Guten Morgen.
Astrid, ich danke Ihnen, und ich weiß es zu schätzen, wieder hier zu sein.
Es könnte sein, dass einige von Ihnen nach Sir Harold Krotos wunderbarer Präsentation,
dem großartigen Überblick über Wissenschaft, Gesellschaft und Nachhaltigkeit, eine Art Kulturschock erleben werden,
denn wir kehren zurück zur Welt der Moleküle, und um so mehr deshalb,
weil ich heute die Zerstörung von Molekülen besprechen möchte.
Es geht also um einen Begriff, der negativ besetzt ist, aber Sie werden sehen,
dass er absolut notwendig ist, um das Leben zu erhalten.
Das tut mir also sehr leid.
Astrid kündigte mich als dem Max Planck-Institut für Biochemie zugehörig an.
Das ist zwar noch richtig, aber seit meiner Pensionierung arbeite ich auch an anderen Orten, wie Sie hier sehen.
Ich spreche nun von der Zerstörung von Proteinen – ein negativ besetzter Begriff, aber absolut notwendig,
um das Leben zu erhalten.
Die Proteolyse der Peptid-Hydrolyse ist eine sehr einfache chemische Reaktion,
bei der man eine Säure oder eine Base zum Kochen bringt und die wir in allen Details nachvollziehen können,
aber die Natur verwendet Enzyme.
Und sie verwendet viele davon.
Für einen solch einfachen chemischen Prozess ist das überraschend.
Was Sie hier nun sehen, ist eine große Anzahl von Proteinasen-Familien,
die sich alle unterschiedlicher Mechanismen bedienen und dreidimensionale Strukturen haben.
Warum besitzen wir so viele von diesen Proteinasen?
Nun, wir haben so viele davon, weil sie wichtig und an der Regulierung physiologischer Prozesse beteiligt sind.
Weil also die proteolytische Aktivität sehr gefährlich sein und essenzielle Proteinmoleküle
in oder außerhalb von Zellen zerstören kann, wird die proteolytische Aktivität auf allen Ebenen
– Transkription, Translation, Aktivierung, Hemmung und Abbau – sehr streng reguliert.
Was ich heute schildern werde, sind die unterschiedlichen Mechanismen von Aktivierung und Hemmung.
Und was Sie hier in diesem Cartoon sehen, sind die verschiedenen Modi, die Mechanismen der Regulierung,
die wir in unseren Studien durch die strukturelle Biologie von Proteinase-Strukturen und ihre Mechanismen gefunden haben.
Dieser Cartoon, den ich kurz durchgehen werde,
basiert größtenteils auf Untersuchungen zur strukturellen Biologie und auf funktionalen Untersuchungen.
Aber es ist ziemlich klar, dass Proteinasen für viele Krankheiten und bösartige Tumore wesentlich sind.
Daher existiert ein großes Interesse an diesen Strukturen und ihren Mechanismen,
sowohl in Bezug auf Medikamente als auch auf den Pflanzenschutz.
Ich werde einige dieser Aspekte während meines Vortrags anhand spezifischer Moleküle erwähnen und beschreiben.
Lassen Sie mich also kurz diese verschiedenen Arten von Mechanismen durchgehen,
die wir in unseren Untersuchungen der Struktur gefunden haben.
Es gibt die einfache Interaktion der grünen Proteinase mit dem entsprechenden roten Proteinase-Inhibitor.
Dies war, genau genommen, das erste Beispiel einer Proteasen-Regulierung, die wir in den späten 1960er,
frühen 1970er Jahren sahen, und die daran beteiligten Inhibitor-Moleküle waren BPTI und die Kazal-Inhibitoren waren BUSI.
Sie haben von BUSI als dem Paradigma für die Entwicklung der Protein-Kernspinresonanzspektroskopie gehört.
Es sind sehr kleine Proteinmoleküle.
Die Regulierung erfolgt durch Substratspezifität.
Einige der Proteasen sind äußerst spezifisch.
Das lässt eine Peptidbindung in den Millionen von Peptidbindungen,
auf die sie im Laufe ihres Lebens innerhalb oder außerhalb von Zellen treffen, übrig.
Die Spezifität kommt durch eine komplexe Bindungsoberfläche zustande.
Somit ist sterische Komplementarität erforderlich, elektrostatische Wasserstoffbindung.
Es gibt eine proenzymatische Spaltung.
