologie nichts von der Chemie, die von diesen linearen Bausteinen abwich. Und das bedeutete, dass man große Chancen vor sich hatte und wenige Konkurrenten. Und das ist ein anderes Thema: Ich mag Konkurrenz nicht besonders. Daher bemühe ich mich stets, ihr auszuweichen und ein Gebiet zu finden, das relativ dünn besiedelt ist, auf dem ein wenig Arbeit zu ziemlich großen Resultaten führen kann - so hoffen wir zumindest. Aus Zeitgründen werde ich daher eine große Menge meiner frühen Arbeiten übergehen und gleich zum Beginn meiner Arbeit über GFP, grün fluoreszierendes Protein, springen. Die muss ich erwähnen, denn sie ist natürlich der Grund, warum ich nach Stockholm eingeladen wurde und dann schließlich hierher. Dies ist ein Video der Qualle, und ich werde versuchen, es Ihnen zu zeigen. Ich glaube, dass dies - trotz einer Suche im Internet - das einzige mir bekannte Video ist, dass es das einzige Video ist, das das Leuchten der Qualle zeigt. Ich habe es nach meinem Nobelvortrag aufgenommen, weil ich feststellte, dass ich es für Vorträge wie diesen benötigte. Ich musste nun bis nach Alaska reisen, weil die Qualle aufgrund von Umweltverschmutzung usw. in Friday Harbour, wo sie von Professor Shimomura entdeckt wurde, nicht mehr zu finden ist. Oder vielleicht wurde sie vertrieben oder ist aufgrund des Global Warming oder aus verschiedenen Gründen verschwunden. Zumindest ist sie in Friday Harbour nicht mehr vorhanden. Ich musste also bis Alaska reisen. Lassen Sie uns versuchen, dieses Video abzuspielen. Dies ist ein Becher, in dem sich eine Qualle befindet. Die arme kleine Qualle ist darin gefangen, und Sie können sie an diesem Leuchten erkennen, wenn wir sie mit UV-Licht bescheinen. Und dies ist das Leuchten des GFP, im Ring um den äußeren Rand der Qualle. Gleich werden wir .... Nach einigem Herumdrucksen müssen wir das Licht ausmachen. Dann können wir die Qualle anstubsen, um sie durch die Biolumineszenz zum Leuchten zu bringen. Im Dunkeln ist es natürlich etwas schwer, sie anzustubsen. Wir mussten es daher üben, um sicherzustellen, dass der Stock sich an der richtigen Stelle befand. Können Sie die Lautstärke bitte etwas hochdrehen. Die Qualle rotiert hier ein wenig. Bringen Sie den Stock an die richtige Stelle. Schalten Sie das Licht aus (Qualle wird angestoßen). Also eine richtige Veranschaulichung auf Film, wenn man sie als solche gelten lassen will, eine der seltenen Gelegenheiten, die ich habe, wissenschaftlich zu arbeiten, ha-ha-ha. Okay, das ist also das ursprüngliche Phänomen. Nicht fürchterlich beeindruckend. Und daraus ergaben sich die drei Nobelpreisanteile. Und zusätzlich eine kleine Revolution in der Biologie, denn das Protein, das die Farbe des Leuchtens von blau zu grün ändert, ist das grün fluoreszierende Protein. Und dieses Protein wurde von Douglas Prasher geklont, und dann konnte Marty Chalfie zeigen, dass es in anderen Organismen funktioniert. Hier können Sie zum Beispiel eine Maus hervorbringen, die am ganzen Körper fluoreszierend leuchtet. Denn indem wir die DNA für das grün fluoreszierende Protein in die Maus bringen, wird die Maus und ihre gesamte Nachkommenschaft, nachdem wir die DNA in die Keimbahn gebracht haben, dauerhaft grün sein. Nur für diejenigen unter Ihnen, die an der Umweltfreundlichkeit der Chemie interessiert sind: Dies wird von DNA codiert, ist nicht toxisch, synthetisierbar von jedem Organismus, der Luft tolerieren kann. Und es geschieht in etwa 230 sequenziellen Kompensationen. Eine Zyklisierung, ein oder zwei Autooxidationen, geht zu 100 % in flüssige Lösung, und das einzige Nebenprodukt ist Wasserstoffperoxid. Und das ist in Sachen Umweltfreundlichkeit nicht schlecht. Wir änderten seine Farben und korrigierten die Helligkeit des Grüns der Qualle, stellten eine zyanblaue Version her, schließlich auch eine gelbe Version. All dies mit Hilfe der Kristallstruktur, die ich hier nicht erwähnt habe, doch sie ist