Wie Sie aus den vorigen Vorträgen sehen, scheinen Onkogene überall zu sein,
sowohl in uns als jetzt auch in der biologischen Forschung.
Ich werde über ein ähnliches Thema wie der letzte Vortragende sprechen
über Ihnen über die Entwicklung der Idee der Onkogene und Proto-Onkogene erzählen.
Und wie das funktioniert, ursprünglich mit tierischen Viren in nicht-humanen Wirtszellen,
führte uns dazu, die genetischen Mechanismen in allen Krebsarten zu erkennen.
Es gibt bekannte Viren, die mit menschlichem Krebs zusammenhängen.
Sie stehen auf der ersten Folie, wenn ich sie sehen könnte.
Darin sind DNA-Viren, der Epstein-Barr Virus, der mit Burkitt Lymphom in Verbindung gebracht wird, ein Nasopharynx-Karzinom,
das Hepatitis B-Virus in Bezug auf das primäre Leberzellenkarzinom,
und die kürzlich beschriebenen humanen Retroviren HTLV und ATLV im Zusammenhang mit dem T-Zellenlymphom beim Erwachsenen.
Für die Mehrheit der menschlichen Krebserkrankungen in den entwickelten Ländern sind Viren wie diese aber nicht wichtig.
Aber andere Faktoren wie Zigarettenrauch, Strahlung und
verschiedene undefinierte Lebenszyklusfaktoren sind für die Entstehung der meisten Krebsarten verantwortlich.
Die Krebsforschung nach Viren, die hoch onkogenetische Retroviren genannt werden, wird jedoch sehr eifrig seit vielen Jahren betrieben,
weil diese Viren die sehr einfache Fähigkeit haben, Krebs zu verursachen.
Im Gegensatz zur normalerweise mehrstufigen Natur von Karzinogenen können diese Viren eine normale Zelle infizieren,
und in einem einfachen Schritt die normale Zelle in eine Krebszelle verändern.
Die Viren, die das können, unterscheiden sich von den normalen Viren.
Normale Viren haben entweder DNAs als ihr genetisches Material und ersetzen das genetische Material dieser Zelle mit der viralen DNA -
könnten Sie den unteren Teil der Folie zeigen bitte? –
oder sie haben virale RNAs als genetisches Material; eine virale RNA, die sich ohne DNA-Intermediate repliziert.
Die meisten Viren, die uns infizieren, gehören zu diesem Typ von Herpesvirus, Erkältungsvirus, Masernvirus usw.
Die Viren, die auf diese sehr schnelle Weise Krebs verursachen können, sind als Retroviren bekannt,
weil sie den normalen Informationsfluss umkehren.
Anstatt dass die Information von den DNA zur RNA und den Proteinen fließt,
fließt sie im Fall der Retroviren in umgekehrter Richtung, von der RNA zur DNA.
Diese DNA wird dann zur DNA der Zelle hinzugefügt und vervielfacht sich als Zellgen mit der Zell-DNA.
Der Virus ist dazu aufgrund 3 bemerkenswerter Gene im Virus fähig:
Hier sehen wir ein Diagramm des Virus-Lebenszyklus, wobei die virale RNA als diese Kette dargestellt ist.
Diese virale RNA funktioniert als Vorlage.
Wir sehen uns das Genom in der DNA an.
Und dieses Gen, das Polymerase genannt wird, pol kodiert für ein Enzym, das Reverse Transkriptase genannt wird,
und das mithilfe spezifischer Primer diese RNA in eine lineare DNA-Kopie abschreiben kann.
Die lineare DNA-Kopie enthält an beiden Enden, die durch die offenen Felder angezeigt werden,
eine LTR (large terminal repeat) mit einer kleinen Inverted Repeat.
Das sind die anderen viralen Gene.
Dieser Prozess findet im Zytoplasma statt.
Auf sehr spezielle Weise, wobei Doppelsprünge des DNA-Polymerasekomplexes vorkommen.
Die linear nicht-integrierte virale DNA wird dann zum Zellkern transportiert, wo sie von Ligation umgeben ist,
sodass sich die 2 Enden der linearen DNA gegenüberliegen und sich kreisförmig verbinden.
Diese Kreisbindung enthält eine invertierte Repeat, indem diese invertierte Repeat neben die nächste gesetzt wird.
Das pol-Gen, zusätzlich zur Kodierung für die Reverse Transcriptase bei seinem 3-Prime-Ende, kodiert noch für eine weitere Aktivität,
die wir INT nennen, für Integrase, obwohl das noch nicht nachgewiesen ist.