Die meisten Proteasen werden als Proenzyme synthetisiert, die inaktiv sind,
und die Aktivierung erfolgt durch Spaltung des Pro-Teils, ein begrenzter Proteolyse-Schritt.
Und das muss nicht unbedingt eine strukturelle Veränderung nach sich ziehen, so dass es sein kann,
dass der Pro-Teil einfach physisch die Substrat-Bindungsstelle blockiert,
oder es kann eine tiefgreifende Strukturänderung nach sich ziehen – es gibt Beispiele für beide Mechanismen.
Es gibt eine Regulierung durch Kolokalisierung, bei der sowohl die Protease als auch das Substrat membranverankert sind.
So gehören zum Beispiel alle Gerinnungsenzyme zu diesem Typ,
um die Aktivität der Gerinnungsenzyme an der Gefäßoberfläche zu begrenzen.
Das macht sehr viel Sinn.
Es gibt eine Bindung durch den Kofaktor,
dieser blaue Kofaktor bindet an das Enzym und sorgt für eine zusätzliche Bindungsoberfläche für das Substrat.
Nur wenn diese zur Verfügung steht, wird das Substrat stabil gebunden und verarbeitet.
In keiner der beiden Komponenten ereignet sich eine andere strukturelle Veränderung,
aber es gibt Beispiele dafür, das eine Kofaktor-Bindung eine umfassende strukturelle Umgestaltung des Enzymteils bewirkt,
und nur diese Form ist dann enzymatisch aktiv.
Und hier sind diese beiden Mechanismen, auf die ich mein Hauptaugenmerk richten werde.
Oh mein Gott.
Was soll ich tun?
Es führt also dazu, dass ich Dias vom Ende meines Vortrags heranziehe.
Gut, hier haben wir diese Mechanismen, auf die ich mich heute konzentrieren werde,
welche wir in den großen interzellulären Protease-Maschinen sehen.
Sie sind große Aggregate, die die aktiven Bereiche innerhalb dieser Teilchen isolieren.
Die Regulierung geschieht durch das Öffnen oder Schließen eines Zugangs-Ports.
Das ist das letzte Beispiel, eine noch nicht lange zurückliegende Entdeckung der Protease-Regulierung
in der HtrA-Familie der Proteinasen, bei der die Aktivierung durch ein Stresssignal
und die Bildung eines Käfigs um das Substrat erfolgt.
Dies hier sind nun die Moleküle, über die ich heute sprechen werde.
Sie alle sind ziemlich groß, mit Molekulargewichten von bis zu einer Million, und bestehen aus mehreren Untereinheiten.
Dies ist ein Proteasom, das aus 28 Untereinheiten von HslVU besteht, es sind 24 Untereinheiten,
dann ein Dreispitz mit sechs und DegP mit sechs oder 20 oder 24.
Nach Kurts Vortrag sollte ich erwähnen,
dass diese alle ein oder zwei Größenordnungen zu groß für die Kernspinresonanzspektroskopie sind.
Dafür brauchen wir die Kristallografie, daran besteht kein Zweifel.
Lassen Sie mich also mit dem Proteasom beginnen, das wir als erstes bei der archaealen Spezies analysierten.
Warum wählten wir das archaeale Proteasom?
Nur deshalb, weil es eine einfache Chemie hat.
Es hat die Architektur von Hefe, ein menschliches, das ein zylindrisches Molekül ist.
Es besteht aus 28 Untereinheiten, aber die Chemie ist einfach.
Alle diese Alpha-Untereinheiten, die die äußeren Ringe dieses Moleküls bilden, sind identisch, also Alpha sieben,
und dann sind da die inneren Ringe, Beta sieben, und dann eine zweifache Wiederholung,
die als das mit der siebenfachen Achse symmetrische Partikel bezeichnet wird.
Das also war für die strukturelle Biologie des Proteasoms vor einigen Jahren der Ausgangspunkt.
Danach gingen wir natürlich zu dem eukaryotischen Proteasom weiter.
Wir haben Hefe ausgesucht, aber die Hefe-Sequenzen sind den menschlichen Sequenzen sehr ähnlich,
und alles, was wir von der Hefestruktur ableiten, können wir auch auf die menschliche Struktur anwenden.
Es besitzt also die archaeale Architektur, aber hier sind alle Alphas anders.
Hier ist Alpha eins bis sieben, und hier ist Beta eins bis sieben – folglich sehen wir in Eukaryoten
eine wesentlich höhere Komplexität.
