Thomas A. Steitz (2011) - From the Structure of the Ribosome to the Design of New Antibiotics

Well, it’s a pleasure to be here and to talk to you all. This is a very wonderful meeting and venue for interacting between the laureates and the students. What I’m going to do is talk about some of our work on the ribosome and I’m also going to try and say a few words about how we got into studying this particular problem. Every set of studies has a pathway and we had a pathway. So when I was a postdoc in Cambridge, Brian Hartley, who is on the next slide, came up to me in the hallway. In Cambridge people talked a lot and Brian came up to me and he said, well, and this was about 1969, the year before I was going to take my faculty position. He said: “Well, what are you going to do next? What is your next problem?” And I said: “Well, I thought I’d work on the structure of aminoacyl tRNA synthetase complex with tRNA and aminoacid.” And he went: “There there my boy, that’s a very good idea, but why don’t you work on something you could actually do? I suggest hexokinase.” So I thanked him and I ran down to the library to find out what hexokinase was. And I then found that Dan Koshland had used hexokinase as one of the basis for proposing induced fit. Because he was trying to address the question: Why does hexokinase not hydrolise ATP in the absence of glucose? After all, a hydroxile group of sugar is just a water mimic and he said: Ah, there must be an induced fit, the only one the right substrate binds to the catalytic groups, arrange themselves. And if you don’t have, in this case, both substrates you won’t get the real arrangement. So we saw the structure of hexokinase with and without glucose and this is one of the structures that we’ve done in Stryer’s textbook and there is the structure without glucose and there is the structure with glucose. So right, he was right, that is induced fit. So then I wanted to turn back to the problem that had been interesting me all along. And that was inspired by two individuals whom I interacted with a lot, Jim Watson and Francis Crick. Now, Jim was at Harvard when I was a graduate student, actually I played tennis with him, went to his group meetings and he was working on the ribosome, so he got me interested in that area. And when I went to Cambridge, Francis of course was always around talking about everything, including the ribosome and other things. So that got me interested in thinking about the central dogma of molecular biology, which is DNA is copied into DNA, then DNA is transcribed into RNA and then finally the RNA is transcribed into protein. So we started out working on regulatory proteins and polymerases and did this for many years and we are still doing it. We are still trying to put together this entire machinery that is involved in replication, transcription, transcription regulation and the synthesis by the ribosome, and now I’m going to focus on how peptide bond formation occurs. Now, twenty years after my conversation with Brian Hartley, you probably can’t read it, but this is in 1989, our structure of aminoacyl tRNA synthetased, gluing tRNA synthetased with tRNA and ATP was published, twenty years. That would have been a very long assistant professor project. I don’t think I would have made it. So it is important to pick important problems, but you have to have the timing right, the right thing at the right time. So the ribosome, in 1964, when I was a graduate student, this was Jim Watson’s drawing, this is what the ribosome looked, was known about it. It had two subunits, a large and a small one and tRNA came into the A side with the amino acid, but they didn’t know what the tRNA structure was, and then the P side had a peptydyle, a group and didn’t know about the tunnel. And then there was translocation, so that was the general picture, but not much structure really. And then Jim Lake, in 1976, did the first EM studies of the ribosome and showed that the large subunit had this sort of a shape, that’s called the crown view, and the small subunit had a nice shape and they would snuggle up to each other in a friendly fashion, but it didn’t say much about function really. Some years later, actually this was published initially in 1997, by Joachim Frank, he introduced cryo-em, which I think is a fabulous technique for the present and the future, began to show some little invaginations in the Ribosome. They approximately positioned the tRNAs and the A side, P side and the E side, but not quite right, because all these anticodons are together, so that was the beginning of understanding the structure. So in 1995 we figured that it was time to move on and decide on the ribosome, because we’d been studying everything else in the central dogma, and you need the right person at the right time. And Nenad Ban joined the lab in 1995 and said he wanted to work on the ribosome and he was absolutely the right person at the right time. And two years later, Poul Nissen joined and the two of them really initiated the project and did a fabulous job. So what was the problem? Well, my experience tells me that in an audience like this I’m not in 25 words or less going to tell you the details of what the problem in phasing is, or for that matter even what phasing problem is, but we followed the work of the … and the first one to solve a structure of a ... using a heavy atom. You had to find the heavy atom, but then you have to locate it. It has to have a large enough signal so that you can measure its effect on the crystal and on the ribosome we need a super big heavy atom, so we use cluster