Edmond Fischer (2003) - How Proteins Communicate with One Another to Integrate Intracellular Signals

The types of reaction a cell uses to transduce an external signal into a particular response will be discussed. The subject belongs to the field of proteomics as opposed to genomics

Our paths seem to merge at many, many times and I know Hans for many, many years. My only objection is he called me Doctor or Professor Fischer, why don’t you call me Eddie like anybody else. Well yesterday at our round table, several of us mentioned signalling. And this will be the subject of my talk today. By signalling we understand the very complex series of reactions that induce a cell to grow, to develop different shapes and eventually to die, in answer to many external and internal signals. A cell in the body is exposed to a multitude of signals that it has to integrate into a coherent response. And to do that pathways have to speak with one another, to communicate with one another, to coordinate, to synchronise all the reactions that take place and so that the pathways can carry out their specific functions. Now this subject belongs to the field of proteomics which so to speak represents the other side of the coin of genomics. And you all have heard a lot about genomics in connection with the human genome project. And there is no question that the essential completion of the human genome. And the unravelling of the genetic make-up of many dozen organisms now represents an achievement of enormous proportion. One that will change biology by changing the way we are thinking about various problems. And that will affect the future of biomedicine and medicine in general. Nonetheless it is also clear that the accumulation of these huge amounts of DNA-based information can only take us so far. The genome can predict the entire set of proteins that an organism can potentially produce. But it cannot take into consideration the enormous diversification of structure, of gene structure such as gene insertion or switching or recombination. Other kind of rearrangements as seen for instance in the immune system where less than 1,000 genes, V(D)J genes can potentially give rise to more than 500 million proteins. It cannot account for the co-transcriptional or transcriptional modification such as alternative splicing, the epigenetic changes such as mutations following exposure to radioactivity or chemical carcinogen or processing by limited proteolysis, the 100’s of chemical modifications, glycosylation, methylation, isoprenylation, …, 100’s of these. And therefore even if one disregards totally the immune system that has evolved precisely to produce structural diversity, there are far more proteins in the proteome than there are genes in the genome, contrary to the genome which represents a sort of a fixed entity. A problem with a finite end point more or less. The proteome is constantly in a state of flux, changing constantly with the stage of development, the growth of the cell and even with environmental factors. And finally the genome cannot tell us how proteins interact with one another through adaptor proteins, through scaffolding proteins, anchoring proteins, to produce those huge complexes that actually characterise their function. They can’t tell us the signals that will send a protein to the membrane or the ER or the Golgi. To transport in and out of the nucleus which I'm sure Günter Blobel will discuss later, or the signals that will target a protein for destruction at the appropriate time. And of course it won’t tell us anything about the mechanism by which enzymes are regulated. And this is what I want to focus on, regulation by protein phosphorylation. Because we know today that this is probably the most prevalent mechanism by which cellular events are affected. And indeed protein phosphorylation is involved at just about any aspect of cell behaviour, control of metabolism, transcription, translation, immune response, transformation and so forth. Now most of these phosphorylation reactions at least quantitatively occur on serine and threonine. But one of the great excitements in this area was the discovery just 25 years ago that phosphorylation on tyrosine was intimately implicated in transformation and oncogenicity, bringing into play a variety of tyrosine kinases, of cellular and viral origin, or linked to receptor for mitogenic hormones and growth factors. And since the latter represents some of the important molecules by which external signals are received, let me tell you a little bit about these. We know now I think to date about 59 different growth factor receptors. That can be divided in about, oh I think 20 subcategories. They all have the same architecture, a single trans-membrane segment that separates the catalytic activity inside tyrosine kinase, and then on the outside a great variety of structural motifs. That will allow specific binding of the ligand, cysteine rich domains that you find on the EGF or everywhere, those immunoglobulin-like domains, EGF-like, cadherin-like, factor 8, kringles, leucine protein rich - A great variety of domains that would give the specific character to those receptors. Most of the ligands are circulating hormones even though the FGF requires a protein such as heparin to bind. And then except for the F family, this is the largest family of receptors that recognise membrane bound ligands and they are concentrated on, if not exclusively found in the neuronal system where they play an important role in communication by regulating cell migration and axonal path finding and so forth. We begin to understand