Ferid Murad (2007) - Nitric oxide as a messenger molecule and its role in drug development

The role of nitric oxide in cellular signaling in the past three decades has become one of the most rapidly growing areas in biology. Nitric oxide is a gas and a free radical with an unshared electron that can regulate an ever-growing list of biological processes

So after this wonderful start of the meeting, we heard about the Big Bang, and I think the following talk also can be considered that it has been a Big Bang in biomedicine. That was the discovery of nitric oxide. It’s a great pleasure to ask Professor Ferid Murad from Houston, Texas to give his lecture to us here. He won the Nobel Prize in physiology and medicine in 1998. And it was listed for the discoveries concerning nitric oxide as a signalling molecule in the cardiovascular system. Professor Murad. This is my first visit to Lindau. It looks like a very exciting opportunity for the speakers as well as the students and I’m going to enjoy the week, I can assure you. Shortly after the Nobel Prize was announced, my office received numerous phone calls from the local schools in Houston, the high schools, the colleges, asking me to give lectures and meet students and I did that. But the requests really got to be enormous and I couldn’t keep up with it. So I went to the audiovisual television department in the Texas Medical Center and asked if they would help me put a video together. So this morning is going to be movies and films. This department is really an excellent department. They prepare tapes and videos for patients, how do they manage their ileostomy bags, how do they manage their renal shunts for dialysis and so forth. So we got together and put a dialogue together, we exchanged a lot of information back and forth and finally one Saturday morning they showed up at my home and we prepared this video and I think you’ll enjoy it. Now, it was prepared for teenagers but I’ve shown it to 4 year olds, 85 year olds and everybody seems to enjoy it because it’s science in lay language that all of you should understand. So let’s start with the video. Girl 1: Gosh, what’s with all the awards shows? TV: And the winner is... Congratulations. And now I ask you to step forward and receive your Nobel Prize. Girl 1: Nobel Prize? What is that? Girl 2: Beats me. Prof. Dr. Ferid Murad: What? You don’t know what the Nobel Prize is? We have to do something about that. Girl 1: Wow! Girl 2: What’s up with this? Boy: Hey, you’re just coming out of the TV! It’s like aliens. Prof. Dr. Ferid Murad: May I? Girl 1: Yeah sure, why not? So, what’s your story? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, my name is Ferid Murad. You can call me Fred. I’m a doctor and researcher and a scientist at the University Of Texas Medical School. And, oh, by the way I got the “Nobel Prize” in medicine in 1998. Girl 2: So, what is that “Nobel Prize” anyway? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, the Nobel Prize is one of the greatest awards you can get in the world. Boy: Aha... Prof. Dr. Ferid Murad: It’s recognition from other scientists. Girl 2: So? Prof. Dr. Ferid Murad: Hmm. Well, you get to be on TV all over the world. There’s a big party in Sweden. You even get to meet the King and Queen of Sweden. You get a gold medal. Then of course there is the money. Boy: Money? Girl 1: Party? Girl 2: Royalty? Prof. Dr. Ferid Murad: Yeah. Maybe it would be better if I showed you. May I? Girl 1: Mmm...sure. Prof. Dr. Ferid Murad: Thanks. Scientist on TV: Thanks, Fred. Welcome to my world of science and my laboratory. You know, the Nobel Prize wouldn’t even be around if it wasn’t for...dynamite. Anyway. Alfred Nobel, the Swedish inventor and businessman who invented the Nobel Prizes, was the guy who invented dynamite. Nitro-glycerine is the explosive chemical in dynamite. And even though it was very dangerous, Mr. Nobel figured out a way to contain nitro-glycerine so that it could be put to good use like to build stuff. You could say his discovery rocked the world. But nitro-glycerine has other uses. When Nobel started having heart problems, his doctor actually prescribed nitro-glycerine for his heart. But Nobel said: “No way.” So he blew it. Nobody knew why it worked. But it did. and he shared the 1998 Nobel Prize in Medicine with Dr. Robert Furchgott and Dr. Luis Ignarro for figuring it out. Boy: So you’re the dude that figured out why nitro-glycerine helps peoples’ hearts? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, yeah. Girl 2: So? Prof. Dr. Ferid Murad: So what? Girl 2: So why does it work? Prof. Dr. Ferid Murad: We were trying to answer the question to how nitro-glycerine works to help with chest pain. I did experiment, observed the results and collected data. Then I found out if what I thought was right or wrong. Anyway, what I did find was that nitro-glycerine releases nitric oxide and that nitric oxide does a lot of important stuff in the body. Girl 1: So, what is nitric oxide? And what exactly did you figure out that got you this “Nobel Prize”? Prof. Dr. Ferid Murad: Let me show you. Announcer on TV: It protects the heart. It stimulates the brain. It kills bacteria. And it’s a real gas. It’s nitric oxide. No one can say no to NO. Nitric oxide or NO is a simple molecule with two adapts, nitrogen and oxygen. And yes, it’s a colourless, odourless gas. A scientific sensation sweeps the globe. Nitric oxide is everywhere. It’s coming in toxic pollution depletes the ozone layer. It’s even found in car exhaust and cigarette smoke. But from super-menace to superhero. Nitric oxide is also found inside the human body and it helps send very important messages which are not from our sponsors. When blood flows through your blood vessels, the inner lining or endothelium releases nitric oxide. The nitric oxide signals your blood vessel to relax and widen. So what? This in turn lowers blood pressure, the force which the blood exerts on the vessel walls. If your blood vessels make enough nitric oxide, this signals your blood vessel to relax. Then your blood flows on through. No problem. But if blood doesn’t flow through, blood plugs forks. Then... (heart attack). And that’s not all! Scientist on TV: So relaxed blood vessels allow more blood to flow and nitric oxide can have an impact on all different parts of the body. For example, nitric oxide is already saving the lives of babies who are born too early by breathing in very small doses of this gas. It helps their lungs and improves their breathing. And that’s good! In nerve cells nitric oxide can stimulate the brain affecting things like behaviour. Oh behave, baby! As part of the body’s self-defence system nitric oxide defends against tumour cells and bacteria too. It’s amazing stuff. But nitric oxide is no laughing matter and not to be confused with nitrous oxide, better known as laughing gas. Ha-ha... somebody turn of that gas. Boy: So how do you think of all that anyway? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, over time I became very interested in how cells talk to each other. But most other scientists didn’t think that was very important. Scientist on TV: Dr. Murad figured out that when cells talk to each other, it’s like one cell sends an e-mail to another cell somewhere in the body. And the e-mail is the gas nitric oxide. The e-mail can break into another cell and take over how the cell works. It may contain a message like instructions for a blood vessel to relax. Or it may contain some other kind of instructions. For example, if the message is being sent to a cancer cell, the nitric oxide may kill the cancer and then self-destruct. Hasta la vista, baby. Nitric oxide in your body affects so many things. It’s like having a worldwide internet system inside your own body. Girl 1: So why did you go into science in the first place? Prof. Dr. Ferid Murad: Well, it’s really a lot of fun to figure out how stuff like this works. And you don’t have to be brilliant to get ahead. You just have to have some goals and be prepared to work very hard. Scientist on TV: As a scientist you get to do something for the first time that nobody else has ever done. And that’s exciting! Sometimes your discovery opens the door to a whole new way of thinking and even more new discoveries. It is really cool! It’s kind of like the “Science Olympics” and the goal is the Nobel Prize. Teams of scientists from around the world compete with each other. It’s fun. Who’s going to finish first? Who’s going to win the prize? Prof. Dr. Ferid Murad: One of you could be a Nobel Prize winner someday. Who knows? Boy: Hey! I have some more questions. Girl 2: Yeah, me too. Girl 1: Well, I guess we have to find out more on our own. Girl 2: Maybe we could check the internet. Boy: Yeah, and look out for science and the Nobel Prize. Prof. Dr. Ferid Murad: They’re gone and they left some popcorn, didn’t they? Yum! I was very fortunate in that I was one of the first MD PhD students in the United States when the program began in Cleveland and I decided that that’s what I wanted to do somehow. I wasn’t sure how I made that decision. I was excited about chemistry and biology. I guess I was confused more than anything else. And said I’m going to try both and see which way to go and I got hooked and I’ve always straddled the fence the rest of my life. My mentors were Earl Sutherland and Ted Rall. They had just discovered cyclic AMP a year before I joined their laboratory. And what an exciting time this was for a young student. My assignment was to figure out how catecholamines, adrenalin regulates cyclic AMP production in tissues and whether it works through the beta adrenergic receptor or the alpha receptor. And that was a pretty straightforward and actually simple assignment. But to see this whole era of cell signalling and messengers evolve was a remarkably exciting time. To see all the hormones that work through these pathways and all the drugs that were evolving that I became hooked on second messenger systems and cell communication. Cell communication is really an old concept, probably first introduced by Pavlov more than 100 years ago. As you recall from your psychology classes Pavlov had a patient with a gunshot wound to his abdomen who developed a gastric fistula to the exterior. And whenever the patient would see or smell food, he would enhance his gastric secretions. Well, Pavlov was clever enough that he developed pouches and fistulas in dogs and showed them food and they too would enhance their gastric secretions. But he decided to condition these dogs by ringing a bell. And ultimately all he had to do was ring a bell and they would enhance their secretion without having to show them food. That told him that the brain was talking to the stomach, cells communicate with each other. Of course we know today that lots of cells and tissues in the body communicate with each other. And this is summarised for you in this cartoon, in this first slide. This represents three different populations of cells that are going to talk to each other. They can be any cells but I’m going to call cell 1 a neuronal cell. It can be a central neuron or a peripheral neuron. Cell 2 I will call an endothelial cell lining a blood vessel and cell 3 a smooth muscle cell in the wall of that blood vessel. Cell 1 wants to talk to cell 2 and also cell 3. And it does it by producing molecules that Earl Sutherland called first messengers. Today we call them hormones, we call them cytokines, we call them growth factors, we call them a variety of things, paracrine substances, autacoids etc. They come in different shapes and sizes and flavours. Some are small amino acids; some are large proteins like the cardiac troponins. The point is they’re released into the interstitial space in the blood stream and they home the body to find its target. It identifies its target cell by the presence in their membrane of a macromolecule that we call a receptor. Sometimes these receptors are inside of the cell, as with steroids and thyroid hormone, but most often they’re transmembrane proteins, integral membrane proteins in the membrane surface. These ligands or first messengers interact with their appropriate cells that only possess those receptors. That’s where the specificity of the reaction occurs. They fit together conformationally, like a key in a lock. And they then only perturb the cells that have the appropriate receptor. The ligand doesn’t necessarily have to enter inside of the cell to cause the cascade of biochemistry to result in some physiologic response. They can just interact with the receptor, it tweaks it and then all of a sudden, voila, there are lots of different intracellular second messengers that accumulate. The first such second messenger was cyclic AMP. What Sutherland and Rall discovered: This is how glucagon and epinephrine regulated glycogen degradation in the liver. We know today that lots of pathways utilise that messenger. We also know that there are other second messengers besides cyclic AMP: cyclic GMP, calcium, diacylglycerol, nitric oxide. And while there are hundreds and hundreds of first messengers, there are a modest number of intracellular second messengers. Perhaps no more than a dozen at present but there will be more, I’m sure, in the future. These second messengers accumulate and carry out the function within the cell that was brought by this first messenger to the cell surface. What is unique about nitric oxide as an intracellular second messenger is that it’s a gas. It’s a free radical with an unshared electron and a very simple molecule. And because it’s uncharged, the physiologic pH, like all the other messengers, it doesn’t go in and out of membranes... it goes in and out of membranes much more readily than the other messengers that often require energy or transporters to do that. So it not only regulates the biochemistry in the cell in