Erwin Neher (2011) - Signals and Signalling Mechanisms in the Central Nervous System

I think it is a challenge to keep up after these fantastic lectures this morning but I'll try anyway. My topic is signals and signalling mechanisms in the central nervous system and since I understand that this is a pretty diverse audience let me try to give a short introduction into the historical background regarding our knowledge on what happens in our brain. And of course this knowledge about bio-electricity, about signalling the brain starts with Luigi Galvani and Alessandro Volta in Italy. Luigi Galvani who showed that there is electricity in our bodies that frog muscles can be made to twitch when the nerve is stimulated by electric shock. About one hundred years later we got a very good impression on the structure of our brain when Ramon y Cajal showed that our brain is made up of these very delicate structures which we call neurons. And today we know that our brain is a network of about 1012 such neurons which are extensively connected with each other. Each nerve cell receiving input from up to about ten thousand neurons. Ramon y Cajal also developed ideas on the signal flow in the nervous system. When you look at his beautiful drawings you discover these little arrows everywhere. They show what his ideas about the signal flow was and one must say he had very good intuition. He was mostly right. Of course he didn't know what these signals were. But about at the same time Julius Bernstein showed what he called the "negative Schwankung" an electrical signal associated with nerve activity, which he was able to measure with this very difficult apparatus. And he also formulated his membrane theory which said the neurons are surrounded by a membrane and it's actually the voltage across this membrane which is responsible for signal and which changes in the way of this "negative Schwankung" when there is nerve activity. Now, 1952 Hodgkin and Huxley provided our understanding of the action potential of the nerve impulse by showing that actually when you depolarise a nerve something happens. When you cross a threshold the membrane suddenly becomes permanent with sodium ions. So even the electrochemical radiance across biological membranes and sodium rushes in and makes the inside more positive. But this is only a very short duration, soon after the membrane becomes permeable to potassium, potassium ions leaves the cell and this makes it again negative. Okay, so this more or less formed our understanding of what the brain is about. Each cell receives all its inputs mainly on its dendrites and adds up integrates its signals and once the threshold in a given cell has been surpassed the action potential is generated which then travels along the axon and signals to other cells. Now, the other part of course of the picture is what happens when such an electrical signal arrives, that's a nerve ending and signals to the receiving cell. This phenomenon synaptic transmission was first studied in detail at the neuromuscular junction. A special type of synapse when the nerve interacts with the muscle and gives its signal for the muscle to contract. There is a typical synapse at this neuromuscular junction. This is where Sir Bernhard Katz and colleagues studied this process of synaptic transmission in the 50s and 60s. What you see here is one of the basic discoveries which they made when they studied the signal in the muscle which is elicited by a nerve action potential. This is shown down here what happens is when the nerve impulse arrives there is a deflection. A positive signal which is the so-called synaptic signal generated by synaptic current, which then elicits an action potential a nerve impulse very much like the nerve impulse. Now what Bernhard Kutz did he looked at this at the baseline, he turned up the gain of his amplifier and observed something very strange namely that when you look at this baseline in high resolution you see all these little blips. So many researchers might dismiss this signal because it may be just some interference. But he decided to study it and what he found was when he reduced extra-cellular calcium concentration this nerve evoked signal became smaller and smaller and eventually at very low calcium concentration there was basically nothing left and the nerve impulse either did not illicit any signal or else elicited a signal of this kind which by itself happens spontaneously now and then. And this information of course when it was combined with the electro-microscopic evidence at the time that in the nerve terminals there are these little structures, these little granules called synaptic vesicles. This combined led to our current understanding of what synaptic transmission is, namely that a nerve impulse causes the influx of calcium ions. This was an underlying observation was that the strength of the signal is so critically dependent on extra calcium concentration. So this is calcium entering the nerve terminal as a consequence of the action potential, the calcium makes vesicles fuse with the plasma membrane and the vesicles are filled with neurotransmitter which diffuses to the postsynaptic membrane. The neurotransmitter opens channels in the postsynaptic membrane and so this again causes an electrical signal in the postsynaptic membrane. So we have this relatively complex process and electrical signal being translated into a chemical signal and back again to an electrical signal. Okay, so there is one very special feature of this kind of signal transmission which is very different in the brain as compared to a computer. In the computer the signal elicited by one transistor in the receiving circuit is always the same. But in neuroscience you observe basically everywhere you look that the synaptic strength