Und diese Aktivität findet an der Kreisverbindungssequenz statt, die wir AT für Attachment (Anbindung) nennen,,
um 4 Basenpaare im Zentrum zu entfernen und die virale DNA kovalent als co-lineare Kopie mit
minus 2 Basen an jedem Ende in die Zell-DNA einzufügen.
Gleichzeitig führt dieses Enzym, oder ein anderes unbekanntes Enzym, zu einer direkten Duplizierung der Sequenzen in der Zell-DNA.
Also der Virus enthält eine extrem spezifische und effiziente Maschinerie,
die fähig ist, externe Informationen in Form der RNA aufzunehmen und sie der Zell-DNA als kovalente Kopie hinzuzufügen.
Ich werde Ihnen nicht mehr Einzelheiten dieses Prozesses erzählen, weil ich heute um etwas anderes gebeten wurde,
obwohl ich sehr gerne mit jedem, der interessiert ist, heute Nachmittag darüber diskutieren würde.
Also das erste spezielle Merkmal der Retroviren, wodurch sie auf so effiziente Weise Krebs verursachen können,
ist ihre Fähigkeit eine DNA-Kopie der RNA z erstellen und dann diese DNA dem Zell-Genom hinzuzufügen,
wo es zu einem Zellgen wird, ein externes Gen wird zu einem Zellgen.
Nächste Folie - automatische Projektoren funktionieren manchmal besser.
Hier sehen wir wieder einen Cartoon des Genoms des Virus,
mit den offenen Feldern am Ende, die auf die large-terminal-repeat-Sequenz oder LTR verweisen,
und in der Mitte anstelle der Gene schrieb ich einfach virale Kodierungssequenzen.
Die Sequenzkodierung für die Proteine des Virus,
einschließlich die für die Hülle und für die Umschreibung und Integration.
Und hier habe ich die Enden der Viren vergrößert.
Diese großen Felder sind jetzt die Repeat-Sequenz.
Ich habe hier ganz am Ende die AT-Sequenzen angegeben,
von denen wir hörten, dass sie für die Integration des Virus verantwortlich sind.
Zusätzlich gibt es noch viele andere spezifische Sequenzen in der LTR und im Umfeld,
die für die RNA- und DNA-Synthese des Virus zuständig sind.
Und hier gibt es eine Sequenz, die als E für Enkapsidierung bekannt ist,
die den viralen Proteinen sagt, dass sie die virale RNA in ein Viruspartikel enkapsidieren sollen.
Wir können sehen, dass es im Virus eine Trennung der Sequenzen gab, wobei die virale Kodierungssequenzen in der Mitte sind,
und die Sequenzen, die den Virus kontrollieren und als cis-Sequenzen bezeichnen,
weil sie direkt an die nukleare Säure gebunden sind.
Verglichen mit diesen Sequenzen sprechen wir von trans-agierend, weil ihr Produkt auf verschiedenen Molekülen agieren kann.
Sie werden durch die trans-agierende Kodierungssequenz in der Mitte getrennt, wobei die cis-Sequenzen am Ende sind.
Also einige dieser Viren können sehr schnell und effizient Krebs verursachen.
Hier ein Beispiel eines Huhns, das vor 2 Wochen mit einem dieser Viren infiziert wurde,
und das Huhn starb an einer spontan auftretenden Leukämie.
Hier ein Beispiel einer Zelle in einer Zellkultur, die vor 10 Tagen mit dem Virus infiziert wurde,
in sich in eine Krebszelle verwandelte.
Wenn wir uns die Struktur der Viren ansehen, die eine so schnelle Veränderung herbeiführen -
und ein Beispiel davon wir ganz unten gezeigt - sehen wir, dass die Struktur des Virus sich sehr stark
von der Struktur der Viren, über die ich sprach, unterscheidet.
In diesen Top-Viren, die wir als replikationskompetente Viren bezeichnen, können wir die bekannten offenen Felder der LTR sehen.
Hier sind einige cis-Sequenzen, die für die DNA-Synthese und Enkapsidierung verantwortlich sind,
und die 3 Gene, die für virale Proteine kodieren.
Im hoch onkogenen Retrovirus sehen wir, dass die Endsequenzen an jedem Ende gleich sind.
Anders gesagt, der hoch onkogene Retrovirus erhält die cis-Sequenzen,
die für die RNA- und DNA-Synthese und Enkapsidierung der viralen RNA zuständig sind.
Aber einige Kodierungssequenzen wurden entfernt und neue Sequenzen wurden ersetzt.