which it’s made, nitric oxide, but it can come out and travel a couple of hundred Angstrom, microns, to regulate adjacent cells to produce other second messengers such as cyclic GMP. So it’s a very unique messenger molecule. It’s the only messenger I’m aware of that functions both intracellularly as well as extracellularly. It can be a paracrine substance, a local autacoid. It can also bind with other carriers, glutathione, thiols, albumen, other proteins and be transported a distance to be released again and function therefore as a hormone. No other messengers can do that. Nitric oxide is a very old molecule and I have a theory that it participated also in evolution. It was probably one of the first messenger molecules 3 billion years ago, as cells began to communicate with each other. But I won’t get into that story because time doesn’t permit. But today we know that it’s very important as a pollutant. And this is when it became popular about 50 or 60 years ago when it was apparent that all fossil fuels when combusted with oxygen produced a family of nitrogen oxides, NO, NO2, N2O3 etc. All of these nitrogen oxides will interact with ozone and deplete the ozone layer and are responsible for global warming along with the greenhouse gases. But I’m going to tell you that not only is the nitric oxide a pollutant but it’s the mechanism of action of some very important cardiovascular drugs and it’s a very important messenger molecule in the body. And this is just a partial list of the biology that it regulates. And the list is much, much longer than this. It includes muscle relaxation, platelet aggregation, penile erection, killing of parasites and microorganisms and the list goes on and on. We’ll come back to some of that shortly. In 1963, 7 years after the discovery or 6 years after the discovery of cyclic AMP, a couple of chemists discovered for the first time cyclic GMP, another cyclic nucleotide, a cousin of cyclic AMP. All you do is shift the amino group on the purine ring and you have a different structure. They administered inorganic P32 phosphate to rats, harvested the urine and found two major organic phosphates in urine, cyclic AMP, the other being cyclic GMP. That was the first demonstration of cyclic GMP as a natural product. That stimulated a few laboratories to become interested in cyclic GMP, to look for enzymes that made it, enzymes that hydrolysed it etc. And the story began to evolve in the late 1960s, early 1970s just as I was finishing my training and getting ready to join the faculty at the University of Virginia. We know today that there is a family of enzymes called guanylyl cyclases and there are at least seven or eight members of this family and we think there will be even more with splice variants that we’re now isolating. All of these enzymes convert GTP to cyclic GMP and pyrophosphate. The reaction is very analogous to add an OH cyclase that converts ATP to cyclic AMP and pyrophosphate. In fact the catalytic domains of all of the cyclases are homologous with the change of one or two amino acids, one enzyme can make the other nucleotide. The cyclic GMP can be inactivated by a family of phosphodiesterases; there are at least 10 or 11 members in this gene family. And they hydrolyse the phosphodiester bond to convert the cyclic nucleotide to the corresponding monophosphate, either 5’ GMP or 5’ AMP and it becomes inactive. As you will hear later in the week from Doctor Fischer, many of the intracellular second messengers, cyclic AMP, cyclic GMP, diacylglycerol, calcium etc., often activate a protein kinase that then phosphorylates a variety of protein substrates by transferring the gamma phosphate from ATP to a serine-threonine residue or perhaps a tyrosine residue. There are I’m told now as many as 500 or 600 protein kinases. So while the concept of cell communication is pretty simple, a ligand or hormone regulates the second messenger production which then regulates the protein kinase which phosphorylates a protein, the problem is the matrix gets pretty hairy when you consider all the cyclases, the diastasis, the protein kinases and the numerous proteins that can be phosphorylated. When these proteins are phosphorylated, as you’ll hear from Doctor Fischer, their conformation changes. If they’re structural proteins they can influence motility and other processes, contractility. If they’re enzymes they can be activated or inhibited. So as this story was beginning to unfold with cyclic GMP, I decided to desert cyclic AMP and switch my interest to cyclic GMP. As a new young faculty member in the early 1970’s the cyclic AMP field in my opinion was becoming rather crowded, large groups of people around the world. And I didn’t think that I could compete with all these huge laboratories and cyclic GMP was evolving and I said I’m going to go in this new direction. And I wanted to address two questions. We knew that a couple of hormones could increase cyclic GMP accumulation in a couple of tissues, acetylcholine in heart preparations, prostaglandins in vascular preparations. But we didn’t know the molecular coupling mechanism. If we understood ligand binding to the receptor and the coupling to the guanylyl cyclase to make cyclic GMP, we could presumably influence that coupling process with various chemicals and drugs to potentiate a hormone response or block it and maybe come up with some novel therapies for various endocrine diseases. That was quite rational. The second is, although cyclic GMP was a natural product, we had no idea what it did or what its function was. So we began our studies by looking at the enzyme in some detail that made cyclic GMP and the first big surprise was that there wasn’t just a single enzyme but a couple of enzymes. The enzyme activity was in soluble fractions as well as particulate fractions. The kinetic properties of this isoforms was different. I suspected there would be isoforms. I had thought to myself: If there are different compartments and isoforms of guanylyl cyclase, perhaps they’re regulated by different groups of hormones, wouldn’t that be a fun project to sort out. And a lot of that all turned out to be true intuition at the time. Well, to prove that we were dealing with isoforms was going to take a lot of work. We had to purify these soluble particulate activities, clone them, express them, restudy them. We did that, it took us 12 or 15 years of work to do all that. But initially I took a shortcut. I said the cooperativity of the particulate isoform, whereas the typical Michaelis-Menten kinetics of the soluble could be artifactual because these were crude preparations that possessed nucleotidases, phosphatases, phosphodiesterases. So we created a cocktail and added it to our incubations to inhibit all these competing pathways. We made a cocktail pyrophosphate, fluoride, azide, hydroxylamine, sodium nitrite, methylxanthines etc. And quite accidentally, as science often is the case, we found compounds that activated the enzyme. While our goal was to figure out hormonal regulation, we couldn’t do that because once we disrupted tissues, the hormone coupling was lost. Hormones no longer activated extracts of the enzyme. But the small molecules now would activate and maybe they could be our surrogates for understanding hormonal regulation. Much as fluoride was a valuable resource for understanding hormonal regulation of adenylate cyclase. The activators were azide, hydroxylamine and sodium nitrite. And to make a long story short, the effects of the azide were oxygen dependent, enhanced with thiols, had a time lag before the rate of the reaction became maximal. They were tissue specific because tissues possessed inhibitors and activators of the pathway. And we were convinced that these activators were precursors or prodrugs being converted to something else in our incubation. And it became quite a mystery story for several years to figure out what that activator was going to be. We put azide and hydroxylamine and nitrite on cell cultures in tissues. And indeed they would elevate cyclic GMP levels and would also activate the enzyme and extracts. So they would work in both systems. One of the tissues, again fortunately, that we were working with was tracheal smooth muscle. As a student I knew that cyclic AMP relaxed smooth muscle, vascular and airway smooth muscle. And I thought cyclic GMP might antagonise cyclic AMP. So we prepared a smooth muscle preparation that was relatively homogenous in order to do some biochemistry and compare it with a physiologer. We put azide on those smooth muscle preparations, the cyclic GMP levels went up, but the muscle didn’t contract, it relaxed. The opposite of what we expected. The dose response curves, the time courses, everything told us that azide was a smooth muscle relaxant, mediating its effects through cyclic GMP and that’s how it worked. And that was the first physiologic function of cyclic GMP. We said: If these drugs cause relaxation and elevate G, what do the other smooth muscle relaxants do? Nitro-glycerine, which had been around for 100 years, nitroprusside? A lot of popular drugs in the cardiovascular intensive care units. They decreased after load, lowered blood pressure in patients with infarction and so forth. We put them on our preparations, they relaxed as expected. The surprise was that they elevated cyclic GMP levels. So now we had a family of compounds that we called nitrovasodilators that were capable of activating guanine cyclase in cell free preparations and elevating cyclic GMP levels in various tissues. These compounds included hydroxylamine, azide, sodium nitrite, some hydrazines, nitro-glycerine, nitroprusside, nitrosoureas, nitrosamines and a long list of other compounds, all NO donors. They all have nitrogen. Some are converted spontaneously based on redox and pH incubations. Some are converted insomatically, azide requires catalase conversion. And we reasoned that the intermediate for all of these prodrugs or precursors had to be nitric oxide. And the reason we thought it was nitric oxide is because azide’s tissue specificity was in part influenced by the presence of haemoglobin and myoglobin in our tissue extracts. These were inhibitors. We knew from the literature that NO had a very high affinity for the heme prosthetic group of haemoglobin, myoglobin. So we reasoned that all of these prodrugs or precursors were converted to nitric oxide. When we generated nitric oxide in the fume hood chemically, sodium nitrite, ferrous sulphate, sulphuric acid, ventilated the gas into our incubations, every preparation was activated. What an exciting period that was. The first demonstration that a free radical could activate an enzyme. And I thought that would be interesting chemistry. Lots of folks were sceptical. They all thought of free radicals and the nitric oxides as pollutants and toxic materials and sure enough it activated. Some people argued: Murad, you’re inhibiting an inhibitor, you’re disinhibiting in your crude preparations. So we were obliged to purify the enzyme to homogeneity and when we did the concentration the nitric oxide required to activate kept becoming lower, lower, lower as we moved scavengers and sinks from our incubation. Transition metals, thiols, proteins and sucked it up, you know. Nanomolar concentrations of NO would activate the enzyme and the Vmax would increase 200- to 400-fold, as it would lower the Km for GTP. So we realised that we had figured out the mechanism of action of the nitrovasodilators, such as nitro-glycerine that had been used clinically for 100 years. As a pharmacologist, when you find an exogenous material that does something in a biological system, you should ask yourself: Is it mimicking a natural pathway that’s already there? And is it working through a similar mechanism? So I proposed in some review articles in the late ‘70s that perhaps the effects of various hormones to increase cyclic GMP levels were because they were increasing the production of nitric oxide from some endogenous precursor, perhaps by altering some redox pathway. We couldn’t prove that hypothesis because the technology was not there to measure nitric oxide in its oxidation products at animals or concentrations back in the 70’s. There were crude colorimetric assays. So to prove this took another seven or eight years of technology development before we and others were able to prove that it turned out to be the case. But we expected that nitric oxide was going to be an intracellular second messenger and that was heresy. And it was enough to show that it activates... a free radical activates an enzyme, now you're saying a free radical is a second messenger and it turned out to be true, we turned out to be right. And basically that’s the reason we went to Stockholm. Shortly after this Robert Furchgott, a vascular pharmacologist in New York, showed for the first time that a group of agents would relax vascular segments in the organ bath in the laboratory. Agents such as acetylcholine, histamine, bradykinin that were known to be hypotensive in man or animals had always failed to cause relaxation in the laboratory. He found, if he preserved the integrity of the endothelium in his blood vessel preparations, they would cause relaxation. And that was an exciting turn of events in 1980. I heard him present this work, he said that these substances caused the release of a factor from the endothelium which he called endothelium-derived relaxant factor, or EDRF, and had a half-life of only several seconds. I said: Bob, this is a reactive species, maybe a free radical, maybe it works in cyclic G, maybe it’s going to be related somehow to NO. Let’s figure this out. Well, we moved to Stanford, Bob went to New York, his wife developed breast cancer and that collaboration never took place. But a couple of years later we became impatient and moved on ourselves and showed that that hypothesis