den meisten von Ihnen als 11-strängige, fast vollständige runde Beta-Fass-Struktur vertraut. Wir haben sie jetzt für alle möglichen Arten von Biochemie in Zellen verwendet. Doch wir wollen nicht lediglich Proteine markieren. Das ist 90 % dessen, was die meisten Leute tun wollen. Doch ich wollte, insbesondere im Ausgang von meinen früheren Erfahrungen, erkennen, was es mit der interzellulären Chemie auf sich hatte. Daher erfand ich Wege, Sensoren künstlich herzustellen, in denen wir, sagen wir, ein zyanes fluoreszierendes Protein und ein gelbes fluoreszierenes Protein mit einem protease-empfindlichen Linker verbanden. Und dann nutzten wir das quantenmechanische Phänomen des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers aus, bei dem das zyan fluoreszierende Protein (CFP) und das gelb fluoreszierende Protein (YFP) miteinander kommunizieren, wenn sie sich in räumlicher Nähe befinden. Wenn es angeregt ist, überträgt das zyane Protein seine Energie auf das gelb fluoreszierende Protein. Doch wenn wir diese Verbindung in ihre beiden Hälften lösen, driften die beiden Moleküle auseinander und dann unterbrechen wir die Energieübertragung und wir gehen wieder zurück zum emittierenden zyanen Protein. Während das CFP und das ZEP, wenn sie sich in räumlicher Nähe befinden, miteinander kommunizieren. Wenn es angeregt ist, überträgt das zyane Protein seine Energie auf das gelb fluoreszierende Protein. Wenn wir jedoch diese Verbindung in ihre zwei Hälften aufbrechen und wenn sie sich voneinander wegbewegen, dann unterbrechen wir die Energieübertragung und wir kehren zur Emittierung von Zyan zurück. Dies kann zur Messung von Kalzium verwendet werden. Wenn man einen für Kalzium empfindlichen Linker hier anbringt, kann man zyklisches AMP untersuchen, indem man dies auf die von zyklischem AMP unabhängige Proteinkinase aufpfropft. Ed Fischer ist hier, und er teilte sich den Nobelpreis für einige dieser wichtigen Entdeckungen über die Proteinkinasen. Und die allgemeine Phosphorylierung können wir auf diese Weise ebenfalls verstehen, indem wir Phosphoraminosäuren bindende Proteine zusammen mit den Substraten von Proteinkinasen verwenden. Ich werde Ihnen nur ein Beispiel zeigen - für mehr habe ich keine Zeit -, bei dem es um eine Kalziumänderung geht. Dies zeigt Ihnen die frühe Entwicklung des Embryos eines Zebrafischs, wobei rot eine hohe Kalziumkonzentration bedeutet, und die roten Vorstadien zeigen jede Teilungsfurchung vorher an. Unmittelbar bevor es zur Ausbildung der Teilungsfurche kommt, sehen Sie diese Welle von tiefrot, die den hohen Kalziumwert anzeigt. Dies löst dann die Actomyosin-ähnlichen Kontraktionen aus, die dann die Tochterzellen auseinanderziehen, indem sie den Gürtel enger ziehen und sie abschnüren. Und dies geht nach der Befruchtung mehrere Minuten lang so weiter. Hier ist natürlich einige Zeit verstrichen, und nach einiger Zeit werden die Teilungen im Wesentlichen asynchron und so weiter. Die erste Teilung war die spektakulärste, weil es ein einziger, großer Äquatorialgürtel war. Dies ist die Arbeit meines früheren Postdoc Atsushi Miyawaki. Dies ist also nur ein Beispiel von den Freude bereitenden Dingen, die man auf biologischem Wege lernen kann. Doch ich habe es natürlich nur ausgewählt, weil es ein schöner Film ist. Ich erzählte Ihnen, dass ich schöne Farben liebte, und es war wirklich recht frustrierend für mich, dass als Kind Hellrot meine Lieblingsfarbe war und dass das grün fluoreszierende Protein sich weigerte, uns irgendwelche reproduzierbaren hellen roten Farben zu geben. Es gab uns Zyan und Blautöne und gelbliche, widerliche Grüntöne. Doch nie ein gutes, ehrliches Rot. Und daher war es eine Offenbarung, als eine russische Arbeitsgruppe zeigte, dass Korallen, bei denen es sich tatsächlich um entfernte biologische Verwandte der Quallen handelt, sehr entfernte.... Natürlich gibt es sie in vielen Farben, doch was bis dahin niemand