Guten Morgen.
Heute möchte ich gerne über unsere Arbeit zur Immunität sprechen, und wie sich die Maus
ziemlich weitreichend als Modellorganismus für Forward Genetics vervollkommnet hat.
Meine Arbeit begann mit einer eher alten Prämisse. Bereits vor mehr als 100 Jahren,
als man Mikroben erst als Erreger von Infektionskrankheiten erkannt hatte,
fragte man sich bereits, wie sie den Wirt schädigten.
Richard Pfeiffer, hier im Hintergrund hinter Robert Koch zu sehen,
machte dazu eine interessante Beobachtung.
1891 prägte er den Begriff "Endotoxin",
um damit etwas intrinsisch Toxisches im Zusammenhang mit Gram-negativen Bakterien zu beschreiben.
Er bemerkte, selbst durch Hitze abgetötete Organismen konnten,
wenn sie Meerschweinchen injiziert wurden, in Form eines echten Infekts, Schock oder Tod verursachen,
obgleich er keine lebensfähigen Organismen aus der
Bauchhöhle gewinnen konnte, nachdem er die Mikroben verabreicht hatte.
Richard Pfeiffer wurde wegen dieser Beobachtung sehr berühmt,
und obgleich er heute als ziemlich zweifelhafter Charakter angesehen wird, wurde er zu seinen Lebzeiten 33 Mal
für den Nobelpreis in Physiologie oder Medizin nominiert.
Grund dafür war, damals wie heute, sterben hunderte, vielleicht tausende Menschen
täglich an Endotoxin-induziertem Schock und so etwa könnte ein typischer Patient mit
Gram-negativer Septikämie aussehen.
Das ist ein Kind mit einer Meningokokken-Blutvergiftung.
Dies ist eine schwere systemische Form einer Entzündung und man muss verstehen, dass damals der Ursprung
alle Entzündungen im Dunkeln lag.
Pfeiffer hatte hier vielleicht eine einzelne molekulare Gattung identifiziert, durch die eine Entzündung hervorgerufen wurde.
Im Laufe der Jahre, die auf seinen ersten Bericht folgten, entdeckte man, dass Endotoxin,
nun Lipopolysaccharide oder LPS genannt, in Zusammenhang mit allen Gram-negativen Bakterien stand.
Es war eine strukturelle Komponente der äußeren Schicht der äußeren Membran.
Sie hat einen Lipid- und Polysaccharid-Teil und der Lipid A Teil war der toxische Teil des Moleküls.
Lipid A Moleküle wurden schließlich vollständig künstlich hergestellt
und vermögen das meiste von dem was Pfeiffer lange vorher erkannt hatte.
Wir können eine typische LPS-Struktur so zeichnen und aus unserer Arbeit und der Arbeit anderer
ergab sich kürzlich, dass LPS Makrophagen aktiviert, um Zytokine zu erzeugen.
Diese Zytokine, und unter diesen vor allem der Tumor-Nekrose-Faktor, binden die Rezeptoren an viele andere Zellen
und lösen die Freisetzung terminaler Mediatoren von Vasodilatation aus und führen zum Schock
und der Aggregation von Blutplättchen und all solchen Dingen, die zum klinischen Krankheitsbild gehören.
Eine der Hauptfragen war: „Welches ist der Rezeptor für Lipopolysaccharide?“
Dies war ein schwieriges Problem, das direkten Versuchen, es biochemisch zu knacken, widerstand.
Ab 1990 war durch die Arbeiten von Ulevitch und Wright bekannt, dass Antikörper
gegen das Oberflächenantigen CD14, welches an Makrophagen vorhanden ist, die LPS-Reaktion stark hemmen würden.
Doch CD14 ist ein GPI-verankertes Protein.
Es verfügte über keinen cytoplasmischen Bereich und man vermutete, es könnte nur funktionieren, indem man es mit einer Art
mysteriösem Co-Rezeptor, der über einen cytoplasmischen Bereich verfügte und das Signal über die Membran leitete, verbinden würde.
Die Art dieser Rezeptoren war nicht bekannt, aber was TNF betraf,
war zu der Zeit bekannt, dass NF kappaB
ein wesentlicher Transkriptionsfaktor war, der zur Aktivierung des TNF-Gen führen würde.