compounds at very, very low resolution, where the signal is much stronger. And so here’s Joachim Frank’s twenty axiom resolution map of the large subunit. The first structure that was published was at nine axiom resolution, that we published, and we could see helixes and we saw the shape was the same, so we knew we were on the right track and then we went to progressively higher resolutions. And then finally in 2000, we got the atomic structure with the large ribosome RNA in green and white and the 5S rRNA coloured in purple and white. And protein scattered around the surface and the preptydyl transferring centre right at the bottom on the left, totally surrounded by our … and I’m not going to go into this in detail but we found that only RNA was at the side of peptide bond formation. So, as Francis Crick had predicted in 1968, the ribosome is indeed a ribozyme, that is it’s the RNA that’s involved in catalysis, which makes sense. If you think about the fact that the machine that makes proteins, the first protein couldn’t have been a protein, it’s the chicken and the egg problem. So indeed we showed that was right. And if you split the ribosome in half, now you can see that there’s a tunnel through it that’s about 100 Å long and about 20 Å wide and right at the surface of RNA that’s split, showing there’s pretty tightly packed and that there’s protein that protrudes in towards the centre. And here is a model of the 70th, that we’ve done recently, and again you can see the RNA has a very complicated twisted shape with the proteins embedded around. Here’s the large subunit RNA again, protein scattered around on the surface and the bits of protein that go in are in stabilising the RNA and here we come back to the A side tRNA. And the message is going in and being decoded here and the peptide bond formation is occurring in the bottom in the large subunit. So let me now turn to the source of the regular and catalytic power, and again this was done by a graduate student, Martin Schmeing, who also made a movie that I’m going to show you momentarily. And so what he did was, what I think is important in using structural studies to understand function, he captured every state in the process and took a structure of that and then he put it together in a movie. So here is the process, the A side substrate with an amino acid, the alpha amino group attacking the carbonile carbon of the peptidal tRNA, Now, he couldn’t, in the large subunit, look at the whole tRNA so he actually had just CCA amino acid, CCAI peptide and so here are the three tRNAs and the long polypeptide tunnel, and you can see the proteins coming into the interior. And so we’re going to focus on this area here, and finally he got the situation right at the side of peptide bond formation with the attacking alpha amino group in a position to attack the carbon EO carbon, positioned by a three prime hydroxyl of a sugar of A76 and positioned also by this A. And so then the question is: How does it work, what’s involved in catalysis? Well, part of it is orienting the substrates, that’s standard. Orienting the substrates, very important, but there’s more to it than that. And what’s involved in chemistry, and that was what we were wondering, ... Scott Strobel and Rachel Green’s lab removed the 2 prime hydroxyl, the P site here, so this is the 2 prime hydroxyl of the A and the P site tRNA, because that is about the only thing that could be helping here. And indeed they found that reduced the rate by 10.000 fold. And earlier, Andrea Barta, using our structure work in her similar studies, proposed a shuttle mechanism in which the 2 prime hydroxyls, picking up the proton from the alpha amino group to facilitate a nuclearphyl attack and then that proton going to relieving 3 prime hydroxyl group. And all the subsequent structural and bio chemical studies are consistent with this shuttle mechanism. So what’s involved in a ribosome’s catalytic power are substrate orientation, this proton shuttle and probably transition stabilisation by water molecule. Well, I could show you all these detailed structures, one at a time, but rather than doing that I will show you Martin’s movie with music. Okay, so that’s the RNA proteins in blue, now we’re focusing in onto the peptidyl transferring centre, we’re going to land on the peptidyl transferring centre, and on one side is going to be the P loop from that ribosome, it’s combining the P side substrate, and then the A loop is on the other side. So now we have coming in here, an analogue of the P side substrate, it’s going to make hydrogen bonds, there’s the structure by the way, and as the commune carbon is protected by this base, Martin discovered, now we have the attacking A site substrate coming in. Again making the hydrogen bond with the A loop and now it’s oriented incorrectly to attack, but when you get a CCA, Martin found, you get a rearrangement and now it’s ready to attack and there’s a water molecule stabilising the touch of hetero intermediate. So now we’re about to have the reaction here. It’s about to attack, okay. So there’s the touch of hetero intermediate, the Oxi-N9 interacting with the water molecule and it breaks down to give the product. And there’s the product CCA and that’s another crystal structure here. And now the product is going to go off to the exit site, the E site. There’s always a little bit of Walt Disney in between the structures here, so this is made up. So the E site is some distance away, now the thing that’s important about the E site is it has to discriminate against tRNAs with an amino acid, it only binds