Mein Dank geht an die Stiftung für ihre Gastfreundschaft und an Sie alle für Ihre Anwesenheit hier.
Ich bin Maschinenbauer aus Instinkt und Neigung.
Ich begann mit dem Maschinenbau als Doktorand in Cornell, als meine Betreuer an einer Idee arbeiteten,
Licht durch ein Loch zu senden, das sehr viel kleiner
als die Lichtwellenlänge war, und dies als ein
kleine Nanolampe zu verwenden, um Punkt für Punkt durch die Probe zu fahren.
Die Beugungsgrenze sollte überwunden werden, von der Stefan sprach, um ein Höchstauflösungsbild zu erreichen.
Ich arbeitete an der Hochschule für Aufbaustudien sechs Jahre lang an dieser Technologie
und hatte das Glück, sie solange weiterzuentwickeln bis zum Tage,
an dem ich meinen Fuß in die Tür der Bell Labs bekam, dort schließlich mein eigenes Labor erhielt
und weitere sechs Jahre an dieser Technologie arbeitete.
In dieser Zeit entwickelten wir, während die Technologie langsam verbessert wurde, einige Anwendungen.
Wir konnten Polarisationskontraste verwenden, zum Betrachten magneto-optischer Materialien,
oder wir verwendeten Fluoreszenz, um Phasenübergänge und Langmuir-Blodgett Monoschichten sehen zu können,
und Höchstauflösungslithografie, Histologie
und kryogene Spektroskopie von Quantentöpfen vorzunehmen.
Die Technologie gewann zunehmend an Bedeutung, aber zweierlei Gründe brachten mich zum Nahfeld.
Ich wollte mich in der Wissenschaft nicht mit inkrementellen Dingen
sondern mit wirklich Großem und Wirkungsvollem befassen
und dafür schien Nahfeld eine Möglichkeit zu bieten.
Das andere, was ich daran mochte war, als wir damit begannen, war uns keiner bekannt, der daran arbeitete.
Ich mochte den Gedanken, ein noch unerforschtes Feld zu betreten, in dem es nicht jede Menge Ellbogen gab,
die mir in die Seite stießen, während ich versuchte meine Arbeit zu tun.
Es zeigte sich, dass ein paar andere Gruppen bereits daran arbeiteten.
Die Idee reicht bis in die zwanziger Jahre zurück,
damals war es dennoch ein ziemlich offenes Territorium und es fühlte sich faszinierend an.
Allerdings, im Laufe der Entwicklung und mit dem Beginn unsers Erfolgs drängten immer mehr in das Feld.
Besonders mit zwei Anwendungen, die wir im Jahr 1992 vorstellten,
erreichten wir den Weltrekord bei der Datenspeicherdichte durch das Schreiben von Bits
mit Nahfeld im 60-Nanometer-Bereich.
Damit eröffnete sich ein großer Bereich, auf den sich die Leute stürzten.
Ich stand unter dem Druck auf dieser Basis ein Programm zur späteren Vermarktung zu starten,
was ich aber nicht wirklich wollte.
Ich wollte keine große Gruppe leiten.
Ich wollte noch immer einfach erkunden, wohin das Nahfeld führen könnte.
Zum Glück hatten meine Vorgesetzten bei Bell Verständnis dafür und so konnte ich dies verfolgen.
Es zahlte sich aus: Wir waren nämlich sehr schnell zu dem in der Lage,
von dem ich geträumt hatte, nämlich im Bereich Biologie im Jahre 1993
das Aktinzytoskelett in einer etwa 50-Nanometer-Auflösung anzusehen.
Das Problem war, es handelte sich um eine fixierte Zelle; der Traum war aber ein optisches Mikroskop, mit dem man
sich lebenden Zellen mit der Auflösung
eines elektronischen Mikroskops ansehen kann, und da waren wir noch nicht.
Es gab eine Sache bei diesem Experiment: diese einzelnen Aktinfilamente hatten einen ausreichend großen Signal-Rausch-Abstand,
der nahelegte, wir könnten sogar einzelne Moleküle sehen.
Zu dieser Zeit war das noch ziemlich ungewiss,
einige Jahre zuvor hatte nämlich W. E. Moerner bei kryogenen Temperaturen die spektrale Signatur einzelner Moleküle gesehen.
Sie werden davon in wenigen Tagen hören.
Es zeigte sich, dass es in der Tat sehr leicht war, einzelne Moleküle mit Nahfeld zu sehen,
da der Brennpunkt so klein ist, dass man den Hintergrund nahezu auf Null reduziert
und danach ist es sehr leicht, die einzelnen Moleküle zu sehen.
Doch gab es Überraschungen, etwa dass die Formen unterschiedlich waren und so weiter.
Als Ursache dafür stellte sich die Ausrichtung der Moleküle heraus, wir konnten also die Ausrichtungen messen
und sogar ihre Positionen bis hinunter auf ein Vierzigstel der Lichtwellenlänge bestimmen.
