Lassen Sie mich zu Beginn den Untertitel "Optische Mikroskopie 2.0" erklären.
Er bezieht sich auf den größten amerikanischen Philosophen des 20. Jahrhunderts.
Falls Sie sich fragen, wer das ist - es handelt sich um Yogi Berra; er war Fänger bei den New York Yankees.
Rechts sehen Sie ihn in einem philosophischen Gespräch mit einem Schiedsrichter.
Er sagte eine Menge kluger Dinge.
Zum Beispiel sagte er: "Wenn du an eine Weggabelung kommst, nimm sie."
Ich rate das jedem Studenten.
Außerdem sagte er: "Man kann viel wahrnehmen, indem man einfach beobachtet."
Warum spricht ein Physiker bei einer Tagung über Physiologie bzw. Medizin?
Nun, Sie dürfen nicht vergessen: Physiker haben einige Beiträge zur Medizin geleistet.
Der erste Physiker, der einen Nobelpreis erhielt, war Roentgen; er bekam ihn im Jahr 1901 für die Entdeckung der Röntgenstrahlen.
Und Röntgengeräte hatten natürlich einen nachhaltigen Einfluss auf die Medizin.
Aber es steckt noch mehr dahinter.
Sehen Sie sich nur die modernen Techniken an, die wir heutzutage in der Medizin und in der Biologie anwenden -
neben den Röntgengeräten gibt es die Elektronenmikroskope,
es gibt die Kernspinresonanz für die strukturelle Biologie und die Kernspintomographie.
Es gibt die Computertomographie mit Röntgenstrahlen, die Positronenemissionstomographie -
sie alle wurden im Wesentlichen durch Physiker eingeführt.
Doch abgesehen von diesen bildgebenden Techniken ist auch darauf hinzuweisen, dass das Markieren wichtiger Elemente,
vor allem von Proteinen, für das Markieren poly- und monoklonaler Antikörper große Bedeutung hatte.
Radioaktive Nukleotide, EM-Immunfärbung, Fluoreszenzmarkierung, das Markieren grün fluoreszierender Proteine -
all diese Dinge waren von großer Bedeutung.
Was ist der Farbcode?
Und dann, erst vor kurzem: Einzelmolekülmanipulation und -bildgebung, optische Auflösung im Sub-Wellenlängenbereich.
Das Farbcode-Symbol - alles, was farbig ist, hat Nobelpreise gewonnen.
Die weißen Dinge warten noch auf ihren ersten Nobelpreis.
Lassen Sie mich über einen Teil der optischen Mikroskopie sprechen,
der die Art und Weise, in der wir biologische Forschung betreiben, von Grund auf verändert hat.
Es begann mit der ersten Manipulation von Zellen, Paramecium E. coli, durch Art Ashkin bei den Bell Laboratories.
Steve Block griff das rasch auf und befestigte E. coli auf dem Objektträger eines Mikroskops,
schnappte sich E. coli mit einer optischen Pinzette, drehte es herum, um die Antriebe zu untersuchen.
Und ich begann damit, ein einzelnes Molekül der DNA zu manipulieren.
Das ist wirklich das ABC des Biotrapping.
Als ich in den späten Achtzigern nach Stanford ging, wollte ich wissen,
ob ich Moleküle, insbesondere DNA, unmittelbar manipulieren konnte.
Auf diesem Bild sehen Sie eine mit fluoreszierenden Farbstoffen gefärbte Einzelmolekül-DNA.
In das optische Mikroskop wurde ein Laser eingeführt, es wurde an einen motorisierten Spiegel-Joystick angeschlossen,
und schon kann man eine Einzelmolekül-DNA herumschwänzeln lassen.
Die Studenten, die damit befasst waren, waren selbstverständlich begeistert.
Sie verschwanden in den Laboren und beschäftigten sich stundenlang damit, wie mit Videospielen.
Schließlich musste ich ihnen sagen: Das macht natürlich Spaß, aber führen wir ein paar Experimente durch.
Wie auch immer.
Ich habe Jim Spudich unterstützt, Bob Simmons... Bob Simmons war ein Jahr lang in Stanford.
Er kam zu mir und sagte: Können Sie uns bitte dabei helfen, zusammen mit Jim Spudich ein Aktin-Myosin-System zu untersuchen.
Klar, sagte ich.
Zusammen haben wir dann das vorgeschlagen...
wir erstellten das System, mit optischen Pinzetten ein einzelnes Aktinfilament zu halten,
lösten das Substrat mit einer Styroporkugel - unser Ziel war es, die Kraft zu messen, die entstand, wenn Aktin ATP hydrolysierte.
Wir kamen dem Ziel sehr nahe, erreichten aber noch nicht die äußerste Grenze -
würden wir den Arbeitstakt eines einzelnen Aktinfilaments sehen?
Mein Labor war im zweiten Stock bei Varian.
Mit Jim, Bob und dem Studenten Jeff Finer verlegten wir es in das Erdgeschoß von Beckman,
und damit waren wir endlich in der Lage, die Anziehungskraft eines einzelnen Aktinmoleküls auf Myosin zu klären.
Das war ein sehr schöner Erfolg.