the A-slated tRNA. So it goes into a little pocket and there is no room for an amino acid in this region for, so it only binds the A-slated TRNA. Okay, and then one last trip from the A site to the P site, and it’s ready to start over again. So that’s what we know about peptide bond formation. Actually, Martin went from my lab to working in Venki Ramakrishnan’s lab and he made another movie with music in for EfTu, you ought to listen to that as well. He’s great. He has a second career possibility, I’m sure. So now on the last twelve minutes or so I want to talk about antibiotics, what we know about how antibiotics bind to the ribosome and inhibit it, and the source of antibiotic resistance and then what is being done to design new antibiotics, not by us but by a company we founded called Rib-X. I’m sure you’re all aware of MRSA, Mersa, Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus, which in the New York Times, October 17th, in 2007, four years ago almost, 19.000 deaths in US hospitals alone. I’m told now it’s around 20.000, or 100.000 worldwide. So it’s a major problem and it’s not the only resistant bacteria, so this is becoming a major problem that needs to be dealt with. So the question is how to antibiotics bind to the 50S. It turns out that the ribosome is, about 50% of antibiotics bind to the ribosome, and most of them bind to the large subunit. So it’s a major target. And so this work was done by another postdoc, Jeff Hansen initially, and then there was more work done subsequently that I’ll mention. So here’s the tRNA binding site, split away in the interior of the ribosome and there are some antibiotics that are specifically against TB, that I will mention at the end. There is an E site inhibitor, chloramphenicol and anisomycin. I’m actually going to skip over this particular one, and then there are macrolides, I shall concentrate on the bind further down in the tunnel, erythromycin and azithromycin, z-pack, I expect many of you have taken that. These are current antibiotics. And so how do these bind? So these studies were done some years ago by Jeff Hanson looking at the binding of a whole group of macrolides and the macrolide rings, all super imposed, they have different substitutions in making different interactions, almost all with the RNA. And it binds, here’s where peptide bond formation occurs, it binds further down the tunnel. So how do they work? So again, here’s where the antibiotic binds in red, and green are the residues whose mutation make the ribosome resistant to the antibiotics and there’s where polypeptide chain occurs, synthesis occurs, so if you look up the ribosome, there’s where peptide bond formation occurs, residue mutations lead to resistance and there is the antibiotic, it’s blocking the tunnel. I like to call it molecular constipation, as a way of getting the point across. And mutation of this residue to a G reduces the binding constant, so it’s a G in Haloarcula Marismortui, which is a species we use in an AN E.coli, so they decided that in fact they should mutate this residue, so there is the A or the G, and you can see that that N2 is right under the macrolide ring, so they got to get rid of that. So this student in post doc decided to mutate that G to an A in Haloarcula Marismortui, make a pseudo U bacteria if you will. And in fact now erythromycin binds very well, no problem whatsoever. And you can see where there’s erythromycin, which could bind either situation, it only changes the position a little bit due to this pesky N2 that’s on the G. So that means it doesn’t pack as tightly, which is why the binding constant goes down. Okay, well, now what? Well, the question that arose for many years is whether antibiotics bind differently to the archaeal ribosomes that we were studying, Haloarcula Marismortui and the bacterial ones, because archaeal is a sort of a eucaryote in disguise. They hung out with eucaryotes for a billion years or so. And so we thought, of course, they were the same, but there was some disagreement. So if we compare erythromycin as it’s bound to the deinococcus radiodurance in white and Marismortui in yellow, the rings are orthogonal, so that didn’t look so good. So these three, a student and two post docs, actually David is here, used thermos thermophilus and redid the experiments, now asking on the eubacteria what happens and the long and short of the story is that it binds the same. Here is erythromycin bound to the 70S, it superimposes exactly on our structure and doesn’t superimpose on the deinococcus radiodurance model. And the same thing is true for azythromycin, so we conclude that in fact macrolides bind to the mutated 50S exactly as they bind to the thermo thermophilus ribosomes. And that’s important if you’re going to use this information, because the next thing and last thing I’m going to talk about is how do you use this information to make new antibiotics. And this work I’m going to talk about is done by Rib-X pharmaceuticals and I’m just a reporter here. And the idea is to take bits and pieces of adjacently bound antibiotics, so there are many different families of antibiotics that buy nearby in the peptidyle transferring centre. And so what they do is they take a piece of one and chemically tie it to a piece of another with a lot of chemical synthesis and computational analysis to see what’s the right thing to do. So a lot of computational chemistry involved in this as well. And so here, for example, is one combination, which led to a compound they call Radezolid, in which these two compounds are combined and Radezolid has completed