Damals, das führt uns ins Jahr ’94,
stürzten sich viele Leute wegen der Spektroskopie-Anwendungen,
der Datenspeicheranwendungen, der potentiellen biologischen und einzelmolekularen Anwendungen auf diesen Bereich und ich war
es damals wirklich überdrüssig, mich mit Nahfeld zu befassen und das zum Teil auch wegen
den fundamentalen Grenzen der Technologie.
Das Schlimmste daran ist, dass das Licht, das aus
dem Sub-Wellenlängen-Loch tritt, sich extrem schnell ausbreitet.
Selbst wenn man nur zehn Moleküle entfernt ist, erhält man einen signifikanten Auflösungsverlust.
Wenn man davon träumt, lebende Zellen zu sehen, so ist eine Zelle sehr viel gröber.
Doch es gibt sehr viele andere Grenzen, zudem stürzten sich so viele Leute auf diesen Bereich
und meinten, sie könnten Krebs heilen oder der Mond sei aus grünem Käse, oder was auch immer.
Ich lernte in meiner wissenschaftlichen Laufbahn, dass es in der Wissenschaft
alle diese Modeerscheinungen gibt, mit ihrem Auf und Ab und so weiter.
Und Nahfeld wurde zu einer dieser Modeerscheinungen.
Technologien entwickeln sich in etwa so, und hier möchte ich ansetzen.
Hier macht es wirklich Freude und der Einsatz beginnt sich auszuzahlen und das ist die Zeit,
in der man abspringen möchte, weil die Leute bei diesen Dingen ausflippen.
Man möchte dann gerne glauben, es würde aufhören.
Aber für mich ist jede neue Technologie wie ein Neugeborenes, man glaubt, es wird Präsident werden,
oder den Krebs heilen, einen Nobelpreis gewinne, doch meist ist man nur froh, wenn es
schließlich nicht im Gefängnis landet.
So ist es im Grunde, wie die meisten Technologien enden, mit einem Niveau, das etwas über Null liegt,
es gab also einen Nettogewinn, aber eben doch nicht allzu viel.
Beim Nahfeld hatte ich das Gefühl, jedes gute Paper, das ich schrieb, war nur eine Rechtfertigung
für hunderte Paper sinnlosen Quatsches, die dann folgten.
Ich hatte wirklich das Gefühl, was ich tat war ein Negativbeitrag für die Gesellschaft, weil es Zeitverschwendung
und eine Vergeudung von Steuergeldern war.
Also stieg ich aus, und ich stieg nicht nur bei Bell aus, ich gab auch die Wissenschaft auf.
Und da ich keine Ahnung hatte, was ich wollte, wurde ich Hausmann.
Ein paar Monate später, ich fuhr gerade meine Tochter in ihrem Kinderwagen spazieren, erkannte ich,
es gab eine Möglichkeit sich bei einige Experimente, die ich kürzlich durchgeführt hatte, einen anderen Weg einfallen zu lassen,
um die Beugungsgrenze zu überwinden.
Der Gedanke war, ob wir uns um Fluoreszenz kümmern.
Stefan hat davon gesprochen, weshalb Fluoreszenz so wichtig ist.
Das Problem ist, jedes Molekül ist eine kleine unscharfe Kugel und diese unscharfen Kugeln überlagern sich und man erhält nur einen Brei.
Würden sich diese Moleküle irgendwie voneinander unterscheiden, zum Beispiel in unterschiedlichen Farben leuchten,
könnte ich sie auf ihre unterschiedlichen Farben hin in einem höher-dimensionalen Raum
von XY und der Wellenlänge in dieser Achse ansehen.
Sobald sie voneinander isoliert sind, kann ich den Zentroid, das Zentrum
dieser unscharfen Kugeln, sehr viel präziser finden, anstelle des Durchmessers der unscharfen Kugel, und erhalte so mit
beinahe molekularer Präzision die Koordinate jedes Moleküls in der Probe.
Das war also die Grundidee.
Ich war etwa einen Monat ganz begeistert davon, erkannte dann aber, der Haken ist,
selbst mit dem besten Brennpunkt, den man bei einem konventionellen
Mikroskop erhalten kann, kann es in diesem beugungsbegrenzten Punkt Hunderte oder Tausende von Molekülen geben.
Daher braucht es eine absurd gute Auflösung, sei es
bei der Wellenlänge, oder was auch immer es in dieser dritten Dimension ist,
um einschalten zu können und ein Molekül auf innerhalb von Hunderten oder Tausenden zu sehen.
Ich wusste nicht wirklich, wie das erzeugt werden kann.
Ich publizierte das einfach während meiner Arbeitslosigkeit und beließ es dabei.
Am Ende griff ich auf meinen Absicherungsplan zurück.
Mein Vater hatte im Jahre 1985 ein Unternehmen für Werkzeugmaschinen gegründet,
das bereits 1994 einen Umsatz von 50 Millionen erzielte.
Das Unternehmen stellte sehr kundenspezifische, sehr große Maschinen für sehr große Losgrößen eines einzelnen Teils her.
Die Maschinen werden für die Automobilindustrie genau für ein Teil kundenspezifisch hergestellt.