Lassen Sie mich noch über einige andere Revolutionen sprechen, die sich in der Mikroskopie ereignet haben.
Wenn man an die optische Mikroskopie den, an die Beugungsgrenze, wenn Sie so wollen -
sie ist vorgegeben durch die Wellenlänge des Lichts, geteilt durch den Brechungsindex mal zwei mal Signal-Fader,
wobei Signal-Fader angibt, wie eng die Strahlen fokussiert sind.
Bei einem typischen optischen Mikroskop könnten das 250 bis 300 nm sein.
Wenn man aber eine andere Frage stellt - wenn man nicht fragt:
Was ist der Zerstreuungskreis, der Klecks eines einzelnen fluoreszierenden Moleküls bei bester Auflösung, sondern wenn man fragt:
Was ist das Zentrum dieser Auflösung?
Das ist die optische Auflösung geteilt durch das Signal-Rauschverhältnis.
Wäre das Signal-Rauschverhältnis 10/1, dann würde man grundsätzlich statt 300 nm 30 nm erhalten.
Wäre es 100/1, würde man grundsätzlich 3 nm erhalten.
Wenn man Bilder von unabhängigen Molekülen erzeugt - zuerst von diesem, dann von jenem, dann von diesem -
dann würde das normalerweise alles verschmieren, man hätte keine gute optische Auflösung.
Doch Eric Betzig, Harold Hess und unabhängig davon Xiaowei Zhuang...
tatsächlich gab es noch zwei weitere Forschungsgruppen im selben Zeitraum des Jahres 2006,
die sich diese Methode einer Verbesserung der optischen Auflösung einfallen ließen.
Wie sich zeigte, hatte das große Auswirkungen.
Noch etwas will ich kurz erwähnen:
Die stimulierte Emissionsdepletion-Mikroskopie, erfunden von Stefan Hell, war auch von großer Bedeutung.
Ich zeige Ihnen jetzt das Beispiel einer Anwendung.
Während ich Energieminister war, kümmerte sich der letzte Postdoktorand in meinem Labor darum;
es wurde vor kurzem in Science veröffentlicht.
Es geht um die Untersuchung von Biofilmen.
Sehen Sie sich dieses Bild an -
normalerweise stellt man sich Bakterien als freischwebend vor, in der so genannten planktonischen Form.
Doch die meisten Bakterien, die man in der Natur findet, sind keine einzelnen Zellen;
sie landen vielmehr auf Oberflächen und bilden Bakteriengemeinschaften.
Bilden sie jetzt alle ein und dasselbe Bakterium oder handelt es sich um verschiedene Bakterien einem so genannten Biofilm?
Das ist die Grafik eines Biofilms, der auf einer Oberfläche wächst.
In diesen Biofilmen besteht der Großteil der Masse nicht aus Bakterien,
sondern aus Proteinen und Polysacchariden, die von den Bakterien ausgeschieden werden.
Und hier sehen Sie die Kantenansicht eines in unserem Labor wachsenden Biofilms.
Das hier sieht man durch ein optisches Mikroskop mit einer Auflösung von etwa 300 oder 400 nm.
Und das sieht man mithilfe superauflösender Techniken in einem Biofilm.
Erweitern wir diesen gesprenkelten Bereich - hier haben wir's.
Das ist ein Cholerabakterium; es gibt Proteine ab, die den Biofilm bilden.
Und Sie sehen, dass die Auflösung besser ist.
Das Gute daran ist, das es sich hier um Bilder handelt - um Filme, wenn Sie so wollen, Zeitlupenfilme -,
die von echten, wachsenden Biofilmen gemacht wurden.
Man erhält eine sehr hohe Auflösung, da die Biofilmstruktur dafür sorgt, dass sich die Dinge nicht bewegen.
Damit erhält man Auflösungen in der Größenordnung von 10/15 nm.
Das ist ein Beispiel; wir arbeiten weiter daran.
Ich muss sagen, wenn man erst einmal in der Lage ist, Biofilme mit einer Auflösung von 10/15 nm zu untersuchen,
dann öffnet sich eine ganze Welt.
Man sieht, wie diese Bakterien durch die Exozytose von Vesikeln miteinander kommunizieren.
Man sieht die tatsächliche Struktur der Biofilme, das Protein und metrische Polysaccharidstrukturen - Dinge dieser Art.
In dieser ersten Studie wurde das getestet.
Lassen Sie mich noch kurz auf die superauflösende Bildgebung in einem Signalpfad eingehen,
wobei sich in dem Signalpfad, wenn Moleküle mutieren, die Dinge zum Schlechten wenden und Krebs bilden.
Diese Arbeit geht auf meinen vorletzten Postdoktoranden zurück, Xiaolin Nan, der jetzt an der Oregon State Health University ist.
Es gab eine Zusammenarbeit mit Joe Grey, der ebenfalls vom Lawrence Berkley National dorthin übersiedelt ist;
außerdem mit Frank McCormick von der UCSF.
Das ist eine zeichnerische Darstellung dessen, was geschieht.
Für diejenigen unter Ihnen, die darüber nichts wissen - das sind keine Daten.
(Video wird abgespielt.) Können wir bitte den Ton haben?