Um die Rolle dieser neuen Sequenzen festzustellen, führen wir genetische Experimente anhand der rekombinanten DNA-Techniken durch,
die es uns ermöglichen, spezifische Teile in viralen Genomen zu entfernen
und dann die Transfektion tierischer Zellen zu verwenden, die mit dem von Dr. Smith beschriebenen Transformationsprozess zusammenhängen,
und wir können die Viren wiederherstellen und sehen, ob sie noch immer Krebs verursachen können.
Hier ist das Genom eines dieser hoch onkogenen Retroviren,
das neue Sequenzen und andere virale Sequenzen enthält.
Wenn wir mehrere virale Sequenzen entfernen - sehen wir uns dieses Konstrukt an - ist alles, was übrig bleibt,
diese cis-Sequenzen an beiden Enden und die neue Ersatzsequenz, und wir sehen, dass sich der Virus immer noch verändert.
Wenn wir jedoch die viralen Sequenzen erhalten und eine Änderung in den Ersatzsequenzen vornehmen,
sind die wiederhergestellten Viren nicht mehr tumorauslösend.
Das ist die genaue Definition von einem Onkogen,
ein Onkogen oder Onkogene oder Gene in sehr onkogenen Retroviren,
der Code für das Proteinprodukt, das für die neoplastische Transformation benötigt wird.
Ähnliche Experimente wurden mit ca. 20 verschiedenen Viren durchgeführt.
Und etwa 20 verschiedene Onkogene wurden gefunden.
Alle fanden sich in Retroviren und hatten die Fähigkeit, normale Zellen in neoplastische Zellen zu verändern,
nachdem sie zum Zellgenom durch die Retrovirusinfektion hinzugefügt wurden.
Natürlich können Sie die Namen nicht lesen src, yes, fps, fes, abl, ros, fgr, erb, fms,
mas, K-ras, H-ras, myc, myb, fos, raf, skirail und sis sind nur 3-Zeichen-lange Gedächtnisstützen.
Hier sind die Ursprungsarten der Viren angegeben.
Sie wurden in Hühnern, Katzen, Mäusen, Ratten, Truthähnen und Affen gefunden.
In einigen Fällen wurde dasselbe Onkogen von einem Virus in 2 verschiedenen Arten isoliert.
Außerdem sammeln sich die Onkogene in Gruppen basierend auf Ähnlichkeiten in der Sequenz und Funktion an.
Also alle diese 6 Onkogene zeigen eine Tyrosin-Kinase-Aktivität.
Diese 3 zeigen keine solche Aktivität, aber haben eine DNA-Sequenz, die mit scr verbunden ist.
Diese 2 sind durch die Sequenz und ein Protein verbunden, das eine GTP-Bindungsaktivität ausführt.
Diese befinden sich im Zellkern und die Funktion und der Ort der anderen sind nicht bekannt.
Wir sehen, dass die viralen Onkogene kein unendlicher Satz sind,
sondern ein kleiner Satz mit demselben Gen, das wiederholt von verschiedenen Arten isoliert wird.
Außerdem sehen wir, dass auch die verschiedenen viralen Onkogene in zusammenhängende Familien fallen.
Das sagt uns, dass zumindest gemäß dieser Definition von Onkogenen nur eine kleine Anzahl,
wir glauben weniger als 40 Gene, in diese mächtigen Krebsgene verändert werden können.
Und nicht, dass irgendeine Art von Gen ein Krebsgen werden kann.
Wie Professor Ochoa bemerkte, kommt das virale Onkogen von einer normalen Zelle, die als Proto-Onkogen bekannt ist.
Ein Retrovirus erkennt die Zell-DNA in einigen Schritten und verändert sie in ein Onkogen.
Das ist wieder ein spezieller Cartoon, bei dem ein replikationskompetenter Virus, ein hoch onkogener Retrovirus,
mit einem Proto-Onkogen, dessen Sequenz der Sequenz des viralen Onkogens entspricht, verglichen wird.
Sie können sofort sehen, dass das Proto-Onkogen dem viralen Onkogen nicht ähnlich sieht.
Das Proto-Onkogen ist in Exons und Introns aufgeteilt.
Das Proto-Onkogen hat seinen eigenen Promoter und 3 Prime-Sequenzen,
während das virale Onkogen den viralen Promoter und die Endsequenzen verwendet.
Das Proto-Onkogen findet sich in normalen Zellen und ich glaube Dr. Holley erzählte Ihnen,
dass es manchmal eine sehr wichtige Funktion bei der Kontrolle des normalen Zellwachstums hat.
Also die Proto-Onkogenese sind Gene, deren DNA-Sequenzen ähnlich aussehen wie die der viralen Onkogene.