which is the signal produced by a pre-synaptic action potential in the postsynaptic cell. So the synaptic strength changes in a youth dependent member. And neuroscientists are convinced that it is this plasticity, the constant reorganisation of the neuronal network which is at the basis of many of the very complex information processing tasks in the central nervous system. This plasticity occurs on many times scales, there are phenomena of long-term plasticities, so-called long-term depression and I think there is general agreement that this is the basis of learning and memory. But there is also short-term plasticity on the timescale of milliseconds to seconds which mediates basic signalling tasks like filtering adaptation and other things like gain control. So when we study the nervous system today we can principally take two approaches. Either the top-down approach starting from the higher functions and try to understand by lesion, by imaging how these functions are being generated by the element of the brain. Or else we can take the bottom-up approach which starts at the building blocks of molecules and tries to understand phenomena like nerve impulse synaptic transmission and so on. So my laboratory and my interest have guided me on the bottom up pathway. Already during my thesis - this is an illustration taken from my own thesis - recording from a giant neuron of a snail. When I started this research and lined up with Bert Sakmann to tackle some of the problems it was of course known from Hodgkin and Huxley that the action potential is a consequence of the permeability changes in nerve membrane but it was not known at this time what the underlying mechanisms are. Now around that time there was another field of research, which was work on artificial membrane. On so-called bimolecular lipid membranes. These were invented by Mueller and Rudin, two American researchers and more or less mimicked the biological membranes. What they found is that these artificial membranes just consisting of lipids were pretty good insulators but when you added tiny amounts of certain substances like the antibiotic gramicidin suddenly you saw, by recording currents across this membrane after applying a voltage, that there was this jumps in current recording. And all the evidence pointed that these gramicidin molecules formed pores in the membranes, so-called ion channels, which would then lead to a conductance. Obviously here these pores would form and decay and the up and down would be the opening and closing of these ion channels. And of course the proposal was that similar ion channels also would be operative in a biological membranes but the proof that was lacking. In fact there were competing hypothesis about carrier mechanism, about phase transitions in the membranes which might produce phenomenal like action potential. But Bert Sakmann and myself set out to prove this channel concept by showing that actually you can record such discontinuous jumps in current on the biological membrane. So just to give you an idea about the order of magnitude the channels of artificial membranes had an amplitude of about one pico-amp. You see here these arrow which should represent currents on a logarithmic scale, I need not go through all of this but just point out that typically the smallest biological currents that could be recorded at the time were on the order of a nano-amp, which is typically the current which is elicited in a muscle when one single quantum of transmitter, one vesicle fuses with the plasma membrane. But the problem was that all these methods for recording currents had an intrinsic noise of about a tenth or two-tenths of an nano-amp and we wanted to record this currents which were hundredfold smaller. So we had to come up with a new idea. The new idea is now known as the so-called Patch Clamp Technique. We used pipettes, measuring pipettes and did not punch through the membrane, as was usual at that time, but tried to place them touchingly on the surface to isolate little patches of membrane and the idea was that if you were lucky there would be a channel we could record the current flowing through this channel through an amplifier. We used a neuromuscular junction and were looking for this ion channels which are activated by the neuromuscular transmitter, which is acetylcholin, and indeed after a little bit of frustration, two or three years, we got recordings of this type. Very clear step-like changes in current elicited by acetylcholin which was added to the recording pipette. A few years later we happened to run across an improvement in the sense that the quality of this recording is very much dependent on the quality of the contact between the recording electrode and the membrane. And we happened to improve this contact about a hundredfold reaching so-called gigaseal conditions which means that the resistance between the inside of the pipette and the outside is in the order of gigaohms and this actually allowed us to record this current in very high precision. Around the same time the molecular biology had advanced, biochemists had been able to isolate membrane proteins, so-called acetylcholine receptors which could be shown to underlie these step like changes in current namely pentameric proteins which had binding sites for acetylcholine. And when this acetylcholine, the neuromuscular transmitter, binds to these molecules they undergo a conformational change, open the pathway through the channel and creating a current. I think that Bert Sakmann in his lecture on Wednesday or Thursday will show a few examples in terms of movies of what you can observe on the oscilloscope when you do this experiment. So let me just point out we were interested in nerve excitability in neuromuscular transmission. We just wanted to show