...
und ERK, auch bekannt als MAP-K.
Die MAP-K-Signalisierung wird aktiviert,
indem mit dem Tyrosinkinaserezeptor ein Wachstumsfaktor an die extrazelluläre Domäne gebunden wird.
Als Nächstes werden die Signalmoleküle Grb2 und Sos an die interne Andockstelle rekrutiert,
was die Ras-Aktivierung an der Membran zur Folge hat.
Effizienz und Dauer der Signalübertragung werden durch das Gerüstprotein Kinase-Suppressor von Ras, KSR, reguliert.
Ras löst eine Phosphor-Relationskaskade unter Einbeziehung der Proteine Raf, MEK und ERK aus,
was zur ERK-Aktivierung und Translokation in den Zellkern führt.
Im Nukleus angekommen, aktiviert ERK mehrere Transkriptionsfaktoren, welche die Genexpression vermitteln.
Die Zielgene handeln daher...
Lassen Sie mich das wiederholen: Auf der Oberfläche der Zelle befindet sich ein Rezeptormolekül, TRK.
Wenn ein Ligand darauf landet und es aktiviert, wird die zelluläre Seite phosphoryliert.
Zwei weitere Moleküle, Grb2 und Sos, werden phosphoryliert.
Sie aktivieren daraufhin ein Molekül namens Ras, das in der Lage ist, ein weiteres Molekül namens Raf zu ergreifen, dann MEK, dann ERK.
In dieser Kette tritt eine Signalverstärkung auf, doch all diese Moleküle außer Ras werden phosphoryliert.
Wenn Ras oder Raf mutieren, benötigt man für die Vermehrung der Zelle kein Signal von außen.
Und Mutationen von Raf oder Ras sind verantwortlich für ungefähr
- ich sollte nicht sagen: sind verantwortlich...
hängen mit ungefähr der Hälfte bis zu zwei Dritteln aller menschlicher Krebserkrankungen zusammen.
Ras-Mutationen hängen mit mehr als 90 % der Fälle von Bauchspeicheldrüsenkrebs zusammen
und mit zwei Dritteln der multiplen Myelome.
Einige der schwersten Erkrankungen hängen mit Ras-Mutationen zusammen.
Jedenfalls hatte man bei der Verwendung der Elektronenmikroskopie, der Immunoelektronenmikroskopie den Verdacht,
dass es in diesen mutierten Formen von Ras vielleicht Cluster gibt, die...das, was sie hier links sehen, sind Daten.
Es handelt sich um das Bild eines an einem Goldteilchen haftenden Antikörpers, der auf mutierte Formen von Ras zielt.
Die Analyse dieses Bildes brachte einige Autoren zu der Vermutung,
dass sich vielleicht Cluster von Ras bilden, fünf bis acht Ras-Moleküle.
Und dieser Cluster löst dann die Zell-Signalübertragung aus, die zur Zellproliferation und zur unkontrollierten Zellteilung führt.
Das war unser Ausgangspunkt.
Was machten wir mit diesem mutanten Ras-Gen?
Wir fügten einen Initiationsfaktor hinzu, den wir mit einem Tetrazyklin nach oben und unten regeln können...
nicht mit einem Tetrazyklin, sondern mit einem Tetrazyklin-Derivat, das in die Zelle eindiffundieren kann.
Wenn dieses Dox auf dem Katalysatorzentrum landet, kann man die Expression des mutanten Proteins tatsächlich nach oben regeln.
Und das sehen wir in diesem mutanten so genannten KRas-Protein, wo die Mutation am Kodon 12 festgestellt wurde.
Man ersetzt Glyzin durch Asparaginsäure.
Hier haben wir eine Zelle, eine Krebszelle.
Wenn ich in dieses kleine weiße Rechteck hineinzoome, das man bei 200 nm sieht - der Maßstabsbalken liegt bei 200 nm -,
dann sieht man diese kleinen roten Punkte; das sind einzelne Moleküle des mutanten Ras.
Was haben wir gemacht?
Wir haben einfach statistisch überprüft, wie viele dieser mutanten Ras es gibt und ob sie Cluster bilden.
In einer sehr niedrigen Dosis von Dox, 1 ng/ml, stellen wir fest...
das ist ein statistischer Test, der Aussagen über die Bildung von Clustern trifft,
aber man benötigt nicht diesen alten, herkömmlichen statistischen Test, den so genannten Ripley-Test;
man kann Paare zählen, Doppel- Tripel- und Einzelmoleküle.
Bei 1 ng/ml Dox stellen wir fest, dass praktisch alle von ihnen isolierte Einzelmoleküle sind;
nur ein sehr kleiner Teil sind Doppel- und Tripelmoleküle.
Wenn wir die Dosierung von Dox erhöhen, so dass die Konzentration von Einzelmolekülen ungefähr siebenmal höher ist,
finden wir in der Hauptsache immer noch Einzelmoleküle - das ist der grüne Balken -
doch wenn wir uns die Zahl der Doppelmoleküle ansehen, stellen wir fest,
dass nunmehr ungefähr 18 % der Moleküle als Doppelmoleküle ausgebildet sind.
Das Schöne an dieser Superauflösung ist, dass man nur Hanteln sieht.