now how signal is transduced down from those receptors. In the resting state they are separated from one another and inactive. Upon binding of a ligand, for instance EGF, they dimerise and immediately undergo transphosphorylation. And then a signal is transduced by virtue of the fact that those tyrosine phosphate groups can recognise small modules, in this case called SH2, that stands for Src-homology 2 domain, that have a high affinity for tyrosine phosphate group. Not any but within a specific sequence. So before that those adaptor molecules are let’s say free in the cytoplast and they are recruited upon phosphorylation of the receptor. And then the change in conformation in that adaptor, that stands for growth factor receptor bound, described by Joseph Schlessinger. The change in conformation allow other modules, now the SH3 module, to bind to the next elements because it recognises prolene rich region. And then this binds to the next element and then triggers now a cascade of reaction. So this system now would allow a receptor to communicate with a protein far away, under conditions where it would have no other way to communicate. As you see communication is practically mechanical. Proteins interlock with one another like if one were dealing with a tinker toy or Lego type of assemblage. And this interlocking of protein guarantees that only the right protein will be drawn into a particular pathway and guarantees the fidelity of the transcription system. And today 100’s of those kind of modules have been identified by comparative sequence analysis. And they are found on a plethora of adaptor proteins, regulatory proteins, transcription factors and so forth. And I just want to mention, bring up a few of them. You have the SH2, Src-homology 2, I just mentioned that recognises tyrosine phosphate. SH3 that recognises prolene rich region. WW, it’s a domain sandwiched between 2 tryptophan, approximately 27, 30 residue long. That also recognise prolene blobs but of a different sequence and also recognise serine phosphate. The PH domain for pleckstrin homology domain, its principle role is not protein-protein interaction but it recognises anionic head groups on phospholipid, on phosphoinositide such as PIP2, PIP3. And it also recognises G protein and in this case plays an important role in chemotaxis. The PTB domain for phosphotyrosine bound also recognises phosphotyrosine bound but in a totally different way than the SH2. And it recognises particularly this NPXY module. And it has a very high affinity for upstream sequences. So it will bind even when the tyrosine is not phosphorylated. And then the PDZ domain is probably one of the most important domains for protein-protein interaction. And it recognises hydrophobic C termini, hydrophobic C termini, usually valine or isoleucine and also some very, some beta fingers, very sharp beta fingers that mimic in fact the C terminal segment. And those motifs can either be in different proteins or in the same protein so that PDZ can undergo head to tail oligomerisation. And that is its main characters. I will come back to that. The possibility of forming strings of PDZ domain to cluster, to organise receptors and ion channels. So let me now rapidly give you some schematic examples how some of those modules function. The SH2 domain has been found now in more than 100 proteins and they are usually found in adaptor proteins like RAB 2, this is an analogue. And they usually bind to activated receptor. And in most of these you have several SH3 domains which would allow those adaptors to latch on to different proteins in a signalling pathway. But the SH2 domain can play another and very important role. It can serve as a conformational switch. Many enzymes and this is the case of all the Src kinases, contain a tyrosine phosphate that serves as a negative determinant. So the SH2 domain can bind with it and therefore shield the catalytic site. Or in other cases the SH2 domain can bind to an inhibitory domain that again serve as a negative determinant. So in this form those enzymes are inactive, this is the case of the SIP enzyme and some tyrosine phosphatases. In this case, activation occurs when a specific tyrosine phosphatase knocks out this phosphate group and therefore the molecule opens, frees the catalytic site, or when that enzyme comes into contact of another molecule that has a higher affinity for the SH2 domain. So the SH2 domain switches its allegiance from the enzyme, let’s say to the receptor, in this case. So you see the SH2 is, can be considered as an internal conformational switch, just like the phosphate group can function as an external molecular switch to activate or inhibit the enzymes. The main function of the PH domain and this has been found now in about 500 different protein is to bind the molecules to the membrane and to serve the same function as a myristoyl or as a palmitoyl group. And you find these in substrates, for instance for the fibroblast growth factor or the insulin substrate IRS1234. Those molecules have usually a large string of tyrosine residue. And they serve as annex binding, anchoring, annex docking sites for molecules that have SH2 domain. So the way it works, when you activate for instance the insulin receptor, it recruits its substrate to the membrane. The PTB domain slaps it against the receptor and the receptor immediately phosphorylates many of the tyrosine residue and triggers signalling, down signalling. The importance of the PH domain in this reaction can be seen in a kinase, the bruton kinase, BTK, that plays an important role in B cell development and