was in fact the case. This is a blood vessel precontracted with norepinephrine. And then after five or seven minutes we introduced an endothelial dependent vasodilator, acetylcholine, bradykinin, ATP ionophore, histamine etc. And if the endothelium is present, cyclic GMP levels increased within seconds, returned to basals and this is followed by relaxation in the muscle. But that only occurs if the endothelium is intact, if there’s no endothelium there’s no increase in cyclic G, no relaxation. So we knew by the early 1980s there were now two pathways converging on guanylyl cyclase to regulate cyclic GMP synthesis. The NO donors in the endothelial dependent vasodilator pathway. We spent a couple of years showing that this resulted in the activation of protein kinase G in vascular smooth muscle preparations. We then chased the phosphorylation of a variety of proteins with P32 incorporation. And to put all of the story together for you, it’s summarised on this slide. This cartoon represents a blood vessel with the endothelial lining on the left and the smooth muscle compartment on the right and in red are three categories of vasodilators that work by enhancing cyclic GMP production. The nitrovasodilators that are converted spontaneously based on pH oxygen tension etc. or the enzymatically converted, such as nitro-glycerine, to nitric oxide which activates the soluble guanylyl cyclase. Soluble guanylyl cyclase is a heterodimer with an alpha-beta-subunit and the beta-subunit has a heme prosthetic group at the histamine 105 position. The iron in that heme has to be ferrous, NO binds to the ferrous, changes the liganding of the heme to the beta-subunit which then talks to the catalytic domain down at the C-terminal, resulting in activation of the enzyme. The cyclic GMP activates a cyclic G dependent protein kinase. There are a couple of these, soluble and particulate that phosphorylate numerous proteins. These proteins regulate the concentration of cytosol calcium by altering distribution within the cell from stores or through channels in the membrane. And we know that the myosin light-chain kinase is a calcium calmodulin dependent enzyme. So when you decrease calcium, you decrease the kinase, myosin light-chain accumulates in the dephosphorylated state. If you take actin and myosin filaments, when you phosphorylate the myosin light-chain, they slide together for contraction. You dephosphorylate they slide apart and you get relaxation. Since this work it’s been shown that cyclic GMP also regulates the phosphatase activity perhaps. The endothelial dependent vasodilators do exactly the same thing; however, the receptors for these endothelial dependent vasodilators are only on the endothelial cells, not the smooth muscle cells. That’s why patients with arthrosclerosis and cardiovascular disease get direct acting NO donors, nitro-glycerine, nitroprusside etc. They don’t get endothelial dependent vasodilators because their endothelium is abnormal. And I’ll tell you more about that in a moment. But they produce EDRF, which we know is nitric oxide, to work through the same pathway. A third category are the atriopeptins. It was found some years ago by deBold that the granules and atria possess a peptide called atrial natriuretic factor and we found that that factor, atriopeptins and the family of these, activate the particulate isoforms of guanylyl cyclase and there are several of these. It turns out the particulate cyclases are receptor cyclases. For atriopeptins, guanylyl, e-coli enterotoxin etc. And by elevating cyclic G, they too will cause relaxation. Now, you can relax smooth muscle in other ways with agents that alter calcium, agents that increase cyclic AMP, phosphodiesterase inhibitors etc. These are the mechanisms in which you cause relaxation by enhancing cyclic GMP production. But you can start combining this information now to create novel combination therapies for various cardiovascular diseases and I’ll show you how to do that in a moment. There was some other very important observations along the way and I’m going to have to skip them. But it became apparent by the mid and late 1980s that there had to be a pathway that was making nitric oxide. People were finding nitride and nitrate in their condition media, people were finding arginine activation of the pathway. And it turns out indeed there’s a family of enzymes called nitric oxide synthases, very ubiquitous, found in most tissues. And there are 3 isoforms, initially called neuronal NOS, inducible NOS, endothelial NOS, the tissues which they were first purified and characterised. Because they’re so ubiquitous, I’ve suggested we call them NOS-1, 2 and 3 in the chronological order in which they were first characterised, purified, cloned. Very homologous, about 50% to 60% homology with each other. Some are soluble, some are particulates, lots of opportunity for post-translational modifications. Some are acylated with polmitate or myristate; many of them are phosphorylated by various kinases. A very complicated family. Normally this NOS-2 or inducible NOS is not found in tissues. You don’t see transcript or protein unless there’s been an inflammatory insult. So it’s become a biomarker of inflammation. You can enhance its production by anything that turns on the NF-kappaB pathway, endotoxin, pro-inflammatory cytokines, IO1, interfering gamma etc. And you make a lot of enzyme which is a high output production stage for nitric oxide that will participate in a lot of cytoxic and inflammatory processes. All of these enzymes catalyse this reaction. They oxidise the guanidino nitrogen of arginine. They oxidise the turtle guanidino nitrogen to an intermediate hydroxy arginine, further oxidised NO and citrulline. The enzymes are only active as homodimers. They have a heme prosthetic group. They require NADPH oxygen flavines, heme as a prosthetic group. Very complicated. If the bioptron is oxidised to the dihydro, it no longer makes NO but the enzyme now makes super-oxide, one of the worse things you can do in nitric oxide biology. So let me put this pathway together for you. We know now that various hormones and ligands will interact with their appropriate receptors to regulate various co-factors for the nitric oxide synthase pathways to convert arginine to nitric oxide and cytroline. This then activates soluble guanylyl cyclase to make cyclic GMP which activates a kinase and the cascade goes on to cause some processor event. We can influence this pathway in a variety of ways now with pharmacological tools. We have compounds that are receptor agonist and antagonist. We can modify the availability of the cofactors. We have compounds that are arginine analogues or guanidino analogues to block and inhibit the nitric oxide synthases. Some of these are in clinical trials for septic shock and inflammatory diseases. We can scavenge the NO not only with haemoglobin and monoglobin but also with various thiols that are also in clinical trials. There are compounds available that activate the cyclase without NO. We have a mutant enzyme that doesn’t require NO for gene therapy some day we think. You can also enhance the activation by NO or another gas, carbon monoxide, which is a weak activator in the presence of compounds, and there are inhibitors available as well. So we have tools now to begin to approach this system. But the system is a little bit more complicated than that, it always is. When you make nitric oxide, what it wants to do is activate guanylyl cyclase to make cyclic G, to inhibit platelet aggregation, to act as a neurotransmitter, to influence smooth muscle relaxation, all the beneficial sorts of things. However it can get oxidised to nitrite nitrate, it can form complexes with other transition metals. It will form complexes with various thiol groups and proteins. More than 100 proteins get nitrosated on the cysteine residues and one of the important pathways is the interaction of nitric oxide with superoxide anion. This reaction is almost diffusion limited. So whenever you’ve got either in contact with one another, that’s the reaction that will take place and it acts as a steal or a sink to pull it away from the cyclic G pathway. And you make peroxynitrite, which is even more toxic than nitric oxide or superoxide. Peroxynitrite will nitrate protein residues adjacent to the hydroxyl and tyrosines, perhaps sterically inhibiting or interfering with tyrosine kinase phosphorylation in some cases. So maybe the two systems are talking to each other. The tyrosine kinase pathway, the NO pathway, perhaps. There’s been very little evidence in vivo showing that, most of the evidence so far as been in vitro. There is an important disease called endothelial dysfunction. Many of us, certainly the older folks in this audience, have endothelial dysfunction, maybe not so many of the younger people yet. It occurs with hypertension, atherosclerosis, diabetes, tobacco use and perhaps obesity. In all of these disorders there’s oxidated stress, the formation of reactive oxygen species, hydrogen peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical and the tissue of blood vessels don’t make sufficient quantities of nitric oxide, for a variety of reasons and I’m not going to go through all the reasons. But the net outcome is your blood vessels don’t make enough NO. They tend to be vasoconstricted, you accelerate the atherosclerotic process. You diminish perfusion in diabetic ulcers and lesions. So it’s a vicious cycle, as you get more constricted more reactive oxygen species, less NO. It gets worse and worse. So you’ve got to interrupt it, you’ve got to treat the underlying disease and perhaps come along with some new approaches, perhaps arginine supplementation to make more NO, antioxidants to get rid of the reactive oxygen species. And there are a lot of clinical, a lot of annual studies to support that. There are some clinical studies. The clinical studies have been very controversial. Almost through here, another slide. The nitric oxide field is gone absolutely bananas. Our first paper on the biological effects was in 1977. Almost as many as cyclic AMP, more than G proteins and a lot of other things. It’s incredible. That is about 6,000 to 8,000 papers per year, in the last 5 to 10 year period. That’s 20 to 30 papers a day. There’s no one in the world to keep up with it. It’s very frustrating for all of us in the field. But it’s also very exciting to see this interest and enthusiasm. I’ve created a partial list for you, this slide and the next, to show you where this field is going to go I think in the next decade with regard to a novel drug development and how you can take these biochemical molecular targets that we and others have described and turn them around now in high throughput screens and other assays to find chemical leads to make new therapeutics. We know, as I said, that NO is participating as a neurotransmitter in the brain, in some regions of the brain, both centrally and peripherally. If you make a NOS-1 knockout mouse and induce a cerebral infarct, the size of the infarct is smaller. If you make a NOS-3 knockout mouse, induce an infarct, the infarct is bigger. If you do a double knockout, NOS-1 and NOS-3, the mouse is not very smart anymore, it can’t get through the water maze just to find the flow. So the participations of nitric oxide is transmitters in various regions, also with memory and we certainly haven’t figured all that out. We know it plays a role in fluid production and re-absorption, in the eye for glaucoma, retinal neuronal degeneration. We talked a lot about vasodilation; pulmonary hypertension was mentioned in the movie. It’s been exciting to see that develop. Premature babies maintained in in vivo circulation, they don’t need to profuse their lungs because they get their oxygen from the placenta from their mother. If they’re born prematurely, their blood vessels are constricted, their lungs are not developed, they need surfactant, you need to dilate those blood vessels and they shunt right to left, so they’re hypoxic babies. If you give them a little nitric oxide in the nasal catheter, they dilate the vessels, they don’t shunt quite as much, they become oxygenated. There’s been a marvellous improvement to eliminate the need for ECMO therapy, which is rather nasty. You all know about Viagra. It came out of this research, not us but we developed the concepts. We used to joke in the lab, we’ll fill condoms with vasodilators and NO donors and PD inhibitors, they work. Viagra is an inhibitor of the type 5 phosphodiesterase which is found predominantly in blood vessels, both in the corpus cavernosum as well as the systemic vessels. This is why patients who take Viagra and now take NO donors, nitro-glycerine, can get severe hypertension, arrhythmia, strokes etc. So one has to be careful, it’s not a street drug, it can get you in trouble. It participates in wound healing and angiogenesis, atherosclerosis. If you look at exhalation of NO in your breath, it’s a wonderful marker of the severity of asthma. The more inflammation in your lungs, the more induction of NOS-2, the more NO you make, the more NO in your breath, so the clinician can have you breathe into a bag or tube and if the NO is elevated, he knows that your asthma is out of control and he’ll readjust therapy. It’s been very useful. There are clinical studies for septic shock, platelet aggregation. We know that NO regulates genes, both up and down from micro array studies on cells. We’ve become very interested in stem cell biology, the last several years we know that nitric oxide and cyclic G influence embryonic human and mouse stem cell proliferation and differentiation. We think we can force cells into different lineages by playing games with NO and cyclic G. And there are other applications, this is only a partial list, we can’t do everything. Thank you very much.