Es handelte sich um eine erfolgreiche Technologie.
Ich hatte aber ein so großes Ego und hab es immer noch, und sehr viel Naivität,
die ich auch immer noch habe, dass ich der Meinung war, wenn ein einzelner Physiker
in die alte Industrieregion der USA ginge, könnte er sie vor den Japanern retten.
Also ging ich dorthin, um zu sehen, ob ich etwas zur Optimierung dieser Technologie tun könnte.
Ich entwickelte diese Maschine, die eine alte Technologie nutzte,
Hydraulik genannt, verband diese mit Prinzipien der Energiespeicherung, wie sie bei Hybridautos verwendet werden,
sowie mit nichtlinearen Regelalgorithmen und war damit in der Lage eine Maschine herzustellen,
die erst in etwa die Breite dieses Hörsaals hatte, und die ich dann in etwa auf die Größe eines Kleinwagens reduzierte.
Dazu würde sie vier Tonnen bei 8 G Beschleunigung bewegen und auf 5 Mikrometer genau positionieren.
Es war ein erstaunliches Ding, auf das ich sehr stolz war.
Ich verbrachte vier Jahre damit, sie zu entwickeln, drei Jahre damit, sie zu verkaufen, und in dieser Zeit habe ich zwei davon verkauft.
Ich lernte also, dass ich vielleicht kein Wissenschaftler bin aber sicher ein miserabler Geschäftsmann.
Nachdem ich also mehr als eine Million Dollar meines Vaters in den Sand gesetzt hatte, ging ich zu ihm und entschuldigte mich.
Ich sagte: “Es tut mir leid, ich habe alles was mir möglich ist gegeben, ich kann das Teil aber einfach nicht verkaufen.“
Und so kündigte ich wieder.
Das war die dunkelste Zeit meines Lebens, ich hatte nicht nur
meine akademische Laufbahn hingeschmissen sondern auch die Idee in den Sand gesetzt, im Familienbetrieb zu arbeiten.
Ich musste also etwas finden und nahm daher wieder Kontakt mit einem Freund, Harald Hess, bei Bell auf.
Auch er hatte Bell verlassen, als diese in den 90er Jahren schrumpften, und war in die Industrie gegangen.
Er litt an der gleichen Art Midlife-Krise, an der auch ich litt.
Im Geschäftsleben war er erfolgreicher als ich, aber eben doch unzufrieden.
Wir wünschten uns wieder neugierige Forschung zu betreiben und mit den eigenen Händen zu arbeiten.
Wir wollten keine Manager sein, was einem gewöhnlich passiert, wenn man in den 40ern ist.
Wir wollten im Grunde wie Doktoranden leben.
Wir begannen uns in verschiedenen Nationalparks zu treffen und schmiedeten Pläne,
wie wir wieder zurück ins Labor gelangen könnten.
Und ich begann nach einem Jahrzehnt wieder damit, wissenschaftliche Arbeiten zu lesen.
Das Erste, was mir da begegnete haute mich um.
Es war das grüne fluoreszierende Protein.
Der Gedanke, man könne etwas DNA aus einer leuchtenden Qualle schneiden und damit
jedes Protein in einem gewünschten lebende Organismus spezifisch fluoreszieren lassen, mit 100% Bestimmtheit,
das faszinierte mich, da es in dem Aktin-Experiment,
das ich gezeigt hatte, so schwierig gewesen war, eine ausreichende gute Markierung zur Betrachtung des Aktins zu erhalten,
ohne dass daneben eine Menge unspezifischen Mists auftauchte.
Und da meinte ich: “Verdammt, ich glaube, ich werde wieder ein Mikroskopierer.“
Ich hatte aber ein Problem, da ich zehn Jahren lang aus der Physik heraus war,
war mir mein ganzes physikalisches Wissen abhanden gekommen.
Ich konnte mich an nichts erinnern.
Nun, ich brachte die Kinder zur Schule.
Danach ging ich zu dem Häuschen, das wir in der Nähe hatten, setzte mich am See hin und begann Physik neu zu lernen,
ab den Lehrbüchern der Erstsemester und dann weiter.
Innerhalb von drei Monaten fügte sich alles wieder zusammen.
Ich hatte es nicht wirklich vergessen.
Ich war nur irgendwie blockiert.
Und ich versuchte herauszufinden, wie ich das Licht dazu verwenden könnte, um ein besseres Mikroskop zu erhalten.
Damals ging es nicht um ein super-auflösendes Mikroskop,
sondern um ein besseres Mikroskop, welches die Vorteile des Live Cell Imaging von GFP nutzen würde.
Ich begann in grundlegenden Begriffen zu denken, von anfänglich zwei Wellenvektoren, die eine stehende Welle erzeugen.
Ich fügte weitere Wellenvektoren hinzu und erhielt diese merkwürdig periodischen Muster, sah in der Literatur nach
und hörte von etwas, das optische Gitter genannt wurde, die in der Quantenoptik dazu verwendet werden, Atome einzufangen und zu kühlen.