Darauf werde ich später zurückkommen.
Was ist nun die Rolle des Proteasoms?
In Zellen ist es aus vielen Gründen essenziell.
Ein Grund besteht darin, dass es der Scharfrichter des Ubiquitin-Pfads ist,
der von Hershko, Ciechanover und Rose entdeckt und beschrieben wurde, die dafür mit einem Nobelpreis geehrt wurden.
Der Scharfrichter dieses Ubiquitinierungs-, Konjugationspfades ist also das Proteasom,
welches die Ubiquitin-Markierung erkennt, das markierte Polypeptid auseinanderfaltet und abbaut.
Es tut noch mehr.
Es ist eine Reinigungskraft und erkennt denaturierte Proteine und baut sie ab, im Wesentlichen zu Oktapeptiden.
Wenn diese denaturierten Proteine oder ihre Produkte nicht endogen, sondern, zum Beispiel, viralen Ursprungs sind,
wird dies von einem nachgeschalteten Mechanismus erkannt, der diese Peptide, die nun als antigene Peptide bezeichnet werden,
in einem Komplex von MHC-Molekülen erster Klasse zur Zelloberfläche transportiert und eine T-Zellen-Immunantwort auslöst.
Ohne das Proteasom gibt es keine T-Zellen-Immunantwort.
Es ist bei Eukaryoten also absolut lebensnotwendig.
Hier haben wir einen Cartoon, der die Akteure zeigt.
Wir haben die zentralen Partikel.
Hier haben wir tatsächlich eine atomare Struktur.
Darüber werde ich hauptsächlich sprechen,
aber es steht in geringem Ausmaß mit einem regulatorischen Partikel in Zusammenhang, welches genauso komplex ist.
Seine Funktionen bestehen darin, die Ubiquitin-Markierung zu erkennen und das markierte Protein auseinanderzufalten,
das sich dann im Kern verteilt und abgebaut wird.
Dies ist eine Darstellung dieses großen Moleküls mit ungefähr 70.000 Atomen, somit ist es eine Darstellung aller Atome.
Es ist klar, dass es vollkommen intransparent ist, somit müssen wir die Komplexität reduzieren,
indem wir einfach die sekundären Strukturelemente aufzeichnen oder eine Oberflächendarstellung erstellen.
Wir schneiden ein Partikel auf, schauen hinein und sehen, dass die aktiven Bereiche,
die hier mit einem kovalenten Inhibitor markiert sind, innen gelegen sind.
Sie hängen mit dem n-terminalen Threonin zusammen.
Dieses Experiment definierte folglich den Mechanismus des Proteasoms als eine n-terminale Threonin-Protease.
Ich kann nur einige Aspekte dieses Mechanismus herausgreifen,
und ich möchte ihnen gern etwas über das Proteasom als Angriffsziel von Medikamenten erzählen.
Ich glaube, es war für mich und für uns alle überraschend, dass das Proteasom,
das eine solch wesentliche Rolle in allen eukaryotischen Zellen spielt, ein Angriffsziel für Medikamente ist.
Doch dies wurde glücklicherweise herausgefunden, indem man dieses einfache Boronat einsetzte, ein Peptid-Boronat,
und feststellte, dass diese Verbindung ein Medikament gegen bestimmte Formen des unheilbaren multiplen Myeloms ist.
Mit Hilfe der Kristallografie fanden wir heraus, wie es wirkt.
Die Boronsäure fügt die n-terminale Threonin-Hydroxylgruppe hinzu und azetyliert diese.
Diese vor ein paar Jahren gemachte Entdeckung und danach die Tatsache, dass sich diese Verbindung auf dem Markt befindet,
rief eine gründliche Prüfung hervor, insbesondere der Sammlungen großer natürlicher Verbindungen.
Was Sie hier in gelb sehen, sind Verbindungen, die man entdeckte und uns gab und deren Strukturen wir uns anschauten.
Wie Sie sehen, sind sie chemisch ziemlich vielfältig.
Sie haben recht unterschiedliche Hauptgruppen.
Dies ist eine Aldehyd-Gruppe, die ein Halbacetal mit dem n-terminalen Threonin bildet,
und im Übrigen einige Peptidteile besitzt.
Diese sind die...
, die ein Beta-Lakton besitzen und das n-terminale Threonin azetylieren.
Dies ist das Epoxomicin, das über eine Beta-Epoxy-Keton-Gruppe verfügt und sich an die Hydroxyl-Gruppe anheftet.
