Ich freue mich sehr, wieder hier sein zu können.
Und ich werde auch diesmal über unsere Forschung zum Ribosom berichten und wie wir letztendlich versuchen,
die Antibiotikaresistenz zu verstehen.
Ich möchte Ihnen kurz erzählen, wie ich… wie mein Weg war.
1968 schlug mir Brian Hartley, ein Enzymologe in Cambridge am LMB, mein erstes Projekt vor.
Er kam in der Eingangshalle in Cambridge, wo man sich üblicherweise begegnete, auf mich zu und sagte:
„Erzähl mir, was du in deinem nächsten Job machen willst?“
Und ich antwortete: „Nun, ich möchte zur Struktur des Aminoacyl-tRNA-Synthetasekomplexes mit tRNA arbeiten.“
Er klopfte mir auf die Schultern und sagte:
„Mein Junge, du solltest etwas tun, was du tun kannst. Ich schlage Hexokinase vor.”
(Lachen)
Ich bedankte mich bei ihm und rannte ins Labor, um herauszufinden, welche Bedeutung die Hexokinase hat.
Und ich fand heraus, dass Dan Koshland die Hexokinase als ein Modell dafür verwendet hatte,
wozu man das „Induced fit”-Konzept braucht.
Er stellte nämlich die Frage: Warum wird dieses ATP in Abwesenheit von Glucose nicht hydrolysiert,
wenn doch Glucose nur ein Wassermolekül mit einigen Kohlenstoffatomen ist?
Und er sagte: Das ist deshalb der Fall, weil die Glucose…
Er vermutete, dass Glucose die Konformationsänderung herbeiführt, die für die Katalyse benötigt wird.
Wir sagten also: Okay, das wollen wir herausfinden.
Und wir klärten die Struktur der Hexokinase ohne Glucose auf.
Und dann machten wir das Gleiche mit Glucose.
Und das funktioniert tatsächlich (klick).
Koshland hatte also Recht.
Aber dann beschlossen wir, dass wir noch weitergehen sollten.
Und nachdem ich sowohl in Harvard als auch in Cambridge gewesen war und sowohl Watson als auch Crick kannte,
hielt ich es für wichtig, das zentrale Dogma zu untersuchen, das Crick aufgestellt hatte.
Nämlich: DNA wird in DNA kopiert.
So arbeiteten wir also lange, lange Jahre an der Replikation, dem Replisom,
das durch RNA-Polymerasen auf RNA transkribiert und in dieser Phase reguliert wird.
Wir haben das viele Jahre lang untersucht.
Letztendlich, wie Sie im letzten Vortrag gehört haben, greift das Ribosom den „Lochstreifen“ ab
und arrangiert die tRNase für die Proteinsynthese auf dem Ribosom.
Und deshalb werde ich mich hier auf diese letzte Phase konzentrieren.
Nur als Randbemerkung:
1989 rund 20 Jahre nach meinem Gespräch mit Brian Harley
klärten wir die Struktur des Glutamyl-tRNA Synthetasekomplexes mit Glutamin-tRNA auf.
Das war sehr… das war das erste Mal und es war sehr interessant.
Und wieder einmal hatte Hartley Recht behalten.
Man muss sich zum richtigen Zeitpunkt mit dem richtigen Problem befassen.
Es ist großartig, tolle Ideen zu haben, aber man muss sie auch zum richtigen Zeitpunkt umsetzen.
Wir entschieden uns dann, mit dem Ribosom zu beginnen.
Das hier hat mir Jim Watson über das Ribosom erzählt, als ich in Harvard war.
Große Untereinheit, kleine Untereinheit, tRNA an der E-Stelle, P-Stelle, Peptid.
Und dann findet die Synthese statt.
Einiges war damals noch nicht bekannt.
Man kannte die Struktur der tRNA nicht.
Man wusste nicht, dass es einen Tunnel für den Ausgang gab.
Man wusste nicht, dass es die E-Stellen-tRNA gibt.
Und auch strukturelle Details waren nicht bekannt.
Und dann führte Jim Lake einige Untersuchungen des Ribosoms mit dem Elektronenmikroskop durch.
Er beschäftigte sich mit den einzelnen Untereinheiten und stellte fest, dass sie sich aneinander drücken,
um einen Komplex zu bilden.
Das war schon ziemlich gut, sagte aber immer noch nicht viel über die molekularen Details aus.
Und dann veröffentlichte Joachim Frank schließlich 1995 diese Kryo-EM.
Das war die erste Kryo-EM.