Schließlich dachte ich mir die neuen Arten optischer Gitter aus, die sich wirklich gut als
ein 3D multifokales Erregerfeld eignen würden,
um bei lebenden Zellen eine sehr leistungsfähige Bildgebung in hoher Geschwindigkeit zu erhalten.
Ich nannte dies optische Gitter-Mikroskopie und wollte es mit dieser Idee schaffen, wieder zur Wissenschaft zurückzukehren.
Harald half mir bei der Aufgabe mich wieder hineinzuarbeiten und ein Ort, den wir aufsuchten, um diese Idee vorzustellen war
die Florida State University, wo wir auf Mike Davidson trafen.
Mike erzählte uns nicht nur von fluoreszierendem Protein,
sondern von einer ganz neuen Art fluoreszierenden Proteins,
bei dem, wenn man es zuerst mit blauem Licht anstrahlt, nichts geschieht.
Wenn man es aber zuerst mit violettem Licht anstrahlt,
die Moleküle aktiviert werden und blaues Licht daraufhin verursacht, dass es grün wird oder grünes Licht ausstrahlt.
Im Grunde ist es ein fluoreszierendes Molekül, das man ein- und ausschalten kann.
Da saßen Harald und ich also im Flughafen von Tallahassee,
und uns wurde klar, dass dies das fehlende Glied war, um jene Idee, die ich während meiner ersten Arbeitslosigkeit
zehn Jahren zuvor umrissen hatte, zu realisieren.
Der Gedanke war, das violette Licht so niedrig zu fahren, dass sich jeweils nur wenige Moleküle einschalten.
Rein statistisch werden sie wahrscheinlich durch mehr als die Beugungsgrenze getrennt,
sodass man die Zentren der unscharfen Kugeln finden kann.
Diese Moleküle schalten sich entweder aus oder verblassen.
Man fährt das Violett wieder hoch, um eine andere Teilmenge anzuschalten und so geht es in einem fort weiter,
bis man aus der Probe alle Moleküle extrahiert hat (Bleed-Out).
Das war die Idee, die ich 1995 hatte, ausgenommen der Zeit als kritischer Dimension
und dem violetten Licht als Knopf, mittels dessen wir immer höhere Auflösungen entlang dieser Zeitachse erhielten.
Wir hatten ein weiteres Problem, da ich Harald auf der Grundlage des Gittermikroskops überzeugt hatte,
obgleich er nicht davon überzeugt war, es mit mir zu versuchen,
und er hatte seine Arbeit gekündigt und da gab es jetzt zwei arbeitslose Typen.
Wie also setzen wir diese Idee um, denn wir waren der Meinung, dass es so lächerlich einfach ist
und bereits eine Menge Leute darüber nachgedacht haben, und darin hatten wir recht.
Es gab eine Menge Leute, die uns unmittelbar auf den Fersen waren.
Die gute Nachricht ist: Harald ist sehr viel klüger als ich.
Als ich Bell verließ, sagte ich ihnen, sie sollten sich zum Teufel scheren.
Als Harald Bell verließ, konnte er seine gesamte Ausrüstung mitnehmen.
Wir holten sie also aus dem Lagerschuppen und normalerweise
macht man solche Arbeiten in der Garage, aber wir konnten es in seinem Wohnzimmer tun,
denn er war nicht verheiratet und dort war es sehr viel gemütlicher.
In wenigen Monaten hatten wir das Mikroskop gebaut und dann hatte ich einen Termin bei NIH,
bei dem ich über mein Gittermikroskop berichtete und ich bat Jennifer Lippincott-Schwartz und George Patterson,
die das photoaktivierte Protein erfunden hatten, auf ein Gespräch ein.
Wir aßen zusammen zu Mittag, verpflichtete sie zum Stillschweigen
und ich erzählte ihnen von meiner Idee, und dass dies das letzte fehlende Glied sei,
Harald und ich hatten nämlich keine Ahnung von Biologie.
Jennifer ist jedoch eine der besten Zellbiologen der Welt und meinte, ich solle es eben mal mitbringen.
Wir packten unser Mikroskop ein und gingen in Jennifers Dunkelkammer
und danach, innerhalb von zwei Monaten, kamen wir von dieser Art von…
Hier sieht man auf eine Scheibe durch eine Zelle auf zwei Lysosome, kleine Beutel mit Proteinabbau,
dann ist da die Beugungsgrenze und das ist
das photoaktivierte Lokalisierungsmikroskop oder PALM Image und die Auflösung verlief von hier nach hier.
Also zwei Dinge, einmal, Harald und ich wollten vom Konzept dieser Idee ausgehend,
die Daten innerhalb von sechs Monaten in unserer wissenschaftlichen Schrift vorlegen, und wir konnten es,
weil uns alle ließen.
Wir konnten einfach für uns arbeiten.
Das Zweite ist, diese Art Arbeit erfordert diese Abgeschiedenheit, die man in einer solchen Situation nun mal hat.