Nachdem dieses Treffen so wunderbar angefangen hat, haben wir etwas über den Urknall gehört, und ich denke, dass das Thema des folgenden Vortrags ebenfalls als ein Urknall in der Biomedizin angesehen werden kann. Das war die Entdeckung von Stickstoffmonoxid. Es ist mir eine große Freude, Professor Ferid Murad aus Houston, Texas zu bitten, uns hier seinen Vortrag zu halten. die Stickstoffmonoxid als ein Signalmolekül im Herz-Kreislauf-System spielt. Professor Murad. Dies ist mein erster Besuch in Lindau. Es sieht nach einer sehr spannenden Gelegenheit sowohl für die Redner als auch für die Studenten aus, und ich werde diese Woche genießen, das kann ich Ihnen versichern. Kurz nachdem der Nobelpreis bekannt gegeben worden war, erhielt mein Büro zahlreiche Anrufe von den örtlichen Schulen, den High Schools und Colleges in Houston. Man bat mich, Vorträge zu halten und mit den Schülern zusammenzutreffen, und das tat ich. Aber es kamen enorm viele Nachfragen, und ich konnte nicht mehr mit ihnen Schritt halten. Daher fragte ich in der audiovisuellen TV-Abteilung im Texas Medical Center, ob man mir dabei helfen könne, ein Video zusammenzustellen. Heute Morgen wird es also Filme geben. Diese Abteilung ist wirklich eine sehr aufregende Abteilung. Sie erstellen Videos und Tonbänder für Patienten: wie sie mit ihren Kolostomiebeuteln zurechtkommen, wie sie mit ihren Nieren-Shunts für die Dialyse umgehen sollten usw. Wir setzten uns also zusammen und entwarfen einen Dialog. Wir tauschten viele Informationen untereinander aus. Schließlich kamen sie an einem Samstagmorgen zu mir nach Hause und wir drehten dieses Video, und ich denke, es wird Ihnen gefallen. Das Video wurde für Teenager erstellt, aber ich habe es auch Fünfjährigen und 85-Jährigen gezeigt, und allen scheint es zu gefallen, denn es ist Wissenschaft in Laiensprache, die Sie alle verstehen sollten. Lassen Sie uns also mit dem Video anfangen. Meine Güte, was soll das denn mit diesen ganzen Preisverleihungen? Und der Preisträger ist ... Herzlichen Glückwunsch. Ich bitte Sie jetzt nach vorne zu kommen und Ihren Nobelpreis in Empfang zu nehmen. Nobelpreis? Was ist denn das? Da bin ich überfragt. Was? Ihr wisst nicht, was der Nobelpreis ist? Dagegen müssen wir etwas unternehmen. Wow! Was ist denn das? Hey, Sie kommen einfach aus dem Fernseher! Das ist ja wie Aliens. Gestatten? Ja klar, warum nicht? Also - was haben Sie uns zu berichten? Nun, mein Name ist Ferid Murad. Ihr könnt mich Fred nennen. Ich bin Arzt und Forscher und Wissenschaftler an der University of Texas Medical School. Ach, und übrigens, ich habe 1998 den "Nobelpreis" für Medizin bekommen. Ok, was ist denn nun dieser "Nobelpreis"? Der Nobelpreis ist eine der größten Auszeichnungen der Welt, die man bekommen kann. Aha ... Er bedeutet Anerkennung durch andere Wissenschaftler. Und? Hm. Tja, man ist auf der ganzen Welt im Fernsehen. In Schweden gibt es eine große Feier. Man trifft sogar den König und die Königin von Schweden. Man bekommt eine goldene Medaille. Und dann ist da natürlich noch das Geld. Geld? Party? König und Königin? Ja. Vielleicht ist es besser, wenn ich es euch zeige. Darf ich? Mm ... na klar! Danke. Danke, Fred. Willkommen in meiner Welt der Wissenschaft und in meinem Labor. Wissen Sie, den Nobelpreis gäbe es nicht, wenn da nicht ... Dynamit gewesen wäre. Wie auch immer. Alfred Nobel, der schwedische Erfinder und Geschäftsmann, der die Nobelpreise erfand, war derjenige, der das Dynamit erfand. Nitroglycerin ist die explosive Chemikalie in Dynamit. Und obwohl es sehr gefährlich war, fand Herr Nobel einen Weg, um das Nitroglycerin so einzulagern, dass es für sinnvolle Zwecke verwendet werden konnte, zum Beispiel um Dinge zu bauen. Man könnte sagen, dass seine Erfindung die Welt erschütterte. Nitroglycerin hat jedoch noch andere Anwendungsbereiche. Als Nobel anfing, an Herzbeschwerden zu leiden, verschrieb ihm sein Arzt tatsächlich Nitroglyzerin für sein Herz. Aber Nobel sagte: "Auf keinen Fall." Also war die Sache für ihn "geplatzt". nicht gut für das Herz sein konnte. Niemand wusste, warum es wirkte. Aber das tat es. und er teilte sich 1998 den Nobelpreis für Medizin mit Dr. Robert Furchgott und Dr. Luis Ignarro, weil er die Antwort auf diese Frage herausfand. Sie sind also der Typ, der herausfand, dass Nitroglyzerin gut für das Herz ist? Äh, ja. Und? Und was? Und warum wirkt es? Wir versuchten die Frage zu beantworten, auf welche Art und Weise Nitroglyzerin bei Brustschmerz hilft. Ich führte Experimente durch, betrachtete die Ergebnisse und sammelte Daten. Dann fand ich heraus, ob, was ich dachte, richtig oder falsch war. Jedenfalls fand ich heraus, das Nitroglyzerin Stickstoffmonoxid freisetzt und dass Stickstoffmonoxid eine Menge wichtiger Dinge im Körper erledigt. Was ist denn Stickstoffmonoxid? Und was genau haben Sie herausgefunden, das Ihnen diesen "Nobelpreis" einbrachte? Lasst es mich euch zeigen. Es schützt das Herz. Es stimuliert das Gehirn. Es tötet Bakterien. Und es ist ein echtes Gas. Es ist Stickstoffmonoxid. Niemand kann zu NO nein sagen. Stickstoffmonoxid oder NO ist ein einfaches Molekül mit zwei Atomen, Stickstoff und Sauerstoff. Und ja, es ist ein farb- und geruchloses Gas. Eine wissenschaftliche Sensation fegt über die Welt. Stickstoffmonoxid ist überall. Im Zuge der Umweltverschmutzung durch Umweltgifte trägt es zur Zerstörung der Ozonschicht bei. Man findet es sogar in Autoabgasen und Zigarettenrauch. Aber kommen wir von der Superbedrohung zum Superhelden. Man findet Stickstoffmonoxid auch im menschlichen Körper und es hilft dabei, wichtige Signale zu senden, die nicht von unserem Sponsor stammen. Wenn Blut durch Ihre Blutgefäße fließt, dann setzt deren Innenverkleidung oder Ihr Endothel Stickstoffmonoxid frei. Stickstoffmonoxid signalisiert Ihren Blutgefäßen, dass sie sich entspannen und erweitern sollen. Und dann? Das wiederum führt zu einer Senkung des Blutdrucks, der Kraft, die das Blut auf die Gefäßwände ausübt. Wenn Ihre Blutgefäße genug Stickstoffmonoxid bilden, signalisiert dies Ihren Blutgefäßen, dass sie sich entspannen sollen. Dann fließt Ihr Blut weiter hindurch. Kein Problem. Aber wenn das Blut nicht hindurchfließt, bilden sich Blutklumpen. Dann ... (Herzinfarkt). Und das ist nicht alles! Entspannte Blutgefäße lassen also mehr Blut hindurchfließen und Stickstoffmonoxid kann Auswirkungen auf alle möglichen Bereiche des Körpers haben. Beispielsweise rettet Stickstoffmonoxid schon das Leben von zu früh geborenen Babys, die sehr kleine Dosierungen dieses Gases einatmen. Es hilft ihren Lungen und verbessert ihre Atmung. Und das ist gut! Bei Nervenzellen kann Stickstoffmonoxid das Gehirn stimulieren und damit Dinge wie das Verhalten und Benehmen beeinflussen. Oh, benimm dich, Baby! Als Teil des Selbstverteidigungssystems des Körpers verteidigt Stickstoffmonoxid uns auch gegen Tumorzellen und Bakterien. Es ist ein erstaunliches Zeug. Aber Stickstoffmonoxid ist nicht zum Lachen und sollte nicht mit Distickstoffoxid, besser bekannt als Lachgas, verwechselt werden. Ha-ha ... kann jemand bitte dieses Gas abstellen? Wie kommen Sie überhaupt auf das alles? Nun, mit der Zeit begann ich mich sehr dafür zu interessieren, wie Zellen miteinander reden. Aber die meisten anderen Wissenschaftler hielten das nicht für sehr wichtig. Dr. Murad fand heraus, dass, wenn Zellen miteinander reden, dies so ähnlich ist, als wenn eine Zelle einer anderen Zelle irgendwo im Körper eine E-Mail schickt. Und diese E-Mail ist das Gas Stickstoffmonoxid. Die E-Mail kann in eine andere Zelle einbrechen und die Arbeitsweise dieser Zelle übernehmen. Sie kann eine Botschaft enthalten, zum Beispiel die Anweisung an ein Blutgefäß, dass es sich entspannen soll. Oder sie kann eine andere Art von Anweisungen enthalten. Wenn die Botschaft beispielsweise an eine Krebszelle geschickt wird, kann es sein, dass das Stickstoffmonoxid den Krebs tötet und dann sich selbst zerstört. Hasta la vista, Baby. Stickstoffmonoxid bewirkt so viele Dinge in Ihrem Körper. Es ist, als hätte man in seinem eigenen Körper ein weltweites Internetsystem. Warum sind Sie überhaupt in die Wissenschaft gegangen? Nun, es macht wirklich viel Spaß, herauszufinden, wie solche Dinge funktionieren. Und man muss nicht brillant sein, um voranzukommen. Man muss nur Ziele haben und sich darauf einstellen, sehr hart zu arbeiten. Als Wissenschaftler kann man etwas zum ersten Mal tun, das kein anderer jemals getan hat. Und das ist spannend! Manchmal öffnet Ihre Entdeckung die Tür zu einer ganz neuen Art und Weise des Denkens und zu noch mehr neuen Entdeckungen. Das ist wirklich cool! Es ist so etwas wie die "Wissenschaftsolympiade" und das Ziel ist der Nobelpreis. Wissenschaftlerteams aus aller Welt treten gegeneinander an. Es macht Spaß. Wer wird als erster fertig sein? Wer wird den Preis gewinnen? Einer von euch könnte eines Tages ein Nobelpreisgewinner sein. Wer weiß? Hey! Ich habe noch ein paar Fragen! Ja, ich auch. Tja, ich glaube, wir müssen auf eigene Faust mehr herausfinden. Vielleicht finden wir etwas im Internet. Ja, und halte Ausschau nach Wissenschaft und dem Nobelpreis. Sie sind weg und haben noch etwas Popcorn übrig gelassen, oder? Mjam! Für mich fügte es sich sehr glücklich, dass ich, als das Programm in Cleveland startete, einer der ersten medizinischen Doktoranden in den USA war, und ich entschied irgendwie, dass es das war, was ich tun wollte. Ich war mir nicht sicher, wie ich zu der Entscheidung kam. Ich war begeistert von Chemie und Biologie. Ich glaube, mehr als alles andere war ich verwirrt. Und ich sagte, ich werde beides versuchen und schauen, in welche Richtung ich gehen sollte, und ich wurde süchtig danach und sitze seither auf diesem Zaun [zwischen Chemie und Biologie]. Meine Mentoren waren Earl Sutherland und Ted Rall. Ein Jahr, bevor ich in ihr Labor kam, hatten sie gerade ein zyklisches AMP (Adenosinmonophosphat) entdeckt. Was war das für eine aufregende Zeit für einen jungen Studenten! Die mir zugewiesene Aufgabe bestand darin, herauszufinden, wie Katecholamine, Adrenalin, die Produktion von zyklischem AMP in den Geweben reguliert und ob dies über den Beta-Adrenorezeptor oder den Alpha-Rezeptor geschieht. Dies war eine ziemlich einfache und in der Tat leichte Aufgabe. Allerdings war es eine außergewöhnlich spannende Zeit, in der wir erlebten, wie sich dieser ganze Bereich der Zellsignale und Botenstoffe herausbildete. All diese Hormone, die über diese Signalwege wirken, und all diese Medikamente, die entwickelt wurden, zu betrachten - das war es, wonach ich süchtig wurde: sekundäre Botenstoff-Systeme und Zellkommunikation. Zellkommunikation ist eigentlich ein altes Konzept, das wahrscheinlich vor mehr als 100 Jahren