Die Amino-Terminale bilden ein Morpholino, was natürlich ganz spezifisch für ein n-terminales Threonin ist.
Das ist die TMC-Verbindung, ein massiv derivatisiertes Peptid, mit vernetzten Seitenketten,
und von einigem Interesse, weil es keine kovalente Bindung mit dem n-terminalen Threonin eingeht.
Wir haben es uns angeschaut, um zu weiteren Entwicklungen beizutragen.
Das ist die ursprüngliche Verbindung.
Wir erstellten die Kristallstruktur und fanden heraus, dass nicht alle von diesen schwierig herzustellenden Verbindungen,
chiralen Zentren oder Ersatzstoffen, das Protein kontaktieren und notwendig sind.
Wir fertigten daher eine Art Retro-Design an, um die natürliche Verbindung zu vereinfachen,
und entwickelten diese relativ einfache Verbindung,
die leicht herzustellen und fast so gut wie eine natürliche Verbindung ist und weiterentwickelt werden kann.
Das ist der jüngste von diesen Stoffen, eine Reihe von natürlichen Proteasom-Antagonisten.
Es war eine Entdeckung unserer Kollegen von der Universität Zürich, Robert Dudler, der herausfand,
dass ein Krankheitserreger bei Pflanzen einen Virulenzfaktor dieser Struktur absondert.
Sie sehen hier, dass der Stoff durch eine ungesättigte Amidgruppe gekennzeichnet ist, und wir stellten fest,
dass er das Proteasom, das Proteasom bei Pflanzen, zum Angriffsziel nimmt.
Er nimmt es ins Visier und bindet kovalent an das n-terminale Threonin über eine Michael-Addition mit dem C4-Kohlenstoff hier.
Hier sehen Sie deren Elektronendichte.
Das ist die Art von experimentellen Daten, die wir haben.
Was in der Pflanzenzelle geschieht, ist das, was man sieht:
eine Anreicherung von poly-ubiquitiniertem Cyclin B1 ist ein Zeichen dafür, dass das Proteasom nicht länger arbeitet.
Dies führt zur Apoptose und dem Tod dieser Pflanzenzellen.
Die Struktur, die wir sahen, war in der Oberflächendarstellung geschlossen.
Die aktiven Bereiche liegen innen, und die Zugangs- und Ausgangs-Ports waren geschlossen.
In der Tat handelt es sich dabei um eine latente Form.
Auf diese Art und Weise isolieren wir das Molekül.
Die Plaques hier werden von den n-terminalen Segmenten des äußeren Rings gebildet, der aus den Alpha-Untereinheiten besteht.
Wir machen uns nun daran, es konstitutiv zu aktivieren, und stellen somit einen konstitutiv aktiven Mutanten her,
indem wir einfach eines dieser n-terminalen Segmente entfernen.
Eines von sieben.
Was geschieht, können Sie hier bei der Elektronendichte sehen.
Sie entfernen ein Segment und die Struktur wird vollständig zerstört.
Natürlich befinden sich Stoffe hier drinnen.
Es gibt weitere sechs Polypeptidketten, aber es ist ungeordnet und gestattet dem Substrat, hineinzugelangen,
und die Aktivität wird um den Faktor 30 gesteigert.
Ein paar Worte zur Evolution.
Ich sprach von dem einfachen archaealen Proteasom, sieben identische Alphas, Betas,
eine siebenfach gefaltete Achse und eine doppelte Wiederholung.
Bei den komplexen eukaryotischen Proteasomen sind alle Alphas und alle Betas unterschiedlich.
Die meisten Bakterien besitzen kein Proteasom, aber sie verfügen über einen verwandten Mechanismus, der als HslVU bezeichnet wird.
Minus der Sequenz zeigt der Mechanismus deutlich, dass eine Beziehung zwischen diesen und diesen Untereinheiten besteht.
Selbstverständlich haben wir die Kristallstrukturen erstellt und das,
was man aus der Sequenz ableiten konnte, verglichen und verifiziert.
Die Frage dreht sich um Evolution.
Es ist ziemlich klar, dass das einfache bakteriale HslVU eine Art von Ur-Proteasom oder dessen Vorläufer darstellt,
obwohl wir es in modernen Bakterien finden, aber es besteht eine klare Verwandtschaft dieser HslVU-Untereinheit
mit einer Beta-Untereinheit, und auch die archaealen Alpha-Untereinheiten sind damit verwandt.