Die Fähigkeit sich 100% zu konzentrieren, und das immer wieder,
habe ich in meiner Laufbahn als essentiell erfahren; nicht im akademischen Betrieb zu sein, das war für mich der Schlüssel.
Denn ob es bei Bell war, bei der Arbeit für meinen Vater, oder da, wo ich jetzt arbeite,
es ist der Gedanke alleine zu sein und sich mit
100% Aufmerksamkeit auf ein Problem konzentrieren zu können, was es mir erlaubt, etwas zustande zu bringen.
Das sind also alle guten Nachrichten über die Superauflösung,
doch jedes neue Stadium meiner Laufbahn wurde durch die
Einschränkungen der Dinge beeinflusst, an denen ich zuvor gearbeitet hatte.
Superauflösung war ein Haufen voller Einschränkungen.
Zuerst schauen wir uns wieder Fluoreszenz an, und wenn man seine fluoreszierenden Moleküle nicht dicht genug umkleidet,
kann man eine Eigenschaft völlig übersehen, wenn man nicht weniger als eine Halbwertzeit in den Abständen ist.
Das also nennt man das Nyquist-Kriterium.
Sie sehen, will man von diesem Bild eine Stichprobe nehmen, ist die intrinsische Auflösung
des Mikroskops unwesentlich; Sie haben nicht genug Informationen.
Die schlechte Nachricht ist, wenn man dies auf die Superauflösung bezieht,
sofern man nicht den Auftrag hat, von 500 Molekülen eine 20-Nanometer-Auflösung zu erhalten, ist man erledigt.
Es zeigte sich, dies ist ein sehr hoher Standard für Dichte ist,
verglichen mit dem was die meisten Biologen zuvor an beugungsbegrenzter Arbeit getan haben.
Dies bedeutet, die Realisierung dieser Technologien liegt nicht beim Werkzeugentwickler, leider,
sondern beim Biologen, der Vorbereitungsverfahren für Proben finden muss, die dafür funktionieren.
Sie können jetzt natürlich fragen, was das Besondere an der Superauflösung ist.
Wir verwendeten lange Zeit EM, und das war verdammt gut.
Es gibt zwei Hauptgründe, auf die Stefan bereits hingewiesen hat.
Der erste ist der proteinspezifische Kontrast, der gewöhnlich mit struktureller Bildgebung an fixierten Zellen eingestellt wird.
Das Problem jedoch ist, 95% von dem, was wir glauben durch Superauflösung gelernt zu haben, geschah mit chemisch fixierten Zellen,
deren Zweck ist das Vernetzen von Proteinen, wodurch die Ultrastruktur vermasselt wird.
Das bedeutet, wir müssen fast alles, was wir beim Ansehen von fixierten Zellen erfahren, mit einem Sternchen versehen.
Aufregender wäre es, Live Cell Imaging vorzunehmen.
Das Problem ist, wie Sie sich denken können,
selbst wenn ich nur einen Faktor von zwei Auflösungsverbesserungen möchte
in jeder der drei Dimensionen, bedeutet dies meine Voxel sind acht Mal kleiner.
Also habe ich in jedem Voxel ein Achtel so viele Moleküle.
Wenn ich die gleiche Anzahl Photonen möchte, um das gleiche Signal und Geräusch wie in einem beugungsbegrenzten Experiment zu erhalten,
muss ich auf meine Zelle entweder acht Mal so viel Licht geben,
was dieser nicht gefallen wird, oder aber ich muss acht Mal länger darauf warten, dass diese Photonen zum Vorschein kommen
und das ganze Bild wird durch Bewegungsartefakte verwischt.
Man braucht laut Literatur zur Auflösung von Live Cell Imaging
- mit einfachen Kalkulationen berechnet -
1.000 bis über 10.000 mal soviele Photonen wie beim beugungsbegrenzten Experiment.
Das wiederum ist beinahe ein Hirngespinst.
Manchmal empfinde ich, als würde ich bei der Superauflösung den gleichen Albtraum,
den ich beim Nahfeld-Bereich hatte, wieder aufs Neue erleben.
2008 gab es jede Menge verrückter Anforderungen in Hinblick darauf, was man mit Superauflösung tun könnte.
Ich weiß aus meiner Erfahrung, dies war nicht möglich.
Weitere Probleme sind die Intensität,
die für STED oder für PALM irgendwo zwischen Kilowatt bis Gigawatt pro Quadratzentimeter beträgt.
Doch Leben entwickelt sich bei einem Zehntel eines Watts pro Quadratzentimeter.
Wir müssen uns also fragen, wenn wir Live Cell Imaging vornehmen,
schauen wir uns dann eine lebende Zelle an oder eine tote oder eine sterbende, aufgrund der Anwendung all dieses Lichts.
Und diese Methoden erfordern viel Zeit, um ein Bild zu erzeugen und die Zelle ist in Bewegung
und am Ende erhält man Bewegungsartefakte.
Die Moral von der Geschichte ist, mich kümmert es nicht, welche Methode Sie anwenden.
Will man eine höhere räumliche Auflösung, braucht man mehr Pixel.