zum ersten Mal von Pawlow bekannt gemacht wurde. Wie Sie aus Ihren Psychologie-Kursen wissen, hatte Pawlow einen Patienten mit einer Schussverletzung am Bauch, bei dem sich eine Magen-Fistel bis nach außen entwickelte. Wann immer der Patient Nahrung sah oder roch, verstärkte dies die Magensaftsekretion. Pawlow war nun so clever, dass er bei Hunden Hautsäcke und Fisteln heranzüchtete. Er zeigte den Hunden Futter und auch bei ihnen verstärkte sich die Magensaftsekretion. Aber er entschloss sich, diese Hunde zu konditionieren, indem er eine Glocke läutete. Letztendlich musste er nur eine Glocke läuten und bei den Hunden verstärkte sich die Sekretion, ohne dass er ihnen Futter zeigen musste. Dies sagte ihm, dass das Gehirn mit dem Magen sprach, dass Zellen miteinander kommunizieren. Natürlich wissen wir heute, dass viele Zellen und Gewebe im Körper miteinander kommunizieren. Das wird hier für Sie in diesem Cartoon, in diesem ersten Dia zusammengefasst. Dies stellt drei verschiedene Zellpopulationen dar, die miteinander sprechen werden. Sie können jede Art von Zellen sein, aber ich werde Zelle 1 eine Nervenzelle nennen. Sie kann ein zentrales oder ein peripheres Neuron sein. Zelle 2 werde ich eine Endothelzelle nennen, die ein Blutgefäß auskleidet, und Zelle 3 werde ich eine glatte Muskelzelle in der Wand jenes Blutgefäßes nennen. Zelle 1 möchte mit Zelle 2 und auch mit Zelle 3 sprechen. Und sie tut das, indem sie Moleküle produziert, die Earl Sutherland als primäre Botenstoffe bezeichnete. Heute bezeichnen wir sie als Hormone, wir bezeichnen sie als Zytokine, wir bezeichnen sie als Wachstumsfaktoren, wir bezeichnen sie als eine Vielzahl von Dingen, parakrine Substanzen, Autakoide usw. Sie kommen in verschiedenen Formen und Größen und Arten aromatischer Verbindungen vor. Einige sind kleine Aminosäuren, andere sind große Moleküle wie die Herztroponine. Wichtig ist für uns hier, dass sie in den interstitiellen Raum, in den Blutstrom ausgeschüttet werden und zielgerichtet durch den Körper wandern, um ihr Ziel zu finden. Sie finden ihre Zielzelle mithilfe eines Makromoleküls in ihrer Membran, das wir als einen Rezeptor bezeichnen. Manchmal befinden sich diese Rezeptoren im Inneren der Zelle, wie bei Steroiden und Schilddrüsenhormonen, aber in den meisten Fällen handelt es sich um Transmembran-Proteine, integrale Membranproteine auf der Oberfläche der Membran. Diese Liganden oder primären Botenstoffe interagieren mit ihren entsprechenden Zellen, die die einzigen mit diesen Rezeptoren sind. Das ist der Punkt, an dem sich die Spezifität der Reaktion ereignet. Sie passen konformativ zueinander, wie ein Schlüssel in ein Schloss. Und sie "stören" nur die Zellen, die über den entsprechenden Rezeptor verfügen. Der Ligand muss nicht unbedingt in das Innere der Zelle gelangen, um zu bewirken, dass die biochemische Kaskade in einer physiologischen Antwort resultiert. Sie können einfach mit dem Rezeptor interagieren, sie zwicken ihn ein bisschen und auf einmal, voilà, haben wir viele verschiedene intrazelluläre sekundäre Botenstoffe, die sich ansammeln. Der erste dieser sekundären Botenstoffe war zyklisches AMP. Sutherland und Rall entdeckten Folgendes: Auf diese Art und Weise regulierten Glukagon und Epinephrin den Abbau von Glykogen in der Leber. Wir wissen heute, dass viele Signalwege sich dieses Botenstoffs bedienen. Wir wissen auch, dass es neben zyklischem AMP noch andere sekundäre Botenstoffe gibt: zyklisches GMP (Guanosinmonophosphat), Kalzium, Diacylglycerin, Stickstoffmonoxid. Und während es Hunderte und Hunderte von primären Botenstoffen gibt, kennen wir nur eine bescheidene Anzahl von intrazellulären sekundären Botenstoffen. Heute sind es vielleicht nicht mehr als ein Dutzend, aber ich bin sicher, dass es in der Zukunft mehr sein wird. Diese sekundären Botenstoffe sammeln sich an und führen innerhalb der Zelle die Funktion aus, die von diesem primären Botenstoff zur Zelloberfläche gebracht worden war. Das Einzigartige an Stickstoffmonoxid als einem intrazellulären sekundären Botenstoff ist, dass es ein Gas ist. Es ist ein freies Radikal mit einem ungeteilten Elektron und ein sehr einfaches Molekül. Und da es ungeladen ist, der physiologische pH-Wert, wie alle anderen Botenstoffe, durchquert es die Membranen sehr viel schneller als die anderen Botenstoffe, die oft Energie oder ein Transportmittel benötigen, um das zu tun. Stickstoffmonoxid reguliert also nicht nur die Biochemie der Zelle, in der es produziert wurde, sondern es kann sie auch verlassen und ein paar hundert Ångström, Mikrometer, wandern, um angrenzende Zellen zu regulieren und zu veranlassen, dass sie andere sekundäre Botenstoffe wie zyklisches GMP produzieren. Es ist also ein ganz einzigartiges Botenstoff-Molekül. Meines Wissens ist es der einzige Botenstoff, der intrazellulär ebenso funktioniert wie extrazellulär. Es kann eine parakrine Substanz sein, ein lokales Autakoid. Es kann sich mit anderen Trägern verbinden, Glutathion, Thiole, Albumin, andere Proteine, und über eine Entfernung transportiert werden, um dort wieder freigesetzt zu werden und als Hormon zu wirken. Keine anderen Botenstoffe können das. Stickstoffmonoxid ist ein sehr altes Molekül, und ich habe eine Theorie, dass es auch an der Evolution beteiligt war. Wahrscheinlich war es eines der ersten Botenstoff-Moleküle vor drei Milliarden Jahren, als die Zellen begannen, miteinander zu kommunizieren. Allerdings werde ich diese Geschichte nicht vertiefen, da die Zeit dies nicht erlaubt. Heute wissen wir jedoch, dass es als Schadstoff von großer Bedeutung ist. Dadurch wurde es vor ungefähr 50 oder 60 Jahren bekannt, als offenkundig wurde, dass alle fossilen Brennstoffe bei der Verbrennung mit Sauerstoff eine Familie von Stickstoffoxiden produzierten, NO, NO2, N2O3 usw. Alle diese Stickstoffoxide interagieren mit Ozon und führen zum Abbau der Ozonschicht und sind zusammen mit den Treibhausgasen verantwortlich für die globale Erwärmung. Aber ich werde Ihnen sagen, dass Stickstoffmonoxid nicht nur ein Umweltschadstoff, sondern auch das Wirkprinzip einiger sehr wichtiger Herz-Kreislauf-Medikamente und ein Botenstoff-Molekül von großer Bedeutung im Körper ist. Und dies ist nur eine unvollständige Liste der Biologie, die es reguliert. Die Liste ist sehr, sehr viel länger als das. Sie beinhaltet Muskelentspannung, Blutplättchenaggregation, die Erektion des Penis, die Tötung von Parasiten und Mikroorganismen - und die Liste geht weiter und weiter. Auf einiges davon werden wir in Kürze zurückkommen. Im Jahr 1963, sieben oder sechs Jahre nach der Entdeckung des zyklischen AMP, entdeckten ein paar Chemiker zum ersten Mal zyklisches GMP, ein weiteres zyklisches Nukleotid und ein Cousin des zyklischen AMP. Man verschiebt einfach die Amino-Gruppe auf dem Purin-Ring und hat eine andere Struktur. Man verabreichte Ratten anorganisches P32-Phosphat und fand in ihrem Urin zwei wichtige organische Phosphate, zyklisches AMP und zyklisches GMP. Dies war der erste Nachweis von zyklischem GMP als ein natürliches Produkt. Das veranlasste einige Labore, sich für zyklisches GMP zu interessieren und nach Enzymen zu suchen, die es herstellten, Enzyme, die es hydrolysierten usw. Und die Geschichte entwickelte sich in den späten 1960er, frühen 1970er Jahren, als ich gerade meine Ausbildung beendete und mich darauf vorbereitete, mich der Fakultät an der University of Virginia anzuschließen. Wir wissen heute, dass es eine Familie von Enzymen gibt, die Guanylylzyklasen genannt werden. Es gibt mindestens sieben oder acht Mitglieder dieser Familie und wir glauben, dass es mit den Spleißvarianten, die wir zur Zeit isolieren, sogar noch mehr sein werden. Alle diese Enzyme wandeln GTP (Guanosintriphosphat) zu zyklischem GMP und Pyrophosphat um. Die Reaktion ist in hohem Maße analog, wenn man eine OH-Zyklase hinzufügt, die ATP (Adenosintriphosphat) zu zyklischem AMP und Pyrophosphat umwandelt. In der Tat sind die katalytischen Domänen aller Zyklasen homolog, mit der Veränderung von einer oder zwei Aminosäuren, ein Enzym kann das andere Nukleotid produzieren. Das zyklische GMP kann durch eine Familie von Phosphodiesterasen inaktiviert werden. Diese Gen-Familie umfasst mindestens zehn oder elf Mitglieder. Sie hydrolysieren die Phosphodiester-Bindung, um das zyklische Nukleotid in das entsprechende Monophosphat umzuwandeln, entweder 5'-GMP oder 5'-AMP, und es wird inaktiv. Wie Sie im Laufe der Woche von Dr. Fischer hören werden, aktivieren viele der intrazellulären sekundären Botenstoffe, zyklisches AMP, zyklisches GMP, Diacylglycerin, Kalzium usw., häufig eine Proteinkinase, die dann eine Reihe von Protein-Substraten phosphoryliert, indem sie das Gamma-Phosphat von ATP zu einem Serin-Threonin-Rest oder vielleicht einem Tyrosin-Rest überträgt. Man hat mir gesagt, dass wir nun nicht weniger als 500 oder 600 Proteinkinasen kennen. Das Konzept der Zellkommunikation ist ziemlich einfach: Ein Ligand oder Hormon reguliert die Produktion des sekundären Botenstoffs, der dann die Proteinkinase reguliert, die ein Protein phosphoryliert. Das Problem besteht nun darin, dass die Matrix ziemlich brenzlig vertrackt wird, wenn man alle Zyklasen, die Diastasen, die Proteinkinasen und die vielen Proteine berücksichtigt, die phosphoryliert werden können. Wenn diese Proteine phosphoryliert werden, dann verändert sich, wie Sie von Dr. Fischer hören werden, ihre Konformation. Wenn es sich um Strukturproteine handelt, können sie die Motilität und andere Prozesse, die Kontraktilität, beeinflussen. Wenn es sich um Enzyme handelt, werden sie aktiviert oder gehemmt. Als sich nun diese Geschichte mit dem zyklischen GMP entfaltete, beschloss ich, mich vom zyklischen AMP abzuwenden und mein Interesse auf das zyklische GMP zu verlagern. Für ein neues, junges Fakultätsmitglied war in den frühen 1970er Jahren meiner Ansicht nach das Forschungsgebiet des zyklischen AMP ziemlich überfüllt, mit großen Gruppen von Leuten überall auf der Welt. Ich dachte nicht, dass ich mit all diesen großen Laboren konkurrieren könnte, und da sich das Gebiet des zyklischen GMP herausbildete, sagte ich, dass ich in diese neue Richtung gehen würde. Ich wollte zwei Fragestellungen angehen. Wir wussten, dass ein paar Hormone die Anreicherung von zyklischem GMP in einigen Geweben steigern konnten - Acetylcholin bei Herzpräparaten, Prostaglandine bei Gefäßpräparaten -, aber wir kannten den molekularen Mechanismus der Kopplung nicht. Wenn wir die Bindung des Liganden an den Rezeptor und die Kopplung an die Guanylylzyklase, um zyklisches GMP zu produzieren, verstehen würden, könnten wir vermutlich diesen Kopplungsprozess mit verschiedenen Chemikalien und Medikamenten beeinflussen, um eine