that there are channels and wanted to study these channels. What we did not consider and which came as a surprise to us and actually which made our invention of this technique much more relevant is that channels not only are represented in so-called electrical excitable tissue but fulfil a huge array of different tasks in the whole range of other cells. Basically every cell type we looked at and which we started to look at when we had this method at hand tuned out to contain a specific types of channel which do fulfil all these jobs mainly at the interface between the biochemistry and chemistry and electrical signalling. Particularly in the sensory organs where channels are the real elemental transfusing the end signal from the surround to the central nervous system. What also turned out which we were not aware of is that these channels are prime targets for pharmaca. Just one example here a slide given to me by Harald Reuter an investigation on cardiomyocytes, heart cells, which express a particular type of calcium channel which lets calcium enter the cell to produce the heart contraction. When activated by voltage and under controlled conditions if you have a patch with just a single one of these channels you see upon depolarization this flickering open and close. If you do the same under the influence of a so-called calcium antagonist, a molecule which had been known and had been used as a pharmacon to fight hypertension, these channels are much less willing to open. Their opening is suppressed and therefore there is less calcium influx, less contraction of the heart and particularly also less tone on the blood vessels cells. Okay, another surprise was that defects in ion channels cause a number of hereditary diseases. Some of these are quite common but of course the majority of these diseases which have been characterised in between some fifty to a hundred diseases are quite rare diseases. But still they offer the possibility to learn a lot about human biology. To learn a lot about how very defined changes in a functional molecule in the end turn out to lead to pathological changes. And by now it's clear that about a thousand of the, I think we should say now twenty-thousand genes code for ion channels and transport mechanisms. Okay, so much about ion channels let me guide you one more step on the bottomup approach namely concentrate on synaptic transmission, which is my current field of research. And let me just show once more this summary slide on the basic way how this functions. But let me point out that of course in the end things are much more complex than originally thought. If we look today what biochemists, molecular biologists know about the synapse there about a huge number of molecules engaged in both the pre-synaptic compartment and the post-synaptic compartment. To do this job of synaptic transmission, I mean even though the mechanism is quite complex, neurotransmitter release post-synaptic sensitivity, one could do with just a few of these molecules to make such a complex thing. But in fact we are dealing with about fifteen-hundred interacting proteins here and probably the reason why it is such a complex thing is because of synaptic plasticity. Because of course we not only have to understand how the process takes place but also the nature has to have the means to regulate this synaptic connectivity on all these different time scales in a very complicated way. Okay, so we have been interested in some of the mechanisms of short-term plasticity, the very short forms of changes in synaptic transmission. And our preparation during the last few years has been the so-called Calyx of Held synapse in the auditory pathway second relay station of auditory information. This was already described by Hans Held in 1893, it was re-discovered for electro-physiology by Ian Forsythe who showed that these pre-synaptic terminals are so big that you can use our techniques with the patch pipettes to study in detail the pre-synaptic processes. And Gerard Borst together with Bert Sakmann has shown then that indeed you can do a simultaneously dual whole cell recording which means that you can simultaneously look, record currents and voltage both pre- and post-synaptic, that you can by taking excess with the recording pipette to the inter-cell milieu you can control the ions inside the cell. And you can load the terminals with fluorescent indicators and with so-called caged compounds. This will be one thing which I will come back in a second. So when you record from this synapse you see a large so-called excitatory post-synaptic current, a surge of invert-current as a consequence of the transmitter which has been liberated by the nerve. So this invert-current would use an action potential if it were not voltage clamped, if not our apparatus would hold the potential and the post-synaptic site constant. And the understanding of how this works goes again back to Sir Bernhard Katz who proposed that the release, the signal is proportional to two quantities namely to what's called the number of units available, the number of vesicles ready to be exocytosed when an action potential arrives, times the probability that a given vesicle actually fuses during action potential. Now this was extended by an Australian scientists Vere-Jones in 1966 who said this number of units available is proportional to the number of sites from which such vesicles can be released, times a probability that these sites are occupied. So you have the release to be proportional to the number of sites, times probability these are occupied, times the probability that a vesicle is released. Now, what we can observe on the Calyx of Held are the two most prominent forms of so-called short-term synaptic plasticity namely short-term depression, short-term