Und wie Sie sehen, ist das Signal-Rauschverhältnis sehr gut.
Wenn man also...wir haben das dann mit verschiedenen Dosen gemacht.
Wir haben festgestellt...das ist ein Gel, in dem wir hier die Konzentration von Tetrazyklin erhöht haben.
Das ist das Wildtyp-Ras; wir haben die Konzentration in der mutanten Form erhöht.
Wenn man das nach oben regelt, geht dies bemerkenswerterweise nach unten -
in der Zelle scheint es also eine Regel zu geben, die besagt:
In dieser Zelle ist nur eine bestimmte Menge Ras erwünscht.
Das wurde in zwei Zelllinien beobachtet; es handelt sich also um ein kleines Nebenprodukt.
Aber jetzt kommt das Interessante.
Ab 1-2 ng/ml Dox wird das ERK phosphoryliert.
Die Phosphorylierung des ERK nehmen wir Zeichen dafür,
dass es nachgeschaltete Signalübertragungsaktivität gibt und dass sich die Zelle teilen wird.
Das wäre unsere Probe für den mutanten...die Konzentration im mutanten Molekül ist so hoch,
dass das Zellteilungssignal ausgelöst wurde.
Als Nächstes machten wir Folgendes:
In dieser Grafik nahmen wir unser Ras-Molekül...
das ist unser fluoreszierender Farbstoff; es handelt sich um mCherry, ein Derivat des grün fluoreszierenden Proteinfarbstoffs.
Am Ende hatten wir eine kleine Aminosäurekette, die, gekoppelt mit einem von uns so genannten dimerisierenden Wirkstoff,
in dieser Grafik durch die kleinen orangefarbenen Flecken dargestellt...
wir setzten das in die Zelle ein und stellten bei Dox-Konzentrationen von null, wenn also keine mutante Form von Ras vorhanden ist...
wir stellen fest, dass das ERK nicht phosphoryliert wird.
In der Dox-Konzentration, bei der es zuvor keine Phosphorylierung des ERK gegeben hat, stellen wir wieder fest,
dass das ERK nicht phosphoryliert ist, doch als wir den dimerisierenden Wirkstoff einsetzten - voila! -
wurde ein nachgeschaltetes Signalprotein ausgesandt.
Das sagt uns, dass man die Bildung von Dimeren benötigt - bei einer niedrigen Konzentration von ungefähr 18 %.
Wenn man die Konzentration noch weiter erniedrigt, aber die Bildung von Dimeren erzwingt,
erhält man ebenfalls eine nachgeschaltete Signalübertragung.
Anscheinend ist also die Bildung von Dimeren sowohl nötig als auch ausreichend, um der Zelle das Signal zur Vermehrung zu geben.
Und man benötigt keine Cluster höherer Ordnung.
Das liegt wiederum daran, dass die Einzelmolekülfluoreszenz äußerst empfindlich ist.
Dabei bietet sich auch sofort ein Ziel an, denn was wir ebenfalls taten - diese Daten zeige ich nicht -
wir untersuchten diese mutante Form von Ras mit und ohne das GTP als Teil des Moleküls.
Alle, was man hat, ist das im Protein eingebettete Linker-Zentrum,
und wir stellten fest, dass die Linker Dimere mit derselben Frequenz bildeten wie die vollständige mutante Form des Proteins.
Das vorgeschlagene Medikament wäre also...das ist das mutante GD12-Zentrum;
man würde also wollen, dass sich das Medikament an diesen Teil anheftet,
aber auch auf diesen rot dargestellten Linker-Arm einwirkt, um die Dimerisation zu verhindern.
Angesichts dieser Arbeit sagt man sich also: Aha!
Wir glauben zu wissen, wie man es vernünftigerweise anstellt, das Medikament auf sein Ziel zu richten.
Das also eine weitere Anwendung der superauflösenden Bildgebung.
Nun gut.
Gestatten Sie mir ein paar Ausführungen über die Grenzen der Fluoreszenz.
In dieser Grafik sehen Sie einen einzelnen fluoreszierenden Punkt, jetzt auf einem CCD-Array-Sensor abgebildet.
Er ist typischerweise drei bis vier Pixel breit.
Nun findet man das Zentrum dieses Bildes, das üblicherweise ein Zwanzigstel/ein Fünfzigstel eines Pixels ausmacht.
Aber nehmen wir einmal an, dass die Pixel nicht einheitlich auf das Licht reagieren, dass sie um 1, 2 oder 3 % schwanken können.
Und ein Pixel zum Beispiel, anstatt das anzuzeigen, reagiert und zeigt eine geringfügig höhere Ladung an.
Wenn man dieses Muster anpasst, verschiebt man das Bild.
Im Jahr 2006, als das zum ersten auftauchte, kam uns der Verdacht...wir spielten damit herum -
ist es möglich, dass die Schwankung einer CCD-Kamera von Pixel zu Pixel die Auflösung begrenzt?
Wir führten ein ganz einfaches Experiment durch.
Wir nahmen eine kleine Lochblende und stellten weißes Licht dahinter.
Und diese kleine Lochblende wurde sodann in roten und grünen Bereichen auf dem CCD-Sensor abgebildet.