Nachdem es 20 bis 40 Onkogene gibt, nehmen wir an, dass es nur 20 bis 40 Proto-Onkogene gibt,
normale Zellgene, deren Mutation in Form einer Transduktion durch einen Retrovirus Krebs verursachen kann.
Was ist jetzt der Unterschied zwischen dem Proto-Onkogen, das keinen Krebs verursacht,
und dem viralen Onkogen, das Krebs verursacht?
Ich habe schon erwähnt, dass es einen sehr großen Unterschied bei der Regulation gibt,
denn in dem einen Fall wird das Proto-Onkogen durch zelluläre transkriptionale Kontrollsignale kontrolliert.
Im Fall des Onkogens wird die Expression von viralen transkriptionalen Kontrollen kontrolliert.
Außerdem, wenn die Proteinsequenzen, die vom Proto-Onkogen produziert werden,
die durch die starke schwarze Linie dargestellt sind, als wäre die Aminosäurensequenz ausgeschrieben worden,
und nachdem das ein normaler Homolog ist, ist der Vorläufer kontinuierlich dargestellt.
Wenn man sie mit den Proteinsequenzen des viralen Onkogens vergleicht,
die hier mit Kreisen, Xe, Dreiecken und dünnen Linien dargestellt ist, sehen wir, dass es zahlreiche Unterschiede gibt.
Sehen wir uns zuerst die Ähnlichkeiten an.
Immer wenn die dünne Linie kontinuierlich verläuft, sind die Proteine gleich.
Wenn Dreiecke vorkommen, gibt es Unterschiede bei den Aminosäuren in der Mitte des Proteins.
Und die Xe am Ende und die Kreise und Xe am Anfang zeigen an, dass das virale Onkogen
Sequenzen des Virus verwendet, um die Amino- und Carboxy-Endungen seines Proteins zu kodieren.
Anders gesagt, das Proto-Onkogen wurde stark modifiziert während es sich zu einem viralen Onkogen veränderte.
Seine Regulation wurde verändert, indem es seine eigenen Kontrollsequenzen verlor und mit den viralen Kontrollsequenzen
veränderten sich die Enden seiner Proteinmoleküle und einige Aminosäuren in der Mitte.
Das sind Korrelationsveränderungen.
Ich werde Sie nur auf diese eine Art von Experiment hinweisen, das Ihnen zeigt,
wie wir feststellen, welche dieser Veränderungen im Transformationsprozess signifikant sind.
Es gibt so viel mehr, das ich Ihnen darüber erzählen könnte, aber nur um zu zeigen, wie das gemacht wird.
Wir sehen uns wieder die viralen Genome mit den Feldern und den Linien an die die cis-Sequenzen darstellen,
deren Enden alle gleich sind.
Das sind jetzt die sogenannten Retrovirus-Vektoren,
von denen wir alle viruskodierten Sequenzen entfernt haben,
und in diesem Fall mit dem Thymidin-Kinase-Gen oder viralem Onkogen oder zelluläres Proto-Onkogen ersetzt haben.
Das sind die hoch onkogen-ähnlichen Viren, die konstruiert wurden, wie wir sagen, durch ausschneiden und einfügen im Labor.
Wir können beliebig Viren erzeugen, verschiedene Arten von Viren für verschiedene Zwecke.
Hier ist der Zweck, 2 von ihnen anzuschauen, das ein und das zweite.
Das eine enthält ein virales Onkogen, das Harvey RAS-Gen.
Der Virus wird ertragreich erzeugt.
Er kann normale Hühnerzellen sofort bei der Infektion verändern.
Aber er kann keine Rattenzellen verändern.
Obwohl der Virus auch in der Rattenzelle vorhanden ist und die Genexpression im Virus auf einer niedrigen Ebene erfolgt.
Dieser Unterschied hänge mit der Regulation der Genaktivität zusammen.
Die viralen Promoter sind in Hühnerzellen sehr aktiv.
Aber diese speziellen Viruspromoter sind in Rattenzellen nicht aktiv.
In diesem Fall gibt es keine ausreichende Onkogenproduktion, um die Zellen zu verändern.
Ähnlich verhält es sich mit anderen viralen Onkogenen,
wenn die Onkogenexpression auf hoher Ebene erfolgt, werden die Zellen getötet.
Nur wenn die Onkogenexpression auf niederer Ebene erfolgt, werden die Zellen verändert.
Daher können wir experimentell folgern, dass die Veränderung in der Regulation wichtig für den Veränderungsprozess war.
Wir beziehen uns hier auf eine quantitative Veränderung.