phase-two clinical trials successfully. And then another one is to combine macrolide with groups on what’s called the A site, and that’s looking successful. And then finally, what’s really exciting, is to just use this whole binding area and construct daynovel using computational methods, as well as structure-based design to make new antibiotics. And they have a couple of families of compounds that are getting ready for phase-one clinical trials, that are active against gram-negative bacteria, as well as all the resistance strain. So everybody is very excited about that as a new way, and so it looks like there’s many possibilities for designing new antibiotics. So this is the class called Oxazolidinone and here are the names of the people from Rib-X who worked on it and so here is, Linezolid is one that you can get from Pfizer, it’s a good compound but against various strains. So this is the MIC, minimum inhibitory concentration, and if it’s above four it’s not good, you only have to look at green and red. Red is bad, and so influenza, MRSA and so on, but Linezolid goes to Radezolid, the Rib-X compound, and it’s much better. And so again, different enterococci, again, Radezolid is very good, Linezolid is not. And then the next generation enhanced macrolide, again, the azythromycin, very bad against many things, stick it together and you get a new macrolide that works very well. So I think it’s going to work very very well, and then in the last minute or so I’m going to point out another direction that’s possible to take and that is to attack tuberculosis, a very big problem. There are, and this is done by a former graduate student and a post doc, binding some antibiotics to the 70S and here is the 70S, the A site tRNA, small subunit, large subunit, and this is where this family of compounds, capreomycin, viomycin bind, and they interact with both the small subunit and the large subunit right near the decoding centre, and let me just skip ahead quickly, and look at where it’s bound. It’s interacting with the large subunit RNA, small subunit RNA, the tRNA and here is the messenger RNA where it’s being decoded and it locks the tRNA on that orientation. And so what can you do with that? I mean, this is nice to understand, how it works, but what can you do about it? Well, it turns out that two other compounds that Venki’s lab have shown bind to the small subunit, hygromycin and paromomycin bind near to viomycin. So what would you do if you had that information? You’d combine it together and make a new compound, and so I’m hoping that someone will do that hopefully at Rib-X in the near future and get a better antibiotic that’s useful against TB, because there are some resistant strains of TB, particularly XRD that’s resistant to all antibiotics that are coming up, that really need to be addressed. So my main point at the end is that basic research, we only worked on the ribosomes to do basic research, but it’s having a consequence that will be useful in designing drugs effective against bacteria that are resistant, and so at the end let me just thank the people who did this work here, not entirely all on the screen are those in my group who have worked on the ribosome over the years, some of whom I’ve mentioned. This was a collaboration with Peter Moore’s group, and here are some of the group in his group, and there is Scott Strobel group made some of the substrate analogues, and here are some of the people from Rib-X, and then finally I was able to take 14 guests to Stockholm to enjoy the festivities which were really fantastic I must admit, and I was able to take some members of the lab who were pivotal and again I’ll mention Peter Moore, a long-term friend and pillar of the ribosome community. He was very important in this work and interactions. Nenad Ban, who started it, Poul Nissen, who then joined in, Hansen, who did the antibiotic work and Martin Schmeing, who did the substrate work and my administrative assistant Peggy Etherton who keeps me on the straight and is my memory chip and makes sure I go to the right meetings in the right place and I’ll stop there. Thank you.

Es ist mir eine Freude, hier bei Ihnen zu sein und zu Ihnen allen zu sprechen. Dies ist wirklich ein wunderbares Treffen und eine wunderbare Gelegenheit für Gespräche zwischen den Preisträgern und den Studenten. Ich werde über einen Teil unserer Forschungsarbeit zum Ribosom sprechen, und ich werde außerdem versuchen, einige Worte darüber zu verlieren, wie wir dazu kamen, uns mit diesem speziellen Problem zu beschäftigen. Jede Studienreihe hat ihren eigenen Verlauf, und so auch unsere. Während meiner Zeit als Postdoc in Cambridge begegnete mir Brian Hartley – der auf dem nächsten Dia zu sehen ist – im Flur. In Cambridge redeten die Leute ziemlich viel, und Brian kam zu mir und sagte Was ist deine nächste Aufgabe?“ Und ich antwortete: Und er fuhr fort: Ich schlage Hexokinase vor.