vermutet hatte, war, dass einige dieser Farben exakt homolog zum GFP der Qualle sind. Insbesondere griffen sie dieses Protein von Discosoma heraus, das sie wegen seiner hellroten Farbe DsRed nannten. Sie kannten jedoch nicht die Struktur des Chromophors und wussten nicht, wie dieses Protein rot wird. Und dies war etwas, das wir mit Hilfe der Massenspektroskopie der Proteine beisteuern konnten, durch Hydrolyse usw. Ich habe Ihnen hier die Struktur aufgezeichnet, die Kernstruktur des DsRed-Chromophors, der aus einem Hydroxybenzylidin-Imidazolinon besteht, das an ein Azylimin gebunden ist. Das ist eine ziemlich lange und komplizierte Beschreibung. Hier ist es jedoch unter Verwendung der Bakterien dargestellt, die DsRed exprimierten, indem sie als die Tinte verwendet wurden. Wir haben einige sehr geschickte Leute im Labor, die sterile Zahnstocher verwenden, Bakterien aufheben und sie in einem Maßstab von 1 Angström zu 1 cm auf eine Petrischale auf dem Teller ziehen können. Und auf diese Weise sehen Sie die wunderschöne rote Farbe des realen Proteins zusammen mit der Struktur des Chromophors. Es erwies sich als nicht so schwierig, die Farbe dieses DsRed zu einer breiten Palette von Farben zu ändern, die das restliche Spektrum so ziemlich ausfüllten. Sehen Sie, dies ist es, was wir aus der Qualle herausbekamen, und mit Hilfe der Korallenproteine ist es uns gelungen, Leute. Es gab so viele von ihnen gleichzeitig, dass wir uns eine interessantere Nomenklatur ausdenken mussten. Und nach langen kontroversen Gesprächen im Labor kamen wir schließlich auf diese bekannten fruchtigen Namen, bei denen einem der Name der Frucht eine kleine Gedächtnisstütze für die Farbe gibt, wie zum Beispiel Honigtau, Banane-Orange, Tomate, Mandarine, Erdbeere, Kirsche, etc. Auch dies erwies sich als sehr beliebt, doch das Forschungsgebiet bewegt sich natürlich weiter. Dies war im Jahre 2004, und es gibt heute sehr viele andere Farben. Doch ich möchte Ihnen zumindest ein Beispiel für die Verwendung dieser verschiedenen Farben geben. Hier habe ich ein Beispiel aus der Beobachtung des Zellzyklus genommen: die Verwendung der vom Zellzyklus abhängigen Synthese und den Abbau bestimmter Proteine. Sie werden im Verlauf des Vormittags noch mehr über den Mechanismus des Abbaus von Prof. Hershko und Prof. Ciechanover erfahren, so dass dies tatsächlich passend ist. Dies sind Zellen, die mit einem Proteinpaar gefüllt sind, und wir haben es so eingerichtet, dass ein Protein im Prinzip grünlich ist - tatsächlich ist es gelbgrün. Es entsteht während der Mitose. Es entsteht während der G2-Phase des Zellzyklus, G2S. Und dann wird es während der Interphase abgebaut. Es gibt bekannte Triggersignale, die einem Protein sagen: "Synthetisiere mich jetzt" und zu einem anderen Zeitpunkt Und dann haben wir einen anderen Satz von Proteinen, die genau das Gegenteil tun. Sie haben ihre höchste Konzentration in der Interphase und werden im aktiven Teilungsabschnitt des Zellzyklus abgebaut. Und wir verwenden diese Signale, um das rote Protein zu kontrollieren, bei dem es sich um M cherry handelt. Und daher würde die Zelle in der Phase des Zellzyklus, in der sie sich aktiv teilt, grün sein, weil sie Grün erzeugt und Rot abbaut. Es ist wie bei einer Ampel. Atsushi Miyawaki würde es sich umgekehrt ausgesucht haben. Es ist vollkommen beliebig, welche hergestellt und welche abgebaut wird, aber es ist für uns alle, die wir mit Ampeln vertraut sind, leichter, grün als Zeichen für "Weiter" und rot für "stop" zu verwenden. Und wenn dieser Film abgespielt wird, sehen Sie eine Woche im Leben dieser beiden Zellen, wie sie sich teilen. Und bei jeder Teilung wechseln sie zwischen grün und rot, auf diese unterhaltsame, zeitgeraffte Art und Weise. Und dies kommt wieder meiner Liebe schöner Farben entgegen. Schließlich werden die meisten von ihnen durch die von der Zelldichte abhängigen Mechanismen sozusagen ein wenig