Mehr Pixel bedeutet mehr Messungen.
Das dauert länger.
Es bedeutet, die Probe mehr potentiell schädigendem Licht auszusetzen und wenn Sie ehrlich sind,
man hat es immer mit Abwägungen zwischen räumlicher Auflösung,
zeitlicher Auflösung und Abbildungstiefe zu tun.
Jemand, der diese Abwägungen besser und früher als wir alle
wirklich verstanden hatte war der gebürtige Schwede Mats Gustafsson, der eine dritte Methode
der Fernfeld-Superauflösung entwickelte, genannt "strukturierte Beleuchtung".
Bei dieser Technik verwendet man eine Anregung per stehender Welle
statt einer einheitlichen Beleuchtung der Probe, wodurch diese Moiré-Effekte aus den Informationen
in der Probe entstehen, die wiederum niedrigere Frequenzen bewirken und so vom Mikroskop erkennbar werden.
Ein Argument im Bericht des Nobelpreis-Komitees,
weshalb dies keinen Nobelpreis erhielt war, dies sei auf einen Faktor zwei beim
Auflösungsgewinn begrenzt, wohingegen die Lokalisation von STED beugungsunbegrenzt sei.
Doch ich meine, diese Schwäche von SIM ist eigentlich eine Stärke.
Denn erstens, man benötigt sehr viel niedrigere Kennzeichnungsdichten,
was mit der derzeitigen Technologie sehr viel kompatibler ist.
Und zweitens erfordert es um Größenordnungen weniger Licht und ist um Größenordnungen schneller als andere Methoden.
Hier sind ein paar Beispiele.
Sie sehen hier das endoplasmatische Retikulum einer lebenden Zelle und ja, die Auflösung beträgt nur 100 Nanometer,
Sie sehen aber die Detailfülle an Informationen,
die man erhält, weil man in der Lage ist, diese Zelle 1800 Umläufe lang bei der Bildverarbeitung in Subsekunden-Intervallen anzusehen.
Man erhält diesen dynamischen Aspekt, den man mit den anderen Methoden nicht bekommt.
Hier ist ein weiteres Beispiel, das Verhalten von Aktin in einer T-Zelle, nachdem sie die immunologische Synapse ausgelöst hat.
Die gute Nachricht ist, wir konnten 2008 Mats von der UCSF
für Janelia anwerben, aber es wurde diagnostiziert…
2009 wurde bei ihm ein Gehirntumor diagnostiziert und er starb 2011.
Ich übernahm viel aus seiner Gruppe und seiner Technologie und wir versuchen auch,
mit diesem Instrument sein Vermächtnis weiterzuführen.
Der Schlüssel dazu ist: Wenn der Einwand, weshalb man SIM nicht im gleichen Atemzug mit STED und PALM nennt, der ist,
dass es nicht die gleiche Auflösung hat, wie können wir dann diese 100 Nanometer-Barriere überwinden?
Der einfache und dumme Weg ist, einfach die numerische Apertur des Objektivs zu erhöhen.
Vor kurzem kam ein 1,7 NA Objektiv auf den Markt, mit dem man mittels des GFP-Kanals
bis zur 80 Nanometer-Auflösung klettern kann.
Dann kann man dutzende oder hunderte Zeitpunkte mehrfarbig studieren,
da keine speziellen Markierungen notwendig sind.
Bewegung heißt hier, sich die clathrin-vermittelte Endozytose und seine Interaktion
mit dem Cortactin anzusehen, und wie dies dazu beiträgt, diese Vertiefungen hineinzuziehen, um Material in die Zelle zu bekommen
Kürzlich haben wir eine weitere Technik entwickelt.
Eine nichtlineare strukturierte Beleuchtungstechnik, die wieder dieses Photo-Schaltprinzip verwendet, um eine
stehende Welle aufzustellen, um das Aktivierungslicht auf eine räumlich gestaltete Art zu generieren und auf die
gleiche Art die Erkennung vorzunehmen.
Hier hebt man die Auflösung von der doppelten Beugungsgrenze zur dreifachen Beugungsgrenze.
Das brachte uns zu einer 60-Nanometer-Auflösung.
Nicht so viel Zeitpunkte und nicht ganz so schnell, aber man kann damit lebende Zellen sehen.
Nochmal, wenn es das war, dass es nicht die Auflösung anderer Methoden hatte:
Wir haben dieses nichtlineare SIM mit RESOLFT und Lokalisationsmikroskopie verglichen.
Im Grunde haben wir jetzt mit SIM eine ebenso gute Auflösung, wenn nicht sogar eine bessere, als wir dies
mit den anderen Instrumenten haben, doch mit hunderte Male weniger Licht und hunderte Male schneller als mit diesen anderen Methoden.
Ich glaube wirklich, für die Lebendzellenbeobachtung zwischen 60 und 200 Nanometer wird SIM das Go-to-Instrument
und für die strukturelle Bildgebung unter 60 Nanometer wird es PALM sein.