Hier unten sehen wir ein ähnliches Konstrukt.
Aus mehreren technischen Gründen wurde beim Proto-Onkogen etwas entfernt,
das, wie Dr. Ochoa Ihnen erzählte, sich nur in einer einzigen Aminosäure vom viralen Onkogen unterscheidet.
Wieder wird der Virus ertragreich hergestellt.
Aber er kann keine Hühnerzellen verändern, obwohl das virale Onkogen sie verändern kann.
Daher zeigt uns dieses Experiment, dass auch wenn es eine Fehlregulation des normalen Zellgens gibt,
ist es nicht fähig, die Zellen zu verändern.
Daher können wir die Frage im Titel beantworten, wie einige Viren Krebs verursachen können.
Die hoch onkogenen Retroviren verursachen Krebs, indem sie in die
Genome sensibler Zielzellen an neuen Orten ein quantitativ und qualitativ verändertes Zellgen einführen.
Das Zellgen ist das Proto-Onkogen.
Es ist qualitativ verändert, durch Basenpaar-Mutationen und die Fusion mit viralkodierten Sequenzen.
Es ist quantitativ verändert, da es unter viraler Regulation statt der zellulären Regulation steht.
Es ist an neuen Orten, weil der virale Integrationsapparat sehr spezifische für die Bindungssequenz des Virus ist,
aber für die Empfängersequenzen, den Zielsequenzen in der Zelle, überhaupt nicht spezifisch ist.
Bei der Integration gibt es keinen Homolog.
Das ist ein weiteres Thema, das wir später besprechen können.
Die Zelle muss eine geeignete Zelle sein.
Das war eine spezielle Art der Karzinogenese, die durch spezielle Viren erfolgte.
Solche Viren sind in Hauskatzen vorhanden, wo sie solide Tumore auf sehr schnelle Weise verursachen können.
Glücklicherweise gibt es diese Viren nicht beim Menschen.
Und die meisten Krebsarten beim Menschen, wie Dr. Ochoa im Cartoon zeigt, entsteht in mehrstufiger Form.
Hier betrachten wir eine Reihe normaler Zellen und beobachten diese Zellen über eine Zeit,
wo zuerst eine einzige Mutation erscheint und sich dann repliziert, woraus ein veränderter Zellklon entsteht.
Dann erscheint eine zweite Mutation, die wiederum einen veränderten Zellklon erzeugt - jetzt 2 veränderte Klone.
Dann erscheint eine 3. Mutation.
Und irgendwann zwischen 3 und 7, wir wissen nicht genau wann, treten Mutationen auf und die Zelle wird krebsartig.
Wir haben anscheinend 2 sehr verschiedene Arten von Prozessen, die zu Krebs führen.
Wie Dr. Ochoa Ihnen bereits erzählte, sind anscheinend dieselben Proto-Onkogene daran beteiligt.
Wie gleichen wir diese Unterschiede aus? Hier sehen wir Proto-Onkogene und hier aktive Onkogene.
Im Fall der Karzinogenese durch den hoch onkogenen Retrovirus, wurde das Proto-Onkogen durch die Evolution
in mehreren Schritten verändert, sodass ein vielfach verändertes Produkt entstand,
das mutiert, fusioniert und unterschiedlich reguliert wird.
Also der hoch onkogene Retrovirus ist fähig, Krebs so effizient zu verursachen,
indem er das bereits mehrfach veränderte Gen in die Zell-DNA einführt.
Im Fall von nicht-viralen Krebserkrankungen - könnten Sie auf den unteren Teil fokussieren bitte -
im Fall der nicht-viralen Krebserkrankungen
wurden wieder in einigen Fällen Proto-Onkogene gefunden, die verändert waren:
eine Basenpaar-Mutation, eine Amplifikation, eine Translokation.
Aber im Fall der nicht-viralen Krebserkrankungen gibt es einige Proto-Onkogene, die alle einmal verändert wurden.
Und der mehrstufige Prozess ist die Akkumulierung einer Änderung, einer zweiten Änderung, einer dritten Änderung.
Der mehrstufige Prozess fand über die Zeit statt.
Aber aufgrund der Natur der viralen Vektoren ist bei allen Veränderungen das einzelne Gen, das virale Onkogen, beteiligt.
Wir sehen also, dass derselbe Prozess bei der Karzinogenese durch hoch onkogene Retroviren
und anderen Arten von Substanzen eine Rolle spielt.
Es gibt mehrere genetische Veränderungen an normalen Zellgenen, die sie in aktive Krebszellen verwandeln.
Danke!
(Applaus.)