Inzwischen ist diese Methode so richtig durchgestartet, würde ich sagen.
Aber damals hatte das noch eine relativ geringe Auflösung.
Und die Positionen der tRNA waren nicht exakt richtig, aber auf einem guten Weg.
Deshalb beschlossen wir 1995, weiter an der Aufklärung der Ribosomenstruktur zu arbeiten.
Und da hatten vor allem zwei Menschen eine zentrale Bedeutung: Nenad Ban und Poul Nissen, die die Kristalle züchteten,
mit der Bestimmung der Struktur begannen und wichtig für die Aufklärung der Struktur der ribosomalen 50S-Untereinheit waren.
Und so sah die Kryo-EM mit geringer Auflösung aus.
Man kann die Struktur irgendwie erkennen.
Da hält jemand eine Taschenlampe auf seinen Knien.
Es ist sehr schwer, daraus die molekularen Details zu entnehmen.
Aber 1998 hatten wir unsere erste Karte mit einer Auflösung von 9 Angström.
Da waren zum ersten Mal ein paar Details zu erkennen, das hatte aber die gleiche Form.
Wir wussten also, dass wir auf dem richtigen Weg waren.
Und dann machten wir mit einer höheren Auflösung weiter.
Und 2000 hatten wir dann eine Karte mit einer Auflösung von 2,4 Angström.
Und das hier ist die Struktur der ribosomalen 50S-Untereinheit, wie wir sie im Jahr 2000 sahen.
Und die dichte Bepackung der RNA war für uns und alle ziemlich überraschend.
Wir hatten keine Vorstellung, dass RNA so dicht gepackt sein konnte.
Und hier ist das Peptidyl-Transferase-Zentrum mit dem markanten Inhibitor.
Meistens ist kein Protein in der Nähe.
Und es gibt jede Menge dicht gepackte RNA und Proteine sind auf der Oberfläche verstreut.
Wenn man die Ribosom-Untereinheit wie einen Apfel halbiert, sieht man das Peptidyl-Transferase-Zentrum.
Und jetzt erkennen Sie den Tunnel, rund 100 Angström lang.
Das Grüne sind die Proteine, die in das Innere des Ribosoms reichen.
Kleinste Teilchen des Proteins dringen also in das Ribosom ein und stabilisieren die Struktur.
Aber Sie sehen, wie dicht die RNA, in Weiß, gepackt ist.
Hier ist die ribosomale 70S-Untereinheit mit der RNA darum herum, die eine komplexe Struktur bildet.
Hier sehen Sie das.
Sehr komplex.
Um Watson falsch zu zitieren: RNA ist nicht so langweilig wie DNA.
Es hat eine sehr komplexe Struktur.
Und die Proteine sind rundum auf der Oberfläche verstreut.
Und die tRNA, das dekodierende Zentrum, wie Sie gehört haben, befindet sich in der kleinen ribosomalen Untereinheit.
Die Bildung von Peptid-Bindungen erfolgt in der großen Untereinheit.
Eines der Dinge, die wir herausfinden wollten,
war die Quelle der katalytischen Eigenschaften des Ribosoms und der Bildung von Peptid-Bindungen.
Crick hatte 1968 die Hypothese aufgestellt, dass das Ribosom ein Ribozym sei,
wobei er sich natürlich die Frage realisierte, wie es sein könnte,
dass eine Maschine, die Proteine herstellt, aus Protein bestehen kann, bevor ein Protein da ist?
Deshalb vermutete er, dass es sich um RNA handeln musste.
Und in der Tat fanden wir heraus, dass das stimmte.
Ich hatte einen fantastischen Doktoranden, Martin Schmeing,
der diese Arbeit initiiert hat und den größten Teil der Arbeiten durchgeführt hat,
über die ich kurz erzählen werde und der das Video hergestellt hat, dass Sie noch sehen werden.
Und das ist die Reaktion, die vom Ribosom katalysiert wird.
Wir haben eine Aminosäure an der A-Stellen-tRNA.
Die Alpha-Aminogruppe attackiert den Carbonyl-Kohlenstoff der Peptidylgruppe
und die Peptidyl-tRNA an der P-Stelle bildet ein vierflächiges Zwischenprodukt, das dann aufbricht und die Produkte ergibt.
Ich werde Ihnen einige Ergebnisse der strukturellen Arbeit zeigen,
aber in der 50S-Untereinheit verwenden wir nur CCA-Aminosäure oder Peptid.
Inzwischen kann man natürlich das ganze Ribosom und die tRNase verwenden und das haben wir auch gemacht.