Sobald das TNF mRNA hergestellt und verarbeitet wurde, wurde es in einer geschlossenen Form abgesondert,
heute würden wir wahrscheinlich sagen in P-bodies, und diese mussten aufgeschlossen werden,
um die Translation von mRNA und die Herstellung und Verarbeitung des Proteins zu ermöglichen.
Die größte Frage stand nach wie vor im Raum: Was war der wirkliche Membran-überspannende aktivierende Rezeptor für LPS?
Ich hatte das Gefühl, wenn dies gelöst ist, würde es den Schlüssel zum Verständnis liefern, wie der Wirt Kenntnis von den Infektionen
innerhalb der ersten Minuten nach Beimpfung mit Bakterien erhält.
Kurz gesagt, wie funktioniert die angeborene Immun-Erfassung.
Das Finden des LPS Rezeptors ging letztlich von zwei unzusammenhängenden
Unterstämmen von Mäusen aus, die auf LPS aufgrund spontaner Mutationen nicht ansprachen.
Der erste Stamm wurde 1965 von Heppner und Weiss identifiziert, es war der C3H/HeJ Maus-Stamm.
Er erwies sich widerstandsfähig gegen jede Menge von LPS, die Tiere waren aber hoch empfindlich gegen Salmonella Typhimurium,
wie sich später zeigte, und auch gegen LPS und andere Gram-negativen Mikroben.
1978 wurde ein Maus-Stamm, der mit diesem in keinerlei Zusammenhang stand, entdeckt, der resistent gegen LPS war.
Das war die C57 schwarz/10ScCr Maus, und durch Kreuzen der beiden Stämme,
die beide rezessive Probleme hatten, fand man heraus, auch die F1 hybriden Nachkommen waren gegen LPS widerstandsfähig.
Es wurde vermutet, dies beiden Tiere hätten defekte Allele
und in beiden Fällen gab es eng verwandte Kontroll-Stämme mit normaler LPS-Reaktion.
Damit waren die Voraussetzungen für Positionsklonierung geschaffen, was damals LPS Locus genannt wurde.
Positionsklonierung im klassischen Sinne wird heute nicht mehr angewendet und nicht alle hier wissen genau,
was das ist; im Wesentlichen ist es aber Klonierung nach Phänotyp.
Es ist möglich, nur den Phänotyp zu nehmen und die Lokalisation eines Gens zu finden, indem man zuerst
einen kritischen Bereich etabliert - das ist die Phase der genetischen Entschlüsselung -
dann klont man die gesamte DNA quer durch den kritischen Bereich im Bestreben eine physikalische Abbildung zu erlangen,
und schließlich hat man alle Gen-Kandidaten im kritischen Bereich identifiziert
und hält dann nach einer Mutation Ausschau, nämlich der ursächlichen Mutation.
Normalerweise gibt es unter diesen Umständen nur eine.
Diese Klonierung war sehr schwer zu erreichen.
Damals, 1993, machten wir uns an die genetische Kartierung und verwendeten nur 11 Marker bei Maus-Chromosom 4,
von dem wir wussten, das dort der LPS Locus war, und das deckte die meisten Chromosomen ab.
Wir erweiterten den Bereich und nach 2.093 Meiosen fanden wir einen kritischen Bereich zwischen
zwei neuen Markern, B und 83.3, und wir glaubten, dies seien etwa 2,6 Millionen Basenpaare,
heute wissen wir allerdings, dass es etwa doppelt so viele waren.
Wir haben dann mit physikalischen Abbildungen gearbeitet,
eine große Anzahl bakteriell artifiziell Chromosomen in einem überlappenden Format geklont,
um diesen Bereich zu umfassen, und dann begannen wir sie zu sequenzieren, beginnend in der Mitte des Intervalls,
und dann bidirektional nach außen arbeitend.
So gestaltete sich unser Leben etwa drei Jahre lang.
Wir fragmentierten BACs, sequenzierten sie, verglichen die Ergebnisse mit
Bibliotheken von Expressed Sequence Tags, die beim NCBI vorlagen, und suchten nach Genen.
Und während dieser ganzen Zeit fanden wir nur eine kleine Zahl von Pseudogenen, die natürlich nicht das Etikett
„Pseudogen“ trugen, und wir mussten alle Möglichkeiten ausschließen,
dass es sich dabei nicht doch um authentische Gene handelt und sie irgendeine Mutation hätten, die einen Stamm vom anderen unterschied.