facilitation. This you can see here when you give a sequence of stimuli at rapid succession you see if you do this here at two millimol calcium which is more or less normal condition that the response depresses, becomes smaller and smaller. Whereas if you do this at a small extracellular calcium concentration the first response is very small, it's different scale here, but subsequent responses are larger. So this is phenomenon of facilitation. Katz's concept gives a simple explanation to this, namely if you take the response proportional to these two kinds of probabilities, of course when you start here the first response releases a large fraction of the units available. So for the second response, the probability of occupancy of a given site is smaller and after a few responses you have more or less exhausted all your store of vesicles and you are left with a very small response. If however, you have a very small first response so the release probability here under these conditions is very small. You hardly change the probability of occupancy during this train and what you then see is that underlying this depression is actually an increase in the release probability for a given vesicle. This is the basis of facilitation. And here in our preparation these two processes superimpose on each other. Other synapses are made up in the sense that you see either only this or that actually also under normal conditions you see the facilitation in cases where release probability of the first pulse is very small. And each type of synapse in different regions of the brain has its own personality in this respect. Now, let me spend two more minutes I hope to just go into another very basic question, which is relevant for synaptic transmission and that is the calcium dependence. Katz already showed that the influx of calcium is the real trigger for the release but up to relatively recently nobody really knew how high this calcium concentration has to rise in order to trigger this event. And how long the duration of such signals and what its properties are. The reason is that of course the concentration of calcium at a given site depends strongly on the neighbourhood relationships. On how far away the calcium source is from the channels which mediate the calcium influx. Since it matters on a length scale of 10µM ~ 100µM culture imaging which is a method available to look at special distribution of calcium signals is not capable of answering this question. So in order to get an idea on how sensitive this release apparatus to calcium is we resorted to so-called caged calcium measurements. We filled the terminal with a compound called calcium compound which is a chelator like EGTA binding calcium but being photo-labile and giving a UV flash we can split this compound. We can liberate calcium and if we make sure that this compound was distributed evenly and also the light is evenly distributed we can elevate calcium uniformly in the cell and having also a calcium indicator dye, a substance which measures calcium concentration, we can then watch these responses to calcium increases, step-like calcium increases to various levels. And we see that if we increase calcium to about 2 micromolar from a pre-calcium level of only one-tenth of the micromolar we see a very, very small response. If we increase calcium to about 6 micromolar we see a response of about the same magnitude as an action potential induced response. So the cause answer is that the release apparatus response to calcium concentrations in the range of 10 micromolar. Of course this is a very course thing and we have to do biophysical modelling in order to get precise answers. But what I showed you establishes that this un-caging allows us to characterise the sensitivity and the speed of response of the release apparatus that from this knowledge we can then by biophysical modelling infer that actually when this calcium increase is only very short-lived we have to have an increase in the region of the vesicles to about 20um. We also can postulate that this increase has to be extremely short-lived because after having characterised the kinetics we know that any longer increase in calcium would lead to much more sluggish and long-lived responses. And further biophysical modelling then shows that actually you need a very tight spatial coordination between the calcium influx and the release sites. So without being able to go into details let me just summarise, we get the speed of the synaptic response by proximity. This provides a need for a very precise ultrastructural organisation of the synapse and this is also one of the reasons why you have these very many specialised molecules in the nerve terminal. So I shouldn't close without mentioning that of course this is the work of the laboratory and the main contributors to what I summarised here are Ralf Schneggenburger a previous post-lab who is now a professor at the EPFL in Lausanne. And Takeshi Sakaba who used to be a post-doc now he has his own group from Japan and from September he will be a professor in Kyoto. Thank you very much.