angehalten, und deshalb sind sie am Ende größtenteils rot. Nun, dies ist nur eine künstliche Darstellung, es liefert einen schönen Film. Die echte biologische Anwendung des Zellzyklus besteht im Verfolgen großer Massen von Krebszellen im Inneren des Körpers, wo man sie nicht im Zeitraffer beobachten kann. Hier ist das Ablesen der biochemischen Farbe äußerst hilfreich. Ich nehme ein letztes Beispiel von den fluoreszierenden Proteinen, auch diesmal wieder von einer visuell spektakulären Art. Vielen von Ihnen werden die wundervollen Arbeiten von Jeff Lichtman kennen. Er hat einen Aufsatz darüber veröffentlicht, wie er auf kombinatorische Weise rote, gelbe und blaue Proteine ein- und ausgeschaltet hat, indem er sozusagen für jedes von ihnen "gewürfelt" hat. Es ist so, als wenn man den Arm eines Spielautomaten drückt, und je nachdem, wie die Räder zum Stillstand kommen, können entweder alle von ihnen eingeschaltet sein, in welchem Fall man dann eine Art Weiß bekommt, oder man könnte hauptsächlich grün oder ein Grün und zwei Rot bekommen, was Orange ergibt, usw. Es gibt also diese ganze kombinatorische Farbpalette. Jedes Neuron wählt seine eigene Farbe, indem es den Spielautomaten unabhängig von seinen Nachbarn laufen lässt. Und auf diese Weise erhalten Sie diese Art wunderschöner Karten hier, bei denen alle Zellen im Dentigerus verschiedene Farben erhalten. Der Nutzen dieser Sache ist, dass dies wie die Farbcodierung ist, die Elektroingenieure für Kabel verwenden. Sie verwenden farbige Kabel, um sie von hier nach dort verfolgen zu können. Sie müssen nicht ihrem genauen Pfad folgen, wenn sie diesen wunderschönen Farbmustern entsprechen. Man kann sie über große Entfernungen verfolgen. Das ist nur ein kleines Beispiel. So, das ist vielleicht meine erfolgreichste, einflussreichste wissenschaftliche Arbeit. Doch ich möchte zugeben, dass die Tatsache, dass man einen Nobelpreis gewonnen hat, nicht bedeutet, dass man nicht auch demütigende Niederlagen erlebt hat, und ich möchte Ihnen dies anhand eines Beispiels gestehen, eine meiner großen Niederlagen, die mit einer guten Idee begann. Dies ist eine Email, die ich einem Mann namens Peter Hegemann vor langer Zeit (1999) geschrieben habe. Ich sagte ihm: "Professor Hegemann, ich interessiere mich seit einiger Zeit für mögliche Methoden, mit deren Hilfe man die Neuronen von Säugetieren mit Genen transfizieren kann, deren Genprodukt es erlauben würde, die Depolarisation und Aktionspotentiale durch Licht auszulösen." Dies war wirklich keine so gute Idee. Ich hatte mich schon lange für Methoden interessiert, mit denen man Zellen durch Licht anregen konnte, nicht nur für solche, mit denen man ihre biochemische Aktivität ablesen konnte. Mit kleinen Molekülen hatten wir das bereits getan. Dank der Leistungsfähigkeit von GFP wurden wir viel besser im Ablesen, sagen wir von Kalziumsignalen oder allen möglichen biochemischen Signalen in der Zelle, und es wurde offensichtlich, dass wir dies auch genetisch versuchen sollten. Ich habe mich in der Literatur nach dem einfachsten biologischen System umgeschaut, bei dem man ein Licht scheinen und eine Zelle aktivieren kann. Wenn man die Literatur las, war dies wahrscheinlich die auf grünen Algen basierende Arbeit von Professor Hegemann, der Botaniker war. Und deshalb schrieb ich ihm, in der Hoffnung, dass er mir einige seiner Gene geben könnte, die jetzt für uns die Rolle spielen könnten, die Doug Prashers Geschenk des Quallen-GFP gespielt hatte, der unsere Arbeit möglich gemacht hatte. Ich bin kein guter Gen-Kloner, der von Null anfängt. Ich suche und finde interessante Gene, deren Potential von anderen Leuten vielleicht noch nicht erkannt worden ist. Und ich fragte sie. Professor Hegemann gab uns gern einige Gene für das Fehlen von Volvox bei Chlamydomonas. Leider war, was tatsächlich geschah, Folgendes: Rene Meijer, ein Student in meinem Labor, verbrachte zwei oder drei Jahre