Im Sommer 1998 bekamen wir es mit der Angst zu tun,
wir hatten nämlich über 90% des Bereichs erfasst und uns ging das Material zum Sequenzieren aus.
Und das Gen hatten wir noch nicht gefunden.
Natürlich ist es dann, wie immer, am letzten Ort, an dem man sucht.
Ziemlich gegen Ende des Intervalls fanden wir ein kodierendes Gen, einen Orphanrezeptor, genannt der Toll-like-Rezeptor 4.
Das war von Anfang an sehr aufregend.
Zum einen, das Gen, das wir in dem kritischen Bereich gefunden hatten,
hatte Leucine-rich Repeats in seiner Ektodomäne, genauso wie CD14, und wir konnten uns vorstellen,
dass vielleicht durch Nähe oder Transfer LPS von CD14 zu TLR4 gelangte und dann die Reaktion auslöst.
Dies war tatsächlich ein einfach umspannendes Transmembranprotein.
Zweitens, auf der zytoplasmatischen Seite gab es eine starke Homologie zwischen dem TLR4 Rezeptor und dem Interleukin-1 Rezeptor.
Der Interleukin-1 Rezeptor war für entzündende Wirkungen bekannt, wenn er durch ein Proteinliganden, Interleukin-1
ausgelöst wurde, und er konnte NF kappaB aktivieren.
Wir glaubten, dieses Motiv würde vermutlich bewirken,
die Aktivierung des TNF-Gens und anderer entzündlicher Zytokinen-Gene bei einer Stimulation anzutreiben.
Drittens gab es eine Beobachtung, die damals vor zwei Jahren
Jules Hoffmann und seine Kollegen gemacht hatten, welche sich Mutationen ansahen, die eine Anfälligkeit
für Pilzinfektionen bei der Fliege verursachten.
In einem sehr schönen Arbeitspapier in Cell, 1996, zeigten Jules und seine Kollegen, dass Fliegen mit Mutationen in Toll, dem Namensvetter
dieser Superfamilie von Proteinen, für Infektionen durch Pilze anfällig sind, insbesondere gegenüber dem Aspergillus fumigatus.
Sie sehen hier eine tote Fliege mit Hyphen, die aus dem Thorax wachsen, da die Fliege kein
wichtiges antimikrobielles Peptid, das Drosomycin, bilden konnte.
Dies schien eine Parallelgeschichte zu dem Fall zu sein, um den es uns ging, bei dem eine Mutation Mäuse
hochgradig anfällig gegen Gram-negative bakterielle Infektionen machte.
Natürlich hätten sich alle diese Gedanken in nichts aufgelöst, sollten wir keine Mutation finden, aber wir fanden sie.
Wir fanden, dass es im C3H/HeJ Stamm eine Veränderung
in einem einzelnen Basenpaar gab, welche die zytoplasmische Domäne von TLR4 abänderte, weshalb es unfähig war, ein Signal zu geben.
Im C57schwarz/10ScCr Maus-Stamm gab es eine Deletion,
alle Axone des Toll-like-Rezeptor 4 Gen umfassend, eine 74 kb Deletion.
Wir konnten schließlich die exakten Ränder festlegen.
Diese beiden defekten Allele, die im Kontroll-Stamm
nicht vorhanden waren, überzeugten uns vollständig, dass es sich hier um das Gen handelte, nach dem wir suchten.
Es gab noch einige Fragen dahingehend, ob TLR4 wirklich ein Rezeptor für LPS sei.
Innerhalb eines Jahres wurde von Kensuke Miyake und Mitarbeitern bestimmt,
dass eine weitere Unter-Einheit beim Komplex vorhanden war, genannt MD-2, die hier in Violett zu sehen ist,
ein korbförmiges Protein, das in starker Wechselwirkung zu TLR4 steht, das man hier in Türkis sieht.
Es verfügt über alle diese Leucine-rich Repeats, die so ein
geschmeidig geformtes Molekül erzeugen und hier sieht man, das Molekül ist dimer und LPS,
so wie Jie-O Li und Mitarbeiter es 2009 zeigten,
welcher schließlich den Komplex herauskristallisierte, passt in die Tasche des MD-2, hat aber auch etwas Kontakt
mit dem Rückgrat des TLR4.
Wenn dies auftritt, erzeugt es eine Konformationsänderung, die über die Membran hinweg wahrgenommen wird.
Hier beginnen alle entzündlichen Wirkungen
des Lipopolysaccharid, bei diesem einen Molekül.