Hormonreaktion zu verstärken oder zu blockieren, und vielleicht sogar ein paar neue Therapien für verschiedene endokrinologische Erkrankungen zu entwickeln. Das war ziemlich vernünftig. Das zweite Problem bestand darin, dass wir, obwohl zyklisches GMP ein natürliches Produkt war, keine Ahnung hatten, was es tat oder worin seine Funktion bestand. Wir begannen also unsere Studien, indem wir das Enzym, das zyklisches GMP produziert, detailliert untersuchten. Die erste große Überraschung war, dass es sich nicht um ein einzelnes Enzym, sondern um ein paar Enzyme handelte. Die Enzymaktivität war in löslichen Fraktionen wie auch in partikulären Fraktionen vorhanden. Die kinetischen Eigenschaften dieser Isoforme waren unterschiedlich. Ich vermutete, dass es Isoforme geben würde. Ich hatte mir gedacht: Falls es verschiedene Abteilungen und Isoforme von Guanylylzyklasen gibt, werden sie vielleicht von verschiedenen Gruppen von Hormonen reguliert - wäre es nicht ein tolles Projekt, das zu klären und zu sortieren? Viel davon erwies sich als echte Intuition zu jener Zeit. Der Beweis, dass wir es mit Isoformen zu tun hatten, erforderte viel Arbeit. Wir mussten diese löslichen und partikulären Aktivitäten purifizieren, sie klonen, exprimieren und erneut untersuchen. Wir taten dies, und die Arbeit dauerte zwölf oder 15 Jahre. Aber zunächst nahm ich eine Abkürzung. Ich sagte: Die Kooperativität des partikulären Isoforms - im Gegensatz zur typischen Michaelis-Menten-Kinetik des löslichen Isoforms - konnte ein Artefakt sein, da es sich um krude Präparate handelte, die Nukleotidasen, Phosphatasen, Phosphodiesterasen enthielten. Wir erstellten also einen Cocktail und fügten ihn unseren Inkubationen hinzu, um alle diese konkurrierenden Pfade zu hemmen. Wir erstellten einen Cocktail aus Pyrophosphat, Fluor, Azid, Hydroxylamin, Natriumnitrit, Methylxanthine etc. und rein zufällig - wie es in der Wissenschaft häufig der Fall ist - fanden wir Verbindungen, die das Enzym aktivierten. Während es unser Ziel war, die Hormonregulation zu verstehen, konnte uns das nicht gelingen, denn sobald wir die Gewebe störten, ging die Hormonbindung verloren. Extrakte des Enzyms wurden durch Hormone nicht mehr aktiviert. Die kleinen Moleküle wurden jedoch aktiviert, und vielleicht konnten sie unser Ersatz für das Verständnis der hormonalen Steuerung sein. Ähnlich wie Fluor eine wertvolle Ressource für das Verständnis der hormonellen Regulation der Adenylatzyklase war. Die aktivierenden Verbindungen waren Azid, Hydroxylamin und Natriumnitrit. Und um eine lange Geschichte kurz zu fassen: die Wirkungen des Azids waren von Sauerstoff abhängig, wurden durch Thiole verstärkt und zeichneten sich durch eine lange Zeitverzögerung aus, bevor die Reaktionsrate ihr Maximum erreichte. Sie waren gewebespezifisch, denn Gewebe besaßen Inhibitoren und Aktivatoren des Stoffwechselweges. Und wir waren davon überzeugt, dass diese Aktivatoren Vorläufer von Pro-Pharmaka waren, die in unseren Inkubationen zu etwas anderem umgewandelt wurden, und es wurde mehrere Jahre lang zu einer ziemlich geheimnisvollen Geschichte, welcher Aktivator das sein würde. Wir fügten Azid und Hydroxylamin und Nitrit zu Zellkulturen in Geweben hinzu. Und tatsächlich führten sie zu einer Erhöhung der Konzentration von zyklischem GMP und sie aktivierten außerdem die Enzyme und Extrakte. Sie würden also in beiden Systemen funktionieren. Eines der Gewebe, mit denen wir - wiederum zufälligerweise - arbeiteten, war glatte Muskulatur der Luftröhre. Als Student lernte ich, dass zyklisches AMP die glatte Muskulatur entspannt, die glatte Muskulatur der Gefäße und Luftwege. Und ich dachte, dass zyklisches GMP vielleicht ein Gegenspieler von zyklischem AMP sein könnte. Wir fertigten also eine Zubereitung aus glatter Muskulatur an, die relativ homogen war, um einige biochemische Tests daran durchzuführen und einen Physiologen dafür zu konsultieren. Wir fügten diesen Zubereitungen aus glatter Muskulatur Azid hinzu, der Spiegel des zyklischen GMP stieg an, doch die Muskeln kontrahierten sich nicht, sie entspannten sich. Dies war das Gegenteil von dem, was zu erwarten war. Die Dosis-Reaktions-Kurven, die Zeitverläufe: alles sagte uns, dass Azid ein Entspannungsmittel glatter Muskulatur war, das seine Wirkung durch zyklisches GMP vermittelte, und so funktioniert es, und das war die erste physiologische Funktion von zyklischem GMP. Wir sagten: diese Mittel führen zu einer Entspannung und zur Erhöhung von G. Worin besteht die Wirkung der anderen Entspannungsmittel der glatten Muskulatur? Von Nitroglycerin, das man schon seit etwa 100 Jahren kannte, von Nitroprussid, einer Menge der Medikamente, die auf Intensivstationen für Erkrankungen der Herzkranzgefäße beliebt sind? Sie senkten den Gefäßwiderstand, senkten den Blutdruck von Infarktpatienten usw. Wir fügten sie unseren Zubereitungen hinzu, und sie führten erwartungsgemäß zu einer Entspannung der Muskulatur. Überraschend war, dass sie die Konzentration des zyklischen GMP ansteigen ließen. Wir verfügten nun also über eine Familie von Verbindungen, die wir als NO-Pharmaka (nitrovasodilators) bezeichneten und die in zellfreien Zubereitungen Guaninzyklase aktivieren und in verschiedenen Geweben die Konzentration von zyklischem GMP anheben konnten. Zu diesen Verbindungen gehörten Hydroxylamin, Azid, Natriumnitrit, einige Hydrazine, Nitroglycerin, Nitroprussid, Nitrosoharnstoffe, Nitrosamine sowie eine lange Liste anderer Verbindungen, die alle Donoren von Stickstoffmonoxid (NO) waren. Sie alle enthalten Stickstoff. Einige von ihnen wandelten sich spontan um, basierend auf Redox- und pH-Inkubationen. Einige von ihnen werden nicht im Körper umgewandelt, Azid erfordert eine Katalase-Konversion. Und wir überlegten uns, dass die Zwischenstufe aller dieser Pro-Pharmaka oder Vorstufen Stickstoffmonoxid sein musste. Der Grund, warum wir dachten, es sei Stickstoffmonoxid, war folgender: Weil die Gewebespezifität von Azid teilweise durch das Vorhandensein von Hämoglobin und Myoglobin in unseren Gewebeextrakten beeinflusst wurde. Dies waren Inhibitoren. Wir wussten aus der Literatur, dass NO eine hohe Affinität zur prosthetischen Hämgruppe von Hämoglobin, Myoglobin, hat. Also zogen wir den Schluss, dass alle diese Pro-Pharmaka oder Vorstufen in Stickstoffoxid umgewandelt wurden. Wenn wir durch chemische Reaktionen Stickstoffoxid im Laborabzug erzeugten, Natriumnitrit, Eisen(II)-Sulfat, Schwefelsäure, und das Gas in unsere Zubereitungen ventilierten, wurde jede von ihnen aktiviert. Was für eine spannende Zeit das war! Der erste Beweis dafür, dass ein freies Radikal ein Enzym aktivieren konnte. Und ich dachte, das würde eine sehr interessante Chemie sein. Viele Leute waren skeptisch. Sie alle hielten freie Radikale und Stickstoffoxide für schädliche Verbindungen und giftige Stoffe, doch es bestand kein Zweifel daran: Sie hatten eine aktivierenden Wirkung. Einige Leute hielten mir entgegen: Murad, du inhibierst einen Inhibitor. Du führst in deinen primitiven Zubereitungen eine Aufhebung der Inhibition durch. Also mussten wir die Enzyme bis zur Homogenität reinigen, und wenn wir die Konzentration vornahmen, wurde die Menge des zur Aktivierung benötigen Stickstoffmonoxids geringer und immer geringer, noch niedriger, als wir Stoffe aus unserer Inkubation entfernten, die NO absaugten und verschluckten. Übergangsmetalle, Thiole, Protein saugten NO auf, wissen Sie. Nanomolare Konzentrationen von NO führten zu einer Aktivierung des Enzyms, und der Vmax-Wert stieg um das 200- bis 400-fache an, wie sie auch den Km-Wert für GTP senkten. So erkannten wir, dass wir den Wirkungsmechanismus der NO-Pharmaka (nitrovasodilators) herausgefunden hatten, wie etwa von Nitroglycerin, das seit 100 Jahren klinisch verwendet wurde. Findet man als Pharmakologe ein exogenes Material, das in einem biologischen System etwas bewirkt, sollte man sich fragen: Imitiert es einen natürlichen Stoffwechselpfad, der bereits existiert, sowie: Arbeitet es durch einen ähnlichen Mechanismus? Daher schlug ich in einer Buchbesprechung in den späten siebziger Jahren vor, dass die Wirkung verschiedener Hormone, d. h. die Erhöhung der Konzentration des zyklischen GMP, vielleicht darauf zurückzuführen sei, dass sie die Produktion von Stickstoffmonoxid über irgend einen endogenen Vorläufer verstärkte, möglicherweise dadurch, dass sie einen Redox-Stoffwechselweg änderten. Wir konnten diese Hypothese nicht überprüfen, weil in den siebziger Jahren die Technologie noch nicht vorhanden war, um Stickstoffmonoxid in seinen Oxidationsprodukten oder bei Tieren oder Konzentrationen zu messen. Es gab primitive kalorimetrische Untersuchungen. Dies zu beweisen erforderte sieben oder acht Jahre technologischer Entwicklung, bevor wir selbst oder andere zeigen konnten, dass es sich so verhielt. Doch wir erwarteten, dass Stickstoffmonoxid ein sekundärer, intrazellulärer Messenger war, und das war Häresie. Und es genügte zu zeigen, dass es aktiviert ... Ein freies Radikal aktivierte ein Enzym. Nun sagte man, dass ein freies Radikal ein sekundärer Messenger war, und es erwies sich als wahr, es zeigte sich, dass wir Recht hatten. Und im Wesentlichen ist das der Grund, warum wir nach Stockholm kamen. Wenig später zeigte Robert Furchgott, ein Gefäßpharmakologe aus New York, erstmals, dass eine Gruppe von Wirkstoffen Gefäßsegmente in einem Organbad im Labor entspannte. Von Wirkstoffen wie zum Beispiel Acetylcholin, Histamin, Bradykinin war bekannt, dass sie beim Menschen oder in Tierversuchen den Blutdruck senkten. Im Labor hatten sie jedoch niemals eine Entspannung bewirkt. Er stellte fest, dass diese Stoffe, wenn er die Integrität des Endothels in seinen Blutgefäßversuchsanordnungen bewahrte, eine Entspannung verursachte. Und das war 1980 ein aufregendes neues Ereignis. Ich hörte ihm zu, als er seine Arbeiten vorstellte. Er sagte, dass diese Substanzen die Abgabe eines Faktors aus dem Endothel bewirkten, den er EDRF (endothelium-derived relaxant factor) nannte. Er hatte eine Halbwertszeit von nur ein paar Sekunden. Ich sagte: Bob, dies ist eine reaktive Spezies, vielleicht ein freies Radikal. Vielleicht funktioniert es bei zyklischem G, vielleicht stellte es sich als irgendwie mit NO verwandt heraus. Lass uns der Sache auf den Grund gehen. Nun ja, wir gingen nach Stanford, Bob zog nach New York. Seine Frau bekam Brustkrebs, und diese Zusammenarbeit kam nie zustande. Doch einige Jahre später wurde ich ungeduldig, und ich ging der Sache selbst nach und zeigte, dass diese Hypothese tatsächlich zutraf. Dies ist ein Blutgefäß, das zuvor mit Norepinephrin kontrahiert wurde. Und dann gaben wir nach fünf oder sieben Minuten eine vom Endothel abhängige, gefäßerweiternde