Nach diesen fantastischen Vorträgen heute Morgen wird das eine Herausforderung hier mitzuhalten, aber ich werde es dennoch versuchen. Mein Thema sind Signale und Signalgebungsmechanismen im zentralen Nervensystem. Da ich weiß, dass es sich hier um ein recht bunt gemischtes Publikum handelt, möchte ich Ihnen eine kurze Einführung in die Historie unserer Erkenntnisse über die Vorgänge im Gehirn geben. Natürlich beginnt dieses Wissen von der Bioelektrizität, der Signalgebung im Gehirn mit Luigi Galvani und Alessandro Volta in Italien. Luigi Galvani, der zeigte, dass es Elektrizität in unserem Körper gibt, dass man Froschmuskeln zucken lassen kann, wenn man den Nerv mittels Elektroschock stimuliert. Etwa 100 Jahre später bekamen wir eine sehr gute Vorstellung von der Struktur unseres Gehirns, als Ramon y Cajal zeigte, dass unser Gehirn aus diesen äußerst feinen Strukturen, den sogenannten Neuronen besteht. Heute wissen wir, dass unser Gehirn ein Netzwerk aus etwa 1012 solcher Neuronen ist, die flächendeckend miteinander vernetzt sind. Jede Nervenzelle erhält dabei Informationen von bis zu etwa zehntausenden anderen Neuronen. Ramon y Cajal entwickelte auch Ideen bezüglich des Signalflusses im Nervensystem. Wenn Sie sich seine wunderbaren Zeichnungen anschauen, entdecken Sie überall diese kleinen Pfeile. Sie stellen seine Vorstellungen vom Signalfluss dar, und man muss sagen, er hatte eine sehr gute Intuition und lag meistens richtig. Natürlich wusste er nicht, was diese Signale waren. Doch etwa zur selben Zeit stellte Julius Bernstein die von ihm so bezeichnete "negative Schwankung" dar, ein mit der Aktivität eines Nervs assoziiertes elektrisches Signal, das er mit dieser hochkomplizierten Vorrichtung messen konnte. Er formulierte auch seine Membrantheorie, die besagt, dass die Neuronen von einer Membran umgeben sind und es eigentlich die Spannung an dieser Membran ist, die für das Signal verantwortlich ist und sich bei Aktivität des Nervs im Sinne dieser "negativen Schwankung" ändert. dass bei Depolarisierung eines Nervs tatsächlich etwas geschieht. Überschreitet man eine Schwelle, wird die Membran infolge der elektrochemischen Strahlung in biologischen Membranen plötzlich für Natriumionen durchlässig; Natrium strömt ein und verstärkt die positive Ladung im Inneren. Dies ist jedoch nur von sehr kurzer Dauer; kurz danach wird die Membran wieder für Kalium durchlässig, d.h. Kaliumionen treten aus der Zelle aus, wodurch diese wieder negativ wird. Dies bildete also mehr oder weniger unser Verständnis von der Funktionsweise unseres Gehirns. Jede Zelle empfängt ihre Informationen hauptsächlich über die Dendriten und integriert (addiert) dabei die Signale; sobald die Schwelle in einer Zelle überschritten ist, wird das Aktionspotential erzeugt, das dann am Axon entlang wandert und das Signal an andere Zellen sendet. Auf der anderen Seite ist natürlich die Frage, was geschieht, wenn ein solches elektrisches Signal auf ein Nervenende trifft und der Empfängerzelle Informationen übermittelt. Dieses Phänomen - die synaptische Übertragung - wurde erstmals an der neuromuskulären Endplatte näher untersucht, einer speziellen Synapse, an der der Nerv mit dem Muskel in Wechselwirkung tritt und dem Muskel das Signal zur Kontraktion gibt. Die neuromuskuläre Platte ist eine typische Synapse; an ihr untersuchten Sir Bernhard Katz und Kollegen den Prozess der synaptischen Übertragung in den 50er und 60er Jahren. Hier sehen Sie eine der grundlegenden Entdeckungen, die sie bei der Untersuchung des von einem Nervenaktionspotential ausgelösten Signals im Muskel machten. Das ist hier unten dargestellt. Bei Ankunft des Nervenimpulses kommt es zu einer Auslenkung, einem von dem synaptischen Strom erzeugten positiven Signal, dem sogenannten synaptischen Signal, das dann ein dem Nervenimpuls sehr ähnliches Aktionspotential auslöst. Bernhard Kutz schaute sich die Basislinie an, drehte seinen Verstärker auf und beobachtete etwas sehr Seltsames, nämlich dass an der Basislinie bei hoher Auflösung diese kleinen Ausschläge sichtbar werden. Viele Forscher ignorierten dieses Signal, da es einfach eine Interferenz sein konnte. Er aber entschied sich, das Phänomen zu untersuchen, und stellte fest, dass dieses vom Nerv evozierte Signal bei Reduktion der extrazellulären Kalziumkonzentration immer kleiner wurde und schließlich bei sehr niedriger Kalziumkonzentration praktisch nicht mehr vorhanden war. Der Nervenimpuls sendete entweder gar kein Signal oder ein ab und an spontan entstehendes Signal aus. In Kombination mit den damaligen elektromikroskopischen Belegen, dass in den Nervenenden diese kleinen Strukturen, diese Körnchen, die sogenannten synaptischen Vesikel zu finden sind, führten diese Informationen zu unserem heutigen Verständnis der synaptischen Übertragung, dass nämlich ein Nervenimpuls das Einströmen von Kalziumionen auslöst. Die zugrundeliegende Beobachtung war, dass die Signalstärke entscheidend von der extrazellulären Kalziumkonzentration abhängt. Hier strömt Kalzium infolge des Aktionspotentials am Nervenende ein und bewirkt, dass die Vesikel mit der Plasmamembran verschmelzen und mit einem Neurotransmitter gefüllt werden, der durch die postsynaptische Membran diffundiert. Der Neurotransmitter öffnet Kanäle in der postsynaptischen Membran, was wiederum ein elektrisches Signal in der postsynaptischen Membran erzeugt. Wir haben also diesen relativ komplexen Prozess, bei dem ein elektrisches Signal in ein chemisches Signal und wieder zurück in ein elektrisches Signal verwandelt wird. Im Vergleich zum Computer gibt es jedoch im Gehirn eine ganz spezielle Besonderheit bei dieser Art von Signalübertragung. Im Computer ist das durch einen Transistor im Empfängerschaltkreis ausgelöste Signal stets dasselbe. In der Neurowissenschaft beobachtet man jedoch praktisch überall, dass die synaptische Stärke, also das von einem präsynaptischen Aktionspotential in der postsynaptischen Zelle erzeugte Signal... Der Laserpointer macht mir hier schlapp, vielleicht könnte ich einen neuen haben? Die Synapsenstärke ändert sich je nach Verwendungszweck. Neurowissenschaftler sind davon überzeugt, dass diese Plastizität, die kontinuierliche Umorganisation des neuronalen Netzwerks einem Großteil der äußerst komplexen Aufgaben der Informationsverarbeitung im zentralen Nervensystem zugrundeliegt. Diese Plastizität tritt in unterschiedlichen Zeitmaßstäben auf. Es gibt Phänomene der Langzeitplastizität, die sogenannte Langzeitpotenzierung/-depression, und ich denke, es herrscht