Die nächste Frage, der wir uns zuwenden wollten bezog sich auf die Signalgebung von TLR4 und wie sich diese vollzog.
Wir waren damals von dem Forward Generic Ansatz fasziniert, es gab aber keine weiteren
spontanen Mutationen bei Mäusen, die uns etwas über die Wirkungsweise der Signalgebung von LPS hätten sagen können.
Wir entschieden daher, wir mussten neue Phänotypen unter Verwendung eines Mutagens erzeugen, womit wir 2000 begannen.
Etwa während der nächsten 11 Jahre identifizierten wir viele Phänotypen,
die eine Beziehung zur LPS Signalgebung hatten und wir konzentrierten uns auch auf andere Aspekte der Immunität,
und überwachten sie mit verschiedenen Schirmen gleichzeitig.
Damals war ENU-Mutagenese ein blindes Verfahren.
ENU oder Ethyl-Nitrosoharnstoff ist das einzige Mutagen, das sich bei Mäusen wirklich effektiv einsetzen lässt.
Es ist das einzige chemische Mutagen.
Man verabreicht es männlichen Mäusen, es mutiert die Spermatogonien, und Mutationen werden auf den Sohn
dieser Maus übertragen, auf die G1 Generation.
Ein einzelner G1 legt den Stammbaum fest und die G1 wird auf sechs Mäuse gezüchtet, um weibliche Mäuse zu erhalten.
Sie werden dann mit ihren eigenen Töchtern rückgekreuzt und das ergab einige der Mutationen
bei Homozygotie in jedem G3 Nachwuchs, der von dieser Kreuzung geboren wurde.
Wir schufen gewöhnlich sehr kleine Stammbäume, da wir nicht in die Situation kommen wollten,
die gleichen Mutationen immer wieder sichten zu müssen und unsere Ansicht dazu hat sich grundlegend geändert,
was Sie gleich sehen werden.
Damals wussten wir das nicht, aber heute wissen wir, das durchschnittliche Sperma eines G0 Tieres
verfügt über 60-70 Mutationen, die den genetischen Code verändern.
Aus langjährigen Experimenten weiß man, sieht man einen Phänotyp,
kommt das immer von einer Kodierungsänderung, statt von einer irgend gearteten intergenischen Änderung.
Dies war, wie gesagt, ein blindes Verfahren.
Der einzige Weg, weshalb wir wussten, dass ENU wirksam war, war über das Auftreten von Phänotypen in unseren Screenings.
Es war ermutigend eine Menge spezieller Mäuse zu sehen und natürlich versuchten wir
allen Mutationen, und auch allem was wir zu Gesicht bekamen, auf die Spur zu kommen.
Im Laufe von 11 Jahren entdeckten wir 34 Mutationen bei 20 Genen,
was uns einiges darüber erzählte, wie die TL-Rezeptorsignalgebung wirkt.
Wir hatten Mutationen in den Toll-like-Rezeptoren selbst, von denen 12 in Mäusen vorkommen.
Ich zeige hier nur einige davon.
Wir fanden Mutationen auch in Co-Rezeptoren, zusätzlich zu den bereits von mir erwähnten.
Mutationen in Chaperonen wie UNC93B, die die TLRs dahin bringen, wo sie benötigt werden.
Einige Kanalproteine sind ebenfalls zur Signalgebung vom Endosom durch TLRs erforderlich.
Dann gibt es Adaptorproteine, die zum Rezeptor gerufen werden, um weiter zu signalisieren.
Es gibt eine Schicht von Kinasen, die aktiviert werden, dann wird in Folge eine Ubiquitin-Ligase, TRAF6, aktiviert.
Es ubiquitiniert sich selbst und andere Proteine und TAB2 führt dies alles zusammen,
damit die Signalgebung so fortgesetzt wird, wie es sein soll.
Schließlich hat man eine weitere Schicht Kinasen, die sich abbauen, letztendlich phosphorylieren
und zum Abbau von I kappaB und NF kappaB Translokation führen und da sind noch weitere Proteine,
die benötigt werden, um TNF zu verarbeiten und aus der Zelle freizusetzen.
Wir nahmen TNF als den Endpunkt unseres Screenings an.
Anfangs war das sehr schwierig, genauso schwierig wie zuvor.
Doch wurde es einfacher, als das Mausgenom sequenziert und annotiert wurde,
man musste dann keine Ansteckungen mehr durchführen; man wusste, worum es sich bei allen Genen handelte.