Substanz hinzu: Acetylcholin, Bradykinin, ATP-Ionophor, Histamin etc. Und wenn das Endothel vorhanden war, stiegen die Werte für zyklisches GMP innerhalb von Sekunden an, gingen wieder auf die Basiswerte zurück, und anschließend entspannte sich der Muskel. Doch dies geschieht nur, wenn das Endothel intakt ist. Wenn kein Endothelium vorhanden ist, kommt es zu keinem Anstieg des zyklischen G, zu keiner Entspannung. Wir wussten also in den frühen 1980er Jahren, dass es zwei Stoffwechselpfade gibt, die in der Guanylylzyklase konvergieren, um die Synthese von zyklischem GMP zu steuern: die NO-Donoren im endothelabhängigen Stoffwechselpfad zur Gefäßerweiterung. Wir verbrachten einige Jahre damit zu zeigen, dass dies in Zubereitungen des glatten Muskels der Blutgefäße zur Aktivierung der Proteinkinase G führt. Anschließend untersuchten wir die Phosphorylierung einer Vielzahl von Proteinen mit Hilfe der Einfügung von P32. Um die verschiedenen Teile der Geschichte für Sie zusammenzufassen, sind sie auf dem folgenden Dia übersichtlich dargestellt. Dieser Cartoon stellt ein Blutgefäß dar, mit der Endothelauskleidung auf der linken Seite und dem Anteil des glatten Muskels auf der rechten Seite. In rot sind drei Kategorien von gefäßerweiternden Substanzen dargestellt, die eine Verstärkung der Produktion von zyklischem GMP bewirken: die NO-Pharmaka (nitrovasodilators), die aufgrund der pH-Sauerstoff-Spannung etc. spontan umgewandelt werden, wie etwa Nitroglycerin, bis zu Stickstoffmonoxid, das die lösbare Guanylylzyklase aktiviert. Die lösbare Guanylylzyklase ist ein Heterodimer mit einer Alpha-Beta-Untereinheit, und die Beta-Untereinheit verfügt über eine prosthetische Gruppe in der Histamine-105-Position. Das Eisen in diesem Häm muss zweiwertig sein, NO bindet sich an diesen doppelwertigen Liganden, ändert die Bindung des Häm an die Beta-Untereinheit, die dann mit der katalytischen Domäne unten am C-Terminal kommuniziert, was zu einer Aktivierung des Enzyms führt. Das zyklische GMP aktiviert eine zyklische, G-abhängige Proteinkinase. Es gibt zwei von diesen: eine lösbare und eine partikelförmige, die zahlreiche Proteine phosphorylieren. Diese Proteine regulieren die Konzentration von Kalzium im Zytosol, indem sie die Verteilung innerhalb der Zelle aus Vorräten oder durch Kanäle in der Membran ändern. Und wir wissen, dass die Myosin-leichte-Ketten-Kinase ein von Kalzium/Calmodulin abhängiges Enzym ist. Wenn man die Kalziummenge reduziert, verringert man die Kinase, Myosin-leichte-Ketten sammeln sich im dephosphorylierten Zustand an. Wenn man die Aktin- und Myosin-Filamente nimmt, wenn man Myosin-leichte-Ketten phosphoryliert, gleiten sie zur Kontraktion aneinander vorbei. Wenn man Myosin-leichte-Ketten dephosporyliert, kommt es zur Entspannung. Seit dieser Arbeit ist gezeigt worden, dass zyklisches GMP möglicherweise auch die Phosphatase-Aktivität reguliert. Die vom Endothel abhängigen, gefäßerweiternden Substanzen tun genau dasselbe. Die Rezeptoren für diese vom Endothel abhängigen, gefäßerweiternden Substanzen befinden sich jedoch nur auf den Endothelzellen, nicht auf den Zellen der glatten Muskulatur. Das ist der Grund dafür, warum Patienten mit Arteriosklerose und Erkrankungen der Herzkranzgefäße direkt wirkende NO-Donoren verabreicht werden: Nitroglyzerin, Nitroprussid etc. Sie erhalten keine vom Endothel abhängige, gefäßerweiternden Substanzen, weil ihr Endothel nicht normal ist. Ich werde Ihnen sogleich mehr darüber erzählen. Doch sie produzieren EDRF, von dem wir wissen, dass es sich dabei um Stickstoffmonoxid handelt, um über denselben Stoffwechselweg zu arbeiten. Eine dritte Gruppe sind die Atriopeptine. DeBold stellte vor einigen Jahren fest, dass die Granulate und Atria über ein als atrialen natriuretischen Faktor bezeichnetes Peptid verfügen, und wir haben herausgefunden dass dieser Faktor, die Atriopeptine und die Familie dieser Substanzen die partikelförmigen Isoformen der Guanylylzyklase aktivieren, und es gibt mehrere von diesen. Es hat sich herausgestellt, dass die partikelförmigen Zyklasen Rezeptorzyklasen sind, für Atriopeptine, Guanylyl, e-coli-Enterotoxin etc. Und durch die Erhöhung der Konzentration von zyklischem G führen auch Sie zu einer Entspannung. Nun, man kann glatte Muskulatur auch auf andere Weise entspannen: mit Wirkstoffen, die die Kalziumkonzentration ändern, die Konzentration von zyklischem AMP ändern, mit Phosphodiesterase-Inhibitoren etc. Dies sind die Mechanismen, bei denen man durch die Verstärkung der Produktion von zyklischem GMP eine Entspannung herbeiführt. Man kann nun jedoch darangehen, diese Informationen zu kombinieren, um für verschiedene Erkrankungen der Herzkranzgefäße neuartige Kombinationstherapien zu konzipieren, und ich werde Ihnen gleich zeigen, wie man das macht. Es gab noch einige andere sehr wichtige Beobachtungen während unserer Arbeit, aber ich werde sie übergehen müssen. Um die Mitte und gegen Ende der 1980er Jahre wurde jedoch deutlich, dass es einen Stoffwechselweg geben musste, der Stickstoffmonoxid produziert. Die Leute fanden Nitrid und Nitrat in ihren Medien, die Leute fanden die Argininaktivierung des Stoffwechselweges. Und es stellte sich heraus, dass es tatsächlich eine Familie von Enzymen gibt, die man als Stickstoffoxid-Synthasen bezeichnet, die fast allgegenwärtig und in den allermeisten Geweben zu finden sind. Und es gibt drei Isoformen, die ursprünglich als neuronale NOS, induzible NOS und endotheliale NOS bezeichnet wurden, nach den Geweben, aus denen sie zuerst in reiner Form gewonnen und dann beschrieben wurden. Da sie so weit verbreitet sind, habe ich vorgeschlagen, dass wir sie als NOS-1, -2 und -3 bezeichnen, gemäß der chronologischen Reihenfolge, in der sie zuerst beschrieben, in reiner Form gewonnen und dann geklont wurden. Sie sind sehr homolog. Die Homologie zwischen ihnen beträgt etwa 50-60 %. Einige von ihnen sind löslich, andere liegen partikelförmig vor. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten für post-translationale Modifikationen. Einige von ihnen werden mit Polmitat oder Myristat acyliert. Viele von ihnen werden durch verschiedene Kinasen phosphoryliert. Eine sehr komplizierte Familie. Normalerweise ist dieses NOS-2 oder induzibles NOS in Geweben nicht zu finden. Man sieht keine Transkription oder kein Protein, sofern keine Entzündung aufgetreten ist. So wurde es zu einem Biomarker für Entzündungen. Sie können ihre Produktion durch alles verstärken, das zu einer Aktivierung des NF-kappaB-Stoffwechselpfades führt: Endotoxin, proinflammatorische Zytokinen, IO1, Interferon Gama etc. Und sie erzeugen sehr viel Enzym, bei dem es sich um ein Produktionsstadium für Stickstoffmonoxid mit hohem Output handelt, das an vielen zelltoxischen und entzündlichen Prozessen beteiligt ist. Alle diese Enzyme katalysieren diese Reaktion: sie oxidieren den Guanidino-Stickstoff von Arginin. Sie oxidieren den Schildkröten-Guanidino-Stickstoff zu einem Hydroxy-Arginin-Zwischenprodukt, und oxidieren außerdem NO und Citrullin. Diese Enzyme sind nur als Homodimere aktiv. Sie verfügen über eine prosthetische Hämgruppe. Sie benötigen NADPH-Sauerstoff-Flavine, Häm als prosthetische Gruppe. Sehr kompliziert. Wenn das Bioptron zu Dihydro oxidiert wird, produziert es kein NO mehr, sondern das Enzym produziert jetzt Superoxid, eines der schlimmsten Dinge, die man in der Stickstoffoxid-Biologie tun kann. Lassen Sie mich also diesen Stoffwechselpfad für Sie zusammensetzen. Wir wissen jetzt, dass verschiedene Hormone und Liganden mit ihren entsprechenden Rezeptoren zusammenarbeiten werden, um unterschiedliche Co-Faktoren für die Stoffwechselpfade der Stickstoffoxid-Synthase zu regulieren, um Arginin in Stickstoffoxid und Cytrolin umzuwandeln. Dies aktiviert dann die lösliche Guanylylzyklase, um zyklisches GMP zu produzieren, das eine Kinase aktiviert, und die Kaskade läuft weiter, um irgendein Prozessorereignis zu verursachen. Mit Hilfe pharmakologischer Werkzeuge können wir diesen Stoffwechselweg auf vielfache Weise beeinflussen. Wir haben Verbindungen, bei denen es sich um Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten handelt. Wir können die Verfügbarkeit der Co-Faktoren ändern. Wir verfügen über Verbindungen, bei denen es sich um Arginin- oder Guanidino-Analoge handelt, um die Stickstoffoxid-Synthasen zu blockieren und zu hemmen. Mit einigen von ihnen werden klinische Versuche zur Behandlung von septischen Schocks und Entzündungskrankheiten durchgeführt. Wir können das NO nicht nur mit Hämoglobin und Myoglobin "aufsaugen", sondern auch mit verschiedenen Thiolen, die sich ebenfalls in klinischen Tests befinden. Es gibt Verbindungen, die die Zyklase ohne NO aktivieren. Wir glauben, dass wir eines Tages über ein mutiertes Enzym verfügen werden, das für die Gentherapie kein NO benötigt. Man kann die Aktivierung durch NO oder ein anderes Gas auch verstärken, z.B. durch Kohlenmonoxid, bei dem es sich um einen schwachen Aktivator in Gegenwart von Verbindungen handelt, und es gibt auch Inhibitoren. Wir verfügen also nun über Werkzeuge, um damit zu beginnen, auf dieses System genauer eingehen. Doch das System ist etwas komplizierter als das. So ist es immer. Wenn Sie Stickstoffmonoxid produzieren, will es Folgendes tun: die Guanylylzyklase aktivieren, um zur Verhinderung der Blutplättchenaggregation, zur Verwendung als Neurotransmitter, zur Beeinflussung der Entspannung der glatten Muskulatur zyklisches G herzustellen: für alle diese hilfreichen Dinge. Es kann jedoch auch zu Nitrit/Nitrat oxidiert werden, es kann Komplexe mit anderen Übergangsmetallen bilden. Es bildet mit verschiedenen Thiolgruppen und Proteinen Komplexe. Mehr als 100 Proteine werden an den Cysteinresten nitrosiert, und einer der wichtigen Stoffwechselpfade ist die Interaktion von Stickstoffmonoxid mit Superoxidanionen. Diese Reaktion ist fast diffusionsbegrenzt. Wann immer man also die eine Verbindung mit der anderen in Kontakt bringt, ist dies die Reaktion, die stattfinden wird, und sie "verschluckt" oder stiehlt das NO vom Stoffwechselpfad des zyklischen G. Und dies führt zur Entstehung von Peroxynitrit, das sogar noch giftiger ist als Stickstoffoxid oder Superoxid. Peroxynitrit nitriert Proteinreste, die an Hydroxyl und Tyrosine angrenzen, indem es die Phosporylierung der Tyrosinkinase möglicherweise räumlich hemmt oder in einigen Fällen störend darauf einwirkt. Möglicherweise kommunizieren die beiden Systeme also miteinander: der Stoffwechselweg der Tyrosinkinase und der von NO. Vielleicht. Es gibt sehr wenige in vivo Hinweise darauf, die meisten Hinweise waren bislang in vitro. Es gibt eine wichtige, als endotheliale Dysfunktion bezeichnete Krankheit. Viele von