Die Moral von der Geschichte ist, während jedermann sich um dieses Ziel drängte,
um die höchste räumliche Auflösung zu erhalten,
wünschte sich Mats einen eigenen Raum zum Arbeiten, da wo andere es nicht tun.
Und indem er sich etwas zurücknahm, hatte er diese ganze Spielwiese, auf der er sein Instrument entwickeln konnte.
Es stellt sich also die Frage, was ist, wenn wir den ganzen Weg zur Beugungsgrenze zurückgehen.
Gibt es da etwas, was wir als Physiker tun können, um für Biologen bessere Mikroskope zu entwickeln und insbesondere,
gibt es eine Möglichkeit die Geschwindigkeit zu erhöhen
und Nichtinvasivität bei der Bildgebung und dem Live Cell Imaging zu haben, um es in der gleichen Größenordnung zu optimieren,
wie PALM dies hinsichtlich räumlicher Auflösung leistet?
Und warum würde man dies tun wollen?
Nun, das Kennzeichen von Leben ist: es ist lebendig.
Und alles Lebendige ist eine komplexe thermodynamische Melange verringerter Entropie, durch welche
fortlaufend Materie und Energie strömen.
Auch wenn strukturelle Bildgebung wie Superauflösung oder Elektronenmikroskopie immer wichtig bleiben werden,
die einzige Möglichkeit, wie wir verstehen können,
wie sich leblose Moleküle miteinander verbinden, um eine lebendige Zelle zu schaffen ist, dies quer über alle vier Dimensionen
von Raum-Zeit gleichzeitig zu studieren.
Als mir 2008 Superauflösung ebenso zuwider wurde wie das Nahfeld 1994, habe ich mir dies zum Ziel gesetzt.
Die gute Nachricht ist, es gab auf dem Markt ein neues Instrument, das wir nutzen konnten, das Lichtscheibenmikroskop.
Es schießt eine Beleuchtungsebene durch eine 3D Probe, damit nur eine Ebene auf einmal beleuchtet wird.
Es werden also keine Bereiche darüber und darunter beschädigt und man kann ein sehr schnelles Bild aufnehmen,
denn die gesamte Ebene ist beleuchtet, dann führt man das Ebene für Ebene durch die Probe fort.
Dies war für das Verständnis der Embryogenese
bei einer einzelnen Zellenauflösung sehr wichtig, hatte aber eine Einschränkung dadurch,
dass die Lichtscheiben auf dem Einzel-Zell-Level ziemlich dick sind.
Wir konnten dann einige Physik-Tricks einsetzen, nämlich sogenannt nicht-brechende Strahlen.
Zuerst waren es Bessel-Strahlen und schließlich konnte ich meine zehn Jahre alte Gittertheorie aus der Versenkung holen,
denn die zweidimensionalen optischen Gitter sind nicht-brechende Strahlen, die eine Lichtscheibe erzeugen,
die viel dünner ist, und man kann sich dann die Bewegungen innerhalb einzelner Zellen ansehen.
Hier sind einige Beispiele dafür.
In unser Labor kamen etwa 50 verschiedene Gruppen,
um dieses Mikroskop zu nutzen und fast jeder verließ das Labor mit einem breiten Lächeln und zehn Terabytes an Daten.
Danach hören wir nichts mehr von ihnen, denn sie wissen nicht, was man mit zehn Terabytes an Daten anfangen soll.
Ich bin aber auf jeden Fall sehr stolz darauf, was wir mit PALM zuwege gebracht haben, an diesem Punkt bin ich aber überzeugt,
dass dies die Spitzentechnik meiner Laufbahn sein wird.
Eine weitere Sache, die Klarheit brachte, tauchte auf, die Gitter-Lichtscheibe, wie wir sie nannten,
erwies sich als für Einzelmolekül-Techniken geeignet, da sich diese allgemein auf sehr dünne Proben beschränken,
da unscharfe Moleküle die Signatur der scharf eingestellten Moleküle verdunkeln.
Die Gitter-Lichtscheibe ist aber so dünn, dass nur die scharf eingestellten Moleküle beleuchtet werden.
Dadurch konnten wir eine andere Methode der Lokalisationsmikroskopie anwenden,
die die Gruppe Robin Hochstrassers im gleichen Jahr entwickelt hatte
in dem wir PALM entwickelten, statt der Vormarkierung der Zelle und einer festgelegten Anzahl von Molekülen...
Erinnern Sie sich, ich sagte, das Grundproblem ist, ausreichend Moleküle zu erhalten, um die gewünschte Auflösung zu bekommen.
Bei PAINT wird statt der Vormarkierung das ganze Medium um die Zelle mit Fluoreszenz-Farbstoffen markiert.
Gewöhnlich schwirren die Farbstoffe zu schnell herum, als dass man sie sehen könnte, wenn sie aber haften, leuchten sie wie ein Fleck
und man kann sie dann lokalisieren.
Der Vorteil hiervon ist, es gibt eine unendliche Armee an Molekülen,
die ständig hinzukommen und Ihre Zelle umkleiden.
Der Nachteil ist, da das Medium leuchtet, ist SNR normalerweise zu schwach, um viel an Einzel-Molekül-Imaging vorzunehmen.