Also nochmal: Wenn man die ribosomale 50S-Untereinheit halbiert, hat man hier den Polypeptid-Ausgangstunnel.
Innerhalb des angezeigten Feldes erfolgt die Bildung der Peptid-Bindung.
Und dann, ohne all die vielen, vielen Strukturen zu besprechen, die aus dem Substratkomplexen aufgeklärt wurden,
ist schließlich hier das, was Martin Schmeing und Kollegen…was er im Labor herausgefunden hat,
was an der katalytischen Stelle passiert.
Die Ausrichtung des P-Stellen-Substrats hier, der Carbonyl-Kohlenstoff, der angegriffen wird, hier.
Und das ist die Alpha-Aminogruppe vom A-Stellen-Substrat in einer Position,
in der sie den Carbonyl-Kohlenstoff attackieren kann, der hier mit dem 2’-OH interagiert und durch A2451 ausgerichtet wird.
Welcher Mechanismus liegt dem zugrunde?
Heute wissen wir wesentlich mehr und ich werde nicht auf die Details eingehen,
weil das im Rahmen dieses kurzen Vortrags zu viel wäre.
Aber den ersten Verständnisschritt dazu hat Andrea Barta in Österreich beigetragen.
Ihr Labor vermutete einen Protonenshuttle-Mechanismus, bei dem ein Proton von der Alpha-Aminogruppe,
von der angreifenden Aminogruppe, auf die zurück gelassene 3‘-OH-Gruppe übertragen wurde.
Später haben wir herausgefunden, dass es ein wesentlich größeres Netz von Wasserstoffbrücken gibt,
insbesondere Wasser und andere Seitenketten.
Aber auf jeden Fall erfolgt eine Art Protonenshuttle.
Woher kommen diese katalytischen Eigenschaften?
Tatsächlich ist die primäre Quelle der katalytischen Eigenschaften
wie bei den meisten Enzymen die richtige Ausrichtung der Substrate für die Chemie.
Die lästige Entropie, die die Moleküle herumwandern lässt, soll beseitigt werden.
Der Protonenshuttle-Mechanismus trägt chemisch zu diesem Vorgang bei.
Und es könnte eine gewisse Stabilisierung des Übergangszustands dazukommen, zu dem die meisten Enzyme beitragen.
Es gibt viele Schritte in der Ribosom-Protein-Synthese.
Und es läuft ein Elongationszyklus ab, bei dem es eine Peptidyl-tRNA an der P-Stelle gibt,
eine leere A-Stelle und einen EF-Tu-Proteinfaktor, der eine tRNA liefert.
Und dann zieht er sich zurück und die tRNA mit der Aminosäure ist ausgerichtet.
Und so kommt es zur Bildung von Peptid-Bindungen.
Das hier ist eine Darstellung der Prozessstruktur mit geringer Auflösung.
Aber wir müssen wissen, wie der Prozess abläuft.
Und dann kommt dieser andere Faktor, der Elongationsfaktor G, EF-G, ins Spiel und verursacht eine Translokation.
Die Frage, die ich mir dann stelle, ist: Wie ist das möglich?
Alles, was man weiß, ist, dass dieser Faktor eintrifft und irgendwie „vorbeigleitet“.
Aber das muss wesentlich komplexer sein als das.
Wie also entwickelt sich das von hier nach da?
Was verursacht diese Veränderung?
Was macht der EF-G?
Das passiert nicht so mal eben.
Und wir haben herausgefunden, dass das stimmt.
Mit Peter Moore,
einem über all die Jahre sehr wichtigen Kollegen in diesem Projekt haben wir die Struktur EF-G an sich aufgeklärt.
In jüngerer Zeit haben wir sogar die Struktur von Komplexen aufgeklärt.
Das Labor von Ramakrishnan hat diese Struktur des Komplexes von EF-G im Posttranslokationszustand aufgeklärt.
Wir haben die Struktur vor kurzem aufgeklärt.
Hoffentlich finden wir ein Fachjournal, das zur Veröffentlichung bereit ist,
weil das so neu ist und man muss… die wollen einfach so etwas gar nicht veröffentlichen.
Und die kompakte Konformation.
Dieser Faktor, die Komponenten des Faktors haben sich weit von dem Punkt,
an dem sie sich im Elongationskomplex befinden, wegbewegt.
Wenn Sie die 4 betrachten und sehen, wo sich die 4 hinbewegt.
Sie hat sich enorm bewegt.
Und deshalb ist die Frage: Was passiert da?