Es war kein Neuland, wie es früher noch war.
Es ging auch schneller, da bessere Sequenzierungstechnologien
Online verfügbar wurden, zuerst Kapillar-Sequenzierung, danach Plattformen zur massiven parallelen Sequenzierung.
Aber 2011 war klar: der limitierende Schritt bei der Mutationssuche war die genetische Kartierung.
Das gewöhnliche Paradigma bei der Auskreuzung eines Stammes zu einem Marker-Stamm,
das Vornehmen einer kritischen Bereichszuordnung, um dann dort nach Mutationen zu suchen, hatte unsere Arbeit verlangsamt.
Wir konnten zudem sehr viel mehr Phänotypen feststellen, als wir lösen konnten.
Manchmal war ein Jahr erforderlich, eine Mutation aufzuspüren.
Es wurde ein neuer Ansatz gebraucht.
Ich fing an darüber nachzudenken, was der perfekte Ansatz sein könnte und ich dachte an sowas wie Google Glass.
Ich wünschte mir eine magische Brille, durch die ich mir eine Familie von Mäusen anschauen könnte,
so wie diese hier, und selbst wenn die Mutation nicht offensichtlich wäre, so wie ich das gezeigt habe,
könnte ich sagen, welche Maus von der Mutation betroffen ist.
Und nicht nur das, ich könnte auch in einem Augenblick sagen: dies ist eine Mutation in SOX10.
Dieses sind die Koordinaten der Mutation, die Veränderung der Aminosäure, das Motiv, das menschliche Homolog.
Wenn es Strukturdaten gäbe, würde sogar diese gezeigt werden.
Das ist jetzt bereits Realität und wir sind in der Lage, Mutationen in Echtzeit zu finden.
Ich sage Ihnen genau, wie das geht.
Zuerst erzeugen wir eine G1 Maus, so wie wir das immer gemacht haben,
dann aber nehmen wir bei jeder G1 Maus eine Gesamt-Exom-Sequenzierung vor,
im Voraus, um jede Mutation zu finden, die sie in den Stammbaum übertragen könnte.
Wir sind da seit einer Weile am Ball und fanden heraus, die durchschnittliche Anzahl an Mutationen, die den genetischen Code verändern
war 63 pro G1 Maus und die Modalzahl ist 70.
Es gibt Möglichkeiten, diese zu erhöhen, wir zogen es aber vor, es zu unterlassen,
denn wir hatten am Ende zu viel G3 Letalität.
Liegt die Anzahl bei über 30 Mutationen, arbeiten wir mit diesem Stammbaum weiter,
anderenfalls wird er ignoriert.
Damit weiterarbeiten bedeutet, wir bestellen ein Ampliseq Panel, das ist ein Ansammlung PCR Primer, so berechnet,
dass sie sich gegenseitig nicht beeinträchtigen, diese peilen jede der Mutationsstellen an und wir können dann ihren Genotyp feststellen.
Dann sind die Genotypen aller G2 und G3 Mäuse an den Mutationsstellen, die wir mit ENU erzeugt haben, festgestellt.
Erst dann werden die Mäuse für das phänotypische Screening freigegeben.
In diesem Falle schließt dies eine visuelle Überprüfung, das Wiegen der Maus und einen Glukosetoleranztest mit ein.
Dann werden sie in einer Testserie auf die angeborene Immunleistung untersucht (mittels Makrophagen),
wir immunisieren sie und verwenden die Durchflusscytometrie, um die adaptive Immunentwicklung und -leistung zu bewerten.
Danach nehmen wir ein DSS Challenge vor, wir infizieren eine Maus mit dem Zytomegalievirus, danach werden sie zu weiteren
Untersuchungen im Bereich der neurologischen Verhaltensreaktion weitergegeben.
Bis zum 28. Juni 2015 hatten wir auf diese Weise nahezu 64.000 Mutationen geschaffen,
und inzwischen ist es kein blindes Verfahren mehr.
Wir wissen, was jede Mutation ist, und wir wissen, auf welche Gene sie wirken.
Diese Mutationen erstreckten sich auf 17.204 Gene oder auf mehr als 3/4, ich glaube, die Maus hat
insgesamt 24.981 Gene.
Das ist eine enorme Anzahl an Mutationen.