Die Gitter-Lichtscheibe zusammen mit dieser PAINT-Technologie ist eine höchst wundervolle Kombination.
Sie sehen hier den Einsatz dieser Methode die 3D-Bilderfassung bei großen Volumina, und prinzipiell können wir das sehen.
Nehmen Sie Lokalisierungsmikroskopie für viel dickere Proben in der Größenordnung hoher Dichte
und wir haben etwas, damit wir kein EM für den allgemeinen Kontrast benötigen,
um es mit einem lokalen Kontrast zu kombinieren, den wir von PALM erhalten.
Noch eine letzte Sache, Astrid, und dann mache ich Schluss.
Ich habe noch zwei Minuten und 22 Sekunden zum Reden.
Sie sind früh dran.
Es geht darum, wir müssen immer noch die Zellen vom Deckglas nehmen.
Vieles was wir gelernt haben, haben wir durch immortalisierte Zellen gelernt und alle diese Methoden,
versucht man sie von der Einzelzelle auf den Organismus anzuwenden, sind unglaublich empfindlich
hinsichtlich der Variationen des Brechungsindexes, die das Licht beim Hinein- und Hinausgehen der fluoreszierenden Photonen verwischen.
Bei STED haben Sie diesen perfekten Knoten im Doughnut.
Der ist bei Abweichungen sehr empfindlich.
Bei SIM wird die stehende Welle beschädigt.
Bei konfokal wird der Brennpunkt beschädigt.
Bei Lokalisierung, ihrer PFS, benötigt man die Kenntnis über die Form jenes Flecks, damit man seinen Zentroid genau findet.
Alles das wird durch Abweichungen vermasselt.
Lichtscheibe wird nicht gezeigt, aber wenn man es mit einem Embryo zu tun hat...
Die Lichtscheibe ist in der gleichen miserablen Phase, in der sich andere Techniken befinden, bei denen die Leute sagen:
„Wir können die Gesamtentwicklung eines vollständigen Organismus sehen oder neuronale Aktivitäten eines gesamten Gehirns,
wenn wir die Lichtscheibe verwenden“, doch dem ist nicht so, da durch die Abweichungen die Auflösung so schlecht wird.
Man kann einzelne Zellsoma in bestimmten Bereichen des Gehirns nicht auflösen.
An was wir gearbeitet haben war, Anleihen bei Astronomen zu machen und die Instrumente der adaptiven Optik zu verwenden,
damit wir tiefer in die leben Organismen hineinsehen können.
Dies ist das Beispiel für den Blick in das Gehirn eines sich entwickelnden Zebrafisches.
In diesem Falle mussten wir eine sehr schnelle AO-Technik entwickeln, da beim Wechsel von einem Ort zum andern die Abweichung sich ändert.
Das hier repräsentiert 20.000 verschiedene adaptive optische Berichtigungen,
damit dieses große Volumen abgedeckt wird.
Wenn wir tiefer in das Mittelgehirn des Zebrafisches gehen,
etwa 200 Mikrometer tief, schalten wir die adaptive Optik aus.
Das würden Sie mit einem modernen Mikroskop sehen und dann schalten Sie die AO ein
und man ist wieder da, wo man die Beugungsgrenze erhält und das Signal erhält.
Was meine Gruppe betrifft und an was ich derzeit wirklich glaube ist, wir stehen am Scheitelpunkt zu einer Revolution in der Zellbiologie,
denn wir haben Zellen noch immer nicht so untersucht, wie sie in Wirklichkeit sind.
Wir müssen die Zelle unter ihren eigenen Bedingungen studieren und bei diesem Rätsel gibt es drei Teile.
GFP ist großartig, seine Rohdaten sind aber weitgehend ungeordnet.
In den letzten zwei Jahren traten diese Bearbeitungstechniken des Erbguts hervor,
mit denen man mit diesen Proteinen auf endogenen Leveln experimentieren kann.
Es zeigte sich, dass es typischerweise niedrige Stufen waren, konfokale Mikroskopie und diese anderen Techniken
sind viel zu pertubative, um Dynamiken zu untersuchen und man braucht dazu so etwas wie Gitter-Lichtscheiben.
Nochmals, man kann Zellen nicht isoliert betrachten und dabei den Gesamtzusammenhang sehen.
Man muss alle Zell-Zell-Interaktionen sehen, alle Nachrichtenübermittlungen, die im Innern stattfinden,
da, wo sie sich entwickeln, und hier spielt die adaptive Optik eine Rolle.
Die Zukunft meiner Gruppe wird sein, adaptive Optik zu entwickeln, damit dies funktioniert,
dies mit der Gitter-Lichtscheibe zu kombinieren, damit wir ein nichtinvasives Instrument haben, um Dynamiken anzusehen.
Und dann schieben wir die Superauflösungsmethoden wie SIM und PALM mit hinein, um darüber hinaus die höhere Auflösung hinzuzufügen.
Damit danke ich Ihnen für ‘s Zuhören.