damit, diese Gene ans Laufen zu bekommen, und das Schlimmste war, dass es eine Woche lang so aussah, als funktionierten diese Gene sehr gut. Später erwies sich das als ein Artefakt, das wir zum damaligen Zeitpunkt noch nicht kannten. Ich ließ diese Arbeiten ein oder zwei Jahre weiterlaufen und versuchte, das Ergebnis zu reproduzieren, was sich letztlich als Zeitverschwendung erwies. Und als wir dann schließlich die Arbeit an diesen beiden Proteinen aufgaben, gingen wir in das Genom, oder Rene ging in das Genom und fischte zwei weitere plausible Kandidaten heraus. Bessere Kandidaten als diese, und er begann mit ChR1 und verbrachte das Jahr mit dem Versuch, es ans Laufen zu bekommen und es misslang. Zu diesem Zeitpunkt war ihm die Arbeit mit drei Proteinen misslungen: das ist Chlamyopsin, Vovoxopsin und ChR1, und er sagte: "Prof. Tsien, ich brauche ein neues Projekt, weil ich eine PhD haben muss." Also begannen wir eine völlig andere Sache. Wir ließen ChR2 im Kühlschrank, und das erwies sich als das richtige Projekt, das andere Leute mittlerweile in der Neurobiologie überall aufgegriffen haben, und ich vermute, dass diese Leute, einschließlich Hegemann und seine Mitarbeiter, in ein paar Jahren den angemessenen Nobelpreis erhalten werden. Rene schaffte übrigens seine PhD. Er ist jedoch durch seinen kleinen Streifzug in die Biologie entmutigt. Er ging wieder zurück in den Beruf eines Ingenieurs für optische Instrumente. Und er scheint tatsächlich recht glücklich zu sein und nicht verbittert darüber, dass ich ihm seinen Versuch vermasselt habe, der ihn ansonsten vielleicht berühmt gemacht hätte. Also, nur weil Sie denken, ich habe Wissen, ich bin hier oben, ich muss eine emminente Person sein... Nein, auch wir machen Fehler und setzen Projekte in den Sand. Ich möchte mit meinen neuesten Bemühungen enden, die darin bestehen, molekulare Bildgebungsverfahren für Patienten nutzbar zu machen. Dies hat zum Teil mit meinem Wunsch zu tun, in den letzten Jahren meiner beruflichen Arbeit etwas zu tun, was klinisch relevanter ist als die Arbeit, die ich bisher gemacht habe. Ihre klinische Relevanz bestand hauptsächlich darin, Werkzeuge für das Screening von Medikamenten bereitzustellen, die einen hohen Durchsatz erlaubten. Das ist ok, aber es ist ziemlich indirekt. Und ich hatte wenig damit zu tun. Wie Sie vielleicht bemerkt haben werden, kann dasjenige, was wir entwickeln, aus biologischer Perspektive einfach als technische Entwicklung abgetan werden. ist das ein ziemlich interessantes Engineering. Jedoch auch aus biologischer Sicht und aus der Sicht ziemlich renommierter Fachzeitschriften. Doch das Tolle ist: Wenn man an einer klinisch relevanten Sache zu arbeiten beginnt, werden genau dieselben Gedanken plötzlich zu translationaler Forschung. Vom Labortisch zum Krankenbett: Dies ist es, was die für die Vergabe von Fördermitteln zuständigen Behörden für das Größte halten. Und es macht absolut keinen Unterschied, nur dass man eine dünne Schicht klinischer Relevanz darüber klebt. Doch man weiß, dass es nicht nur eine dünne Schicht ist: mein Vater, mein Neffe, mein Doktorvater, viele Kollegen sind beispielsweise an Krebs gestorben. Meine Mutter hatte vor kurzer Zeit einen Schlaganfall. Man hat auch bei mir Krebs festgestellt, doch glücklicherweise geht es mir gut. Alle diese Dinge tragen zu unserer Konzentration auf das Wesentliche bei. Das Problem mit fluoreszierenden Proteinen, was sie in der Biologie so leistungsfähig macht, ist die Tatsache, dass sie von DNA kodiert werden können, was bedeutet, dass wir die gesamte Macht der Molekularbiologie anzapfen können und dass wir sie für die das Verständnis der grundlegenden Lebensprozesse nützlich machen können. Bedauerlicherweise ist der eine Kontext, in dem fluoreszierende Proteine für die Genübertragung oder Genetik ein Handicap werden, der Wunsch, mit realen Patienten zu arbeiten. Nun, es ist eine Sache, mit