signalling. A single point mutation in the PH domain, argenine to cysteine mutation, interferes with its binding to the membrane and causes gross functional aberrations resulting in X-linked agammaglobulinemia simply by not being able to recruit that kinase to the membrane. The PDZ domain, as I said, owes its characteristic to the fact that it can form chains, multiple copies on a chain, MAGUK stands for membrane associated protein with one elate kinase-like. They don’t have any quanylate kinase activity. But here is the post-synaptic density protein PSD95 from which PDZ gets its name, InaD protein that I’ll discuss, so, a large number of proteins that all have the sort of a modular structure. And let me show you, taken from the literature, some schematic examples, how these function. PSD95, its two PDZ domains combine to subunits of the NMDA receptor for instance and dimerise the channel. And another PDZ domain, I think it’s the second one as a matter of fact, can also form a heterodimeric liaison with a PDZ domain of the neuronal nitric oxide synthase. It’s an enzyme that requires calcium calmodulin for activity. So localisation now of the synthase with a channel and the synthase is as I said a calcium calmodulin requiring enzyme. Localisation of the two together will bring about the very efficient production of nitric oxide, following calcium entry. InaD has a 5 PDZ domain, no catalytic activity and its main function again is to cluster many enzymes in the phototransducing, the drosophila phototransducing system. The human homologue has eight of those PDZ domains. So upon activation of the system by a photon through the G protein, there’s an activation at PLC beta. And this produces diacylglycerol and calcium that will now activate this tranchant receptor potential calcium channel and bring about calcium entry and cell depolarisation. And the reverse reaction, the deactivation process, is a calcium dependent reaction that involves PKC, an I-specific protein kinase C, calmodulin, arrestin, a calmodulin-dependent protein kinase. But by clustering all those proteins together, you have a huge amplification of the system. To such an extent that activation of rhodopsin by a single photon will bring about the activation of about 100 calcium channels in a millisecond time scale. So this is the importance of putting all those proteins together. Finally PKZ can participate or can serve as a localisation machinery of the cell, in c-elegans for instance three proteins, 2, 7 and 10. Each with its PDZ domain can participate in the transports of receptors, particularly lets 23A tyrosine kinase receptor. So this unit together with some of its targets or some of its additional protein can serve as a cargo to transport proteins inside the cell. The complexity of the regulation of signalling is well demonstrated by P95VAV and this looks like one of those Swiss army knives that can do anything. With all of its domains it can interact with a number of systems. I don’t describe, it is an enzyme, it is a GEF, a guanine nucleotide exchange factor which is always linked with a PH domain. But importantly it has a very hydrophobic region at the N terminus analogous to calponin. Calponin are proteins that regulate smooth muscle contraction. And that calponin like region serves a very negative function because when part of it is deleted, if you chop off the N terminus then VAV becomes oncogenic. And VAV becomes phosphorylated upon receptor activation. It becomes phosphorylated by the fusion protein BCR-Abl, that is implicated in chronic myelogenous leukaemia. Ok so, our chairman tells me that I am exceeding my time. What I wanted to say is that the big problem for the cell is how now does it select among all the things it can do. Because a protein like VAV serves like those roundabouts that you find in traffic that can send cars in every direction. And this is a big difficulty for the cell. And it can only do that when it receives a signal from the outside, when many receptors collaborate together, speak with one another, generating a combinatorial type of response. So this is some of the things that we know about signalling but where do we go from there? I mean what are the important problems that we have to solve? We know several of the important signalling pathways. We have characterised the elements of those pathways. We know their structure, we know their function. But these molecules are only the words that a cell uses to bring about, to modify its behaviour. We know some of those words, we know bits and pieces of sentences they use but we don’t know the language a cell has to use to synchronise, to coordinate all the reactions that take place. Furthermore through 3½ billions of evolution the cells have had all the time in the world to establish some secondary pathways, parallel pathways, a chance, feedback reactions to regulate their growth, to protect them against adversity or to plan their death. And much more importantly, we don’t know the language cells speak with cells. And this has been absolutely crucial in the establishment of those very complex networks of information as you see during embryonic morphogenesis. That you see in the immune system. And the infinitely more complex central nervous system where 1,000million cells speak with one another through something like a million billion synapses to finally establish the generation of memory and thought and consciousness. And as Erwin Neher said yesterday, this will be one of the main challenges that the biologists will have to solve in the years to come. Thank you for your attention. Applause.