Sie haben diese Topologie eines Beta-Sandwichs in grün, bedeckt mit Alpha-Helixen,
aber vielen Unterschieden in der Alpha-Untereinheit.
Dann verbinden sich diese beiden.
Wir wissen eine Menge über den Mechanismus der Oligomerisierung, um das archaeale Proteasom zu bilden.
Aber wie kann diese Evolution hin zu dem modernen eukaryotischen Proteasom geschehen,
bei dem alle Alphas und alle Betas unterschiedlich sind?
Aus genetischen Experimenten wissen wir, dass keines dieser Alphas oder Betas durch ein anderes ersetzt werden kann.
Wie kann das also sein?
Ein Evolutionssprung von einer Form, bei der alles gleich war, zu einer, bei der alles unterschiedlich ist?
Es muss Zwischenstufen gegeben haben, die im Laufe der Evolution verschwanden,
oder wir haben einfach noch nicht ausreichend viele Kettensequenzen betrachtet.
Nun noch einer dieser Mechanismen und wieder zurück zu den Archaeen, zu Thermoplasma acidophilum.
Das ist das Proteasom, welches Oktapeptide herstellt, und hier ist eine wartende Dreispitz-Protease,
die beinahe ebenso groß ist wie das Proteasom und Dipeptide herstellt,
und dort sind wartende Aminopeptidasen, die Aminosäuren herstellen.
Wie sieht der Dreispitz aus?
Eine ganz andere Architektur, wie Sie sehen werden.
Ein drei-, zweisymmetrisches Partikel.
Wir schauen die dreifache Achse entlang.
Die aktiven Bereiche, wir vergrößern jetzt eine der großen Untereinheiten, 1200 Aminosäure-Reste.
Die aktiven Bereiche befinden sich innen, und wir wissen aus Experimenten,
dass das Substrat durch diese blauen Beta-Propeller-Strukturen hineingelangt, durch einen engen Tunnel,
der eine vollständige Auseinanderfaltung erfordert, und die Produkte verlassen den Bereich über die andere Seite,
durch die gelbe Beta-Propeller-Struktur.
Wir haben uns auch die Struktur der weiteren nachgeschalteten Aminopeptidasen angeschaut, und wir haben gute Beweise dafür,
dass diese großen Moleküle zu kurzlebigen Komplexen werden,
so dass es einen prozessiven Abbau des Polypeptids zu Aminosäuren in einem Zug gibt.
Es werden keine Zwischenprodukte freigesetzt.
Das Proteasom stellt also Oktapeptide her.
Die Oktapeptide bewegen sich dann in den nahegelegenen Dreispitz, der Di- und Tripeptide herstellt,
die am Ausgang des Dreispitzes warten und die Aminosäuren herstellen.
Es handelt sich also um einen gewaltigen Mechanismus mit einem Molekulargewicht von mehreren Millionen.
Lassen Sie mich nun zu diesem sehr neuen Protease-Mechanismus kommen, der ein weiteres,
ziemlich faszinierendes Merkmal aufweist.
Dieser Cartoon zeigt schematisch das Geschehen.
Hier ist die inaktive Protease, die durch ihr Substrat aktiviert werden muss.
Die Aktivierung, das Stress-Signal, erfolgt durch einen Teil, einen c-terminalen Teil des OMP,
wobei OMP äußeres Membran-Protein („outer membrane protein“) bedeutet.
Wenn dieses bindet, öffnet sich die Protease und wird aktiv,
und zur selben Zeit zieht sie sich um das Substrat zusammen und bildet eine Hülle.
Lassen Sie mich die Struktur-Beweise dafür durchgehen.
Das ist die DegP- oder HtrA-Familie, eine große Familie, die in allen Reichen des Lebens anzutreffen ist.
Ihnen gemeinsam ist die Protease, die eine Trypsin-ähnliche Protease ist
und von der wir natürlich durch diese ersten Studien der Verdauungsenzyme sehr gute Kenntnisse haben.
Sie besitzt PDC-Domänen.
PDC-Domänen sind Domänen, die man in vielen anderen Zusammenhängen mit der Protein-Familie gesehen hat.
Sie sind Rezeptoren für die c-terminalen Enden anderer Proteine.
Dies ist die grundlegende Architektur, das grundlegende Bauschema dieser großen Familie.