Man kennt diese beiden sehr großen Veränderungen in der Struktur.
Was geschieht?
Das schwingt da herein, wie hier dargestellt.
Und deshalb denken wir, dass vielleicht die Konformationsänderung Ursache der Translokation ist.
Wir können ein Video davon mit dem sich bewegenden Teil herstellen.
Also wir gehen davon aus, dass es die Konformationsänderung ist,
die auf dem Weg von diesem Prätranslokationsstatus zum Posttranslokationsstatus geschieht,
die die tRNase zur nächsten Stufe treibt.
In den letzten zehn Minuten meines Vortrags
möchte ich meine Aufmerksamkeit erneut auf die Antibiotika und die Antibiotikaresistenz richten.
Sie haben viele Artikel über die Probleme der Antibiotikaresistenz und die daraus resultierenden Todesfälle gelesen.
Die Frage ist, wie Antibiotika sich an die ribosomale 50S-Untereinheit binden
und welche Resistenzmechanismen bestehen.
Sie haben gerade einige Gedanken dazu gehört.
Unsere Arbeit wurde ursprünglich von Jeff Hanson, einem Postdoc-Mitarbeiter durchgeführt und dann von anderen fortgesetzt.
Die tRNA-Bindungsstelle, hier ein Schnitt durch das Ribosom.
Es gibt verschiedene Orte für Antibiotika, über die wir reden werden.
Tuberactinomycine hier, Capreomycin und Viomycin binden neben dem Dekodierungszentrum.
Und sie spielen eine wichtige Rolle für TB.
Sie sind A-Bindungsstellen-Inhibitoren, worauf ich aber hier nicht eingehe.
Und die Makrolide sind so ein bisschen etwas wie eine Bindung in den Tunnel hinein, ein bisschen.
Und wir haben viele von ihnen untersucht, aber ich werde nur beispielhaft über einige reden.
Bei den Makroliden gibt es verschieden große Makrolidenringe, die alle an derselben Stelle im Tunnel binden.
Ihre unterschiedlichen Substituenten interagieren mit der ribosomalen RNA in unterschiedlicher Weise.
Die Seitenkettenbasis vom Ribosom kann sich verändern.
Aber meistens ist das Ganze ziemlich stabil.
Und das hier ist die Stelle, an der die Bildung der Peptid-Bindung erfolgt.
Das Makrolid blockiert also den Prozess.
Wie funktioniert das?
Wenn man sich hier im Aufriss erneut den Tunnel anschaut, sieht man die Bindungsstelle.
Das Makrolid ist rot.
Die Basen sind in Grün dargestellt und deren Mutation verursacht die Resistenz.
Und Sie sehen, dass sie alle miteinander interagieren.
Diese gesamte Gruppe interagiert mit dem Makrolid.
Und so könnte man, wie ich denke richtigerweise, annehmen,
dass die Änderung in der Form der Bindungsstelle die Bindung verhindert.
Das hier ist ohne Makrolid.
Und das hier ist mit Makrolid.
Wir blicken den Tunnel hinauf.
Wie wirkt nun das Makrolid?
Es wirkt durch einen Vorgang, den ich als molekulare Obstipation bezeichne.
Es blockiert den Austritt des Polypeptids aus dem Tunnel.
Die Mutation von A2058 auf ein G verringert die Bindungskonstante um das 10.000-fache.
Und das ist ein G im Haloarcula marismortui und dieser Organismus bindet nicht viel Antibiotika.
Und wenn wir uns anschauen, wo das Makrolid bindet, sieht man,
dass sich das N2 von diesem G hier direkt unter dem Makrolidring befindet.
Für diese Untersuchung haben Daqi Tu und Gregor Blaha im Haloarcula das G zu einem A mutiert
und es so zu einem Pseudobakterium gemacht.
Die Bindungskonstante veränderte sich um viele Größenordnungen.
Wir konnten sehen, wo es gebunden hat.
Und tatsächlich bindet es exakt an der gleichen Stelle, in derselben Ausrichtung, mit der Ausnahme,
dass der Makrolidring verdrängt wird, vermutlich wegen dieser lästigen N2, die die Position einnimmt.
Was machen wir mit diesen Informationen?
Es gibt verschiedene Antibiotikafamilien, die an viele Stellen und benachbarte Stellen binden,
wie Sie im letzten Vortrag gehört haben.
Die Bindungsstellen neben dem Peptidyl-Transferase-Zentrum liegen dicht beieinander.
Einige von uns, die Interesse an diesem Gebiet haben, haben eine Firma gegründet, Rib-X, heute Melinta Therapeutics,
die diese Strukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika nutzt.