Unsere Wege scheinen sich immer wieder zu kreuzen und ich kenne Hans seit vielen, vielen Jahren. Ich habe nur einen Einwand: Warum nennt er mich Doktor oder Professor Fischer? Nenn mich doch einfach Eddie, wie es jeder hier tut. Gestern an unserem Runden Tisch haben mehrere das Thema Signalübertragung angesprochen. Und das ist auch das Thema meines heutigen Vortrags. Unter Signalübertragung verstehen wir die sehr komplexe Abfolge von Reaktionen, die eine Zelle veranlasst, als Antwort auf die vielen externen und internen Signale zu wachsen, unterschiedliche Formen zu entwickeln und schließlich zu sterben. Jede Körperzelle ist einer Vielzahl von Signalen ausgesetzt, die sie in Form einer kohärenten Antwort integrieren muss. Und dazu muss zwischen den einzelnen Signalwegen eine Kommunikation erfolgen und müssen alle stattfindenden Reaktionen so koordiniert und synchronisiert werden, dass die Signalpfade ihre jeweils spezifischen Funktionen ausüben können. Dieses Thema ist in das Gebiet der Proteomik einzuordnen, das sozusagen die andere Seite der Medaille der Genomik repräsentiert. Und Sie alle haben in Verbindung mit dem Humangenom-Projekt schon viel von der Genomik gehört. Und zweifelsohne stellt die wesentliche Entschlüsselung des menschlichen Genoms und des Erbguts vieler Dutzender von Organismen heute eine Leistung in enormer Dimension dar - eine Leistung, die die Biologie verändern wird, indem sie die Art und Weise wandeln wird, wie wir über verschiedene Probleme denken. Und das wirkt sich dann auf die Zukunft der Biomedizin und der Medizin grundsätzlich aus. Dennoch ist wohl auch klar, dass die Akkumulation dieser riesigen Mengen von DNA-basierten Informationen uns nur insoweit voranbringt, als genom-basierte Vorhersagen der gesamten potenziellen Protein-Ausstattung möglich sind, die von einem Organismus produziert werden kann. Nicht berücksichtigt wird dabei aber die enorme Diversifizierung der Struktur, der Genstruktur, wie beispielsweise der Gen-Einbau oder das An- und Abschalten von Genen oder die Gen-Rekombination oder andere Arten von Gen-Umlagerungen, wie sie beispielsweise im Immunsystem vorkommen, wo weniger als 1.000 Gene, V(D)J-Gene, mehr als 500 Millionen Proteine initiieren können. Nicht berücksichtigt werden ko-transkriptionale oder transkriptionale Modifikationen, wie beispielsweise das so genannte alternative Splicen, epigenetische Veränderungen - etwa Mutationen nach Belastung durch Radioaktivität oder chemikalische Karzinogene - oder eine Verarbeitung durch limitierte Proteolyse, mehrere Hundert chemische Modifikationen, Glykosylierung, Methylierung, Isoprenylierung ... Hunderte solcher Vorgänge. Selbst wenn man das Immunsystem, das sich akribisch entwickelt hat, um strukturelle Diversität zu erzeugen, vollkommen außer Acht lässt, gibt es wesentlich mehr Proteine im Proteom als Gene im Genom, das im Gegensatz dazu eine Art feststehende Einheit darstellt - mehr oder weniger ein Problem des finiten Endes. Das Proteom ist kontinuierlich im Wandel begriffen, verändert sich mit dem Stadium der Entwicklung, dem Wachstum der Zelle und sogar durch den Einfluss von Umweltfaktoren laufend. Und schließlich kann uns das Genom nicht verraten, wie Proteine über Adapterproteine, über Netzwerkproteine, über Ankerproteine miteinander interagieren, um diese riesigen Komplexe zu erzeugen, die faktisch ihre Funktionsweise charakterisieren. Es kann uns nichts über die Signale verraten, die ein Protein an die Membran oder das endoplasmatische Retikulum (ER) oder den Golgi-Apparat für den Transport in den Kern und aus dem Kern heraus versendet, worüber - da bin ich sicher - Günter Blobel später berichten wird, oder über die Signale, die sich auf ein Protein richten, um es zum richtigen Zeitpunkt zu zerstören. Und natürlich sagt uns das Genom auch nichts über den Mechanismus, durch den Enzyme reguliert werden. Und das ist das, worauf ich mich konzentrieren möchte: die Regulierung durch Proteinphosphorylierung. Denn wir wissen heute, dass dies der wahrscheinlich am häufigsten vorkommende Mechanismus ist, der für zelluläre Vorgänge verantwortlich ist. Und tatsächlich spielt die Proteinphosphorylierung bei fast jedem Aspekt im Zellverhalten eine Rolle, bei der Stoffwechselsteuerung, Transkription, Translation, Immunreaktion, Transformation usw. Und die meisten dieser Phosphorylierungsreaktionen basieren zumindest quantitativ auf Serin und Threonin. Aber eine der größten Überraschungen auf diesem Gebiet war die vor gerade einmal 25 Jahren gemachte Entdeckung, dass die Phosphorylierung von Tyrosin eng mit Transformationsprozessen und Onkogenität verknüpft ist, wobei eine Vielzahl