Dann bewegten wir die Lochblende, wie hier gezeigt, mit einem kodierten Präzisions-Verschiebetisch;
wir wissen genau, wie weit wir sie bewegen.
Und in dem Maß, in dem wir sie bewegen, bewegt sich natürlich auch der rote bzw. der grüne Punkt.
Doch wir passen den Standort des Zentrums dieses roten bzw. grünen Punkts an,
und wenn die Kamera in Ordnung ist, wandern sie genauso einheitlich herum wie der Verschiebetisch einheitlich herumwandert.
Und wir stellten fest, dass sie tatsächlich einheitlich wandern.
Als wir die Verschiebung durchführten -
man kann den Verschiebetisch um einen sehr kleinen Bruchteil eines Pixels auf der Kamera bewegen,
wodurch man eine Höhenlinienkarte der Differenz erhält -
wenn man den Mikroskop-Verschiebetisch bewegt, wackelt das andere Ding herum, und zwar um 6 bis 10 nm.
Es ist in den CCD-Sensor eingebrannt, was bedeutet, dass man Korrekturen vornehmen kann, nachdem das Bild aufgenommen wurde.
Und wenn wir das tun, dann stellen wir fest - siehe da, wir können die Auflösung, die Superauflösung verbessern.
In einer Nature-Studie aus dem Jahr 2010, als wir ein multiples System hatten - DNA, zwei Farbstoffe -
aber wir dehnten ein Dutzend Systeme, also ein identisches System, auf genau die gleiche Art.
Wir stellten fest, dass die Auflösung des Zeichenabstands dieser Farbstoffe in Wasser etwa einen halben Nanometer betrug,
also 5 Angström.
Das verriet uns also, jedenfalls mit einer Genauigkeit von 5 Angström,
dass wir mit genügend Photonen eine hervorragende Auflösung erreichen würden.
Mit einem einzelnen Farbstoff jedoch erreichten wir die Grenze des Schrotrauschens;
ungefähr...das ist eine logarithmische Kurve, die durchgezogene Linie ist die Grenze des Schrotrauschens, das ist die frühere Arbeit.
Und wir stellten fest, dass Verbesserungen um den Faktor 2 oder 3 möglich sind,
doch aufgrund der Tatsache, dass die Farbstoffe unstabil sind, befindet man sich immer noch in diesem 5 nm-Bereich.
Hier habe ich ein paar Daten darüber zusammengestellt, wie unstabil die Farbstoffe sind.
Das sind die grün fluoreszierenden Protein-Farbstoffe, typische organische Farbstoffe und Quantenpunkte.
Das ist aus Wikipedia, es muss also richtig sein.
Jedenfalls ist das eine allgemeine Schätzung darüber, wie viele fluoreszente Photonen man aus diesen Proben erhält.
Für Farbstoffe sammelt man normalerweise ungefähr 10^4 Photonen, bevor sie ausbleichen,
und sie müssen in etwa einer bis zehn Sekunden gesammelt werden.
Wenn man eine größere zeitliche Auflösung wünscht, kann man nicht einfach den Laser hochdrehen,
denn wenn man das tut, erhält man doppelt angeregte Zustände der Farbstoffmoleküle, und sie würden einfach zerbersten.
In der zeitlichen Auflösung ist man also wirklich eingeschränkt.
Und wenn in PALM oder STORM Anregungen auftreten, dann dauert es ungefähr eine Minute, bis ein vernünftiges Bild entsteht.
Auch unsichtbare Lichtanregung; man macht sich immer Sorgen um Lichtschädigungen.
Ich weise darauf hin, dass diese sehr hoch aufgelösten Bilder, die in der Literatur zu finden sind,
jene, die ich gezeigt habe, in toten Zellen aufgenommen wurden, in totem Gewebe.
Dort erhält man die größte Auflösung.
Doch kann man eine ähnlich hohe Auflösung in lebenden Zellen erreichen?
Die Antwort lautet: vielleicht.
Hier sehen wir ein paar Nanoproben; eine davon ist ein Diamant-Stickstoff-Fehlstellen-Zentrum.
(NV-Zentrum; N ist Stickstoff, V ist die Fehlstelle, vacancy).
Die Lebenszeit beträgt ungefähr 20 Nanosekunden.
Und wir versuchen, den Gehalt an NV-Zentren zu optimieren.
Auch ein Silikon-Fehlstellen-Zentrum wird untersucht.
Wir glauben, dass wir, wenn wir Glück haben, ungefähr eine Milliarde Photonen pro Sekunde bekommen;
geht es schief, erhalten wir 100 Millionen Photonen pro Sekunde.
Man bewegt sich also in einer Größenordnung von mindestens eins oder zwei in einem Quantenpunkt;
drei und mehr Größenordnungen heller als eine fluoreszierender Farbstoff.
Und noch etwas: Sie bleichen überhaupt nicht aus, sind also sehr stabil.
Die Größe gleicht einem GFP.
Das ist ein aufleuchtendes GFP-Protein, das ist ein Quantenpunkt von 5 nm bzw. ein 5 nm-Teilchen,
und das sind andere bekannte Proteine, von denen Sie schon einmal etwas gehört haben.