Wären diese, selbst im heterozygoten Zustand in einer G1 Maus vorhanden, wären sie beinahe mit Sicherheit tödlich.
Sie sind natürlich über mehr als 1000 Stammbäume verteilt und
tangieren insgesamt 26.455 G3 Mäuse.
Wir können berechnen, dass wir 17% aller Gene
in einen Zustand der Phänovarianz mutiert haben, darauf komme ich nochmal zurück, und wir haben sie drei Mal
oder häufiger in homozygotem Zustand getestet, zumindest in einem unserer Screenings.
Insgesamt führten wir 135 Überprüfungen durch, denen die meisten Mäuse unterzogen wurden.
Da, wo es nur um die adaptive Immunleistung ging,
begegneten wir 60 bekannten Genen, von denen bekannt war, dass sie für die Immunentwicklung oder –funktion erforderlich sind,
und wir wiesen sie durch Phänotypen nach.
Zusammen mit diesen
entdeckten wir aber hunderte von Gene, von denen zuvor nicht bekannt war, dass sie etwas mit Immunität zu tun hatten.
Alles dies weist darauf hin, dass ein großer Teil unserer Genome zur Immunabwehr notwendig ist, so wie ich es vermutet hatte.
Wir sind jetzt aber in einer Position, in der wir möglicherweise präzisere Schätzungen darüber vornehmen können, wie groß dieser Anteil ist.
Um diese Daten zu sichten braucht man eine Software, mit der der Betrachter alle Mutationen untersuchen kann.
Wir schrieben ein Programm, genannt Linkage Analyser, und ein Programm zum Durchsuchen, genannt Linkage Explorer,
mit denen dies möglich wurde.
Man kann sich auf irgendein bestimmtes Gen konzentrieren, in jedem gewünschten Screening, bei einer Teilmenge von Mäusen
oder anhand des trivialen Namens eines Phänotyps.
Man kann die Suche auf verschiedene Arten der Mutation beschränken,
man kann sich darauf festlegen, nur große Stammbäume anzusehen, sofern gewünscht.
Die Anzahl der Beobachtungen im homozygoten Zustand lässt sich steuern und der Beobachter wählt ebenfalls
den p-Wert der Zuordnung zwischen dem Phänotyp und dem interessierenden Genotyp.
Dies wird durch die Änderung dieses Wertes hier vorgenommen.
Und es gibt noch andere Methoden, die Qualität der Beobachtung zu begrenzen.
Um Ihnen ein Beispiel zu geben, wir können sagen, wir sind nur an Proben
in Verbindung mit CD8-Zellen interessiert, mit deren Anzahl oder Aktivierungszustand.
Man kann CD8 unter dem Screeningnamen eingeben, wir bestehen darauf, die Mutation drei Mal
oder öfter im homozygoten Zustand zu sehen, wir bestehen auf einem relativ starken p-Wert der Zuordnung, 0,0005,
und prüfen ebenfalls diese anderen Elemente, ich will nicht alle durchgehen, und wir klicken auf „absenden“.
Dann geht man unverzüglich zurück zur Liste der Gene, in diesem Falle eine Liste von 102 Allelen
von 100 beteiligten Genen aus 70 verschiedenen Stammbäumen.
Sie können alleine hieraus erkennen, dass es uns nicht immer um eine einzelne Mutation geht, manchmal haben wir eine Verkettung
von zwei Mutationen, die auf einen Maximalwert der Verkettung fallen, wie Sie sich sicher vorstellen können.
Gewöhnlich arbeiten wir aber mit einer einzelnen daran beteiligten Mutation.
Sie sehen in der ersten Spalte Namen der Gene, und mit einigen, falls jemand unter Ihnen Immunbiologe ist, werden Sie vertraut sein.
Themis ist für die Beteiligung bei der positiven Auswahl von T-Zellen bekannt und taucht in einem Screening
für CD8-Zellen oder für das CD4-CD8 Verhältnis auf.
Einige sind unbekannt.
Ich zweifle daran ob es einem von Ihnen bewusst ist, dass SNRNP40, welches eine Komponente des U5 Spleißosoms ist,
eine selektive Rolle bei der Immunität spielt, aber dem ist so.
In der nächsten Spalte sehen Sie die Koordinaten der Mutation, Einschätzungen dessen, was die Mutation bewirkt,
Sie sehen auch die Screenings, auf denen das Scoring überwacht wurde.