allgemeine Übereinstimmung darüber, dass dies die Grundlage von Lernen und Gedächtnis ist. Es existiert aber auch eine Kurzzeitplastizität in einem Zeitraum von Millisekunden bis Sekunden, die grundlegende Signalgebungsaufgaben wie adaptive Filterung und Verstärkungsregelung vermittelt. Bei der Untersuchung des Nervensystems lassen sich heute im Prinzip zwei Ansätze verfolgen. Entweder der Ansatz von oben nach unten, also ausgehend von den höheren Funktionen, wo man versucht, anhand der Läsionen und mittels Bildgebung zu verstehen, wie diese Funktionen von den Elementen des Gehirns erzeugt werden, oder der Ansatz von unten nach oben, wo man bei den Molekülbausteinen beginnt und Phänomene wie die synaptische Übertragung von Nervenimpulsen usw. zu verstehen versucht. Mein Labor und mein Interesse haben mich auf den von unten nach oben verlaufenden Weg geführt. Bereits während meiner Doktorarbeit - das ist eine Abbildung daraus, die Ableitung eines Riesenneurons einer Schnecke - als ich mit meiner Forschung begann und mich mit Bert Sakmann zusammentat, um einige der Probleme anzugehen, war uns natürlich von Hodgkin und Huxley bekannt, dass das Aktionspotential Folge der Permeabilitätsveränderungen in der Nervenmembran ist. Die zugrundeliegenden Mechanismen waren damals jedoch noch nicht bekannt. Etwa zu dieser Zeit existierte ein anderes Forschungsgebiet, nämlich die Arbeit an künstlichen Membranen, sogenannten bimolekularen Lipidmembranen. Sie wurden von Mueller und Rudin, zwei amerikanischen Wissenschaftlern erfunden und ahmten mehr oder weniger die biologischen Membranen nach. Die Forscher stellten fest, dass diese künstlichen, nur aus Lipiden bestehenden Membranen zwar relativ gute Nichtleiter waren, bei Zugabe winziger Mengen bestimmter Substanzen wie dem Antibiotikum Gramicidin jedoch bei Aufzeichnung der Ströme an der Membran nach Anlegen einer Spannung Sprünge in der Ableitung auftraten. Alles deutete darauf hin, dass diese Gramicidin-Moleküle Poren in den Membranen bildeten, sogenannte Ionenkanäle, die dann die Leitfähigkeit bewirkten. Offensichtlich entstehen diese Poren und bilden sich wieder zurück, und das Auf und Ab entspricht dem Öffnen und Schließen dieser Ionenkanäle. Natürlich nahm man an, dass ähnliche Ionenkanäle auch in biologischen Membranen funktionieren, doch der Beweis fehlte. De facto existierten konkurrierende Hypothesen zu Trägermechanismen und Phasenübergängen in den Membranen, die Phänomene wie das Aktionspotential hervorrufen könnten. Doch Bert Sakmann und ich machten uns daran, dieses Konzept der Kanäle zu beweisen, indem wir zeigten, dass sich solche diskontinuierlichen Sprünge in der Stromkurve der biologischen Membran tatsächlich ableiten lassen. Damit Sie einen Eindruck von der Größenordnung der Kanäle künstlicher Membranen erhalten: Sie beträgt etwa 1 Picoampere. Sie sehen hier diese Pfeile, die Ströme auf einer logarithmischen Skala darstellen sollen. Ich will das nicht alles durchgehen, möchte aber darauf hinweisen, dass typischerweise die kleinsten biologischen Ströme, die man damals ableiten konnte, in der Größenordnung von 1 Nanoampere lagen, also typischerweise dem Strom entsprachen, der in einem Muskel ausgelöst wird, wenn ein Transmitterquantum, ein Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt. Das Problem war jedoch, dass bei all diesen Methoden zur Ableitung von Strömen ein intrinsisches Rauschen von 1/10 oder 2/10 eines Nanoampere auftrat, wir aber diese hundertfach kleineren Ströme ableiten wollten. Wir mussten also mit einer neuen Idee aufwarten - heute wird sie als Patch-Clamp-Technik bezeichnet. Wir benutzten Messpipetten, stachen aber damit nicht durch die Membran hindurch, wie es damals üblich war, sondern versuchen sie im Kontakt mit der Oberfläche zu platzieren, um kleine Stellen der Membran zu isolieren. Die Idee war, dass wir im Falle des Vorhandenseins eines Kanals den durch diesen Kanal fließenden Strom mittels eines Verstärkers aufzeichnen könnten. Wir verwendeten eine neuromuskuläre Endplatte und suchten nach diesen Ionenkanälen, die durch den neuromuskulären Transmitter Acetylcholin aktiviert werden. Und tatsächlich, nach zwei oder drei frustrierenden Jahren, gelang uns diese Ableitung: Ganz deutliche, stufenweise Veränderungen des Stroms, die durch das der Messpipette zugesetzte Acetylcholin hervorgerufen wurden. Einige Jahre später stießen wir zufällig auf eine Verbesserung in dem Sinne, dass die Qualität dieser Ableitung sehr stark von der Qualität des Kontaktes zwischen der Messelektrode und der Membran abhängt. Wir verbesserten diesen Kontakt um etwa das Hundertfache und erreichten auf diese Weise sogenannte Gigaseal-Bedingungen; dabei liegt der Widerstand zwischen der Innen- und Außenseite der Pipette in der Größenordnung von Gigaohm. Dies erlaubte uns die Messung dieses Stroms mit sehr großer Präzision. Etwa um dieselbe Zeit gab es Fortschritte in der Molekularbiologie; die Biochemiker konnten Membranproteine, sogenannte Acetylcholin-Rezeptoren isolieren, und es konnte gezeigt werden, dass diese Rezeptoren, nämlich Pentamerproteine, die über Bindungsstellen für Acetylcholin verfügen, diesen stufenweisen Veränderungen des Stroms zugrundeliegen. Bindet das Acetylcholin, der neuromuskuläre Transmitter, an diese Moleküle, kommt es zu einer Konformationsänderung, der Weg durch den Kanal öffnet sich und es wird ein Strom erzeugt. Ich denke, dass Bert Sakmann Ihnen in seinem Vortrag am Mittwoch oder Donnerstag einige Filmbeispiele dafür zeigen wird, was sich bei diesem Experiment auf dem Oszilloskop beobachten lässt. Wir waren also an der Erregbarkeit von Nerven bei der neuromuskulären Übertragung interessiert. Wir wollten einfach zeigen, dass es Kanäle gibt, und diese Kanäle untersuchen. Was wir nicht bedacht hatten und für uns daher überraschend