“ Ich dankte ihm und stürzte in die Bibliothek, um herauszufinden, was Hexokinase war. Und dann stellte ich fest, dass Dan Koshland Hexokinase als eine der Grundlagen dafür verwendet hatte, ein „induced fit“-Konzept vorzuschlagen. Denn er versuchte, die folgende Frage anzugehen: Warum wird ATP in Abwesenheit von Glucose nicht von Hexokinase hydrolisiert? Schließlich ist eine Hydroxyl-Gruppe von Zucker nur eine Nachahmung von Wasser. Und er sagte: Hier muss ein „induced fit“ vorliegen, die einzige, mit der sich das richtige Substrat an die katalytischen Gruppen bindet, die diese selbst anordnen. Und wenn man in diesem Fall nicht beide Substrate hat, wird man nicht das tatsächliche Arrangement bekommen. So sahen wir die Struktur von Hexokinase mit und ohne Glucose, und dies ist eine der Strukturen, die wir in Stryers Lehrbuch behandelt haben, und hier haben wir die Struktur mit Glucose und dort die Struktur ohne Glucose. Er hatte also Recht – dies ist ein „induced fit“. Dann wollte ich mich wieder der Fragestellung zuwenden, die mich die ganze Zeit über interessiert hatte. Die Inspiration verdanke ich zwei Personen, mit denen ich viel zu tun hatte: Jim Watson und Francis Crick. Jim war in Harvard, als ich dort Doktorand war – ich spielte mit ihm Tennis und ging zu seinen Gruppentreffen – und er forschte über das Ribosom und weckte somit mein Interesse an diesem Thema. Und als ich nach Cambridge ging, sprach dort Francis natürlich immer über alles Mögliche – unter anderem über das Ribosom und andere Dinge. Dies brachte mich also dazu, über das zentrale Dogma der Molekularbiologie nachzudenken: DNA wird in DNA kopiert, dann wird DNA in RNA transkribiert und schließlich wird RNA in Protein transkribiert. Wir begannen also mit der Forschung zu Regulatorproteinen und Polymerasen. Dies taten wir viele Jahre lang und tun dies auch heute noch. Wir versuchen immer noch, diesen Gesamtmechanismus zusammenzusetzen, der an der Replikation, Transkription, Transkriptionsregulierung und der Synthese durch das Ribosom beteiligt ist, und ich werde mich nun darauf konzentrieren, auf welche Art und Weise die Bildung von Peptidbindungen vor sich geht. wurde unsere Struktur der Aminoacyl-tRNA-Synthetase, der Verbindung von tRNA-Synthetase mit tRNA und ATP, veröffentlicht. Ich glaube nicht, dass ich es geschafft hätte. Es ist wichtig, sich entsprechende Fragestellungen herauszusuchen, aber man muss auch das richtige Timing haben und die richtige Sache zur richtigen Zeit tun. Dies ist eine Darstellung des Ribosoms nach einer Zeichnung von Jim Watson, so wie man es sich nach dem Kenntnisstand im Jahr 1964, als ich Doktorand war, vorstellte. Es enthielt zwei Untereinheiten, eine große und eine kleine, und die tRNA kam an der A-Stelle mit der Aminosäure hinein, wobei man jedoch keine Kenntnis über die Struktur der tRNA besaß. Die P-Stelle hatte ein Peptidyl, eine Gruppe, und man wusste nichts von dem Tunnel. Dann gab es da die Translokation, das war also das allgemeine Bild, aber es enthielt nicht wirklich viel zur Struktur. Dann führte Jim Lake 1976 die ersten elektronenmikroskopischen Studien durch und zeigte, dass die große Untereinheit diese Form besaß – dies wird als „Kronenansicht“ bezeichnet – und die kleine Untereinheit eine hübsche Form besaß und dass sie sich freundlich aneinanderschmiegten, aber damit wurde nicht wirklich viel über die Funktion ausgesagt. Einige Jahre später führte Joachim Frank im Rahmen einer erstmals 1997 veröffentlichten Studie die Kryo-Elektronenmikroskopie ein – die ich für eine ausgezeichnete Methode für die Gegenwart und die Zukunft halte – und wies einige kleine Einstülpungen im Ribosom nach. Sie platzierten die tRNAs und die A-Stelle, die P-Stelle und die E-Stelle an ungefähre, jedoch nicht ganz korrekte Positionen, da alle diese Anticodons zusammen sind. Dies markierte den ersten Schritt zum Verständnis der Struktur. da wir alles andere in Bezug auf das zentrale Dogma bereits untersucht hatten. Man braucht die richtige Person zur richtigen Zeit. Nenad Ban schloss sich dem Labor 1995 an und sagte, er wolle das Ribosom erforschen – und er war genau die richtige Person zur richtigen Zeit. Zwei Jahre später kam Poul Nissen hinzu. Die beiden brachten das Projekt richtig in Gang und leisteten großartige Arbeit. Was war nun die Fragestellung? Meine Erfahrung sagt mir, dass ich einem Publikum wie diesem nicht in 25 oder weniger Worten die Details der Problematik des Phasing mitteilen oder ihm auch nur erklären werde, was das Phasing-Problem ist, aber wir folgten der Arbeit von ... und der erste, der die Struktur eines ... löste, indem er sich eines schweren Atoms bediente. Das schwere Atom muss gefunden, aber dafür muss es lokalisiert werden. Es muss über ein ausreichend starkes Signal verfügen, so dass seine Wirkung auf dem Kristall gemessen werden kann. Für das Ribosom benötigten wir ein besonders großes, schweres Atom, und daher verwendeten wir Clusterverbindungen in einer sehr, sehr niedrigen Auflösung, bei der das Signal sehr viel stärker ist. Und so haben wir hier Joachim Franks Karte der großen Untereinheit in 20-Å-Auflösung. Die zuerst von uns veröffentlichte Struktur war bei einer 9-Å-Auflösung. Wir konnten Helices erkennen und wir sahen, dass die Form dieselbe war. Somit wussten wir, dass wir uns auf dem richtigen Weg befanden, und gingen Schritt für Schritt weiter zu höheren Auflösungen. Im Jahr 2000 erhielten wir schließlich die Atomstruktur mit der großen Ribosomen-RNA, die hier in Grün und Weiß dargestellt ist, und mit der 5S-rRNA, die hier in Lila und Weiß eingefärbt ist. Auf der Oberfläche befinden sich verstreute Proteine, und das Peptidyl-Transfer-Zentrum befindet sich ganz unten links und ist vollständig umgeben von ... Ich werde dies nicht im Detail ausführen, aber wir haben festgestellt, dass sich nur RNA auf der Seite der Peptidbindungsbildung befand. Somit ist, wie Francis Crick 1968 vorhergesagt hatte, das Ribosom tatsächlich ein Ribozym. Das bedeutet, dass es die RNA ist, die an der Katalyse beteiligt ist. Dies macht Sinn. Wenn wir darüber nachdenken, dass es einen Mechanismus gibt, welcher Proteine produziert, dann kann das erste Protein kein Protein gewesen sein – es ist das Problem von Henne und Ei. Wir hatten also in der Tat nachgewiesen, dass dies richtig