Und die Folien, die ich jetzt zeige, stammen alle von denen.
Ich bin also nur der Überbringer der Botschaft.
Hier ist also wieder das Peptidyl-Transferase-Zentrum mit verschiedenen Antibiotikafamilien,
die alle dicht aneinander im Peptidyl-Transferase-Zentrum gebunden sind.
Und worum es dann geht…die Strategie ist, ein Stück von einer zu nehmen
und sie chemisch mit einem Stück von einer anderen zu verbinden.
Hier sind also beispielsweise drei Antibiotika.
Und das erste mit der Bezeichnung Radezolid hat eine ziemlich erhöhte Potenz.
Und dazu möchte ich noch etwas erklären.
Hier werden erneut Fragmente miteinander kombiniert.
Und dann kann man das Makrolid kombinieren.
Und am wichtigsten ist es - und ich habe keine Folien, um Ihnen zu zeigen, was die tatsächlich gemacht haben -,
diesen gesamten Bereich zu nehmen und eine völlig neue Antibiotikafamilie zu entwickeln.
Und das sieht ziemlich vielversprechend aus,
was die Bekämpfung von gram-positiven und gram-negativen Bakterien betrifft.
Das ist die RX-01 Familie.
Diese nimmt Linezolid, die bei zahlreichen Stämmen nicht wirksam ist.
Rot ist schlecht, alles über 4 ist schlecht, sehr schlecht.
Wenn man Radezolid nimmt, die Kombination, funktioniert das sehr gut.
Und das gilt auch für verschiedene Enterokokken.
Sie sehen, dass Linezolid nicht zu großartig ist.
RX-02, das ist das verbesserte Makrolid.
Genau das gleiche.
Wenn man das Makrolid betrachtet, das Azithromycin... sehr schlecht, sehr, sehr, sehr schlecht,
128 ist nichts gegen all diese Stämme.
Stellt man die Kombination her, wird alles richtig gut.
Die Strategie funktioniert also.
Und ich sollte vielleicht einfach sagen, dass es funktioniert und dass es entwickelt wird.
Linezolid hat die klinischen Studien der Phase 2 absolviert.
Und weitere Dinge sind auf den Weg gebracht.
Und dann noch eine Anmerkung zu den A-Bindungsstellen.
In unserer Arbeit weisen wir nach, dass Viomycin und Capreomycin an die A-Stelle binden.
Und es bindet an die kleine Untereinheit.
Und dort ist die Bindungsstelle.
Sie interagiert mit den großen und kleinen Untereinheiten.
Und hier ist zu sehen, wo sich das befindet.
Es interagiert mit dem tRNA der großen Untereinheit und der kleinen Untereinheit.
Und an dieser Stelle erfolgt die Dekodierung.
Dadurch wird das Ribosom in dieser Position blockiert.
Es kann sich also nicht weiterbewegen.
Das ist gut zu wissen.
Aber was kann man damit machen?
Es hat sich herausgestellt, dass jetzt viele Verbindungen bekannt sind, die in dieser Nachbarschaft binden.
Es ist das Viomycin hier, aber das gilt auch für viele andere Verbindungen.
Und wenn man Geld locker machen könnte für ein TB-Antibiotikum – was nicht so naheliegend ist –
und wenn man ein Pharmazieunternehmen dazu bewegen könnte, so etwas zu entwickeln, könnte man die, so vermute ich,
in irgendeiner Weise kombinieren oder einfach die Oberfläche nutzen,
um eine neue Verbindung zu entwickeln, die gegen TB wirksam wäre.
Die Idee ist also ist die, diese Informationen zur Entwicklung eines Antibiotikums zu nutzen,
das gegen all diese resistenten Stämme wirksam wäre.
Und das ist ein großes Problem, weil der XDR-Stamm gegen alles resistent ist.
Das ist ein bedeutender Punkt, auf den ich noch hinweisen möchte.
Nämlich der, dass Grundlagenforschung sehr wichtig ist.
Grundlagenforschung zur Struktur und Funktion des Ribosoms führt zur Entwicklung neuer Antibiotika,
die sich als wirksam gegen resistente Bakterienstämme erweisen.
Es gibt eine Menge Anstöße in den USA und an anderen Orten für die NIA, die Translationsforschung zu unterstützen.
Und ich muss sagen, dass die einzige Translationsforschung, die ich befürworte, die Ribosom-Forschung ist.
Und hier damit möchte enden.
Vielen Dank.
Applaus..