von Tyrosinkinasen ins Spiel kommt, die zellulären und viralen Ursprungs sind oder mit dem Rezeptor für mitogene Hormone und Wachstumsfaktoren verbunden sind. Und weil Letzterer einige der bedeutenden Moleküle repräsentiert, über die externe Signale empfangen werden, möchte ich ein paar Worte dazu sagen. Wir kennen heute ungefähr 59 verschiedene Wachstumsfaktorrezeptoren, die sich in ungefähr 20 Unterkategorien unterteilen lassen. Und sie haben alle die gleiche Architektur, ein Einzeltransmembran-Segment, das die katalytische Aktivität innen, Tyrosinkinase, separiert und dann gibt es außen eine große Vielzahl von strukturellen Bindungsmotiven. Das ermöglicht die spezielle Liganden-Bindung, cysteinreiche Domänen, die man auf dem EGF oder anderswo findet, diese immunoglobulin-ähnlichen Domänen, EGF-artig, Cadherin-artig, Faktor 8, Kringel, leucin-reiches Protein - eine große Vielzahl von Domänen, die diesen Rezeptoren einen speziellen Charakter verleihen. Die meisten Liganden sind zirkulierende Hormone, wenn auch der FGF ein Protein wie Heparin zur Bindung benötigt. Und mit Ausnahme der F-Familie ist dies die größte Rezeptorenfamilie, die membrangebundene Liganden erkennt. Und sie konzentrieren sich auf das neuronale System, wenn sie nicht sogar ausschließlich dort anzutreffen sind, wo sie durch Regulierung der Zellwanderung und der axonalen Signalpfadfindung usw. eine bedeutende Rolle in der Kommunikation spielen. Sie können sich jetzt vielleicht vorstellen, wie Signale von diesen Rezeptoren abwärts übertragen werden. Im Ruhezustand sind sie voneinander getrennt und inaktiv. Bei Bindung eines Liganden, beispielsweise EGF, vereinigen sie sich und durchlaufen sofort eine Transphosphorylierung. Und dann wird quasi aufgrund der Tatsache, dass diese Tyrosinphosphatgruppen kleine Module erkennen können, ein Signal übertragen, in diesem Fall als SH2 bezeichnet, was für src-homology 2-Domäne steht, die eine hohe Affinität zur Tyrosinphosphatgruppe aufweisen. Das gilt innerhalb einer spezifischen Sequenz. Vorher sind diese Adaptermoleküle sozusagen frei im Zytoplast und werden über die Phosphorylierung des Rezeptors rekrutiert. Die Konformationsänderung in dem Adapter, der für die Wachstumsfaktorrezeptorenbindung steht, wie von Joseph Schlessinger beschrieben, ermöglicht es dann anderen Modulen, in diesem Fall dem SH3-Modul, sich an die nächsten Elemente anzudocken, weil es eine prolen-reiche Region erkennt. Und dieses bindet sich dann an das nächste Element und löst eine Reaktionskaskade aus. Dieses System würde nun einem Rezeptor die Kommunikation mit einem weit entfernten Protein unter Verhältnissen ermöglichen, unter denen es keine anderen Kommunikationsmöglichkeiten gibt. Wie Sie sehen, verläuft die Kommunikation praktisch mechanisch. Die Proteine verzahnen sich miteinander, als ob man es mit dem Zusammenbau von Tinkertoy-Elementen oder lego-artigen Bausteinen zu tun hätte. Und diese Verzahnung des Proteins gewährleistet, dass nur das richtige Protein in einen speziellen Signalpfad gezogen wird. Dadurch wird die Fidelität des Übertragungssystems gewährleistet. Und bis heute wurden durch die vergleichende Sequenzanalyse Hunderte solcher Modularten identifiziert. Und sie sind in einer Fülle von Adapterproteinen, regulierenden Proteinen, Transkriptionsfaktoren usw. zu finden. Ich möchte hier nur einige erwähnen. Es gibt die SH2-Domäne (src-homology 2), von der ich gerade gesprochen habe, die das Tyrosinphosphat erkennt, die SH3-Domäne, die die prolen-reiche Region erkennt, WW, eine Domäne zwischen zwei Tryptophanen, ungefähr 27, 30 Distanzen lang, die ebenfalls Prolen-Blobs, aber mit einer anderen Sequenz, und außerdem Serin-Phosphat erkennt. Die Hauptfunktion der PH-Domäne (Pleckstrin-Homologie-Domäne), ist nicht die Protein-Protein-Interaktion, sondern das Erkennen von anionischen Kopfgruppen auf Phosphorlipid, auf Phosphorinositid, wie PIP2, PIP3. Sie erkennt auch das G-Protein und spielt diesbezüglich eine wichtige Rolle in der Chemotaxis. Die PTB-Domäne (Phosphotyrosin-Bindung) erkennt die Phosphotyrosin-Bindung, aber auf eine komplett andere Weise als die SH2-Domäne. Sie erkennt speziell dieses NPXY-Modul und hat eine sehr starke Affinität zu Upstream-Sequenzen. Es kommt also auch zur Bindung, wenn das Tyrosin nicht phosphoryliert ist. Und die PDZ-Domäne ist wahrscheinlich eine der wichtigsten Domänen für die Protein-Protein-Interaktion. Sie erkennt hydrophobe C-Termini, üblicherweise Valin oder Isoleucin und auch einige Beta-Finger, sehr scharfe Beta-Finger, die faktisch das C-Endsegment nachahmen. Und diese Bindungsmotive können sich entweder in verschiedenen Proteinen