war. Wenn Sie das Ribosom halbieren, sehen Sie, dass ein Tunnel hindurchführt, der ungefähr 100 Å lang und ungefähr 20 Å breit ist. Genau auf der Oberfläche der aufgespalteten RNA kann man erkennen, dass hier alles ziemlich eng gedrängt ist und dass ein Protein in Richtung des Zentrums hineinragt. Hier ist ein Modell der 70S-Einheit, das wir kürzlich erstellt haben, und wieder können Sie erkennen, dass die RNA eine sehr komplizierte und verdrehte Gestalt mit den um sie herum eingebetteten Proteinen aufweist. Hier ist wieder die große RNA-Untereinheit, Protein ist auf der Oberfläche verteilt, und die kleinen Protein-Teilchen, die hineingehen, stabilisieren die RNA, und hier kommen wir zurück zur A-Stellen-tRNA. Die Botschaft tritt ein und wird hier dekodiert. Die Bildung der Peptidbindung findet im unteren Teil der großen Untereinheit statt. Lassen Sie mich nun auf den Ursprung der ribosomalen und katalysierenden Energie zu sprechen kommen. Auch dieses Thema wurde wiederum von einem Doktoranden behandelt, von Martin Schmeing, der außerdem einen Film produziert hat, den ich Ihnen sofort zeigen werde. Was er tat und was ich für sehr wichtig halte, wenn man Strukturen untersucht, um die Funktion zu begreifen, ist, dass er jedes Stadium des Prozesses festhielt, seine Struktur erstellte und dies zu einem Film zusammenfügte. Hier ist der Prozess, das A-Stellen-Substrat mit einer Aminosäure, die Alpha-Amino-Gruppe greift den Carbonyl-Kohlenstoff der Peptidyl-tRNA an, Er konnte allerdings in der großen Untereinheit nicht die gesamte tRNA betrachten, so dass er tatsächlich nur CCA-Aminosäure und CCAI-Peptid hatte. Hier haben wir die drei tRNAs und den langen Polypeptid-Tunnel, und Sie können sehen, wie die Proteine in das Innere hineinkommen. Wir werden uns auf diesen Bereich hier konzentrieren. Schließlich gelangte er zu einem korrekten Verständnis der Situation an der Stelle der Entstehung der Peptidbindung, mit der angreifenden Alpha-Amino-Gruppe in einer Position, um den Carbonyl-Kohlenstoff anzugreifen, mit einem 3’-Hydroxyl eines Zuckers von A76 und mit diesem. Somit lautet die Frage: Wie funktioniert die Katalyse und was ist an ihr beteiligt? Nun, ein Teil besteht darin, die Substrate auszurichten, das ist Standard. Die Ausrichtung der Substrate ist von großer Bedeutung, aber es gibt noch mehr, was wichtig ist. Was ist wichtig im Bereich der Chemie – das war es, worüber wir nachdachten .... Im Labor von Scott Strobel und Rachel Green wurde das 2’-Hydroxyl entfernt, die P-Stelle hier; somit ist dies das 2’-Hydroxyl der A- und der P-Stellen-tRNA, denn dies ist so ziemlich das Einzige, was hier hilfreich sein könnte. In der Tat stellten sie fest, dass dies die Geschwindigkeit um das 10.000-fache reduzierte. Zu einem früheren Zeitpunkt hatte Andrea Barta unter Verwendung unserer Strukturforschung in ihren eigenen, ähnlichen Studien einen Shuttle-Mechanismus vorgeschlagen, in welchem die 2’-Hydroxyle das Proton aus der Alpha-Amino-Gruppe aufnehmen, um einen nukleophilen Angriff zu ermöglichen, und in dem dann dieses Proton die 3’-Hydroxyl-Gruppe entlastet. Alle nachfolgenden strukturellen und biochemischen Studien stimmen mit diesem Shuttle-Mechanismus überein. An der katalytischen Wirkung eines Ribosoms sind demnach Substratorientierung, dieser Protonenshuttle und möglicherweise eine Übergangsstabilisierung durch ein Wassermolekül beteiligt. Ich könnte Ihnen jetzt nacheinander all diese detaillierten Strukturen zeigen, aber stattdessen werde ich Ihnen Martins Film, mit Musik unterlegt, vorführen. Okay, dies sind die RNA-Proteine in Blau; dann bewegen wir uns auf das Peptidyl-Transfer-Zentrum zu, wir werden auf dem Peptidyl-Transfer-Zentrum landen. Auf der anderen Seite wird die P-Schleife dieses Ribosoms sein, das Substrat der P-Stelle wird kombiniert, und dann ist die A-Schleife auf der anderen Seite. Hier kommt nun ein Analog zum Substrat der P-Stelle herein und wird Wasserstoff-Bindungen eingehen kommt nun, wie Martin feststellte, das angreifende A-Stellen-Substrat herein. Es geht wiederum eine Wasserstoffbindung mit der A-Schleife ein und ist nun für einen Angriff nicht korrekt ausgerichtet. Martin entdeckte jedoch, dass man, wenn man ein CCA bekommt, eine neue Anordnung erhält. Nun ist es bereit anzugreifen, und hier stabilisiert ein Wassermolekül die Berührung eines Hetero-Zwischenprodukts. Hier wird sich nun die Reaktion ereignen. Es ist im Begriff, anzugreifen. Dort haben wir die Berührung des Hetero-Zwischenprodukts, das Oxi-N9 interagiert mit dem Wassermolekül und es spaltet sich auf, um das Produkt zu ergeben. Hier haben wir das Produkt CCA, und hier eine weitere Kristallstruktur. Das Produkt wird sich nun in Richtung der Exit-Stelle, der E-Stelle, entfernen. Zwischen den Strukturen gibt es immer ein bisschen Trickfilm à la Walt Disney – dies hier ist erfunden. Die E-Stelle befindet sich in einiger Entfernung. Wichtig ist, dass die E-Stelle tRNAs mit einer Aminosäure benachteiligen muss. Sie bindet nur die acylierte tRNA. Es tritt also in eine kleine Tasche hinein, und da es in dieser Region keinen Platz für eine Aminosäure gibt, wird nur die acylierte tRNA gebunden. Okay – jetzt noch eine letzte Reise von der A-Stelle zur P-Stelle, und dann kann es wieder von vorne beginnen. Das ist also das, was wir über die Bildung von Peptidbindungen wissen. In der Tat wechselte Martin von meinem zu Venki Ramakrishnans Labor und produzierte dort einen weiteren Film mit Musik zum Thema Ef-Tu (elongation factor - thermo unstable). Auch den sollten Sie sich ansehen. Er ist großartig. Ich bin überzeugt, dass ihm eine zweite Karriere