uns, mit Sicherheit die Älteren unter uns, haben eine endotheliale Dysfunktion, von den jungen Leuten möglicherweise noch nicht so viele. Sie tritt zusammen mit Bluthochdruck, Arterioskelerose, Diabetes, Tabakkonsum und möglicherweise auch mit Übergewicht auf. Bei allen diesen Krankheiten kommt es zu oxydiertem Stress, der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, Wasserstoffperoxid, Superoxidanionen, Hydroxylradikalen, und die Gewebe der Blutgefäße erzeugen keine ausreichenden Mengen von Nitritoxid, aus einer Vielzahl von Gründen; ich kann diese Gründe nicht alle durchgehen. Doch das Nettoergebnis ist, dass die Blutgefäße nicht genug NO produzieren können. Sie tendieren dazu, verengt zu sein, wodurch der atherosklerotische Prozess beschleunigt wird. Die Durchblutung wird durch diabetische Geschwüre und Verletzungen verringert. Es handelt sich demnach um einen Teufelskreis: Je mehr die Blutgefäße verengt sind, umso mehr reaktive Sauerstoffspezies entstehen, umso weniger NO. Es wird schlimmer und schlimmer. Man muss den Kreislauf also unterbrechen. Man muss die zugrundeliegende Krankheit behandeln und möglicherweise mit einige neuen Therapien darangehen, möglicherweise mit der Zuführung von zusätzlichem Arginin, um mehr NO zu produzieren; oder mit Antioxidantien, um die reaktiven Sauerstoffspezies zu beseitigen. Und es gibt viele klinische, viele Jahresstudien, die dies belegen. Es gibt einige klinische Untersuchungen. Die klinischen Untersuchungen waren sehr umstritten. Wir sind fast am Ende. Hier ist ein weiteres Dia. Das Forschungsgebiet um Stickstoffmonoxid ist völlig verrückt geworden. Unser erster Aufsatz über die biologischen Wirkungen erschien 1977. Fast ebenso viele wie zu zyklischem AMP, mehr als zu G-Proteinen und vielen anderen Themen. Es ist unglaublich. Das entspricht etwa 6000 bis 8000 Aufsätzen im Jahr, im Zeitraum der letzten 5 bis 10 Jahre. Das sind 20 bis 30 Aufsätze am Tag. Niemand auf der Welt kann darüber den Überblick behalten. Es ist für alle von uns in diesem Forschungsfeld sehr frustrierend. Es ist aber auch sehr spannend, dieses Interesse und diese Begeisterung zu sehen. Ich habe eine Teilliste für Sie zusammengestellt, dieses Dia und das nächste, um Ihnen zu zeigen, wohin sich dieses Feld meiner Meinung nach in den nächsten 10 Jahren bewegen wird, was die Entwicklung neuer Medikamente betrifft, und wie wir diese biochemischen, molekularen Zielobjekte, die wir und andere beschrieben haben, nehmen können, und sie nun in Prüfverfahren mit hohem Durchsatz und andern Untersuchungen verwenden können, um chemische Hinweise zur Herstellung neuer Heilmittel zu finden. Wir wissen, wie ich bereits sagte, dass NO als Neurotransmitter am Hirnstoffwechsel beteiligt ist, in manchen Bereichen des Gehirns, sowohl zentral, als auch an der Peripherie. Wenn Sie eine Maus mit NOS-1 versehen und einen zerebralen Infarkt herbeiführen, ist der Umfang des Infarktes kleiner. Wenn Sie eine Maus mit NOS-3 versehen und einen zerebralen Infarkt herbeiführen, so ist der Umfang des Infarktes größer. Wenn Sie eine Maus mit NOS-1 und ohne NOS-3 versehen , ist die Maus nicht mehr sehr clever. Sie kommt nicht mehr durch aus dem Wasserlabyrinth. Es gibt also die Beteiligung von Stickstoffmonoxid als Transmitter in verschiedenen Bereichen, auch im Gedächtnis, und wir haben all das keineswegs verstanden. Wir wissen, dass es, bei einem Glaukom, bei der Produktion und Aufnahme von Flüssigkeit im Auge eine Rolle spielt, bei der neuronalen Degeneration der Retina. Wir haben ausführlich über die Gefäßerweiterung gesprochen, Bluthochdruck in der Lunge wurde im Film angesprochen. Es war eine aufregende Sache, diese Entwicklung mitzuverfolgen. Ungeborene Babys, verbunden mit der mütterlichen in vivo-Zirkulation, müssen ihre Lungen nicht aufblähen, weil sie ihren Sauerstoff von der Plazenta der Mutter bekommen. Wenn sie zu früh geboren wurden, sind ihre Blutgefäße verengt, ihre Lungen sind nicht entwickelt, sie benötigen einen oberflächenaktiven Stoff. Man muss diese Blutgefäße erweitern, ihr Blut fließt von der rechten in die linke Herzkammer, die Babys leiden an Sauerstoffmangel (Hypoxie). Wenn man ihnen über einen Nasenkatheder ein wenig Stickstoffmonoxid gibt, erweitert dies die Gefäße, der Blutfluss von der rechten in die linke Herzkammer geht zurück, ihr Blut wird mit Sauerstoff angereichert. Es hat eine wunderbare Verbesserung gegeben, mit der sich das Erfordernis einer ECMO-Therapie, die höchst unangenehm ist, eliminieren ließ. Sie haben alle von Viagra gehört. Es ging aus dieser Forschung hervor, nicht aus unserer, aber wir entwickelten die Konzepte. Wir haben im Labor Witze darüber gemacht: dass wir Kondome mit gefäßerweiternden Substanzen füllen würden, und mit NO-Donoren und PD-Inhibitoren. Sie funktionieren. Viagra ist ein Inhibitor der Typ-5-Phosphodiesterase, die man hauptsächlich in Blutgefäßen findet, sowohl im corpus cavernosum, als auch in den systemischen Gefäßen. Dies ist der Grund dafür, warum Patienten, die Viagra nehmen und nun zusätzlich NO-Donoren, Nitroglyzerine, sehr hohen Blutdruck, Herzrhythmusstörungen, Schlaganfälle etc. bekommen können. Man muss also vorsichtig sein. Es ist kein Medikament, das aus nichtmedizinischen Gründen genommen werden sollte, es kann zu Komplikationen führen. Es ist an der Wundheilung und der Angiogenese beteiligt, an der Atherosklerose. Wenn Sie sich die Menge ausgeatmeten NOs ansehen, ist dies ein wunderbarer Marker für die Schwere von Asthma. Je mehr Entzündungen in Ihrer Lunge sind, umso mehr Induktion von NOS-2, umso mehr NO produzieren Sie, umso mehr NO gelangt in die von Ihnen ausgeatmete Luft. Der Arzt kann Sie daher in einen Beutel oder eine Röhre blasen lassen, und wenn der NO-Gehalt erhöht ist, weiß er, dass Ihr Asthma außer Kontrolle ist und er passt die Therapie daran an. Das ist sehr nützlich gewesen. Es gibt klinische Studien für septischen Schock, Blutplättchenaggregation. Wir wissen aus Mikroarray-Studien an Zellen, dass NO Gene reguliert, sowohl hoch- als auch herunterreguliert. Wir haben großes Interesse an der Stammzellenbiologie entwickelt. Seit den letzten paar Jahren wissen wir, dass Stickstoffmonoxid und zyklisches G die Vermehrung embryonaler Stammzellen beim Menschen und bei Mäusen beeinflusst. Wir glauben, dass wir Zellen auf unterschiedliche Entwicklungsbahnen zwingen können, indem wir mit NO und zyklischem G herumspielen. Und es gibt noch andere Anwendungen, dies ist nur eine Teilliste. Wir können nicht alles tun. Haben Sie vielen Dank.

Ferid Murad (2007)

Nitric oxide as a messenger molecule and its role in drug development

Ferid Murad (2007)

Nitric oxide as a messenger molecule and its role in drug development

Abstract

The role of nitric oxide in cellular signaling in the past three decades has become one of the most rapidly growing areas in biology. Nitric oxide is a gas and a free radical with an unshared electron that can regulate an ever-growing list of biological processes. Nitric oxide is formed from L-arginine by a family of enzymes called nitric oxide synthases. These enzymes have a complex requirement for a number of cofactors and regulators including NADPH, tetrahydrobioterin, flavins, calmodulin and heme. The enzymes are present in most cells and tissues. In many instances, nitric oxide mediates its biological effects by activating the soluble isoform of guanylyl cyclase and increasing cyclic GMP synthesis from GTP. Cyclic GMP, in turn, can activate cyclic GMP-dependent protein kinase (PKG) and can cause smooth muscles and blood vessels to relax, decrease platelet aggregation, alter neuron function, etc. These effects can decrease blood pressure, increase blood flow to tissues, alter memory and behavior, decrease blood clotting, etc. The list of effects of nitric oxide that are independent of cyclic GMP formation is also growing at a rapid rate. For example, nitric oxide can interact with transition metals such as iron, thiol groups, other free radicals, oxygen, superoxide anion, unsaturated fatty acids, and other molecules. Some of these reactions result in the oxidation of nitric oxide to nitrite and nitrate to terminate the effect, while other reactions can lead to altered protein structure function and/or catalytic capacity. These effects probably regulate bacterial infections, inflammation of tissues, tumor growth, and other disorders. These diverse effects of nitric oxide that are cyclic GMP dependent or independent can alter and regulate numerous important physiological events in cell regulation and function. Nitric oxide can function as an intracellular messenger, an antacoid, a paracrine substance, a neurotransmitter, or as a hormone that can be carried to distant sites for effects. Thus, it is a unique molecule with an array of signaling functions. However, with any messenger molecule, there can be too little or too much of the substance, resulting in pathological events. Some of the methods to regulate either nitric oxide formation, metabolism, or function have been in clinical use for more than a century, as with the use of organic nitrates and nitroglycerin in angina pectoris that was initiated in the 1870s. Inhalation of low concentrations of nitric oxide can be beneficial in premature infants with pulmonary hypertension and increase survival rates. Ongoing clinical trials with nitric oxide synthase inhibitors and nitric oxide scavengers are examining the effects of these agents in septic shock, hypotension with dialysis, inflammatory disorders, cancer therapy, etc. Recognition of additional molecular targets in the areas of nitric oxide and cyclic GMP research will continue to promote drug discovery and development programs in this field. Current and future research will undoubtedly expand the clinician’s therapeutic armamentarium to manage a number of important diseases by perturbing nitric oxide formation and metabolism. Such promise and expectations have obviously fueled the interests in nitric oxide research for a growing list of potential therapeutic applications. There have been and will continue to be many opportunities from nitric oxide and cyclic GMP research to develop novel and important therapeutic agents. There are presently more than 80,000 publications in the area of nitric oxide research. The lecture will discuss our discovery of the first biological effects of nitric oxide and how the field has evolved since our original reports in 1977. The possible utility of this signaling pathway to facilitate novel drug development and the creation of numerous projects in the Pharmaceutical and biotechnology industrials will also be discussed.

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