Wir untersuchen außerdem Seltene-Erdionen.
Das stammt aus einer Website für Lasermaterialien.
Das ist Neodymium YAG, ein sehr wichtiger industrieller Laser.
Wenn man ihn vom Grundzustand aus mehrfach bis zu 808 nm anregt, kehrt er schnell wieder in diesen Zustand zurück, in den 4F3/2-Zustand.
Von dort aus erhält man Fluoreszenz bis hinunter zum Grundzustand, und man erhält all diese anderen fluoreszierenden Linien.
Diese Linie hier, 1064, ist die berühmte YAG-Laserlinie, die seit einem Dutzend...seit Jahrzehnten,
seit drei oder vier Jahrzehnten als äußerst wichtiger Laser verwendet wird.
Die Emissionsrate ist heller als bei einem Quantenpunkt, und sie hat noch weitere wichtige Eigenschaften.
Sowohl die Nanodiamanten als auch die Seltenen Erden Teilchen ermöglichen die Durchführung von STED.
Lassen Sie mich kurz darauf eingehen, was das ist.
Wenn man in einem Farbstoffmolekül vom Grundzustand in den bis zum oberen Vibrationsband angeregten Zustand eines Farbstoffs übergeht,
kehrt die Anregung schnell zum unteren Ende dieses Singulett-Zustands zurück.
Man erhält ein fluoreszierendes Photon für weitere, darunter liegende Zustände, und es entleert sich schnell.
Vor einiger Zeit schlug Stefan Hell vor, zuerst eine einzelne Laserspitze zur Anregung des Volumens zu verwenden.
Dann sendet man einen weiteren Laserstrahl mit einem Donut-Loch in der Mitte aus,
und dieser Laserstrahl entleert den angereicherten Zustand in diesem Bereich hier,
indem er ihn von der Position L2 in die Position L3 bringt.
Übrig bleibt ein winziger Fleck von Anregung hier oben in diesem angeregten Zustand; diese ganze Region hat man entleert.
Je mehr man die Intensität dieses Strahles erhöht, umso kleiner wird dieser Fleck.
In der Tat sollte die Intensität hunderte Male höher sein als diejenige Intensität,
welche die spontane Rate der stimulierten Rate angleicht.
Auf diese Weise erhält man eine bessere räumliche Auflösung.
In einem organischen Farbstoff beträgt die Lebensdauer der Farbstoffmoleküle einige wenige Nanosekunden,
und die Sättigungsintensität - also die Intensität, die von S1 bis hier stimuliert -
beträgt entsprechend der natürlichen Lebensdauer etwa 15 MW.
Um einen sehr hoch aufgelösten Fleck zu erhalten, benötigt man eine Intensität von etwa 500 MW.
Das Gute an einem seltenen System ist: Die Lebensdauer ist viel länger.
Das Schlechte daran ist:
Die Lebensdauer ist viel länger, was man aber dadurch ausgleicht, dass man viel mehr Emissionsquellen einsetzt, sagen wir 500.
Aber entscheidend hierbei ist, dass die Sättigungsintensität um etwa vier Größenordnungen abgenommen hat.
Deshalb ist die Anwendung der STED-Technik mit Seltenen Erden viel leistungsstärker.
Wenn Sie herausfinden wollen, was die STED-Technik - das ist eine Wiederholung; ich gehe jetzt nicht darauf ein.
Nun - da die Intensitäten höher sind, kann man multiple Interferenzen nutzen.
Wenn man in das Objektiv eines Mikroskops drei Laserstrahlen einfallen lässt
und das Objektiv auf einen Punkt scharfstellt, bildet sich ein Muster -
es ist nicht genau dieses Muster, aber ein Muster von Knoten und Bäuchen in einer Dreiecksform.
Und wieder sättigt man alles außer kleinen Flecken, und man stellt fest,
dass man schon mit einem handelsüblichen YAG-Laser in der Lage sein sollte, eine räumliche Auflösung von etwa 30 nm zu erreichen.
Nun, wo liegt der Unterschied zu STORM oder PALM?
Man regt die Probe an und wartet darauf, dass die natürliche Lebensdauer abläuft.
Es ist also nicht mehr nur ein kleiner Bruchteil der Anregung.
Man sieht, man sammelt die gesamte Fluoreszenz.
Anstatt also nur, sagen wir, ein, zwei, drei oder fünf Prozent des Bereichs anzuregen, regt man diesen gesamten Bereich an,
nur dass er viel kleiner ist.
Die Datenerfassungsrate zur Aufnahme eines vollständigen Bildes ist also mindestens um zwei Größenordnungen schneller.
Deshalb glauben wir, dass wir zumindest nachberechnen können -
dass wir ungefähr einer halben Sekunde ein vollständiges Bild mit einer Auflösung von 30 nm aufnehmen können.
Das ist ein weiterer Vorteil.
Hier haben wir noch eine Anwendung.
Ich kann Ihnen allerdings nichts davon erzählen, und wir haben noch nichts gemacht.
Ich bekomme nämlich erst in zwei Wochen ein Labor, und meine Postdoktoranden kommen in einer Woche.
Wir können es also kaum erwarten, dass wir damit anfangen können.