offensteht. In den letzten zwölf Minuten möchte ich über Antibiotika sprechen, darüber, wie Antibiotika sich nach unserem Kenntnisstand an das Ribosom binden und es hemmen, über die Ursache für Antibiotikaresistenz und darüber, was hinsichtlich der Entwicklung neuer Antibiotika unternommen wird – nicht von uns, sondern von einer von uns gegründeten Firma namens Rib-X. Sicher ist Ihnen allen MRSA, Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus, bekannt. Laut der New York Times vom 17. Oktober 2007, also vor vier Jahren, verursachte dieser Keim allein in US-Krankenhäusern 19.000 Todesfälle. Soweit ich weiß, geht man weltweit von 20.000 bis 100.000 Todesfällen aus. Es handelt sich also um ein großes Problem, und da MRSA nicht das einzige resistente Bakterium ist, wird es zu einem sehr großen Problem, das man in den Griff bekommen muss. Die Frage ist also, wie Antibiotika sich an die 50S-Untereinheit des Ribosoms binden. Wie sich herausgestellt hat, binden sich 50 % der Antibiotika an das Ribosom, und die meisten davon binden sich an die große Untereinheit. Sie ist also ein wesentliches Angriffsziel. Die entsprechende Forschungsarbeit wurde anfangs von einem weiteren Postdoc, Jeff Hansen, unternommen, und später gab es hierzu weitere Arbeiten, die ich erwähnen werde. Hier haben wir die tRNA-Bindungsstelle, im Inneren des Ribosoms abgespaltet, und hier haben wir einige Antibiotika, die speziell gegen Tuberkulose-Bakterien eingesetzt werden und auf die ich am Ende meines Vortrags eingehen werde. Hier ist ein E-Stellen-Inhibitor, Chloramphenicol und Anisomycin. Dieses hier werde ich übergehen. Dann haben wir hier die Makrolide. Ich werde mich auf die Bindung weiter unten im Tunnel konzentrieren. Erythromycin, Azithromycin – ich nehme an, dass viele von Ihnen das eine oder andere schon einmal eingenommen haben. Es handelt sich dabei um gebräuchliche Antibiotika. Wie ist ihr Bindungsmechanismus? Jeff Hanson führte die entsprechenden Studien vor einigen Jahre durch und betrachtete dabei die Bindung einer ganzen Gruppe von Makroliden. Die Makrolidringe, die alle überlagert sind, haben unterschiedliche Substitutionen bei unterschiedlichen Interaktionen, nahezu alle mit der RNA. Sie binden weiter unten im Tunnel – dort kommt es zur Bildung der Peptidbindung. Wie funktionieren sie? Wir sehen hier in Rot die Bindung durch die Antibiotika und in Grün die Überreste, deren Mutation für die Antibiotikaresistenz des Ribosoms verantwortlich ist. Dort werden Polypeptidketten gebildet, dort findet Synthese statt; wenn Sie also das Ribosom betrachten, ereignet sich dort die Peptidbindungsbildung. Die Mutation der Überreste führt zur Resistenz. Hier sehen Sie das Antibiotikum, das den Tunnel blockiert. Ich bezeichne dies gern als „molekulare Verstopfung“, um den Sachverhalt deutlich zu machen. Eine Mutation dieses Überrests zu einem G reduziert die Bindungskonstante. Dies ist ein G in Haloarcula marismortui, welches eine Spezies ist, die wir bei E.coli eingesetzt haben. Sie beschlossen also, tatsächlich diesen Überrest mutieren zu lassen. Hier ist das A oder das G, und Sie können erkennen, dass sich das N2 direkt unter dem Makrolidring befindet. Sie haben es also geschafft, ihn loszuwerden. Dieser Postdoc-Student beschloss, bei Haloarcula marismortui das G zu einem A mutieren zu lassen, also, wenn Sie so wollen, ein Pseudo-Eubakterium herzustellen. Erythromycin bindet in der Tat sehr gut; es gibt keinerlei Probleme. Sie können sehen, wo hier Erythromycin vorliegt, welches in beiden Situationen binden kann; es verändert nur aufgrund dieses lästigen N2 auf dem G ein wenig die Position, das ist alles. Das bedeutet also, dass es nicht ganz so eng zusammengepackt wird, was der Grund dafür ist, dass die Bindungskonstante sinkt. Okay – und was jetzt? Die Frage, die sich über viele Jahre stellte, ist, ob sich Antibiotika auf andere Art und Weise an die Ribosomen der Urbakterien binden, die wir untersuchten, die Ribosomen von Haloarcula marismortui und die bakteriellen Ribosomen, denn Urbakterien sind so etwas wie verkleidete Eukaryoten. Sie haben etwa eine Millarden Jahre mit den Eukaryoten verbracht. Wir dachten, dass sie natürlich gleich seien, doch es gab widersprechende Hinweise. Wenn wir Erythromycin in der Bindung mit Deinococcus radiodurans (dargestellt in Weiß) mit Erythromycin in der Bindung mit Haloarcula marismortui (dargestellt in Gelb) vergleichen, sind die Ringe orthogonal. Das sah also nicht so gut aus. Somit setzten diese drei – ein Student und zwei Postdocs (dies hier ist David) – Thermus thermophilus ein und wiederholten die Experimente, um den Ablauf bei Eubakterien zu klären. Um es auf den Punkt zu bringen: die Bindung ist dieselbe. Hier haben wir Erythromycin, gebunden an das 70S-Ribosom. Es überlagert exakt unsere Struktur, und es überlagert nicht das Deinococcus radiodurans-Modell. Für Azithromycin gilt dasselbe. Daraus schlussfolgern wir, dass sich Makrolide tatsächlich auf exakt dieselbe Art und Weise an die mutierte 50S-Untereinheit binden, wie sie sich an die Thermus thermophilus-70S-Ribosomen binden. Dies ist wichtig, wenn Sie aus dieser Information Nutzen ziehen möchten, denn als nächstes – und letztes – möchte ich darüber sprechen, wie man diese Information bei der Entwicklung neuer Antibiotika einsetzt. Die Arbeit, von der ich berichten werde, wird von der Firma Rib-X Pharmaceuticals durchgeführt, und ich trete hier nur als Berichterstatter auf. Die Idee besteht darin, Teile und Stücke angrenzend gebundener Antibiotika zu nehmen, damit man viele verschiedene Familien von Antibiotika erhält, die in der Nähe des