oder im selben Protein befinden, sodass die PDZ-Domäne einer Kopf-Fuß-Oligomerisierung unterliegen kann. Und das ist ihr Hauptcharakter. Ich werde auf diese Möglichkeit, Stränge von PDZ-Domänen zu Gruppen zu formieren, um Rezeptoren und Ionenkanäle zu organisieren, noch zurückkommen. Ich möchte Ihnen jetzt rasch anhand von Beispielen veranschaulichen, wie einige dieser Module funktionieren. Die SH2-Domäne wurde inzwischen in über 100 Proteinen gefunden, und zwar üblicherweise in Adapterproteinen wie RAB 2, das ist ein Analogon. Und sie binden üblicherweise an aktivierte Rezeptoren. Und bei den meisten sind mehrere SH3-Domänen vorhanden, die es solchen Adaptern ermöglichen, sich in einem Signalpfad bei verschiedenen Proteinen einzuklinken. Die SH2-Domäne kann aber auch noch eine andere, sehr wichtige Rolle übernehmen, nämlich als Konformationsschalter dienen. Viele Enzyme (und alle Src-Kinasen) enthalten ein Tyrosin-Phosphat, das als negative Determinante dient. Die SH2-Domäne kann sich damit verbinden und deshalb die katalytische Bindungsstelle abschirmen. Oder die SH2-Domäne kann in anderen Fällen an eine inhibitorische Domäne binden, die wiederum als negative Determinante dient. In dieser Form sind diese Enzyme also inaktiv. Dies ist der Fall beim SIP-Enzym und einigen Tyrosin-Phosphatasen. Eine Aktivierung erfolgt dann, wenn ein spezielles Tyrosin-Phosphat diese Phosphatgruppe lahmlegt und sich deshalb das Molekül öffnet, die katalytische Bindungsstelle frei macht oder dieses Enzym dann in Kontakt mit einem anderen Molekül kommt, das eine höhere Affinität für diese SH2-Domäne aufweist. Die SH2-Domäne richtet also sozusagen ihre Loyalität in diesem Fall statt auf das Enzym auf den Rezeptor. Man kann das SH2 also als internen Konformationsschalter betrachten, so wie die Phosphatgruppe als externer molekularer Schalter fungieren kann, um die Enzyme zu aktivieren oder zu hemmen. Die Hauptfunktion der PH-Domäne - und dies hat sich jetzt in über 500 verschiedenen Proteinen bestätigt - besteht darin, die Moleküle an die Membran zu binden und die gleiche Funktion wie eine Myristoyl- oder Palmitoyl-Gruppe zu erfüllen. Und diese findet man in Substraten, beispielsweise dem Fibroplast-Wachstumsfaktor oder dem Insulinsubstrat IRS1234. Diese Moleküle haben üblicherweise einen großen Tyrosinrest-Strang. Und sie dienen als Anhangsbindungs-, Verankerungs-, Anhangsandockstellen für Moleküle, die eine SH2-Domäne aufweisen. Wenn man also beispielsweise den Insulinrezeptor aktiviert, führt er sein Substrat an die Membran heran. Die PTB-Domäne "klatscht" es an den Rezeptor und der Rezeptor phosphoryliert sofort einen Großteil des Tyrosinrests und löst eine Signalübertragung nach unten aus. Die Bedeutung der PH-Domäne bei dieser Reaktion wird an einer Kinase deutlich, der Bruton-Kinase, BTK, die eine bedeutende Rolle in der B-Zellen-Entwicklung und Signalübertragung spielt. Eine Einzelpunktmutation in der PH-Domäne, die Arginin-zu-Cystein-Mutation, beeinträchtigt deren Bindung an die Membran und verursacht Wachstumsfunktionsaberrationen, die zu einer X-verbundenen Agammaglobulinämie führen, weil diese Kinase einfach nicht an die Membran hergeführt werden kann. Wie ich bereits sagte, verdankt die PDZ-Domäne ihre Charakteristik der Tatsache, dass sie Ketten bilden kann, Mehrfachkopien einer Kette. MAGUK steht für membran-assoziiertes Protein mit Guanylatkinase-artiger Domäne. Diese Proteine weisen keine Guanylatkinaseaktivität auf. Aber hier ist das postsynaptische Dichteprotein PSD95, von dem das PDZ seine Bezeichnung erhalten hat, das InaD-Protein, das ich noch besprechen werde, also eine Vielzahl von Proteinen, die alle eine modulare Struktur aufweisen. Und lassen Sie mich noch die Funktionsweise von einigen schematischen Beispielen aus der Literatur aufzeigen. PSD95, seine beiden PDZ-Domänen schließen sich zu Untereinheiten des NMDA-Rezeptors zusammen und dimerisieren den Kanal. Und eine weitere PDZ-Domäne, ich glaube das ist faktisch die zweite, kann zudem eine heterodimere Verbindung mit einer PDZ-Domäne der neuronalen Stickoxid-Synthase eingehen. Dabei handelt es sich um ein Enzym, das für seine Aktivität Calcium-Calmodulin benötigt. Die Lokalisierung der Synthase mit einem Kanal und der Synthase (die wie ich bereits sagte, ein Enzym ist, das Calcium-Calmodulin benötigt), also die Lokalisierung der beiden zusammen führt nach dem Calciumeintritt zu der sehr effizienten Produktion von Stickoxid. InaD hat eine PDZ5-Domäne, keine katalytische Aktivität. Und auch hier besteht die Hauptfunktion im Clustern vieler Enzyme in der Phototransduktion, dem Drosophila-Phototransduktionssystem. Das