Lassen Sie uns nun einen Blick auf die E.
coli-Version, DegP, werfen, über die wir am meisten wissen.
Als erstes werde ich Ihnen etwas über ihre Funktion, ihre Funktion im Allgemeinen erzählen.
Das erste Dia habe ich mir von meinem verehrten Kollegen Michael Ehrmann in Duisburg/Essen
und von Tim Clausen aus Wien ausgeliehen.
DegP ist die Reinigungskraft für den periplasmatischen Raum bei gramnegativen E. coli.
Insbesondere schaut es sich die korrekte Faltung der Proteine der äußeren Membran an.
Diese werden natürlich, wie alle Proteine, im Cytoplasma synthetisiert,
durch die cytoplasmatische Membran transportiert und dann in die äußere Membran eingegliedert.
Dort können viele Dinge geschehen, und das OMP erreicht dann nicht sein endgültiges Ziel.
Das ist die Ursache des Stresssignals, das Signal, dass das OMP nicht korrekt gefaltet ist, ein exponierter c-Terminus.
Hier schauen wir uns die Struktur eines OMP an.
Es ist ein integrales Membranprotein mit einer Fass-Struktur und einem c-terminalen Segment,
dieses rote Segment, das ein Teil des Fasses ist.
Wenn OMPs nicht korrekt gefaltet sind, ragt dieses c-terminale Segment hervor
und stellt das Signal für die Aktivierung der DegPs dar.
Das führt dazu, dass es aus dem periplasmatischen Raum entfernt wird.
Somit ist DegP eine Reinigungskraft, wie ich bereits erwähnte.
Es hat eine Protease-Aktivität und, bemerkenswerterweise, auch die entgegengesetzte Aktivität.
Es hat eine Chaperon-Protein-Aktivität.
Manchmal hilft es also fehlgefalteten OMPs, sich neu zu falten, insbesondere bei niedriger Temperatur.
Dies ist eine ziemlich faszinierende Balance von Aktivitäten, Zerstörung und Rettung,
im selben Molekül, unter denselben Bedingungen.
Dazu werde ich einige Worte sagen.
Das war die erste Struktur von DegP, die wir analysierten.
Wir stellten fest, dass es in hexamerischer Form vorlag.
Es ist ein aus Trimeren bestehendes Dimer.
Wir schauen entlang der drei oder vier Achsen hier.
Wir sehen in grün die Trypsin-Domäne und in rot die PDC-Domäne.
Schon in diesen ersten Kristallen sahen wir zwei verschiedene Formen von DegP6,
eine geschlossene Form und eine offene Form, was unmittelbar die Mobilität der PDC-Domänen aufzeigte.
Sie können sich falten und diese geschlossene Struktur bilden oder sich wegbewegen,
um die offene Struktur zu bilden.
Die aktiven Bereiche sind, wie bei allen diesen Mechanismen, im Inneren verborgen.
Dieses DegP6 ist inaktiv.
Seine Inaktivität lässt sich einfach erklären, denn die Bindungsstelle für das Substrat ist völlig deformiert.
Was Sie hier in grau sehen, ist Trypsin.
Es ist Trypsin mit einem gebundenen Substrat, und dies ist das Segment, an das sich das Substrat anheftet.
Sie sehen, dass die Schleife völlig deformiert ist.
Im aktiven DegP6 ist sie über den aktiven Bereich gefaltet, was sofort die Inaktivität erklärt.
Die Aktivierung geschieht durch das Stresssignal, und das Stresssignal besteht in dem c-terminalen Segment eines ungefalteten OMP.
Das ist die Elektronendichte einer aktivierten HtrA-Struktur, was die Peptidbindung des Stresssignals an die PDC-Domäne zeigt.
Dies verursacht eine Reihe von Strukturveränderungen an der Schnittstelle zwischen PDC und Proteasendomäne
und führt letztendlich dazu, dass sich der aktive Bereich der Protease öffnet, der Trypsin-Teil,
so dass sie das Substrat binden und aktiv werden kann.
Ein paar Worte zu einigen grundlegenden funktionalen Eigenschaften von DegP.
Zunächst ist es eine prozessive Protease, die wir ganz einfach beobachten können,
indem wir uns das Spektrum der Produkte im Zeitablauf anschauen.
Wir kontrollieren den Abfluss der Peptide während einer begrenzten Zeit der Verdauung,
und wir stellen fast, dass es keine Veränderung gibt.