menschlichen Stammzellen zu arbeiten, die von Menschen gewonnen wurden, oder mit menschlichen Zellen, die einer Person entnommen wurden. Wenn man jedoch in eine lebende Person zurückgehen will, so ist dies - zumindest zur Zeit - weder technisch machbar noch ethisch erlaubt: sagen wir, indem wir das Gen einer Qualle in Sie transjizieren, wenn Sie der Patient wären. Denn, wissen Sie, wir müssen heute fragen: Welchen Nutzen bringt Ihnen das persönlich? Es mag für uns als Forscher sehr gut sein, für uns; aber ist es auch gut für Sie? Und darüber hinaus sind Menschen für fluoreszierende Stoffe zu dick und zu lichtundurchlässig, obwohl fluoreszierende Stoffe für mich offenbar sehr gut gewesen sind. Also benötigen wir andere Techniken, wie Magnetresonanzbildgebung (MRI). MRI ist das Thema einer eigenen Reihe von Nobelpreisen. Es ist eine tolle Technik, außer wenn wir molekularen Kontrast verwenden wollen. Dann ist sie nicht sehr empfindlich. Eine große Menge des Kontraststoffs wird benötigt, um ihn sehen zu können. Dies sind in der Regel Gd-Chelate. Was machen wir also? Nun ja, wir untersuchen Proteasen bei Krebs, weil sie biologisch wichtig sind. Tatsächlich sind sie für die Metatastasenbildung verantwortlich und erforderlich, was geschieht, wenn Krebszellen den Primärtumor verlassen und sie zu anderen Stellen des Körpers wandern. Das ist es, was Krebspatienten den Tod bringt. Nicht die Entstehung des Primärtumors, obwohl das natürlich der Ort ist, an dem alles anfängt. Doch was die Leute umbringt, ist die Wanderung zu entfernten Organen. Und dies erfordert, dass die Krebszellen die Fähigkeit erwerben, sich einen Weg durch normales Gewebe zu bahnen, einschließlich durch die untere endotheliale Membran, die Blutgefäße auskleidet, einschließlich der normalen, zusätzlichen Zellmatrix. Und sie verwenden Enzyme, wie zum Beispiel die Matrix-Metalloproteinasen 2 und 9, um dies zu tun, und es geschieht ziemlich universal. Vielleicht könnte man dieser Anforderung entkommen, doch sie ist ziemlich universal. Wir versuchen also aufgrund ihrer biologischen Relevanz die Aktivität derjenigen Proteinasen zu erkennen, die die Metastasierung ermöglichen. Und außerdem, weil sie mit dem Mechanismus verträglich sind, den ich Ihnen sogleich beschreiben werde. Er besteht darin, dass - hat man eine Reihe stark positiv geladener Aminosäuren, zum Beispiel eine Reihe von Argininen - sie sich mit Hilfe elektrostatischer Wechselwirkung gerne an die Außenseite von Zellen heften und dann über Prozesse, die noch kaum verstanden sind, in das Innere der Zelle gelangen. Dieser Vorgang, wie ich Ihnen soeben beschrieben habe, ist elektrostatisch, aber sehr wahllos, weil im Prinzip alle Zellen negative Ladungen haben oder eine negativ geladene Hülle auf ihrer Oberfläche. Was ich über dieses bekannte Phänomen hinaus beigesteuert habe, ist die Idee der Maskierung der positiven Ladungen mit einer nicht-klebenden Trägerschicht, die aus einer entsprechenden Anzahl negativer Ladungen besteht. Und das Polycadin und Polyamin, die Arginine und Glutamate neutralisieren sich gegenseitig und halten sich gegenseitig aus dem Weg, bis wir den Linker durchtrennen, was hier in grün dargestellt war. Wir verwendeten die MMPs, um den Linker durchzutrennen. Die Tumorzellen, jedoch nicht die normalen Zellen, verfügen über die Fähigkeit, diese Schicht abzureißen und die Klebrigkeit wiederherzustellen, die Maskierung der Klebrigkeit des Polycadins aufzuheben, das dann wieder an dem Gewebe klebt. Ein Beispiel dafür, wie dies aussieht, befindet sich hier in einem Tumor, der mit GFP markiert wurde. Dies ist ein Beispiel für die Nützlichkeit von GFP, doch dies ist etwas, was man nur bei einer Maus, nicht am Menschen tun kann. Menschliche Tumore werden niemals grün leuchtend, zumindest nicht in einem Patienten. Doch wir können unser synthetisches Molekül injizieren, auf dem sich ein dunkelroter Farbstoff