menschliche Homolog hat acht solcher PDZ-Domänen. Bei Aktivierung des Systems durch ein Photon über das G-Protein erfolgt also eine Aktivierung bei PLC Beta. Und das führt zur Produktion von Diacylglycerin und Calcium, was wiederum diesen prägnanten Rezeptorpotenzial-Calciumkanal aktiviert und den Calciumeintritt sowie die Zelldepolarisierung auslöst. Und die umgekehrte Reaktion, der Deaktivierungsprozess, ist eine calciumabhängige Reaktion unter Beteiligung von PKC, einer I-spezifische Proteinkinase C, Calmodulin, Arrestin, eine calmodulin-abhängige Proteinkinase. Aber durch das Clustern dieser Proteine wird eine riesige Verstärkung des Systems bewirkt, und zwar in einem solchen Ausmaß, dass die Aktivierung von Rhodopsin durch ein einziges Photon in einem Zeitraum von einer Millisekunde zur Aktivierung von rund 100 Calciumkanälen führt. Das ist also die Bedeutung des Clusterns all dieser Proteine. Und schließlich kann PKZ als Lokalisierungsmaschine der Zelle wirken oder dienen. In C-elegans beispielsweise können drei Proteine, 2, 7 und 10, jeweils mit ihrer PDZ-Domäne an den Rezeptortransporten beteiligt sein, insbesondere beim 23A Tyrosinkinase-Rezeptor. Diese Einheit kann also gemeinsam mit einigen ihrer Ziele oder einem Teil ihres zusätzlichen Proteins als Fracht für den Transport von Proteinen innerhalb der Zelle dienen. Die Komplexität der Regulierung der Signalübertragung lässt sich gut an P95VAV demonstrieren. Das sieht aus wie eines dieser Schweizer Taschenmesser, das für fast alle Funktionen geeignet ist. Mit all seinen Domänen kann es mit einer Vielzahl unterschiedlicher Systeme interagieren. Ich werde es hier nicht beschreiben, es ist ein Enzym. Es ist ein GEF, ein Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der immer mit einer PH-Domäne verbunden ist. Aber bedeutenderweise weist es analog zu Calponin eine stark hydrophobe Region am N-Ende auf. Calponine sind Proteine, die die Kontraktion der glatten Muskulatur steuern. Und diese Calponin-artige Region übernimmt eine sehr negative Funktion, weil Vav-Proteine bei Eliminierung eines Teils durch Abtrennung des N-Endes onkogenetisch werden. Und das Vav-Protein wird bei Rezeptoraktivierung phosphoryliert. Es wird durch das Fusionsprotein BCR-Abl phosphoryliert, das man mit der chronischen myeloischen Leukämie (CML) in Verbindung bringt. Ok, gerade gibt mir der Vorsitzende ein Zeichen, dass ich meine Zeit überschreite. Was ich sagen will, ist, dass das große Problem für die Zelle darin besteht, eine Auswahl unter all den Möglichkeiten zu treffen, die sie realisieren könnte, weil ein Protein wie das Vav-Protein ähnlich funktioniert wie diese Kreisverkehre, die Fahrzeuge in jede Richtung weiterleiten können. Und das ist eine große Schwierigkeit für die Zelle. Und sie kann das nur bewältigen, wenn sie von außen ein Signal erhält und wenn viele Rezeptoren zusammenarbeiten, miteinander kommunizieren, eine kombinatorische Art von Reaktion erzeugen. Das sind also einige Aspekte, die wir über die Signalübertragung wissen. Aber wie geht es von da aus weiter? Was sind die wichtigsten Probleme, die wir zu lösen haben? Wir kennen mehrere der bedeutenden Signalwege. Wir haben die Elemente dieser Signalwege charakterisiert. Wir kennen ihre Struktur, wir kennen ihre Funktion. Aber diese Moleküle sind nur die Wörter, die eine Zelle üblicherweise hervorbringt, um ihr Verhalten zu modifizieren. Wir kennen einige dieser Wörter, wir kennen Fragmente und Teile der verwendeten Sätze, aber wir kennen nicht die Sprache, die eine Zelle verwenden muss, um alle erfolgenden Reaktionen zu synchronisieren und zu koordinieren. Und darüber hinaus hatten die Zellen in 3,5 Milliarden Jahren der Evolution alle Zeit der Welt, sekundäre Signalwege, parallele Signalwege, Möglichkeiten und Feedback-Reaktionen zur Regulierung ihres Wachstums, zum Schutz in Notzeiten oder zur Planung ihres Todes zu etablieren. Und noch wichtiger ist vielleicht, dass wir die Sprache nicht kennen, die die Zellen mit anderen Zellen sprechen. Und diese war absolut entscheidend für den Aufbau dieser sehr komplexen Informationsnetzwerke, wie man sie in der embryonalen Morphogenese sieht, wie man sie im Immunsystem sieht - und in dem unendlich komplexeren zentralen Nervensystem, wo 1.000 Millionen Zellen über ungefähr 1.000.000 Milliarden Synapsen miteinander kommunizieren, um letztendlich die Erzeugung des Gedächtnisses und der Gedanken und des Bewusstseins zu bewältigen. Und wie Erwin Neher gestern schon sagte, wird dies eine der wesentlichen Herausforderungen sein, die die Biologen in den kommenden Jahren zu lösen haben. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.