kam und unsere Erfindung dieser Technik erheblich relevanter machte, war, dass Kanäle nicht nur in elektrisch erregbarem Gewebe vorliegen, sondern auch eine unglaubliche Vielzahl unterschiedlicher Aufgaben in allen anderen Zellen erfüllen. Es stellte sich heraus, dass praktisch jeder Zelltyp, den wir uns anschauten, als uns dieses Verfahren zur Verfügung stand, spezielle Kanäle enthielt, die all diese Aufgaben hauptsächlich an der Schnittstelle zwischen Biochemie, Chemie und elektrischer Signalgebung erfüllten, insbesondere in den Sinnesorganen, in denen Kanäle am Ende die eigentlichen Überträger des Signals von der Umgebung auf das zentrale Nervensystem sind. Es stellte sich zudem heraus - und dessen waren wir uns ebenfalls nicht bewusst - dass diese Kanäle das vorrangige Ziel von Medikamenten sind. Nur ein Beispiel: Hier sehen Sie eine Folie, die mir Harald Reuter gegeben hat, über die Untersuchung von Kardiomyozyten, also Herzzellen, die eine bestimmte Art von Kalziumkanal exprimieren, der Kalzium in die Zelle strömen lässt, um die Kontraktion des Herzens zu induzieren. Hat man eine Stelle mit nur einem dieser Kanäle und aktiviert man diesen mittels Spannung unter kontrollierten Bedingungen, sieht man, dass er bei Depolarisierung auf und zu geht. Macht man dasselbe unter dem Einfluss eines sogenannten Kalziumantagonisten, eines Moleküls, das damals bereits bekannt war und als Medikament gegen Bluthochdruck eingesetzt wurde, öffnen sich diese Kanäle weit weniger bereitwillig. Das Öffnen wird unterdrückt, so dass weniger Kalzium einströmt, das Herz weniger stark kontrahiert und insbesondere der Tonus der Blutgefäßzellen niedriger ist. Eine weitere Überraschung war, dass Defekte in den Ionenkanälen zu einer Reihe von Erbkrankheiten führen. Einige davon sind recht häufig, doch der Großteil dieser etwa fünfzig bis hundert Erkrankungen tritt natürlich eher selten auf. Dennoch eröffnen sie die Möglichkeit, etwas über die menschliche Biologie zu erfahren, darüber wie genau definierte Veränderungen in einem funktionellen Molekül am Ende zu pathologischen Veränderungen führen. Heute ist klar, dass etwa 1000 der, ich denke wir können sagen 20.000 Gene Ionenkanäle und Transportmechanismen codieren. Gut, so viel zu den Ionenkanälen. Begeben wir uns in unserem Ansatz von unten nach oben auf die nächste Stufe und konzentrieren wir uns auf die synaptische Übertragung, mein aktuelles Forschungsgebiet. Ich zeige Ihnen noch einmal diese Folie, die einen Überblick über die grundlegende Funktionsweise gibt. Ich möchte allerdings betonen, dass die Dinge am Ende wesentlich komplexer sind als man ursprünglich dachte. Wenn wir uns heute anschauen, was Biochemiker und Molekularbiologen über die Synapse wissen, dann existiert eine unglaubliche Anzahl von Molekülen, die sowohl im präsynaptischen als auch im postsynaptischen Kompartiment an der synaptischen Übertragung beteiligt sind. Selbst wenn der Mechanismus relativ komplex ist - Neurotransmitter-Freisetzung, postsynaptische Sensibilität - käme man für einen solch komplexen Vorgang mit einigen wenigen dieser Moleküle aus. De facto haben wir es hier aber mit etwa 1500 interagierenden Proteinen zu tun. Der Grund für diese Komplexität ist wahrscheinlich die synaptische Plastizität, denn wir müssen natürlich nicht nur verstehen, wie der Prozess stattfindet, sondern die Natur muss auch über die Mittel verfügen, diese synaptische Vernetzung innerhalb der unterschiedlichen Zeitrahmen auf äußerst komplizierte Weise zu regulieren. Wir sind also an einigen der Mechanismen der Kurzzeitplastizität interessiert, d.h. den kurzfristigen Veränderungen bei der synaptischen Übertragung. Während der letzten Jahre haben wir uns mit der sogenannten Heldschen Calyx, einer Synapse der Hörbahn beschäftigt, die die zweite Relaisstation akustischer Informationen darstellt. Sie wurde bereits 1893 von Hans Held beschrieben und von Ian Forsythe für die Elektrophysiologie wiederentdeckt; er zeigte, dass diese präsynaptischen Nervenenden so groß sind, dass man die präsynaptischen Prozesse mit unserer Technik der Patch-Pipette näher untersuchen kann. Gerard Borst und Bert Sakmann haben gezeigt, dass tatsächlich eine simultane, duale Ganzzellableitung, d.h. die gleichzeitige prä- und postsynaptische Aufzeichnung von Strömen und Spannungen möglich ist, man die Ionen im Inneren der Zelle steuern kann, indem man sich mit der Messpipette Zugang zum interzellulären Milieu verschafft, und sich die Nervenenden mit fluoreszierenden Indikatoren, sogenannten Käfigverbindungen bestücken lassen. Darauf komme ich in einer Sekunde noch zurück. Bei Ableitung von dieser Synapse zeigt sich als Folge des von dem Nerv freigesetzten Transmitters ein großer, sogenannter exzitatorischer postsynaptischer Strom, ein plötzlicher Anstieg des Einwärtsstromes. Ohne Voltage-Clamp, ohne unsere Vorrichtung, die das Potential und die postsynaptische Stelle konstant hält, würde dieser Einwärtsstrom ein Aktionspotential induzieren. Das Verständnis dieser Vorgänge geht ebenfalls auf Sir Bernhard Katz zurück, der postulierte, dass das Signal zu zwei Größen proportional ist, nämlich zur Anzahl der verfügbaren Einheiten und zur Anzahl der Vesikel, bei denen es bei Ankunft eines Aktionspotentials zur Exozytose kommt, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Vesikel tatsächlich während eines Aktionspotentials verschmilzt. Dies wurde von dem australischen Wissenschaftler Vere-Jones 1966 noch weiter gefasst; nach seiner Auffassung ist die Anzahl der verfügbaren Einheiten proportional zur Anzahl der Stellen, an denen solche Vesikel freigesetzt werden, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass diese Stellen belegt sind. Die Freisetzung muss also proportional sein zur Anzahl der Stellen, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass diese belegt sind, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass ein Vesikel freigesetzt wird. Nun, was wir an der Heldschen Calyx beobachten können, sind die beiden markantesten Formen der sogenannten synaptischen Kurzzeitplastizität, nämlich short-term depression (STD) und short-term facilitation (STF). Sendet man in rascher Folge eine Reihe von Reizen - bei zwei Millimol Kalzium, was mehr oder weniger normwertig ist - sieht man, dass die Reaktion abnimmt und immer kleiner wird. Tut man dagegen dasselbe mit einer kleinen extrazellulären Kalziumkonzentration, fällt die erste Reaktion zwar auch sehr gering aus - der Maßstab ist hier anders - die späteren Reaktionen sind dagegen größer. Das ist das Phänomen der STF. Katz' Konzept liefert hierfür eine einfache Erklärung: Nimmt man nämlich die Reaktion proportional zu diesen beiden Wahrscheinlichkeiten und fängt hier an, setzt die erste Reaktion einen großen Teil der verfügbaren Einheiten frei. Bei der zweiten Reaktion ist die Wahrscheinlichkeit der Belegung einer Stelle somit kleiner, und nach ein paar Reaktionen ist mehr oder weniger der gesamte Vorrat an Vesikeln aufgebraucht und die Reaktion ist nur noch sehr gering ausgeprägt. Fällt jedoch die erste Reaktion sehr gering aus, ist auch die Wahrscheinlichkeit einer Freisetzung unter diesen Bedingungen sehr gering. Die Belegungswahrscheinlichkeit ändert sich während dieser Abfolge kaum. Sie sehen, dass dieser Depression eigentlich eine Zunahme der Freisetzungswahrscheinlichkeit für ein bestimmtes Vesikel zugrundeliegt. Das ist die Basis der STF. Hier in unserem Beispiel überlagern sich diese beiden Prozesse. Andere Synapsen sind dergestalt aufgebaut, dass man entweder nur dies sieht oder - auch unter normalen Bedingungen - in Fällen, in denen die Freisetzungswahrscheinlichkeit des ersten Impulses sehr gering ist, die STF. In dieser Hinsicht hat jede Synapse in den verschiedenen Gehirnregionen ihre eigene Persönlichkeit. Ich möchte mich jetzt noch zwei Minuten mit einer anderen grundlegenden Frage beschäftigen, die für die synaptische Übertragung relevant ist, und zwar mit der Kalziumabhängigkeit. Katz hatte bereits gezeigt, dass der Kalziumeinstrom der eigentliche Auslöser für die Freisetzung ist, doch bis vor kurzem wusste niemand wirklich, wie hoch die Kalziumkonzentration sein muss, um diesen Vorgang auszulösen, und wie lange solche Signale dauern und welche Eigenschaften sie haben. Der Grund dafür ist, dass die Kalziumkonzentration an einer bestimmten Stelle natürlich stark von den Nachbarschaftsverhältnissen abhängt, wie weit z.B. die Kalziumquelle von den Kanälen, die den Kalziumeinstrom vermitteln, entfernt ist. Da es um eine Längenskala von 10-100 µm geht, lässt sich diese Frage mittels Kalziumbildgebung, einem Verfahren, mit dem sich die spezielle Verteilung von Kalziumsignalen untersuchen lässt, nicht beantworten. Um also eine Vorstellung davon zu erhalten, wie empfindlich dieser Freisetzungsmechanismus für Kalzium ist, griffen wir auf die sogenannte caged-Kalzium-Messung zurück. Wir füllten die Nervenenden mit einer caged-Kalzium-Verbindung, also einem Chelator wie EGTA, der Kalzium bindet, jedoch photolabil ist und einen UV-Blitz erzeugt. Wir können diese Verbindung spalten und Kalzium freisetzen. Wenn wir für eine gleichmäßige Verteilung der Verbindung und des Lichts sorgen, können wir die Kalziumkonzentration in der Zelle gleichmäßig erhöhen. Mit einem Kalziumindikatorfarbstoff, einer Substanz, die die Kalziumkonzentration misst, können wir die Reaktionen auf die schrittweise Kalziumerhöhung auf verschiedene Konzentrationen beobachten. Bei einer Kalziumerhöhung von einem Präkalziumspiegel von nur 1/10 Mikromolar auf etwa 2 Mikromolar sehen wir nur eine äußerst geringe Reaktion. Erhöhen wir Kalzium auf etwa 6 Mikromolar, besitzt die zu beobachtende Reaktion etwa dieselbe Größenordnung wie eine von einem Aktionspotential induzierte Reaktion. Die Antwort ist, dass die Reaktion des Freisetzungsmechanismus auf die Kalziumkonzentrationen etwa im Bereich von 10 Mikromolar liegt. Natürlich ist das nur eine grobe Schätzung und wir müssen biophysikalische Modelle erarbeiten, um genaue Antworten zu erhalten. Was ich Ihnen gezeigt habe, beweist jedoch, dass uns dieses sogenannte Uncaging erlaubt, die Sensibilität und Geschwindigkeit der Reaktion des Freisetzungsmechanismus zu charakterisieren. Von diesem Wissen können wir dann mit Hilfe biophysikalischer Modelle ableiten, dass es im Falle einer nur sehr kurzzeitigen Kalziumerhöhung zu einem Anstieg im Bereich der Vesikel auf etwa 20 µm kommt. Wir können auch postulieren, dass dieser Anstieg außerordentlich kurzzeitig sein muss, denn nach Erstellung des kinetischen Profils wissen wir, dass ein längerer Kalziumanstieg zu erheblich schleppenderen und längeren Reaktionen führen würde. Weitere biophysikalische Modellversuche zeigten, dass de facto eine sehr enge räumliche Koordination zwischen dem Kalziumeinstrom und den Freisetzungsstellen notwendig ist. Ich kann hier nicht weiter ins Detail gehen, möchte Ihnen aber noch eine Zusammenfassung geben. Die Geschwindigkeit der synaptischen Reaktion hängt von der Lage ab, daher ist eine sehr genaue ultrastrukturelle Organisation der Synapse notwendig. Das ist auch einer der Gründe, warum diese unzähligen spezialisierten Moleküle in den Nervenenden existieren. Ich möchte meinen Vortrag nicht schließen, ohne anzumerken, dass dies natürlich die Arbeit des Labors ist und zwei Leute wesentlich zu dem beigetragen haben, was ich Ihnen heute gezeigt habe, nämlich Ralf Schneggenburger, ein früherer Post-Doc im Labor, heute Professor an der EPFL in Lausanne, und Takeshi Sakaba, ebenfalls ein früherer Post-Doc, der jetzt eine eigene Arbeitsgruppe in Japan leitet und ab September Professor in Kyoto ist. Vielen Dank.