Das ist ein klares Anzeichen dafür, dass keine Zwischenprodukte freigesetzt werden.
Wir müssen das erklären.
Die Produkte sind hauptsächlich 12-mer und 18-mer.
Können wir das erklären?
Wir können es.
Dieser Cartoon zeigt, was geschieht.
Wir betrachten nur den Trimer in diesem Oligomer, den Sie in einer Minute sehen werden.
Dies ist die inaktive Form.
Hier ist die PDC-Domäne, und dort ist die aktive Seite, jetzt geschlossen, der Proteasen-Domäne.
Wenn das aktivierende Peptid bindet, verursacht es eine Strukturveränderung,
die sich bis zum aktiven Bereich in der angrenzenden Proteasen-Domäne ausbreitet, und dann beginnt die Spaltung.
Schauen Sie hier.
Hier findet eine Bindung statt, dann eine Aktivierung und eine Spaltung in dem roten Segment.
Jetzt wird ein neuer c-Terminus generiert, und dieser neue c-Terminus hat dann genau die richtige Sequenz,
um an eine andere PDC-Domäne zu binden.
Das Substrat pendelt also zwischen PDC und den aktiven Bereichen, bleibt in der Kammer und wird vollständig verdaut.
Das erklärt die Prozessivität, und die Entfernungen zwischen den aktiven Bereichen sind dergestalt,
dass wir die Bildung von 12-meren und 18-meren erklären können.
Wenn man DegP aus E.
coli isoliert, stellt man fest, dass es sich um 24-mer handelt,
und zwar um ein 24-mer mit einer zusätzlichen Biegung, die sich als ein OMP herausstellt.
Das ist die Kristallstruktur, die jüngst von Krojer, Ehrmann und Clausen bestimmt wurde.
Es ist ein 24-mer und bildet eine offene Schale, und hier innen befindet sich das Substrat.
In der Kristallografie sehen wir das nicht so abstrakt, denn es ist ungeordnet.
Es hat viele Möglichkeiten, sich in dem symmetrischen Käfig zu orientieren.
Aber seine Größe ist ausreichend für ein OMP, das hier sehr gut hineinpasst.
Wenn wir mit einem Elektronenmikroskop dieses Präparat betrachten, können wir die Gestalt dieses Moleküls bestimmen.
Aber da wir die detaillierte Struktur der Komponenten kennen, können wir sie darin modellieren,
und in dem MVC, das Materie in sich hat, und diese Materie ist ein Substrat, ist ein OMP.
Das ist also die Zusammenfassung.
Wir haben den inaktiven Hexamer, wir haben den aktiven 24-mer.
Die Inaktivität ergibt sich aus der Deformation der Substrat-Bindungsstelle,
so dass diese L2-Schleife die Anknüpfung des Substrats nicht erlaubt.
Im aktiven 24-mer wird das bewegt, und es gibt einen einfachen Zugang zu der Substratbindung.
Das ist der Auslöser.
Der Auslöser ist, wie ich sagte, das c-terminale Segment eines OMP,
das an die PDC-Domäne bindet.
Das fasst noch einmal zusammen, was ich Ihnen erklärt habe.
Lassen Sie es mich wiederholen.
Wir haben das inaktive DegP, die hexamerische Form, nur ein Monomer wird hier angezogen.
Wir haben das gefaltete OMP, aber wenn es sich auseinanderfaltet, gibt es den c-Terminus frei.
Dieser bindet an die PDC-Domäne, was eine Konformationsänderung in der Proteasen-Domäne auslöst.
Zur selben Zeit bildet es eine Hülle, eine 24-merische oder 12-merische Hülle um das Substrat herum.
Das reine Substrat sieht sich mit 24 Proteasen konfrontiert.
Man könnte sagen, es ist hoffnungslos.
Hier drinnen wird es abgebaut, aber zumindest bei niedriger Temperatur besitzt es eine gewisse Chance – die Chance,
dass es sich in dieser Kammer neu faltet, dass es das Signal-Peptid zurückruft und es seinem eigenen Körper einverleibt.
Wenn dies geschieht, dann kehrt DegP zu seiner inaktiven Form zurück.
Das führt zur Demontage der Hülle, und ein intaktes gesundes OMP wird in die Freiheit entlassen.
Dies ist die Chaperon-Protein-Aktivität.
Bei hoher Temperatur ist es in erster Linie eine Protease.
Also, Astrid, es sind noch – Sie gaben mir ...