Edmond Fischer (2003)

How Proteins Communicate with One Another to Integrate Intracellular Signals

Edmond Fischer (2003)

How Proteins Communicate with One Another to Integrate Intracellular Signals

Comment

„Signaling is very complex“, Edmond Fischer emphasizes at the beginning of this talk, his fourth one at the Lindau Nobel Laureate Meetings. Yet this complexity appears less daunting and more challenging when one listens to Fischer who is one of the pioneers of signaling research and at the age of 83 still an engaging and prolific speaker. Together with Edwin Krebs he had discovered the mechanism of reversible protein phosphorylation, which turned out to be the most prevalent switch of intracellular communication. In this presentation, however, he only briefly mentions his own achievement and turns to the wider field of signal integration within cells. Even if the unraveling of the human genome was an „achievement of enormous proportion“, the knowledge of the genome is not nearly sufficient to explain and understand cellular signaling. „The cell in a body is exposed to a multitude of signals that it has to integrate into a coherent response“, he says. „The pathways have to speak to another – this is a subject that belongs to the field of proteomics.“ Focussing on signal transduction via enzyme-coupled receptors, Fischer summarizes current knowledge on how extracellular signals are relayed into the cell, and then turns to a detailed description of interaction domains, which allow signaling proteins to assemble to signaling complexes that consequently trigger downstream cascades. „Communication is practical mechanical: Proteins interlock with one another, comparable to lego“, Fischer says. Vividly he introduces form and function of interaction domains such as SH2, PH, and PDZ to his audience. It is typical for Fischer that he does not get lost in details but keeps the big questions at the horizon in mind. „How does the cell select among all it can do?“ Doesn’t its situation resemble that of a car driver who finds himself in a roundabout that can send him to many different directions? How can a cell, faced with a plethora of signals, choose the right combinatorial type of response? „We know several important pathways, their structures and elements“, Fischer concludes. „But these molecules are only the words that the cell brings about to modify its behaviour. We know some of these words, even pieces of sentences, but we do not know the language the cell uses to synchronize the signals.“Joachim Pietzsch

Abstract

The types of reaction a cell uses to transduce an external signal into a particular response will be discussed. The subject belongs to the field of proteomics as opposed to genomics. Some characteristics of both will be contrasted, emphasizing that the proteome that remains constantly in a state of flux represents a far more complex and dynamic entity than the genome.

The main focus of the talk will be on signalling by tyrosine phosphorylation which has been directly implicated in the regulation of cell growth, differentiation and transformation. External signals coming in the form of mitogenic hormones and growth factors act on transmembrane receptors that are themselves tyrosine kinases; these, in turn, transduce they signals with the help of a variety of adapter or docking proteins that interact with one another through a diversity of binding domains, thereby initiating different signalling pathways. Some of the properties of these modules will be detailed. The src-homology 2 (SH2) domain, in addition to allowing adapter or linker proteins to bind to activated receptors, can also serve as an internal conformational switch to regulate the activity of various enzymes. The PH domain recruits protein to the membrane while the PDZ domain which is usually found in multiple copies within a protein serves mainly to cluster ion-channels and receptors on the membrane, and bridge them to the cytoskeleton.

Transmembrane protein tyrosine phosphatases which catalyze the reverse reaction also have a modular structure, often containing immunoglobulin-like and/or fibronectin type III repeats. Surprisingly and contrary to the tyrosine kinase growth factor receptors that respond mainly to circulating ligands, the tyrosine phosphatase receptors display all the hallmarks of cell adhesion molecules. This would suggest that they are involved in, or regulated by, cell-cell or cell-matrix interaction, with the exciting possibility that they might be directly implicated in contact inhibition. Some of the problems that confront us in the field of cell signalling and remain to be solved will be summarized.

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