Wir haben noch eine Gruppe gebildet, eine für Neurowissenschaften - eine informelle Gruppe für Neurowissenschaften.
Das ist Lang Lang; ich bin ein Groupie von Lang Lang.
Wir haben viel darüber gesprochen, was wir in der Neurowissenschaft verwenden können;
wie wir diese neuen Methoden in der Neurowissenschaft anwenden können.
Es gibt faszinierende Möglichkeiten.
Ich glaube nicht, dass ich den Großteil dieser Möglichkeiten erschöpfend behandeln kann.
Jedenfalls aber hat sich gezeigt, dass in dieser kleinen Abteilung, der ich angehöre, molekulare und zelluläre Physiologie...
Tom Sudhof ist dabei, Axel Brunger auch, ebenso Brian Kobilka.
In einer Fakultät mit zwölf Abteilungen haben wir einen guten Start hingelegt.
Wie auch immer.
Das überspringe ich...was wir versuchen...
wir haben versucht, mit einer Auflösung von einer Millisekunde zuzusehen, wenn Neuronen...
wenn es in einer Synapse eine Spannungsspitze gibt, die ein Vesikel, durchschnittlich ein Vesikel pro Spannungsspitze freisetzt.
Können wir die Synapsen-Freisetzung mit einer Auflösung von einer Millisekunde erfassen?
Wenn die Neurotransmitter freigesetzt werden, wandern sie zu Rezeptoren auf der anderen Seite,
sie machen eine Reihe komplexer Vorgänge mit, chemischer Vorgänge,
die zur Phosphorylierung von Molekülen auf der anderen Seite führen.
Können wir diese Phosphorylierung sehen?
Das überspringe ich.
Ich sage nur Eines dazu:
Wir entwickeln auch ein Verfahren zur Sichtbarmachung der Phosporylierung
oder anderer chemischer Veränderungen im Bereich des molekularen Fußabdrucks in der Zelle - es wäre sehr schön, das zu können.
Wir führten ein Toy-Experiment durch, das wir im Jahr 2012 publizierten; dabei entnahmen wir einer Synchrotronstrahlung Licht.
Wir sandten es durch einen Mikrointerferometer, gaben es auf eine Probe und untersuchten das zurückgestreute Licht.
Dahinter steckte folgende Idee:
Wenn man zum Beispiel eine Zelle mit einem Liganden stimuliert
- in diesem Fall war es eine PC12-Zelle, und stimulierender Ligand war der Nervenwachstumsfaktor -
dann hat das die Differenzierung der PC12-Zelle zur Folge.
Und wenn man zwei Tage lang das Infrarotspektrum untersucht, findet man verschiedene Linien, die sich tatsächlich verändern.
Wir beschäftigten uns ein bisschen mit Mikroskopie; es war sehr grobe Mikroskopie - die Maßstableiste zeigt 50 Mikron an.
Hier ändert sich die Wellenzahl, und man sieht chemische Veränderungen in der Zelle.
Nun, das ist absolut uninteressant, weil die räumliche Auflösung schrecklich ist.
Die Frage lautet also: Kann man eine bessere räumliche Auflösung erreichen?
Räumliche Superauflösung?
Die Antwort lautet: Jan, wir können - wir glauben, dass wir das können.
Das ist die Darstellung eines Mikroskopobjektivs, eines hoch auflösenden visuellen Objektivs.
Doch wenn man sich das untere Ende dieses Objektivs ansieht, dann sieht man...mehr als eine halbkugelförmig geformte Oberfläche.
Das ist die abschließende Stelle, an der diese Objekte mit hoher numerischer Apertur scharfstellen.
Die Idee ist jetzt:
Wir nehmen ein Infrarotobjektiv, entweder reflektiv oder lichtdurchlässig, mit einer numerischen Apertur von etwa 0,7;
das ist die größte Öffnung, die man käuflich erwerben kann.
Und man konzipiert ein abschließendes Element, das aus Germanium besteht.
Warum Germanium?
Das will ich Ihnen sagen - es liegt daran, dass der Brechungsindex von Germanium 4 ist, nicht 1,5.
Und wenn man ein Blickfeld von 50 Mikron auf einer Seite hat, macht man sich um chromatische Aberration keine großen Sorgen.
Man sollte in der Lage sein, eine numerische Apertur von etwa 1,4 zu erhalten,
wenn es ein visuelles Mikroskop mit einer Anfangsbrechung von 1,5 wäre.
Das gibt uns eine Vorstellung davon, wo unser sin(Theta) liegen sollte, nämlich bei etwa 0,93.
Wenn sin(Theta) bei 0,93 liegt, dann bedeutet das, man nutzt Licht von zehn Mikron,
was im Bereich des Infrarotsignals der Phosphorylierung liegt.
Man hat ein Objektiv mit sehr großer numerischer Apertur,
und wir glauben, wir können eine Auflösung von vielleicht 1,3/1,4 Mikron erreichen, auch wenn das Licht bei nur zehn Mikron liegt.
Und da sich dieses Licht nur schwer durch das Wasser fortpflanzt, liegt die Eindringtiefe bei etwas über zehn Mikron.