befindet, und aufgrund des Mechanismus, den ich gerade beschrieben habe, markiert er den Krebs und lässt ihn rot leuchten. Weil nur der Krebs diesen Linker exakt in der Mitte zwischen dem Glyzin und dem Leucin durchtrennen kann, kann er die Maskierung der negativen Ladungen aufheben, die negativen Ladungen "wegwerfen", die Maskierung der positiven Ladungen aufheben, die die Adhäsion an die Zelle bewirken können. Als wichtige Kontrolle: Wenn wir das Molekül mit d-Aminosäuren herstellen - wir haben also das Molekulargewicht nicht geändert, wir haben den Grad der Hydrophobie nicht geändert, doch dieses ansonsten entsprechende Molekül ist kein Enzymsubstrat -, dann leuchtet der Tumor nicht auf. Dann sagten wir, wir wollten in der Magnetresonanzbildgebung arbeiten, und dies ist der Beweis dafür, dass wir es können. Hier ist eine Maus mit einem Tumor, bevor wir sie injiziert hatten, und in diesem kontrollierten Anfangsstadium unterscheidet sich das Tumorgewebe hinsichtlich der MRI-Helligkeit nicht vom restlichen Tumor. Doch nachdem wir das richtige Molekül injiziert haben - was in diesem Fall ein wenig komplizierter ist, es hat sechs heraushängende Peptide - , leuchtet der Tumor jetzt auf. Und hiervon hoffen wir, dass dies beim Menschen durchgeführt werden kann. Man könnte dasselbe Molekül injizieren, und es könnte sogar als Teil der jährlichen Vorsorgeuntersuchung geschehen. Anhand von irgendetwas Leuchtenden in Ihrem Körper könnten wir erkennen, ob Sie irgendwo einen Tumor haben, weil MRI durch den gesamten Körper scannen kann. Dies ist der Kontrollversuch, bei dem das von uns injizierte Material über die d-Aminosäuren verfügt und sich daher nicht ansammelt. Es ist wichtig, Krebs früh zu erkennen, denn wenn wir Krebs in diesem Stadium erkennen könnten, wenn der Tumor noch lokal begrenzt ist, haben wir eine gute Überlebenschance. Wenn wir hingegen bis hierher warten, kostet dies das Gesundheitssystem eine riesige Geldmenge mehr - etwa hundertmal mehr, doch die Prognose ist sehr düster und der Krebs wird im Allgemeinen zu spät erkannt. Leider bevorzugt die Industrie, hier außen zu arbeiten, weil sie a) wesentlich mehr Geld verdient und weil es b) wesentlich leichter ist, die Patienten zu gewinnen, wenn sie dem Tode nahe sind, als wenn sie noch relativ gesund sind, wie es bei den meisten der Fall ist, wenn man versucht, das Screening durchzuführen. Lassen Sie mich Ihnen einen letzten Film zeigen, der Ihnen dies in Aktion zeigt, und hier möchte ich die Idee einführen. Wir verfügen fast über einen separaten Peptidtyp, der periphere Nerven einfärben kann, die zu durchtrennen wir uns bei chirurgischen Eingriffen am meisten fürchten. Und hier ist der Film. Im Anfangszustand kann man kaum sagen, wo sich der Tumor befindet. Im fluoreszenten Modus, wenn wir auf die Betrachtung der fluoreszenten Bereiche schalten, kann man zwar sehen, wo sich der Tumor befindet, aber man kann nicht operieren. Das ist die Kombination der beiden. Dies ist allein das weiße Licht. Können Sie den Tumor sehen? Nein? Im fluoreszenten Licht sehen Sie ihn, können aber nicht operieren. Doch wir verwenden den Computer, um die beiden Ansichten 15 mal pro Sekunde zu kombinieren. Es sieht also so aus, als hätte der Tumor GFP, doch es ist in Wirklichkeit nicht GFP, es ist unser synthetisches Molekül. Und nun haben wir ihn erkennbar gemacht, hier ist ein großer, massiver Tumor, weil er in der künstlichen Farbe Grün leuchtete, was bedeutet, dass die Protease aktiv ist. Und hier ist der freigelegte Nerv. Doch man könnte bereit sein zu versuchen, den Nerv zu schonen und den Tumor herauszuschneiden, indem man entlang dieser Linie schneidet. Das wäre jedoch ein Fehler. Denn in einem Moment, wenn wir es mit dem Nervenpeptid überprüfen, wo der Nerv verläuft, zeigt sich dieser verborgene Zweig, der vom Tumor umgelenkt wurde. Dies ist der Zweig des Nervs, den man bei regelmäßigem, weißem Licht nicht hätte