Peptidyl-Transfer-Zentrums eine Bindung eingehen. Was nun getan wird, ist Folgendes: Man nimmt ein Stück des einen Antibiotikums und verbindet es chemisch mit einem Stück eines anderen Antibiotikums, indem man sich in hohem Maße der chemischen Synthese und computergestützen Chemie bedient, um herauszufinden, was man tun muss. Hieran ist sehr viel computergestütze Chemie beteiligt. Hier haben wir beispielsweise eine Kombination, die zu einer Verbindung namens Radezolid geführt hat. Diese beiden Verbindungen wurden kombiniert, und Radezolid ist in klinischen Phase-II-Studien mit Erfolg erprobt worden. In einem anderen Fall wurden Makrolide mit Gruppen, die an der A-Stelle binden, kombiniert, und dies sieht erfolgversprechend aus. Letztendlich wirklich aufregend ist, diese gesamte Bindungsregion einzusetzen und abermals mit Hilfe von rechnerischen Methoden und strukturbasiertem Design vorzugehen, um neue Antibiotika herzustellen. Rib-X hat ein paar Familien von Verbindungen parat, die demnächst für klinische Studien der Phase I reif sind und die gegen gram-negative Bakterien als auch gegen die ganzen resistenten Stämme wirksam sind. Insofern herrscht angesichts dieser neuen Methode große Aufregung und Begeisterung, und es sieht so aus, als gebe es viele Möglichkeiten, um neue Antibiotika zu entwerfen. Dies hier ist die Klasse der als Oxazolidinone bezeichneten Verbindungen, und hier haben wir die Namen der Mitarbeiter bei Rib-X, die in diesem Bereich geforscht haben. Linezolid ist ein Antibiotikum, das man von Pfizer bekommen kann und das eine gute Verbindung ist, die gegen mehrere Stämme wirksam ist. Das hier ist die MHK, die minimale Hemm-Konzentration, und wenn diese über vier liegt, dann ist das nicht gut – achten Sie einfach auf Grün und Rot. Rot ist schlecht, wie hier für Influenza, MRSA und so weiter dargestellt, aber Linezolid wird zu Radezolid, der von Rib-X hergestellten Verbindung, weiterentwickelt, die sehr viel besser wirkt. Hier haben wir das gleiche Bild, für andere Enterokokken, und wiederum wirkt Radezolid sehr gut und Linezolid hingegen nicht. Dann haben wir hier die nächste Generation verbesserter Makrolide. Wieder weist Azithromycin in vielen Fällen eine sehr schlechte Wirksamkeit auf, aber es ergibt, wenn man es kombiniert, ein neues Makrolid, das sehr gut wirkt. Ich bin überzeugt, dass es sehr, sehr gut wirken wird. In der letzten Minute möchte ich noch einen anderen möglichen Weg hervorheben, den man einschlagen kann, nämlich die Bekämpfung der Tuberkulose, die ein sehr großes Problem darstellt. Ein ehemaliger Doktorand und Postdoc hat einige Antibiotika an das 70S-Ribosom gebunden. Hier haben wir das 70S-Ribosom, die A-Stelle der tRNA, die kleine Untereinheit, die große Untereinheit, und an dieser Stelle binden die Verbindungen dieser Familie, Capreomycin und Viomycin, und sie interagieren sowohl mit der kleinen als auch mit der großen Untereinheit in der Nähe des Dekodierungszentrums – lassen Sie mich ganz schnell fortfahren und uns einen Blick auf die Bindungsregion werfen. Die Verbindung interagiert mit der RNA der großen Untereinheit, mit der RNA der kleinen Untereinheit, mit der tRNA, und hier haben wir die Boten-RNA, dort, wo sie dekodiert wird, und die Verbindung hält die tRNA in dieser Richtung fest. Was kann man damit also anfangen? Ich meine, es ist zwar schön, wenn man versteht, wie dies funktioniert – aber was kann man damit machen? Nun, es hat sich herausgestellt, dass – wie in Venkis Labor nachgewiesen werden konnte – zwei andere Verbindungen sich an die kleine Untereinheit binden: Hygromycin und Paromomycin gehen in der Nähe von Viomycin eine Bindung ein. Was würden Sie also mit dieser Information tun? Sie würden diese Verbindungen kombinieren und eine neue Verbindung erschaffen, und daher hoffe ich, dass irgend jemand bei Rib-X dies in naher Zukunft tun und so ein wirksameres Antibiotikum erhalten wird, das gegen TB einsetzbar ist. Es gibt einige resistente TB-Stämme – insbesondere XDR-TB, der gegen alle eingesetzten Antibiotika resistent ist –, und diese müssen unbedingt bekämpft werden. Daher möchte ich am Ende vor allem darauf hinweisen, dass wir zwar zunächst die Ribosomen nur erforscht haben, um Grundlagenforschung zu betreiben, aber dass die sich daraus ergebenden Schlussfolgerungen uns helfen werden wirkungsvolle Medikamente gegen resistente Bakterien zu entwickeln. Lassen Sie mich deshalb jenen danken, die diese Forschungsarbeit geleistet haben. Nicht alle auf der Leinwand gehören zu meiner Gruppe, die jahrelang an dem Ribosom geforscht haben und von denen ich einige genannt habe. Dies war eine Zusammenarbeit mit der Gruppe von Peter Moore, und hier ist die Gruppe von Scott Strobel, die einige der Substrat-Analoge erstellte. Hier haben wir einige der Mitarbeiter von Rib-X, und schließlich konnte ich 14 Gäste nach Stockholm mitnehmen, um an den wirklich fantastischen Feierlichkeiten teilzunehmen. Ich konnte einige Mitarbeiter des Labors mitnehmen, die eine entscheidende Rolle spielten, und an dieser Stelle nenne ich noch einmal Peter Moore, einen langjährigen Freund und ein Eckpfeiler der Ribosomen-Forschergemeinschaft. Seine Arbeit und Interaktionen waren von großer Bedeutung. Nenad Ban, der damit begann, Poul Nissen, der sich dann daran beteiligte, Hansen, der die Antibiotika-Forschung betrieb, und Martin Schmeing, der die Substrate erforschte, und meine persönliche Assistentin Peggy Etherton, die mich auf dem richtigen Kurs hält und mein Speicherchip ist und dafür sorgt, dass ich zu den richtigen Veranstaltungen am richtigen Ort gehe. Damit möchte ich enden. Vielen Dank.