Es handelt sich um eine Immersion, es wird ins Wasser getaucht;
das ist eine kleine Mikrolinse, die sich jetzt direkt auf der Zellenoberfläche befindet, und das führt zu einer Weißfeldfbeleuchtung.
Das ist aber erst der Anfang; wir machen hier nicht Halt.
Wir wollen...das ist der abschließende Teil einer Abhandlung, die ich zusammen mit Michael Fee, jetzt Neurobiologe,
geschrieben habe, als er bei mir studierte; außerdem mit Ted Hänsch.
Wir sandten Mikrowellenstrahlung durch eine Miniatur-Koaxialkabel mit einem Durchmesser von vielleicht 1,5 mm.
Diese kleine zentrale Ader schärften wir mit einer Feile.
Wenn man darüber nachdenkt...die elektromagnetische Strahlung, die durch dieses Koaxialkabel strömt, gibt immer noch weißes Licht ab.
Sie pflanzt sich mit Lichtgeschwindigkeit fort, modifiziert durch das dielektrische Material.
Die Wellenlänge ist irrelevant.
Das kann man alles in dieses kleine Koaxialkabel packen,
denn auch bei einer Wellenlänge von zehn Metern pflanzt sich die Strahlung mit Lichtgeschwindigkeit fort.
Sie wird durch die Ader lokalisiert.
In diesem Toy-Experiment sandten wir elektromagnetische Strahlung aus, und sie wurde reflektiert.
Wir untersuchten die Interferenz zwischen dem reflektierten Licht und einem Referenzstrahl, den Kreuzterm -
das ist eine sehr empfindliche Art und Weise, eine Phasenverschiebung zu entdecken, irgendeine Änderung.
Und wenn wir es über ein 100-Mikron-Netz senden, dann können wir Änderungen der Phasenverschiebung sehen.
In diesem Toy-Experiment verwendeten wir Mikrowellenstrahlung in einem Maßstab von ein paar Zentimetern,
und wir erhielten eine Auflösung von weit über 4.000.
In derselben Abhandlung schlugen wir Folgendes vor:
Übrigens kann man das auch im Infrarotbereich machen, da die Eindringtiefe der Metalle und alles andere das zulassen.
In dieser Abhandlung von zweieinhalb Seiten wiesen wir also darauf hin -
ja, Nahfeld im Infrarotbereich ist möglich, mit einer sehr guten räumlichen Auflösung.
Das war 1989.
Ich wandte mich wieder dem Einfangen und Kühlen von Atomen und der Atominterferometrie zu.
Ted ging zurück zum Wasserstoff.
Wir hätten berühmt werden können, aber...
Wie auch immer.
Nach meiner viereinhalbjährigen Auszeit in der Regierung kam ich zurück und sagte:
Ich möchte mich mit Infrarotspektroskopie befassen.
Als ich einen Vortrag am Lawrence Berkeley Lab hielt, erfuhr ich, dass sie tatsächlich wiederentdeckt worden war.
Das ist ein Stück Silikon, anisotrop, die Kanten zu einer Pyramide geformt.
Nicht alle Seiten, sondern nur zwei Seiten wurden mit Metall beschichtet.
Wenn alle Seiten mit Metall beschichtet sind, wird es zu einem Wellenleiter.
Mit zwei Metallseiten ist es eine Übertragungsleitung.
Und da es eine Übertragungsleitung ist, kann man die elektromagnetische Strahlung in ein kleineres Volumen quetschen.
Das ist die Berechnung davon.
Hier auf der Spitze mit einer Breite von 40 nm sieht man das erweiterte elektromagnetische Feld.
Das ist es, was wir vorhaben.
Wir wollen Spitzen wie diese in Verbindung mit superauflösender sichtbarer Strahlung und Nahinfrarotstrahlung verwenden,
wiederum direkt über der Zelle schwebend.
Wir hoffen, mit dieser Technik eine Auflösung, eine chemische Auflösung im Bereich von zehn Nanometern zu erhalten.
Das steht also auf dem Plan.
Bleiben Sie dran; vielleicht kann ich in sechs Monaten oder in einem Jahr einige experimentelle Ergebnisse vorlegen.
Jedenfalls aber ist das der Grund dafür, warum ich es Mikroskopie 2.0 nenne;
man kann wirklich eine räumliche Auflösung von weit über 100 oder besser erhalten,
nicht nur im sichtbaren Bereich und im Nahinfrarot, sondern auch in lebenden Zellen.
Haben wir erst einmal eine Bildgebung von Millisekunden, ist die Bewegung in lebenden Zellen nicht mehr relevant.
Diese Bewegung, durchschnittlich eine Sekunde oder Zehntelsekunden, verhindert eine echte Superauflösung.
Ich schließe mit diesem Bild des Leeuwenhoek-Mikroskops.
Ich darf Sie daran erinnern, dass das ein Mikroskop mit einem Objektiv war,
doch das Zentrum dieses Objektivs ist eine kleine Glaskugel.
Das ist das abschließende Fokuselement unseres Infrarotobjektivs.
Es geht also zurück bis ins Jahr 1700; die Dinge ändern sich nicht wirklich.
Optik ist immer noch Optik.
Vielen Dank.