Dann weiter da drüben sehen Sie die Anzahl der Beobachtungen
homozygoter Referenzallele, heterozygote oder homozygote für die Mutation.
In diesen drei Spalten sehen Sie die Bewertung der Verkettung,
entweder in einem additiven, einem rezessiven oder einem dominanten Vererbungsmodell.
Falls Sie sich den Vererbungsplan ansehen wollen,
dann klicken Sie diese Nummer an und Sie sehen einen Manhattan-Plot.
Dies ist ein Log-skalierter Plot der Wahrscheinlichkeit der Verkettung und man kann mit der Maus über irgendeine der Mutationen gehen,
die Sie hier sehen; dies alles sind die Mutationen in dem Stammbaum, nur eine davon zeigt eine starke
Verkettung über der Bonferroni Korrektur-Linie, und wenn Sie hier mit der Maus rübergehen, sehen Sie, dass dies SNRNP40 ist.
Vielleicht wissen Sie nicht, was SNRNP40 ist, Sie können das also anklicken
und erhalten einige Informationen zu diesem Gen, welche vorausberechnet wurden.
Sie sehen, unsere Mutation bewirkt eine kürzere Version des Proteins und dies wäre
im realen Programm interaktiv, Sie könnten mit der Maus darüber ziehen und die Domänenstruktur sehen.
Sie können das Genmodell anklicken und sehen, die Mutation ist in der Nähe von Axon 5 und man nimmt an,
dass es Axon 5 entfernt, was ein In-Frame-Produkt erzeugt.
Sie finden noch viele weitere Informationen, dies wurde alles vorausberechnet.
Wenn man die authentischen Daten sehen möchte, die Rohdaten,
kann man auch den Maximalwert anklicken und hier sehen Sie die phänotypische Leistung
der homozygoten Mutanten und die Referenzallele bei Homozygoten.
Jetzt gibt es zwischen den Heterozygoten und den Homozygoten eine Überlappung.
Bei einem qualitativen Ansatz wäre der Versuch, dies abzubilden, ein schrecklicher Aufwand, was wir früher
immer gemacht haben und Sie werden diesen Daten nicht einmal vollständig vertrauen, denn,
schließlich haben wir hier nur eine begrenzte Anzahl Mäuse.
Und Sie denken vielleicht, das ist so eine Art Glücksfall.
Beachten Sie aber, dass graduell, indem wir uns der Sättigung nähern, wir immer wieder
die gleichen Gene treffen und der Computer erkennt das zeigt „Superstammbäume“ an, wann immer er darauf trifft,
entweder bei identischen Allelen, die von der gleichen G0 übertragen wurden,
oder bei verschiedenen Allelen, die das gleiche Gen getroffen haben.
Sie werden in einem einzigen großen künstlichen Stammbaum zusammengefasst.
Irgendwann werden alle Mutationen auf diese Art integriert sein.
Derzeit fallen über die Hälfte aller Gene in
Superstammbäume und die Zahlen steigen rasch.
Mit mannigfaltigen Allelen wächst das Vertrauen in eine Verknüpfung zwischen Phänotyp und Genotyp.
Das gleiche Browser-Programm wird dazu verwendet, Superstammbäume zu untersuchen.
Im Falle von SNRNP40, das ich hier für Sie nachgeschaut habe,
haben wir eine Gesamtzahl von 16 Stammbäumen, 16 G1 Mäuse,
wir haben aber nur vier verschiedene Allele, hier ist das eine, das ich Ihnen gezeigt habe und drei weitere.
Das eine, das ich Ihnen zeigte, ist vermutlich nach unserer Einschätzung das 0-Allel.
Und wieder hat man die gleichen Modelle additiver, rezessiver und dominanter Vererbung.
Wenn wir eines von diesen anklicken, sehen wir etwas recht Unterschiedliches.
Wir haben jetzt 376 G3 Mäuse von allen diesen Stammbäumen untersucht, hier sind alle Mutationen,
die in all diese Stammbäume enthalten sind;
die dunkelblauen haben mehrere eigene Allele und wenn Sie mit der Maus über den Spitzenwert fahren,
ist das natürlich SNRNP40, das Sie hier rot sehen.
Hier gibt es wirklich keine Unklarheit, man hat eine deutliche Verschiebung bei der phänotypischen Leistung der Homozygoten
im Vergleich zu den Heterozygoten oder Referenzallelen.
Das ist es, was diesen spektakulären p-Wert ergibt.