(Anderer Sprecher): Wenn Sie möchten, können Sie noch ein paar Minuten haben.) – Danke.
Am Montag, bei der Zusammenkunft mit den Studenten beim Essen, wurde ich immer wieder nach den Firmen gefragt,
an deren Gründung ich vor einigen Jahren mitgewirkt hatte und die in meinem Lebenslauf erwähnt wurden.
Offensichtlich gab es hier von Seiten der Studenten ein großes Interesse – das ist verständlich.
Nicht alle können einen Job auf dem akademischen Arbeitsmarkt finden und halten nach anderen Chancen Ausschau.
Ich sagte ihnen, dass es diese anderen Chancen gibt und dass ich, zumindest in zwei Fällen, daran beteiligt war,
solche Chancen hervorzubringen.
Lassen Sie mich nur kurz das durchgehen, was geschah.
Das Forschungsgebiet der strukturellen Biologie ist so ausgereift und vollentwickelt,
dass es eine solide Grundlage für geschäftliche Unternehmungen bietet.
Und es ist ein ziemlich interessantes Geschäft.
Es ist ein Geschäft an der Schnittstelle zur Grundlagenforschung,
wenn neue Strukturen beispielsweise zu medizinischen Zwecken oder für die Saatgutwissenschaft bestimmt werden müssen
– die Schnittstelle von Grundlagenforschung und Anwendung.
Die erste dieser Gründungen, an der ich mitwirkte, war Proteros vor ungefähr zehn Jahren.
Mittlerweile ist es ein mittelständisches und tatsächlich florierendes Unternehmen,
das keine großen Investitionen benötigte.
Es wächst durch seine Einnahmen.
Seine Tätigkeit besteht darin, den Kunden – selbstverständlich gegen Geld – Informationen über Protein-Strukturen
und Protein-Ligand-Komplexe zur Verfügung zu stellen.
Diese Informationen sind für Pharma-Unternehmen von Bedeutung, um die Verbindungen,
die sie in Screening-Experimenten entdeckt haben, weiterzuentwickeln.
Proteros bietet die Informationen an und verfügt über die geeigneten Technologien, nämlich üblicherweise die Protein-Produktion.
Sie verkaufen Struktur-Analysen von kovalenten Proteinen und Protein-Ligand-Informationen und leben davon.
Es ist eine interessante Tätigkeit und mit Sicherheit eine Karriere-Alternative zur akademischen Arbeit.
Das zweite Unternehmen ist eine traditionellere moderne Biotech-Firma, und zwar eine Firma,
die ein neues Behandlungsprinzip für Autoimmun-Erkrankungen entwickelt.
Es geht zurück auf meine eigene Arbeit, vor vielen Jahren, an der ersten Struktur eines Antikörper-Moleküls,
das Sie sich hier drehen sehen.
Ein Antikörper-Molekül bindet Antigene an die Spitzen dieser Arme und übt,
wie Sie sehen, seine eigentliche Funktion mit diesem Stamm-Teil aus.
Das war also die erste Art von Experiment.
Das andere war eine neuere zusätzliche Studie, um nämlich die Struktur eines Antikörper-Rezeptors für Immunzellen zu bestimmen.
Dies ist ein entscheidender Vorgang.
Antikörper binden an das Antigen, opsonisieren es – beispielsweise ein Bakterium – und der opsonisierte Komplex
wird von den Immunzellen über ihre Rezeptoren erkannt.
Sie werden Fc-Rezeptoren genannt, denn sie binden an den Fc-Teil des Antikörper-Moleküls.
Dies war die Struktur – immer noch im akademischen Umfeld – aber dann dachten wir uns,
dass dies von großem Nutzen insbesondere bei Autoimmunerkrankungen wäre.
Wir überlegten: das ist eine Immunzelle, das ist ein Antigen-Antikörper-Komplex, die Bindung an den Rezeptor stimuliert sie.
Bei Autoimmunerkrankungen müsste dieser Vorgang gehemmt werden.
Und wir überlegten weiter, dass der passende Antagonist hierfür ein löslicher Fc-Rezeptor wäre
– und das war der Ausgangspunkt für dieses Unternehmen.
Wir führten einige Tierversuche durch, deren Ergebnisse ziemlich gut waren, und nun befindet es sich in klinischen Tests,
die von SuppreMol durchgeführt werden.
Damit möchte ich schließen und mich für Ihre Aufmerksamkeit bedanken.