sehen können. In unserem Overlay-Modus färben wir ihn hellblau, nur weil dies eine andere Farbe ist, die im Körper nicht vorkommt. Nun ist die Aufgabe des Chirurgen sehr viel leichter gemacht geworden: Das grüne Gewebe ist herauszuschneiden, das hellblaue intakt zu lassen. Das Hellblaue sind die Nerven, die Sie nicht verletzen wollen, und da sind sie. Mit Hilfe von Mechanismen wie diesem können wir tatsächlich die nachoperative Überlebensrate bei verschiedenen Tumorformen verbessern, und hier ist einer, bei dem wir die Überlebensrate um das Fünffache steigern konnten. Natürlich muss noch sehr viel mehr Arbeit geleistet werden, und mein letztes Dia enthält einige Lektionen für junge Wissenschaftler. Versuchen Sie, wichtige Probleme zu finden, die entweder zahlreiche andere Forschungen beeinflussen, oder beantworten Sie wichtige Fragen oder geben Sie ihnen vielleicht klinische Relevanz. Doch es müssen Probleme sein, die Ihnen eine innere, sinnliche Freude bereiten, oder die Sie Ihre Neurosen leichter ertragen lassen. Einschließlich, zum Beispiel, zu meinen älteren Verwandten auf Distanz zu gehen. Akzeptieren Sie, dass Ihre Trefferquote gering sein wird, doch hoffentlich nicht null. Es ist besser, viele Ideen zu habe, und Sie sahen, dass wir in einigen Fällen keinen Treffer erzielten, wie beim Kanal-Rhodopsin, in anderen hatten wir Glück. Sie müssen lernen, aus Zitronen Limonade zu machen. Die Natur weist Sie oft in seltsame Richtungen, lernen Sie sie auszunutzen. Halten Sie an Ihrem ursprünglichen Plan nicht notwendigerweise auf immer und ewig fest. Ich werde nebenbei etwas bemerken, was völlig nicht-wissenschaftlich ist: Wenn Sie lange genug am Leben und gesund bleiben wollen, um Ihre Konkurrenten - zumindest wissenschaftlich - zu überleben, so raten ich Ihnen, dass Sie sich regelmäßig bewegen. Es gibt mittlerweile wissenschaftliche Hinweise darauf, dass körperliche Bewegung tatsächlich das Wachstum von Stammzellen im Gehirn fördert und dass sie zur Ausschüttung von Wachstumshormonen führt usw. Es ist gut für Sie, besonders auf Treffen wie diesem, sich daran zu erinnern, dass Preise letztlich Glücksache sind. Man versucht viele verschiedene Dinge. Nicht unbedingt Ihre besten Ideen sind vielleicht diejenigen, die am erfolgreichsten sind. Lassen Sie sich nicht durch Preise motivieren oder beeindrucken, weil Sie sie nicht vorhersagen können und weil Sie Ihr Leben nicht daran ausrichten können. Und nur weil so viele Leute unsere Unterschrift oder unser Foto haben wollen und glauben, wir seien eine Art Idol, hoffe ich Ihnen gezeigt zu haben, dass auch wir Schwächen haben wie alle andern Menschen auch. Natürlich ist es absolut entscheidend, dass Sie die richtigen Mitarbeiter finden, sowohl jüngere als auch ältere, und dass Sie sie ausnutzen, aber auf eine freundliche Art, so dass beide Parteien davon profitieren. Nur auf diesem Wege können wir die beste Wissenschaft zustande bringen. Und hier sehen Sie eines unserer letzten, mit fluoreszenten Bakterien gemalten Bilder. Es gibt viele Menschen, deren Arbeit hierzu beigetragen hat. Vielen Dank.

Roger Tsien (2011)

Engineering Molecules for Fun, Profit, and Clinical Relevance

Roger Tsien (2011)

Engineering Molecules for Fun, Profit, and Clinical Relevance

Abstract

Molecules to observe and manipulate biological systems and disease processes can be devised by a variety of strategies, ranging from pure chemical design and total synthesis to genome mining and high-throughput directed evolution. Examples of both successes and failures will be chosen from my own experience, including calcium indicators, molecular voltmeters and photomultipliers, fluorescent proteins, and peptides that light up tumors and nerves. The key personal challenge is to match one’s own neuroses and pleasures with research challenges that will have the widest possible impact.

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