In diesem Falle würde ich sagen, man braucht keine weitere Bestätigung,
doch unser Standardverfahren ist, bei jedem Fall ein schärfer ausgerichtetes Allel zu erzeugen.
Die große Frage, die wir heute stellen können, und zuvor nicht stellen konnten ist,
wie sehr haben wir die Genome mit unseren 64.000 Mutationen geschädigt?
Wenn wir uns auf nur ein Screening konzentrieren, das CD8-Screening,
sehen wir, in allen untersuchten Stammbäumen
wurden mindestens 67,76% aller Gene angefasst,
doch nicht alle davon wurden in Homozygotie überführt.
Doch Mutationen in 45,9% der Gene wurden drei Mal oder öfter in Homozygotie überführt.
Das sagt nichts darüber aus, wieviel Schäden diese Mutationen verursacht haben, wir haben uns aber auch das angesehen.
Wenn wir etwa von 0-Allelen sprechen,
von vorzeitigen Stoppcodons oder kritischen Fehlern der Spleißstelle,
dann waren nahezu 6% aller Gene betroffen und wurden drei Mal oder öfter im homozygoten Zustand untersucht.
Dies wäre eine sehr konservative Schätzung darüber, wieviel Schädigung erfolgte.
Wenn wir die 0-Allele oder die wahrscheinlich schädigenden Allele betrachten, wobei wahrscheinlich schädigend
durch ein Programm, genannt PolyPhen-2, festgelegt ist, das vermutet, wie viel Schaden eine bestimmte Aminosäure verursachen kann,
dann haben wir: 24,91% aller Gene wurden drei Mal oder öfter
im reinerbigen Zustand mutiert und untersucht.
Dies wäre eine sehr großzügige Schätzung bezüglich der beim Genom erfolgten Schäden.
Der wahre Wert, den wir kennen, wird von diesen beiden Schätzungen eingeklammert.
Wir wissen nicht, wo genau er zwischen diesen beiden liegt, wir haben eine Ahnung, dass er sich irgendwo in Nähe der Mitte befindet,
weshalb wir dahin tendieren zu sagen, dass es etwa 16-17%
aller Protein-kodierender Gene sind, die zu phänotypischen Variationen mutierten.
Wir stehen natürlich erst am Anfang dieses Prozesses,
und wir könnten eine Linie ziehen und sagen,
dies ist die konservative und dies die großzügige Schätzung der Schädigung.
Mit der Zeit werden diese beiden Kurven sich annähern, sie werden sich aber nie wirklich berühren,
und wir werden immer etwas im Zweifel über das genaue Schadensausmaß sein, das wir beim Genom verursacht haben.
Was aber haben wir erreicht?
Früher brauchten wir fünf Jahre, um nur ein Gen positionell zu klonen, jetzt benötigen wir etwa eine Stunde.
Dann wurde ein Phänotyp in fünf Jahren gelöst,
jetzt werden in unserem Labor jeden Tag ein oder zwei Phänotypen gelöst.
Dies bedeutet, wir kommen 3.000 Mal schneller voran als zuvor.
Wir werden derzeit nur durch die Zahl, in der sich Mutationen erzeugen und überprüfen lassen, beschränkt.
Das bedeutet, wir können jede Woche etwa 1.400 Mutationen abfragen.
Und viele davon, etwa 1/2% davon, verursachen einen Phänotyp auf mindestens einem unserer Screenings.
Wir können projizieren, dass wir die Mehrheit der Gene zerstören und ihre phänotypischen Konsequenzen
etwa innerhalb von drei Jahren analysieren, und dann wissen wir, welches die meisten
Gene sind, die für eine starke Immunität, so wie wir dies definiert haben, erforderlich sind.
Das war eine sehr langwierige Geschichte, und ich muss besonders Alexander Poltorak für das
positionelle Klonen des LPS Locus danken.
Ich habe jetzt eine sehr viel größere Gruppe als damals und in der gegenwärtigen Gruppe sind es besonders
die Computerleute Chun Hui Bu, Stephen Lyon, Sara Hildebrand, David Pratt und Xaiowei Zhan,
die Anerkennung für das automatische positionelle Klonen verdienen, das ich Ihnen gezeigt habe.
Wir wurden auch von Tao Wang und Yang Xie im Center for Computational Biology unterstützt.
Meinen herzlichen Dank an Sie alle.
(Applaus)